Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биология и особенности распространения морских бактерий - продуцентов альфа-галактозидаз и альфа- N- ацетилгалактозаминидаз

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биология и особенности распространения морских бактерий - продуцентов альфа-галактозидаз и альфа- N- ацетилгалактозаминидаз"

На правах рукописи

НЕДАШКОВСКАЯ Ольга Ильинична

БИОЛОГИЯ И ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ос-ГАЛАКТОЗИДАЗ И сх-М-АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМИНИДАЗ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 1998

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН, г. Владивосток

Научные руководители: доктор биологических наук Михайлов В.В. кандидат биологических наук Иванова Б.П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Лауреат Государственной премии Шубин Ф.Н.

кандидат химических наук Лукьянов П.А.

Ведущая организация: Институт биологии моря Дальневосточного отделения Российской Академии Наук

Защита состоится "_"_ 1998 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 003.99.02 Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН по адресу: г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Почтовый адрес: 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ТИБОХ ДВО

РАН.

Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.х.н. Звягинцева Т.Н.

Актуальность темы Морские микроорганизмы обладают широким спектром физиологических адаптации, что позволяет им осваивать разнообразные экониши Мирового океана, а мультиферментные системы помогают утилизировать любые субстраты в качестве источников углерода и энергии, необходимые для метаболизма. Изучение ферментов, гидролизующих природные соединения в океане, актуально, поскольку дает представление о механизмах и скорости трансформации органического вещества в морских экосистемах. Морская биота существенно отличается от наземной, поэтому высока вероятность обнаружения в морской среде отличных от наземных микроорганизмов - продуцентов ферментов с уникальной специфичностью и активностью, удовлетворяющих практическим потребностям современной биотехнологии.

Микроорганизмы являются наиболее технологичными источниками ферментов, гак как они обладают высокой скоростью размножения и могут осуществлять синтез биологически активных веществ в конролируемых человеком условиях. Привлекают внимание исследователей микробные a-N-ацетилгалактозаминидазы (а-ГалИАц), способные удалять а-1,3-связанные остатки N-ацетилгалактозамина из гликопротеинов групповых веществ группы крови А с превращением последних в вещества группы О. В настоящее время выделено и охарактеризовано несколько подобных ферментов, которые, тем не менее, не соответствуют требованиям, предъявляемым биотехнологическим производством. Например, фермент, выделенный из Aspergillus niger (McDonald, Bahl, 1972), не действует на природные субстраты, гликозидазы анаэробной патогенной бактерии Clostridium perfringerts трудно получить в значительном количестве (Zevy, ArainofF, 1980). Гликозидаза из почвенного гриба-микромицета Acremonium sp. (Kadowaki et al., 1989) проявляет активность в не физиологических условиях (рН 4.5), что значительно усложняет процедуру обработки эритроцитов, для которых приемлемыми являются только физиологические условия (рН 7.0). Фермент с искомой специфичностью обнаружен в культуральной жидкости штамма анаэробной бактерии Ruminococcus torques IX-70 (Hoskins el al, 1997), выделенного из фекалий теплокровных. Однако, данная группа анаэробов нуждается в особых условиях культивирования и специфических факторах роста.

Большой практический интерес представляют се-галактозидазы (а-Гал), способные удалять а-1,3-связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ и эритроцитов группы крови В с превращением последних в вещества и эритроциты группы О. а-Гал с такой специфичностью были выделены из актиномицегов (Oishi, Aida, 1971), простейших (Yates el al., 1975; Cavazzoni et al., 1987), зерен кофе (Zarmitz, ICabat, 1960; Dey, Pridham, 1972) и батата (Chien, Lin-Chu, 1991). Известны примеры успешного переливания людям (добровольцам) энзиматически (а-Гал из зерен кофе) трансформированных эритроцитов (Goldstein et al., 1982; Goldstein, 1984; Lenny et al., 1991; 1994; 1995). Однако, технологичного препарата фермента так и не было получено.

Практическое решение вопроса затруднено отсутствием источников относительно дешевых ферментов, способных проявлять высокую активность непосредственно на эритроцитах в физиологических (рН, температура, ионная сила) условиях. Таким образом, поиск новых, более доступных и эффективных источников специфичных и стабильных ферментов для крупномасштабной модификации эритроцитов является актуальным. Другой важнейшей областью применения а-Гал является их использование в сельскохозяйственной биотехнологии и пищевой промышленности для гидролиза а-галактозидных связей, присутствующих в раффинозе, мелибиозе и стахиозе, обычно встречающихся в сое, что снимет ограничения в потреблении данных продуктов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение таксономической структуры и особенностей распространения морских бактерий -потенциальных продуцентов а-Гал и а-ГалКАц, выделенных из разных источников и обитающих в различных акваториях Мирового океана, а также поиск продуцентов гликозидаз, инактивирующих антигенную специфичность А и В эритроцитов, удовлетворяющих требованиям биотехнологии.

Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:

1) Определение таксономического состава морских микроорганизмов - потенциальных продуцентов ферментов.

2) Изучение особенностей распространения бактерий-продуцентов а-Гал и а-ГалЫАц, принадлежащих к различным таксономическим группам, в различных районах Мирового Океана.

3) Проведение отбора перспективных для биотехнологии штаммов бактерий, синтезирующих гликозидазы.

4) Фенотипическая и филогенетическая характеристика штамма бактерий КММ 426 -продуцента уникальной а-№ацетилгалактозаминидазы.

Научная новизна. Впервые на основании изучения штаммов микроорганизмов, выделенных из морской воды, донных осадков, а также анализа микробных ассоциаций морских растений и животных собранных в заливе Петра Великого на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин" в Охотском море и в тропических районах Тихого океана, установлено таксономическое положение бактерий, синтезирующих а-Гал и а-ГалЫАц и выявлены особенности их распространения в различных районах Мирового Океана. Так, бактерии, синтезирующие а-Гал, чаще встречались в северо-западных водах Тихого океана, в южных районах Тихого и Индийского океанов преобладали продуценты а-ГалИАц. Показано, что штаммы-продуценты более многочислены среди симбиотрофов животных, чем среди свободноживущих микроорганизмов. Впервые получены штаммы морских микроорганизмов, продуцирующие ферменты, обладающие специфичностью к групповым веществам крови человека и удовлетворяющие требованиям биотехнологии.

Из штамма Р5еис1оакеготопаз ер. КММ 701, выделенного из морской воды, получена а-Гал, модифицирующая эритроциты В группы крови человека в эритроциты О группы. Охарактеризован изолированный из пробы донных осадков штамм бактерий КММ 426 - продуцент уникальной а-ГалЫАц, которая инактивирует иммунодетерминанты эритроцитов А группы крови, превращая их в эритроциты О группы.

Дано описание нового рода бактерий семейства Р1аюЬас1епасеае - АгепапоЬаШг, представляющую собой отдельную филогенетическую ветвь в группе Р!аюЬас1егшт-Су1ор1ш%а-Вас1его1с1е!. Описан новый вид АгепапоЬас1ег Ыепаш.

Практическая значимость. Изучение таксономической структуры морских микроорганизмов, как свободноживущих, так и ассоциированных с макрогидробионтами, их способности синтезировать физиологически активные вещества может дать новые знания о роли ассоциативной микрофлоры в жизнедеятельности населяющих Океан организмов и, в конечном счете, функционировании морских экосистем. Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов. Фундаментальное значение имеет описание нового для ситематики морских микроорганизмов рода бактерий АгепапоЬас1ег, отнесенного нами к семейству ПачоЪааег'шсеае, и нового вида А. Ыегтш. Полученные, охарактеризованные и запатентованные гликозидазы используются в структурных и биохимических исследованиях и могут быть основой для биотехнологического производства ферментов

с заданной субстратной специфичностью. Изучение энзиматического воздействия на клеточные антигены открывает возможность направленного изменения антигенной структуры биологических материалов при условии применения ферментов с точно установленной субстратной специфичностью. а-Гал также могут быть использованы для гидролиза а-галактозидных связей, присутствующих в раффинозе, мелибиозе и стахиозе. Эти сахара, обычно встречающиеся в сое, не метаболизируются человеческим организмом в связи с отсутствием а-Гал в желудочно-кишечном тракте, что вызывает дискомфорт пищеварения и является главным ограничением потребления продуктов из семян бобовых растений.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на International Science Conf. "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East" (Ancorage, Alaska, U.S.A., Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug.29 - Sept.2, 1994), International Conf. of the North Pacific Marine Science Organization (PICES) "Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas" (Vladivostok, Russia, June 19-24, 1995), II Дальневосточной региональной конференции с всероссийским участием "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке (27-29 апреля, Владивосток, 1998), научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 1998), Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8) (Halifax, Canada, Aug. 9-14, 1998).

Материалы диссертации изложены в 11 печатных работах, получено положительное решение на патент РФ «Штамм морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 - продуцент а-галактозидазы».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на стр. машинописного текста, список литературы из названий, из них - зарубежные.

Автор выражает глубокую признательность своим руководителям д.б.н. В.В. Михайлову и к.б.н. Е.П. Ивановой. Автор благодарит своих соавторов: сотрудников лаборатории микробиологии, лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, Гематологического научного центра РАМН (г. Москва), лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН д.б.н. В.И. Светашева и к.х.н. М.В. Высоцкого.

Основные положения, выиоснмые на защиту.

1. Таксономическая структура морских микроорганизмов - продуцентов а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз отражает доминирование грамотрицательных бактерий родов Pseudoalteromonas и Vibrio, среди грамположительных бактерий - представителей родов Bacillus и Corynebacterium.

2. Продуцентов a-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз следует искать среди микроорганизмов-ассоциантов морских животных.

3. Микроорганизмы-продуценты a-галактозидаз преобладают в бореальных областях, бактерии, синтезирующие ct-N-ацетилгалактозаминидазы - в тропических районах Мирового Океана.

4. Характеристика штамма морских бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 -продуцента a-галактозидазы (К.Ф. 3.2.1.22).

5. Описание представителя нового рода Arenariobacter gen. nov. и нового вида Arenariobacter latericius sp. nov. КММ 426т - продуцента a-N-ацетилгалактозаминидазы (К.Ф. 3.2.1.49).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили штаммы микроорганизмов, выделенные из морской воды, донных осадков, водорослей Chandras sp., Fucus evanescens, Polysiphonia sp., Ptylota sp., Talossiophylus clatrum, морской травы Zostera marina; двустворчатых моллюсков: Crenomytilus grayanus, Patinopeclen jessoensis, Crassostrea gigas, Pina sp., Pieria sp.; губок: Aurora globustellata, Aulosaccus sculcei, Lalrinculia sp., Mycale adherens, Steletta vatidissima, Haliclona sp., Petrosia seriata, Plocamia fragilis, Chondrociadia gigantea, Choneplasma calix, Choneplasma sp., Dictioceratiola sp., Dysidea sp., Geodia sp., Grantessa sp., Halichondria panicea, Haliclona sp., Hymeniacidon assimilis, Thiodendronia sp., Trachiopsis halichondroides, Adelas sp., семейств Iotochroideae, Veronidae и неидентифицированных видов губок; голотурий: Aciinopyga mauritiana, Cucwnaria japónica, Holothuria aira, Holothuria sp., Pseudostichopus trachus, Psolus eximus, Psolus regalis, Stichopus horrens, Stichopus japonicus, Thelenota ananas; морских звезд: Aphelasterias japónica. Asterias amurensis, Ceromaster patagonicus. Crossaster papposus, Culcila novaeguineae, Distolasterias nippon, Fronia manilis, Henricia aspera, Henricia sp., Leptasteriasisheri, Lethasterias nanimensis var.chelifera, Nordoa sp., Patiria pectinifera, Pteraster tesselalus, офиур Opheopholis aculeata, Gorgonocephalus caryi, морского ежа Strongylocentrotus sp. и неидентифицированных иглокожих, креветок Eualus japónica и Spirontocaris ochototensis, мягких кораллов Paragorgia arbórea, Palythoa sp. и неидентифицированного мягкого коралла; рыбы Tetraodon sp., а также морских асцидий, червей и краба таксономическое положение которых не установлено, собранных в заливе Петра Великого на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, а также во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин" в Охотском море и в тропических районах Тихого океана (табл. 1).

Посев из разведений морской воды, донных осадков, гомогенатов тканей животных, водорослей и морской травы производился асептически на агаризованную питательную среду (Youshimizu, Kimura, 1976). Выделенные 2008 штаммов бактерий были идентифицированы с помощью Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 8th Edition, 1984, 1986; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition, 1994, фундаментальной сводки The Prokaryotes..., 1992, а также используя сведения, опубликованные за последние годы в International Journal of Systematic Bacteriology.

Методы изучения биологических свойств бактерий.

Были изучены микроморфология клеток и макроморфология колоний, подвижность, окраска по Граму, потребность в ионах натрия для роста; тест Хыо-Лейфсона ставили на модифицированной для морских бактерий среде (Lemos et al., 1985); способность продуцировать оксидазу тестировали по Ковачу; присутствие каталазы, мочевины, индола, сероводорода, чувствительность к 0/129 определяли согласно "Методам общей бактериологии" под редакцией Ф. Герхардта и др. (Зт., М.: "Мир", 1983-1984) Способность бактерий к синтезу пигментов изучали на среде Кинга (King et al., 1954), для обнаружения флексирубина применяли 20%-ный КОН (Fautz, Reichenbach, 1980). Гидролиз желатина, крахмала, твинов-20, 40, 60, 80 определяли по описанным ранее методам (Blazevic, Ededer, 1975). Деградация казеина, эластина, крахмала, альгината учитывалась по образованию чистой зоны вокруг колоний. Для определения бактериального окисления 95 источников углерода была использована тест-система для грамотрицательных бактерий BIOLOG. Хитиназную активность определяли двумя методами: "чашечным" (с коллоидным хитином на голодном агаре) и эспресс-методом, используя в качестве субстрата />-нитрофенил-М-ацетил-р-П-

Таблица 1

Количество штаммов бактерий, выделенных в различных районах Мирового океана

Район отбора Дата Глубина Темпера- Соле- Источники выделения Количество

проб (м) тура (°С) ность (%о) выделенных

иггаммои

Тихий океан

Охотское море 1988, 160 4 35 Морская вода 45

июнь Грунт 72

Губка Steletta validissima 38

Губка Plocamia fragilis 23

Губка Choneplasma calix 13

Губка Choneplasma sp. 24

Губка Haliclona sp. 12

140 Губка Hymeniacidon assimilis 13

380 Губка Lalrinculia sp. 8

160 Губка M y cale adherens 4

Губка Aulosaccus schulcei 1

Губка Chondrocladia gigantea 2

25 Губка Thiodendronia s p. 7

140 Нсидснтифицированные губки 16

30 Мягкий коралл Paragorgia arbórea 5

Иендентифипированный 3

мягкий коралл

160 Голотурия Pseudostichopus trachus 1

Голотурия Cucumaria japónica 19

Голотурия Psolus eximius 12

Голотурия Psolus regalis 9

Офиура Opheopholis aculeata 6

Офиура Gorgonocephalus caryi 17

Морская звезда Plerasîer tesselalus I

Морская звезда Henricia espera 16

Морская звезда Henricia sp. 19

Морская звезда Ceromaster 30

patagonicus

111 Морская звезда Lethasterias 11

пап ¿mensis

Морская звезда Leptasterias fisheri 15

140 Морская звезда Crossasíer popposus 24

Морской еж Strongilocentroius sp. 3

Креветка Kualus japónica 14

Креветка Spirontocaris ochototensis 15

Неидентифицированные черви 12

1992, 1-5 11 35 Морская вода 30

июль Грунт 60

Водоросль Polysiphonia sp. 28

Водоросль Chondrus sp. 4

Водоросль Fucus evanescens 2

Водоросль Plylota sp. 1

Водоросль Talossiophylus cïatrum 3

160 4 Губка Geodia sp. 1

Губка Grantessa sp. 7

Губка Halichondria panicea 23

140 Неидентифицированные губки 20

Неидентифицированные асцидии 12

Неидентифицированные черви 6

Японское море 1985- 5-10 20 33 Морская вода 140

1992 15 Грунт 86

5-10 Моллюск Crenomytiüus grayanus 132

Моллюск Patinopecten jessoensis 13

Морская трапа Zoswra marina 14

Продолжение таблицы 1.

Район отбора Дата Глубина Темпера- Соле- Источники выделения Количество

проб (м) тура (°С) ность (%о) выделенных

нггаммон

Голотурия Stichopus japonicus 21

Морская звезда Asterias amurensis 7

Морская звезда Patina pectinifera 60

Морская звезда Aphelasterias 3

japónica

Морская звезда Distolasterias nippon 3

Тихий океан,

Коралловое 1988, 3-7 22 33 Морская вода 46

море июль

Грунт 43

Губка lotochroidae 13

Губка Dictioceratioia sp. 13

Губка Trachyopsis halichondroides 1

Губка Adelas sp. 12

Губка Veronidae 14

Губка Dysidea sp. 2

Голотурия Holothuria atra 24

Голотурия Actinopyga mauritiana 58

Голо1урия Thelenota ananas 10

Голотурия Holothuria sp. 17

Морская звезда Culcita novaequinea 22

Морская звезда Nardoa sp. 26

Морская звезда Fronia manilis 23

Неидентифицированные губки 79

Неидентифицированные иглокожие 12

Южно-Китай- 1989, 3 24 34 Грунт 11

ское море январь

Голотурия Holothuria atra 5

Рыба Tetraodon sp. 5

Острова Кука 1988, 7 24 35 Неидентифицированные губки 30

октябрь Голотурия Stichopus horrens 57

Индийский

океан

Сейшельские 1990, 15 24 36 Морская вода 25

острова июнь Грунт 41

Губка Aurora globusîellata 1

Губка Petrosia seriata 1

Неидентифицированная губка 11

Голотурия Holothuria sp. 61

Моллюск Pina sp. 5

Моллюск Plena sp. 14

Мягкий коралл Palythoa sp. 40

Неидентиифицированные черви 42

Красное море 1990, 140 26 38 Морская вода 11

июнь Грунт 14

Рыба 3

Нендентифицированная губка 1

Атлантический

океан

Канарские 1990, 140 18 31 Грунт 3

острова май

Неидентнфицированный краб 16

Неидентифицированные черви 10

глюкозаминид. Планшеты с культурами и субстратом инкубировали при комнатной температуре до 24 часов. При положительном результате развивалась желтая окраска, интенсивность которой оценивали по трехбалльной шкале. Активность а-Гал и а-ГалИАц определяли по количеству образующегося в процессе ферментативной реакции п-нитрофенола при использовании хромогенных субстратов р-нитрофенил-a-D-галактопиранозида и /ыштрофенил-М-ацетил-а-О-галактопиранозида, соответственно. Зафиксированные глутаровым альдегидом эритроциты смешивали с раствором гликозидазы и после 24 ч инкубации с перемешиванием при 2б°С отмывали забуференным физраствором рН 7.3 и смешивали с соответствующими сыворотками. После 1 часа инкубации при комнатной температуре производили определение агглютинирующей способности таких абсорбированных сывороток. Агглютинационные тесты осуществляли на 96-круглолуночных планшетах в серии двойных разведений нормальной и/или абсорбированной ("истощенной") сыворотки (растворов антител) с помощью нативных эритроцитов, предварительно отобранных из нескольких образцов донорской крови. Для определения активности на групповых веществах крови (ГВК) раствор фермента в изотоническом фосфатном буфере, рН 7.3, инкубировали с ГВК, имеющими детерминанты А-, В- и Н-антигенов эритроцитов человека, в течение 24 ч при 26°С с последующим проведением реакции гемагглютинации в стандартных планшетах для иммунологических реакций по методу Кабата (Kabat, 1956). Чувствительность к антибиотикам определяли методом дисков, импрегнированных следующими антибиотиками: канамицин (10 мкг), ампициллин (10 мкг), бензилпенициллин (10 мкг), стрептомицин (Юмкг), эритромицин (15 мкг), гентамицин (10 мкг), оксациллин (20 мкг), линкомицин (15 мкг), ристомицин (25 мкг), рифампицин (25 мкг), неомицин (25 мкг), цефалоридин (10 мкг), полимиксин В (25 мкг). Пигменты были экстрагированы из клеток метанолом, спектры абсорбции определяли между 250 и 700 нм (спектрофотометр Specord М40). Электронные фотографии негативно окрашенных клеток были выполнены с помощью электронного микроскопа Zeiss ЕМ 10 СА (80 KV). Образцы были приготовлены, используя 1.25%-ный уранилацетат. Содержание Г+Ц оснований в ДНК определяли по методу Мармура и Доти (Marmur, Doty, 1962). Анализ метиловых эфиров жирных кислот был выполнен при помощи газо-жидкостной хроматографии, используя Supelcowax 10 column, 30 м х 0.25 мм, 210°С (Svetashev et al., 1995). Характеристика бактериального генома (genomic fingerprints) штамма A. latericius КММ 426т была выполнена с помощью техники амплифицирования ДНК (PCR-реакции) с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих двум типам повторяющихся межгеномных олигонуклеотидных последовательностей ERIC (Judd et al., 1993) и BOX (Versalovic et al., 1991). 16S рибосомальный ген был амплифицирован с использованием универсальных праймеров и секвенирован с помощью набора реактивов (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) и ДНК-секвенатора, модель Applied Biosystems 373A (Chun, Goodfellow, 1995). Сравнение полученных 16S рДНК-олигонуклеотидных последовательностей с аналогичными последовательностями близкородственных бактерий, депонированных в Банке генетических данных (GenBank), получено с помощью компьютерной обработки.

Филогенетическое древо было построено с использованием стандартных филогенетических методов (Fitch, Margoliash, 1967; Saitou, Nei, 1987). Матрицы эволюционного родства были получены на основе алгоритма Джукса и Кантора (Jukes, Cantor 1969). Программа PHYLIP (Felsenstein, 1993) была использована для выяснения окончательной некорневой топологии. Нуклеотидные последовательности 16S рибосомального гена штамма Arenariobacter latericius КММ 426'1' были депонированы в Банке генетических данных (GenBank) под номером AF052740.

Результаты и обсуждение

Таксономические исследования и характеристика особенностей распространении штаммов-продуцентов гликозидаз в различных районах Мирового Океана.

Штаммы-продуценты а-Гал и а-ГалКАц встречались почти во всех районах Океана. Наибольшее количество микроорганизмов протестировано на содержание этих ферментов среди изолятов Охотского моря (676 - на а-Гал и 184 - на а-ГалИАц), Японского моря (501 и 496, соответственно) и Индийского Океана в районе Сейшельских островов (267 и 106 штаммов ). В соответствии с этим выделено и большее число изолятов-продуцентов а-Гал (263, 161, 77), a-NAcfan (25, 92, 24 ) в Охотском, Японском морях и Индийском океане, соответственно. В целом, 28 % (562) из 2008 синтезировали а-Гал и в меньшей степени а-ГалЫАц - 19% (163) изученных штаммов.

В Охотском и Японском морях микроорганизмы, синтезирующие а-Гал, составляли 39 и 32%, почти в два раза меньше встречаются продуценты а-ГалКАц (14 (25) и 19% (92), соответственно). В более теплых водах, вблизи островов Кука, в ЮжноКитайском море, у Сейшельских островов количество продуцентов этих ферментов заметно снижалось (29% (77) и 23% (24). 9,5% (2) и 14% (3) в Индийском океане у Сейшельских островов и Южно-Китайском море. Следует отметить, что в Тихом океане у островов Кука почти половина изолятов продуцировала и а-Гал и а-ГалИАц, тогда как в Атлантике у Канарских островов до 73% (11) изолятов синтезировали а-Гал, а продуцентов а-ГалЫАц там обнаружено не было.

Пятнадцать процентов (301) штаммов, ассоциированных с животными, синтезировало а-Гал и 12% (103) - а-ГалКАц. Продуценты названных ферментов гораздо более редки среди симбиотрофов водорослей (2% (40) - а-Гал, 1% (9) - а-ГалЫАц). Среди свободноживущих микроорганизмов воды и грунта наиболее распространены штаммы, синтезирующие а-Гал (6% (120) и 5% (100), соответственно). Еще более редки бактерии, показавшие a-N-ацетилгалактозаминидазную активность (4% (34) и 2% (17), соответственно).

Доминирующими группами микроорганизмов, как и следовало ожидать, (табл. 2) были грамотрицательные бактерии родов Pseudoalteromonas и Vibrio. Доминирование представителей семейства Vibrionaceae уже было отмечено ранее среди микробных ассоциаций мидии, крабов, прибрежных рыб, тогда как доминирование грамотрицательных неферментирующих бактерии родов Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Flavobacterium - среди свободноживущих микроорганизмов (Stanier et al., 1966; Baumann et al., 1972; Михайлов и др., 1988; Austin, 1988; Иванова и др., 1992). Из грамположительных бактерий, выделенных нами, бактерии родов Bacillus, галотолерантные виды которого постоянно выделяются из морской среды (Иванова, Михайлов, 1992), и Corynebacterium составляли значительное количество микробных сообществ.

От 25 до 75% псевдоапьтеромонад, выделенных из проб воды Охотского моря, проб грунта, животных и водорослей Японского моря, продуцировали а-Гал. Способность синтезировать а-ГалЫАц отличала псевдоальтеромонады из животных Японского моря и Атлантического океана, проб воды и грунта Индийского океана.

Аналогичным образом представлено распределение штаммов-продуцентов изучаемых ферментов среди бактерий рода Vibrio. Пятьдесят процентов (6) вибрионов из животных и проб грунта Охотского моря продуцировали а-Гал. Среди вибрионов из воды Японского моря и Индийского океана, а также симбионтов животных Японского моря и микроорганизмов грунта Охотского моря часто встречались продуценты а-NAuTan. Следует отметить, что среди вибрионов из воды Индийского океана довольно много продуцентов как а-Гал, так и а-ГалЫАц.

Бациллы, обитающие во всех бассейнах Мирового океана, также отличались способностью синтезировать а-Гал. Много продуцентов а-Гал выделено из бацилл, изолированных из проб воды, грунта и животных Охотского моря, а также

Таблица 2.

Систематическое положение и количественное соотношение штаммов, _синтезирующих а-галактозндазы и сс-М-ацетилгалактозамипидазы_

Систематическое положение а-Гал а-ГалЫАц

Acinetobacter 74 39

A eromonas 15 7

Pseudoaileromonas 451 321

Arihrobacter 25 7

Bacillus 372 85

Corynebacterium 183 53

Haiomonas 98 43

Enterobacter 23 6

Flavobacterium 60 23

Flexibacter-Cytophaga 4 3

Micrococcus 145 70

Photobacterium 59 8

Pseudomonas 53 23

Rhodococcus 14 7

Vibrio 322 106

He идентифицированы 110 54

ассоциированных с животными Японского моря и свободноживущих в воде Индийского океана.

Бактерии рода СогупеЬааегшт, содержащие такие ферменты, были немногочисленны. Тем не менее можно выделить группу коринебактерий, ассоциированных с животными Охотского моря, среди которых было найдено около 40% (22) - продуцентов а-Гал, тогда как в Индийском океане обнаружено только 18,7 % активных штаммов.

Псевдоальтеромонады, выделенные из воды и водорослей Охотского моря, воды и животных Японского моря, вибрионы, ассоциированные с животными Охотского моря, и выделенные из грунта и воды Японского моря, бациллы и коринебактерии Охотского моря, Индийского океана, ассоциированные с животными, синтезировали а-Гал. а-ГалЫАц синтезировались псевдоальтеромонадами водорослей Охотского моря и животных Японского моря и Атлантического океана, вибрионами и бациллами животных Японского моря и вибрионами грунта Японского моря.

Распространение а-галактозидаз, а-Ы-ацетилгалактозамшшдаз у штаммов, ассоциированных с некоторыми видами морских животных и водорослей Тихого океана

Источник выделения Общее кол-во штаммов Количество активных штаммов

а-Гал а-ГалЫАц

Охотское море

Водоросль Ро1у$1рЬота 5р 34 31 (91,2)* 6(17,6)

Водоросль СЬопдгш 5р. 29 18(62,1) 2 (6,9)

Губка НаНсИопЛгш рапкеа 13 8(61,5) 4 (30,8)

Губка 1Ыойепс1гота ер. 7 4(57,1) 1 (14,3)

Неидентнфицированные губки 31 12(38,7) 4(12,9)

японское море

Моллюск Сгепотуи1ш grayanus 149 62 (41,6) 48 (32,2)

Голотурия ^ккоризуаротсш 21 5 (23,8) 3(14,3)

Морская звезда Ра иг ¿а рес1Ш/ега 61 8(13,1) 10(16,4)

Острова Кука Голотурия $искориз коггепз 48 19(39,6) 21 (43,7)

* - % от всех штаммов каждого животного.

В ходе эксперимента мы проанализировали около 100 микробных популяций морских животных и растений, а также воды и донных осадков. Таксономический состав микробных ассоциаций, показанный на примере голотурии 5Ис1горш Иоггею, водоросли Ро1уз1рИота ер., популяций свободноживущих микроорганизмов - на примере штаммов бактерий, выделенных из морской воды, отражает доминирование грамотрицательных бактерий (рис. 1). Наиболее интересные данные по распространению изучаемых ферментов среди их представителей показаны в таблице 3.

Не идентифицированные

"' АКеготопаз-подобные

29%

^до^ Аапе1оЬас1ег

Коринеформы ^

8% Рэеидотопаз На1отопаз

7% 8%

АЬсагсНа Шгю 3%

-, ,_^^Д/(еготопа5-подобные На1отопаз 42%

Не идентифицированные Flavobacteriaceae 9% 6%

Коринеформы,.

\Zibrio

4% 11%

ВасШиз 15%

Не идентифицированные Меготолаз-подобные

7% Мюгососсиз 61%

2%

в

Рисунок 1. Таксономический состав микроорганизмов, выделенных из голотурии ЗЧИориБ Иоггет (А), водоросли Ро1у51рИота эр. (Б), морской воды (В).

Заметим, что свыше 90% (31) микроорганизмов, ассоциированных с водорослью Polysiphonia sp., 57% (4) - 62% (18) микроорганизмов, ассоциированных с губками из Охотского моря синтезировали а-Гал. Заслуживают внимания микробные популяции голотурии Stichopus horrens, собранной в районе островов Кука, в отличие от всех других микробных ассоциаций, почти 44% (21) симбиотрофных бактерий этой голотурии синтезировали a-TanNAn.

Таким образом, проведенные исследования позволили оценить способность морских микроорганизмов из различных систематических групп, преимущественно ассоциированных с такими гидробионтами, как голотурии, губки, моллюски, синтезировать а-Гал и а-ГалКАц. Отдельные штаммы были отобраны как перспективные продуценты а-Гал и а-ГалЫАц для дальнейших исследований.

Таксономическая и филогенетическая характеристика штамма КММ 426 - продуцента cx-N-ацетилгалактозамшшдазы.

Из проб песчанного грунта, отобранных с глубины 20 м у о. Ку-Лао-Ре (Вьетнам), был выделен штамм бактерий КММ 426. Организм является грамотрицательной, аэробной неподвижной палочкой (0.4-0.6 х 3-5 мкм) (рис.2).

Рисунок 2. Электронная микрофотография Arenariobacter latericius КММ 426т (х 10 000).

На морском агаре и глюкозопептонной среде бактерии образуют круглые гладкие блестящие колонии темно оранжевого цвета 2-3 мм в диаметре; не образуют эндоспор, не аккумулируют поли-р-гидро-ксибутират в качестве внутриклеточного резервного продукта, не имеют аргинин-дегидролазной системы; оксидазо-, каталазо- и фосфатазоположительны и требуют Na+ или морскую воду для роста. Рост наблюдается на среде, содержащей от 1% до 7% NaCl при температуре от + 10°С до +37°С, с оптимумом роста при 8°С. Рост культуры не обнаружен при 4°С и при 42°С. Бактерии развиваются в среде со значениями pH от 6.5 до 12.0, с оптимумом роста при 7.5-8.5, не гидролизуют агар-агар, крахмал, альгинат, желатин, целлюлозу и эластин; продуцируют хитиназу, ДНКазу, а-Гал, а-ГалИАц (табл. 4). Спектры утилизации 95 источников углерода были определены с помощью тест-систем, разработанных Biolog Inc. (USA) для грам-отрицательных микроорганизмов. Штамм КММ 426 чуствителен к эритромицину, ампициллину, линкомицину, ристомицину, рифампицину, цефалоридину и полимиксину В. Организм продуцирует каротиноидные пигменты с пиками волн спектров абсорбции 338 нм, 408 нм, 434 нм, 459 нм, 488 нм. Флексирубин не был

обнаружен. Жирнокислотный состав клеток штамма КММ 426 в основном представлен разветвленными насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами (табл. 5). Некоторые жирные кислоты не удалось идентифицировать. Содержание Г+Ц оснований ДНК для штамма КММ 426 - 42.4±0.4 моль%, согласно методу термальной денатурациии.

Таблица 4.

Основные фенотнпические характеристики Arenariobacter lutericius

Характеристики A. latericius

КММ 426т

Наличие жгутиков -

Оксидаза, каталаза +

Потребность в Na+ для роста +

Потребность в органических факторах роста

Аргннин-дегидролаза

Денитрификация

Продукция индола

Фенилалашш-деаииназа

Протеолитическая активность

Продукция::

агаразы, амилазы, желатиназы, цсллюлазы -

хнтиназы, ДНКазы, щелочной фосфатазы, а- +

галактозидазы, a-N-ацетилгалактозамииндазы

Рост при:

10°С, 28°С, 37°С +

Рост при:

1%, 3%, 5%, 7%NaCl +

Утилизация:

мелибиозы, цитрата, трегалозы -

глицерина, лактозы +

L-аргинина, L-тироэина +

Чувствительность к антибиотикам:

канамишш (30fig) -

ампициллин (10pg) +

беизнлпеиицшишн (lOfig) -

стрептомицин (lOpg) -

эритромицин (15fig) +

гентамицин (lO^lg) -

оксациллин (20|ig) -

линкомицин (15^ig) +

ристомицин (25 ng) +

рифампицин (25 pg) +

иеомицин (25 pg) -

цефалоридин (10 ng) . +

полимиксин В (25 pg) +

Состав жирных кислот АгепагюЬасгег Шепсшз КММ 426т

Жирные кислоты АгепагюЬас1ег \atericius

КММ 426т

Насыщенные кислоты

13:0 0.07

14:0 1.03

15:0 13.26

16:0 3.30

17:0 0.18

18:0 0.10

17.96

Разветвленные насыщенные кислоты

¡13:0 0.30

а13:0 0.13

¡14:0 0.17

а14:0 0.17

¡15:0 17.26

а15:0 6.60

¡16:0 0.92

а16:0 0.13

¡17:0 0.75

а17:0 0.28

26.71

Ненасыщенные кислоты

14:1 0.15

15:1(п-8) 0.76

15:1(п-б) 2.33

16:1(п-7) 10,96

16:1(п-5) 0,34

17:1(п-8) 0,57

17:1(п-6) 1,23

16,34

Разветвленные ненасыщенные кислоты

¡15:1 19,27

а15:1 1,73

¡16:1 0,32 а16:1

¡17:1 5,79

а17:1 0,56

27,67

_Сумма_88,66

Анализ морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических признаков позволил идентифицировать изолят как представителя семейства ЛатЬасгепасеае, обладающего некоторыми специфическими признаками, отличающими его от других описанных ранее бактерий этого семейства.

Для установления филогенетических связей и точного таксономического положения штамма КММ 426 было проведено секвенирование 16Б рибосомального гена. Филогенетический анализ подтвердил генетическое родство изучаемого организма с

-E.coli

-Microscilla arenaria ATCC 23161T

- -Flectobadllus major ATCC29496T

-Microscilla marina ATCC23134T

-Microscilla furvescens ATCC23129T

-Microscilla sericea ATCC23182T

-:-Cytophaga lermentans

-Microscilla aggregans subsp. catalatica ATCC23190T

. - Flectobadllus glomeralus ATCC43844T

- Flexibacter maritimus ATCC43398T

LCapnocytophagacanimorsus ATCC35979T

Capnocytophaga cynodegmi ATCC49044T

-Cytophaga lytica ATCC23173T

-Arenariobacter latericias KMM Í26T

-Cytophaga uliginosa ATCC14397T .

p Psychroserpens burtonensis ACAM167

- Psychroserpens burtonensis ACAM188 •

L РэусЬгозефепз burtonensis ACAM181

r GeiidibacteralgensA374

Geiidibacter algens A296

Geiidibacter algens C8ST5

-Cytophaga marinoflava ATCC19326T

-Flavobacterium gondwanense DSM5423T

-Flavobacterium salegens DSM5424T

-Cytophaga latercula ATCC23177T

_OI_

Рисунок 3. Филогенетическое древо, построенное на основании анализа олигонуклеотидных последовательностей 16S рибосомальных генов представителей группы Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides и Arenariobacter latericius KMM 426т. Масштаб: 10% нукпеотидных замен на позицию.

IS

представителями группы Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides, представленой пятью основными филогенетическими подгруппами: цитофагами, флавобактериями, сфингобактериями, сапроспирами и бактероидами (Gherna, Woese, 1992). Анализ показал, что штамм КММ 426 образует родственную, но отличную ветвь с уровнем гомологии олигонуклеотидных последовательностей от 80% и выше, что позволило (Fox et al., 1992) идентифицировать данный микроорганизм как представителя нового рода группы Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (Woese, 1994).

Таким образом, штамм КММ 426 может быть включен в семейство Flavobacteriaceae и помещен в новый род Arenariobacter как Arenariobacter latericius sp. nov. (рис. 3).

Описание рода Arenariobacter gen. hoy.

Arenariobacter (A.re.na.ri.o.bac'ter. L. adj. arenarius dwelling on sand; M. L. n. bacter masc. equivalent of Gr. net. n. bakterion rod, staff; M.L. masc. n. Arenariobacter, pertaining to rod dwelled on sand where organism was isolated.

Rod-shaped cells with pearled or slightly irregular sides and rounded ends, are about 3 to 5 цт long and 0.4-0.6 цт. Nonmotile. Gram negative. Does not form endospores or resting stages. Does not accumulate poly-P-hydroxybutyrate as an intracellular reserve product, and does not have an arginine dihydrolase system. Colonies are circular, low convex, shiny with entire edges on solid media containing high nutrient components. Colonics arc dark orange because of nondiffusible carotenoid pigments that gave main absorption peaks at 338 nm, 408 nm, 434 nm, 459 nm and 488 nm. Flexirubin pigments arc absent. Requires Na+ ion or seawater for growth. Growth occurs in media containing 1% to 7% of NaCl. The temperature range is from 10°C to 37°C, with optimum growth occurring at 28 °C. The pH values range from 6.5 to 12.0, with optimum growth occurring at 7.5-8.5. Strictly aerobic. Chemorganotroph. Cytochrome oxidase, catalase, and alkaline phosphatase positive. Does not decompose agar-agar, starch, alginate, gelatin. Produces chitinase, DNAase.

The major polar lipid is phosphatidylathanolamine. Sphingophospholipids are absent. The predominant cellular fatly acids odd-numbered, ¿jo-branched (about 70%), 16:0,16:l(n-7), 18:0, 18:l(n-7) in minor quantities.

The G+C content of the DNA for the strain KMM 426 was 42.4±0.4 (as determined by thermal denaturation method). Phylogeneticallly is a member of the family Flavobacteriaceae.

Contains one species, Arenariobacter latericius, whose type strain is strain KMM 426.

Characteristics of the type species are the same as the characteristics of the genus.

Описание вида Arenariobacter latericius gen. nov., sp. nov.

la.te.ri'.ci. us. L. masc. adj. latericius, dark orange bricken colour; ML masc. adj. latericius of dark orange bricken colour.

Description as for the genus plus the following. No growth is detected at 4°C and at 42°C. Alkalitolerant. Proteolytic activity is absent. Produces a-galactosidase, a-N-acetylgalactosidase. Utilizes a-D-glucose, L-glutamic acid, L-ornithine, uridine, glycerol, D, L-a-glycerol phosphate, glucose-l-phosphate, glucose-6-phosphate. Does not utilize tween 20, tween 40, tween 60, tween 80, a-cyclodextrin , adonitol, L-arabinose, D-arabitol, ¡'-erythriol, L-fucose, /«-inositol, psicose, L-rhamnose, D-sorbitol, xylitol, methylpyruvate, mono-methylsuccinate, acetic acid, c/j-aconitic acid, citric acid, formic acid, D-galactonic acid lactone, D-galacturonic acid, D-gluconic acid, D-glucosaminic acid, D-glucuronic acid, a-hydroxybutyric acid, p-hydroxybutyric acid, y-hydroxybutyric acid.p-hydroxyphenylacetic acid, itaconic acid, a-ketobutyric acid, o-ketoglutaric acid, a-ketovaleric acid, malonic acid,

propionic, quinic acid, D-saccharic, sebacic acid, succinic acid, bromosuccinic acid, D-alanine, L-histidine, hydroxy- L-proline, L-leucine, L-phenylalanine, L-pyroglutamic acid, D, L-camitine, y-aminobutyric acid, urocanic acid, inosine, thymidine, phenylethylamine, putrescine, 2-aminoethanol, 2,3-butanediol.

Susceptible to erythromycin, ampicillin, cephaloridin, polymyxin B, lincomycin. Not susceptible to kanamycin, benzylpenicillin, oxacillin, neomycin, streptomycin, gentamicin, ristomicyn, rifampicyn.

The G+C content of the DNA is 42.4±0.4 mol%. Type strain is KMM 426 deposited in Collection of Marine Microorganisms (KMM) of the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia. Isolated from marine environment (sandy sediments). (International Journal of Systematic Bacteriology, в печати).

Штамм KMM 426 - продуцент уникальной a-N-ацетилгалактозамшшдазы.

Штамм бактерий, отнесенный к новому роду и виду данного рода Arenariobacter latericias KMM 426т отличался высокой удельной a-N-ацетилгалактозаминидазной активностью по /ьнитрофелил-Ь'-ацетил-се-В-галактозамшшду и субстратной специфичностью к антигенам эритроцитов А группы крови человека.

a-N-ацетилгалактозаминидазная активность была обнаружена в сырых клетках штамма КММ 426. Для получения ос-ГалЫАц штамм-продуцент выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): бактопептон (Difco) - 5.0, глюкоза - 1.0, К2НР04 . 0.2, дрожжевой экстракт (Difco) - 2.0, дистиллированная вода - 500 мл, морская вода - 500 мл; рН 7.8. Посевной материал штамма КММ 426 культивировали в колбах емкостью 250 мл, содержащие 50 мл ферментационной среды, в течение 24-30 ч при 25° С на качалке со скоростью вращения 150 об/мин до получения плотности 10^ клеток/мл. Полученным посевным материалом засевали колбы емкостью 1000 мл, содержащие 500 мл ферментационной среды того же состава. Ферментацию проводили в течение 24 ч при 25°С на качалке со скоростью вращения 120 об/мин. Затем биомассу отделяли от культуральной жидкости и экстрагировали дезинтегрированные клетки. Полученный экстракт подвергали ионообменной хроматографии на колонке с DEAE-Toypearl 650 M фирмы "Toya Soda" (Япония) (14 х 2.0), гельфильтрации и рехроматографии на DEAE-Toyopearl 650 M. В результате применяемой схемы очистки получают препарат фермента с удельной активностью 65 ед/мг белка и не содержащий примеси других гликаназ и гликозидаз.

Фермент имеет оптимум действия при рН 7.0-8.0, требуемый для проведения реакции трансформации эритроцитов человека группы крови А в О в щадящих эритроциты условиях. Фермент термостабилен: сохраняет 100% активности по р-нитрофенил-Ы-ацетил-а-П-галактозаминиду в течение 10-минутного прогревания при 50°С и рН 7,2. Молекулярная масса фермента составляет 84 кДа по данным гельфильтрации. Препарат a-TanNAn проявляет высокую активность в реакции ингибирования гемагглютинации с групповым веществом крови А, содержащем детерминанты, аналогичные А эритроцитам.

Таким образом, в результате проведенного скрининга обнаружен штамм морской бактерии - продуцент фермента, обладающего уникальной спрособностью инактивировать серологическую активность эритроцитов группы крови А, не требующий особых условий культивирования и дорогостоящих питательных сред. Из биомассы этой бактерии получен препарат фермента, способный удовлетворить технологическим требованиям, предъявляемым к условиям обработки эритроцитов: высокотермостабильный и имеющий оптимум действия при рН 7.2.

Фенотипнческие признаки РзеийоаНеготопаз ер. КММ 701

Характеристики Р$ехк1оа11еготоп№ ер.

КММ 701

Полярный жгутик +

Оксидаза +

Потребность в Иа+ для роста +

Потребность в органических факторах роста +

Аргинин-дегидролаза -

Денитрификация -

Продукция:

агаразы, хитиназы -

желатиназы, липазы, амилазы, эласгазы +

Рост при:

10°С, 28°С, 30°С +

37°С -

Рост при:

0.5% №С1 +

3%, 6%, 10% ЫаС1 +

15%ИаС1 -

Утилизация::

Б -Маннозы -

О -Глюкозы +

мальтозы -

Б -галактозы +

О -фруктозы -

О-арабинозы -

сахарозы

мелибиозы -

маннита -

сорбита -

цитрата -

глицерина -

Чусгвительность к антибиотикам:

капамицин (ЗОцё) +

ампициллин (Юцз) +

беизилпенициллин (10ц§) +

стрептомицин (Юцв) -

эритромицин (15щ>) +

генгамицин (Юцё) +

оксациллин (20^) -

полимиксин В (25|^) +

линкомицин (1 -

неомицин (25щ>) +

тетрациклин (30^) -

О/129 (250 -

Г+Ц состав ДНК 42.4

Штамм аэробных гетеротрофных бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 - продуцент а-галактозидазы.

Штамм бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 был выделен из пробы морской воды, отобранной у о. Парамушир (Курильские острова) во время 16-го рейса НИС «Академик Опарин». По своим фенотипическим признакам и филогенетическим свойствам штамм КММ 701 хорошо укладывается в описание рода Pseudoalteromonas (табл. 6). Но видовая принадлежность этого штамма до сих пор не определена, возможно он будет отнесен к новому виду псевдоальтеромонад.

а-Гал, выделеная из биомассы штамма КММ 701, способна инактивировать групповую специфичность В эритроцитов крови человека, удаляя а-1,3-связанные остатки гатактозы из гликопротеинов групповых веществ и эритроцитов группы крови В с превращением последних в вещества и эритроциты группы О, и не влиять на А эритроциты. Культивирование штамма-продуцента проводили на такой же питательной среде и при тех же условиях, которые описанны для штамма КММ 426, в течение 18 ч. до поздней логарифмической фазы. Последовательность процедур выделения и очистки а-Гал из клеток штамма КММ 701 включала экстракцию дезинтегрированной биомассы, ионообменную хроматографию на колонке с DEAE-Toyopearl 650 M, гельфильтрацию на колонке с сефарозой CL-4B и рехроматографию на DEAE-Toyopearl 650 M. В результате очистки получен препарат фермента с выходом 30% и удельной активностью 10 ед/мг белка, не содержащий сопутствующих гликаназ и гликозидаз. Фермент в течение суток стабилен при 20°С, имеет рН-оптимум 6.7-7.7, устойчив к действию NaCl, в 4 раза превосходит по эффективности действия а-галактозидазу из зеленых бобов кофе. Молекулярная масса фермента, по оценке с помощью метода гельфильтрации, составила 195 кДа. Выделенная из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 ct-Гал по своей относительной эффективности действия на групповые вещества крови и оптимуму действия в нейтральной области рН может быть весьма перспективной не только как биохимический исследовательский инструмент, но и как один из реагентов для получения унифицированных по ABO-специфичности донорских эритроцитов.

Получено положительное решение на выдачу патента РФ «Штамм морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 - продуцент а-галактозидазы».

Таким образом, крупномасштабный поиск бактериальных продуцентов а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз позволил нам охарактеризовать неизвестные ранее особенности распространения продуцентов гликозидаз. Например, микроорганизмы, продуцирующие a-галактозидазы, следует искать в бореальных областях Мирового океана, в то время как штаммы, синтезирующие a-N-ацетилгалактозаминидазы, с большей вероятностью можно обнаружить среди бактерий тропической зоны. Эти исследования явились частью того исходного материала, который лежит в основе изучения ресурсов микробного населения океана и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов.

Выводы.

1. Установлена таксономическая структура морских микроорганизмов, синтезирующих a-галактозидазы и a-N-ацетилгалактозаминидазы, на основании изучения 2008 бактериальных штаммов, выделенных из морской воды, донных осадков, морских растений, двустворчатых моллюсков, губок, иглокожих, ракообразных, рыб, морских червей и мягких кораллов, собранных в различных акваториях Мирового Океана. В результате проведенных исследований было обнаружено, что доминирующими группами микроорганизмов, продуцирующими гликозидазы, были грамотрицательные

бактерии родов Pseudoalteromonas и Vibrio-, среди грамположительных бактерий -представители родов Bacillus и Corynebacterium.

2. Выявлены особенности распространения морских микроорганизмов -продуцентов гликозидаз в различных акваториях Мирового Океана: бактерии, синтезирующие а-галактозидазы, чаще встречались в северо-западных районах Тихого океана, а продуценты a-N-ацетилгалактозаминидаз - в тропических областях; продуценты изучаемых ферментов преобладали среди бактерий - ассоциантов, но не среди свободноживущих микроорганизмов.

3. Получены штаммы морских микроорганизмов, продуцирующие уникальные ферменты, обладающие специфичностью к групповым веществам крови человека и удовлетворяющие требованиям биотехнологии: a-галактозидаза (К.Ф. 3.2.1.22) из штамма Pseudoalteromonas sp. КММ 701, модифицирующая эритроциты В группы крови человека в эритроциты универсальной группы О, и a-N-ацетилгалактоза.минидаза (К.Ф. 3.2.1.49) из штамма бактерий КММ 426, которая инактивирует иммунодетерминанты эритроцитов А группы крови, превращая их в эритроциты группы О.

4,Описан новый род бактерий семейства Flavobacteriaceae, Arenariobacter, представляющий отдельный филогенетический кластер в группе Flavobacterium-Cytophaga-Bacteroides. Описан новый вид Arenariobacter latericius КММ 426т.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Распространение a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских и пресноводных микроорганизмов. Микробиология, 1994, т. 63, в. 5, с. 847-853 (в соавторство).

2. Распространение в морских симбионтных ассоциациях микроорганизмов, продуцирующих физиологически активные вещества. Сб. научных трудов "Морская микробиология", 1995. Изд-во Дальневосточного ун-та, Владивосток (ред. И.Е. Мишустина), с. 9-14 (в соавторстве).

3. Поиск продуцентов a-галактозидаз среди морских бактерий рода Alteromonas. Прикл. биохим. микробиол., 1996, т. 32, № 6, с. 624-628 (в соавторстве).

4. Распространение морских микроорганизмов, продуцирующих ß-N-ацетилгалактозаминидазы, а-галактозидазы, a-N-ацетилгалактозаминидазы. Биология моря, 1998, т. 24, №6, с. 351-358 (в соавторстве).

5. Скрининг бактериальных a-N-ацетилгалактозаминидаз, преобразующих эритроциты группы крови А в группу крови О. Материалы II Дальневост. региональн. конф. с всероссийским участием Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке, 2729 апреля 1998 г., Владивосток, Дальнаука, 1998 г., с. 8 (в соавторстве).

6. Ферменты морских бактерий, инактивирующие специфичность эритроцитов. Тез. докл. научн. конф. ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". Владивосток, Дальнаука, 1998, с. 45-46 (в соавторстве).

7. Морская бактерия Flavobacterium sp. КММ 426 - продуцент a-N-ацетнлгалакгозаминидазы, преобразующей эритроциты группы крови А в эритроциты группы крови О. Ibidem, 1998 г., с. 74-75 (в соавторстве).

8. Comparative study of the distribution of a-galactosidases and a-N-acetylgalactominidases among marine microorganisms. Abstr. Intern. Sei. Conf. «Bridges of science between North America and Russian Far East». Anchorage, Alaska, USA, Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug. 29-Sept. 2,1994, p. 282 (в соавторстве).

9. Distribution peculiarities of the marine microorganisms producing chitobiases, a-galactosidases and a-N-acetylgalactosaminidases from different area of the World Ocean. Abstr. Intern. Conf. North Pacific Marine Sei. Org. (PICES) «Workshop on the Okhotsk Sea and adjancent Areas». Vladivostok, Russia. June 19-24, 1995, p. 43 (в соавторстве).

10. The Collection of Marine Microorganisms as a base for fundamental and applied studies in marine microbiology and biotechnology. Proc. Conf. Oceanology International 97