Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование клеток целомической жидкости у беломорской полихеты ARENICOLA MARINA (L. )

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование клеток целомической жидкости у беломорской полихеты ARENICOLA MARINA (L. )"

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ЦЕЛОМИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ У БЕЛОМОРСКОЙ ПОЛИХЕТЫ ARENICOLA MARINA (L).

03.00.11. - эмбриология, гистология и цитология

АВТО Р ЕФ ЁР AT диссертации на соискание ученой степени кандидата биологический наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Научный руководитель -кандидат биологических наук, доцент О.Ю.ЧАГА

Официальные оппоненты: доктор биологи ческил наук Крзсновская И. А. кандидат биологических наук Краснодембский Е.Г.

Ведущее учрехадение: институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится октября 1995 г. в час мин

на заседании Диссертационного совета Д 063.57.22 по защите диссертаций на соискание степени доктора наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет, аудитория 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доцент

Д.К.Обухов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение относительно простых защитных систем беспозвоночных животных представляет большой интерес для исследоватцлей, работающих в области сравнительной иммунологии и гистологии тканей внутренней среды. Этот интерес обусловлен тем, что многие процессы, из которых слагается сложнейший иммунный ответ у позвоночных животных (распознавание споего и несвоего, фагоцитоз, синтез гуморальных факторов), характерны и для беспозвоночных и нередко представлены у этих животных в более простой и доступной для анализа форме. И здесь особое место принадлежит работам, посвященным организации защитной системы у шгогошетннковых червей, т.к., в соответствии с современными представлениями, полихеты являются ключевой группой в эволюции трохофорных животных, давшей начало моллюскам и членистоногим.

У полихет основную роль в осуществлении защитных реакций (фагоците.-,, инкапсуляция, заживление ран) играют свободные целомоциты. Эти подвижные клетки замечательны своим структурным разнообразием (целомическая жидкость некоторых полихет содержит до б различных типов целомоцитов). но, к сожалению, мы до сих пер очень мало о них знаем, а данные разных авторов порой плохо согласуются друг с другом (см. Dales, Dixon, 1981).

Так, благодаря работам, выполненным в начале века, мы имеем представление о морфологии целомоцитов у многих видов полихет (см. Romieur, 1923). В то же время, авторы современных ультраструктуриых исследований не соотносят свои результаты с данными, имеющимися в этих старых работах. Кроме того, некоторые принципиальные моменты, касающиеся организации системы подвижных клеточных элементов у полихет (например, вопрос о возможных гасгогенетичееких отношениях между разными типами целомоцитов и вопрос об обновлении свободных целомоцитов) остаются практически не исследованными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей, работы являлось исследование организации системы подвижных клеточных элементов у одного из представителей полихет - пескожила, Arenkola marina f L.). В этой связи были поставлены следующие задачи: I. Провести подробный морфологический ■ и цитохимический анализ целомоцитов пескожила. 2. На его основе разработать рациональную классификацию целомоцитов. 3. Исследовать процессы диффереицирожи и обновления свободных целомоцитов с помощью метода 3Н-тимидиновой авторздиогряфии. 4 На основе данных морфологического анализа и авторадиографических опытов установить

возможные гистогеиетчческяе отношения между разными типами целомоцитов. 3. Исследовать клеточные механизмы защитных реакций у пескожила и связанные с защитной функцией особенности структурной организации целоыоцитов.

Научная новизна. В результате проведенного исследования выделено 6 основных типов целомоцнтов и установлены гисгогепмическне отношения между некоторыми типами клеток. С помощью метода 'Н-тимидинооой авторадиографии впервые показано, что в популяции свободных целомоцитов происходит достаточно интенсивное обновление. Полученные данные свидетельствуют о том, что оно происходит в основном за счет свободно циркулирующих цел омоцнтов некоторых типов, способных к еннтезу ДНК. Также определено время днфференцировхи веретеновидаых клеток, составляющих основную часть свободных целомоцитов. Продемонстрирована способность веретеновидных клеток к амебоидной подвижности, агглютинации и фагоцитозу. С помощью методов электронной микроскопии и окрашивания флюоресцентным фаллоидином изучен цитоскелет у иитактных клеток и у клеток ¡п уНго.

Научная и практическая значимость. Результаты данного исследования имеют теоретическое значение. Они позволили существенно расширить представления об организации системы целомоцитов у полихет и могут быть использованы в сравннтагьно-иимунояошческих и сравнительно-гистологических исследованиях тканей внутренней среды. Полученные данные включены в курс лекций по гистологии и в спецкурсы по тканям внутренней среды, читаемые на кафедре цитологии и гистологии СШГУ, и используются г.ри проведении палевых практик.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых специалистов Общества Анатомов, Гистологов и Эмбриологов Санкт-Петербурга в 1990 и 1991 годах и на научных семинарах кафедры цитологии и гистологии и лаборатории сравнительной гистологии Биологического научно-исследовательского института СПбГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы (всс совместно с ОАО. Чага).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, 4-х глав, Выводов и списка литературы, включающего 60 отечественных и иностранных работ. Общий объем работы, включая таблицы, иллюстрации и список литературы, состааляет 90 страниц.

МАТЕРИАЛЫ и методы

И следования проводили на беломорских полихетах - пескожилах. Atenuóla marina (L.). Пескожилов собирали на верхней литорали в районе морской биологической станции СПбГУ (Чупннская губа Белого моря).

Морфологический анализ «еломоцитов включал витальные, суправитальные наблюдения, гистологические и электронно-микроскопические исследования. Пробы целомической жидкости брали в районе туловищных сегментов охлажденными до 4"С стерильными шприцами с заранее набранным фиксатором и быстро перемешивали. В качестве фиксатора использовали 2.5% глутаральдегидом на фосфатном буфере с сахарозой (рН 7.2-7.4; 750 мОсмоль).

Для изготовления постоянных препаратов использовали предметные стекла, покрытые полилизином. Дифференциально окрашенные гематоксклш'.о. ■ эозииом-азуром II (ГЭА) мазки исследовали с помощью светового микроскопа при увеличении х1350. В ходе цитохимического исследования был поставлен рад стандартных реакций на белки н ДНК, а также проведено специфическое окрашивание ДНК флюоресцентными красителями Хехст-33258, ДАПИ, акридиновый оранжевый.

Для выявления в целомоцитах фибриллярного актина использовали окрашивание фаллоидинсм, меченым родамином (ФР). Для этого готовили постоянные препараты как описано выше. В качестве фиксатора использовали 4% забуференный формалин (750 мОсмоль). Фиксацию проводили а течение 30 мин при 9°С во влажной камере, после чего мазки обрабатывали 0,1% раствором Trilon-XlOO (10 .мин) и 0.1 микромолярным раствором ФР (40 мин). Для исследования изменеиий актинового цитоскелета целомоцитов in vitro целомическую жидкость собирали стерильным охлажденным шприцем без фиксатора, но со стерильной морской водой и раскапывали на стекла с пояилизи-ном. Стекла оставляли при 9°С во влажной камере на 1, 5, 15, 30 или 60 мин. Далее мазки фиксировали 4% формалином, обрабатывали раствором Triton-XlOO и окрашивали ФР.

Для выявления зависимости клеточного состава целомической жидкости от веса и пола животных и его сезонных изменеиий проводили тотальный и дифференциальный киеточный подсчет (использовано 100 животных).

Фагоцитарную активность целомоцитов пескожила наблюдали при введении в целомическую полость взвеси кармина. Пробы брали через 2 ч после инъекции кармина.

Динамику обновления целомоцитов изучали в опытах с однократным введением [метил-3! (¡¡-тимпанна. Раствор 3Н-тимидина инъецировали в целомичес/сую полость животных из расчета 74 КБк на I г веса животного. В 1-м опыте пробы целомической жидкости брали на сроках 2 и 24 ч, 5, 15, 20, 25 и 60 сут после инъекции животным 'Н-тимидина, у 2-5 равных жнпотных на каждом сроке. Во 2-й опыте пробы целомической жидкости были взяты у одних и тех же животных через 3 ч , 6, 10 и 20 сут после инъекции им 41-тимидина (использовано 6 животных). Индексы меченых ядер (ИМЯ) определяли, подсчитывая по 1 ООО клеток у каждого животного. Интенсивность включения 3Н-тимидина оценивали, подсчитывая число зерен серебра над ядрами целомоцитов, по 10 меченых целомоцитов каждого типа у каждого животного.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА КЛЕТОК' ЦЕЛОМИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ.

Согласно нашим наблюдениям, в губе Чупа в конце мая-начале июня и с конца июля по сентябрь цел омическая жидкость пескожилов содержит немногочисленные гаметы на ранних стадиях созреоання. У самок оии представлены одиночным» молодыми оощпми. У самцов это сперматогошш и сперматоциты, собранные в пакеты (ыорулы) из 8-32 клеток. Клетхи относительно крупные - до 6 мкм в диаметре. Объединение отдельных теток в пакеты осуществляется за счет центральной цитоплазматической массы (Downing, 1911; Расеу, Bentley, 1992). В конце нюня -первой половине июля. т.е. в период интенсивного сперматогенеза, количество половых продуктов резко возрастает. В это время значительная часть гамет у самцов представлена пакетами сперматид и сперматозоидов, а у самок - крупными (до 200 мкм) эреаылм ооцнтамя.

■ Как отмечено выше, количество гамет зависит от сезона и достигает максимума перед нерестом, в начале июля. Количество целомоцитов мало меняется в течение лета и в среднем составляет II млн.клеток/мл целомической жидкости, варьируя у отдельных животных от 2 до 19 млн.клеток/мл. Специальные исследования, проведенные в июне и августе 1992 г, не выявили явной зависимости чясяа целомоцитоп от размера и пола животных.

ОБЩАЯ МОРФОЛОГИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ И ГИСТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ ЦЕЛОМОЦИТОВ

На основании суправитальных наблюдений и изучения дифференциально окрашенных ГЭА препаратов в целомической жидкости A.marina идентифицированы 6 типов целомоцитов: говенильные клетки, молодые, средние и зрелые амебоциты (веретсноввдные клетки), эозинофилы и гранулоичты (рис.1). Эта классификация является наиболее полной по сравнению с имеющимися в литературе (Gambie, Ashworth, 1898, 1900; Romieu, 1923; Левина, 1937; Dales. Dixon, 1981).

Первый тип целомоцитов объединяет, по-видимому, ювенильные формы. Это мелкие (5-7 мхм) округлые ктетки, известные в литературе под названием лимфоцитоподобных (Romieu, 1923; Dales, Dixon, 1981). Они имеют относительно крупные ядра с ядрышками. При окрашивании ГЭА иитоплазма этих клеток бледн ■ розовая, ядра голубые. Эта окраска типична также и для большинства амебоцитов. ' Очертания ядер в ювенильиых клетках неровные, в ядрах имеются участки более плотно упакованного хроматина. При ультраетруктурном анализе в этих клетках удается выявить множество свободных рибосом, отдельные цистерны шероховатой эндоплазматическок сети и митохондрии, расположенные по периферии клетки.

Среди целомоцитов этого типа отмечены митоти-чески делящиеся клетки на стадиях поздней анафазы и те-лофазы. Митотнческий индекс составляет 0.25-1.25%. Среди целомоцитов других типов митотические фигуры не встречаются. Доля юве-нильных клеток составляет в среднем 10% при значительных индивидуальных колебаниях (от 3.2 до 21.5%).

Самый многочисленный тип объединяет молодые и средние иеретеноввдные

клетки. Всего на их долю

Рис.1. Типы целомоцитов пескожила. 1 - товенильные метки, 2-4 - соответственно, молодые, средине и зрелые веретеногидные амебоциты, 5 - эозинофилы, б - гранулоцигы.

приходится от 50 до ^'о (в среднем 7С/о), из них около 5% - это молодые амебоциты. Отличительная черта этих клеток - вытянутая веротеновидкая форма. Овальное ядро обычно находится в центральной, расширенной части клетки. К концам клетка равномерно сужается. Размеры молодых амебоцитов варьируют от 6 до 10 мкм,' а средних - от 10 до 30; размеры ядер - от 5 до 10 мкм. При этом самые мелкие амебоциты имеют относительно крупные ядра. По мере роста клеток ядерно-плазменное отношение уменьшается.

Ультраструетурный анализ показывает, что органоиды в веретеновидных амебоцитах развиты слабо; имеются отдельные цистерны шероховатой звдоплазматическон сети, митохондрии и ыикрофибриллы. Цитоплазма этих клеток обычно содержит включения гликогена, фагосомы и в различной степени вакуолизирована. При этом мембрана, окружающая вакуоли, морфологически ничем не отличается от плазматической мембраны. Более того, изредка удается наблюдать вакуоли, мембрана которых переходит в плазматическую.

Наконец, все веретеновидные амебоциты содержат в цитоплазме некоторое количество гранул различной формы и электронной плотности. Эти гранулы хорошо различимы при использовании метода дифференциально-интерференционного контраста, но на окрашенных мазках целомкческой жидкости их выявить не удается. Лишь при окрашивании акридиновым оранжевым часть гранул дает интенсивное храсное свечение, что, вероятно, свидетельствует об их лизосомной природе.

Зрелые амебоциты (рис.1) составляют от 5 до 30% . Эти очень узкие клетки достигают в длину 100 «км и содержат в цитоплазме осевой цитоскелетный тяж, окрашивающийся белковыми красителями. Осевой тяж хорошо заметен и при суправиталышх наблюдениях. Кроме того, он часто выявляется в средних амебоцитах. Обычно это один тяж, но иногда можно видеть несколько параллельных тяжей или структуру, напоминающую сеточку. Ядра в зрелых амебоцитах обычно расположены в средней чада клеток и имеют углубление в виде борозды в том месте, где проходит осевой тяж. Это удается гмблюдагь и на некоторых ультратонккх срезах. Среди средних и зрелых амебоцитов встречаются клетки с эксцентрично расположенными ядрами к двуядерные клетки.

Электронно-микроскопическое исследование показывает, что зрелые амебоциты отличаются от остальных амебоцитов меньшим количеством 1-ранул, но более мощным цитоскеяетным тчжем. Иногда можно видеть, что тяж представлен центральным пучком фдааменгев, который окружен микрогрубочками. Фкламенты обычно ориентированы вдаль продольной оси клетки. Окрашивание мазкоо ФР

свидетельствует о том, что одним из основных белков, входящих в состав тяжа является фибриллярный актин.

Как показыпаег наше исследование, зрелые амебоциты во многом похожи ка средние амебоциты. Между клетками этих двух типов, также как между молодыми и средними амебоцитами, есть много переходных форм ц трудно установить четкие границы. Почти нет сомнений, что оии представляют собой последовательные стадии созревания веретеновидных клеток. Достаточно очевидно также, что молодые амебоциты возникают из округлых ювенкльных клеток. Таким образом, можно вполне уверенно предполагать, что ювенилыше клетки, молодые, средние и зрелые амебоциты, составляющие вместе большинство клеток целояа и образующие единый морфологический ряд. представляют собой последовательные стадии дифферепцировки единой клеточной линии.

Кроме амебоцитов и ювенильных клеток, в целомкческой жидкости пескожи—i встречаются клетки еще двух типов - эозинофилы и гранулоциты.

Эозинсзфилы - это округлые или верггеноендные клетки, цитоплазма которых интенсивно окрашивается эозином л акридиновым оранжегыи. Оии известны в литературе под название« округлых гиалиновых Яейкоиитов (Romieu, 1923) л эозннофильных амебоцитов (Левина, 1937). Ядра i этих клетках, относительно мелкие (1-5 мкм), неправильной формы, с плотно упаковаш!ым хроматином. У веретеновидных клеток этого типа ядра обычно палочковидные, узкие. Попадаются двуядерные формы. Доля эозинофилов обычно не превышает 2%, варьируя у отдельных животных от 0.1 до 5.5% Все это позволяет предполагать, что эозинофиды скорее всего являются деградирзющими, вышедшими из Дйфференцировкн целомопитами, вставшими на путь апоптоза (Ornierod, 1993; Seamus, 1993).

Гранулоциты впервые были оиисаны Ромье (Romieu, 1923), позднее Дэйлс и Диксон (Dales, Dixon, 1981) обнаружили эти клетки при электронно-шнфоско-пическоч анализе. Гранулоциты имеют размеры от 10 до 20 лжи и содержат в цитоплазме множество мелких гранул, которые-окружены мембраной (Dales, Dixon, 1981 J. Форма клеток овальная или каплевидная. Цитоплазма при окрашивании ГЭА остается прозрачной, ядра голубые, светлые, с декондексирозанным хроматином, гранулы резко оозииофильны. Гранулы также дают положительную реакцию на катионные балки.

На временных препаратах доля гранулоцитоо не велика (в среднем 3%). При этом встречаются животные, у которых клетки зтого типа вообще не обнаруживаются. Количество гранулоцитов в целомической жидкости, возможно.

зависит от сезона. На постоянных препаратах гранулоциты встречаются крайне редко, что, вероятно, связано с низкой адгезивной способностью этих клеток.

Что касается гистогенетических отношений грзнулоцигов с остальными типами целомоцитов, то мы полагаем, что гранулоциты - это самостоятельная клеточная популяция.

КЛЕТКИ С ПОЛИХРОМНЫМИ ГРАНУЛАМИ

Как на временных, так и на постоянных препаратах можно часто наблюдать целомоциты, содержащие крупные (2-3 мкм) гранулы (рис.2). В живых клетках гранулы интенсивно преломляют свет. На постоянных препаратах, окрашенных ГЭА, материал гранул оказывается полихромным. Встречаются как полностью эозинофильные, так и базофнпьные гранулы. Во многих гранулах центральная часть оказывается эозинофилыюй, а периферическая окрашивается азуром И. Кроме того, в части гранул выявляется зернистая структура.

Морфологический анализ показывает, что клетки с гранулами в основном представляют собой амебоциты на разных стадиях дифференцировки. При этом количество транул на клетку варьирует от 1 до 50 и более и не обязательно соотвепствуегг степени зрелости амебоцитов. Эозинофилы также могут содержать крупные гранулы, но чащ? немного, 2-3 гранулы на клетку. Важно подчеркнуть, что у одного животного обычно присутствуют Как клетки с гранулами, так и обычные амебоциты на разных стадиях созревания и эозинофилы. Иными словами, создается впечатление, что голнхромные гранула не являются обязательным продуктом дафферен-цироакн этих клеток.

Кроме того, оказалось, что распределение юигок с гранулами зависит от возраста животных, их псша, а также коррелирует со стадией

Рис.2, Клетки с полихромными гранулами (а), фагоцитированными ооцитами (б) и бурыми включениями (в) из целомической жидкости самцов (а и в) и самок (б).

созревания половых продуктов. Во-первых, нам не удалось найти клетки с гранулами у молодых животных весом около 1 г. у которых патовые продукты в целоиическоП жидкости, как правило, отсутствуют. Во-вторых, клетки с многочисленными блестящими гранулами присутствуют только у самцов и только в конце июня и в первой половине июля, т.е в период интенсивного сперматогенеза. В что же время у самок можно встретить целомоциты с фагоцитированными ооцитами. В конце июля, после вымета половых продуктов, подобные клетки исчезают, но зато и у самцов, и у самок появляются целомоциты с бурыми включениями неправильной формы и разных размеров. В августе и сентябре у самцов доля клеток с бурыми включениями составляет 8-14%, а у самок - только 1-2%. В сентябре у некоторых животных в целомической жидкости также встречаются н так называемые "бурые тела", т.е. азотные агрегаты клеток, цитоплазма которых заполнена бурыми включениями.

Эти наблюдения и ряд литературных данных (Калякина, 1982; Рясеу, Bentley, 1992) заставили нас предположить, что полихромные гранулы являются мужскими гаметами, фагоцитированными цепомоцитамн. Подобное явление вообще характерно для многих беспозвоночных (Кауфман, 1977; Dales, I97X).

Действительно, в июле часто можно наблюдать стерматкды и сперматозоид«, "прилипшие" к поверхности целомоцитоа Эти картины очень похожи на ранние стадии эадоцитоза, а именно - на стадию адгезии, предшествующую интерналмапии фагоцитируемого объекта. Наше предположение подтверждают и данные цитохимическою и авгораднографического анализа. Так, время одного из авторадиографических экспериментов совпади с моментом созревания «оловых продуктов у экспериментальных животных. В ходе этого опыта пробы целомической жидкости брали у одних н тех же животных с 3 по 13 июля. В начале опыта, через 3 ч после введения 'Н-тнмидина, в пробах целомической жидкости встречались юлько единичные пакеты сперматогониеа или молодые ооиоты. В то же время количество клеток с гранулами было невелико. Черо 6 и 10 сут у Тех же животных отмечено появление зрелых поповых продуктов и большого числа целомоцитоа со множеством гранул. При этом в некоторых клетках часть гранул оказалась сильно меченой. Иными словами, гранулы могут быть клетками, включившими ]Н-тимндим в начала эксперимента, а позднее фагоцитированными целоиоцитамн.

Наконец, материал гранул интенсивно окрашивается при проведении реакций на общие и катионные белки и ДНК. Следовательно, полихромные гранулы обнаруживают те же реакции, что и мужские гаметы, и содержат катионные белки (вероятно, гистоны) и компактно упакованную ДН1С.

Таким обратом, на основании всех имеющихся сведений мы считаем, что поли-хромные гранулы - это фагоцитированные целомоцитами мужские гаметы. Бурые же включения могут представлять собой остаточные тела - результат потного внутриклеточного переваривания захваченного материала, в том числе и собственных гамет.

НЕКОТОРЫЕ СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЦЕЛОМОЦИТОВ ПЕСКОЖИЛА

Проявленное нами исследование и имеющиеся литературные данные

свидетельствуют о ток, что амебоциты и, в меньшей степени, эозинофилы обладают

»

амебоидной подвижностью, способностью к агглютинации и фагоцитозу (Ashworth, 1904: Левина, 1937; Кешаск, ¡955; Fitzgerald, RatcIifTe, 19S0, ¡989). Из-за малочисленности и практического отсутствия гранулоцитов на постоянных препаратах мы ничего не можем сказать о функциях этих клеток.

Цел омом* гы пескожила агглютинируют in vitra. ¡Многоклеточные агрегаты образуются почти мгновенно н состоят как из веретеновкдных, так и из округлых клеток. Отдельные иаяомоциты, не вступившие в контакт с другими клетками, оседают на поверхность предметного стекла, быстро меняя форму и образуя многочисленные псевдоподии. Со временем многоклеточные агрегаты распадаются, з входившие в их состав клетки также распластываются на стекле.

Высокую фагоцитарную активность иеломоцитов пескожила по отношению к инородным частицам отмечает большинство авторов (Ashworth. 1904; Левина, 1937; fCermack, 1955). 8 наших опытах с введением в целом взвеси кармина через 2 ч наблюдалось появление большого числа амебоцитов с мелкими захваченными частицами, а вокруг более крупных частиц образовывались клеточные агрегаты. Аналогичным образом ведут себя цетомоииты пескожила и при инъекции бактерии в полость тела (Fitzgerald, Ratcliffe, 1980, 1989). Целомоцигы пескожила также способны фагоцитировать оставшиеся после нереста гам er и (см.выше).

Фагоцитоз к образование клеточных агрегатов янляются, по-видимому, основным«! клеточными защитными механизмами у пескожила. Фагоцитоз, агппотниания, а также амебоидная подвижность - это процессы, тесно связаные с реорганизацией цитоскелета. У пескожила большинство целомоцитов содержит в цитоплазме уникальную цитоскедетную структуру - осевой тянс. Он формируется в процессе дифференцировки этих клеток и, по нашим данным, представлен аетиновыми фнламентами, окруженными микротрубочками. Кроме того, в неактивированных целом оцитах выявляются замкнутые кольцевые структуры.

состоящие из актиновых фнлаиентов. При активации клеток осевой гяж и актнновые кольца подвергаются быстрой разборке. Уже через 15-30 мин в условиях т У1Чо фибриллярный актин выявляется только по периферии цитоплазмы, при этом верегеновидиые клетки теряют свою характерную форму.

Можно предполагать, что цитоскелетиый стержень выполняет двоякую функцию. Во-первых, эта структура, по-видимому, служит для поддержания весьма необычной формы зрелых веретеновидных клеток. Во-вторых, цитоскелетный стержень может быть источником цитоскелетных белкой, необходимых для обеспечения быстрых процессов амебоидной подвижности в ходе. кктичашш защитных клеток, их агглютинации и фагоцитоза. Что же касается актиновых колец, то их функции в настоящее время не ясны; может быть, они служат необычной формой запасания фибриллярного актина.

Итак, у пескожила клетки, принадлежащие к одной линии дифференцировки веретеновидных амебоцитов, реализуют два основных защитных механизма. Во-первых, они способны фагоцитировать инородные частицы, во-вторых, благодаря высокой амебоидной подвижности, они способны бистро агглютинировать и формировать крупные клеточные агрегаты. Последние представляют собой либо капсулы вокруг инородных частиц, либо, вероятно, тромбы, обеспечивающие клеточное свертывание целомической жидкости при повреждении стснки тела.

У позвоночных животных эти же функции выполняются разными типами клеток. Фагоцитоз инородных частиц обеспечивают клаки моношпарно-макрофа-гального ряда, микроорганизмов - нейтрофилы-микрофаш, а свершвание крови у позвоночных слагается из двух тесно взаимосвязанных, но самостоятельных механизмов - клеточного и гуморального. Первый из них представляет собой вхтнвацше и агглютинацию специализированных клеток - тромбоцитов или, у млекопитающих, кровяных пластинок, которые образуют клеточных белый тромб. Второй процесо заключается в активации факторов свертывания в тканевой жидкости или в плазма крови и приводит к полимеризации фибриногена с образованием волокон фибрина.

Хотя гуморальное свертывание целомической жидкости у г.ескожнла, судя по всему, отсутствует, по своей способности к быстрой агглютинации амебощггы этих животных функционально сопоставимы с тромбоцитами и кровяными пластинками позвоночных. Интересно, что такая функциональная аналогия сопровождается и некоторой аналогией структурной. Действительно, все эти клетки имеют достаточно специализированный ннтоскелет. У веретеновидных клеток он представлен осевым стержнем из актиновых филаментов и иикротрубочек, а у тромбоцитов и кровяных

пластинок - периферическим кольцом микротрубочек, поддерживающим дисковидную форму этих клеток, и сетью актнновых филаментсв. В обоих случаях при активации клеток происходит быстрая реорганизация актиновых филаментов и использование актина при формировании псевдолодий. Это сопровождается разборкой михротрубочковых структур и изменением формы клеток.

Другая структурная аналогия между амебоцитами и тромбоцитами-кровяными пластинками, по-видимому, состоит в следующем. У тромбоцитов и кровяных пластинок имеется специализированная мембранная структура - так называемая тубулярная система. Она представлена глубокими ветвящимися впячиваииями плазматической мембраны, пронизывающими всю цитоплазму. Подобная тубулярная система, вероятно, существует и у амебоцитов пескожила. Хотя назначение этой тубулярной системы и у тромбоцитов, и у амебоцитов остается неизвестным, ее наличие в специализированных клетках, обеспечивающих клеточное свертывание и у позвоночных, н у полихет позволяет предполагать, что она играет важную роль в процессе активации этих клеток.

Таким образом, по своим морфофункшюналькым особенностям амебоциты пескожила могут быть сопоставлены, с одной стороны, с фагоцитирующими клетками крови позвоночных и беспозвоночных животных, а с другой - с тромбоцитами и кровяными иласгиккзш позвоночных.

АВТОРДДИОГТАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОБНОВЛЕНИЯ ЦЕЛОМОЦИТОВ

Результаты автораднографкческнх . экспериментов показали, что среди свободных целомоцитов пескожила к синтезу ДНК способны в основном ювенильные юплки и молодые амебоциты, однако иногда первичная метка выявляется и в средних амебоцитах. На 1-10 сут после введения животным 'Н-тнмидинз ИМЯ ¡овеннльных клеток достигает максимума. После 10-15 сут число меченых ювенильных клеток постепенно снижается, и у многих животных меченые клетки этого типа совсем исчезают. Таким образом, динамика изменения количества меченых ювенильных клеток соответствует таковой камбиальных элементов в обновляющихся клеточных популяциях (см., например, Чага,1982). ■

Еще более резко изменяется количество меченых молодых амебоцитов. Индекс фазы 3 для «их сопоставим с таковым ювенильных клеток и составляет в среднем около 6 %. Количество меченых клеток этого типа возрастает до 27.5 % через 6 сут и до 45.5 % через 10 сут, а затем резко снижается. Такую динамику можно объяснить

тем, что молодые амебоциты - это достаточно непродолжительная, транзитная стадия развития амебоцитов, в которые дифференцируются ювенилышс клетки. Сходная кинетика выявлена и для средннх амебоцитов. Их ИМЯ увеличивается за первые 10 сут почти в 15 раз, что можно объяснить лишь переходом в эту стадию дифференцировки менее зрелых молодых амебоцитов. К 20 сут ИМЯ ювенильных клеток, молодых и средних амебоцитов резко снижаются. Меченые зрелые амебоциты впервые появляются на 10-15 сут, и их число возрастает до конца опытов.

На основании этих результатов, а также данных о разведении ангорздно-графической метки в ходе опытов (см.ниже) мы считаем, что цел ом опиты пескожила активно пролиферируют и что в значительной степени обновление этой клеточной популяции происходит за счет размножения свободных малодифференцнропанных целомоцитов. Очевидно, что т аким рабочим камбием являются ювеннльпые клетки и молодые амебоциты. Также вполне вероятно, что в данной системе имеется и пул стволовых клеток, которые делятся крайне редко. Это длительно обнаруживаемые о циркуляции интенсивно меченые юпенильные клетки и молодые амебоциты. Такие стволовые клетки могут быть либо свободно циркулирующими в целомической жидкости, либо прикрепленными, например, входящими в состав цеяомнческого эпителия.

Результаты авторадиографических опытов хорошо согласуются с полученными нами н имеющимися в литературе сведениями о морфологии целомоцитов разных типов (Gamble, Ashwcnh, 1894, 1900; Ashworth. 1904; Romicu, 1923: Левина, 1937; Dales. Dixon, 19s I), подтверждая предложенную выше схему нх гисгогенетичсских отношений и позволяя оценить время днфференнировкн веретеновндных клеток. Тик, длительность стадии молодых амебоцитов составляет около 5-10 сут, а срединх амебоцитов - около 10-15 сут . Следовательно, всего, по нашим рассчетам, от начала дифференцировки до стадии зрелого амебоиита проходит около 15-25 сут .

Вопрос о возможных гистогенетических отношениях между разными типами целомоцитов у полжет постоянно поднимается в литературе, но конкретных фактов для его решения практически нет. Попытки некоторых авторов провести авторадиографнческий анализ обновления целомоцитов у ряда полихегт, в том числе и у пескожила, оказались неудачными (Dales. Dixon, 1981). Только морфологические данные о наличии переходных форм .между разными типами целомоцитов не могут служить строгим доказательством той или иной точки зрения (Dales, Dixon, 1981; Dhuinaut, Porcliet-Hennere, 1988) e отличив от результатов комплексного морфологического и авторэдиографического апатита.

Пислг введения пескожилам 'Н-тимвдина со временем происходит значительное разведение метки. Так, в 1-м опыте через 2 ч после введения 3Н-гимндина среднее число зерен серебра на клетку составило около 70 для ювенильных и 50 для веретеновидных клеток, тоща как к концу опыта (через 60 сут) оно составляло 6-8 зерен на клетку, т.е. уменьшилось почти в 10 раз. Следовательно, за 60 сут клетки должны были пройти по крайней мере 2-3 деления.

Вопрос о способности к делению свободных иеломоцнтов полихет дискутируется о литературе длительное время, но до сих пор не может быть решен окончательно. Нольшинство исследователей придерживается мнения, что у полихет свободные клетки целом а не делятся (Faure-Fremid, 1934: Dales,1961; Dale,, Dixon, 1981; Porchct-Henneri et at., 1987). Левина (1937) и Ромьг (Roniieu, 1923) обнаружили единичные митотичссхи делящиеся клетки у А.татйш. Мы также встречали у пескожила делящиеся ивеняльные клетки, однако их количества было явно недостаточно для того, чтобы объяснить результаты наших аэтораднографнческих экспериментов. Кроме того, по данным о разведении метки, способностью к «»готическому делению должны обладать не только ювенильные, но и незрелые веретенозндные клетки. Однако за все время наблюдении нам не удалось обнаружить ни одной делящейся веретеновидиой клетки. Косвенными указаниями на возможность деления этих клеток являются включение в их ядра 'Н-тимидина на ранних сроках после введения его животным и наличие двуядериых амебоцитов.

Низкое число митозов на исследованных нами препаратах может быть обусловлено, по крайней мере, тремя причинами. С одной стороны, митотически делящиеся клетки могут обладать пониженной адгезивной способностью, и в этом случае при фиксации материала они могут смываться с предметного стекла. С другой стороны, обнаружение делящихся клеток часто представляет значительные трудности из-за их метких размеров. К тому же, время проведения наших экспериментов совпало с моментом нереста пескожилов, когда нх целоыическая жидкость содержит множество созревающих половых продуктов; отличить митотически делящиеся одиночные сперматогоиии от ювеиильиых клеток практически невозможно. Однако известно, что у А.пшгиш начальные стадии созревания половых продуктов происходят в гонадах, и в целомнческую жидкость попадают уже пакеты из 4-8 сперматогониев (Downing, 1911). Следовательно, значительно более вероятно, что наблюдаемые нами картины относятся к ювенильным целомоцитам, а не к сперматогониям.

Наконец, возможно, что свободные целомоциты действительно делятся крайне редко. Тогда, в связи с полученными данными, встает вопрос о внешнем источнике ни обновления, на роль которого, вероятно, могут претендовать некоторые участки целомического эпителия и гемамебоциты. На возможность обновления целомоцитов за счет цалотелия у A.marina указывали Эчворс (Ashworth, 1904) и Кермак (Kermack, 1955). При этом Кермак (Кегтпаск. 1955) также не отрицает возможности происхождения целомоцитов из "кровяных телец" (гемамебоцитов). На возможное участие гемамебоцитов в обновлении свободных клеток целома у пескожила указывала и Левина (1937). Поршет-Хеннере с соавторами, основываясь практически на таких же фактах, независимо высказали точку зрения о происхождении целомоцитов из гемамебоцитов у представителей другого семейства полихет -ceM.A,m'/(/jÉ'(Porchet-Henneréei al., 19X7).

Результаты наших авторадиографических экспериментов не исклю-шЮт наличия внешнего источника обновления циркулирующих целомоцитов. Однако, окончательно решить этот вопрос в настоящее время возможно, лишь используя такие методы как клеточное культивирование, клонирование и маркировка клеток.

ВЫВОДЫ

1. В целомической жидкости Armkata marina морфологически идентифицированы б типов целомоцитов. Это ювенильные клетки (ИГ »), молодые (5"'о), средние (65"о) и зрелые (15%) амебоциты (веретеновндные клетки), эозииофилы (!%} к граиулоциты (3"'о).

2. Тотальный и дифференциальный клеточные подсчеты демонстрируют значительные индивидуальные колебания общего числа целомоцигон и нх относительного содержания у пескожила. При этом явная зависимость числа целомоцитов от каких-либо факторов (сезона иаблюдсьий, веса и пола животных) отсутствует.

3. Амебоциты пескожила способны к амебоидной подвижности, агглкнинаиии и агрегации, а также являются активными фагоцитами. По своим морфофункциональным характеристикам они. с одной стороны, сопоставимы с фагоцитами большинства многоклеточных животных, а с другой - с кровяными пластинками и тромбоцитами позвоночных.

4. Целомоциты пескожила могут содержать в цитоплазме значительное количество крупных полихромных гранул. Зависимость появления клеток с гранулами от сезона наблюдений и пола животных и проведенный

цитохимический и авторадиографический анализ позволяют считать, что полихромные гранулы - это мужские гаметы, фагоцитированные целомоцитами.

5. Молодые, средние и зрелые амебоцигы являются последовательными стадиями дифферениировки единой линии веретеновндных клеток. Начальные этапы этой дифферениировки представлены юаенильнымн клетками. Гистогенетические отношения между эозинофшыми и гранулоцитами с одной стороны, и остальными типами целомоциюв - с другой, не лены.

6. Югенильные клетки и молодые амебоциты способны к синтезу ДНК. Индекс фазы S для них составляет около 10%. Способность ювенильиых клеток к делению подтверждается наличием митозов и сильным разведением авторадиографической метки в ходе опытов.

7. В популяции циркулирующих целомоцитов существует достаточно интенсивное обновление. Время дифферениировки веретеновндных клеток, по нашим расчетам, в среднем составляет около 15-25 сут .

8. Основным рабочим камбием в данной клеточной популяции являются ювеинльные клетки и молодые амебоциты. Сохранение в циркуляции в течение длительного времени сильно меченых ювекильных клеток свидетельствует о наличии в этой системе медленно обновляющегося пула стволовых клеток.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

Персинина М., Чага О. Обновление к дифференцировка клеток целомической жидкости у полихеты Arenicola marina. I. Морфология и классификация иглочоцитов // Цитология. 1У94. Т.36, С. 261-267.

Персинина М., Чага .О. Обновление и дифференцировка клеток целомической жидкости у полихеты Arenicola marina. И. Клетки с полихромными гранулами // Цитология. 1994. Т.35, С. 268-274.

Персинина М„ Чага О. Обновление и дифференцировка клеток целомической жидкости у полихеты Arenicola marina. III. Авторадиографический анализ // Цитология. 1995. Т.37, С. 101 - И 2.