Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Альфа-галактозидаза Penicillium canescens 239 и Cladosporium cladosporioides 189

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Альфа-галактозидаза Penicillium canescens 239 и Cladosporium cladosporioides 189"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

л Л ■иі'

Маланчук Валентина Михайлівна

УДК 577.154.576.852+582

а-ГАЛАКТОЗИДАЗА PENICILLIUM CANESCENS 239 І CLADOSPORIUM CLADOSPORIOIDES 189

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів, Інститут мікробіолі вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, Заслужений науки України Захарова Ірина Яківна, Інсі мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НА!

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспон

НАН України, Малашенко Юрій Романович, Інсі мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного 1 України, завідувач відділом біології газоокислюї мікроорганізмів

доктор біологічних наук Костерін Сс Олексійович, Інститут біохімії ім О.В. Палладіна ] України, завідувач відділом біохімії м’язів

Провідна установа: Київський національний університет імені Та Шевченка, біологічний факультет, кафедра біохімії

Захист відбудеться “20” грудня 2000 року о 10 годині на засій спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і віру солоп Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболоть 154.

З дисертацією можна познайомитись у бібліотеці Інституту мікробіоло вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Забо ного, 154).

Автореферат розісланий “2Д ” листопада 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

Пуріш Л.К-

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальпість теми. а-Галактозидаза відноситься до надзвичайно великої >упи глікозид аз і здатна каталізувати гідроліз термінальних нередукуючих лишків a-D-галактози в оліго-, полісахаридах, а також складних глікокон’югатах, зиймаючи участь як в їх синтезі, так і їхній деградадії, завдяки чому фермент іедставляє безсумнівний науковий та практичний інтерес.

a-Галактозидаза може використовуватись в науково-дослідних роботах як »нкий інструмент для дослідження структури складних вуглеводвмісних ополімерів та контролю їх модифікації (Murakami, 1990), а також в біотехноло-чних процесах нового типу, що відзначаються екологічною чистотою та :ономічністю. Так, в харчовій промисловості, зокрема в цукровому виробництві, стосування ферменту для переробки меляси дозволяє підвищити вихід цукру на >-15 % та створює передумови для розробки безвідходної технології одержання тфу (Ganter et al., 1988). Обробка а-галактозидазою соєвих продуктів значно жращує їх якість та харчову цінність, що особливо важливо при використанні їх в аринниптві для відгодівлі молодняку, а також в якості харчових сумішей для гей, що знаходяться на безлактозній дієті (Sacai et al., 1987).

В останні роки інтерес до а-галакгозидаз значно зріс, завдяки виявленню у деяких них унікальної властивості - здатності відщеплювати детермінанту а-1,3-зв’язану ■галактозу від глікокон’югагів мембран еритроцитів типу В(Ш) з трансформацією танніх в універсальні донорські еритроцити 0(І)-тилу (Zhu et al., 1996). Таким чином, явилась реальна можливість створення універсальної донорської крові на основі оконверсії еритроцитів, що допоможе зняти гостроту проблеми своєчасного та іективного забезпечення хворих кров’ю певної групової специфічності. Особливо це туально дія України, де внаслідок Чорнобильської катастрофи значно зросла шсість захворювань крові та кровотворних органів, для успішного лікування яких, ряд з іншими методами, широко застосовуюється інфузійпо-трансфузійна терапія сенко, 1995).

Насьогодні в Україні відсутні препарати а-галактозидази. Комерційні іепарати ферменту одержують в США, Японії та Германії (фірми “Sigma”, lokkaydo toge”, “Boethringer Mannheim”) із зелених бобів кави та шляхом кробіологічного синтезу з використанням в якості продуцентів мікроміцетів із дів Absidia, Aspergillus, Mortierella, а також актиноміцету із роду Streptomyces та теробактерії E. coli. Але для трансформації еритроцитів донорської крові групи Ш) придатна лише а-галактозидаза із зелених бобів кави. Однак висока вартість епарату обмежує його використання, тому пошук нових більш доступних і іективних джерел високоспецифічних а-галакгозидаз є актуальним.

Зв'язок робота з науковими програмами, планами, темами. Робота конана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту кробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного в рамках проведення досліджень за

темами: “Изучить структурные и внеклеточные гликополимеры и ферме микробной клетки с целью создания новых подходов хемосистематики и разрабс новых биотехнологий" (1988-1992 гг., № гос. рег. 0.188.0.052916). “Вивче молекулярних механізмів функціонування гліхополімерів і карбогідраз, розрс біотехнологій препаратів для практичного застосування” (1993-1997 рр, 07/11).

Мета і завдання дослідженая. Метою даної роботи було одерж високоочгацених препаратів а-галактозидази, дослідження їх фізико-хіміч властивостей, специфічності і механізму дії та розробка наукових основ їх пракгачі застосування. У відповідності з поставленою метою передбачалось виріпк наступних завдань:

- скринінг активних продуцентів а-галактозидази;

- розробка оптимальних умов біосинтезу, виділення та очистки ферменту;

- дослідження фізико-хімічних властивостей, специфічності та механізму а-галактозидази;

- створення наукових основ практичного застосування фермент препаратів.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше а-галактозидазна активність (0,12-1,7 Е/мл культуральної ріда виявлена серед міхроміцетів, що належать до родів Acremonium, Alterne Cercosporella, Chaetomium, Curvularia, Eurotium, Fusarium, Gliocladi Paecilomyces, Stachybotrys, Stemphylium, Torula.

2. Вперше в Україні знайдено високоефективні продуценти позаклітинної галактозидази Pénicillium canescens 239 та Cladosporium cladosporioides 189 розроблено наукові основи одержання високоочшцених та конкурентноздат препаратів ферменту. Встановлена глікопротеїнова природа а-галактозізд вперше у вуглеводному компоненті ферменту виявлено арабінозу та рамнозу.

3. Вперше для грибних а-галаюгозидаз встановлена здатність ферменту і-canescens 239 відщеплювати детермінанту а-1,3-зв’язану D-галактозу глікокон’югатів мембран еритроцитів типу В(ІІІ) з трансформацією останні еритроцити 0(І)-тнпу.

4. Вперше для грибних а-галактозидаз в активному центрі ферменту виявл електрофільно-нуклеофільну систему - імідазольну групу гістидину і карбоксил групу аспарагінової кислоти та запропоновано гіпотетичний механізм дії фермені

Практичне значення одержаних результатів. а-Галактозидаза P. canesc 239, завдяки високому рівню активності та здатності знімати грулосгіецифічи еритроцитів донорської крові груш В(ІП) шляхом відщеплення детермінангноі

1,3-зв’язаної D-галактози від глікокон’югатів мембран еритроцитів типу В(Ш перспективною для використання в практичній гематології з метою створе; універсальної донорської крові на основі біоконверсії еритроцитів.

з

Висока ефективність препаратів а-галакгозидази Р.сстезсет 239 та сісиіозрогіоійех 189 при гідролізі важкозасвоюваних галактоолігосахаридів афінози та стахіози) соєвого молока до простих цукрів (галактози і сахарози) ізволяє рекомендувати їх для використання в харчовій промисловості, зокрема для іготовлення соєвого молока поліпшеної якості. Розробка інструктивно-методичних комендацій для виготовлення такого молока шляхом ферментативного гідролізу, ладення науково-технічної документації (ТУ і ТІ) на препарат а-галактозидази Р. пехсет 239 та проведення його медико-біологічних досліджень, а також іержання дозволу Міністерства охорони здоров’я на застосування препарату в рчовій промисловості - все це створює передумови для впровадження в Україні івітніх технологій одержання високоякісних продуктів із сої, зокрема продуктів кувально-профілактичного призначення.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального ітеріалу, викладеного в дисертації, отримана автором особисто. Дослідження дії а-пактозидази Р.сапеясет 239 і С. сІа^рогіоШея 189 на еритроцити В(ПІ)- типу ійснено за участю к.м.н. Р.А. Кульмана (Гематологічний туковий центр РАМН, Москва, Росія ). Медико-біологічні дослідження препарату а-галакгозидази сапезсепз 239 проведено спільно з к.г.н. Ятченко О.О. та к.б.н. Хіміч Т.Л. (УкрНДІ рчування МОЗ). Постановка завдань та обговорення одержаних результатів 'вводились за участю к.б.н. Буглової Т.Т., за що автор висловлює Ш щиру ячність. Окрему подяку автор висловлює співробітникам відділу систематики кроміцетів ІМВ НАНУ к.б.н. Еланській 1.0 та к.б.н. Соколовій О.В. за допомогу у ігримці мікробіологічно “чистих” культур продуцентів а-галактозидази.

Апробація результатів дисертації Основні результати і положення дисертації повідались та обговорювались на конференціях фундаментальних досліджень лятуту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ (Київ, 1991,1993, 00); І Установчому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 93); Європейському симпозіумі з вуглеводів “ЕигосагЬ X (Ірландія, 1999)” Публікації. Основні результати досліджень опубліковані в 16 наукових працях, гих 6 статей в наукових журналах, 2 депоновані статті, 1 патент та 7 тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду гератури, викладу основних матеріалів і методів досліджень, дев’яти розділів асних експериментальних досліджень та їх обговорення, висновків, списку гератури, який включає 208 першоджерел (з них 152 іноземних), а також дев’яти датків. Загальний обсяг роботи становить 199 сторінок машинописного тексту, бота ілюстрована 49 рисунками і 31 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ РОЗДІЛ 1. Огляд літератури Складається із 7 підрозділів, в яких висвітлено питання поширенім та »логічної ролі а-галактозидази, а також деяких особливостей біосинтезу

ферменту; охарактеризовано основні метода виділення та очистки грибі позаклітинних а-галакгозидаз, розглянуто деякі фізико-хімічні властивості грибі а-галакгозидаз, іх субстратну специфічність. Проаналізовано літературні дані щ< функціональних груп активного центру ферменту та механізму його дії; розглшг деякі аспекти практичного застосування а-галактозидаз.

РОЗДІЛ 2. Матеріал» і методи

Об’єктом дослідження був позаклітинний фермент а-галактозвдаза (а-галактозид галактогідролаза КФ. 3.2.1.22). Продуцентами а-галактозидази б) мікроміцети Pénicillium canescens Sopp 16073 (239) і Cladosporiwn cladosporioù (Fres.) 16038 (189), одержані нами в результаті скринінгу ферменту серед 2( культур мікроміцетів, дріжджів та бактерій із музею ІМВ НАНУ.

Культивування P. ccmescens 239 і C. cladosporioides 189 здійснювали періодами способом в умовах качалок (п=160 і 220 об/хв) при температурі 28° ± Io С оптимізованих нами середовищах А і Б відповідно, наступного складу (г/л): сої борошно - 20; сечовина - 0,4; (NH^SQt -0,5; КН2РО4 - 2,5; СаС12 - 0,6; MgS04- 1 дріжджевий автолізат - 4,0 (середовище А): соєве борошно - 30; сечовина - С (NH4)2S04 -2,5; КН2РО4 - 5,0; СаС12 - 0,6; MgS04 -2,5; дріжджевий автолізат - 4,0, pH ; (севедовише Б).

Оптимізацію живильного середовища та умов культивування здійснювали допомогою методів математичного планування експериментів поеташ відсіювального експерименту, дробового факторного експерименту, стрімке сходження і повного факторного експерименту (Максимов, 1969).

При визначенні а-галакхозидазної та інших глікозидазних активно« використвували відповідні синтетичні субстрати: п-нітрофеніл-а-О-галакто ранозид (n-НФГ) фірми “Sigma”, п-НФ-р-О-галактопіранозид (“Sigma”), n-НФ-а і D-глюкопіранозид (“Sigma”), п-НФ-а-Б-фукозид (Koch-Light”), п-НФчх-ацетилгалакгозамінід (“Serva”), п-НФ-З-К-ацегалгалактозамінід (“Koch-Light”), НФ-а- і ß-N-ацегилглюкозамінід (“Koch-Light”). Ступінь гідролізу нітрофенільн субстратів визначали колориметричним методом (Chaplin, 1986).

При визначенні а-галакганщазної активності з використанням природа субстратів, кількість глюкози (еквівалентна кількості галактози), вивільненої внаслід гідролізу мелібіози, визначали глюкозооксидазним методом (Билай, 1973); кількіс галактози, що утворилась внаслідок гідролізу рафінози - методом Somogyi (1952).

Інвертазну активність визначали за допомогою глюкозооксидазного мето (Cruz, 1982).

За одиницю активності а-галактозидази та інших глікозидаз прийнято та кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 мкмоля субстрату за хвилину стандартних умовах досліду (температура 37°С, pH 4,6).

Визначення протеолітичної активності здійснювали за методом Ансона модифікації Петрової (Петрова, 1966).

Ступінь гідролізу дисахаридів (Galal,2Gal, Galal,3Gal, GaIal,4Gal, ralal,6Gal) а-галактозидазою оцінювали за утворенням вільної галактози, яку ¡скачали на вуглеводному аналізаторі Biotronik LC-2000 (ФРГ).

Дію препаратів а-галактозидази на фіксовані глутаровим альдегідом зигроцити донорської крові груш В(ПІ) оцінювали за титром анти-В сироваток ісля виснаження їх В(ПІ)-еритроцитами, попередньо обробленими препаратами а-шактозидази (Кульман, 1986).

Визначення продуктів гідролізу соєвого молока здійснювали методом шкошарової хроматографії на сілікагелі KSK-2 в системі розчинників етилацетат-дтова кислота-вода у співвідношенні 3:1:1.

Білок визначали за методом Lowry et al. (1951). Визначення вмісту нуклеїнових іслот здійснювали за методом Спірина (1958).

Для виділення та очистки а-галактозидази P. canescens 239 і С. cladosporioides 19 використовували осадження (NH^SCU при ЗО % та 90% насичення, ацидування і обробку МпСЬ, іонообмінну хроматографію на DEAE Тоуореагі 650 М TSK-гелі і гель-фільтрацію на Тоуореагі HW-55 TSK-гелі (“Toyosoda”, Японія), змогеїшість ферментних препаратів визначали методом диск-електрофорезу в 7,5 і ПААГі в 0,025 М трис-гліциновому буфері, pH 8,3 за методом Davis (1964). оелектрофокусування препаратів а-галактозидази проводили в борат-поліольній істемі за методом Троїцького (1982).

Вміст нейтральних цукрів в препаратах визначали за методом Dubois et al. 955). Ідентифікацію нейтральних моносахаридів здійснювали методом газо-динної хроматографії препаратів у вигляді ацетатів поліолів; обробку препаратів юводили згідно методу Albersheim et al. (1976); аналіз здійснювали на газовому юмагографі “Chrom-5” (ЧРСР).

Визначення амінокислотного складу а-галактозидази та вмісту в ній аміноцукрів юводали на амінокислотному аналізаторі LC-5001 (“Biotronic”, ФРГ). Суму залишків ісгеїну і цистіну визначали після попереднього окислення над мурашиною кислотою; іипгофан визначали після обробки тіогліколієвою кислотою (Дарбре, 1989).

Молекулярну масу а-галактозидази в нативній системі визначали методом ль-фільтрації на сефарозі 6В; в денатуруючій системі - на сефарозі CL-6B в іисутності 6 М гуанідин-НСІ (Дарбре, 1989).

Максимальну швидкість реакції і константу Михаеліса визначали за методом ійнуівера-Берка (Диксон, 1966). Енергію активації - за методом Арреніуса орншп-Боуден, 1979). При визначенні рК груп, що іонізуються у вільному :рменгі та в фермент-субстрагному комплексі застосовували метод Діксона 'иксон, 1966). Кінетичний аналіз даних по впливу іонів металів (Ag+ та Hg24) та ецифічних реагентів (п-хлормеркурібензоату, N-етилмалешіміду, йодацетміду) на галактозидазну активність здійснювали за методами Діксона та Лайнуівера-Берка ерезин, 1976). Імідазольну групу гістидину зондували диетилпірокарбонатом за

методом Miles (1978), карбоксильні груш амінокислот блокували толуолсульфонат-1-цшшогексил-3(2-морфоліноетил)карбодиімідом (СМЕ-карбо; імід) (Riehm et al 1966).

Результати дослідів статистично обробляли, використовуючи коефіцн Ст’юдента.

РОЗДІЛ 3. Скрвнінг позаклітинної а-галактозидази серед мікроорганізм різних тасономічних груп

В результаті скринінгу а-галактозидази серед 2600 культур мікроміцеї дріяаджів та бактерій із музею ІМВ НАНУ встановлено (табл. 1.), що галактозидазна активність найбільш поширена серед мікроміцстів (61 %), більшості родів, зокрема Fusarium та Cladosporium, вона виявлена впери Найбільш високий рівень а-галакгозидазної активності (0,5- 2,6 Е/мл) виявлено у штамів мікромідетів, що належать до родів РепісіИіит, Cladosporium, Aspergillu Fusarium.

РОЗДІЛ 4. Деякі фізіолого-біохімічні особливості продуцентів а-галактозидазн

Як показали наші дослідження, спектр глікозидазних активностей в культуралы рідині 20 штамів мікромідетів характеризується великим розмаїттям, в ньому виявле а- і ß-галактозидазну, ß-глюкозидазну, а- і ß-N-ацетилгалактозамінідазну, ß-ацетилглюкозамінідазну, інвертазну та фукозидазну активності. На основі анал спектру з 20 штамів було видібрано два штами продуценти P. canescens 239 і cladosporioides 189, які характеризувались досить високим рівнем а-галактозидазі активності (2,6 і 0,8 Е/мл відповідно) при відсутності інвертазної і фукозидазі активностей, що робить препарати, одержані із цих штамів, перспективними д використання в харчовій промисловості та медицині.

, Дослідження трофічних властивостей P. canescens 239 і C. cladosporioides 1 показало, що найбільш ефективним джерелом вуглецю для біосинтезу галактозидази е соєве борошно, в той час як моно- і олігосахариди виявляють різ дію на синтез ферменту в залежності від таксономічної належності культури, ода такі вуглеводи, як D-галактоза, L-арабіноза і лактоза в більшій мірі, ніж інші цук£ виступають в ролі індукторів синтезу а-галактозидази. Універсального джере азоту нами не виявлено, однак суміш сульфату амонію та сечовини у співвідноше* З : 2 є найбільш ефективною.

РОЗДІЛ 5. Оптіїмізація складу середовища та умов культивування

продуцентів

В результаті оптимізації умов біосинтезу а-галактозидази за допомогс математичних методів планування експерименту вихід ферменту в культуралы рідину P. canescens 239 і C. cladosporioides 189 збільшився в 2,2 і 6,8 разів і станові 4,5 та 5,5 Е/мл відповідно, що перевершує відповідний рівень більшості відомі насьогодні продуцентів а-галактозидази мікробного походження. Встановлено, і

шашка синтезу ферменту в оптимальних умовах періодичного режиму 'льтивуваїпш визначається родовою належністю культури: зазначений

иссимальний рівень активності ферменту із Р. сапеясет 239 і С. сШозрогіоШз !9 відмічено на 4-ту і 8-у добу відповідно.

Таблиця 1

:-Галактозидазна активність в культуральній рідині мікроміцетів, дріжджів і бактерій

а-Галактозидаза

Рід* Кількість штамів Активні** Максимальний

Абсолютна кількість в% рівень активності, Е/мл

Всього: 2600 935 35,9 2,6

МІКРОМЩЕТИ

сшмотим 17 6 33,3 0,14

ІТЕТШАМА 20 9 45,5 0,23

ЗРЕЯСИХШ 344 184 53,1 0,7

ЕйСОЗРОШЫА 2 1 - 0,09

'НАЕТОЫиМ 24 19 19,2 0,16

ІАООБРОтиМ 24 17 72,2 0,8

'ШУ1ЛАЫА 8 4 50,0 0,156

топим 12 5 41,6 0,155

ШАШШ 167 78 46,7 1,700

иосілоіим 8 3 37,5 0,175

юкштил 41 7 17,0 0,200

ЮЮЕРОЯА 3 2 - 0,14

AECILOmC.ES 13 2 15,3 0,12

ЕШС1ШШ 521 405 78,0 2,6

ТАСНУВОтУБ 9 7 77,7 0,135

тЕМРнтш 6 5 83,3 0,138

ОЯША 23 9 41,6 0,133

ЧІСНОТЖКШ 50 31 62,5 0,198

ВСЬОГО: 27 родів 148 види 1424 910 61,2 2,6

ДРІЖДЖІ

ІССНАЮтСЕБ 59 13 22,0 0,15

"тУАШотскБ 19 9 47,3 0,167

АШЮА 25 1 4,0 0,14

ВСЬОГО: 11 родів 33 види 155 23 14,9 0,167

БАКТЕРІЇ

тНЮВАСТЕІІ 127 2 1,5 0,120

ВСЬОГО: 3 роди 31 вид 668 2 0,56 0,12

имітки: * наведені тільки ті роди, у представників яких виявлено а-галактозцдазну активність;

** - кількість активних штамів в % розраховувалась тільки в тому випадку, коли досліджувалось на наявність ферментативної активності більше 5 штамів.

Отже, вперше в Україні одержано високоефективні продуценти галактозидази • Р. сапеясепя 239 і С. сісніоярогіоісіез 189 •

РОЗДІЛ 6. Виділення та очистка а-галактозидазн Р.сапезсет 239 і С('Іайойрогіоісіві 189 Для видалення та очистки а-галакгозидази використовували класичні мето білкової хімії: фракціювання сульфатом амонію, ацилування, іонообмін хроматографію та гель-фільтрацію (рис. 1).

І п

КУДЬТУРАЛЬНА РІДИНА. тям вчммкіь»Мігаііи

Супврішаяг

Фгвсткчшпді (NHQ; SOt ЗО г 90И амтеввЕ

ПРЕПАРАТ

а-ГАЛАКТОЗИДАЗИ

ЬюШафмпарф!

наДЕАЕТоуорягібЗОМ

TSK-reid

І ФРАКЩяГІ ІФРАКШЯ II І

Г«аЦйшір«ці* ваш Toysptail HW-S5 ТЖ-геяі

Хрсмиоірафіс ва ДЕАЕ Тоуоревгі 650 М TSK-mni

ПРЕПАРАТ и-ГАЛАКТОЗИДАЗИ Пягоц мпишісгь 294 Е/иг біда, _________ДИЙ27И___________

КУЛЬТУРАЛЬНА РІДИНА дшмяаіиІтМІйігВю

І- О“*

Оброби 0,02 ММоСІг

І СУПЕРНАТАНТ і

Осад Ь ГВдгаалеядідерНО

Осждюшш (NH<>2 SO4

SOKatwna

ПРЕПАРАТ

а-ГАЛАКГОЗИДАЗИ

ІпитоГалнттргюттоїрафц1 ва ДЕАЕ Tayopetd 650МТЖ-геиі

_L

ПРЕПАРАТ

a-ГАЛАКТОЗИДАЗИ

Гат-флиршдхш Tojrapcad HW-55 TSK-гвді -і.

ПРЕПАРАТ а-ГАЛАКТОЗИДАЗИ Питом» агагандсгь 24 ЕУмг GUna, __________Вигід 2.ІК_______

Рис І. Схема нидцісння та очистки о-гадакгозидази P. canescens 239 (І) і С. cladosporioides 189 (П). - -

В результаті проведених досліджень були одержані гомогенні, за даними дис електрофорезу в 7,5 % ПААГі та ізоелекгрофокусування в борат-поліольній систеї препарати а-галактозидази P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 з питоме активністю 294 і 24 Е/мг білка відповідно, яка на порядок перевершує акгавніс комерційних препаратів ферменту відповідного ступеню очистки, зокрема і галактозидази із зелених бобів кави, Aspergilltis niger і E.coli фірми “Sigma”.

Отже, вперше в Україні розроблено наукові основи одержання високоочшцені та конкурентоздатних препаратів а-галакгозидази P. canescens 239 і і cladosporioides 189.

РОЗДІЛ 7. Фізнко-хімічні властивості а-галактозндаза P.canescens 239 і C.cladosporioldes 189 Методом ектрофорезу в 7,5 % ПААГі встановлено, що одержані препарати а-шактозидази P. canescens 239 і C. cladosporioides 189 - глікопротеїнової природи із тіввідношенням білок : вуглеводи 6 : 1 і 11 : 1 відповідно. За даними ГРХ рглеводний компонент а-галактозидази із обох джерел містить ідентичні цукри, а іме, манозу, арабінозу і рамнозу. Ь аміноцукрів ідентифіковано глюкозамін. рабіноза і рамноза в складі а-галакгозвдази виявлені вперше.

Вивчення амінокислотного складу препаратів а-галактозидази P. canescens 239 С. cladosporioides 189 показало, що загальним для досліджуваних ферментів, як і и більшості грибних а-галактозидаз, є переважний вміст кислих амінокислот над ¡повними, та високий вміст гідрофобних амінокислот (до ЗО %).

За фізико-хімічними властивостями обидві а-галактозидази подібні до грменту із Aspergillus nidulans, Cephalosporium асгетопіит та Pycnoportis nnabarinus: це кислі високомолекулярні білки з ідентичною молекулярною масою, ;а становить 400 кДа та рі рівною б, 1 та 5,9 відповідно (табл. 2). Вони мають

Таблиця 2

Деякі властивості а-галактозидази

Препарати а-галакгозвдази

Властивості Р. canescens 239 С. cladosporioides 189 Aspergillus nidula-rts (Rios S. 1993) Cephalospori urn асгетопіит (Запроме-товаО, 1989) Pycnoporus cirmabarinus (Ohtakara Akira 1987)

Ізоелектрична точка, рі 6,1 5,8 6ß 4,96 5,5

Молекулярна маса (кДа) 400+1,0 400 ±2,5 370 240 210

Молекулярна маса мономеру №) 66,5 ± 1,0 66 ±1,5 87 - 52

Термооптимум гідролізу п-НФГ 50 50 50 40 75

Термооптимум гідролізу рафінози 40 50 - - -

рН-оптимум гідролізу п-НФГ 5,0 5,0 4,5-5,0 5,5 . 5.0 _

рН оптимум гідролізу рафінози 5,0 5,5-6,0 - 6,0

РН-стабільність 4,0-7,0 4,0-7,0 4,0-7,0 4.0-7.0 4,0-9,0

ігомерну структуру і складаються із 6 субодиниць з молекулярною масою 66 і ,5 кДа відповідно. Термо- та рН-оптимуми гідролізу синтетичного та природного бстратів знаходяться в типовій для більшості грибних а-галактозидаз області ачень і становлять 40 - 50° С та pH 5,0 - 6,0. Ферменти стабільні в широкому іпазоні значень pH від 4,0 до 7,0, однак для них характерна швидка інактивація и витримуванні препарату понад ЗО хв при оптимальній температурі. Висока

стабільність препаратів при зберіганні їх в забуференому розчині, або в ЗМ сульф; амонію при оптимальному значенні pH та температурі + 4°С, очевидно, пов’язані високим вмістом гідрофобних амінокислот та присутністю вуглеводне компоненту в молекулі ферменту.

РОЗДІЛ 8. Специфічність а-галактозидази Р.сапе$сет 239 і С.сШо$ротіоійе$ 189 Дослідження субстратно! специфічності а-галактозидази показало (табл. 3), і фермент із Р. сапеясет 239, як і більшість грибних а-галактозидаз, проявляє вузі специфічність відносно структури глікону, гідролізуючи тільки а-О-галактозцг Конфігурація біля СІ і С4 атомів субстрату, а також наявність замісників в С2 та С

Таблиц)

Субстратна специфічність препаратів а-галактозидази

1 Препарати а-галактозидази

Субстрат Структура Р. сапезсею 239 С. сіасіо.чропоісі: 189 '

Е/мг білка кт, мМ Утях Е/мг білка Кчо, мМ

п-Нітрофеніл-а-О-галактозид Оа1а1-п-НФ 333,0 1,0 34,00 0,76

І п-Нітрофшіл-Р-О-галактозид Сгаїрі-п-НФ 0 - 0 -

п-Нітрофеніл-а-Б-глюкозид йІсаІ-п-НФ 0 - 0 -

п-Нітрофеніл-0-О-глюкозид вІсРІ-п-НФ 0 - 5,31 0,91

п-Нітрофеніл-а-Б-фукозид РисаІ-п-НФ 0 - 0 -

і п-Нітрофеніл-М-Ас-а-О-галактозамінід (ММАсаІ-п-НФ 0 - 0 -

п-Нітрофеніл-ІЧ-Ас-р-О- галакгозамінід ваШАсрі-п-НФ 0 - 1,13 1,1

п-Нітрофеніл-Н-Ас-Р-І)- глюкозамінід ОІсИАсрІ-п-НФ 0 - 2,93 0,85

Мелібіоза Са1а1,даіс 10,0 4,0 1,60 1,70

Рафіноза С]а1а1,60ІсЄ1,2Рпі 7,2 5,7 3,30 2,20

Стахіоза Оаіа 1,6<3а1а1,601ср 1,2Рт 9,1 3,5 2,5 1,80

положенні є суттєвими для взаємодії з ферментом. На відміну від ферменту із сатзсеяу 239, специфічність а-галактозидази із С. сІасІозрогіоШь 189 віднос глікону більш широка: крім а-Б-галактозидів вона гідролізує Р-Б-глюкозиди, також нітрофенільні похідні аміноцукрів в Р-конфігурації.

За кінетичними параметрами, а саме, Кш для одних і тих же субстратів та V, їх гідролізу, досліджувані а-галактозидази значно відрізняються між собою (та£ З). Хоча і тут простежується загальна тенденція: як і більшість а-галакіозвд грибного походження, ферменти проявляють більшу спорідненість до синтетично субстрату і гідролізують його із швидкістю, яка на порядок перевершує швидкіс гідролізу природних субстратів - мелібіози, рафінози і стахіози. Очевиді:

инником цього є більш висока спорідненість ферменту до агліконової частини ингетичного субстрату.

Обидва препарати а-галактозидази, як і а-галактозидаза із зелених бобів кави, іроявляють широку специфічність відносно типу а-Б-галактозидного зв’язку, ідщеплюючи з різною швидкістю термінальну а-1,2-, а-1,3- і а-1,6-зв’язану В-алактозу в дисахаридах (рис. 2). Однак відомо, що здатність до гідролізу углеводних субстратів, що містять а-1,3-зв’язки, залежить від присутності озгалуженої структури з нередукуючого кінця субстрату, зокрема трисахариду їа1а1,3(Риса1,2)Са1, який, як відомо, с групоспецифічною детермінантою ритроцитів типу В(ІП).

СаІаІ.бСаІ

Рис. 2. Специфічність а-галактозидази відносно типу зв’язку .

Як показали наші дослідження на модельних системах - зашитих глутаровим іьдегідом В(ІП)-еригроцитах, а-галактозвдаза Р. сапеисет 239, подібно ферменту зелених бобів кави, здатна відщеплювати детермінантну а-1,3-зв’язану Э-їлакгозу від В-аіггигену на еритроцитах людини, про що свідчить незначне ііщення титру сироваток після їх виснаження В(ІИ)-еритроцитами, попередньо зроблених препаратами а-галактозидази (табл. 4). І навпаки, а-галактозидаза С. асІоярогіоИез 189, відщеплюючи а-1,3-зв’язану О-галактозу в дисахаридах, не діє і вказаний субстрат.

Отже, вперше для грибних а-галактозидаз встановлена здатність ферменту із сапезсет 239 відщеплювати детермінантну а-1,3-зв’язану Б-галактозу від [ікокон’югатів мембран еритрощггів тішу В(ІІІ) з трансформацією останніх в ііверсальні донорські еритроцита 0(І)-типу, що відкриває перспективи для користання препаратів ферменту в практичній гематології з метою одержання ііверсальної донорської крові на основі біоконверсії еритроцитів.

Таблиц

Титр сироваток після виснаження В(ЇЇІ) еритроцитами, обробленими препаратами а-галактозидази

Препарат Тигр виснаженої сироватки*

pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,3

а-Галактозидаза P. canescens 239 1:32 1:32 1:16 1:16

а-ГзлакгозидазаС. cladosporioides 189 0 0 0 0

а-Галактозидаза із зелених бобів кави (“Sigma”), США 1:64 1:64 1:64 1:64

Примітка. * - титр вихідної сироватки 1:64;

РОЗДІЛ 9. Дослідження функціональних груп активного центру а-галактозидази.

Для управління ферментативним процесом та зміщення реакції в напрям збільшення виходу цільового продукту необхідно було встановити механі каталітичної дії а-галактозидази. Важливим підходом до цього € іденгифікаї функціональних груп активного центру ферменту, які безпосередньо приймак участь в каталізі.

Аналіз кинетичних кривих залежності швидкості а-галактозидазної реакції і величини pH дозволив встановити наявність двох груп, що іонізуються в активно центрі а-галактозидази P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 з відповідай значеннями рК 4,0-4,1 і 5,3-5,4, які відповідають карбоксильній групі аспарагіної кислоти та імідазольній групі гістидину. Наявність в каталітичному центрі галактозидази карбоксильної і імідазольної груп підтверджують і знайдені на; величини теплоти іонізації цих груп.

Однак, одержані дані не є прямим доказом присутності цих груп в активно: центрі ферменту. Тому для більш точної ідентифікації функціональних груп і застосували інгібіторний аналіз ферментативної реакції з використанням іоі металів та специфічних хімічних реагентів.

Встановлено, що ЕДТА, азвд натрію та о-фенантролін не впливають швидкість ферментативної реакції (табл. 5), а це свідчить про те, що в каталізі, яки здійснює а-галактозадаза, не приймають участі функціональні груш, що містя атоми металу. Майже повне пригнічення а-галактозидазної активності іонами Hg" Ag+ може бути наслідком їх взаємодії, в першу чергу, із сульфгідрильний карбоксильними, або імідазольними групами ферменту.

Встановлений нами конкурентний характер інгібування а-галактозидази об препаратів іонами Ag+ при різних значеннях pH (табл. 6) та захисний ефект ] галактози на молекулу ферменту свідчать про те, що іони срібла зв’язуються функціональними групами, що знаходяться в активному центрі ферменту. Той фак

Таблиця 5

Вплив хімічних реагентів на активність а-галактозидази

Реагент Концент- рація реагенту, М pH ІНКуба- ЦІЇ Залишкова активність (в %) препаратів а-галакгозидази

P. canescens 239 С. cladosporioides 189

Контроль 0 4,6 100 100

ЕДТА 10'J 4,6 102,3 ± 1,1 98,5 ±1,0

О-фенантролін 10J 4,6 99,0 ±1,5 97,0 + 2,0 г

Азид натрію 10’J 4,6 110,8 ±3,5 99,0 + 1,7

2 х 10'2 4,6 100,0± 1,1 97,7 ±3,1

Диетилпірокарбонат 10'J 4,6 65,0 ±1,1 60,0 ±1,2

Ї0'2 4,6 39,0 ±1,2 29,0 ±1,3

СМЕ-карбодиімід 10'3 4,6 60,0 ±іа 63,0 ±2,0

5 x 10-i 5,0 35,0 ±1,0 32,0 + 1,1

5 x 10’3 6,0 62.0 ±1,3 65,0 ±1,4

5 x 10'3 7,0 86,0 ±1,4 80,0 ±1,5

п-ХМБ 10"4 4,6 10,0 ±1,1 9,0 ±1,0

10'3 4,6 0 0

Йодацетамід 10'j 4,6 9,0 ±1,0 10,0 ±1,2

N-етилмалеінімід 10’3 4,6 8,0 ±2,0 9,0 ±1,6

римітаа. Час інкубації ферменту з реагентом - ЗО хв.

) при збільшенні pH від 4,0 до 6,0 величина К, зменшується менше, ніж в 100 зів, свідчить про те, що іони срібла зв’язуються з такою групою в активному нтрі ферменту, яка депротонуєгься в межах pH 4,0 - 6,0 і має рК не вище, ніж 6,0, це може бути імідазольна група гістидину (рК 5,6 - 7,0). Зондування активного нтру а-галакгозидази P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 диетилпіро-рбонатом - високоспецифічним реагентом на імідазольні групи (табл. 5), яке изводить до інтенсивної інактивації ферменту з утворенням N-етоксиформіл-дазолу, підтверджує зроблений нами висновок.

Пригнічення а-галактозидазної реакції СМЕ-карбоксидиімідом (табл. 5), ичому більш інтенсивно в кислій області значень pH, свідчить про модифікацію в гивному центрі а-галактозидази карбоксильних груп.

Іони ртуті, а також такі сильні тіолові інгібітори як п-ХМБ, N-етилмалеімід і аацетамід майже повністю і миттєво інгібують активність а-галактозидази Р. са-icens 239 і С. cladosporioides 189 (табл. 5). Неконкуренгний характер інгібування •алактозидази іонами Hg+ і n-ХМБ (табл. 6) та відсутність захисного ефекту D-іактози на молекулу ферменту, а також кінетика реактивації пригніченого зменгу тіоловими реагентами - L-цистеїном, глутатіоном і р-меркаптоетанолом -

свідчать про те, що в молекулі ферменту, але не в його активному центрі, присуі БН-грули, які необхідні для прояву його активності.

Таблиц;

Характер і константи інгібування препаратів а-алактозидази

Ефектор pH інкубації Константа інгібування (КІ5 М) препаратів а-галакгозидази Характер Інгібування

Р. сапезсет 239 С. сШойротШскь 189

а8+ 4,0 3,3 х 10'5 3,6 х 10'5 конкуренти.

6,0 3,7 х 10* 4,3 х 10* -II-

не* 4,6 3,0 х 10'7 5,7 х 10-7 неконкуренга

п-ХМБ 4,6 2,8 х Ю* 4,7 х Ю"6 -II-

Галактоза 4,6 5,0 х 10‘2 1,5 х 10'2 конкурента

Примітка. Час інкубації ферменту з ефекгором ЗО хв

Таким чином, в результаті кінетичних досліджень та інгібіторного аналізу гапактозидазної реакції встановлено, що в активному центрі а-галактозидази сапевсет 239 і С. сІсиїоврогіоШез 189 знаходиться імідазольна група гістидину карбоксильна група аспарагінової кислоти. вН-грули не приймають участі каталітичному акті, і, очевидно, локалізовані поза активним центром фермені виконуючи функцію додаткових зв’язків, необхідних для орієнтації і зв’язувая потрібним чином молекули субстрату з активним центром ферменту, обумовлюю1 тим самим специфічність дії а-галакгозидази.

РОЗДІЛ 10. Механізм дії а-галактозидази

З огляду на вище викладене, а також з врахуванням особливостей гальмуван а-галактозидазної реакції продуктом реакції (Б-галактозою) та надлити субстрату (п-НФГ, мелібіозою), ми пропонуємо гіпотетичну схему механізму дії < галактозидази, згідно якої розщеплення а-галактозидного зв’язку відбуваєгь завдяки потужній електрофільній атаці імідазольної групи гістидину з рК 5,4 на С О зв’язок. Карбоксилат-іон з рК 4,1, внаслідок специфічної взаємодії інтермедіатом, стабілізує іон карбонію інгермедіату, захищаючи^-. його в нуклеофільної атаки з обох сторін, завдяки чому продукт реакції Б-галактоза м таку ж аномерну конфігурацію, що і субстрат.

Запропонована схема в цілому узгоджується із схемою “двохступеневог механізму дії а-галактозидази із солодкого мигдалю, запропонованою Беу і РгісШа (1977). Однак нами показано, що утворення іону карбоніл на проміжному етапі і обов’язково призводить до його рацемізації; конфігурація інгермедіату мої стабілізуватись за рахунок специфічної взаємодії інгермедіату з карбоксилат-іонс ферменту, як це було показано для а-галактозидази із кокосових горіхів (Беері 1987).

Отже, вперше для грибних а-галактозидаз запропоновано гіпотетичний еханізм дії ферменту. Однак взаємозв’язок між специфічністю та механізмом дії зсліджуваних а-галактозидаз з одного боку, та будовою і властивостями їх ставних центрів, з другого, в значній мірі лишається нез’ясованим і може бути редметом подальших досліджень як частини більш загальної проблеми яановлешм детермінант активності біополімерів.

РОЗДІЛ 11. Дослідження гідролізу олігосахарндів соєвого молока препаратами а-галактозидазн.

Оскільки нами встановлено, що обидва препарати а-галактозидази ззщеплюють а-1,6-зв’язки, досліджувалась здатність препаратів гідролізувати іжкозасвоювані а-1,6-галактоолігосахариди соєвого молока - рафінозу та стахіозу метою покращення якості останнього. .

Методом тонкошарової хроматографії встановлено, що обидва препарати дролізують зазначені олігосахариди до простих цукрів - галактози та сахарози, даному інтенсивність гідролізу а-галактозндазою із C. cladosporioides 189 вдвічі льша, порівняно із ферментом із P. canescens 239. Оіггимізація процесу дозволила іільшити його інтенсивність в 2,6 - 5 разів відповідно і досягти рівня відповідної ггивності препаратів із Lactobacillus fermentum, які вже використовуються кордоном для покращення якості соєвих продуктів.

На осові а-галакгозидази P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 нами «роблено ферментативний метод визначення рафінози і стахіози в соєвому молоці : інструктивно-методичні рекомендації по виготовленню соєвого молока щіпшеної якості. Складено науково-технічну документацію (ТУ і ТІ) на препарат ■галактозидази P. canescens 239 та проведено його медико-біологічні дослідження, також одержано дозвіл МОЗ України на застосування ферменту в харчовій юмисловості.

Отже, висока ефективність препаратів при гідролізі важкозасвоюваних лактоолігосахаридів соєвого молока та наявність необхідної науково-технічної кументації на препарат ферменту створюють передумови для впровадження в сраїні новітніх технологій переробки сої.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової облеми, що стосується одержання та вивчення високоспецифічних позаклітинних галактозидаз грибного походження Проведено скринінг а-галактозидази серед 24 культур мікроміцетів, 155 дріжджів і 357 бактерій із музею живих культур ІМВ ШУ, а також серед 611 свіжовиділених із грунту бактеріальних ізолятів, ійбільша частота, з якою зустрічається а-галакгозидаза (71-83 %) та найбільш сокий рівень її активності (0,5- 2,6 Е/мл) виявлено у штамів мікроміцетів, що лежать до родів Pénicillium, Cladosporium, Aspergillus і Fusarium.

2.3 використанням математичних методів планування експериментів провед оптимізація умов культивування найбільш перспективних продуцентів галактозвдази P. canescens 239 і С. cladosporioides 189, в результаті якої рівень галактозидазної активності в культур альній рідині підвищився в 2,2 і 6,8 рі відповідно.

3. Розроблені методи виділення і очистки препаратів а-галактозидази культуральної рідини P. canescens 239 і С. cladosporioides 189, які включаї фракціюваїїня сульфатом амонію, ацилування, іонообмінну і гель-хроматографік TSK-гелях. Питома активність гомогенних препаратів а-галактозидази станов 294 і 24 Е/мг білка відповідно, і перевершує на порядок активність відповіді препаратів ферменту фірми “Sigma”.

4. а-Галактозидаза P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 прояв максимальну активність при гідролізі синтетичного (n-НФГ) та природа (рафіноза) субстратів при 40-50°С, активна і стабільна в широкому діапазоні знач pH від 4,0 до 7,0 з оптимумом дії при pH 5,0-6,0. а-Галакгозидаза надзвичаі стійка при зберіганні З в насиченому розчині сульфату амонію при оптимальне pH і температурі +4° С.

5. а-Галактозидаза із обох продуцентів с кислим олігомерним білкоіь ідентичною молекулярною масою, що становить 400 кДа; молекулярна м мономеру - 66,5 та 66 кДа для P. canescens 239 і С. cladosporioides 189 відповід Молекула ферменту має глікопротеїнову природу і характеризується висок вмістом дикарбонових і гідрофобних амінокислот та наявністю манози, арабінс рамнози і глюкозаміну в її вуглеводному компоненті.

6. За допомогою кінетичного та інгібіторного аналізу, а також специфічі хімічних реагентів встановлено, що в активному центрі а-галактозидази прису електрофільно-нуклеофіпьна система - імідазольна група гістидину та карбоксилі група аспарагінової кислоти. В активному центрі відсутні атоми металу і SH-rpy але останні необхідні для стабілізації активної конформації білкової молекули.

Запропонована гіпотетична схема “двохступеневого” механізму дії галактозидази, згідно якого розщеплення галактозидного зв’язку відбуваєт: внаслідок електрофільної атаки імідазольної групи гістидину, карбоксильна ж гр; аспарагінової кислота стабілізує конформацію іону інтермедіату.

7. а-Галактозидаза - P. canescens 239 проявляє вузьку специфічність відно< глікону, гідролізуючи лише а-галактозиди; а-галактозидаза С. cladosporioides 1 крім а-галактозидів гідролізує р-глюкозиди, p-N-Ac-глюкозамініди та P-N-/ галактозамініди. Обидва препарати проявляють широку специфічність відно< типу зв’язку, відщеплюючи з різною швидкістю термінальну а-1,2-, а-1,3- і а-1 зв ’язану D-галактозу.

8. Встановлено, що а-галактозидаза P. canescens 239 здатна відщеплюв< детермінанту а-1,3-зв’язану D-галактозу від глікокон’югатів мембран еритроци

(ІП) з трансформацією останніх в універсальні донорські еритроцити 0(Г)-типу, що дкривае перспективи для використання препаратів ферменту в практичній матології з метою створення універсальної донорської крові.

9. Встановлена висока ефективність препаратів а-галактозидази P. canescens 19 і C. cladosporioides 189 при гідролізі олігосахаридів соєвого молока до :гкозасвоюваних цукрів - галактози і сахарози та розроблено інструктивно-гтодичні рекомендації по виготовленню соєвого молока поліпшеної якості шляхом грментативного гідролізу.

10. На основі а-галактозидази розроблено ферментативний метод визначення іфінози та стахіози в соєвому молоці, який включено в методику виготовлення ієвого молока поліпшеної якості.

11. Розроблено науково-технічну документацію (ТУ і ТІ) на препарат а-лактозидази P. canescens 239, проведено його медико-біологічні дослідження та [ержано “Висновок державної санітарно-гігієнічної експертизи нормативної ікументаціГ Міністерства охорони здоров’я України про застосування препарату галактозидами в харчовій промисловості.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Митропольська Н.Ю., Бухало A.C., Маланчук В.М., Буглова Т.Т., Качуровська В.П. а-Галактозидазна активність в культурах вищих BasidiomycetesJ/Укр. ботан. журн. - Київ: Наукова думка - 1990. - 47, № 5. -С. 56-59.

Буглова Т. Т., Маланчук В.М., Элланская И.A., Зайченко А.М., Захарова И.Я. Физиолого-биохимические особенности продуцентов а-галактозидазы. //Микробиол. журн. -1991. 53, № 6 С. 34-41.

Буглова Т.Т., Маланчук В.М., Захарова И.Я., Элланская И.А., Кульман Р.А. Выделение, очистка и некоторые свойства грибной а-галактозидазы. //Микробиол. журн. - 1994. - 54, № 4. С. 3-11.

Буглова Т.Т., Маланчук В.М. Влияние температуры и pH на активность грибной а-галактозидазы //Микробиол. журн. 1995. -57, № 1 С. 43-48. Malanchuk V.M, Buglova Т.Т., Varbanets L.D., Zakharova I.Ya, Kuhlmann R.A., Likhosherstov L.M., Martynova MD. Substrate specificity of a-galactosidase from Pemcillium sp.23 //Микробиол. журн. - 1999. - 61, № 1. -P. 74-79.

Маланчук B.M., Буглова T.T., Варбанец Л.Д., Захарова И.Я. Исследование функциональных групп в активном центре а-галакгозидазы Cladosporium cladosporioides 189 //Микробиол. журн. - 2000. - 62, № 4. С. 9-20.

Буглова Т. Т., Еланська I.O., Маланчук В.М., Захарова І.Я., Жданова Н.М., Кульман P.A., Соколова Е.В., В’юницька В.О. Спосіб одержання alpha-галактозидази /ЛІатент України № 10512 A. -1996. - 9 с.

8. Буглова Т. Т., Маланчук В.М., Элланская И.А., Соколова Е.В., Артышкс

JI.B., Писарчук Е.Н., Нагорная С.С., Колесова Є.А. Скрининг внеклеточн а-галактозидазы и a-N-ацетилгалактозаминидазы среди микроорганизм различных груш. //Редкол. “Микробиол. журн.” - Киев, 1990. - 17 с. - Деп. ВИНИТИ 07.05.90, № 2360-В 90.

9. Буглова Г. Т., Маланчук В.М., Элланская И.А., Захарова И.Я., Цибин М,

Оптимизация состава среды и условий культивирования продуцентов галактозидазы. //Редкол. “Микробиол. журн.” - Киев, 1993. - 13 с. - Деп ВИНИТИ 28.04.93, № Ц45-В 93.

10. Буглова Т. Т., Маланчук В.М., Элланская И.А., Соколова Е.В. Внеклеточі a-галактозидаза микромицетов. //Тезисы докл. На Всес. конф. “Мето, получения, анализа и применения ферментов” - Юрмала -1990. - С. 92.

11. Еланська 10., Буглова Т. Т., Соколова О.В., Маланчук В.М. a-Галактозидг

грибного походження та фізіологічна регуляція її активності. //9 з’їзд УІ

травень, 1992, Дніпропетровськ. - Київ: Наукова думка - 1992. - С. 434

12. Буглова Т.Т., Маланчук В.М., Элланская И.А. Выделение, очистка некоторые свойства грибной а-галактозидазьі.//Матсріали 1-го установче (VIII) з’їзду УМО, 13-16 вересня 1993 p., Одеса Микробиол. журн. -1994 56, № 1. С. 39-40

13. Маланчук В.М., Варбанец Л.Д. Получение грибной a-галактозидазы д эгоимотерапии болезни Фабри. //Матеріали V національного з’їзду Украї “Досягнення сучасної фармацеї та перспективи її розвитку у ново тисячолітті”. Харків, 1999. С. 181-182.

14. Ludmila D. Varbanets, Valentina М. Malanchuk, Tatjana T, Buglova. Fungal galactosidase catalyzing hydrolysis of glycopolymers terminal a-D-link galactose. //XIX International Carbohydrate Symposium. San Diego, Califom August 4-14, 1998, P. 211. University of California San Diego.

15. Malanchuk V.M., Varbanets L.D., Buglova T.T., Zakharova I.Ya. Carbohydr; contribution to the reaction rate, catalyzed by Ciadosporium sp. 18 alpl galactosidase. //10th European Carbohydrate symposium. Galway, Ireland, My 1

16.1999. Abstract Book P. 416. Ed. Angela Savage, Antony Moran, Maria Tuol National University of Ireland, Galway.

16. Varbanets L.D.,. Malanchuk V.M. Substrate specificity of Penicillium sp. 23 galactosidase. //10th European Carbohydrate symposium. Galway, Ireland, My 1

16.1999. Abstract Book P. 121. Ed. Angela Savage, Antony Moran, Maria Tuol National University of Ireland, Galway.

Іалапчук В.М. а-Галактозидаза Pénicillium canescens 239 і Cludosporium ladosporioides 189. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за пеціальнісгю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіологи та вірусології ім. [.КЗаболотного НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено одержанню та вивченню високоспецифічних ct-іл актозидаз грибного походження. Проведено скринінг а-галактозидази серед 2600 ультур мікроміцетів, дріжджів та бактерій, в результаті якого відібрано 2 ерспективні продуценти Pénicillium canescens 239 і Cladosporium cladosporioides 89, вивчено їх трофічні властивості та оптимізовано умови культивування. Із ультур альної рідини продуцентів виділено і очгацено до гомогенного стану асокоакгивні препарати а-галактозидази, досліджено їх фізико-хімічні властивості, еханізм та специфічність дії. Встановлено, що обидві а-галактозидази мають гікопротеїнову природу і характеризуються високим вмістом дикарбонових і дрофобних амінокислот та наявністю манози, арабінози, рамнози і глюкозаміну в : вуглеводному компоненті. В активному центрі а-галактозидази присутня [ідазольна група гістидину та карбоксильна група аспарагінової кислоти, шропонована гіпотетична схема “двохступеневого” механізму дії ферменту, оказано, що а-галакгозидаза P. canescens 239 здатна відщеплювати детермінантну -1,3-зв’язану D-галактозу від глікокон’ютатів мембран еритроцитів типу В(ПІ) з іансформаціао останніх в універсальні донорські еритроцити 0(І)-типу; обидва іепарати а-галактозидази ефективні при гідролізі олігосахаридів соєвого молока > легкозасвоюваних цукрів - галактози і сахарози.

Ключові слова: а-галактозидаза, Pénicillium canescens, Cladosporium

idosporioides, В(ІП)-еритроцнпи, рафіноза, стахіоза, соя

Маланчук В.М. а-Галактозидаза Pénicillium canescens 239 і Cladosporium idosporioides 189. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по ециальности 03.00.07 - микробиология. - Інститут микробиологии и вирусологии [. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена получению и исследованию высокоспецифичных а-пактозидаз грибного происхождения. Проведен скрининг а-галактозидазы среди 00 культур микромицетов, дрожжей и бактерий из музея живих культур ИМВ ШУ, в результате которого отобраны два наиболее перспективных продуцента -canescens 239 и С. cladosporioides 189, исследованы их трофические свойства и тимизированы условия культивирования. Разработаны эффективные методы деления и очистки а-галактозидазы из культуральной жидкости продуцентов, иючающие фракционирование сульфатом аммония, ионообменную и гель-оматографию на синтетических поливиниловых сорбентах - TSK-гелях. Удельная

активность гомогенных препаратов фермента составляет 294 и 24 Е/мг 6ej соответственно. Исследованы физико-химические свойства, механизм специфичность действия фермента Установлено, что а-галакгозвдаза P. caneso 239 и С. cladosporioides 189 проявляет максимальную активность при гидрол] синтетического (n-НФГ) и природного (раффиноза) субстратов при 40-50°С, актш и стабильна в широком диапазоне значений pH от 4,0 до 7,0 с оптимумом дейсп при pH 5,0-6,0. Фермент устойчив при хранении его в насыщенном расгв< сульфата аммония при оптимальном значении pH и температуре +4° С. Галактозидаза обоих продуцентов имеет гликопротешовую природу; соотношя белок : углеводы составляет 6 :1 i 11:1 для P. canescens 239 и С. cladosporioides 1 соответственно. Молекула фермента характеризуется высоким содержат дикар боновых и гидрофобных аминокислот, а также наличием маннозы, арабино: рамнозы и глюкозамина в ее углеводном компоненте. а-Галактозидаза им> олигомерную структуру и состоит из 6 субъединиц. Молекулярная масса олигом! составляет 400 кДа, молекулярная масса мономера - 66,5 и 66 кДа для P. caneso 239 и С. cladosporioides 189 соответственно. В активном центре а-галактозидг присутствует имидазольная группа гистидина и карбоксильная rpyi аспарагиновой кислоты; SH-группы находятся на некотором расстоянии активного центра фермента и необходимы для поддержания активной конформаи белковой молекулы. Предложена гипотетическая схема “двуступенчагш механизма действия а-галакгозидазы, согласно которой расщепление галактозида связи происходит вследствие электрофильной атаки имидазольной груп гистидина, при этом карбоксильная группа аспарагиновой кислоты стабилизир; конформацию интермедиата. а-Галактозидаза P. canescens 239 проявляет узк специфичность по отношешпо к гликону, гидролизуя только а-галакгозиды. отличие от сс-галактозидазы С. cladosporioides 189, гидролизующей, кроме галактозидов, (3-глюкозиды, P-N-Ac-глюкозаминиды и P-N-Ac-галактозаминщ Оба препарата обладают широкой специфичностью по отношению к типу свя отщепляя с различной скоростью терминальную а-1,2-, а-1,3- и а-1,6-связанную галактозу. Выявлена уникальная способность а-галаетозидазы P. canescens i отщеплять детерминантную а-1,3-связаннун> D-галактозу от гликоконьюга' мембран эршроцитов типа В(Ш) с трансформацией последних в эритроциты О типа, что открывает перспективы для использования препаратов фермента практической гематологии с целью создания универсальной донорской кро Установлена высокая эффективность препаратов а-галактозидазы P. canescens 23 С. cladosporioides 189 ври гидролизе олигосахаридов соевого молока легкоусваиваемых сахаров - галактозы и сахарозы.

Ключевые слова: а-галактозидаза, Pénicillium canescens, Cladospori cladosporioides, В(Ш)-эритроциты, раффиноза, стахиоза, соя

Malanchuk V.M. Pénicillium canescens 239 and Cladosporium cladosporioides 9 a-galactosidases. - Manuscript

Thesis for a candidate’s degree by the speciality 03.00.07 - microbiology. -K.Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of -.raine, Kyiv, 2000.

Thesis is focused on the production and investigation into the highly specific a-[actosidases of fiingus origin. Screening for a-galactosidases among 2600 cultures of cromycetes, yeast and bacteria as a result of which 2 promising producers Pénicillium nescens 239 and Cladosporium cladosporioides 189 were identified, their trophic jracteristics examined and cultivation conditions optimized. Highly active a-galacto-ase preparations were isolated from the culture liquid and purified to homogenous state, ir physical and chemical properties, mechanism and specific effects were explored, th a-galactosidases were found to be the glycoprotein nature showing high content of dicarbonic and hydrophobic aminoacids and presence of the mannose, arabinose, inose and glucosamine in their carbohydrate moiety. a-Galactosidase active center jears to contain the imidazole histidine group and carboxyl group of asparagine acid, e hypothetical scheme for the "two-step" mechanism of the enzyme effect was posed. a-Galactosidase of P.canescens 239 was shown to be able to split off the erminant a-1,3-bound D-galactose from the B(III)-erythrocyte membrane glycoconju-es with the transformation of the latter into the universal donor 0(I)-erythrocytes; both ;alactosidase preparations appeared effective during hydrolysis of the oligosaccharides he soybean milk to easily digested sugars, galactose and sucrose.

Key words: a-galactosidase, Pénicillium canescens, Cladosporium

dosporioides, B(III)-erythrocytes, raffinose, stahyose, soybean.