Морские аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes

Недашковская, Ольга Ильинична

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морские аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Морские аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes"

На правах рукописи

НЕДАШКОВСКАЯ ОЛЬГА ИЛЬИНИЧНА

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2007

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бузолева Любовь Степановна доктор биологических наук, чл.-корр. РАН Булгаков Виктор Павлович доктор медицинских наук, профессор Шубин Феликс Николаевич

Ведущая организация - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ)

на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при Дальневосточном государственном университете по адресу: 690600, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27, ауд. 435, коференц-зал.

Факс (4232)268543

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу 690600, г Владивосток, Океанский пр, 37, Научный музей ДВГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Дальневосточного государственного университета

Автореферат разослан сентября_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита состоится "_31_"_октября

2007 г в 10 часов

кб н

Ю А Галышева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Таксономический состав микробного населения является одной из наиболее важных характеристик естественных морских экосистем Молекулярно-биологические методы, применяемые для исследования этих сложных биологических образований, существенно обогатили наши знания о видовом разнообразии и структуре микробных сообществ, включая как некультивируемые, так и культивируемые микроорганизмы Применение методов изоляции и культивирования морских бактерий остается существенным для понимания физиологии и экологии морских организмов

Тип Bacteroidetes, или тип Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), представляет одну из основных филогенетических ветвей домена Bacteria и объединяет гетеротрофных грамотрицательных и палочковидных бактерий, которые способны передвигаться посредством скольжения Бактерии данного типа являются одним из доминирующих компонентов микробиоты морских экосистем и характеризуются большим видовым разнообразием и широким спектром адаптаций к различным условиям обитания (Bernardet et al, 2006, Bowman, Abel, 2005, Kirchman, 2002) В настоящее время тип Bacteroidetes включает морских бактерий, которые представлены 65 валидно описанным родом и 114 видами, а также 8 видами с неопределенным таксономическим положением Следует отметить, что 52 рода, включающих 76 видов, представлены облигатно морскими бактериями Среди них преобладают члены сем Flavobacteriaceae, которые отнесены к 42 родам и 80 видам Бактерии, принадлежащие к 29 родам и 44 видам, встречались только в морской среде Морские Cytophaga-подобные бактерии обладают широким спектром физиологических адаптаций, что позволяет им осваивать разнообразные экойиши Мирового океана, а мультиферментные системы помогают утилизировать любые субстраты в качестве источников углерода и энергии, необходимые для метаболизма (Reichenbach, 1992) Изучение ферментов, гидролизующих природные соединения в океане, актуально, поскольку дает представление о механизмах и скорости трансформации бактериями органического вещества в морских экосистемах

Несмотря на постоянный интерес микробиологов к поиску и изучению новых бактерий типа Bacteroidetes в различных экосистемах Мирового океана, бактерии данной таксономической группы, обитающие в Тихоокеанском бассейне, почти неизучены с позиции их экофизиологических и таксономических особенностей Таким образом, фундаментальное значение с точки зрения их биоразнообразия, имеет изучение экофизиологических свойств и таксономического состава морских бактерий типа Bacteroidetes Исследование метаболического потенциала и особенностей строения Cytophaga-подобных бактерий обогатит наши знания о биологической активности данных микроорганизмов и о занимаемых ими экологических нишах Совокупность знаний о таксономическом разнообразии, местах обитания и биологическом потенциале позволит оценить роль бактерий типа Bacteroidetes в преобразовании органического вещества в морских экосистемах Создание коллекций культур является необходимым условием сохранения штаммов

новых морских бактерий, а также штаммов-продуцентов ценных биологически-активных веществ

Цель настоящей работы - охарактеризовать экофизиологические свойства и таксономический состав аэробных гетеротрофных бактерий типа Вас1его1с1е1е$, изолированных из морей бассейна Тихого океана

Для выполнения поставленной цели предстояло решить следующие задачи

1 Выделить чистые культуры морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Вас1его!^е(еб- из различных микробных сообществ морей бассейна Тихого океана и культивировать полученные штаммы бактерий

2 Охарактеризовать изолированные штаммы бактерий на основе метода полифазной таксономии

3 Установить таксономический статус выделенных штаммов, определить таксономическую структуру и описать новые таксоны морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Вааегок1еге5.

4 Исследовать экофизиологические свойства изолятов и определить их 4 метаболический потенциал

5 Провести поиск штаммов-продуцентов гидролитических ферментов и других биологически активных веществ, перспективных для биотехнологии

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Гетеротрофные бактерии типа Ва&егок1е1е$ широко распространены и являются постоянным компонентом мезофильных микробных сообществ экосистем морей бассейна Тихого океана

2 Морские Cytophaga-пoд,o6ныe бактерии характеризуются значительным таксономическим разнообразием Применение метода полифазной таксономии позволило идентифицировать представителей 32 родов и 49 видов бактерий и описать 45 новых видов в составе 8 известных и 18 новых родов

3 Метаболически активные бактерии родов Cellulophaga, МапЬаМег и ТюЬеШа являются доминирующими таксономическими группами среди культивируемых бактерий сем РЬзмоЪаШгшсеае и типа Вас1егои1е1е8 в целом

4 Морские бактерии типа Васгегоиявляются продуцентами уникальных биологически-активных веществ, в том числе ферментов, инактивирующих групповые вещества крови человека

Научная новизна работы. Впервые детально изучены экологические особенности, распространение, видовой состав и таксономическая структура бактерий типа 5<яс/егогй^е.у, изолированных из акваторий Тихого океана Показано, что выделенные бактерии являются таксономически гетерогенной группой и принадлежат к 32 родам и 49 видам в составе типа Вас(его1с!е1е$ Фундаментальное значение имеет детальная характеристика и описание новых эволюционных линий бактерий, отнесенных к 18 новым родам и 45 новым видам В результате проведенного таксономического исследования впервые идентифицированы и описаны бактерии новых родов А^&аМег, Адштагта, АгетЬас(ег, Втота, ЕсЫтсо1а, РиЫшг^а, ОгатеИа, ЬееиюепИоеЬеИа, МапЬас(ег, Магтфехйе, Мезота, РЛосеИа, РоппЬас1ег, ЯеюИепЬасЫеИа, Кояет^а, иЫЬаМег, УиеШЬаМег и \¥то£гас1зкуе11а Описаны также новые виды в составе известных родов

Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gillma, Polaribacter, Salegentibacter и Zobellia В данном исследовании уточнен и дополнен диагноз рода Formosa, члена сем Flavobacteriaceae класса Flavobacteria, на основании вновь полученных результатов Род и вид Gaetbulimicrobium brevivitae реклассифицирован как Aquimarina brevivitae comb nov на основании филогенетического анализа и сходства в составе клеточных жирных кислот Два вида с неопределенным таксономическим положением [Cytophaga] latercula и [Cytophaga] marinoßava реклассифицированы в новые роды Aquimarina и Leeuwenhoekiella, соответственно Роды Hongiella и Chimaereicella, принадлежащие к классу Sphmgobacteria, реклассифицированы в род Algoriphagus на основании близкого филогенетического родства, генотипических и фенотипических характеристик

Установлено, что члены сем Flavobacteriaceae являются доминирующей таксономической группой среди бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из микробных сообществ морей Тихого океана, и впервые показано, что бактерии этого семейства, принадлежащие к родам Cellulophaga, Maribacter и Zobellia, существенно численно превосходят другие культивируемые бактерии типа Bacteroidetes Полученные новые знания значительно расширили наши представления о биологии, экологии и таксономическом разнообразии, видовом составе и филогенетических взаимосвязях морских Cytophaga-подобных бактерий

При изучении морфологии клеток штамма нового вида бактерий Formosa agariphila КММ 3901Т впервые обнаружен неизвестный ранее для Cytophaga-подобных бактерий тип размножения - почкование

Практическое значение. Изучены экофизиологические особенности, распространение и таксономическая структура аэробных морских бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ Тихого океана на основе применения современных молекулярно-биологических методов, показано, что Cytophaga-подобные бактерии бассейна Тихого океана являются таксономически разнообразной группой, включающей членов 32 родов и 49 видов

В результате исследования метаболической активности выявлено присутствие протеаз, гликозилгидролаз, липаз и ДНК-аз у более чем 50% исследованных штаммов и проведен отбор перспективных для биотехнологии штаммов бактерий, обнаружен и запатентован штамм новой морской бактерии Arembacter latericius КММ 426т - продуцент а-Л'-ацетилгалактозаминидазы, способной конвертировать вещества группы крови человека А в группу О в физиологических условиях, что может найти применение в трансфузионной медицине, полученные и охарактеризованные гликозилгидролазы могут использоваться в структурных и биохимических исследованиях и быть основой для биотехнологического производства ферментов с заданной субстратной специфичностью Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов

Создана, поддерживается и постоянно пополняется коллекция штаммов морских бактерий типа Bacteroidetes в составе Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, которая содержит типовые штаммы, штаммы-продуценты биологически активных веществ и микроорганизмы, идентификация которых продолжается в настоящее время,

Изучение таксономической структуры морских микроорганизмов, как свободноживущих, так и ассоциированных с макрогидробионтами и их способности синтезировать физиологически активные вещества служит источником новых знаний о роли ассоциативной микрофлоры в жизнедеятельности населяющих океан организмов и, в конечном счете, функционировании морских экосистем, которые могут быть использованы для обучения экологов и морских микробиологов

Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН с 1989 по 2007 гг

Благодарности Автор выражает глубокую благодарность директору ТИБОХ ДВО РАН академику В А Стонику и чл -корр РАН В.В Михайлову за всестороннюю поддержку в проведении работы, искреннюю признательность Prof Dr Н -Y Park, Dr К -S Bae, Dr M Suzuki, Dr S В Kim, Prof Dr J Swings, Dr M Vancanneyt, Prof Dr Stackebrandt, Dr M Rohde и другим коллегам за помощь в работе Автор признателен своим соавторам - сотрудникам лаборатории микробиологии, химии ферментов, химии углеводов и химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН, Института микробиологии им С Н Виноградского РАН и лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН за участие в работе и дружескую помощь

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на International Science Conference "Bridges of Science between North America and the Russian Far East", Anchorage, USA -Vladivostok, Russia, 1994, International Conference of North Pacific Marine Science Organization (PICES) «Workshop on the Okhotsk Sea and adjancent Areas» Vladivostok, Russia, 1995, Conference Oceanology International 97 Pacific Rim, Singapore, 1997, 8-th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Halifax, Canada, 1998, II Дальневосточной региональной конференции "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке", Владивосток, Россия, 1998, 2-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, Россия, 2000, региональной научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока», Владивосток, Россия, 2001, Meeting of the Microbial Society of Korea, Cheonan, Korea, 2004, International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies, Seoul, Korea, 2004", Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия,

2004, "Isolation and identification of the novel flexibactena using polyphasic approach", International Union of Microbiological Societies (IUMS) Congress, San-Francisco, USA,

2005, II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия, 2006

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 72 печатные работы 51 экспериментальная статья, 20 тезисов докладов и 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части объектов и методов исследования (глава 4), результатов и обсуждения (главы 5-6), заключения и выводов, изложенных на 240 страницах, включая 40 таблиц, 25 рисунков и списка цитируемой литературы из 361 наименования, из них 25 — на русском и 336 — на иностранных языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 4. Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили штаммы аэробных гетеротрофных пигментированных грамотрицательных палочковидных микроорганизмов типа Bacteroidetes, выделенные из морской воды, донных осадков, зеленых водорослей Acrosiphonia sonden и Ulva fenestrata, красных водорослей Chondrus sp, Polysiphonia japónica и Polysiphoma sp , бурых водорослей Chorda filum и Laminaria japónica, губки Artemisina sp и неидентифицированных губок, голотурии Stichopus japomcus, морской звезды Distolasterias sp, морского ежа Strongylocentrotus intermedius, неидентифицированной актинии, кораллов Paragorgia arbórea, Palythoa sp и неидентифицированных кораллов, собранных в заливе Петра Великого на Морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, а также во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин" в Охотском и Японском морях и в тропических районах Тихого океана в 1989-2005 гг В работе были использованы типовые штаммы бактерий, полученные из зарубежных коллекций культур микроорганизмов

Для выделения чистых культур бактерии выращивали на модифицированной среде Youshimizu-Kimura (1976), приготовленной на 50% натуральной морской воде, морском агаре 2216 (Difco) и морском бульоне 2216 (Difco) Изучены морфология клеток и колоний, подвижность, окраска по Граму, потребность в ионах натрия для роста Тест Хью-Лейфсона ставили на модифицированной для морских бактерий среде (Lemos et al, 1985), гидролиз желатина, крахмала, твинов-20, 40 и 80, способность продуцировать оксидазу, каталазу, мочевину, индол, ацетоин и сероводород определяли согласно "Методам общей бактериологии" под редакцией Ф Герхардта и др (1984), для обнаружения пигментов типа флексирубина применяли 20%-ный КОН (Fautz, Reichenbach, 1980) Деградация казеина, эластина и хитина учитывалась по образованию чистой зоны вокруг колоний Для определения утилизации бактериями 95 источников углерода использована тест-система для грамотрицательных бактерий Microlog GN2 (BIOLOG Inc, США) Идентификацию бактерий также осуществляли при помощи тест-систем API 20 Е, API 20 NE и API ZYM (bioMéneux, Франция) Чувствительность к антибиотикам определяли методом дисков Морфология клеток была изучена с использованием сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии

Анализ метиловых эфиров жирных кислот был выполнен согласно стандартному протоколу Microbial Identification System (MIDI, Michigan, USA, Sasser, 1990) и газо-жидкостной хроматографии с использованием Supelcowax 10 column, 30 м х 0 25 мм, 210 °С (Svetashev et al, 1995) Изопреноидные хиноны экстрагировали из лиофилизованных клеток и анализировали согласно Akagawa-Matsushita et al (1992) и Nakagawa, Yamasato (1993) При анализе полярных липидов использовали специфические реагенты для фосфолипидов (Vaskovsky et al, 1975) и 2% нингидрин для аминосодержащих липидов

Определение нуклеотидного состава ДНК проводили методом термической денатурации (Marmur, Doty, 1962), для некоторых штаммов использовали ГЖХ согласно методу Mesbach et al (1989) Уровень ДНК-ДНК реассоциации определяли спектрофотометрическим методом реассоциации (De Ley et al, 1970) или методом

Ezaki et al (1989) Гены 16S pPHK изолированных штаммов амплифицированы с использованием универсальных олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к высоко консервативным участкам бактериальных 16S рРНК генов, включая 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (гибридизующий в позициях 8±27 по Escherichia coli), 5 '-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' (гибридизующий в позициях 1513+1492) и 5 '-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (гибридизующий в позициях 1541±1522) Полученные последовательности секвенированы с помощью набора реактивов (Taq Dye Deoxy Terannator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) и ДНК-секвенатора, модели Applied Biosystems 373A и 377A (Chun, Goodfellow, 1995, Hiraishi, 1992, Kim et al, 1998, Suzuki et al, 2001, Vancanneyt et al, 2004) Сравнение полученных 16S рДНК-олигонуклеотидных последовательностей с аналогичными последовательностями близкородственных бактерий, депонированных в Банке генетических данных (GenBank), получено с помощью компьютерной обработки Филогенетические деревья построены с использованием стандартных филогенетических методов (Felsenstem, 1993, Fitch, Margoliash, 1967, Saitou, Nei, 1987) Пакет программ PHYLIP (Felsenstem, 1993, 1995) использован для выяснения окончательной некорневой топологии

Активность ферментов, деградирующих полисахариды, определяли по нарастанию количества восстанавливающих Сахаров (Nelson, 1944) За единицу активности принимали количество ферментного препарата, содержащегося в 1 мг белка, которое катализировало образование 1 нмоля восстанавливающих Сахаров за 1 ч при 18°С Содержание белка в экстрактах определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951) Активность гликозидаз определяли по количеству и-нитрофенола, образующегося в процессе ферментативной реакции при использовании хромогенных субстратов Для определения активности на групповых веществах крови (ГВК) раствор фермента в изотоническом фосфатном буфере, рН 7 3, инкубировали с ГВК, имеющими детерминанты А-, В- и Н-антигенов эритроцитов человека, в течение 24 ч при 26°С с последующим проведением реакции гемагтлютинации в стандартных планшетах для иммунологических реакций Процент нарушения целостности мембран определяли по изменению уровня эстеразной активности с использованием в качестве субстрата диацетилфлуоресцеин (ДАФ) (Rotman, Papermaster, 1966)

Результаты и обсуждение Глава 5. Распространение, филогения и таксономический состав морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных акваторий Тихого океана 5.1. Распространение

Бактерии типа Bacteroidetes были изолированы из всех проб морской воды и донных осадков, из тканей зеленых, красных и бурых водорослей и беспозвоночных животных, отобранных в Охотском, Японском и Южно-Китайском морях Тихого океана и могут рассматриваться как группа морских бактерий, имеющих широкое распространение Следует отметить, что бактерии родов Cellulophaga, Zobelha и Maribacter сем Flavobacteriaceae, встречающиеся как среди сообществ свободноживущих бактерий, так и среди ассоциантов водорослей и животных, изолированы из всех исследованных морских экосистем При изучении эпифитов водорослей Охотского и Японского морей идентифицированы штаммы известных видов Cellulophaga baltica и С fueteóla, которые были описаны как ассоцианты бурой водоросли Fucus serratus, обычного обитателя Балтийского моря (Johansen et al, 1999), а также вида С lytica, типовой штамм которого был ранее выделен из песчаного грунта побережья Коста Рики (Lewm, 1969) и вида Zobellia galactamvorans, штамм которого был впервые изолирован из красной водоросли Delessena sanguínea, собранной в проливе Ла-Манш (Barbeyron et al, 2001) Таким образом, получение нами результаты значительно расширили знания об ареалах данных видов. Кроме того, в микробных сообществах Японского моря обнаружены штаммы новых для науки видов родов Cellulophaga и Zobellia (табл 1)

При изучении эпибионтов серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius, типичного представителя фауны Японского моря, был обнаружен штамм КММ 6066, филогенетически близкий к бактерии с неясным таксономическим положением [Cytophaga] marinoflava, которая была изолирована из пробы воды в Северном море (Colwell et al, 1970) Однако наибольшее сходство выявлено между нуклеотидными последовательностями генов 16S рРНК штаммов КММ 6066 и LMG 22550T-LMG 22554, выделенных из морской воды вблизи антарктического континента На основании проведенных генетических и фенотипических исследований, данные штаммы были помещены в новый род и вид Leeuwenhoekiella aequorea, а [Cytophaga] marinoflava была реклассифицирована как L marinoflava comb nov (табл 1)

Бактерии рода Arembacter изолированы из морской воды, донных осадков, водорослей и беспозвоночных животных Охотского, Японского и ЮжноКитайского морей (табл 1) В настоящее время род Arembacter включает 4 валидно описанных вида (табл 1) Штаммы A certesu и A palladensis были изолированы из зеленой водоросли Ulva fenestrata, A troitsensis — из пробы донных осадков, собранных в Японском море Ареал штаммов A latericius значительно шире, так как они изолированы из пробы песчаного грунта в Южно-Китайском море, из голотурии Stichopus japonicus и бурой водоросли Chorda fllum из Японского и Охотского морей, соответственно Несмотря на широкое распространение, штаммы данного вида имеют схожие фенотипические признаки, включая нижний предел температуры роста (10°С)

Бактерии рода Algoriphagus также имеют обширный ареал и характеризуются значительной экологической пластичностью Так, штаммы видов A aqmmarinus, А marineóla, A halophilus, A manmtohvorans, A ormthinivorans, A chordae и А winogradskyi выделены из микробных сообществ Японского моря (табл. 1, Yi, Chun, 2004, Yoon et al, 2004) Штаммы

Таблица 1 Систематическое положение видов морских бактерий типа

Bacteroidetes, изолированных и описанных в данном исследовании_

Класс Flavobacteria

Сем Flavobacteriaceae_

Род_Вид_Источник и место выделения типового штамма_

Algibacter Nedashkovskaya et al 2004

A lectus Зеленая водоросль Ulva fenestrata, Японское море

Aquimai та Nedashkovskaya et al 2005

A intermedia Морской еж Strongylocentrotus intermedius, Японское море

A muelen Морская вода, Японское море

Arenibacter Ivanova et al 2001 emend Nedashkovskaya et al 2006 A latericius Грунт, Южно-Китайское море

A certesn Зеленая водоросль Ulva fenestrata, Японское море

A palladensis Зеленая водоросль Ulva fenestrata, Японское море A troitsensis Грунгт, Японское море

Bizioma Nedashkovskaya et al 2005

В paragorgia Коралл Paragorgia arbórea, Охотское море

Cellulophaga Johansen et al 1999

С pacifica Морская вода, Японское море

Formosa Ivanova et al 2004 emend Nedashkovskaya et al. 2006

F agariphtla Зеленая водоросль Acrosiphonia sonden, Японское море

Githsia Van Trappen et al 2004

G mitskevichiae Морская вода, Японское море Gramella Nedashkovskaya et al 2005

G echimcola Морской еж Strongylocentrotus intermedins, Японское море

Leeuwenhoekiella Nedashkovskaya et al 2005

L aequorea Морская вода, Антарктида

Maribacter Nedashkovskaya et al 2004

M sedimenticola Грунт, Японское море M aquivivus Морская вода, Японское море

М orientahs Морская вода, Японское море

М ulvicola Зеленая водоросль Ulva fenestrata, Японское море

Marmiflexile Nedashkovskaya et al 2006

M gromovu Морской еж Strongylocentrotus intermedius, Японское море

Mesoma Nedashkovskaya et al 2003

M algae Зеленая водоросль, Acrosiphonia sonden, Японское море

М mobilis Морская вода, Японское море

Pibocella Nedashkovskaya et al 2005

P ponti Зеленая водоросль, Acrosiphonia sonden, Японское море

Polaribacter Gosmk et al 1998

_P butkevichu_Морская вода, Японское море_

Род_Вид_Источник и место выделения типового штамма_

Salegenttbacter McCammon, Bowman, 2000

S aganvorans Губка Aríemisma sp , Охотское море S holothunorum Голотурия Aposttchopus japomcus, Японское море S mishustinae Морской еж Strongylocentrotus intermedins, Японское море Ulvibacter Nedashkovskaya et al 2004

U litorahs Зеленая водоросль Ulvafenestrata. Японское море

Vitellibacter Nedashkovskaya et al 2003

V vladivostokensis Голотурия Aposttchopus japomcus, Японское море Winogradskyella Nedashkovskaya et al 2005

W thalassocola Бурая водоросль Chorda filum, Японское море W epiphitica Зеленая водоросль Acrosiphoma sonden, Японское море

W eximia Бурая водоросль Laminaria japónica, Японское море

Zobellia Barbeyron et al 2001

Z amurshense Морская вода, Японское море Z laminarme Бурая водоросль Laminaria japónica, Японское море

Z russelh Зеленая водоросль Acrosiphoma sonden, Японское море

Класс 'Sphingobacteria' Algoriphagus Bowman et al 2003

A aquimarinus Морская вода, Японское море A chordae Бурая водоросль Chorda filum, Японское море

A winogradsku Зеленая водоросль Acrosiphoma sonden, Японское море A vanfongensis Коралл Palythoa sp , Южно-Китайское море Cyclobacterium Raj and Maloy 1990

С amurskyense Морская вода, Японское море Echinicola Nedashkovskaya et al 2006

E pacifica Морской еж Strongylocentrotus intermedius, Японское море

E vietnamensis Морская вода, Южно-Китайское море Fulvivirga Nedashkovskaya et al 2007

F kasyanovn Морская вода, Южно-Китайское море

Pontibacter Nedashkovskaya et al 2005

P actiniarum Актиния, Японское море

Reichenbachiella Nedashkovskaya et al 2003 emend Nedashkovskaya et al 2005

R agariperforans Морская вода, Японское море Roseivirga Nedashkovskaya et al 2005

R echinicomitans Морской еж Strongylocentrotus intermedius. Японское море _R ehrenbergn_Зеленая водоросль Ulva fenestrata, Японское море_

видов A locisalis и A yeomjeoni обнаружены в пробах воды Желтого моря (Yoon et al, 2005а, д) A vanfongensis выделен из пробы воды Южно-Китайского моря (табл 1) A ratkowskyi и A antarcticus изолированы из морского льда и скоплений цианобактерий меромиктических озер Антарктиды (Bowman et al, 2003, Van Trappen et al, 2004) Аэробный тип метаболизма и отсутствие потребности в хлориде натрия или в морской воде для роста, отмеченное для большинства представителей рода Algoriphagus, вероятно, помогло им адаптироваться и к жизни в наземных условиях Так, бактерии видов A terrigena и A boritolerans изолированы из проб почвы, отобранных на о Докдо в Японском море и в континентальной части Турции, соответственно (Yoon et al, 2006, Ahmed et al, 2007) При изучении микрофлоры щелочной артезианской воды в Испании обнаружен штамм вида А alkaliphilus (Tiago et al, 2006) Галотолерантные бактерии рода Pontibacter также

приспособились к жизни как в морской среде, так и в почве Недавно новая бактерия Р akesuensis AKS 1т, филогенетически близкая к описанному нами роду и виду галотолерантных бактерий Р actimarum, ассоцианта асцидии, собранной на глубине 120 м в Японском море, была изолирована из пробы грунта в китайской пустыне, характеризующейся крайне засушливым климатом (Zhou et al, 2007) Данные факты свидетельствует о значительной степени лабильности и приспособляемости к условиям окружающей среды аэробных бактерий типа Bacteroidetes

Анализ распространения морских аэробных Bacteroidetes, основанный на литературных и собственных данных, показывает, что бактерии данного типа встречаются почти во всех изученных микробных сообществах мирового океана, особенно обильны они в прибрежной зоне, богатой питательными веществами и кислородом (Reichenbach, 1989) Ареалы таких родов как Cellulophaga, Zobelha, Maribacter, Salegentibacter и Winogradskyella также достаточно обширны, в то же время, ареалы большинства видов довольно узкие, и только некоторые виды Cytophaga-подобяых бактерий могут рассматриваться как экологически пластичные организмы благодаря приобретенным адаптациям к разнообразным факторам окружающей среды, которые помогают им успешно конкурировать с другими видами бактерий и заселять новые места обитания

5.2. Филогения

Применение секвенирования генов 16S рРНК и основанного на нем филогенетического анализа к изучению выделенных штаммов выявило большое видовое разнообразие и дало возможность обнаружить значительное число уникальных и неизвестных ранее микроорганизмов.

Полученные нуклеотидные последовательности представляли гетерогенную группу, состоящую из 88 филотипов, что позволяет рассматривать выделенные нами бактерии как таксономически разнообразную группу микроорганизмов Следует отметить, что только 4 из них имели максимальную гомологию (100%) с последовательностями известных видов Cellulophaga lytica (7 последовательностей), С baltica (9), С fueteóla (4) и Z galactanivorans (10), что разрешает идентифицировать их как представителей данных таксонов Секвенирование 93 штаммов бактерий выявило высокое разнообразие последовательностей, которые были разделены на 30 групп и имели высокую гомологию (96-99%) с типовыми штаммами 14 известных родов Филогенетический анализ 23 последовательностей, представляющих 15 филотипов, и результаты ДНК-ДНК гибридизации дали основание для идентификации и описания новых видов в составе родов Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gilhsia, Polaribacter, Salegentibacter и Zobellia (табл. 1,рис 1) Изучение видовой принадлежности еще 71 бактерии, которые относятся к 44 филотипам со сходством последовательностей

Таблица 2 Нуклеотидные последовательности генов 16Б рРНК валидно описанных бактерий, показавшие наиболее близкое сходство с изученными изолятами

Номер Номер в Ближайший аналог Сходство

штамма библиотеке последовательностей (%)

КММ 3960 АУ521223 Psychroserpens burtonensis 95 0

КММ 6032 АВ080771 Arembacter troitsensis 98 8

КММ 6133 АУ586527 Olleya marihmosa 97 2

КММ 6150 АУ608409 Gramella echimcola 98 6

КММ 6151 АУ271625 Manbacter aqmvivus 96 0

КММ 6171 АУ187689 Algibacter lectus 96 2

КММ 6177 АУ694003 Bizioma algoritergicola 98 3

КММ 6211 АУ521225 Winogradskyella eximia 97 1

КММ 6214 АУ187689 Algibacter lectus 94 2

КММ 6220 АВ078038 Reichenbachiella agariperforans 92 0

КММ 6221 0(2185611 Echinicola pacifica 94 0

КММ 6241 АУ264840 Hongiella ormthimvorans 97 0

КММ 6269 АУ576653 Salegentibacter mishustinae 94 4

КММ 6270 АУ682200 Salegenttbacter flavus 93 3

КММ 6277 АУ883937 Gaetbuhbacter saemankumensis 91 1

КММ 6314 АУ189722 Polanbacter butkevichn 99 3

КММ 6317 0(^002871 Gramella portivictoriae 98 9

КММ 6319 М92279 Salegenttbacter salegens 94 8

КММ 6320 АУ576655 Gilhsia mitskevichiae 94 8

КММ 6325 АУ682200 Salegentibacter flavus 94 8

с известными видами от 92 до 95 8% в настоящее время продолжается (табл 2) Обнаруженные молекулярные различия 50 изолятов и валидно описанных видов, поддержанные фенотипическими характеристиками, позволили отнести их к 18 новым родам, которые включают 29 видов бактерий (табл 1) Кроме того, высокая степень родства (96 9-99%) отмечена между 21 полученным филотипом (60 последовательностей) и видами описанных нами родов А^Жа&ег, АгетЬас1ег, Втота, СгатеИа, ЬеегтепкоеТаеНа, МапЬас(ег, Мехота и ^^¡^¿гас1зкуе11а

Flavobacterium aquatile АТСС 11947т (M62797)

— Marimflexile gromovu KMM 6038T (DQ312294)

— Wmogradskyella epiphytica KMM 3906T (AY521224)

— Wmogradskyella thalassocola KMM 3907T (AY521223) Wmogradskyella eximia KMM39441 (AY521225)

" Algibacter lectus KMM 3902T (AY187689) Bizionia paragorgiae KMM 6029T (AY651070)

1_I— Formosa agariphila KMM 3901T (AY187688)

'— Formosa algae KMM 3553T (AY228461)

-Gillisia mitskevichlae KMM 6034T (AY576655)

-Aquimarina brevivitae SMK-19T (AY987367)

-Aquimarina muelleri KMM 6020T (AY608406)

- Aquimarina latercula АТСС 23177т (M58769)

-Mesonia algae KMM 3909T (AF536383)

-Mesonia mobilis KMM 6059T (DQ367409)

-Gramella echmicola KMM 6050T (AY608409)

_j— Salegentibacter mishustmae KMM 6049T (AY576653)

'-Salegentibacter aganvorans KMM 7019T (DQ191176)

— Ulvibacter litorahs KMM 3912T (AY243096)

Leeuwenhoekiella marinoflava АТСС 19326т (M58770) I Leeuwenhoekiella aequorea KMM 6066 (AJ780980) ^ Leeuwenhoekiella aequorea LMG 22550T (AJ278780)

-Polaribacter butkevichu KMM 3938T (AY189722)

-Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516т (AB071382)

Cellulophaga pacifica KMM 3664т (AB100840)

• Zobelha amurskyensis KMM 3526т (AB121974)

■c

Pibocella ponti KMM 6031T (AY576654) — Maribacter ulvicola KMM 3951T (AY271626)

I-Maribacter aquivivus KMM 3949T (AY271625)

1|-Maribacter sedlmenticola KMM 3903T (AY271623)

Maribacter orientals KMM 3947T (AY271624) Arenibacter latericius KMM 426T (AF052742)

Arenibacter palladensis KMM 3961T (AJ575643)

Рис 1 Филогенетическое древо, основанное на сравнении последовательностей 168 рРНК генов, показывающее эволюционные отношения между новыми таксонами, описанными в данном исследовании и другими членами сем Р1сп>оЬас1епасеае Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов

17%

2%-

16%

ЕЭ А1дЬас±сг

□ Асуи/тап'па ЕЯ Агет'ЬасЛег

□ В/гзот'а

ЕЭ Се//и/орЬада

□ Рогтоза

62 ОаеХЬиИЬаЫсг И СгатеПа Я МапЬасЛег

□ ЛТезол/а

Н РэусЬповегрепв И 5>а1едепИЬас1ег ЕЯ Тепа&Ьаси/ит

а 1Мпо^ас1вкуе/1а

Ш 2^оЬеШа ^ А1допрЬадиэ Н Другие

17%

Рис. 2. Таксономический состав бактерий типа Васгего1с1е!е5, изолированных из различных акваторий Тихого океана

5.3. Таксономический состав

В настоящем исследовании впервые определена таксономическая структура культивируемых морских ВасЛего1с1е1е$, которая представлена 49 видами 32 родов классов ШауоЬаШпа и 'Зр1г^оЬас1епа'. Большая часть бактерий (428 штаммов или 95,8%) относится к сем. Р1ауоЬас1ег'шсеае. Культивируемые сфиигобактсрии, численность которых в совокупности составляет 19 штаммов или 4,2% от общего числа идентифицированных

Рис. 3. Сканирующие микрофотографии клеток штамма КММ 39017, показывающие палочковидные клетки, почкование и нитевидные структуры (а, б). Трансмиссионные микрофотографии ультратонких срезов штамма КММ 39011 (в-д), показывающие нитевидные структуры (с) и образование почек па материнских клетках (д, показано стрелками). Масштабная линейка 1.0 мкм (а) и 0.5 мкм (б-д)

штаммов, возможно, могут рассматриваться и качестве минорных компонентов изученных микробных популяций. Среди представителей сем. Flavobacteriaceae доминировал» члены родов Maribacter, ZobelI ¡а и Cdlulophaga (75, 75 и 72 штамма, соответственно), составляя 16.1-16.8% от всех изолированных бактерий (рис, 2). Высокая численность штаммов вышеперечисленных родов хорошо согласуется с физиологическими особенностями этих групп микроорганизмов, поскольку все изученные нами

бактерии родов Cellulophaga и Zobellia и многие марибактеры могут гидролизовать агар и альгинат, которые являются основными полисахаридами красных и бурых водорослей и могут служить доступным источником питания для эпифитов Следующими по численности были бактерии, принадлежащие к филогенетически близким родам Bizionia и Formosa (24 и 23 штамма или 5 45 1%, соответственно), при этом, если все биционии были ассоциированы с животными, то бактерии рода Formosa преимущественно выделялись с поверхности таломов водорослей (табл 3)

При изучении морфологии штамма Formosa agariphila КММ 3901т впервые для представителей типа Bacteroidetes было показано размножение клеток при помощи почкования (рис 3) Грамотрицательные бактерии, образующие почки, были ранее описаны среди представителей родов Antarctobacter, Roseovarius и Hyphomonas а-класса и родов Alteromonas и Glaciecola у-класса типа Proteobacteria (Labrentz et al, 1998, 1999, Werner et al, 2000, Van Trappen et al, 2004a, б) Вероятно, для палочковидных бактерий образование почек является обычным способом изменения соотношения поверхности клеток к их объему для достижения наиболее эффективного доступа к субстрату (Van Gemerden, Kuenen, 1984) Также были обнаружены нитевидные образования на внешних мембранах клеток штамма КММ 3901Т, которые могли соединяться с такими же фибриллоподобными структурами других клеток, создавая своеобразную «сеть» Подобные образования были обнаружены и у бактерий рода Winogradskyella Данные структуры, по-видимому, являются ценной адаптацией для колонизации поверхности водорослей или других организмов, а также для прикрепления к другим клеткам

5.4. Различия в таксономическом составе в звисимости от источника выделения

Большая часть изолятов была ассоциирована с водорослями - 190 штаммов, примерно одинаковое число штаммов было выделено из проб морской воды и из беспозвоночных животных (114 и 119, соответственно), и только 24 штамма были изолированы из проб донных осадков (табл 3)

Анализ таксономического состава свободноживущих бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из проб морской воды и донных осадков, показал их принадлежность к 20 родам и доминирование штаммов рода Cellulophaga (36 штаммов или 26 1%) Бактерии родов Zobellia и Maribacter встречались реже (23 и 22 штамм или 16 7 и 15 9%, соответственно) Среди изолятов было идентифицировано 12 (8 7%) и 9 (6 5%) штаммов родов Aquimarina и Salegentibacter Эти же таксоны преобладали и среди бактерий, изолированных из проб морской воды и представленные 18 родами (рис 4) В то же время штаммы, изолированные из проб донных осадков, принадлежали к 9 родам, среди которых доминировали члены родов Tenacibaculum и Maribacter (6 и 5 штаммов, или 25 и 20 8%, соответственно) (рис 5)

Таблица 3 Таксономический состав и источники выделения морских аэробных

гетеротрофных бактерий типа Вас(его1с1е1ея

Таксон Число штаммов Источники выделения

Водоросли Морская вода Грунт Животные

Тип Bacteroidetes 447 190 114 24 119

Класс Flavobacteria

Сем Flavobacteriaceae 428 185 108 22 113

Algibacter 8 6 - 1 1

Aquunarina 13 - 12 - 1

Arenibacter 18 10 1 2 5

Bizioma 24 - - - 24

Cellulophaga 72 29 33 3 7

Chiyseobacterium 1 - 1 - -

Formosa 23 18 5 - -

Gaetbulibacter 14 - - - 14

Gillisia 3 1 1 - 1

Gramella 12 - - 2 10

Leeuwenhoekiella 2 - - - 2

Maribacter 75 47 18 5 5

Marimflexile 2 - - - 2

Mesoma 9 5 2 - 2

Muricauda 1 - - - 1

Olleya 1 1 - - -

Pibocella 1 1 - - -

Polaribacter 3 - 2 - 1

Psychroserpens 12 - - - 12

Salegentibacter 22 1 7 2 12

Tenacibaculum 12 2 1 6 3

Ulvibacter 5 5 - - -

Vitellibacter 1 - - - 1

Winogradskyella 19 14 4 - 1

Zobelha 75 45 21 1 8

Класс 'Sphingobacteria' 19 5 6 2 6

Algoriphagus 8 3 2 2 1

Cyclobacterium 1 - 1 - -

Echimcola 4 - 1 - 3

Fulvivirga 1 - 1 - -

Pontibacter 1 - - - 1

Reichenbach lella 1 - 1 - -

Roseivirga 3 2 - - 1

Таксономическая структура бактерий, ассоциированных с водорослями и беспозвоночными, более разнообразна и состоит из представителей 28 родов (табл 3) Члены родов Вшота, ЕсЫтсо1а, Маппфехйе, ОИеуа, РЛосеИа, РопиЬаМег, \Jlvibacter и УиеШЬас1ег были идентифицированы только среди бактерий-ассоциантов Вероятно, богатое видовое разнообразие связано с прикрепленным образом жизни данных бактерий, которые лишены жгутиков и не могут свободно перемещаться в воде Организм хозяина является для

S Algoriphagus

□ Aquirmrina и Cc/lulophaga

□ Formosa E Maribacter

□ Mcsonia „ □ Po/aribactcr

ы Salegentibactcr a VWnogradskyetla a Zobellia Ы Другие

Рис. 4. Таксономический состав морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из морской воды

ЕЭ Alcjbactcr в Algoriphagus fa Arenibacter □ Ceilulophaga И Grameila и Maribacter 13% н Salegentibacter 0 Tcnadbaculum is Zobellia

Рис. 5. Таксономический состав морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из дойных осадков

бактерий относительно стабильной средой обитания, обеспечивает им постоянный приток питательных веществ и защищает их от естественных врагов, сохраняй микроорганизмы, адаптированные к данным условиям обитания. Среди эпибионтов доминировали бактерии родов Zobellia и Maribacter (53 и 52 штамма или 17.1 и 16.8%, соответственно), численность бактерий рода Ceilulophaga составила 36 штаммов или 11.6%. Среди бактерий, ассоциированных с водорослями, также наблюдалось доминирование членов данных ролов {рис. 6). Кроме того, следует отметить нумерически значимые роды Formosa, Winogradskyella и Arenibacter (18, 14 И 10 штаммов или 9.5, 7,4 и 5.3%).

Таксономическая структура эпифитов различалась в зависимости от вида Организма-хозяина. Бактерии рода Zobellia были наиболее многочисленными

Э%

25%

Рис. 6. Таксономический состав морских Bacteroidetes, изолированных из водорослей

0 Alybacter S Algoriphagus В Arenibacter Е Ce/lulofJiaga О Font losa К Maribacter ЕЗ Meson/a Я Utvibactcr ЕЭ VWnogradskyella 0 Zobe/lia К Другие

аэробных бактерий типа

16%

13%

12%

ffl Arcnibacter O Bizionia И Cdluloptiaya (П Ecfiinicota н Gaetbulibacter XI Gramdla Я Maribacter ■ 3,y И Psydinjscfjjcns S3 Saleyentibactcr И Tenadbacutum S Zobellia N Ppугие

Рис. 7. Таксономический состав морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из беспозвоночных животных

среди ассоциалтов зеленой водоросли Acrosiphonia zander i, а рода Ceilidophaga - среди цитофагоиодобиых бактерий бурой водоросли Laminaria japónica; марибактеры доминировали среди флавобактерий красной водоросли Polysiphonia japónica и зеленой водоросли Ulva fenestrata, а штаммы рода Arenibacter - среди цитофагоиодобиых бактерий-ассоциантов бурой водоросли Chorda Jilum.

Таксономический состав бактерий, ассоциированных с беспозвоночными, отличался от такового эпифитов (рис. 7). Доминирующей группой среди ассоцнантов животных были бактерии рода Bizionia (24 штамма или 20.2%), далее но численности располагались члены родов Gaetbulibacter, Psychroserpens, Salegentibacier и Gramella (14, 12, 10 и 10 штаммов или П.8, ЮЛ, 8.4 и 8.4%, соответственно).

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что таксономический состав культивируемых бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ морской среды, различается, что, вероятно, коррелирует с изменяющимися факторами среды Он характеризуется необычайно широким спектром уникальных видов, большая часть которых была описана нами впервые

Глава 6. Экофизиологические особенности аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из акваторий Тихого Океана

Изолированные чистые культуры бактерий являются гетеротрофными и аэробными организмами с широким спектром органических субстратов, используемых в качестве источников углерода и энергии

Все бактерии относятся к мезофильным организмам, пределы роста которых находятся между 4 и 49°С Нами обнаружена тенденция к психрофильному росту среди изолятов Так, нижние пределы роста 96% штаммов составили 4-6 °С и более 50% штаммов росли до 28-36°С, при этом максимальная температура роста 43 8% штаммов составила 28-34°С Эти результаты коррелируют с данными филогенетического анализа, которые показали близкие эволюционные связи бактерий, изолированных как в нашем регионе, так и в антарктических водах При изучении выделенных штаммов впервые были обнаружены новые бактерии, принадлежащие к родам Algoriphagus, Gillisia, Polaribacter и Salegentibacter, представители которых отличались психрофильными свойствами и были выделены ранее только из полярных мест обитания

Изолированные бактерии росли при концентрациях хлористого натрия в среде от 0 до 18% Большая часть изолятов (394 или 88 1%) демонстрировала галлофильные свойства, рост 53 (11 9%) штаммов происходил на питательных средах, не содержащих хлорида натрия или морской воды Верхние пределы роста более половины штаммов (278 или 62 2%) составили 6-8% NaCl, примерно одинаковое число изолятов росли до 5 и 10-18% NaCl (87 и 82 штамма, или 19 5 и 18 3%, соответственно) Среди штаммов обнаружены новые галофильные бактерии родов Gramella, Mesoma и Salegentibacter, которые не растут в отсутствие соли или морской воды и рост которых наблюдался при концентрации хлористого натрия более 15% С другой стороны, из морской среды впервые были изолированы новые галотолерантные бактерии родов Cyclobacterium, Echinicola, Leeuwenhoekiella, Mariniflexile и Pontibacter, рост которых существенно не зависит от наличия хлористого натрия или морской воды в питательной среде

Таким образом, способность к росту в широком диапозоне температур и солености может рассматриваться в качестве полезных адаптаций, помогающих бактериям данной таксономической группы, которые часто изолируются из прибрежных мест обитания, выживать в постоянно изменяющихся условиях окружающей среды

На агаризованных питательных средах все изоляты образовывали колонии желтого, розового или красного цвета благодаря продукции каротиноидных и

флексирубиновых пигментов Синтез каротиноидных пигментов также можно рассматривать в качестве полезной адаптации, защищающей клетки бактерий от действия солнечной радиации

6.1. Бактерии типа Bacteroidetes - продуценты протеаз, гликаназ, нуклеаз и липолитических ферментов

Бактерии типа Bacteroidetes часто рассматриваются как одни из важных деструкторов органических веществ (Bowman, Abel, 2005, Reichebach, 1989, 1992) Широкое распространение Bacteroidetes в морской среде, вероятно, можно объяснить обширным спектром адаптаций бактерий к условиям среды обитания

Для изучения участия морских Cytophaga-подобных бактерий, обитающих в акваториях Тихого океана, в круговороте углерода, азота и фосфора был проведен скрининг продуцентов гликаназ (амилазы, агаразы, альгиназы, хитиназы), эстераз, протеаз (желатиназ, эластаз и казеиназ), нитратредуктаз и щелочных фосфатаз, соответственно

Гидролитическая активность была изучена у 447 штаммов морских Cytophaga-поцобтлх бактерий Анализ результатов данного исследования показал, что все тестируемые бактерии продуцировали щелочные фосфатазы и 176 (38 8%) редуцировали нитраты до нитритов Большинство изолятов были способны продуцировать широкий спектр гидролитических ферментов (табл. 4) Число штаммов, которые гидролизовали протеины (казеин и желатин), составило 164 (36 7%) и 373 (83 4%), соответственно. Следует отметить, что продуценты желатиназ были наиболее многочисленными как среди представителей класса Flavobacteria (356 штаммов или 83 2%), так и среди бактерий класса 'Sphingobacteria' (15 штаммов или 78 9%) Примерно одинаковое количество штаммов вышеперечисленных филогенетических кластеров разрушали полисахариды Так, гидролиз агара, важного компонента клеточных стенок красных водорослей, осуществляли 228 (53 3%) флавобактерий и 11 (57 9%) флексибактерий Амилолитической активностью обладали 251 (58 6%) представителей Flavobacteria и И (57 9%) 'Sphingobacteria' Хитинолитической активностью обладали только 12 (2 7%) штаммов, все они относились к классу Flavobacteria Ни один из изученных штаммов не продуцировал целлюлазы, хотя многие образовывали кислоту из целлобиозы, промежуточного продукта гидролиза целлюлозы Среди штаммов, гидролизующих твины, преобладали продуценты эстераз, действующие на твин 20 и твин 40 [325 (72 7%) и 327 (73 1%) штаммов, соответственно] В то же время, продуцентов эстераз, разрушающих твин 80, было гораздо меньше (219 штаммов или 49%) Нуклеазная активность была определена у 151 (33 8%) штамма (табл 4)

Таблица 4 Гидролитическая активность морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes

Таксон Кол-во штаммов Твин 20 Твин 40 Твин 80 Агар Казеин Желатин Крахмал Хитин ДНК

Тип Bacteroidetes 447 325 (72 7) 327 (73 1) 219(49 0) 240 (53 7) 164(36 7) 373 (83 4) 266 (59 5) 12(2 7) 151 (33 8)

Класс Flavobacteria 428 313 (73 1) 311 (72 7) 207 (48 4) 228 (53 3) 160(37 4) 356 (83 2) 251 (58 6) 12 (2 8) 143 (33 4)

Algibacter 8 5 (62 5) 4(50) - 8(100) - 8(100) 7 (87 5) - 1(12 5)

Aquimarina 13 13 (100) 13(100) 13(100) - 12 (92 3) 12(92 3) 12(92 3) 6 (46 1) 12 (92 3)

Arembacler 18 4 (22 2) 9(50) 2(11 1) - 2(11 1) 4 (22 2) - - 4 (22 2)

Biztoma 24 7(292) 10(41 7) 6(25) - 22(917) 23 (95 8) 7 (29 2) - 1(4 2)

Cellulophaga 72 63 (89 7) 57 (79 4) 31(43) 72 (100) 41 (55 5) 72(100) 62 (88 5) 1(14) 36 (50)

Formosa 23 15(65 2) 12(52 2) 6 (26 1) 20 (87) 1(4 3) 21 (91 3) 22 (95 6) - -

Gaetbuhbacter 14 6 (42 8) - - - - И (79 3) 10(71 4) - -

Gilhsia 3 1 (33 3) 2 (66 7) 2 (66 7) - 3 (100) 3 (100) 2 (66 7) - 2 (66 7)

Gramella 12 5(417) 7 (58 3) 8 (66 7) - 9(75) 11 (91 7) 7 (58 3) - 2(16 7)

Leeuwenhoekiella 2 1(50) 2(100) 2(100) - 1(50) 2(100) 1(50) - -

Maribacter 75 63 (83 8) 68 (90 5) 39(51 3) 46 (62 2) 5(6 8) 39(51 3) 18(24 3) - 8 (10 8)

Marimflexile 2 - - - - - 2(100) - - -

Mesoma 9 9 (100) 8 (88 9) 7 (77 8) - 7 (77 8) 9(100) - - -

Polaribacter 3 1 (33 3) 2 (66 7) 2 (66 7) 1 (33 3) 2 (66 7) 3 (100) 2(667) - 2

Psychroserpens 12 6(50) 3(25) 6(50) - 6(50) 11 (91 7) 5 (41 7) - -

Salegentibacter 22 15 (68 2) 17 (77 8) 16(72 7) 2(9 1) 8 (36 10 21 (95 4) 21 (95 4) - 13(59 1)

Tenacibacuhim 12 10(83 3) 11(91 7) 11 (91 7) - 11 (917) 12(100) 2 (16 7) - 4(33 3)

Ulvibacter 5 5(100) 5(100) 3(60) - 1(20) 4(80) 1(20) - 2(40)

Winogradskyella 19 15 (78 9) 15 (78 9) 13 (68 4) 6(31 6) 8(42 1) 17 (88 4) 12(63 1) - 2(10 5)

Zobellia 75 67 (89 3) 64 (85 4) 39(52) 73 (97 3) 17(22 7) 68 (90 7) 59 (78 7) 5(6 7) 53 (70 7)

Другие 5 3(60) 3(60) 2(40) - 4(80) 4(80) 2(40) - 1(20)

Класс 19 9(47 4) 12 (63 2) 7 (36 8) И (57 9) 2(10 5) 15 (78 9) 11 (57 9) - 6(31 6)

Sphingobacteria

Algortphagus 8 4 (50 0) 6(75 0) 4 (50 0) 7 (87 5) 1(12 5) 8(100) 5 (62 5) - 1 (12 5)

Echinicola 4 2(50) 3(75) 2(50) 3(75) - 1(25) 4(100) - -

Roseivirga 3 1 (33 3) 1 (33 3) - - - 3 (100) - - 2 (66 7)

Другие 4 2(50) 2(50) 1(25) 2(50) 1(25) 3(75) 2(50) - 3(75)

Примечание в скобках дано процентное содержание активных штаммов

Эктогидролитическая активность морских Bacteroidetes хорошо коррелирует с их таксономической структурой Так, отмеченное выше доминирование членов родов Maribacter, Zobellia и Cellulophaga, возможно, обусловлено продукцией обширного спектра гидролитических ферментов, способных гидролизовать фосфатные соединения, липиды, полисахариды, протеины и нуклеиновые кислоты, а также конвертировать нитраты в нитриты Штаммы нумерически значимых родов Formosa, Salegentibacter, Winogradskyella и Aquimarina также показали высокий процент гидролитической активности Наиболее встречаемые эпибионты животных, аффилированные с родами Bizionia, Gaetbulibacter, Psychroserpens и Gramella, продуцировали протеолитические ферменты (от 50 до 100%) Кроме того, от 10 до 79 2% штаммов продуцировали сероводород, образующийся при разложении белков Возможно, некоторые из изолированных штаммов являются оппортунистическими патогенами животных

6.1.1. Бактерии типа Bacteroidetes — продуценты фукоиданаз

Морские Cytophaga- подобные бактерии являются продуцентами ферментов, гидролизующих фукоиданы, гетерополисахариды бурых водорослей, представлящие большой интерес с точки зрения биологической активности (Sakai et al, 2002, Berteau, Mulloy, 2003, Кузнецова и др, 2004, Colín et al, 2006) Для определения способности изолированных нами бактерий гидролизовать фукоиданы, был проведен скрининг продуцентов фукоиданаз, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи между остатками сульфатированной фукозы в фукоидане, среди 51 штамма, изолированных из бурых, зеленых и красных водорослей, морского ежа Strongylocentrotus intermedius и голотурии Stichopus japonicus, собранных в Японском море

Таблица 5 Удельная активность гликозилгидролаз в экстрактах наиболее активных морских бактерий семейства Flavobacteriaceae

ПМ-полиманнуроновая кислота, ПГ-полигулуроновая кислота, ФФ и ФЛ - фукоиданы, выделенные из бурых водорослей F evanescens и L cichorioides, соответственно, Л-ламинаран, АП-амилопектин, нмоль/ч мг белка_

№ Таксономическое ... Субстрат , Штамм ——-——

п/п положение ПМ ПГ ФФ ФЛ Л АП

Зеленая водоросль Acrosiphoma sonden

1 Formosa sp KMM3901T 1137 6 907 3 98 3 48 8 50 1 101 9

2 Mesonia algae KMM 3909T 0 0 55 0 0 0 3 1

Морской еж Strongylocentrotus intermedius

3 Winogradskyella KMM62n „ 69 524 15 2 72 0 sp

4 Gramella sp_KMM 6054 0 0 56 8 5 5 48 7 156 6

Фукоиданы, выделенные их бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides, служили субстратами

В результате проведенных исследований оказалось, что более 40%

штаммов продуцировали фукоиданазы Высокий уровень фукоиданазной активности был отмечен у 4 изолятов, включая типовые штаммы видов Mesoma algae КММ 3909т и Formosa agariphila КММ 3901т, изолированные из зеленой водоросли Acrosiphonia sonden, и штаммы Winogradskyella sp КММ 6211 и Gramella sp КММ 6054, ассоциированные морским ежом Strongylocentrotus intermedius (табл 5), которые были отобраны для дальнейших исследований по установлению структур фукоиданов В отличие от штамма Formosa agariphila КММ 3901Т, который наряду с фукоиданазами продуцировал и высоко активные альгинат-лиазы, остальные штаммы не продуцировали других полисахараз, которые обычно осложняют изоляцию фукоиданаз и затрудняют изучение их свойств и специфичности

6.2. Морские Cytophaga-поцобные бактерии - потенциальный источник гликозидаз

Деполимеризация таких биомолекул как агар, каррагинан, хитин, крахмал и другие отмечена не у всех изученных бактерий (табл 4) Чтобы изучить способность Cytophaga-подобных бактерий гидролизовать более короткие фрагменты полимеров до би- или мономеров, был проведен скрининг продуцентов гликозидаз среди 351 штамма. Более 60% штаммов типа Bacteroidetes продуцировали а- и р-галактозидазы, Р-глюкозидазы, а-маннозидазы, р-ксилозидазы и p-jV-ацетил-глюкозаминидазы (табл 6) Количество штаммов, синтезирующих а-фукозидазы и а-Л^-ацетил-галактозаминидазы было значительно меньше, составляя 30 8 и 33 3%, соотвественно. Подобное соотношение штаммов-продуцентов выше перечисленных гликозидаз наблюдалось и среди бактерий сем Flavobacteriaceae Среди членов класса 'Spingobacteria' было обнаружено существенно больше продуцентов гликозидаз, кроме a-TV-ацетил-галактозаминидаз, что, вероятно, можно объяснить количеством тестируемых штаммов

Широкий спектр гликозидазной активности продемонстрировали представители родов Cellulophaga и Zobellia, которые также участвовали в деградации биомакромолекул (табл 4), т е эти бактерии могут быть отнесены к организмам с широкой экологической нишей. Бактерии рода Maribacter достаточно слабо гидролизовали крупные молекулы природных полимеров, но более 80% штаммов этого таксона активно продуцировали гликозидазы Более выраженная специализация в гидролизе гликозидных связей наблюдалась среди штаммов рода Arembacter, которые наиболее активно гидролизовали все изученные гликозидные связи (72-94% штаммов), хотя они слабо осуществляли деполимеризацию биомолекул, имея более узкую экологическую нишу по сравнению с целлюлофагами и зобелиями Высокий процент продуцентов а- и р-галактозидаз, которые участвуют в гидролизе агара, отмечен как среди агаролитических бактерий родов Cellulophaga и -Zobellia,

Таблица 6 Гликозидазная активность бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из акваторий Тихого Океана

Таксон Кол-во штаммов а-галакто-зидаза /?-галакто-зидаза /3-ГЛЮКОЗИ- даза a-N- ацетил-галактозами нидаза P-N- ацетил-глюкозамин идаза а- маннози-даза а-фукози-даза Д-ксилози-даза

Тип Bacteroidetes 351 237 (67 5%) 251 (71 5%) 278 (79 2%) 117 (33 3%) 277 (78 9%) 224 (63 8%) 108 (30 8%) 248 (70 6%)

Класс Flavobacteria 338 222 (65 7%) 235 (69 5%) 262 (77 5%) 110(32 5%) 265 (78 4%) 213 (63%) 100(29 7%) 233 (69%)

Algibacter 7 2 (28 6%) 6 (85 7%) 7 (100%) - 4 (57 1%) 3 (42 9%) 3 (42 9%) 3 (42 9%)

Aquimarina 11 - 1 (9 1%) 3 (27 3%) 2(18 2%) 6 (54 6%) 7 (63 6%) 8 (72 7%) 2(18 2%)

Arembacter 16 16(100%) 14 (87 5%) 16(100%) 13 (81 2%) 15 (93 7%) 15(93 7%) 13(812%) 12(75%)

Bizioma 18 3(16 7%) 6 (33 3%) И (61 1%) 8 (44 4%) 16(88 9%) 10(55 5%) 5 (27 2%) 5 (27 2%)

Cellulophaga 62 54 (87 1%) 55 (88 7%) 45 (72 6%) 9 (14 5%) 44 (71%) 44 (71%) 1 (1 6%) 47 (75 8%)

Formosa 21 8(38 1%) 15(71 4%) 15(71 4%) 5 (23 8%) 17(81%) 4(19%) 12(57 1%) 18(85 7%)

Gaelbuhbacter 2 1 (50%) - 2 (100%) - 2 (100%) - 1 (50%) 2 (100%)

Gillisia 2 1 (50%) 1 (50%) 2 (100%) - 2(100%) - - 1 (50%)

Gramelta 9 4 (44 4%) 5 (55 5%) 9 (100%) - 6 (66 7%) - - 5 (55 5%)

Leeuwenhoekiella 1 1 (100%) - 1 (100%) - - - - -

Maribacter 65 60 (92 3%) 62 (95 4%) 58 (89 2%) 37 (56 8%) 55 (84 6%) 51 (76 7%) 20 (30 5%) 58 (89 2%)

Manmflexile 1 - 1 (100%) 1 (100%) - 1 (100%) - 1 (100%) 1 (100%)

Mesoma 7 - - 3 (42 9%) 1 (14 3%) 7 (100%) - 1 (14 3%) -

OUeya 1 1 (100%) - 1 (100%) - 1 (100%) - 1 (100%) 1 (100%)

Polaribacter 2 - 1 (50%) 1 (50%) - 1 (50%) - - 1 (50%)

Tenacibaculum 6 - - - - 6 (100%) - - -

Ulvibacter 5 2 (40%) 2 (40%) 2 (40%) - 4(80%) 2 (40%) - 2 (40%)

Vitellibacter 1 - - - - 1 (100%) 1 (100%) - -

Winogradskyella 19 1 (5 3%) - 13(68 4%) - 15 (78 9%) 4(21%) 7 (36 8%) 1 (5 3%)

Zobellia Класс Sphingobacteria 71 62 (87 3%) 71 (100%) 61 (85 9%) 33 (46 5%) 52 (73 2%) 65 (91 5%) 24 (33 8%) 66 (92 9%)

13 12 (92 3%) 13 (100%) 12(92 3%) 4 (30 8%) 8(61 5%) 9 (69 2%) 6(461%) 12(92 3%)

Algoriphagus 5 4 (80%) 5 (100%) 4 (80%) 1 (20%) 3 (60%) 5 (100%) 2 (40%) 4 (80%)

Cyclobacterium 1 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%)

Echimcola 3 3(100%) 3 (100%) 3 (100%) - 2 (66 7%) 3 (100%) 3 (100%) 3(100%)

Reichenbachiella 1 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) - 1 (100%) - - 1 (100%)

Rosemrga 3 3 (100%) 3(100%) 3 (100%) 2 (66 7%) 1 (33 3%) 2 (66 7%) 1 (33 3%) 3 (100%)

так и среди членов рода АгетЬас1ег, для которых способность к гидролизу агара ранее не сообщалась Все тестируемые штаммы родов А^ЬаОег, АгетЬаМег, ОгатеЦа и За^епиЬа&ег продуцировали Р-глюкозидазы Несмотря на то, что среди изученных бактерий было обнаружено только 12 (2 7%) продуцентов хитиназ (табл 4), число штаммов, обладающих /2-#-ацетилглюкозаминидазной активностью, превышало 50% для всех родов, кроме Яояеы^а (табл 6)

Следовательно, на основании полученных данных, можно предположить, что бактерии типа Вас1ег<ж1е1е5 являются активными деструкторами полисахаридов морской среды, разрушая их на крупные фрагменты при помощи гликаназ и далее гидролизуя их до би- и мономеров гликозидазами Более того, учитывая способность морских Cytophaga-noдo6ныx бактерий утилизировать сахара, часто до образования кислоты, можно предполагать возможность осуществления полного гидролиза данных соединений бактериями типа ВаШго1с1е1е5 Высокая гидролитическая активность, возможно, играет и защитную роль, так как бактерии данной таксономической группы обладают низким уровнем продукции антибиотических веществ В целом полученные нами данные свидетельствуют, что морские Вас1его1с!е1ез могут рассматриваться как группа бактерий, активно осуществляющая ремедиацию органического вещества океанов

6.2.1. АгетЬас(ег Шепсшя КММ 426т - продуцент уникальной а-Л-ацетилгалактозаминидазы

В результате исследования гликозидазной активности морских бактерий типа Вас1егсийе1е$ был обнаружен штамм АгетЬаМег Шепыш КММ 426т, который отличался от других тестируемых изолятов высокой удельной а-Ы-ацетилгалактозаминидазной активностью по п-нитрофенил-Т^-ацетил-а-О-галактозаминиду и субстратной специфичностью к А-антигенам эритроцитов

а-/У-ацетилгалактозаминидаза

СаШАсаЧ1^3)-Са1Р(1^4)С1с^сР(1-^3)-Са1Р(1->4)-С1с-церамид

2 Г 1

Киса А (II)

ваф (1->4)С^Аф(1->3)-Саф(1->4)-С1с- церамид 2 Т 1

Риса О (I)

Рис 8 Модификация группового вещества крови А а-Л^ацетил-галактозаминидазой

» т

человека а-АГ-Ацетилгалактозаминидаза, выделенная из штамма КММ 426 , инактивировала групповую специфичность А(П)-эритроцитов человека,

конвертируя их в клетки группы крови О (I) и не оказывая влияния на B(III)-эритроциты, в физиологических условиях (рН 7.0-8 0) (рис 8) Препарат a-N-ацетилгалактозаминидазы характеризуется общей активностью 139 Ед и удельной активностью 23 Ед /мг белка и не содержит примеси других гликаназ и гликозидаз Молекулярная масса фермента составляет 84 кДа по данным гельфильтрации на сефарозе CL-4B фирмы "Pharmacia" (Швеция). Фермент имеет оптимум действия при рН 7 0-8.0, требуемый для проведения реакции трансформации эритроцитов человека группы крови А в О (Н) в щадящих эритроциты условиях Фермент термостабилен сохраняет 100% активности по и-нитрофенил-а-О-галактопиранозиду в течение 10 минутного прогревания при 50° С и рН 7,2

6.3. Roseivirga echinicomitans КММ 6058х - продуцент индольных метаболитов

Из экстракта культуральной жидкости новой морской бактерии Roseivirga echinicomitans КММ 6058т, ассоцианта морского ежа Strongylocentrotus intermedins, были выделены моно- и диацетилтриптамины [ЛГ-ацетил-(1) и N,N-диацетил-(2) триптамины, соответственно], основой структуры которых является индольное кольцо (рис 9) Лг,Лг-диацетилтриптамин-(2) выделен из природного источника и получен синтетическим путем впервые Моноацетилированный триптамин был выделен ранее из актинобактерии Streptomyces staurospores АМ-2282 (Shu-Wei, Cordell, 1997) и морской бактерии Cytophagasp AM 13 1 (Shaaban et al, 2002) Триптамин может образовываться в клетках бактерий из аминокислоты триптофана (Дворникова, 1980) Триптамины также обнаружены в растениях и животных и включают большую группу биологически активных веществ, обладающих нейромедиаторным, гормональным и иммуномодулирующим действием Проведенные нами эксперименты показали, что спиртовый экстракт морского ежа не содержит подобных веществ, что подтверждает бактериальное происхождение соединений 1 и 2 При изучении биологической активности соединения 1 и 2 проявляли слабую цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам карциномы Эрлиха (табл 7) Данные по гемолитической активности соединений 1 и 2 показали, что N,N-диацетилтриптамин (2) имеет более высокую активность, чем N-диацетилтриптамин (1) Оба соединения были проверены на способность нарушать целостность мембран спермиев и яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius Как видно из таблицы 5, соединение 2 вызывало 50% нарушение целостности мембран у спермиев и яйцеклеток при концентрациях 7 5 и 15 мкг/мл, соответственно При концентрации 50 мкг/мл соединение 1 не оказывало влияния на целостность мембран указанных клеток Разница в цитотоксической активности обоих соединений была отмечена также при использовании в качестве биологической модели оплодотворенных яйцеклеткок морского ежа При концентрации 50 мкг/мл 1 не ингибировал развитие эмбрионов, а соединение 2 при этой же концентрации вызывало 100% остановку деления эмбрионов

13 14

15=16

Рис 9 Соединения 1 (Ri=H, R2=COCH3) и 2 (R,=R2=COCH3)

Возможно, при определенных условиях выделенные ацетилтриптамины, особенно М,ЛГ-диацетилтриптамин, могут влиять на развитие популяций морского ежа 81гоп^у1осеШгоШ8 ¡МегтесЬш, ценного объекта промысла в Тихоокеанском регионе

Таблица 7. Биологическая активность соединений ТУ-диацетилтриптамина (1) и ДАГ-диацетилтриптамина (2), выделенных из штамма морской бактерии

Соединение 1* 2* з* 4*

спермии яйцеклетки

1 >50 >50 0 >50 >100

2 75 15 100 >6 25<12 5 100

1* Концентрация (мкг/мл), приводящая к 50% нарушению целостности мембран спермиев и яйцеклеток морского ежа

2* Процент ингибирования деления оплодотворенных яйцеклеток морского ежа при концентрации веществ 50 мкг/мл

3* Концентрация вещества (мкг/мл), вызывающая 100% гемолиз мышиных эритроцитов

4* Концентрация вещества (мкг/мл), вызывающая 50% гибель опухолевых клеток карциномы

Эрлиха

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Flavobacteria и 'Sphingobacteria' Следует отметить, что только 4 филотипа были идентичны ранее опубликованным В результате дальнейшего исследования таксономического статуса изолятов при помощи полифазного метода были достоверно идентифицированы и описаны 45 новых видов бактерий в составе 8 известных и 18 новых родов В данном исследовании были также уточнены и дополнены диагнозы родов Algoriphagus и Formosa на основании вновь полученных данных Роды Hongiella и Chimaereicella реклассифицированы в род Algoriphagus Род и вид Gaetbulimicrobium brevivitae реклассифицирован как Aquimarina brevivitae comb nov Молекулярные и фенотипические свойства изолированных нами бактерий послужили основанием для реклассификации видов с неопределенным таксономическим положением [Cytophaga] latercula и [Cytophaga] marino/lava в новые роды Aquimarina и Leeuwenhoekiella, соответственно Полученные новые знания значительно расширили наши представления о биологии, экологии, видовом составе и филогенетических взаимосвязях морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes

При изучении выделенных мезофильных штаммов впервые были обнаружены новые бактерии, принадлежащие к родам Algoriphagus, Gilhsia, Polaribacter и Salegentibacter, представители которых были выделены ранее только из полярных мест обитания и отличались психрофильными свойствами Более того, в настоящем исследовании описан новый род и вид бактерий Leeuwenhoekiella aequorea, штаммы которого были изолированы из антарктической морской воды и из морского ежа Strongylocentrotus intermedius, обычного представителя фауны Японского моря

В процессе изучения морфологии клеток нового вида бактерий Formosa agariphila, ассоциированной с зеленой водорослью Acrosiphonia zonderi, впервые обнаружен неизвестный ранее для Cytophaga-подобных бактерий тип размножения - почкование

Исследование таксономической структуры культивируемых морских бактерий типа Bacteroidetes изученных нами микробных сообществ выявило доминирование членов сем Flavobacteriaceae (428 штаммов или 941%) Показано, что бактерии родов Zobellia, Maribacter и Cellulophaga, насчитывающие 75, 75 и 72 штамма, соответственно, являются наиболее многочисленными как среди представителей сем Flavobacteriaceae, так и среди членов типа Bacteroidetes

Анализ метаболического потенциала показал, что морские аэробные бактерии типа Bacteroidetes активно участвуют в круговороте фосфора, азота и углерода Все тестируемые бактерии продуцировали щелочные фосфатазы и 176 (38 8%) редуцировали нитраты до нитритов Большинство изолятов продуцировали широкий спектр гидролитических ферментов, включая протеазы (желатиназы и казеиназы), полисахаразы (агаразы и амилазы), липазы и ДНК-азы Кроме того, изученные штаммы показали высокий уровень гликозидазной активности

В результате проведенного скрининга впервые получен и детально охарактеризован штамм новой морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426т, продуцирующий фермент a-N-ацетилгалактозаминидазу, обладающий

специфичностью к групповым веществам А эритроцитов человека в физиологических условиях и удовлетворяющий требованиям биотехнологии

В процессе настоящего исследования была создана коллекция морских бактерий типа Bacteroidetes в составе Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, которая содержит типовые штаммы, штаммы-продуценты биологически активных веществ и микроорганизмы, идентификация которых продолжается в настоящее время

ВЫВОДЫ

1 Исследование неизученных ранее аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes бассейна Тихого океана показало, что они широко распространены в морских экосистемах и являются постоянным компонентом мезофильных микробных сообществ Новые знания о биологических и экологических особенностях культивируемых морских бактерий классов Flavobacteria и 'Sphingobacteria' существенно расширили представления о таксономическом составе, филогении, экологических и физиологических особенностях морских Cytophaga-подобных бактерий

2 На основании применения полифазного метода выявлено значительное таксономическое разнообразие аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ Идентифицированы бактерии, принадлежащие к 32 родам и 49 видам, из которых 45 таксонов представителяют новые эволюционные линии 15 новых видов описано в составе известных родов Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gdhsia, Polaribacter, Salegentibacter и Zobellia, 30 видов - в составе 18 новых родов Algibacter, Aquimarina, Arenibacter, Bizionia, Echinicola, Fulvivirga, Gramella, Leeuwenhoektella, Maribacter, Marimflexile, Mesonia, Pibocella, Pontibacter, Reichenbachiella, Roseivirga, Ulvibacter, Vitellibacter и Winogradskyella

3 Впервые определена таксономическая структура культивируемых аэробных морских бактерий типа Bacteroidetes, которая характеризуется доминированием представителей семейства Flavobacteriaceae класса Flavobacteria Бактерии класса 'Sphingobacteria', вероятно, являются минорным компонентом изученных микробных сообществ Показано, что члены родов Cellulophaga, Maribacter и Zobellia являются наиболее многочисленными таксономическими группами среди морских бактерий сем Flavobacteriaceae и аэробных бактерий типа Bacteroidetes

4 Обнаружен неизвестный ранее для бактерий типа Bacteroidetes способ размножения клеток - почкование

5 Морские аэробные бактерии типа Bacteroidetes обладают высоким уровнем нитратредуктазной и гидролитической активности, включая фосфатазную, прот еолитическую, гликаназную, липолитическую и нуклеазную Отобраны штаммы-продуцунты гликозил-гидролаз, перспективные для биотехнологии

6 Идентифицирован и детально охарактеризован штамм Arenibacter latericius КММ 42бт-продуцент уникальной а-ТУ-ацетилгалактозаминидазы, инактивирующей А-эритроциты крови человека в физиологических условиях

7 Создана коллекция морских бактерий типа Bacteroidetes в составе Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, которая содержит типовые

штаммы, штаммы-продуценты биологически активных веществ и микроорганизмы, представляющие новые эволюционные линии, и является фундаментальным базисом для изучения таксономического разнообразия и биологической активности и поиска продуцентов метаболитов, имеющих биотехнологическое значение

Список основных публикаций по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1 Бакунина И Ю , Иванова Е П, Михайлов В В , Недашковская О.И, Горшкова Н М , Парфенова В В Распространение a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских и пресноводных микроорганизмов//Микробиология 1994 Т 63 №5 С 847-853

2 Лукьянов П А, Новикова О Д, Михайлов В В , Недашковская О.И., Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Каррагиназная активность бактериальных штаммов, ассоциированных с красными водорослями из района Курильских островов//Биология моря 1994 Т 20 №6 С 472-473

3 Иванова Е П , Бакунина И Ю , Недашковская О.И., Горшкова Н М , Михайлов В В , Елякова Л А Распространение морских микроорганизмов, продуцирующих ß-Af-ацетилгалактозаминидазы, а-галактозидазы, a-N-ацетилгалактозаминидазы // Биология моря 1998 Т 24 №6 С 351-358

4 Бакунина И Ю , Шевченко Л С, Недашковская О.И., Шевченко Н М, Алексеева С А, Михайлов В В , Звягинцева Т Н Поиск фукоидангидролаз среди морских микрооорганизмов // Микробиология 2000 Т 69 №3 С 370-376

5 Бакунина И Ю , Кульман Р А , Лихошерстов Л М , Мартынова М Д, Недашковская О.И., Михайлов В В , Елякова Л А а-МАцетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426т, устраняющая групповую специфичность А-эритроцитов // Биохимия 2002 Т 67 № 6 С 830-837

6 Воробьева Е В , Красикова И Н, Дмитренок А С, Дмитренок П С, Исаков В В , Недашковская О.И, Соловьева Т Ф Характеристика необычного липида А моносахароидной природы из морской бактерии Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199х// Биоорг химия 2006 Т 32 № 5 С 538-545

7 Томшич С В , Командрова Н А, Видмальм Г, Недашковская О.И., Шашков А С, Перепелов А В Структура кислого О-специфического полисахарида морской бактерии Cellulophaga balhca //Биоорг химия 2007 Т 33 № 1,С 1-5

8 Урванцева А М, Бакунина И Ю, Недашковская О.И., Ким С Б, Звягинцева Т Н Распространение внутриклеточных фукоидан гидралаз и других ферментов, деградирующих полисахариды бурых водорослей, среди морских бактерий сем Flavobacteriaceae // Прикл Биохим Микробиол 2006 Т 42 №5 С 552-559

Статьи, опубликованные в ведущих зарубежных журналах

9 Ivanova Е Р , Nedashkovskaya O.I., Chun J , Lysenko A M , Frolova G M , Svetashev VI, Vysotsku M V , Mikhailov V V, Huq A, Colwell R R Arenibacter gen nov, a new genus of the family Flavobacteriaceae and descnption of new species, Arenibacter latericius sp nov // Int J Syst Evol Microbiol 2001 V 51 P 1987-1995

10 Nedashkovskaya O.I., Suzuki M , Vysotsku M V , Mikhailov V V Reichenbachia agariperforarts gen nov, sp nov, a novel marine bactenum in Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides phylum // Int J Syst Evol Microbiol 2003 V. 53 P 81-85

11 Nedashkovskaya O.I., Suzuki M , Vysotsku M V , Mikhailov V V Vitellibacter vladivostokensis gen nov, sp nov, a new member of the phylum Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides // Int J Syst Evol Microbiol 2003 V 53 P 1281-1286

12 Nedashkovskaya О I., Suzuki M , Vysotsku M V , Mikhailov V V Arenibacter troitsensis sp nov, isolated from marine bottom sediment//Int J Syst Evol Microbiol 2003 V. 53 P 1287-1290

13 Nedashkovskaya O.I, Kim S B , Han S K, Lysenko A M , Rohde M , Zhukova N V , Falsen E, Frolova G M , Mikhailov V V, Bae K S Mesoma algae gen nov, sp nov, a novel marine bactenum of the family Flavobacteriaceae isolated from the green alga Acrosiphonia sonderi (Kutz) Komm // Int J Syst Evol Microbiol 2003 V 53 P 1967-1971

14 Nedashkovskaya OA, Kim S B , Han S K, Rhee M S , Lysenko A M , Falsen E , Frolova G M , Mikhailov V V, Bae, K S Ulvibacter litoralis gen nov , sp nov, a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from the green alga Ulva fenestrata // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 119-123

15 Nedashkovskaya O.I., Suzuki M, Lysenko AM, Snauwaert C, Vancanneyt M, Swings J, Vysotsku M V, Mikhailov V V Cellulophagapacifica sp nov // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 609-613

16 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Hati S KL, Lysenko A M , Rohde M , Rhee M -S , Frolova G M , Falsen E, Mikhailov V V, Bae K S Maribacter gen nov, a new member of the family Flavobacteriaceae, isolated from marine habitats, containing the species Maribacter sedimenticola sp nov, Maribacter aquivivus sp nov, Maribacter orientahs sp nov and Maribacter ulvicola sp nov // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1031-1037

17 Nedashkovskaya O.I., Suzuki M, Vancanneyt M , Cleenwerk I, Zhukova N V , Vysotsku M V , Mikhailov V V, Swings J Salegentibacter holothuriorum sp nov, isolated from the edible holothurian Apostichopusjapomcus // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1121-1124

18 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Han S K, Lysenko A M , Mikhailov V V, Bae K S Arenibacter certesn sp nov, a novel marine bactenum isolated from the green alga Ulva fenestrata // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1187-1190

19 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Han S K, Rhee M -S , Lysenko A M , Rohde M , Zhukova N V , Frolova G M , Mikhailov V.V, Bae K S Algibacter lectus gen nov, sp nov , a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from green algae // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1271-1275

20 Nedashkovskaya O.I., Suzuki M , Vancanneyt M , Cleenwerck I, Lysenko A M , Mikhailov V V , Swings J Zobelha amurskyensis sp nov, Zobelha lammariae sp nov and Zobelha russellu sp nov, novel marine bacteria of the family Flavobacteriaceae // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1643-1648

21 Nedashkovskaya O.I., Vancanneyt M , Van Trappen S , Vandemeulebroecke K, Lysenko A M, Rohde M, Falsen E, Frolova G M , Mikhailov V V, Swings J Description of Algoriphagus aquimarinus sp nov, Algoriphagus chordae sp nov and Algoriphagus wirwgradskyi sp nov, from sea water and algae, transfer of Hongiella halophila Yi and Chun 2004 to the genus Algoriphagus as Algoriphagus halophilus comb nov and emended descriptions of the genera Algoriphagus Bowman et al 2003 and Hongiella Yi and Chun 2004 // Int J Syst Evol Microbiol 2004 V 54 P 1757-1764

22 Nedashkovskaya OA, Kim S B , Han S K, Snauwaert C , Vancanneyt M, Swings J, Kim K -O , Lysenko A M , Rohde M , Frolova G M , Mikhailov V V , Bae K S Winogradskyella thalassocola gen nov, sp nov, Winogradskyella epiphytica sp nov and Winogradskyella eximia sp nov, marine bacteria of the family Flavobacteriaceae // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 49-55

23 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lee K H , Bae K S , Frolova G M , Mikhailov V V , Kim I S Pibocella pond gen nov , sp nov , a novel marine bactenum of the family Flavobacteriaceae isolated from the green alga Acrosiphonia sonderi // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 177-181

24 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lysenko A M , Frolova G M, Mikhailov V.V, Lee K H, Bae K S Description of Aquimarina muelleri gen nov, sp nov, and proposal of the reclassification of [Cytophaga] latercula Lewin 1969 as Stanierella latercula gen nov, comb nov //Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 225-229

25 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lee D H , Lysenko A M , Shevchenko L S , Frolova G M , Mikhailov V V , Lee K H , Bae K S Roseivirga ehrenbergu gen nov, sp nov, a novel marine bactenum of the phylum 'Bacteroidetes', isolated from the green alga Ulva fenestrata // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 231-234

26 Nedashkovskaya O.I., Kim SB, Lysenko AM, Mikhailov VV, Bae KS, Kim IS Salegentibacter mishustinae sp nov , isolated from the sea nrchin Strongylocentrotus mtermedius // Int

J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 235-238

27 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lee K H, Mikhailov V V , Bae K S Gillisia mitskevichiae sp nov, a novel bactenum of the family Flavobacteriaceae, isolated from sea water // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 321-323

28 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lysenko A M , Frolova G M , Mikhailov V V, Bae K S Bizioma paragorgiae gen nov , sp nov, a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from the soft coral Paragorgia arborea // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 375-378

29 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Lysenko A M , Frolova G M , Mikhailov V V , Bae K S , Lee D H , Kim I S Gramella echwicola gen nov, sp nov, a novel halophilic bactenum of the family Flavobacteriaceae isolated from the sea urchm Strongylocentrotus intermedius // frit J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 391-394

30 Nedashkovskaya O.I., Vancanneyt M, Dawyndt P, Engelbeen K, Vandemeulebroecke K, Cleenwerck I, Hoste B , Mergaert J, Tan T -L, Frolova G M , Mikhailov V V, Swings J Reclassification of [Cytophaga] marinoflava Reichenbach 1989 as Leeuwenhoekiella marinoflava gen nov , comb nov and description of Leeuwenhoekiella aequorea sp nov // Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 1033-1038

31 Nedashkovskaya OX, Kim S B , Lysenko A M, Park M S , Mikhailov V V, Bae K S , Park H -Y Roseivirga echinicomitans sp nov, a novel marine bactenum isolated from the sea urchm Strongylocentrotus intermedius, and emended descnption of the genus Roseivirga // Int J Syst Evol Microbiol V 55 P 1797-1800

32 Nedashkovskaya O.I., Kim SB, Lee MS, Park MS, Lee KH, Lysenko AM, Oh HW, Mikhailov V V , Bae K S Cyclobacterium amurskyense sp nov, a new manne bactenum isolated from sea water //Int J Syst Evol Microbiol 2005 V 55 P 2391-2394

33 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Suzuki M, Shevchenko L S , Lee M S , Lee K H, Park M S , Frolova G M , Oh H W , Bae K S , Park H -Y , Mikhailov V V Pontibacter actimarum gen nov, sp nov, a new member of the phylum 'Bacteroidetes' and proposal of Reichenbachiella gen nov as replacement for the illegitimate, prokaryotic, genenc name Reichenbachia Nedashkovskaya el al 2003 //Int J Syst Evol Microbiol V 55 P 2583-2588

34 Nedashkovskaya O.I, Vancanneyt M, Cleenwerck I, Snauwaert C , Kim S B , Lysenko A M, Shevchenko L S , Lee K H , Park M S , Frolova G M , Mikhailov V V, Bae K S , Swings J Arembacter palladensis sp nov, a novel manne bactenum isolated from the green alga Ulva fenestrata, and emended description of the genus Arembacter //Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 155-160

35 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Vancanneyt M , Lysenko A M , Rohde M , Frolova G M , Zhukova N V , Mikhailov V V , Bae K S , Oh H W , Swings J Formosa agariphila sp nov, a badding flavobactenum isolated from manne environments, and emended descnption of the genus Formosa // Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 161-167

36 Nedashkovskaya O.I., Vancanneyt M , Chnstiaens L, Kalmovskaya NI, Mikhailov V.V , Swings J (2006) Aquimarina intermedia sp nov , and reclassification of Stamerella latercula Nedashkovskaya et al 2005 and Gaetbuhmicrobium brevivitae Yoon et al 2006 as Aquimarina latercula comb nov and Aquimarina brevivitae comb nov, respectively // Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 20372041

37 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Vancanneyt M, Lysenko A M , Shin D S , Park M S , Lee K H , Jung W J, Mikhailov V V, Bae K S, Swings J (2006) Echmicolapacijica gen nov, sp nov, a novel flexibactenum isolated from the sea urchm Strongylocentrotus intermedius // Int J Syst Evol Microbiol V 56 P 953-958

38 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Vancanneyt M, Shin D S , Lysenko A M, Shevchenko L S , Krasokhm V B , Mikhailov V V, Swings J, Bae K S Salegentibacter agarivorans sp nov, a novel manne flavobactenum isolated from the sponge Artemisina sp // Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 883-887

39 Nedashkovskaya O.I., Kim S B , Mikhailov V V, Bae K S Mariniflexile gromovn gen nov, sp nov, a new gliding bacterium isolated from the sea urchin Strongylocentrotus intermedius //Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 1635-1638

40 Nedashkovskaya O.I., Kim S В , Zhukova N V, Kwak J , Mikhailov V V , Bae К S Mesonia mobilis sp nov , a new marme bacterium isolated from sea water // Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 2433-2436

41 Pinhassi J , Bowman J P , Nedashkovskaya О I., Lekunberri I, Gomez-Consarnau L, Pedros-Alio С Leeuwenhoehella blandensis, sp nov, a genome-sequenced novel marme member of the family Flavobacteriaceae // Int J Syst Evol Microbiol 2006 V 56 P 1489-1493

42 Nedashkovskaya О I, Kim S В , Shin D S , Beleneva I A, Vancanneyt M , Mikhailov V V Echmicola vietnamensis sp nov, a new bacterium of the phylum Bacteroidetes isolated from sea water //Int J Syst Evol Microbiol 2007 V 57,761-763

43 Nedashkovskaya OI, Kim SB, Shin DS, Beleneva I A, Frolova GM, Mikhailov VV Fulvivirga kasyartova gen nov, sp nov, a novel member of the phylum Bacteroidetes isolated from sea water m the mussel farm//Int J Syst Evol Microbiol 2007 V 57 P 1046-1049

44 Nedashkovskaya ОI, Kim S В , Kwon К К, Shin D S , Luo X S , Kim S -J, Mikhailov V V Proposal of Algoriphagus vanfongensis sp nov, transfer of the genera Hongiella (Yi and Chun 2004) Nedashkovskaya et al 2004 and Chimaereicella Tiago et al 2006 to the genus Algoriphagus, and emended description of the genus Algoriphagus (Bowman et al, 2003) Nedashkovskaya et al 2004 // Int J Syst Evol Microbiol 2007 V 57 P 1988-1994

45 Nedashkovskaya О I, Vancanneyt M, Kim S В , Hoste В , Bae К S. Algibacter mikhailovn sp nov, a novel marine bacterium of the family Flavobacteriaceae, and emended description of the genus Algibacter//Ы J Syst Evol Microbiol 2007 V 57 P 2147-2150

46 Nedashkovskaya О I, Kim S В , Lysenko A M , Lee К H , Bae К S , Mikhailov V V Arembacter echmorum sp nov , a novel bacterium of the family Flavobacteriaceae // Int J Syst Evol Microbiol 2007 V 57, (in press)

47 Nedashkovskaya О I, Vancanneyt M , De Vos P, Kim S В , Lee M S , Mikhailov V V Maribacter polysiphoniae sp nov isolated from a red alga // Int J Syst Evol Microbiol 2007 V 57, (m press)

Статьи, опубликованные в других отечественных и зарубежных журналах

48 Олейникова Г К, Ивчук О И, Денисенко В А, Чайкина Е JI Мензорова Н И, Недашковская О.И., Кузнецова ТА Индольные метаболиты из новой морской бактерии Roseivirga echmicomitans КММ 6058т // Химия природн соедин 2006 Т 42 №6 С 713-717

49 Nedashkovskaya O.I., Kim S В , Lysenko А М , Mikhailov V V, Kim I S , Bae К S Polaribacter butkevichu sp nov, a novel marme mesophilic bacterium of the family Flavobacteriaceae // Curr Microbiol 2005 V 51 №6 P 408-412

50 Silipo A, Molinaro A , Nazarenko E L, Sturiale L , Garozzo D , Gorshkova R P , Nedashkovskaya O.I., Lanzetta R, Pamlli M Structural characterization of the carbohydrate backbone of the hpooligosacchande of the marine bacterium Arembacter certesu strain KMM 3 941T // Carbohydr Res 2005 V 340 № 16 P 2540-2549

51 Perepelov AV, Shashkov AS, Tomshich SV, Komandrova NA, Nedashkovskaya O.I. Pseudoaminic acid containing O-specific polysaccharide from a marine bacterium Cellulophaga fucicola //Carbohydr Res. 2007 V 342 №10 P 1378-1381

Патент

52 Недашковская О.И., Бакунина И Ю , Кульман Р А , Лихошерстов JI М , Мартынова М Д, Михайлов В В, Елякова JIА «Штамм бактерий Flavobacterium sp - продуцент a-N-ацетилгалактозаминидазы» Патент № 2141526 БИ № 32 от 20 11 99 г

Работы, опубликованные в материалах региональных и международных конференций и симпозиумов

53 Bakunina I Yu , Ivanova Е Р, Mikhailov V V , Nedashkovskaya O.I, Gorshkova N M , Elyakova L A Comparative study of the distribution of a-galactosidases and a-JV-acetylgalactomimdases among marine microorganisms Abstr Intern Sci Conf «Bridges of science between North America and

Russian Far East» Anchorage, Alaska, USA, Aug 25-27, Vladivostok, Russia, Aug 29-Sept 2, 1994 P 282

54 Mikhailov V V , Nedashkovskaya O.I., Novikova О D , Luk'yanov P A , Solov'eva T F , Ovodov Yu S Bacterial producers of carrageenases screening and characterization of enzyme activity // Abstr Intern Set Conf «Bridges of science between North America and Russian Far East» Anchorage, Alaska, USA, Aug 25-27, Vladivostok, Russia, Aug 29-Sept 2,1994 P 290

55 Bakunma I Yu, Ivanova В P, Nedashkovskaya O.I., Gorshkova N M, Elyakova L A Distribution peculiarities of the marine microorganisms producing chitobiases, a-galactosidases and ci-N-acetylgalactosamimdases from different area of the World Ocean Abstr Intern Conf North Pacific Marine Sci Org. (PICES) «Workshop on the Okhotsk Sea and adjancent Areas» Vladivostok, Russia June 19-24, 1995 P 43

56 Mikhailov V V, Romanenko L A , Nedashkovskaya O.I, Gorshkova N M , Ivanova E P Physiological peculiarities of microbial associations of Far-Eastern manne invertebrates //Microbial Biosystems New Frontiers Program & Abstracts Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), 9-14 August, 1998, Halifax, Nova Scotia, Canada, p 235-236

57 Недашковская О.И., Иванова E П, Бакунина И Ю , Михайлов В В Скрининг бактериальных a-iV-ацетилгалактозаминидаз, преобразующих эритроциты группы крови А в группу крови О Материалы II Дальневост региональн конф с всероссийским участием «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке, 27-29 апреля 1998 г, Владивосток» Дальнаука 1998 С 8

58 Недашковская О.И., Бакунина И Ю, Михайлов В В Морская бактерия Flavobacterium sp КММ 426-продуцент cwV-ацетилгалактозаминидазы, преобразующей эритроциты группы крови А в эритроциты группы крови О Материалы II Дальневост региональн конф с всероссийским участием «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке, 27-29 апреля 1998 г, Владивосток» Дальнаука 1998 С 74-75

59 Shevchenko L S , Oleynikova G К, Nedashkovskaya О.I., Mikhailov V V, Kuznetsova T A Biologically active substances produced by marine bactena associated with some invertebrates //Proc 9th International Symposium on Manne Natural Products (IX MaNaPro) Townsville, 5-10 July 1998, Australia, p A10

60 Бакунина И Ю, Бурцева Ю В , Сова В В , Шевченко Н М, Шевченко Л С, Недашковская О.И, Алексеева С А, Кусайкин М И, Урванцева А М , Михайлов В В , Звягинцева Т Н Распространение фукоиданаз в морских беспозвоночных и микроорганизмах // Absrtacts 2nd International Symposium Chemistry and Chemical Education 26-39 September 2000, Vladivostok, Russia Far-Eastern Umv Press, p 206

61 Бакунина И Ю , Недашковская О.И., Кульман Р А, Иванова Е П , Алексеева С А , Звягинцева Т Н, Михайлов В В, Елякова Л А Гликозид-гидролазы редкой специфичности из морских бактерий //Тез докл научн конф ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских микро- и макроорганизмов и растений Дальнего Востока" Владивосток Дальнаука 2001 С 14-15

62 Недашковская О.И., Куриленко В В , Шевченко Л С, Михайлов В В Фенотипическая характеристика бактерий филогенетического кластера Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides, обитающих в дальневосточных морях //Тез докл регион научн конф ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских микро- и макроорганизмов и растений Дальнего Востока " Владивосток Дальнаука 2001 С~ 137-139

63 Недашковская О.И. Изоляция и идентификация новых таксонов морских Cytophaga-подобных бактерий // Тез докл регион научн конф "Исследования в области физическо-химической биологии и биотехнологии" 16-18 ноября, 2004, Владивосток Дальнаука 2004 С 9

64 Воробьева Е В , Красикова И Н, Дмитренок А С , Дмитренок П С , Исаков В В , Недашковская О.И, Соловьева Т Ф Структура необычного липида А из морской бактерии Chryseobacterium indoltheticum СЕР 103168 //Тез докл регион научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 16-18 ноября 2004, Владивосток, Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН С 88

65 Nedashkovskaya O.I., Kim, S В Taxonomic diversity of the marine bacteria of the family Flavobacteriaceae inhabiting the Far-Eastern Seas 2004 Int Meeting of the Microbial Society of Korea May 13-14,2004. Sangnok Resort Convention Center, Cheonan, Korea P 27-29

66 Nedashkovskaya, O.I., Kim, SB, Bakunma, IY, Lysenko, AM, Lee, K-H, Park, HY, Mikhailov, V V , Bae, К S Isolation and characterization of Arembacter spp from different marine habitats "2004 Intern Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies 21-22 October, 2004, Seoul" Abstract Book, P 170 Poster no A030

67 Nedashkovskaya O.I., Kim S В , Vancanneyt, M , Lysenko, A M , Lee, К -H , Park, M S , Frolova, G M , Bakunina, I Yu, Oh, H W, Bae, К S , Mikhailov, V V "Isolation and identification of the novel flexibactena using polyphasic approach" IUMS Congress, 2005 San-Francisco, USA, July, 2005 Abstract 05-IUMS-A-2723-ASM

68 Олейникова Г К, Ивчук О И, Денисенко В А, Чайкина Е Л, Мензорова Н И, Недашковская О.И., Кузнецова ТА Индольные метаболиты из новой морской бактерии Roseivirga echimcomitans КММ 6058т // Тез. докл II per научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 19-21 декабря 2006 г Владивосток Дальнаука 2006 С 21

69 Недашковская О.И. Гидролитическая активность бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных акваторий Тихого Океана // Тез докл II Регион научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 19-21 декабря 2006 г Владивосток Дальнаука 2006 С 85

70 Недашковская О.И., Ванканнейт М, Ким С Б Algibacter luridus sp nov, новая агаролитическая бактерия сем Flavobacteriaceae, изолированная из морского ежа Strongylocentrotus intermedins II Тез докл II Регион научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 19-21 декабря 2006 г Владивосток Дальнаука 2006 С 83-84

71 Немцева ЮА, Терентьева НА, Недашковская О.И., Терентьев JIJI Исследование биосинтеза нуклеиновых кислот в клетках морских микроорганизмов и определение активности ферментов фосфорилирования предшественников синтеза ДНК // Тез докл II Регион научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 19-21 декабря 2006 г Владивосток Дальнаука 2006 С 86

72 Урванцева А М , Бакунина И Ю , Глазунов В П, Исаков В В , Недашковская О.И, Звягинцева Т Н Деполимеризация фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens под действием ферментов морских бактерий Н Тез докл II Регион научн конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" 19-21 декабря 2006 г Владивосток Дальнаука 2006 С 99

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать «18» сентября 2007 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Уел печ л 2 37 Заказ № 14549

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел 36-26-16,55-95-31 чты краски

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Недашковская, Ольга Ильинична

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Филогения и таксономическое разнообразие морских гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes

1.1. Таксономия и филогения

1.1.1. Класс Flavobacteria

1.1.1.1. Семейство Flavobacteriaceae

1.1.1.1.1. Род Cellulophaga

1.1.1.1.2. Род Formosa

1.1.1.1.3. Род Gillisia

1.1.1.1.4. Род Polaribacter

1.1.1.1.5. Род Salegentibacter

1.1.1.1.6. Род Zobellia

1.1.1.2. Семейство Cryomorphaceae

1.1.2. Класс '■Sphingobacteria'

1.1.2.1. Род Algoriphagus

1.1.2.2. Род Cyclobacterium

1.1.2.3. Род Hongiella

1.2. Хемотаксономические признаки морских бактерий типа Bacteroidetes

1.2.1. Пигменты

1.2.2. Клеточные жирные кислоты

1.3. Скользящее движение

ГЛАВА 2. Экофизиологические особенности морских бактерий типа

Bacteroidetes

2.1. Приспособляемость к условиям окружающей среды

2.2. Распространение в морских микробных сообществах

2.2.1. Встречаемость в микробных сообществах донных осадков

2.2.2. Распространение в морской воде

2.2.3. Разнообразие бактерий - ассоциантов водорослей и их роль в метаморфозе организма-хозяина

2.2.3.1. Альгицидная активность

2.2.4. Бактерии, ассоциированные с животными

2.2.4.1. Патогенные бактерии

ГЛАВА 3. Биологически активные вещества морских бактерий типа 58 Bacteroidetes

3.1. Первичные метаболиты

3.2. Вторичные метаболиты

ГЛАВА 4. Объекты и методы исследования

4.1. Источники выделения бактерий

4.2. Состав сред для изоляции и культивирования бактерий

4.3. Физиолого-биохимические методы

4.4. Методы изучения морфологии клеток

4.5. Хемотаксономические методы

4.5.1. Пигменты

4.5.2. Изопреноидные хиноны

4.5.3. Липиды

4.5.4. Определение антимикробной активности

4.6. Генетические методы

4.6.1. Выделение ДНК

4.6.2. Определение нуклеотидного состава ДНК

4.6.3. Определение уровня гомологии ДНК

4.6.4. Секвенирование генов 16S рРНК

4.6.5. Филогенетический анализ

4.7. Определение активности ферментов

4.8. Определение биологической активности ацетилтриптаминов 77 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. Распространение, филогения и таксономический состав 78 морских аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных акваторий Тихого океана

5.1. Распространение

5.2. Филогения

5.3. Таксономический состав

5.4. Различия в таксономическом составе в зависимости от 89 источника изоляции

5.5. Новые таксоны бактерий типа Bacteroidetes

5.5.1. Новые таксоны класса Flavobacteria сем. Flavobacteriaceae

5.5.1.1. Бактерии рода Aquimarina

5.5.1.1.1. Aquimarina muelleri gen. nov., sp. nov., и реклассификация 96 [Cytophaga] latercula Lewin 1969 как Stanierella latercula gen. nov., comb. nov.

5.5.1.1.2. Aquimarina intermedia sp. nov., и реклассификация Stanierella 99 latercula как Aquimarina latercula comb. nov.

5.5.1.2. Бактерии рода Arenibacter

5.5.1.3. Cellulophaga pacifica sp. nov.

5.5.1.4. Описание Formosa agariphila sp. nov.

5.5.1.5. Описание Leeuwenhoekiella aequorea gen. nov., sp. nov., и рекласифика- 121 ция [Cytophaga] marinoflava Reichenbach 1989 как Leeuwenhoekiella marinoflava gen. nov., comb. nov.

5.5.1.6. Бактерии рода Maribacter

5.5.1.7. Бактерии рода Salegentibacter

5.5.1.7.1. Salegentibacter holothuriorum sp. nov.

5.5.1.7.2. Salegentibacter mishustinae sp. nov.

5.5.1.7.3. Salegentibacter agarivorans sp. nov.

5.5.1.8. Бактерии рода Winogradskyella

5.5.1.9. Zobellia amurskyensis sp. nov., Zobellia laminariae sp. nov. и Zobellia 152 russellii sp. nov.

5.5.2. Новые таксоны класса Sphingobacteria

5.5.2.1. Виды рода Algoriphagus. Реклассификация родов Hongiella и 158 Chimaereicella в род Algoriphagus и новая редакция рода Algoriphagus

5.5.2.2. Cyclobacterium amurskyensis sp. nov.

5.5.2.3. Бактерии рода Echinicola

5.5.2.3.1. Echinicola pacifica gen. nov., sp. nov.

5.5.2.3.2. Echinicola vietnamensis sp. nov.

5.5.2.4. Бактерии рода Roseivirga

5.5.2.4.1. Roseivirga ehrenbergii gen. nov., sp. nov.

5.5.2.5.2. Roseivirga echinicomitans sp. nov.

ГЛАВА 6. Экофизиологические особенности аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из акваторий Тихого океана

6.1. Бактерии типа Bacteroidetes - продуценты протеаз, гликаназ, нуклеаз и 192 липолитических ферментов

6.1.1. Бактерии типа Bacteroidetes - продуценты фукоиданаз

6.2. Морские Cytophaga-пояобные бактерии - потенциальный 198 источник гликозидаз

6.2.1. Arenibacter latericius КММ 426т - продуцент уникальной a-Nацетилгалактозаминидазы

6.3. Roseivirga echinicomitans КММ 6058 - продуцент индольных метаболитов 206 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 209 ВЫВОДЫ 212 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морские аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes"

Таксономический состав микробного населения является одной из наиболее важных характеристик естественных морских экосистем. Молекулярно-биологические методы, применяемые для исследования этих сложных биологических образований, существенно обогатили наши знания о видовом разнообразии и структуре микробных сообществ, включая как некультивируемые, так и культивируемые микроорганизмы. Применение методов изоляции и культивирования морских бактерий остается существенным для понимания физиологии и экологии морских организмов.

Тип Bacteroidetes, или тип Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), представляет одну из основных филогенетических ветвей домена Bacteria и объединяет гетеротрофных грамотрицательных и палочковидных бактерий, которые способны передвигаться посредством скольжения. Бактерии данного типа являются одним из доминирующих компонентов микробиоты морских экосистем и характеризуются большим видовым разнообразием и широким спектром адаптаций к различным условиям обитания (Bernardet et al., 2006; Abel, Bowman, 2005a, 6; Kirchman, 2002). В настоящее время тип Bacteroidetes включает морских бактерий, которые представлены 61 валидно описанным родом и 110 видами, а также 8 видами с неопределенным таксономическим положением. Следует отметить, что 46 родов, включающих 69 видов, представлены облигатно морскими бактериями. Среди них преобладают члены сем. Flavobacteriaceae, которые отнесены к 40 родам и 78 видам. Бактерии, принадлежащие к 26 родам и 41 виду, встречались только в морской среде. Морские Cytophaga-подобные бактерии обладают широким спектром физиологических адаптаций, что позволяет им осваивать разнообразные экониши Мирового океана, а мультиферментные системы помогают утилизировать любые субстраты в качестве источников углерода и энергии, необходимые для метаболизма (Reichenbach, 1992). Изучение ферментов, гидролизующих природные соединения в океане, актуально, поскольку дает представление о механизмах и скорости трансформации бактериями органического вещества в морских экосистемах.

Несмотря на постоянный интерес микробиологов к поиску и изучению новых бактерий типа Bacteroidetes в различных экосистемах Мирового океана, бактерии данной таксономической группы, обитающие в Тихоокеанском бассейне, почти неизучены с позиции их экофизиологических и таксономических особенностей. Таким образом, фундаментальное значение с точки зрения их биоразнообразия, имеет изучение экофизиологических свойств и таксономического состава морских бактерий типа Bacteroidetes. Исследование метаболического потенциала и особенностей строения Cytophaga-подобных бактерий обогатит наши знания о биологической активности данных микроорганизмов и о занимаемых ими экологических нишах. Совокупность знаний о таксономическом разнообразии, местах обитания и биологическом потенциале позволит оценить роль бактерий типа Bacteroidetes в преобразовании органического вещества в морских экосистемах. Создание коллекций культур является необходимым условием сохранения штаммов новых морских бактерий, а также штаммов-продуцентов ценных биологически-активных веществ.

Цель настоящей работы - охарактеризовать экофизиологические свойства и таксономический состав аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из морей бассейна Тихого океана.

Для выполнения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Выделить чистые культуры морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes из различных микробных сообществ морей бассейна Тихого океана и культивировать полученные штаммы бактерий.

2. Охарактеризовать изолированные штаммы бактерий на основе метода полифазной таксономии.

3. Установить таксономический статус выделенных штаммов, определить таксономическую структуру и описать новые таксоны морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes.

4. Исследовать экофизиологические свойства изолятов и определить их метаболический потенциал.

5. Провести поиск штаммов-продуцентов гидролитических ферментов и других биологически активных веществ, перспективных для биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes широко распространены и являются постоянным компонентом мезофильных микробных сообществ экосистем морей бассейна Тихого океана.

2. Морские Cytophaga-подобные бактерии характеризуются значительным таксономическим разнообразием. Применение метода полифазной таксономии позволило идентифицировать представителей 32 родов и 49 видов бактерий и описать 45 новых видов в составе 8 известных и 18 новых родов.

3. Метаболически активные бактерии родов Cellulophaga, Maribacter и Zobellia являются доминирующими таксономическими группами среди культивируемых бактерий сем. Flavobacteriaceae и типа Bacteroidetes в целом.

4. Морские бактерии типа Bacteroidetes являются продуцентами уникальных биологически-активных веществ, в том числе ферментов, инактивирующих групповые вещества крови человека.

Научная новизна работы. Впервые детально изучены экологические особенности, распространение, видовой состав и таксономическая структура бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из акваторий Тихого океана. Показано, что выделенные бактерии являются таксономически гетерогенной группой и принадлежат к 32 родам и 49 видам в составе типа Bacteroidetes.

Фундаментальное значение имеет детальная характеристика и описание новых эволюционных линий бактерий, отнесенных к 18 новым родам и 45 новым видам. В результате проведенного таксономического исследования впервые идентифицированы и описаны бактерии новых родов Algibacter, Aquimarina, Arenibacter, Bizionia, Echinicola, Fulvivirga, Gramella, Leeuwenhoekiella, Maribacter, Mariniflexile, Mesonia, Pibocella, Pontibacter, Reichenbachiella, Roseivirga, Ulvibacter, Vitellibacter и Winogradskyella. Описаны также новые виды в составе известных родов Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gillisia, Polaribacter, Salegentibacter и Zobellia. В данном исследовании уточнен и дополнен диагноз рода Formosa, члена сем. Flavobacteriaceae класса Flavobacteria на основании вновь полученных результатов. Род и вид Gaetbulimicrobium brevivitae реклассифицирован как Aquimarina brevivitae comb. nov. на основании филогенетического анализа и сходства в составе клеточных жирных кислот. Два вида с неопределенным таксономическим положением [Cytophaga] latercula и [Cytophaga] marinoflava реклассифицированы в новые роды Aquimarina и Leeuwenhoekiella, соответственно. Роды Hongiella и Chimaereicella, принадлежащие к классу Sphingobacteria, реклассифицированы в род Algoriphagus на основании близкого филогенетического родства, генотипических и фенотипических характеристик.

Установлено, что члены сем. Flavobacteriaceae являются доминирующей таксономической группой среди бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из микробных сообществ морей Тихого океана, и впервые показано, что бактерии этого семейства, принадлежащие к родам Cellulophaga, Maribacter и Zobellia, существенно численно превосходят другие культивируемые бактерии типа Bacteroidetes. Полученные новые знания значительно расширили наши представления о биологии, экологии и таксономическом разнообразии, видовом составе и филогенетических взаимосвязях морских Cytophaga-подобных бактерий.

При изучении морфологии клеток штамма нового вида бактерий Formosa agariphila КММ 3901 впервые обнаружен неизвестный ранее для Cytophaga-подобных бактерий тип размножения - почкование.

Практическое значение. Изучены экофизиологические особенности, распространение и таксономическая структура аэробных морских бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ Тихого океана на основе применения современных молекулярно-биологических методов; показано, что Cytophaga-подобные бактерии бассейна Тихого океана являются таксономически разнообразной группой, включающей членов 32 родов и 49 видов.

В результате исследования метаболической активности выявлено присутствие протеаз, гликозидгидролаз, липаз и ДНК-аз у более чем 50% исследованных штаммов и проведен отбор перспективных для биотехнологии штаммов бактерий; обнаружен и запатентован штамм новой морской бактерии т

Arenibacter latericius КММ 426 - продуцент a-iV-ацетилгалактозаминидазы, способной конвертировать вещества группы крови человека А в группу О в физиологических условиях, что может найти применение в трансфузионной медицине; полученные и охарактеризованные гликозилгидролазы могут использоваться в структурных и биохимических исследованиях и быть основой для биотехнологического производства ферментов с заданной субстратной специфичностью. Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов.

Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН с 1989 по 2007 гг.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность директору ТИБОХ ДВО РАН академику В.А. Стонику и чл.-корр. РАН В.В. Михайлову за всестороннюю поддержку в проведении работы, искреннюю признательность Prof. Dr. H.-Y. Park, Dr. K.-S. Bae, Dr. M. Suzuki, Dr. S.B. Kim, Prof. Dr. J. Swings, Dr. M. Vancanneyt, Prof. Dr. Stackebrandt, Dr. M. Rohde и другим коллегам за помощь в работе. Автор признателен своим соавторам -сотрудникам лаборатории микробиологии, химии ферментов, химии углеводов и химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН, Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН за участие в работе и дружескую помощь.

Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, Россия, 2000; региональной научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока», Владивосток, Россия, 2001; Meeting of the Microbial Society of Korea, Cheonan, Korea, 2004; International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies, Seoul, Korea, 2004", Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия, 2004; "Isolation and identification of the novel flexibacteria using polyphasic approach", International Union of Microbiological Societies (IUMS) Congress, San-Francisco, USA, 2005; II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, Россия, 2006.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 72 печатные работы: 51 экспериментальная статья, 20 тезисов докладов и 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части: объектов и методов исследования (глава 4), результатов и обсуждения (главы 5-6), заключения и выводов, изложенных на 240 страницах, включая 40 таблиц, 25 рисунков и списка цитируемой литературы из 361 наименования, из них 25 - на русском и 336 - на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Недашковская, Ольга Ильинична

212 ВЫВОДЫ

1. Исследование неизученных ранее аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes бассейна Тихого океана показало, что они широко распространены в морских экосистемах и являются постоянным компонентом мезофильных микробных сообществ. Новые знания о биологических и экологических особенностях культивируемых морских бактерий классов Flavobacteria и 'Sphingobacteria' существенно расширили представления о таксономическом составе, филогении, экологических и физиологических особенностях морских Cytophaga-noRoftrnxx. бактерий.

2. На основании применения полифазного метода выявлено значительное таксономическое разнообразие аэробных бактерий типа Bacteroidetes, изолированных из различных микробных сообществ. Идентифицированы бактерии, принадлежащие к 32 родам и 49 видам, из которых 45 таксонов представителяют новые эволюционные линии: 15 новых видов описано в составе известных родов Algoriphagus, Cellulophaga, Cyclobacterium, Formosa, Gillisia, Polaribacter, Salegentibacter и Zobellia, 30 видов - в составе 18 новых родов Algibacter, Aquimarina, Arenibacter, Bizionia, Echinicola, Fulvivirga, Gramella, Leeuwenhoekiella, Maribacter, Mar inifl exile, Mesonia, Pibocella, Pontibacter, Reichenbachiella, Roseivirga, Ulvibacter, Vitellibacter и Winogradskyella.

3. Впервые определена таксономическая структура культивируемых аэробных морских гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes, которая характеризуется доминированием представителей семейства Flavobacteriaceae класса Flavobacteria. Бактерии класса 'Sphingobacteria', вероятно, являются минорным компонентом изученных микробных сообществ. Показано, что члены родов Cellulophaga, Maribacter и Zobellia являются наиболее многочисленными таксономическими группами среди морских бактерий сем. Flavobacteriaceae и аэробных бактерий типа Bacteroidetes.

213

4. Обнаружен неизвестный ранее для бактерий типа Bacteroidetes способ размножения клеток - почкование.

5. Морские аэробные бактерии типа Bacteroidetes обладают высоким уровнем нитратредуктазной и гидролитической активности, включая фосфатазную, протеолитическую, гликаназную, липолитическую и нуклеазную. Отобраны штаммы-продуценты гликозид-гидролаз, перспективные для биотехнологии.

6. Идентифицирован и детально охарактеризован штамм Arenibacter latericius КММ 426т-продуцент уникальной a-N-ацетилгалактозаминидазы, инактивирующей А-эритроциты крови человека в физиологических условиях.

7. Создана коллекция морских бактерий типа Bacteroidetes в составе Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, которая содержит типовые штаммы, штаммы-продуценты биологически активных веществ и микроорганизмы, представляющие новые эволюционные линии, и является фундаментальным базисом для изучения таксономического разнообразия, экологического потенциала, биологической активности и поиска продуцентов метаболитов, имеющих биотехнологическое значение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показано, что аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes широко распространены в различных биотопах морей бассейна Тихого океана и являются постоянным и таксономически разнооборазным компонентом микробных сообществ. В настоящей работе изучены Cytophaga-uojxo6nbiQ бактерии, выделенные из различных источников морской среды: морской воды, донных осадков, водорослей и беспозвоночных животных. Из 447 штаммов бактерий типа Bacteroidetes, изолированных и идентифицированных в данном исследовании, большая часть (190 штаммов или 42.5%) была ассоциирована с водорослями, а наименьшее число штаммов (24 штаммов или 5.4%) получено из проб грунта. Применение метода секвенирования гена 16S рРНК к изучению разнообразия морских культивируемых Cytophaga-подобных бактерий позволило нам идентифицировать изоляты, принадлежащие к 32 родам и 49 видам классов Flavobacteria и 'Sphingobacteria'. Следует отметить, что только 4 филотипа были идентичны ранее опубликованным. В результате дальнейшего исследования таксономического статуса изолятов при помощи полифазного метода были достоверно идентифицированы и описаны 45 новых видов бактерий в составе 8 известных и 18 новых родов. В данном исследовании были также уточнены и дополнены диагнозы родов Algoriphagus и Formosa на основании вновь полученных данных. Роды Hongiella и Chimaereicella реклассифицированы в род Algoriphagus. Род и вид Gaetbulimicrobium brevivitae реклассифицирован как Aquimarina brevivitae comb. nov. Молекулярные и фенотипические свойства изолированных нами бактерий послужили основанием для реклассификации видов с неопределенным таксономическим положением [Cytophaga] latercula и [Cytophaga] marinoflava в новые роды Aquimarina и Leeuwenhoekiella, соответственно. Полученные новые знания значительно расширили наши представления о биологии, экологии, видовом составе и филогенетических взаимосвязях морских аэробных гетеротрофных бактерий типа Bacteroidetes.

При изучении выделенных мезофильных штаммов впервые были обнаружены новые бактерии, принадлежащие к родам Algoriphagus, Gillisia, Polaribacter и Salegentibacter, представители которых были выделены ранее только из полярных мест обитания и отличались психрофильными свойствами. Более того, в настоящем исследовании описан новый род и вид бактерий Leeuwenhoekiella aequorea, штаммы которого были изолированы из антарктической морской воды и из морского ежа Strongylocentrotus intermedius, обычного представителя фауны Японского моря.

Исследование таксономической структуры культивируемых морских бактерий типа Bacteroidetes изученных нами микробных сообществ выявило доминирование членов сем. Flavobacteriaceae (428 штаммов или 94.1%). Показано, что бактерии родов Zobellia, Maribacter и Cellulophaga, насчитывающие 75, 75 и 72 штамма, соответственно, являются наиболее многочисленными как среди представителей сем. Flavobacteriaceae, так и среди членов типа Bacteroidetes.

Анализ метаболического потенциала показал, что морские аэробные бактерии типа Bacteroidetes активно участвуют в круговороте фосфора, азота и углерода. Все тестируемые бактерии продуцировали щелочные фосфатазы и 176 (38.8%>) редуцировали нитраты до нитритов. Большинство изолятов продуцировали широкий спектр гидролитических ферментов, включая протеазы (желатиназы и казеиназы), полисахаразы (агаразы и амилазы), липазы и ДНК-азы. Кроме того, изученные штаммы показали высокий уровень гликозидазной активности.

В результате проведенного скрининга впервые получен и детально охарактеризован штамм новой морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426 , продуцирующий фермент oc-iV-ацетилгалактозаминидазу, обладающий

211 специфичностью к групповым веществам А эритроцитов человека в физиологических условиях и удовлетворяющий требованиям биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Недашковская, Ольга Ильинична, Владивосток

1. Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Алексеева С.А., Иванова Е.П., Романенко JI.A., Горшкова

2. Н.М., Исаков В.В., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. Особенности деградации фукоидана морскими протеобактериями Pseudoalteromonas citrea // Микробиология. 2002. Т. 71. № I. С. 49-55.

3. Беленева И.А., Жукова H.B. Бактериальные сообщества некоторых бурых и красных водорослейзалива Петра Великого Японского моря // Биология моря. 2006. Т. 75. № 3. С. 410-419.

4. Беленева И.А., Жукова Н.В., Масленникова Э.Ф. Сравнительное изучение структуры микробных сообществ мидии Mytilus trossulus из культивируемых и природных популяций залива Петра Великого II Микробиология. 2003. Т. 72. № 4. С. 528-534.

5. Варбанец Л.Д., Иваница В.А., Броварская О.С., Винарская Н.В., Зимаковская, Л.А. Выделение ихарактеристика липополисахарида Cytophaga lytica //MiKpo6ioji. журн. 2001.Т. 63. № 5. С. 1020.

6. Горбенко Ю.А. О наиболее благоприятном количестве «сухого питательного агара» в средахдля культивирования морских гетеротрофных микроорганизмов // Микробиология. 1961. Т. 25. № 1. С. 168-172.

7. Громов Б.В. Новая бактерия родаMicrocyclus // Докл АН СССР. 1963. Т. 1526. С. 733-734.

8. Дворникова Т.А. Микробиологический синтез и превращение индольных соединений. Кишинев:1. Штиинца". 1980. 64 с.

9. Заварзин Г.А. С.Н. Виноградский и современная микробиология // Микробиология. 2006. Т. 75.5. С. 581-592.

10. Запрометова С.М., Улезло И.В., Кульман Р.А., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.Д. // Субстратная специфичность а-галактозидазы // Биохимия. 1990. Т. 55. № 12. С. 2281-2285; 1992. Т. 57. № 7. С. 797.

11. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Горшкова Н.М., Романенко Л.А., Михайлов В.В., Елякова Л.А., Парфенова В.В. Распространение хитинразлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. 1992а. № 3-4. С. 69-75.

12. Иванова Е.П., Киприанова Е.А., Аминин Д.Л., Михайлов В.В., Агафонова И.Ю. Биологическая активность микроорганизмов-ассоциантов мидии Crenomytilus grayanus II Биотехнология и биотехника. Сер. А. 19926. № 1. С. 25-30.

13. Иванова Е.П., Михайлов В.В. Микроорганизмы-ассоцианты мидии Crenomytilus grayanus и их гидролитическая активность // Микробиология. 1992. Т. 61. Вып. 3. С. 514-519.

14. Кузнецова Т.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей и перспективы их применения в медицине // Антибиотики и химиотерапия. 2004. Т. 49. № 5. С. 24-30.

15. Куриленко В.В., Иванова Е.П., Михайлов В.В. Зональное распространение эпифитных микроорганизмов на морской траве Zostera marina II Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С. 427428.

16. Методы общей бактериологии // Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир. 1984. Т. 1 535 с. Т. 3 - 263 с.

17. Михайлов В.В., Кузнецова Т.А., Еляков Г.Б. Морские микроорганизмы и их вторичные метаболиты. Владивосток: Дальнаука. 1999. 132 с.

18. Михайлов В.В., Терентьев JI.JI., Терентьева Н.А. Морские микроорганизмы и их ферменты. Владивосток: Дальнаука. 2004. 229 с.

19. Олейникова Т.К., Ивчук О.И., Денисенко В.А., Чайкина Е.Л. Мензорова Н.И., Недашковская О.И., Кузнецова Т.А. Индольные метаболиты из новой морской бактерии Roseivirga echinicomitans КММ 6058т // Химия природн. соедин. Т. 42. № 6. С. 713-717.

20. Романенко Л.А., Калиновская Н.И., Михайлов В.В. Таксономический состав и биологическая активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидией Halocynthia aurantium // Биология моря. 2001. Т. 27. № 5. С. 334-339.

21. Урванцева A.M., Бакунина И.Ю., Ким Н.Ю., Исаков В.В., Глазунов В.П., Звягинцева Т.Н. Выделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия растит, сырья. 2004. № 3. С. 15-24.

22. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Рубин А.Б. Индукционные светом процессы защиты клеток от фотоповреждений // Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 6. С. 865-875.

23. Фролова Г.М., Павель К. Г., Шпартеева А.А., Недашковская О.И., Горшкова Н.М., Иванова Е.П., Михайлов В.В. Липидный состав новых видов рода Shewanella, изолированных из дальневосточных морей // Микробиология. 2005. Т. 74. Вып. 6. С. 766-771.

24. Христофорова Н.К. Основы экологии. Владивосток. Дальнаука. 1999 г. 515 с.

25. Aasen A.J., Liaaen Jensen S. The carotenoids of flexibacteria II. A new xanthophyll from Saprospira grandis II Acta Chem. Scand. 1966a. V. 20. P. 811-819.

26. Aasen A.J., Liaaen Jensen S. Carotenoids of flexibacteria IV. The carotenoids of two further pigment types // Acta Chem. Scand. 1966b. T. 20. C. 2322-2324.

27. Abell G.C.J., Bowman J.P. Ecological and biogeographic relationships of class Flavobacteria in the Southern Ocean // FEMS Microbiol. Ecol. 2005a. V. 51. № 2. P. 265-277.

28. Abell G.C.J., Bowman J.P. Colonization and community dynamics of class Flavobacteria on diatom detritus in experimental mesocosms based on Southern Ocean seawater // FEMS Microbiol. Ecol. 20056. V. 53. №3. P. 379-391.

29. Adachi M., Fukami K., Kondo R., Nishijima T. Identification of marine algicidal Flavobacterium sp. 5 N-3 using multiple probes and whole-cell hybridization // Fish. Sci. 2002. V. 68. № 4. P. 713-720.

30. Agogue H., Casamayor E.O., Bourrain M., Obernosterer I., Joux F., Herndl G.J., Lebaron P. A survey on bacteria inhabiting the sea surface microlayer of cotal ecosystems // FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V. 54. № 2. P. 269-280.

31. Ahmed I., Yokota A., Fujiwara T. Chimaereicella boritolerans sp. nov., a boron-tolerant and alkaliphilic bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 986-992.

32. Akagawa-Matsushita M., Itoh Т., Katayama Y., Kuraishi H., Yamasato K. Isoprenoid quinone composition of some marine Alteromonas, Marinomonas, Deleya, Pseudomonas and Shewanella species // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 2275-2281.

33. Alderkamp A.-C., Sintes E., Herndl G.J. Abundance and activity of major groups of prokaryotic plankton in the coastal North Sea during spring and summer // Aquat. Microb. Ecol. 2006. V. 45. № 3. P. 237-246.

34. Alfredsson G.A., Kristjansson J.K., Hjorleifsdottir S., Steller K.O. Rhodothermus marinus gen. nov., a thermophilic, halophilic bacterium from submarine hot springs in Iceland // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 299-306.

35. Allison D.G., Sutherland I.W. The role of exopolysaccharides in adhesion of freshwater bacteria // J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P. 1319-1327.

36. Alonso C., Warnecke F., Amann R., Pernthaler J. High local and global diversity of Flavobacteria in marine plankton // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. № 5. P. 1253-1266.

37. Austin B. Marine microbioloogy. Cambridge Univers. Press. 1988. 222 p.

38. Bano N., Holibaugh J. Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 2. P. 505-518.

39. Barbeyron Т., Michel G., Potin P., Henrissat В., Kloareg B. i-Carrageenases constitute a novel family of glycosidase hydrolases, unrelated to that of к-carrageenases // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 45. P. 35499-35505.

40. Bardy S.L., Ng S.Y.M., Jarell K.F. Prokaryotic motility structures //Microbiology. 2003. V. 149. № 2. P. 295-304.

41. Bernardet J.-F., Kerouault В., Michel C. Comparative study on Flexibacter maritimus strains isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax) in France // Fish Pathol. 1994. V. 29. № 2. P. 105-111.

42. Bernardet, J.-F., Nakagawa Y. An introduction to the family Flavobacteriaceae // The Prokaryotes // Eds. Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer and Stackebrandt. New York: Springer-Verlag, 2006. V. 7. P.455-480.

43. Bernardet J.-F., Nakagawa Y., Holmes B. Proposed minimal standards for describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1049-1070.

44. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 2003. V. 13. № 1. P. 29-40.

45. Bisset A., Bowman J., Burke C. Bacterial diversity in organically-enriched fish farm sediments // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. V. 55. № 1. P. 48-56.

46. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. P. 911-917.

47. Bolinches J., Lemos M.L., Barja J.L. Population dynamics of heterotrophic bacterial communities associated with Fucus vesiculosis and Ulva rigida in an estuary // Microb. Ecol. 1988. V. 15. № 3. P. 345-357.

48. Borrall R., Larkin J.M. Flectobacillus marinus (Raj) comb, nov., a marine bacterium previously assigned to Microcyclus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1978. V. 28. P. 341-343.

49. Bowman J.P., Brown J.L., Nichols D.S. Biodiversity and ecophysiology of bacteria associated with Antarctic sea-ice // Antarct. Sci. 1997a. V. 9. № 2. P. 134-142.

50. Bowman J.P., McCammon S.A., Brown J.L., Nichols P.D., McMeekin T.A. Diversity and association of psychrophilic bacteria in Antarctic sea ice // Appl. Environ. Microbiol. 19976. V. 63. № 8. P. 3068-3078.

51. Bowman J.P., McCuaig R.M. Diversity and biogeography of prokaryotes dwelling in Antarctic continental shelf sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 5. P. 2463-2484.

52. Bowman J.P., Nichols D.S. Aequorivita gen. nov., a member of the family Flavobacteriaceae isolated from terrestrial and marine Antarctic habitats // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 15331541.

53. Bowman J.P., Nowak B. Salmonid gill bacteria and their relationship to amoebic gill disease // J. Fish Dis. 2004. V. 27. № 8. P. 483-492.

54. Brambilla E., Hippe H., Hagelstein A., Tindall B. J., Stackebrandt E. 16S rDNA diversity of cultured and uncultured prokaryotes of a mat sample from Lake Fryxell, McMurdo Dry Valleys, Antarctica // Extremophiles. 2001. V. 5. № 1. P. 23-33.

55. Brinkmeyer R., Knittel K., Jiirgen J., Weyland H., Amann R., Helmke E. Diversity and structure of bacterial communities in Arctic versus Antarctic pack ice // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 11. P. 660-6619.

56. Britschgi T.B., Giovannoni S.J. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 6. P. 1707-1713.

57. Brown M.V., Bowman J.P. A molecular phylogenetic survey of sea-ice microbial communities (SIMCO) // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 35. № 2. P. 267-275.

58. Bruns A., Rohde M., Berthe-Corti L. Muricauda ruestringensis gen. nov., sp. nov., a facultatively anaerobic, appendaged bacterium from German North Sea intertidal sediment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1997-2006.

59. Burchard R.P. (1999). (3-Lactam antibiotic selection of non-swarming mutants of Flexibacter maritimus //Can. J. Microbiol. V. 45. № 9. P. 786-790.

60. Burchard R.P., Sorongon M. A gliding bacreium strain inhibits adhesion and motility of another gliding bacterium strain in a marine biofllms // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 10. P. 4079-4083.

61. Campbell L.L., Williams O.B. A study of chitin-decomposing micro-organisms of marine origin // J. Gen. Microbiol. 1951. V. 5. P. 94-95.

62. Chan E.C.S., McManus E.A. Distribution, characterization, and nutrition of marine microorganisms from the algae Polysiphonia lanosa and Ascophyllum nodosum // Can. J. Microbiol. 1969. V. 15. № 7. P. 409-420.

63. Chiura H., Noro Y., Kanayama S., Ueda Y., Simidu U., Takagi J. Site specific deoxyribonuclease produced by a marine bacterium, Flavobacterium I 16-04 // Agric. Biol. Chem. 1988. V. 52. № 8. P. 2107-2109.

64. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum // Carbohydr. Res. 1999. V. 320. № 1-2. P. 108 119.

65. Cho J.-C., Giovannoni S.J. Croceibacter atlanticus ge. nov., sp. nov., a novel marine bacterium in the family Flavobacteriaceae //Syst. Appl. Microbiol. 2003. Y. 26. № 1. P. 76-83.

66. Cho J.-C., Giovannoni S.J. Robiginitalea biformata gen nov., sp. nov., a new marine bacterium in the family Flavobacteriaceae that contains higher G + С composition // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1101-1106.

67. Choi D.H., Cho B.C. Lutibacter litoralis gen. nov., sp. nov., a marine bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from tidal flat sediment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 771-776.

68. Choi D.H., Khim Y.-G., Hwang C.Y., Yi H., Chun J., Cho B.C. Tenacibaculum litoreum sp. nov., isolated from tidal flat sediment // Int. J. Syst. Bacterid. 2006. Y. 56. P. 635-640.

69. Chun J., Goodfellow M. A phylogenetic analysis of the genus Nocardia with 16S rRNA gene sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. Y. 45. P. 240-245.

70. Cleenwerck 1., Vandemeulebroecke K., Janssens D., Swings J. Re-examination of the genus Acetobacter, with descriptions of Acetobacter cerevisiae sp. nov. and Acetobacter malorum sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. Y. 52. P. 1551-1558.

71. Cole J.J., Findlay, S., Pace M.L. Bacterial production in fresh and saltwater: a cross-system overview //Mar. Ecol. Prog. Ser. 1988. V. 43. P. 1-10.

72. Colwell R.R. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numerical taxonomy of Vibrio cholerae, Vibrioparahaemolyticus, and related Vibrio species// J. Bacteriol. 1970. V. 104. № 2. P. 410-433.

73. Cottrell M.T., Kirchman D.L. Natural assemblages of marine Proteobacteria and members of the Cytophaga-Flavobacter cluster consuming low- and high-molecular-weight dissolved organic matter // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 4. P 1692-1697.

74. Davey K.E., Kirby R.R., Turley C.M., Weightman A.J., Fry J.C. Depth variation of bacterial extracellular enzyme activity and population diversity in the northeastern North Atlantic Ocean // Deep-Sea Research II. 2001. V. 48. № 4-5. P. 1003-1017.

75. De Beer H., Hugo C.J., Jooste P.J., Vancanneyt M., Coenye Т., Vandamme P. Chryseobacterium piscium sp. nov., isolated from fish of the South Atlantic Ocean off South Africa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. v. 56. P. 1317-1322.

76. Decho A.W. Microbial exopolymer secretions in ocean environments: their role(s) in food webs and marine processes // Oceanogr. Mar. Biol. 1990. V. 28. № 1. P. 73-153.

77. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts, A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates//Eur. J. Biochem. 1970.V. 12. № l.P. 133-142.

78. DeLong E.F., Franks D.G., Alldredge A.L. Phylogenetic diversity of aggregate-attached vs free-living marine bacterial assemblages // Limnol. Oceanogr. 1993. V. 38. № 5. P. 924-934.

79. Deming J.W. Psychrophiles and polar regions // Biofutur. 2003. V. 229. № 1. P. 43-50.

80. Desai J.D., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. № 1. P. 47-64.

81. Descamps V., Colin S., Lahaye M., Jam M., Richard C., Potin P., Barbeyron Т., Yvin J.-C., Kloareg B. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae // Mar. Biotechnol. 2006. V. 8. № 1. P. 27-39.

82. Dobson S.J., Colwell R.R., McMeekin T.A., Franzmann P.D. Direct sequencing of the polymerase chain reaction-amplified 16S rRNA gene of Flavobacterium gondwanense sp. nov. and

83. Du H., Jiao N., Hu Y., Zeng Y. Diversity and distribution of pigmented heterotrophic bacteria in marine environments // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. V. 57. № 1. P. 92-105.

84. Eddy S.D., Jones S. H. Microbiology of summer flounder Paralichthys dentatus finderling production at a marine fish hatchery// Aquaculture. 2002. V. 211. № 1. P. 9-28.

85. Eilers H., Pernthaler J., Peplies J., GlcJckner F.O., Gerdts G., Amann R. Isolation of novel pelagic bacteria from the German Bight and their seasonal contributions to surface picoplankton // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 11. P. 5134-5142.

86. Einen J., 0vreas L. Flaviramulus basaltis gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from seafloor basalt// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 24552461.

87. Eriksson K.E.L., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and Enzymatic Degradation of Wood and Wood Components. Springer-Verlag, Berlin. 1990, pp. 181-224.

88. Fautz E., Reichenbach H. A simple test for flexirubin-type pigments // FEMS Microbiol. Lett. 1980. V. 8. №2. P. 87-91.

89. Felsenstein J. PHYLIP (phylogenetic inference package), version 3.5c. Department of Genetic, University of Washington, 1993. Seattle, USA.

90. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.57c. 1995. Seattle: University of Washington.

91. Fitch W.M., Margoliash E. Construction of phylogenetic trees: a method based on mutation distances as estimated from cytochrome с sequences is of general applicability // Science. 1967. V. 155. P. 279-284.

92. Franzmann P.D., Deprez P.P., McGuire A.J., McMeekin T.A., Burton H.R. The heterotrophic, bacterial microbiota of Burton Lake, Antarctica // Polar. Biol. 1990. V. 10. № 4. P. 261-264.

93. Frette L., Jergensen N.O.G., Irming H., Kroer,N. Tenacibaculum skagerrakense sp. nov., a marine bacterium isolated from the pelagic zone in Skagerrak, Denmark //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. №2. P. 519-524.

94. Fuhrman J.A., McCallum K., Davis A.A. Phylogenetic diversity of subsurface marine microbial communities from the Atlantic and Pacific Oceans // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. № 5. P. 1294-1302.

95. Fujihara M., Iisima N., Yamamoto I., Nagumo T. Purification and chemical and physical characterization of an antitumor polysaccharide from the brown seaweed Sargassum fulvellum // Carbohydr. Res. 1984. V. 125. № 1. P. 97-106.

96. Furusawa G., Yoshikawa Т., Takano Y., Mise K., Furusawa I., Okuno Т., Sakata T. Characterization of cytoplasmic fibril structures found in gliding cells of Saprospira sp. // Can. J. Microbiol. 2005. V. 51. № 10. P. 875-880.

97. Furusawa G., Yoshikawa Т., Yasuda A., Sakata T. Algicidal activity and gliding motility of Saprospira sp. SS98-5 // Can. J. Microbiol. 2003. V. 49. № 2. P. 92-100.

98. Garneau M.-E., Vincent W. F., Alonso-Saez L., Gratton Y., Lovejoy C. Prokaryotic community structure and heterotrophic production in a river-influenced coastal arctic ecosystem // Aquat. Microbiol. Ecol. 2005. V. 42. № 1. P. 27-40.

99. Garrity G.M., Bell J.A., Lilburn T.G. Taxonomic outline of the Prokaryotes // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed, release 5.0. New York: Springer-Verlag, 2004. DOl: 10.1007/bergyesoutline200405.

100. Georgiou G., Lin S.C., Sharma M.M. Surface active compounds from microorganisms // BioTechnology. 1990. V. 10. № 1. P. 60-65.

101. Gillan D.C., Cadёe G.C. Iron-encrusted diatoms and bacteria epibiotic on Hydrobia ulvae (iGastropoda: Prosobranchia) //J. Sea Res. 2000. V. 43. № 1. P. 83-91.

102. Glockner F.O., Fuchs B.M., Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 8. P. 3721-3726.

103. Goris J., Suzuki K., De Vos P., Nakase Т., Kersters, K. Evaluation of a microplate DNA DNA hybridization method compared with the initial renaturation method // Canadian J. Microbiol. 1998. V. 44. P. 1148-1153.

104. Gosink J.J., Woese C.R., Staley J.T. Polaribacter gen nov., with three new species, P. irgensii sp. nov., P. franzmannii sp. nov. and P. filamentus sp. nov., gas vacuolate polar marine bacteria of the

105. Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group and reclassification of 'Flectobacillus glomeratus' as Polaribacter glomeratus comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 223-235.

106. Gross J. Uber freilebende Spironemaceen // Mitteilungen aus der Zoologischen Station zu Neapel. 1911. V. 20. P. 188-203.

107. Grossart H.P., Levold F., Allgaier M., Simon M., Brinkhoff T. Marine diatom species harbour distinct bacterial species //Environ. Microbiol. 2005. V. 7. № 6. P. 860-873.

108. Grossart H.P., Schlingloff A., Bernhard M., Simon M., Brinkhoff T. Antagonistic activity of bacteria isolated from organic aggregates of the German Wadden Sea // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 47. № 3. P. 387-396.

109. Grossart H.P., Simon M. Bacterial coloization and microbial decomposition of limnetic organic aggregates (lake snow) // Aquat. Microb. Ecol. 1998. V. 15. № 2. P. 127-140.

110. Groudieva Т., Kambourova M., Yusef H., Royter M., Grote R., Trinks H., Antranikian G. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria associated with Arctic sea ice, Spitzbergen // Extremophiles. 2004. V. 8. № 6. p. 475-488.

111. Gupta R. The natural evolutionary relationships among Prokaryotes // Crit. Rev. Microbiol. 2000. V. 26. №2. P. 111-131.

112. Gupta R. The phylogeny and signature sequences characteristics of Fibrobacteres, Chlorobi, and Bacteroidetes//Crit. Rev. Microbiol. 2004. V. 30. № 2. P. 123-143.

113. Hamana K., Nakagawa Y. Polyamine distribution profiles in the eighteen genera phylogenetically located within the Flavobacterium-Flexibacter-Cytophaga complex // Microbios. 2001. V. 106. № 1. P. 7-17.

114. Hansen G.H., Bergh 0., Michaelsen J., Knappskog D. Flexibacter ovolyticus sp. nov., a pathogen of eggs and larvae of atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. // Int. I. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. №3. P. 451-458.

115. Hanzawa N., Nakanishi K., Nishijima M., Saga N. 16S rDNA-based phylogenetic analysis of marine flavobacteria that induce algal morphogenesis //J. Mar. Biotechnol. 1998. V. 6. № 1. P. 80-82.

116. Hanzawa N., Singleton F.L., Hamada E., Colwell R.R., Miyachi S. Isolation and characterization of a marine bacterium producing a seed-germination inhibitor // J. Mar. Biotechnol. 1993. V. 1. № 3. P. 105-108.

117. Heissenberger A., Herndl G.J. Formation of high molecular weight material by free-living marine bacteria//Mar. Ecol. Prog. Ser. 1994. V. 111. P. 129-135.

118. Hiraishi A. Direct automated sequencing of 16S rDNA amplified by polymerase chain reaction from bacterial cultures without DNA purification//Lett. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. № 3. P. 210-213.

119. Hosoya S., Yokota A. Reclassification of Flexibacter aggregans (Lewin 1969) Leadbetter 1974 as a later heterotypic synonym of Flexithrix dorotheae Lewin 1970 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 1086-1088.

120. Humphry D.R., George A., Black G.W., Cummings S.P. Flavobacterium frigidarium sp. nov., an aerobic, psychrophilic, xylanolytic and laminarinolytic bacterium from Antarctica// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1235-1243.

121. Hunnicutt D.W., Kempf M.J., McBride M.J. Mutations in Flavobacterium johnsoniae gldF and gldG disrupt gliding motility and interfere with membrane localization of GLDA U J. Bacterid. 2002. V. 184. JVo 9. P. 2370-2378.

122. Imai I., Ishida Y., Hata Y. Killing of marine phytoplankton by a gliding bacterium Cytophaga sp., isolated from the coastal sea of Japan // Mar. Biol. 1993. V. 116. JV» 4. P. 527-532.

123. Ivanova E.P., Bowman J.P., Christen R., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Gorshkova N.M., Mitik-Dineva N., Sergeev A.F., Mikhailov V.V. Salegentibacter flavus sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 583-586.

124. Johns R.B., Perry G.J. Lipids of the bacterium Flexibacter polymorphus // Arch. Microbiol. 1977. V. 114. №3. P. 267-271.

125. Johnson E.A., An G.H. Astaxanthin from microbial sources // Crit. Rev. Biothechnol. 1999. V. 11. P. 297-326.

126. Jooste P.J. The taxonomy and significance of Flavobacterium-Cytophaga strains from dairy sources. 1985. PhD thesis, University of the Orange Free State.

127. Jukes Т.Н., Cantor, C.R. Evolution of protein molecules // Mammalian Protein Metabolism / Ed. Munro H.N. New York: Academic Press, 1969. V. 3. P. 21-132.

128. Junge K., Eicken H., Deming J.W. Bacterial activity at -2 to -20 °C in Arctic wintertime sea ice // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. №1.P. 550-557.

129. Junge K., Imhoff F., Staiey Т., Deming J.W. Phylogenetic diversity of numerically important arctic sea-ice bacteria cultured at subzero temperature // Microb. Ecol. 2002. V. 43. № 3. P. 315-328.

130. Kaneda T. Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function and taxonomic significance //Microbiol. Rev. 1991. V. 55. №2. P. 288-302.

131. Kawamura Y., Suzuki S., Gasa S., Kusuda R. Partial purification of a pathogenic substance from Flavobacterium species which causes Suminori diseases in nori Porphyra species // Microbios. 1997. V. 92. P. 139-145.

132. Kelly K.M., Chistoserdov A.Y. Phylogenetic analysis of the succesion of bacterial communities in the Great South Bay (Long Island) // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 35. № 1. P. 85-95.

133. Khan S.T., Nakagawa Y., Harayama S. Krokinobacter gen. nov., sp. nov., with three novel species, in the family Flavobacteriaceae //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006a. V. 56. P. 323-328.

134. Khan S.T., Nakagawa Y., Harayama S. Sandarakinotalea sediminis gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 20066. V. 56. P. 959-963.

135. Khan S.T., Nakagawa Y., Harayama S. Sediminibacter furfurosus gen. nov., sp. nov. and Gilvibacter sediminis gen. nov., sp. nov., novel members of the family Flavobacteriaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 265-269.

136. Khan S.T., Nakagawa Y., Harayama S. Sediminicola luteus gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006в. V. 56. P. 841-845.

137. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. V. 16. P. 111-120.

138. Kirchman D.L. The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 39. № 2. P. 91-100.

139. Kirchman D.L., Yu L., Cottrell M.T. Diversity and abundance of uncultered Cytophaga-like bacteria in the Delaware Estuary // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 11. P. 6587-6596.

140. Kisand V., Cuadros R., Wilkner J. Phylogeny of culturable estuarine bacteria catabolizing riverine organic matter in the Northern Baltic Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 1. P. 379-388.

141. Kondo R, Imai I, Fukami K., Minami K., Hiroishi A. Phylogenetic analysis of algicidal bacteria (family Flavobacteriaceae) and selective detection by PCR using a specific primer set // Fisheries Sci. 1999. V. 65. № 3. P. 432-435.

142. Kwon К. K., Lee Y. K., Lee H. K. Costertonia aggregata gen. nov., sp. nov., a mesophilic marine bacterium of the family Flavobacteriaceae, isolated from a mature biofilm // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 20066. V. 56. P. 1349-1353.

143. Labrentz M., Collins M.D., Lawson P.A., Tindall B.J., Braker G., Hirsch P. Antarctobacter heliothermus gen. nov., sp. nov., a budding bacterium from hypersaline and heliothermal Ekho Lake //Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1363-1372.

144. Lapage S.P., Sneath P.H.A., Lessel E.F., Skerman V.B.D., Seeliger H.P.R., Clark W.A. (Eds). International Code of Nomenclature of bacteria (1990 Revision). Washington, DC: American Society for Microbiology Press, 1992, 189 p.

145. Larkin J. M., Borrall R. Family I. Spirosomaceae Larkin and Borrall 1978, 595AL // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore: Williams & Wilkins. 1984. V. l.P. 125-132.

146. Lau K.W.K., Ng C.Y.M., Ren J., Lau S.C.L., Qian P.Y., Wong P.K., Lau T.C., Wu M. Owenweeksia hongkongensis gen. nov., sp. nov., a novel marine bacterium of the phylum 'Bacteroidetes' И Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005a. V. 55. P. 1051-1057.

147. Lau K.W.K., Ren J., Wai N.L.M., Qian P.Y., Wong P.K., Wu M. Lishizhenia caseinilytica gen. nov., sp. nov., a marine bacterium of the phylum Bacteroidetes II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006a. V. 56. P. 2317-2322.

148. Lee S.D. Tamlana crocina gen. nov., sp. nov., a marine bacterium of the family Flavobacteriaceae, isolated from beach sediment in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 764-769.

149. Lemos M.L., Toranzo A.E., Barja J.L. Modified medium for oxidation-fermentation test in the identification of marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 40. № 6. P. 1541-1 543.

150. Lewin R.A. A classification of flexibacteria//J. Gen. Microbiol. 1969. V. 58. P. 189-206.

151. Lewin R.A. Flexithrix dorotheae gen. et sp. nov. (Flexibacterales); and suggestions for reclassifying sheathed bacteria//Can. J. Microbiol. 1970. V. 16. №6. P. 511-515.

152. Lewin R.A. Saprospira grandis: a flexibacterium that can catch bacterial prey by "ixotrophy" // Microbial. Ecol. 1997. V. 34. № 3. P. 232-236.

153. Lewin R.A. Bacteria that catch other bacteria // Int. Forum on Mar. Sci. & Technol. Econom. Develop.'2000. 2000. P. 32-36.

154. Lewin R.A., Lounsbery D.M. Isolation, cultivation, and characterization of flexibacteria // J. Gen. Microbiol. 1969. V. 58. P. 145-170.

155. Li L., Kato C., Horikoshi K. Microbial diversity in sediments collected from the deepest cold-seep area, the Japan Trench // Mar. Biotechnol. 1999. V. 1. № 4. P. 391-400.

156. Li Z., Hu Y., Liu Y., Huang Y., He L., Miao X. 16S rDNA clone library-based bacterial phylogenetic diversity associated with three South China Sea sponges // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 23. № 9. P. 1265-1272.

157. Li Z.-Y., Liu Y. Marine sponge Craniella austrialiensis-assoclated bacterial diversity revelation based on 16S rDNA library and biologically active Actinomycetes screening, phylogenetic analysis // Lett. Appl. Microbiol. 2006. V. 43. № 4. P. 410-416.

158. Liu Z.-P., Wang B.-J., Dai X., Liu X.-Y., Liu S.-J. Zhouia amylolytica gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from sediment of the South China Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 2825-2829

159. Llobet-Brossa E., Rossello-Mora R., Amann R. Microbial community composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. №7. P. 2691-2696.

160. Long R.A., Azam F. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria // Appl. Envir. Microbiol. 2001. V. 67. № 11. P. 4975-4983.

161. Lopez-Garci'a P., Gaill F., Moreira D. Wide bacterial diversity associated with tubes of the vent worm Riftiapachyptila И Environ. Microbiol. 2002. V. 4. № 4. P. 204-215.

162. Lowry O., Rosenbrogh N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.

163. Ludwig W, Klenk H.-P. Overview: a phylogenetic backbone and taxonomic framework for procaryotic systematics // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Boone D.R., Castenholz R.W., Garrity G.M. New York: Springer, 2001. V. 1. P. 49-65.

164. Lutnaes B.F., Strand A., Petursdottir S.K., Liaaen-Jensen S. Carotenoids of thermophilic bacteria Rhodothermus marinus from submarine icelandic hot springs // Biochem. Syst. Ecol. 2004. V. 32. № 5. P. 455-468.

165. Lydell C., Dowell L., Sikaroodi M., Gillevet P., Emerson D. A population survey of members of the phylum Bacteroidetes isolated from salt marsh sediments along the East coast of the United States // Microbiol. Ecol. 2004. V. 48. № 2. P. 263-273.

166. Macian M.C., Pujalte M.J., Marquez M.C., Ludwig W., Ventosa A., Garay E., Schleifer K.H. Gelidibacter mesophilus sp. nov., a novel marine bacterium in the family Flavobacteriaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1325-1329.

167. Maeda Т., Sasaki M., Ohsugi S.-Y., Mitsutani A., Furushita M., Shiba T. 5'-Nuclease PCR assay of gliding bacteria that kill Skeletoma costatum in seawater // Microbes Environ. 2003. V. 18. № 4. P. 188-195.

168. Maki Т., Yoshinaga I., Katanozaka N., Imai I. Phylogenetic analysis of intracellular bacteria of harmful marine microalga, Heterocapsa circularisquama (Dinophyceae) // Aquat. Microbiol. Ecol. 2004. V. 36. №2. P. 123-125.

169. Maneerat S., Bamba Т., Harada K., Kobayashi A., Yamada H., Kawai F. A novel crude oil emulsifer excreted in the culture supernatant of a marine bcterium, Myroides sp. SMI // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 70. № 2. P. 254-259.

170. Maneerat S., Nitoda Т., Kanzaki H., Kawai F. Bile acids are new products of a marine bacterium, Myroides sp. strain SMI // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67. № 5. P. 679-683.

171. Manelius A., Dahlberg L., Hoist O. Some properties of a thermostable 3-xylosidase from Rhodothermus marinus //Appl. Biochem. Biotech. 1994. V. 44. № 1. P. 39-48.

172. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. №3. P. 208-218.

173. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature // J. Mol. Biol. 1962. V. 5. P. 109-118.

174. Marti'nez-Garcia M., Diaz-Valdes M., Wanner G., Ramos-Espla A., Anton J. Microbial community associated with the colonial ascidian Cystodytes dellechiajei // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. № 2. P. 521-534.

175. Matsuo Y., Suzuki M., Kasai H., Shizuri Y., Harayama S. Isolation and phylogenetic characterization of bacteria capable of inducing differentiation in the green alga Monostroma oxypermum II Environ. Microbiol. 2003. V. 5. № 1. P. 25-35.

176. McBride M.J. Bacterial gliding motility: multiple mechanisms for cell movement over surfaces // Ann. Rev. Microbiol. 2001. V. 55. № 1. P. 49-75.

177. McGuire A.J., Franzmann P.D., McMeekin T.A. Fleetobacillus glomeratus sp. nov., a curved, nonmotile, pigmented bacterium isolated from antarctic marine environment // System. Appl. Microbiol. 1987. V. 9. № 4. P. 265-272.

178. Mesbah M., Premachandran U., Whitman, W.B. Precise measurement of the G + С content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography // Int. J. Syst. Bacteriol. 1989. V. 38. P. 159-167.

179. Mergaert J., Verhelst A., Cnockaert M.C., Tan T.-L., Swings J. Characterization of facultative oligotrophic bacteria from polar seas by analysis of their fatty acids and 16S rDNA sequences // Syst. Appl. Microbiol. 2001. V. 24. № 1. p. 98-107.

180. Michel G., Nival-Collen P., Barbeyron Т., Czjzek M., Helbert W. Bioconversion of red seqweed galactans: focus on bacterial agarases and carrageenases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 71. № 1. P. 23-33.

181. Mitsutani A., Takesue K., Kirita M., Ishida Y. Lysis of Skeletonema costatum by Cytophaga sp. isolated from the coastal water of the Ariake Sea // Nippon Suisan Gakkaishi. 1992. V. 58. № 1 1. P. 2059-2167.

182. Mudarris M., Austin В., Segers P., Vancanneyt M., Hoste В., Bernardet J.-F. Flavobacterium scophthalmum sp. nov., a pathogen of turbot (Scophthalmus maximus L.) // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 447-453.

183. Naganuma Т., Coury D.A., Polne-Fuller M., Gibor A., Harikoshi K. Characterization of agarolytic Microscilla isolates and their extracellular agarases // Syst. Appl. Microbiol. 1993. V. 16. № 3. P. 183-190.

184. Nagasaki K., Yamaguchi M., Imai I. Algicidal activity of a killer bacterium against the harmful red tide dinoflagellate Heterocapsa circularisquma isolated from Ago Bay, Japan // Nippon Suisan Gakkaishi. 2000. V. 66. № 4. P. 666-673.

185. Nair S., Chandramohan D., Bharathi P.A.L. Differential sensivity of pigmented and non-pigmented marine bacteria to metals and antibiotics // Water Res. 1992. V. 26. № 4. P. 431-434.

186. Nakagawa Y., Sakane Т., Suzuki M., Hatano K. Phylogenetic structure of the genera Flexibacter, Flexithrix, an Microscilla deduced from 16S rRNA sequence analysis // J. Gen. Appl. Microbiol. 2002. V. 48. №3. P. 155-165.

187. Nakagawa Y., Yamasato K. Emendation of the genus Cytophaga and transfer of Cytophaga salmonicolor to Marinilabilia gen. nov.: phylogenetic analysis of the Flavobacterium-Cytophaga complex//Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 599-603.

188. Nakagawa, Y., Yamasato, K. Phylogenetic diversity of the genus Cytophaga revealed by 16S rRNA sequencing and menaquinone analysis//J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 1155-1161.

189. Nakanishi K., Nishijima M., Nishimura M., Kuwano M., Saga N. Bacteria that induce morphogenesis in Ulva pertusa (Chlorophyta) grown under axenic conditions // J. Phycol. 1996. V. 32. № 3. P. 479-482.

190. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. № . 2. P. 375-381.

191. Nikolaeva E.V., Usov A.I., Tambiev A.H. Study on the marine agarolytic bacterium-infusorium association//Mar. Biol. 1999. V. 135. № 3. P. 407-410.

192. Nogi Y., Soda K., Oikawa T. Flavobacterium frigidimaris sp. nov., isolated from Antarctic seawater // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. № 4. P. 310-315.

193. Nold S.C., Zwart G. Patterns and governing forces in aquatic microbial communities // Aquat. Ecol. 1998. V. 32. № l.P. 17-35.

194. Nordberg Karlsson E., Abou-Hachem M., Hoist O., Danson M.J., Hough D.W. Rhodothermus marinus-. a thermophilic bacterium producing dimeric and hexameric citrate synthase isoenzymes // Extremophiles. 2002. V. 6. № 1. P. 51-56.

195. Nordberg Karlsson E., Bartonek-Roxa E., Hoist O. Evidence for substrate binding of a recombinant thermostable xylanase originating from Rhodothermus marinus //FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 168. № l.P. 1-7.

196. O'Brien M., Colwell R.R. A rapid test for chitinase activity that uses 4-methylumbelliferyl-A^-acetyl-beta-D-glucosaminide // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. № 7. P. 1718-1720.

197. Okita T.W., Raymond L., Rodriguez L., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Cloning of the glycogen biosynthetic enzyme structural genes of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. № 13. P. 6944-6552.

198. Pinhassi J., Zweifel U.L., Hagstrom A. Dominant marine bacterioplankton species found among colony-forming bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. № 9. P. 3359-3366.

199. Politz O., Krah M., Thomsen K.K., Borriss R. A highly thermostable endo-(I,4)-(i-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. № 6. P. 715-721.

200. PolzM.F., Harbison С., Cavanaugh С. Diversity and heterogenety of epibiotic bacterial communities on the marine nematode Eubostrichus dianae //Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. №9. P.4271-4275.

201. Potin P., Sanseau A., Le Gall Y., Rochas C., Kloareg B. Purification and characterization of a new к-carraggenase from a marine Cytophaga-like bacterium // Eur. J. Biochem. 1991. V. 201. № I. P. 241 -247.

202. Pringsheim E.G. The Vitreoscillaceae: a family of colourless, gliding, filamentous organisms // J. Gen. Microbiol. 1951. V. 5. P. 124-149.

203. Raj H.D. A new species Microcyclus flavus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1970. V. 20. P. 61-81.

204. Raj H.D. A new species Microcyclus marinus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. V. 26. P. 528-544.

205. Raj H.D. Proposal of Ancylobacter gen. nov. as a substitute for the bacterial genus Microcyclus 0rskov 1928 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V. 33. P. 397-398.

206. Raj H.D., Maloy S.R. Proposal of Cyclobacterium marinus gen nov., comb, nov., for a marine bacterium previously assigned to the genus Flectobacillus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P. 337-347.

207. Reichenbach H. The order Cytophagales Leadbetter 1974, 99ALI/ Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Staley J.Т., Bryant M.P., Pfennig N., Holt J.C. Baltimore: Williams & Wilkins, 1989. V. 3. P. 2011-2073.

208. Reichenbach H. The order Cytophagales //The Procaryotes / Eds. Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H. New York: Springer, 1992. V. 4. P. 3631-3675.

209. Reichenbach H., Kleinig H. The pigments of Flexibacter elegans II Arch. Microbiol. 1974. V. 101. № l.P. 131-144.

210. Rochas C., Potin P., Kloareg B. NMR spectroscopic investigation of agarose oligomers produced by an a-agarase // Carbohydr. Res. 1994. V. 253. № 1. P. 69-77.

211. Romanenko L.A., Uchino M., Frolova G.M., Mikhailov V.V. Marixanthomonas ophiurae gen. nov., sp. nov., a marine bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from a deep-sea brittle star // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 457-462.

212. Rooney-Varga J.N., Giewat M.W., Savin M.C., Sood S., LeGresley M., Martin J.L. Links between phytoplankton and bacterial community dynamics in a coastal marine environment // Microb. Ecol. 2005. V. 49. № l.P. 163-175.

213. Rotman В., Papermaster B.W. Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters // Proc. Nath. Acad. Sci. USA, 1966. V. 55. P. 134-141.

214. Ruperez P., Anrazem O., Antonio Leal J. Potencial antioxidant capacity of sulfated polysacchrides from the edible marine brown saeweed Fucus vesiculosus // J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. № 4. P. 840-845.

215. Russell N.J., Nichols D.S. Polyunsaturated fatty acids in marine bacteria a dogma rewritten // Microbiology (UK). 1999. V. 145. № 4. P. 767-779.

216. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406-425.

217. Sakai Т., Kimura H., Kato I. A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan II Mar. Biotechnol. 2002. V. 4. № 4. P. 399-405.

218. Sakai Т., Kimura H., Kato I. Purification of sulfated fucoglucuronomannan lyase from bacterial strain of Fucobacter marina and study of appropriate conditions for its enzyme digestion // Mar. Biotechnol. 2003. V. 5. № 4. P. 380-387.

219. Sana В., Ghosh D., Saha M., Mukherjee J. Purification and characterization of an extracellular, uracil specific ribonuclease from a Bizionia species isolated from the marine environment of the Sundarbans // Microbiol. Res. 2007. in press.

220. Sarwar G., Matayoshi S., Oda H. Purification of к-carrageenase from marine Cytophaga species // Microbiol. Immunol. 1987. V. 31. № 9. P. 869-877.

221. Sass A.M., Sass H., Coolen M., Cypionka H., Overmann J. Microbial communities in the chemocline of a hypersaline deep-sea basin (Urania basin, Mediterranean Sea) // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 12. P. 5392-5402.

222. Sasser M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids II USFCC Newsl. 1990. V. 20. № 1. P. 1-6.

223. Sfanos K., Harmody D., Dang P., Ledger A., Pomponi S., McCarthy P., Lopez J. A molecular systematic survey of cultured microbial associates of deep-water marine invertebrates // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. № 3. P. 242-264.

224. Shiba Т., Taga N. Heterotrophic bacteria attached to seaweeds // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1980. V. 47. № 3. P. 251-258.

225. Shinohara M.L., Ihara M., Abo M., Hashida M., Takagi S., Beck T. A novel thermostable branching enzyme from an extremely thermophilic bacterial species, Rhodothermus obamensis // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57. № 5-6. P. 653-659.

226. Shaaban M., Maskey R.P., Wagner-Dobler I., Laatsch H. Pharacine, a natural p-cyclophane and other indole derivatives from Cytophaga sp. strain AM 13.11 // J. Nat. Prod. 2002. V. 65, № 11. P. 1660-1663.

227. Shu-Wei Y., Cordell G.A. Metabolism studies of indole derivates using a staurosporine producer, Streptomyces staurosporeus II J. Nat. Prod. 1997. V. 60. № 1. P. 44-48.

228. Sjoling S., Cowan D.A. High 16S rDNA bacterial diversity in glacial meltwater lake sediment, Bratina Island, Antarctica // Extremophiles. 2003. V. 7. № 4. P. 275-282.

229. Smith D.C., Steward G.F., Long R.A., Azam F. Bacterial mediation of carbon fluxes during a diatom bloom in a mesocosm // Deep-Sea Res. II. 1995. V. 42. № I. P. 75-97.

230. Smith M.C., Bowman J.P., Scott F.J., Line M.A. Sublithic bacteria associated wih Antarctic quartz stones // Antarc. Sci. 2000. V. 12. № 2. P. 177-184.

231. Sohn J.H., Lee J-H., Yi. H., Chun J., Bae K.S., Ahn T.-Y., Kim S.-J. Kordia algicida gen. nov., sp. nov., an algicidal bacterium isolated from red tide// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 675680.

232. Spiegelman D., Whissell G., Greer C.W. A survey of the methods for the characterization of microbial consorthia and communities // Can. J. Microbiol. 2005. V. 51. № 5. P. 355-386.

233. Spyere A., Rowley D., Jensen P.R., Fenical W. New neoverrucosane diterpenoids produced by the marine gliding bacterium Saprospira grandis // J. Nat. Prod. 2003. V. 66. № 6. P. 818-822.

234. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 846-849.

235. Staley J.T., Gosink J.J. Poles apart: biodiversity and biogeography of sea ice bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1999. V. 53. № 10. P. 189-215

236. Stevens H., Stiibner M., Simon M., Brinkhoff T. Phylogeny of Proteobacteria and Bacteroidetes from oxic habitats of tidal flat ecosystem // FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V. 54. № 3. P. 351-365.

237. Stewart J.R., Brown R.M. Cytophaga that kills or lyses algae // Science. 1969. V. 164. P. 152-154.

238. Sugano Y., Matsumoto Т., Noma M. Sequence analysis of the agaB gene encoding a new beta-agarase from Vibrio sp. strain JT0107 // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1218. №1. P. 105-108.

239. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simple technique for thin-layer microchromatography of lipids // J. Chromatogr. 1972. V. 67. P. 376-378.

240. Svetashev V. I., Vysotskii M. V., Ivanova E. P., Mikhailov, V. V. Cellular fatty acid of Alteromonas species // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. № 1. P. 37-43.

241. Tako M., Nakada Т., Hongou F. Chemical characterization of fucoidan from commercially cultured Nemacystus decipiens (Itomozuku) // Biosci. Biotech. Biochem. 1999. V. 63. № 10. P. 1813-1815.

242. Tan, T.L. Biolog metabolic fingerprints for clustering marine oligotrophic bacteria from polar regions // Microbial communities functional versus structural approaches / Eds. Insam H., Rangger A. Berlin: Springer-Verlag, 1997. P. 161-170.

243. Tan T.L., Joiris C.R., Glansdorff N., Rtiger H.-J. Dominance of oligotrophic bacteria in surface waters above Gunnerus and Astrid Ridges, Antarctic Ocean // Arch. Hydrobiol. Spec. Issues. Advanc. Limnol. 1999. V. 54. P. 237-253.

244. Taniuchi Y., Tajima K., Shimono I., Ezura, Y. Survival of Flexibacter sp. strain F-2, the causative bacterium of spotting disease of sea urchin Strongylocentrotus intermedins at low temperatures // Nippon Suisan Gakkaishi. 2002. V. 68. № 1. P. 46-51.

245. Tenreiro S., Nobre M.F., Rayney F.A., Miguel C., Da Costa M.S. Thermonema rossianum sp. nov., a new thermophilic and slightly halophilic species from saline hot springs in Naples, Italy // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 122-126.

246. Teramoto M., Takaichi S., Inomata Y., Ikenaga H., Misawa N. Structural and functional analysis of a lycopene p-monocyclase gene isolated from a unique marine bacterium that produces myxol // FEBS Lett. 2003. V. 545. № 2-3. P. 120-126.

247. Thorseth I.H., Torsvik Т., Torsvik V., Daae F.L., Pedersen R.B. Keldysh-98 Scientific Party Diversity of life in ocean floor basalt// Earth Planetar. Sci. Lett. 2001. V. 194. № 1-2. P. 31-37.

248. Tiago I., Mendes V., Pires C., Morais P.V., Verissimo A. Chimaereicella alkaliphila gen. nov., sp. nov., a Gram-negative alkaliphilic bacterium isolated from a nonsaline alkaline groundwater // Syst. Appl. Microbiol. 2006. V. 29. № 2. P. 100-108.

249. Topping J.N., Heywood J.L., Ward P., ZubkovM.V. Bacterioplankton composition in the Scotia Sea, Antarctica, during the austral summer of 2003 // Aquat. Microb. Ecol. 2006. V. 45. № 3. P. 229-235.

250. Umezawa H., Okami S., Ohnuki Т., Ishizuka M., Takeuchi Т., Shiio Т., Yugari Y. Marinactan, antitumor polysaccharide produced by marine bacteria //J. Antibiot. (Tokyo). 1983. V. 36. № 5. P. 471-477.

251. Urios L., Agogue H., Lesongeur F., Stackebrandt E., Lebaron P. Balneola vulgaris gen. nov., sp. nov., a member of the phylum Bacteroidetes from the north-western Mediterranean Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 1883-1887.

252. Validation List № 41 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 327-328.

253. Vandamme P., Pot В., Gillis M., De Vos P., Kesters K., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics// Microbiol. Rev. 1996. V. 60. № 2. P. 407-438.

254. Van de Peer Y„ De Rijk P., Wuyts J., Winkelmans Т., De Wachter R. The European Small Subunit Ribosomal RNA database // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 175-176

255. Van Trappen S., Mergaert J., Swings J. Flavobacterium gelidilacus sp. nov., isolated from microbial mats in Antarctic lakes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1241-1245.

256. Van Trappen S., Mergaert J., Van Eygen S., Dawyndt P., Cnokaert M.C., Swings J. Diversity of 746 heterotrophic bacteria isolated from microbial mats from ten Antarctic lakes // Syst. Appl. Microbiol. 2002. V. 25. №4. P. 603-610.

257. Van Trappen S., Vandecandelaere I., Mergaert J., Swings J. Algoriphagus antarcticus sp. nov., a novel psychrophile from microbial mats in Antarctic lakes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004в. V. 54. P. 1969-1973.

258. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipids analysis Hi. Cromatogr. 1975. V. 114. P. 129-141.

259. Vinogradov E., MacLean L., Crump E.M., Perry M.B., Kay W.W. Structure of the polysaccharide chain of the lipopolysaccharide from Flexibacter maritimus II Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. № 8. P. 1810-1815.

260. Wakabayashi H., Hikida M., Masumura K. Flexibacter maritimus sp. nov., a pathogen of marine fishes//Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 396-398.

261. Ward-Rainey N., Rainey F.A., Stackebrandt E. A study of the bacterial flora associated with Holothuria atra II J. Exp. Mar. Biol. 1996. V. 203. № 1. P. 11-26.

262. Webster N.S., Bourne D. Bacterial community structure associated with the Antarctic soft coral, Alcyonium antarcticum IIFEMS Microbiol. Ecol. 2007. V. 59. № 1. P. 81 -84.

263. Webster N.S., Negri A.P., Munro M.M.H.G., Battershill C. Diverse microbial communities inhabit Antarctic sponges // Environ. Microbiol. 2004. V. 6. № 3. P. 288-300.

264. Weiner R.M., Melick M., Quintero E. Hyphomonas adhaerens sp. nov., Hyphomonas johnsonii sp. nov. and Hyphomonas rosenbergii sp. nov., marine budding and prostecate bacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 459-469.

265. Willet W.C., Trichopoulos D. Nutrition and cancer:a summary of evidence // Cancer Causes Control. 1996. V. 7. № l.P. 178-180.

266. Wilson В., Danilowicz B.S., Meijer W.G. The diversity of bacterial communities associated with Atlantic cod Gadus morhua II Microb. Ecol. (в печати).

267. Winogradsky S. Etudes sur la microbiologie du sol. Sur la degradation de la cellulose dans le sol // Ann. 'Inst. Pasteur. 1929. V. 43. P. 549-633.

268. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbial. Rev. 1987. V. 51. №2. P. 221-271.

269. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya// Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. V. 87. № 12. P. 4586-4579.

270. Yi H., Chun J. Hongiella mannitolivorans gen. nov., sp. nov., Hongiella halophila sp. nov. and Hongiella ornithinivorans sp. nov., isolated from tidal flat sediment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 157-162.

271. Yoon J., Maneerat S., Kawai F., Yokota A. Myroides pelagicus sp. nov., isolated from seawater in Thailand // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006a. V. 56. P. 1917-1920.

272. Yoon J.-H., Kang S.-J., Jung S.-Y., Lee C.-H., Oh T.-K. Algoriphagus yeomjeoni sp. nov., isolated from a marine solar saltern in the Yellow Sea, Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005a. V. 55. P. 865-870.

273. Yoon J.-H., Kang S.J., Lee C.H., Oh Т.К. Dokdonia donghaensis gen. nov., sp. nov., isolated from sea water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 20056. V. 55. P. 2323-2328.

274. Yoon J.H., Kang S.J., Lee C.H., Oh Т.К. Donghaeana dokdonensis gen. nov., sp. nov., isolated from sea water//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006в. V. 56. P. 187-191.

275. Yoon J.-H., Kang S.-J., Lee C.-H., Oh T.-K. Marinicola seohaensis gen. nov., sp. nov., isolated from sea water of the Yellow Sea, Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005в. V. 55. P. 859-863.

276. Yoon J.-H., Kang S.J., Oh T.K Algoriphagus locisalis sp. nov., isolated from a marine solar saltern // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005г. V. 55. P.1635-1639.

277. Yoon J.-H., Kang S.-J., Oh T.-K. Polaribacter dokdonehsis sp. nov., isolated from seawater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006г. Y. 56. P. 1251-1255.

278. Yoon J.H., Kang S.J., Oh Т.К. Tenacibaculum lutimaris sp. nov., isolated from a tidal flat in the Yellow Sea, Korea// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005д. V. 55. P. 793-798.

279. Yoon J.H., Lee M.H., Kang, S.J., Oh Т.К. Algoriphagus terrigena sp. nov., isolated from soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006д. V. 56. P. 777-780.

280. Yoon J.-H., Yeo S.H., Oh T.-K. Hongiella marincola sp. nov., isolated from sea water of the East Sea in Korea//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1845-1848.

281. Youschimizu M., Kimura T. Study on intestinal microfloraof salmonids // Fish Pathol. I976.V. 10. № 2. P. 243-259.

282. Zhang Y., Jiao N., Cottrell M.T., Kirchman D.L. Contribution of major bacterial groups to bacterial biomass production along a salinity gradient in the South China Sea // Aquat. Microb. Ecol. 2006. V. 43. №3. P. 233-241.

283. Zhou Y., Wang X., Liu H., Zhang K.Y., Zhang Y.Q., Lai R., Li W.J. Pontibacter akesuensis sp. nov., isolated from a desert soil in China// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 321-325.

284. ZoBell C.E., Upham H.C. A list of marine bacteria including descriptions of sixty new species // Bull. Scripps Inst. Oceanogr. Univ. Calif. 1944. V. 5. P. 239-292.

Информация о работе

Недашковская, Ольга Ильинична
доктора биологических наук
Владивосток, 2007
ВАК 03.00.16

Диссертация

Морские аэробные гетеротрофные бактерии типа Bacteroidetes - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно