Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинантная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina: получение, свойства и перспективы применения

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina: получение, свойства и перспективы применения"

На правах рукописи

Голотин Василий Александрович

Рекомбинантная щелочная фосфата» морской бактерии Cobetiamarina: получение, свойства и перспективы применения

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 янз 2015

Владивосток - 2014

005557552

005557552

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова

ДВО РАН

кандидат биологических наук Балабанова Лариса Анатольевна

Брыков Владимир Алексеевич

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией генетики Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Невинский Георгий Александрович

доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией ферментов репарации Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Институт биоорганической химии им. академико М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «6» марта 2015 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН и адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс (423)231-40-50, e-mail: Jissovet ii'piboc.dvo.ni

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН г.Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН) Текст диссертации и автореферата размещен на сайте \wv\v.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «30» декабря 2014 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О. В.

сшщля характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время предметом особого внимания учёных являются адаптированные к холоду ферменты из-за их способности функционировать при низких температурах. Богатейшим источником таких ферментов являются морские микроорганизмы, адаптированные не только к низким температурам, но и к другим экстремальным условиям обитания: высокому давлению, вязкости и солености морской воды, а также сезонному дефициту питательных веществ (De Prada, Brenchley, 1997; Feller et al., 2003; Hoppe, 2003). Интерес к термолабильным ферментам возник- благодаря их повышенной, по сравнению с наземными аналогами, каталитической активности. Поэтому изучение структурных особенностей этих ферментов позволит выявить причины их высокой эффективности. К сожалению, такие уникальные ферменты присутствуют, как правило, в природном источнике в следовых количествах, что значительно затрудняет их выделение, к тому же многие морские микроорганизмы трудно культивировать в лабораторных условиях. Однако в настоящее время методы генной инженерии позволяют получать как рекомбинантные аналоги таких ферментов, так и создавать на их основе белки с заданными свойствами и функциями, что расширяет возможности их использования в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности (Глнк, Пастернак, 2002). Возможность использования уникальных свойств ферментов морских пснхрофильных микроорганизмов для целей биотехнологии и медицины побуждает к исследованию их молекулярно-генетических характеристик и созданию суперпродуцентов ценных рекомбинантных белков. В качестве примера таких белков могут являться термолабильные щелочные фосфатазы (ЩФ) морского происхождения. Щелочные фосфатазы [3.1.3.1] являются неспецифическими моноэстеразами, катализирующими удаление фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление мэкроэргических связей рибо- и дезоксприбонуклеозидфосфатов, что определяет их важную роль в метаболизме и круговороте фосфора. Практический интерес к ЩФ объясняется их широким использованием в генной инженерии, гибридизациоиной ДНК-технологии и в медицине для получения иммуноконъюгатов и рекомбинантных антител (McComb, 1979; Tu et al., 2004).

Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН была выделена и охарактеризована ЩФ из психрофнльной морской бактерии Cobella marina КММ 296 с уникально высокой удельной активностью (_: 10000 ед./мг), что является самым высоким показателем на сегодняшний день для представленных на мировых рынках коммерческих препаратов (Иванова и др., 1994; Plisova et al., 2005; Nasu et al., 2012). Предполагалось, что морская бактерия, способная размноч;аться в широком интервале температур (от 4 до 42 °С), специализируется в симбиозе с моллюском Crenomytihis ¡'rayaniis как участник процесса биоминерализации экзоскелета этого моллюска (Иванова и др., 1994; Leveque et al., 2004;

Ivanova et al., 2005; Dorozhkin, 2009). Наличие у данной ЩФ высокой активности и стабильности в условиях различных химических модификаций белка оказалось важным фактором для получения на ее основе конъюгатов и её использования как в иммуноферментном анализе, так и в генно-инженерных исследованиях (Plisova et al., 2005).

Целью данной работы являлось получение рекомбинантной высокоактивной ЩФ морской бактерии С. marina КММ 296 в клетках продуцента Esherichia coli, изучение ее структурных особенностей, физико-химических и каталитических свойств, а также перспектив применения в генной инженерии, молекулярной биологии и диагностике.

В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить оптимальные генетические конструкции, несущие ген ЩФ морской бактерии С. marina КММ 296, для синтеза высокоактивной рекомбинантной щелочной фосфатазы (ОяАР).

2. Оптимизировать условия для экспрессии высокоактивной ОяАР.

3. Разработать и оптимизировать схему выделения ОяАР.

4. Исследовать физико-химические и каталитические свойства См АР.

5. Методами моделирования пространственной структуры и сайт-направленного мутагенеза исследовать структуру белков ОяАР, ОиАР/LoC, ОяАР/CGL, ОяАР/МВЬ-Д/.

6. Применить Cm АР для дефосфорилирования концов генно-инженерных векторов перед лигированием.

7. .Апробировать ОяАР в составе химерных многофункциональных белков для мониторинга экспрессии и очистки различных рекомбинантных белков на примере бифункциональног силикатеиноподобного катепсина губки l.anlriculia oparinae (ОиАР/LoC).

8. Применить ОяАР как молекулярный маркер в лектин-иммуноферментных методах с использованием гибридных бифункциональных галактозосвязывающего лектина мидии С. grayaniíS (ОяАР/CGL) и маннан-связывающего лектина трепанга Aposlickopiis ¡aponíais (С'т А Р/М В L-AJ).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штамм Я. coli Rosetta (DE3)/40Pho, несущий рекомбинантную плазмиду 40Pli, продуцирует функционально активную ОяАР в растворимой форме.

2. Оптимальные условия для экспрессии позволяют увеличить выход ОиАР до 10 мг из 1 л культуры клеток F.. coli Rosetta (DE3)/40Pho.

3. Оптимальная схема выделения позволяет получать 2 мг гомогенного препарата ОиАР с удельной активностью 12920 ед/мг из 1 л культуры клеток Я. coli Rosetta (DE3)/40Pho.

4. ОяАР с молекулярной массой 55 кДа проявляет максимальную активность при значении pH 10,3 и температуре 40 - 50 °С в 1 М ДЭА буфере при отсутствии экзогенных ионов металлов.

Максимальная эффективность катализа у С/и АР - S,2 у. Ю7 c''/М"1 в 1 М ДЭА при значении рН 8,0 и температуре 25 "С.

5. Незначительные отличия в структуре Стк? от ее прототипа из Vibrio sp. (VAP) согласно in silica данным могут объяснить причины повышения термостабильности и каталитической эффективности, увеличения значений Km и kcat при значении pHjlO.O, образования активного мономера, и субстратной специфичности.

6. С/иАР эффективно дефосфорилирует концы векторов перед дотированием, повышая эффективность лигирования генов в вектор до 99%.

7. С/иАР в составе химерного белка с силикатеиноподобным катепсином /,. oparinae перспективна как- молекулярный маркер для мониторинга катепсин-содержащих фракций при его хроматографической очистке.

8. Cm АР в составе химерных белков с манан-связывающим лектином голотурии A. japónicas и галактозосвязывающим лектином мидии С. gravarais перспективна для определения уровня глпкозилирования клеточных маркеров патологических состояний человека и их ранней дифференциальной диагностики.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена рекомбинантная высокоактивная ЩФ С. marina КММ 296 в клетках Я. coll с выходом 10 мг на 1 л культуры. Мономерный фермент выделен в гомогенном состоянии с удельной активностью 12920 ед/мг и каталитической эффективностью 8,2 х Ю7 с"'/М'', что в настоящее время является самыми высокими показателями для ЩФ. Впервые показано, какие структурные изменения могут влиять на повышение термостабильностп Стк? в 4 раза по сравнению с гомологом из Vibrio sp. (82 % гомологии). Впервые получены мутанты С/иАР, доказывающие наличие эндогенного

. . 2 V

иона Mg в активном центре мономера и его участие в катализе. Впервые на примере силикатеиноподобного катепспна губки !.. oparinae генно-инженерными методами показана перспектива применения С//:АР в качестве молекулярного маркера для проведения очистки труднодетектируемых рекочбинантных белков. Впервые на основе С/я АР получены рекомбинантные гибридные бифункциональные лектины - маннан-связывающий лектин голотурии A. japónicas и галактозосвязывающий .пектин мидии С. grayanus, перспективные диагностические средства для выявления онкологических и других патологий человека, связанных с изменением профиля глпкозилирования клеточных маркеров.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на второй (2011), четвертой (2012), пятой (2013) и шестой (2014) международных научно-практических конференциях "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиаюпш и медицине", Санкт-Петербург; 1-м Симпозиуме по морским ферментам и полисахаридам (1st symposium on marine enzymes and polysaccharides), Нячанг, Вьетнам, 2012;

на 2-м международном симпозиуме по наукам о жизни (2nd International Symposium on Lite Sciences), Владивосток, 2013; международной конференции FEBS ЕМВО, Париж, Франция, 2014.

Личный вклад автора. Автор лично участвовал в планировании экспериментов, а также л1гчно проводил большинство представленных в диссертации экспериментов, участвовал в анализе и обсуждении всех полученных результатов. Эксперименты с применением методов биоинформатики проводились совместно с к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н.

Публикации. Всего опубликовано 30 работ, из них по материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 2 статьи в цитируемых рейтинговых зарубежных журналах, 1 статья в отечественном рецензируемом журнале, 2 патента, 13 статей и тезисов в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 177 наименований. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 61 рисунок.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю аспирантуры к.б.н. Рассказову Валерию Александровичу, а также руководителю диссертационной работы к.б.н. Балабановой Ларисе Анатольевне. Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: к.х.н. Мензоровой Наталье Ильиничне, к.б.н. Сибирцеву Юрию Тимофеевичу и м.н.с. Сейткалиевой Александре Валерьевне за ценные консультации по вопросам жидкостной хроматографии, к.х.н. Мензоровой Наталье Ильиничне и д.б.н. Бакуниной Ирине Юрьевне за ценные консультации по вопросам ферментативного катализа, к.ф-м.н. Лихацкой Галине Николаевне за результаты исследований, полученных с помощью методов биоинформатики, к.ф-м.н. Зелепуге Елене Александровке за консультирование по вопросам моделирования, к.б.н. Булгакову Александру Александровичу и к.б.н, Чикаловец Ирине Владимировне за помощь в проведении лектин-ферментного анализа и предоставлении антител и лигандов к лектинам CGL и MBL-А/. Автор выражает благодарность сотрудникам БПИ ДВО РАН: д.б.н. Булгакову Виктору Павловичу и к.б.н. Шкрыль Юрию Николаевичу за предоставленные данные электронной микроскопии наночастиц кремния. А также автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Ковальчук Светлане Николаевне за неоценимую помощь и консультации при выполнении диссертации.

Работа поддержана грантами РФФИ 12-04-00825-а и 14-04-00696 А, и программой "Дальний Восток" 15-1-5-020.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Выделение геномной ДНК С. marina проводили фенольной экстракцией с использованием гуанндннизотиоцианата при pH 8,0. Гель-электрофорез ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook ft al., 19S9). Амплификация специфических фрагментов с ДНК С. marina и кДНК С. yraxamis, Л. japónicas и L. oparinac проводили с геноспецифичными праймерами и Энцикло ДНК полимеразой (Евроген) в амплификаторе «Eppendorf». Температура отжига праймеров рассчитывалась по формуле: (4GC+2AT)±5°C. Мутации в гены рекомбинантных белков вводили методом ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза. Лнгирование рестриктов ПЦР-фрагментов в плазмиду рЕТ-40Ь(+) в эквимолярном количестве проводили в 20 мкл инкубационной смеси с использовании Т4ДНК-лигазы (Fermentas) при +14°С в течение ночи. Трансформацию Я. coli плазмидной ДНК проводили с использованием хлористого марганца (Hanahan, 1983). Выделение плазмидной ДНК из П. coli осуществляли методом щелочного лизиса (Мазин и др., 1990). Секвенирование ДНК проводили на автоматическом анализаторе 310 (ABl PRISM). Экспрессию рекомбинантных белков проводили в /:'. coli Rosetta (DE3). Оптимизацию экспрессии проводили при различных температуре (12-24"С), концентрации индуктора экспрессии ИПТГ (0,2-0,5 мМ) и времени культивирования (12-18 ч). Очистку рекомбинантных. белков осуществляя!! с использованием анпонообменного сорбента (ДЭАЭ-52 целлюлоза, Whatman), металлоафинной смолы (Ni-NT А агароза, Qiagen) и гель-фильтрации (сефакрил S-100HR и супердэкс 200PG, Sigma). Влияние различных солей, ионов металлов, температуры, а также каталитические параметры определяли на обессоленном гомогенном препарате фермента. Содержание ионов двухвалентных металлов в белке определяли методом зтомно-адсорбционной спектроскопии (Shimadzu 6800).

Анализ нуклеотндных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программ Maestro (http://wvvy.sqlmaestro.com), GENERUNNER, CHROMAS, BLAST, Clustal\V2 (httir/.Чуу.' л .obi.ас.ul.-'). Теоретические модели пространственных структур белков получали с помощью программы МОЕ (http: "у ууу..-.chemcomp сотр с использованием в качестве прототипов известные кристаллические структуры белков (PDB; htlp://v."A-',v,rosb.oru'pdb>. Молекулярный докниг белков с субстратами, мутагенез in silico проводили с помощью программы МОЕ. Конформационную подвижность белков рассчитывали методом нормальных мод с использованием серверов elNEMO (http://vvww.sciences.univ-nantes.fr/elnemo/) и программы GROMACS ("•'. у ¡jromncs.nr'j). Значения рКа определяли с помощью сервера PROPKА (http://propka.ki.ku.dk ).

s

2. Результаты исследовании м их обсуждение 2.1. Получение рекомбинантной С/и А Р. Для построения экспрессирующей конструкции амплифицировали кодирующий участок гена ЩФ С. marina КММ 296. ■ Полученная плазмида 40Ph размером в 7699 пар оснований (п.о.) характеризуется наличием NcoI/SacI-фрагмента рЕТ-40Ь(+) и последовательности СтАР (1530 п.о.), адаптированной по N-концу для экспрессют в Е. coli (рис. I А). Для удаления плазмидного белка DsbC и шести гистидинов (His-tag) с N-конца С'жАР в плазмиде предусмотрен специфичный сайт для энтеропептидазы. После экспрессии плазмиды 40Ph в клетках Е. coli Rosetta (DE3) в оптимальных условиях, при температуре 16°С, концентрации индуктора ИПТГ 0.2 мМ и культивировании клеток в течение 12 часов (рис.1 Б), получен функциональный рекомбинантный белок СтАР в растворимой форме с выходом 10 мг на 1 л культуры. В результате применения разработанной и оптимизированной схемы очистки удалось получить 2 мг гомогенного препарата СтАР, очищенного в 93 раза, с удельной активностью 12920 ед/мл.

0

'V

"it. i

l

г-К

40Ph

(76Ö9n O.)

•w

J/<s

QJ

£L

< 4C0 £

8 201

sr

Температура. °C

Рис. 1. A - Плазмида 40Ph, определяющая синтез рекомбинантной щелочной фосфатазы морской бактерии С. marina (СтАР); Б - График зависимости синтеза растворимого рекомбинантного белка СтАР в клетках штамма Я. coli Rosetta (DE3)/40Pho от температуры при культивировании в течение 12 часов и концентрации индуктора ИПТГ 0,2 мМ. На оси ординат слева - относительная активность СтАР (ед), на оси ординат справа - общее количество белка (мг), на оси абсцисс - температура культивирования. Красная кривая -удельная активность СтАР (ед/мг); черная кривая - суммарная активность СтАР в полученном экстракте клеток; синяя кривая - общее количество белка, определенное методом Бредфорда.

2.2. Физико-химические и каталитические свойств:! СтАР. Молекулярная масса СтАР после этапа удаления плазмидного белка DsbC, определенная методом гель-фильтрации, составила 56 ± 2 кДа. Согласно расчетам, такая молекулярная масса соответствует мономеру СтАР и нативной ЩФ из С1, marina КММ 296 (Plisova et al., 2005).

СтАР проявляет максимальную активность при pH 10,3 в 1 М диэтаноламиновом буферном растворе (ДЭА). СтАР сохраняет исходную активность после 5 ч инкубации в

широком интервале рН (6,0 - 11,0) в 0,1 М Трис-НС1 и ДЭА, и 3-25 % активности - при тех же значениях рН в ацетатном, карбонатном и глициновом буферных растворах (рис. 2 А). При значениях рН ниже 6 препарат необратимо теряет свою активность.

В ходе исследовании было выявлено два оптимальных температурных режима для проявления максимальной активности СтАР - 40 и 50'С (рис. 2 Б), что может указывать на конформационные перестройки в пространственной структуре белка при этих значениях. Предварительная инкубация фермента в течение 15 мин в интервале температур 20 - 45 °С в присутствии ионов Му2' слабо влияет на стабильность, тогда как предварительная инкубация при 50°С понижает фосфатазную активность до 20 % от исходной величины. При отсутствии ионов время полуинактивации СтАР при 47 и 37'С составляет 15 и 45 мин

соответственно (рис. 2 В). Это показывает, что СтАР является умеренным психрофилом, проявляя большую температурную стабильность, чем его ближайший гомолог - ЩФ У1Ьгю яр. (УАР), время полуинактивации которого при 40 и 32 "С составляет 6 и 30 мин соответственно.

>гУ

г

И'

I

ьл

Рис. 2 А - Графики зависимости активности СтАР от различных значений рН и природы буферных растворов: черный - 30 мМ Ыа-ацетатного; красный - 50 мМ трис-НСЦ зеленый - 20 мМ ДЭА; синий - 20 мМ глицин-ЫаОН; сиреневый - 20 мМ Ыа-карбонатного; Б - Графики зависимости активности СтАР от температуры: измерение активности проводили в стандартном буфере в течение 30 мин при различных температурных режимах) (красный); измерение остаточной активности проводили после предварительной инкубации фермента при различных температурах в течение 15 мин в присуствии ионов 1у^2' в стандартном буфере при 25 С (черный); В - Графики зависимости стабильности СтАР от температуры в отсутствии ионов Мц" : фермент предварительно инкубировали при различных температурах, отбирая аликвоту через каждые 10 минут. Остаточную активность измеряли в стандартном буфере при 25'С.

Несмотря на существенное влияние ионов Мд2' на стабильность СтАР, активность фермента в отсутствии катионов двухвалентных металлов в инкубационной среде не изменялась. Кроме того, добавление ЭДТА до 100 мМ и ДСН до 5 % в инкубационную смесь уменьшает активность СтАР лишь до 60 и 40% соответственно. Отсутствие значительного ингибирующего эффекта может указывать на мономерное состояние СтАР и экранирование активного центра фермента элементами пространственной структуры, предохраняющими прочно связанные каталитические ионы 2,п2' и с аминокислотными остатками (а.о.)

активного центра от воздействия хелатирующего агента. В присутствии солей NaCl пли КС1 в буферном растворе 0,1 f.l трис-HCl, рН 10, при концентрации от 0,2 до 0,3 М активность ОпАР увеличивается в 2 раза, но при дальнейшем увеличении концентрации NaCl активность снижается, в то время как 1 М КС1 практически не влияет на активность фермента. Вероятно, избирательная устойчивость к высоким концентрациям ионов К помогает 1ДФ С. marina КММ 296 выполнять свою функцию в тканях моллюска, участвующих в минерализации постоянно растущей раковины, так как уже существуют доказательства необходимости повышения концентрации ионов К^ при зарождении и развитии остеобластов, из которых формируется костная ткань (Henney ct al. 2009).

Кинетические параметры Си АР были определены при различных значениях рН (от 8,0 до 10,3). ОкАР имела уникально высокие значения числа оборотов (kcat) и константу Михаэлиса-Ментен (Km), равные, соответственно, 28300 с"' и 13,2 мМ в 1 М ДЭА (рН 10,3) с каталитической эффективностью (kcat/Km) 2,1 х 10б с"'/М"' для субстрата я-НФФ. Значения величин каталитической эффективности и Km в I М ДЭА при рН 8,0 были 8,2 х 107 с /М и 0,3 мМ соответственно. Сравнительные каталитические показатели для некоторых ЩФ, измеренные в трис-HCl буферном растворе, рН 8,0, при 25'С, представлены в Таблице 1. Каталитические параметры ЩФ кишечника теленка, включая ее высокоэффективные мутанты, также значительно уступают показателям ОпАР (Kozlenkov et al, 2002, Nasu et al., 2012). В зависимости от условий реакции Km ЩФ кишечника теленка с удельной активностью до 56007800 ед/мг находится в пределах от 1,3 до 3,9 мМ, kcat - от 1800 до 6100 с"', а максимальная каталитическая эффективность достигает не более 1,4 х 10б - 1,6 х 106 с"'/М"' (Kozlenkov et al,

2002).

Таблица 1. Сравнительная характеристика каталитических параметров ОяАР, УАР и ЕСАР в трис-НС1 буферном растворе (рН 8,0) при 25'С._ __

Щелочная фосфатаза kcat, с 1 Km, мМ kcat/Km, c'/M"1

С marina, ОяАР 1500 0,045 3,3 x 10'

Vibrio sp.. VAP (Hauksson. Andresson, 2000) 204 0,17 1,2 x 10''

E. coii, ECAP (Tibbitts et ai, 1994) 62 0,06 1,1 x 10е

Таким образом, ОпАР на сегодняшний день является не только самой высокоактивной, но и самой эффективной из известных ЩФ. Необычные свойства ОяАР может объяснить её уникальная структура.

2.3. Моделирование пространственной структуры С/яАР. На основе пространственной структуры прототипа из Vibrio sp. (VAP; PDB: 3E2D_A) построена высокоточная модель пространственной структуры ОпАР со среднеквадратичным отклонением Са-атомов (RMSD) 0,46 А (Рис. 3 А). Упаковка ОяАР и VAP относится к (а-Р-а) типу: Р-лист

состоит из 9 р-тяжей, с обеих сторон окруженных а-спиралями. О.АР имеет большой «краун»-домен и длинные протяженные петли, покрывающие активный центр, как у УАР. Как и в структуре УАР. каталитичский центр СжАР глубоко погружен в щель между двумя петлями и образован идентичными металлосвязывающими а.о., каталитическим остатком 5ег65 и субстрат-связывающим остатком А^129. Незначительные стличия, обнаруженные в пространственной структуре молекулы СжАР, обусловлены наличием некоторых отличий в первичной структуре, что показывает выравнивание последовательностей а.о. СжАР и УАР. Это преимущественно гидрофобные а.о., располагающиеся на поверхности молекулы СжАР

Рис. 3. (А) -Теоретическая модель мономера СжАР (игаРго!: (21 \V622). Структура белка показана в виде ленточной диаграммы, Р-структура показана желтым цветом, а-спирали -красным цветом, изгибы - голубым цветом, неупорядоченная структура - серым цветом; (Б) -Суперпозиция Са-атомов модели СжАР и пространственной структуры УАР. Синим цветом обозначены идентичные участки аминокислотных последовательностей, зеленым, желтым и красным обозначены гомологичные и негомологичные аминокислотные остатки.

Методом нормальных мод было определено, что петля, участвующая в образовании димера в структуре УАР. у СжАР имеет большую конформационную подвижность (Рис. 4 А), Это может объяснить преобладание мономерной формы СжАР в растворе в условиях проведения хроматографий. К тому же каждая субъединица не нуждается в структурной кооперации для выполнения субстрат-связывающей и каталитической функций и обладает независимой конформационной подвижностью (Рис. 4 Б).

(Рис. 3 Б).

А

Б

А Б

Рис. 4. Конформационная подвижность мономера СткР (А) и димера (Б): 1 - активный центр мономера, 2- петля, участвующая в стабилизации димера.

Такие незначительные различия в структурах ЩФ приводят к существенным изменениям в термостабильности и кинетике катализа у СткР. Несмотря на то, что вся поверхность молекулы ОйАР является высокогидрофобной, расчет электростатического поверхностного потенциала вблизи активного центра показал присутствие протяженной поверхности положительно заряженных а,о. вдоль узкого входа в ферментативную полость. Это позволяет эффективно накапливать молекулы субстрата из раствора по направлению к активному центру. С другой стороны скопление отрицательно заряженных а.о., расположенных напротив связанного продукта реакции - РО43", усиливает его отталкивание, что ускоряет освобождение активного центра (Рис. 5 А, Б).

Опопярные * акцептор божьайивтл Оостатсжрастириталя @ : эроыат-аром.

О кислы« * донор бсжнвси цепи О «кипла« металла фи аромат.-« О основные ■ »эяцелгоросиоеиой цепи контакт растворителя !§* ? аромат -катион Огкбро<$оСнь<% донор оокюной цепи контакт иона металла приблизительный * ьгестололожание местоположение конгур лмгаида рецептора

Рис. 5. Схема контактов, образуемых аминокислотными остатками активного центра, с субстратом АМФ (А) и и-НФФ (Б).

Анализ протоннрования а.о. в СтАР при значении pH >10 показал, что положительно заряженный субстрат-евязывающий остаток Arg становится нейтральным и неспособным связывать отрицательно заряженный субстрат. В дополнении к этому нейтрально заряженный остаток Туг441 становится отрицательно заряженным, что способствует ускорению высвобождения продукта реакции РО/'из ферментативной щели. Этим можно объяснить столь высокие каталитические показатели Сиг АР (Km и kcat). Согласно модели пространственной структуры Си АР остаток Тгр274 образует стэкинг-взаимодействие с кольцом субстрата АМФ над входом в активный центр Cm АР, что определяет ее специфичность к молекуле ДНК (Рис. 5 А).

2.4. Направленный мутагенез ОиАР. Результаты атомно-адсорбционной спектроскопии показали, что на одну мономерную молекулу СтАР приходится два атома Zn и один атом Mg, как и в большинстве известных структур ЩФ (Heiland et al., 2009). Так как для всех ЩФ, включая VAP, оба сайта связывания ионов цинка являются идентичными, то для выявления роли а.о., формирующих третий Му2'-связывающий сайт в структуре Си АР, получали мутанты с заменой а.о. на нейтральный остаток Gly в местах предположительного связывания ионов Mg2f: /\spl2Gly, Asp273Gly, Asp315Gly, His316Gly, Trel lSGly, Glu26SGly и Trp274Gly. Практически все мутанты Cm АР, в которых был нарушен прямой контакт а.о. с ионом Mg2' или их косвенный контакт через атомы других а.о. или воды, оказались неактивными, что также подтверждает наличие эндогенного иона Mg*f в структуре СтАР. Мутанты Asp64Gly и /\sp443Gly, где нарушение контактов происходит на периферии молекулы, сохраняли, соответственно, 14% и 67% активности по сравнению с природным типом СтАР. Компьютерный анализ пространственной структуры мутантов выявил, что нарушение любого внутримолекулярного контакта Mg*f с а.о. приводит к нарушению координации сразу всех ионов металлов в СтАР. На ЗЭ-модели СтАР показано, что ион Мц2' принимает участие в формировании общей сети водородных связей, пронизывающей структуру активного центра СтАР.

2.5. Перспективы применения рекомбмнантной СтАР.

2.4.1. Применение СтАР для дефосфорилировяння векторов. Для повышения эффективности лигирования при получении плазмидных конструкций рестрицированные плазмиды обрабатывхтись СтАР для дефосфорилирования её З'-концов с целью предотвращения самолигирования вектора. При использовании СтАР эффективность получения рекомбинантных конструкций составила 99 % и намного превышала эффективность использования классической ЩФиз/:'. coli (Fast АР, Fermentas).

2.4.2. Получение гибридною бифункционального спликатеиноподобного катепсина CmAP/LoC. Силикатеины, гомологи катепсина L, - белки спикул губок, которые обладают способностью гпдролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема и конденсировать молекулы предшественника - тетраэтоксиэтилана с образованием кремниевых наноструктур определенной формы (Cha et ai, 1999). Широкие возможности применения силикатеинов в биотехнологии получения нанокомлозитных материалов на основе кремния делают перспективным исследование свойств силикатеинов разных видов губок и их рекомбинантных аналогов (Müller et al., 2009; Schröder et al., 2009; Wang et ai, 2012). Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН был получен рекомбинантный аналог спликатеиноподобного катепсина морской губки L. oparlnae (Ковальчук и др., 2013). Однако метод определения количества осажденного им кремнезёма из кремнесодержащих веществ часто приводил к недостоверным результатам, так как примесные белки способны к неспецифическому агрегированию друг с другом и к неспецифическому осаждению их компонентом самого субстрата, THEOS (тетракис (2-гидроксиэтил) ортосиликат). Это сильно затрудняло определение специфической активности содержащих рекомбинантный силикатеин фракций при хроматографпческой о'шетке.

На основе плазмиды рЕТ-40Ь(+) была получена химерная конструкция, несущая структурные гены фосфатазы Си АР и спликатеиноподобного катепсина морской губки L. oparlnae (LoC). После проведения экспрессии в клетках Е. coli было выявлено повышение выхода LoC в клеточном экстракте в полтора раза по сравнению с ранее разработанным методом его получения (Ковальчук и др., 2013). Это, вероятно, связано с особенностями процессинга химерного белка в клетках рекомбинантного штамма. ЩФ морской бактерии, расположенная с N-конца химерного белка CmkPILoC, может выполнять роль шаперона для силикатеина эукариотического происхождения, механизм действия которого требует дополнительного изучения. Выделение химерного белка было основано на оптимизированной схеме выделения С/и АР, за исключением последней стадии. Для гель-хроматографии вместо сефакрила S-100HR использовали супердэкс 200PG, предназначенный для белков с молекулярной массой до 600 кДа. Способность химерного спликатеиноподобного катепсина CmkPiLoC осаждать аморфный кремний из субстрата THEOS подтвердил его функциональность. Обработка »(мерного белка CmkVILoC энтерокиназой приводила к получению функционально активного LoC, который в перспективе можно будет применять для получения наночастиц для различных целей, в том числе для целей фотоники и получения биокомпозитных наноматериалов.

Таким образом, слияние LoC и С'/иАР для получения бифункционального белка с легко детектируемой фосфатазной активностью позволило более точно и быстро определять наличие

и количество сплпкатеина во фракциях при проведении хроматографии. Кроме того, было установлено, что слияние структурного гена ОлАР с генами белков, склонных к быстрой агрегации, таких как силикатенны, повышает их растворимость и, соответственно, функциональность при гетерологической экспрессии.

2.4.3. Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего лектима Cra/t/yCGL. В современном представлении лектины - это обширный класс белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их структуры (Королёв, 1984; Jialong et al, 2011; Wei-Chuan Chang, 2011). На основе способности лектинов определять профиль микрогетерогенности углеводов на поверхности клеток, измененных патологическим процессом, были разработаны различные лектин-ферментные и лектин-иммуноферментиые методы ранней и дифференциальной диагностики (ELLA) (Чикаловец и др., 2010; Ruzmanov et at., 2013). Ранее из морской мидии С. prayanus был выделен и охарактеризован галактозоспецифичный (Gal/GalNAc-специфичный) лектин (CGL), на основе которого для выявления различий в гликозилировании онкофетальных антигенов (ОФА) были разработаны методы твердофазного лектин-ферментного анализа (ТЛФА) (Чикаловец и др., 2010; Фуртак и др., 1999; 2000). Было показано, что лектин проявляет специфичность к углеводным цепям, характерным для злокачественного роста клеток, таким как Т-антиген (Gaipi—>3GalNAc-0-SerAThr) и Тп-антиген (GalNAc-O-Ser/Thr). Была определена нуклеотидная последовательность гена CGL, что позволило открыть новый класс лектинов, близких по структуре к рицину (l'ovalchuk et al., 2013).

В лектин-нммуноферментном методе для детекции связанных с лектином углеводных цепей необходимо получить меченные пероксидазой А хрена антитела к лектину, что является затратной по времени п ресурсам процедурой. В данной работе вместо использования конъюгатов пероксидазы хрена и антител к CGL предложено использование С/л АР для цветной визуализации лектин-связанных комплексов. Для этого использовали генно-инженерные методы сшивания С/кАР и CGL с целью получения бифункционального гибрида CmAP/CGL. В результате оптимизации генетических конструкций была получена плазмида рЕТ400иAP/CGL, имеющая 8192 и.о. и характеризующаяся наличием Ncol/Sall-фрагмента плазмиды рЕТ-40Ь(+) и фрагмента ДНК размером 2028 п.о., содержащего гены Cm АР и CGL, соединенных между собой гибким линкером (GjS)? с сайтом энтерокиназы. После экспрессии рекомбинантной плазмиды в клетках /:'. coli гибрид CmAP/CGL был очищен по такой же схеме, что и С'/лАР. Фракции CmAP/CGL определяли по активности СтАР. Согласно данным гель-хроматографии на супердэксе 200PG, химерный белок элюировал как мономер, имеющий молекулярную массу 104 кДа с плазмндным белком DsbC и 72кДа - без DsbC (рис. 6 А, Б).

Для тестирования функциональности гибрида ОяАР/СИ, лектин-ферментным методом использовали муцин желудка свиньи (РБМ). Было установлено, что существует линейная зависимость между концентрациями гибрида С'тАР/СО, и лиганда, указывающая на высокую специфичность такого взаимодействия (Рис. 6 В ),

'JUJf

NCiA

A

3.5-

T«H g

0

j S.O

1 1.51 1.Ú

ÍO.S

» PSM 100 ид/ml « PSMSOng/ml PSM 25 цд/ml r PSM 12,5 ug/ml » PSM B.25 цд/ml -•«-PSM S. 12 цд/ml _ PSM156 ,:g/rr

3 4 5 8 7 § 9 10 11 12 13 Концентрация CmAP/CGl, мкг/мл

в

Рис. 6. А - Модель пространственной структуры гибрида СтАРЮСЪ. ЫйА — галактозосвязывающие сайты СОЬ. Б - Электрофореграмма очищенного гибридного белка СтАР/ССЬ в 12,5 % ДСН-ПААГ (показано стрелкой). В - Влияние различных концентраций СтАР/Са- и муцина (РБМ) на чувствительность лектин-ферментного метода: по оси абсцисс показана концентрация СшАР/ССЬ (мкг/мл); по оси ординат - относительная активность ЩФ (ОП при Х=400нм).

Таким образом, предложенный ранее метод использования CGL (Чикаловец и др., 2010) усовершенствов;ш, что позволяет проводить анализ лектин-связанных форм в образце при концентрации как гибридного пектина CmAP/CGL, так и муцина менее 2 мкг/мл. Это делает CmAP/CGL перспективным для использования в диагностике патологий трофобласта и рака прямой кишки.

2.4.4. Получение гибридного бифункционального маннан-связывяющего лектина С/яАР/МВЬ-,4./. К числу пектинов с высоконаправленной углеводной специфичностью относится и маннан-связывающий пектин С-типа дальневосточного трепанга MBL-AJ (Bulgakov el al., 2007). Было показано, что результаты исследований углеводного профиля гликоконъюгатов MBL-/J./ могут найти широкое практическое применение при разработке методов диагностики рака на основе определения раковоэмбрионапьных антигенов (РЭА) (Булгаков и др., 2011). Так как для количественного определения лектин-субстратных комплексов в данном методе так же, как и для лектина CGL, требуется дополнительное получение антител к MBL-А/, меченных, пероксидазой А хрена, представляется перспективным

использовать C'mAP в качестве цветного маркера для визуализации образовавшихся комплексов. В результате использования генно-инженерных ОиАР-содержащих химерных конструкций для синтеза рекомбинантного лектина MBL-AJ удалось получить растворимый бифункциональный гибрид CmAP/MBL-A/ с активностью C'mAP и специфичностью MBL-Д/. Рекомбинантная плазмида pET40CmAP/MBL-A/ состоит из 8194 п.о. и характеризуется наличием NcoI/SalI-фрагмента плазмиды рЕТ-40Ь(+) и фрагмента ДНК размером 2034 п.о., содержащего химерный ген, трансляция которого начинается с Cm АР и заканчивается маннан-связывающим пектином MBL-А/. Функциональные домены молекулы CmAP/MBL-A/ соединены между собой гибким линкером (GiSV Экспрессию и очистку гибрида C'mAP/MBL-А/ проводили, как описано выше. Активные фракции определяли по активности C'mAP. На последней стадии гель-хроматографии на супердэксе 200PG рекомбинантный гибрид OmAP/MBL-A/ элюировал в виде димера с молекулярной массой 200 кДа - с плазмидным белком DsbC, и 140 кДа - без DsbC (pH 8,2). При более высоком значении pH ( 9,2) активность CmAP/MBL-A/ определялась как во фракциях белков с молекулярной массой 200 кДа, так и 400 кДа, а после обработки CmAP/MBL-A/ энтерокиназой - 140 кДа и 280 кДа. Так как, согласно полученным результатам. СткР является мономером, а MBL-Д/ существует в природе в активной форме в виде димера и тетрамера (Bulgakov el al., 2007), было предположено, что гибридный белок CmAP/MBL-А/ может образовывать олигомерные структуры за счет субъединиц лектина. Для подтверждения этого предположения была получена модель пространственной структуры гибридного лектина CmAP/MBL-A/ в димерной форме.

2.4.5. Моделирование пространственной структуры манна н-связывнющего лектина и его гибридного аналога Он/1 T7M15L-4./. Модель пространственной структуры лектина MBL-А/ получили на основе пространственной структуры его ближайшего гомолога из голотурии Cucumaria echinata (CEL-IV, код PDB: 3ALU) (Рис. 7 А). Мономер MBL-А/ содержит один углевод-распознающий домен, поэтому функционально активной формой лектина является димер (Bulgakov et al., 2007). Согласно ЗО-модели MBL-А/, в формирование димера MBL-А/ вовлечены дисульфидные мостки между мономерами (Рис. 7 Б). Димеры MBL-А/ в природе способны образовывать тетрамеры за счет а.о. цистеинов, расположенных на N-концах каждого мономера.

Модель структуры димера бифункционального гибрида CmAP/MBL-A/, состоящего из высокоактивной щелочной фосфатазы C'mAP и маннан-связывающего лектина MBL-А/, была также получена с помощью программы МОЕ. (Рис. 7 В). Анализ пространственной структуры гибридного белка CmAP/MBL-A/ выявил возможные механизмы образования олигомерных структур. Каждый мономер лектина, входящий в состав химеры CmAP/MBL-A/, также как и природный аналог, стабилизирован двумя внутримолекулярными S-S связями и образует еще

два дисульфидных мостика за счет близко расположенных к N-концу а.о. цистеина (Рис. 7 Б). При этом N-концы каждого из мономеров лекгина расходятся в противоположные стороны под некоторым углом, что позволяет двум доменам СжАР в составе химеры CmАР/МВЬ-А/ располагаться в пространстве независимо друг от друга (Рис. 7 В). Однако механизм образования тетрамерной формы химерного белка ОйАР/МВЬ-А/ при рН_-9,2, скорее всего, отличается от природного, так как N-концевые а.о. цистеина в химерном белке заняты связью с

Рис. 7. А - Модель пространственной структуры мономера МВЬ-А/: показаны дисульфидные мостики (Суз24-Суз35 и Суз52-С.уз168) и свободные группы а.о. СузбО и С.уэ 172 на С-конце мономера лектина. Б - Модель пространственной структуры димера МВЬ-А/: М| (оранжевый) и Мг (фиолетовый) - субъединицы МВЬ-А/; показаны два межсубъединичных дисульфидных мостика Суз60-Суз'172 и Суз'60-Суз172. В - Модель пространственной структуры димера СтАР/МВЬ-А/: М] и Мг - субъединицы (оранжевый и фиолетовый); N и С - концы субъединицы М|; N и С - концы субъединицы Мг.

2.4.6. Молекулярный докиш ¡п хШсо и мутагенез лектина в гибридном бифункциональном белке ОмАР/М ВБ-/1./. Для выяснения структурных особенностей и углеводной специфичности лектина МВЬ-А/ был проведен молекулярный докинг лектина с модельным манноолигосахаридом. На основе этих данных в лектин МВЬ-А/ были введены точечные аминокислотные замены: \V100A, (}103Н. А156Ы, Р159К и А156М/Т159К (Табл. 2).

В результате тестирования полученных экспериментальным путем мутантных форм гибридного лектина ОиАР/МВЬ-А/ методом лектин-ферментного анализа было установлено.

что при мутации \У100А происходит уменьшение связывания лектина с лигандом на 14±3 соответствующее расчетным данным (Рис. 8 А, Табл. 2).

Таблица 2. Энергия взаимодействия и степень сродства МВЬ-А/ с модельным манноолигосахаридом

Лек-тин МВЬ-А/ Сольватация*, кса1/то1 Аффинность**, кса1/пю1

Дикий тип -57,70 -7,69

\V100A -44.77 -5,66

0103Н -46,35 -6,62

А156Ы -58,68 -8,49

П59К -65.58 -8,21

А156ШЧ59К -74.53 -9,49

*- свооодная энергия связывания лиганда с рецептором в присутствии растворителя, включая Ван-ден-Ваальсовы и электростатические взаимодействия, **- аффинность связывания лиганда (ккал/моль), рассчитанная с оценочной функцией ОВУ1/\У8А сКЗ (СогЬеН еI ей., 2012).

£ 06

го

к

» 0.4

п /

i

А156№

• Р159К -А-ОЮЗН

у- Дикий тип

❖ \Л/100А

А156№Р159К

0.9 0.8-

С

0 0.7-

§ 0.6-х

1 0.5-| 0.4-I 0,3-

I 0.2

I

- СтАР/мвыи

Г/В1-А^_

200

300

400

Концентрация лиганда, нг/мл

А

500

Концентрация лиганда. нг/мл

Б

Рис. 8. А - Графики зависимости концентрации углевод-связанных форм СтАР/МВЬ-А/ от концентрации СтАР/МВЬ-А/ дикого типа (розовый) и концентрации мутантов СтАР/МВЬ-А./. Гибридные лектины СтАР/МВЬ-А/использовали в сериях двукратных разведений. В качестве лиганда использовали муцин желудка свиньи в одинаковой концентрации. По оси абсцисс обозначена концентрация лиганда (нг/мл), по оси ординат - относительная активность СтАР (ОП при Х=400нм). Б - Сравнительный лектин-иммуноферментный анализ с использованием нативного лектина МВЬ-А/ (нижняя кривая) (по оси ординат - ОП при Х=492нм) и гибрида СтАР/МВЬ-Д/ (верхняя кривая) (по оси ординат - ОП при Х=400нм). В качестве лиганда использовали эмбриональный а-1-кислый гликопротеин в сериях двукратных разведений, лектины были использованы в одинаковой концентрации. По оси абсцисс обозначена концентрация лиганда (нг/мл).

Мутации 0103Н и А156Ы приводили к ухудшению связывания лектина с лигандом, соответственно, на 12 ± 2 % и 8 ± 2 %, а замена а.о. П59К улучшала связывание с лигандом на 10 ± 3 %. Однако наибольшей углевод-связывающей активностью обладал двойной мутант А156Н/П591С, который показывал на 25 ± 5 % большую аффинность к муцину, чем гибрид СтАР/МВЬ-Д/ с природным типом лектина (Рис. 8 А). Кроме того, при использовании

гибридного лектина C'mAP/MBL-Д/ чувствительность лектин-иммуноферментного метода повышалась в 2 раза по сравнению с чувствительностью природного лектина MBL-А/ (Рис. 8 Б). Увеличение чувствительности может объясняться тем, что удельная активность используемой для визуализации лектин-субстратного комплекса пероксидазы А хрена составляет 576 ед/мг, в то время как активность О.АР в гибриде C'mAP/MBL-Д/ достигает 1500 ед/мг в 0,1 М трис-HCl буферном растворе и 5100 ед/мг в 1 М ДЭА.

Таким образом, использование гибрида CmAP/MBL-Д/ позволяет повысить чувствительность лепин-иммуноферментного метода и уменьшить время проведения анализа и его стоимость. Метод перспективен для ранней дифференциальной диагностики рака шейки матки (Булгаков и др., 2011).

выводы

1. Разработана оптимальная конструкция - плазмида 40Ph размером 7699 п.о., включающая Ncol/Sacl фрагмент плазмиды рЕТ-40Ь(+) и ген щелочной фосфатазы морской бактерии С. marina. Получен рекомбинантный штамм П. coli Rosetta (DE3)/40Pho, позволяющий получать рекомбинантный белок (СтАР) со свойствами щелочной фосфатазы морской бактерии С. marina в растворимой форме.

2. Подобраны оптимальные условия для экспрессии СткР с использованием рекомбинантного штамма Ii. coli Rosetta (DE3)/40Pho, что повысило уровень ее экспрессии до 10 мгв 1 л культуры клеток.

3. Разработана и оптимизирована схема выделения и очистки Cm АР из 1 л культуры клеток /:. coli Rosetta (DE3)/40Pho с итоговым выходом 2 мг гомогенного (>99%) препарата белка с удельной активностью фермента 12920 ед/мг.

4. Определены физико-химические свойства СткР, а именно: молекулярная масса, стабильность (при различных значениях pH, температуры в присутствии и отсутствии экзогенных ионов Mg'h), температурный оптимум, pH-оптимум, влияние высокой ионной силы, ионов тяжелых металлов, ингибиторов, устойчивость к хелатирующему агенту ЭДТА и детергенту ДСН, а также определены каталитические параметры СтАР (kcat. Km, kcat/Km).

5. Методами компьютерного моделирования получены теоретические модели пространственных структур СтАР, силикатеиноподобного катепсина L. oparinae (LoC), галактозосвязывающего лектина С. grayaniis (COL), маннан-связывающего лектина A. japonicus (MBL-А/) и CmAP-содержащих гибридных белков. Установлены структуры их активных центров, металлосвязывающих сайтов и сайтов связывания с субстратами, подтверждающие свойства белков. Выявлено, что нарушение любого внутримолекулярного контакта Mg2f в СтАР коррелирует с потерей каталитической активности фермента. Предсказана структура

гибридного мутантного лектина ОкАР/МВЬ-А/ с более высокой углевод-связывающей активностью.

6. Показана возможность применения С'тАР в генной инженерии. Использование On АР вместо ЩФ из П. coli позволило повысить эффективность лигирования целевых генов до 99%.

7. Показано, что ОиАР может быть использована в качестве молекулярного маркера для детекции целевого рекомбинантного белка - силикатеиноподобного катепсина !.. oparinac (I.oC), при гетерологической экспрессии и хроматографической очистке.

8. Получены рекомбинантные гибридные С/яАР-содержащие белки на основе галактозосвязывающего лектина С. grayanns (ОлАР/CGL) и маннан-связывающего лектина А. japonicus (CmAP/MBL-Д/) для усовершенствования лекгин-иммуноферментных методов определения уровня гликозилирования при различных патологиях человека, в частности, при онкологических заболеваниях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях

1. Golotin V., Balabanova L„ Likhatskaya G., Rasskazov V. Recombinant production and characterization of a highly active alkaline pliophatase from marine bacterium Cobctia marina // Marine Biotechnology. - 2014. DOI 10.1007/sl 0126-014-9601-0.

2. Balabanova L., Golotin V., Kovalchuk S., Bulgakov A., Likhatskaya G., Son O., Rasskazov V. A Novel bifunctional hybrid with marine bacterium alkaline phosphatase and Far Eastem holothurians mannan-binding lectin activities H Plos One. 2014. V. 9, Ы 11. el 12729.

3. Голотин В. A. Получение химерного белка на основе щелочной фосфатазы из бактерии Cobetia marina и силикатеиноподобного катепсина из морской губки Latrunadia oparinac Н Вестник ДВО Р АН. 2014. Т. 1. С. 169-173.

Патенты

1. Балабанова Л.А... Голотин В.А., Рассказов В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET400nAP/MBL-T. кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии и маннан-связывающего лектина С-типа. рекомбннантный штамм /;. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T -продуцент гибридного полипептпда CmAP/MBL-T и способ его получения // Патент РФ, №2538169. 17.10.2014.

2. Балабанова Л.А., Голотин В.А.. Коватьчук С.Н., Черников О.В., Чикаловец И.В., Рассказов В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET400«AP/CGL, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид ОлАР/CGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы Cm АР и галактозоспецифичного лектина CGL, рекомбннантный штамм /:. coli

Rosetta(DE3)/pET40C'/KAP/CGL - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/CGL и способ его получения // Патент РФ, заявка на патент №2014114093, 2014

Материалы конференций

1. Balabanova L., Golotin V., Kovalchuk S., Likhatskaya G., Bulgakov A., Chernikov O., Chikalovets I., Molchanova V., Rasskazov V. Recombinant chimeric bifunctional proteins with alkaline phosphatase activity of marine bacterium Cobetla marina for the assessment of lectin-binding patterns: FEBS EMBO 2014 conference, 30 Aug. - 4 Sept. 2014, Paris, France // FEBS Journal. 2014. V. 281, suppl. l.-P. 418.

2. Голотин В. А., Балабанова Л. А., Рассказов В. А. Получение экспрессирующего вектора щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina II Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине : сб. статей Второй междунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Россия, Санкт-Петербург, 26-28 окт. 2011,- СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2011. Т. 2. С. 166-167.

3. Голотин В. А., Балабанова Л. А., Рассказов В. А. Оптимизация схемы выделения высокоактивной рекомбинантной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina // Физиология, медицина, фармакология. Высокие технологии, теория, практика : сб. статей Четвертой мечсдунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии», 15-16 нояб. 2012 г., Санкт-Петербург, Россия. 2012. С. 36-38.

4. Golotin V. A., Balabanova L. A., Rasskazov V. A. Optimization of a highly active recombinant alkaline phosphatase CmkP expression and purification /7 1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides, Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. - Nha Trang: VAST, 2012. P. 26.

5. Голотин В. А., Балабанова Л. А., Рассказов В. А. Получение химерного белка на основе щелочной фосфатазы из бактерии Cobetia marina и маннан-связывающего лектина из голотурии Apostichopusjaponicus для диагностики рака// Физиология и медицина. Высокие технологии, теория, практика : сб. ст. Пятой междунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», 14-15 нояб. 2013 г., Санкт-Петербург. 2013. Т. 1. С. 37-39.

6. Голотин В. А., Балабанова Л. А., Лихацкая Г. П., Рассказов В. А, Структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina [Электронный ресурс] // Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7-14 нояб. 2013 г. : сб. работ. Владивосток, 2013. С. 30^10.

7. Balabanova L. A., Golotin V. A., Likhatskaya G. N., Rasskazov V. A. Structural study of a marine bacterium Cobetia marina alkaline phosphatase // 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. P. 12.

8. Golotin V. A., Balabanova L. A., Rasskazov V. A. Biochemical and catalytic properties of the recombinant alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina // 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. P. 36.

9. Rasskazov V. A., Balabanova L. A., Golotin V. A., Kozhemyako V. В., Kovalchuk S. N., Likhatskaya G. N., Menzorova N. I., Seytkalieva A. V., Sibirtzev Yu. Т., Terentyeva N. A., Zvyagintseva T. N. Hydrolytic enzymes of marine organisms as new tools for medicine and biotechnology // 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. P. 15.

10. Голотин В. А., Ярмоленко H. С., Балабанова Jl. А., Черннков О. В., Чикаловец И. В., Молчанова В. И., Рассказов В. А. Получение рекомбинантного бифункционального полипептида на основе щелочной фосфатазы морской бактерии и галактозосвязывающего лектина морской мидии // материалы всероссийской научно-практической конференции «Биологически активные вещества из морских гидробионтов в биотехнологии и медицине». Здоровье. Медицинская экология. Наука. - 2014. - № 3 (57). - С. 22-23.

11. Голотин В. А., Балабанова Л. А., Рассказов В. А. Очистка и лектин-связывающие свойства рекомбинантного гибридного белка для диагностики рака // Физиология и медицина. Исследования, высокие технологии, стартапы: сб. статей Шестой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», 22-23 мая 2014., Санкт-Петербург, Россия. -СПб : Изд-во Политехи, ун-та, 2014. С. 150-151.

12. Лихацкая Г. Н., Булгаков А. А., Балабанова Л. А., Голотин В. А., Рассказов В.А., Трифонов Е. В., Тарасов Г. В., Нурминский Е. А. Моделирование пространственной структуры лектина голотурии и его комплексов с манноолигосахаридом // III Международная научная Интернет - конференция "Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии", Казань, 25 сент. 2014. С. 104-106.

13. Шкрыль Ю. Н., Булгаков В. П., Веремейчик Г. Н., Голотнн В. А., Семилетова И. В., Тимофеева Я. О., Каменев Д. Г. Синтез кристаллов кремния с использованием силикатеина морских губок Latruncilia oparinae [Электронный ресурс] // XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 5-15 сентября 2014 г. С. 14-16.