Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биология и особенности распространения морских бактерий - продуцентов α-галактозидаз и α-nацетилгалактозаминидаз

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Недашковская, Ольга Ильинична, Владивосток

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ

ХИМИИ

На правах рукописи

Недашковская Ольга Ильинична

БИОЛОГИЯ И ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ а-ГАЛАКТОЗИДАЗ И а^АЦЕТИЛГАЛАКТОЗАМИНИДАЗ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., с.н.с. Михайлов В.В. к.б.н., с.н.с. Иванова Е.П.

ВЛАДИВОСТОК - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Особенности океанических экосистем как среды обитания морских микроорганизмов..............................................................................................10

1.2. Важнейшие таксономические группы морских гетеротрофных микроорганизмов....................................................................................................12

1.3. Биологически активные вещества, синтезируемые морскими микроорганизмами............................................................................................13

1.3.1 Протеолитические и литические ферменты...................................................14

1.3.2. Ферменты, гидролизующие сложные полисахариды морской среды

1.3.2.1. Целлю л о литические ферменты...................................................................17

1.3.2.2. Агаразы.........................................................................................................18

1.3.2.3. Ламинараназы..............................................................................................19

1.3.2.4. Хитиназы......................................................................................................20

1.3.2.5. Липолитические ферменты..........................................................................22

1.3.2.6. Другие гидролазы........................................................................................23

1.3.2.7. Тирозиназы...................................................................................................26

1.4. а-Галактозидазы и а-Кацетилгалактозаминидазы как перспективный объект медицинской и сельскохозяйственной биотехнологии

1.4.1. Распространение и функции а-галактозидаз................................................27

1.4.2. Механизм действия а-галактозидаз..............................................................31

1.4.3. Физико-химические свойства а-галактозидаз..............................................33

1.4.4. Локализация а-галактозидаз в клетках эу- и прокариот.............................34

1.4.5. Применение а-галактозидаз..........................................................................35

1.4.6. а-Галактозидазы, модифицирующие эритроциты человека.......................36

1.4.7. Механизм действия а^ацетилгалактозаминидаз.......................................39

1.4.8. Распространение а-Кацетилгалактозаминидаз...........................................40

1.4.9. а-Кацетилгалактозаминидазы, участвующие в ферментативной конверсии эритроцитов человека

1.4.9.1. а-1Чацетилгалактозаминидазь1 эукариот...................................................41

1.4.9.2. а-Кацетилгалактозаминидазы прокариот................................................41

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования................................... ..................................................44

2.2. Условия выделения. Среды культивирования и консервации.......................47

2.3. Методы изучения биологических свойств

2.3.1. Физиолого-биохимические признаки............................................................48

2.3.2. Изучение ферментативной активности.........................................................50

2.3.3. Изучение действия ферментов на эритроциты.............................................54

2.3.4. Чувствительность к антибиотикам...............................................................56

2.3.5. Электронная микроскопия............................................................................56

2.4.6. Анализ жирных кислот..................................................................................56

2.4.7. Методы геносистематики................................................................................57

Глава 3. Особенности распространения штаммов-продуцентов гликозидаз

в различных районах Мирового Океана и их таксономический состав..............59

3.1. Соотношение штаммов - продуцентов а-галактозидаз и а-Кацетил-галактозаминидаз среди свободноживущих и ассоциированных с морскими животными и растениями микроорганизмов.........................................................60

3.2. Распространение штаммов - продуцентов а-галактозидаз и а-Кацетилгалактозаминидаз ^различных раонах Мирового океана.................62

3.3. Таксономический состав штаммов, показавших а-галактозидазную и а-Кацетилгалактозаминидазную активности...........................................................64

3.3.1. Встречаемость штаммов-продуцентов а-галактозидаз и а-Кацетилгалактозаминидаз среди бактерий рода Pseudoalteromonas................67

3.3.2. Встречаемость штаммов-продуцентов а-галактозидаз и а-Кацетилгалактозаминидаз среди бактерий родов Vibrio, Bacillus и Corynebacterium........................................................................................................70

3.4. Некоторые особенности таксономического состава микробных

ассоциаций...............................................................................................................75

Глава 4. Таксономическая и филогенетическая характеристика штамма КММ 426

4.1. Физиолого-биохимические свойства штамма.................................................78

4.2. Некоторые хемо-таксономические характеристики.......................................80

4.3. Установление таксономического положения..................................................82

4.4. Описание рода Arenariobacter...........................................................................86

4.5. Диагноз вида Arenariobacter latericius..............................................................87

Глава 5. Штамм КММ 426 - продуцент уникальной а-Иацетилгал актоз аминид азы

5.1. Схема очистки фермента................................................................................89

5.2. Некоторые характеристики фермента.............................................................92

Глава 6. Штамм аэробных гетеротрофных бактерий Pseudoalteromonas_sp.~ КММ 701 - продуцент"а-галактозидазы

6.1. Фенотипические признаки штамма КММ 701................................................95

6.2. Некоторые характеристики фермента.............................................................98

6.3. Сравнительный анализ а-галактозидазы штамма КММ 701 и

а-галактозидаз других морских бактерий............................................................,.103

Выводы......................................................................................................................106

Список литературы...................................................................................................108

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Морская биота существенно отличается от наземной, поэтому высока вероятность обнаружения в морской среде отличных от наземных бактерий продуцентов ферментов с уникальной специфичностью и активностью, для потребностей современной биотехнологии. Поиск продуцентов а-галактозидаз и а-№цетилгалактозаминидаз и изучение методов консервации, фенотипических, генотипических, филотипических и экологических свойств и признаков этих - продуцентов-предстаетяютсж важной задачей. Актуальность таких работ связана и с прикладными аспектами, среди которых можно выделить получение ферментов с новыми свойствами и специфичностью. Нельзя не учитывать и экологическое значение таких работ. Изучение связей в фундаментальной цепочке биоразнообразия-биотехнология также представляет значительный интерес.

Место проведения работы и цель

Основная часть исследований проведена в лаборатории микробиологии Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН), г. Владивосток. Исследования начаты в 1988 году.

Целью настоящей работы явилось изучение таксономической структуры и особенностей распространения морских бактерий - потенциальных продуцентов а-галактозидаз и а-№цетилгалактозаминидаз, выделенных из разных источников и обитающих в различных акваториях Мирового океана, а также поиск продуцентов гликозидаз, инактивирующих антигенную специфичность А и В эритроцитов, удовлетворяющих требованиям биотехнологии.

Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:

1) Определение таксономического состава морских микроорганизмов потенциальных продуцентов ферментов.

2) Изучение особенностей распространения бактерий-продуцентов а-галактозидаз и а-Мацетилгалактозаминидаз, принадлежащих к различным таксономическим группам, в различных районах Мирового Океана.

3) Проведение отбора перспективных для биотехнологии штаммов бактерий, синтезирующих гликозидазы.

4) Фенотипическая и филогенетическая характеристика штамма бактерий КММ 426 - продуцента уникальной а-1Ч-ацетилгалактозаминидазы.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые на основании изучения штаммов микроорганизмов, выделенных из морской воды, донных осадков, а также анализа микробных ассоциаций морских растений и животных собранных в заливе Петра Великого на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин" в Охотском море и в тропических районах Тихого океана, установлено таксономическое положение бактерий, синтезирующих а-галактозидазы (а-Гал) и а-№цетилгалактозидазы (а-ГалМАц) и выявлены особенности их распространения в различных районах Мирового Океана. Так, бактерии, синтезирующие а-Гал, чаще встречались в северо-западных водах Тихого океана, в южных районах Тихого и Индийского океанов преобладали продуценты а-ГалКАд. Показано, что штаммы-продуценты более многочислены среди симбиотрофов животных, чем среди свободноживущих микроорганизмов. Впервые получены штаммы морских микроорганизмов, продуцирующие ферменты, обладающие специфичностью к

групповым веществам крови человека и удовлетворяющие требованиям биотехнологии. Из штамма Pseudoalteromonas sp. КММ 701, выделенного из морской воды, получена а-Гал, модифицирующая эритроциты В группы крови человека в эритроциты О группы. Охарактеризован изолированный из пробы донных осадков штамм бактерий КММ 426 - продуцент уникальной а-ГалИАц, которая инактивирует иммунодетерминанты эритроцитов А группы крови, превращая их в эритроциты О группы.

Дано описание нового рода бактерий семейства Flavobacteriaceae -Arenariobacter, представляющего собой отдельную филогенетическую ветвь в группе Flavobacterium-Cytophaga-Bacteroides. Описан новый вид Arenariobacter latericius.

Практическая значимость

Изучение таксономической структуры морских микроорганизмов, как свободноживущих, так и ассоциированных с макрогидробионтами, их способности синтезировать физиологически активные вещества может дать новые знания о роли ассоциативной микрофлоры в жизнедеятельности населяющих Океан организмов и, в конечном счете, функционировании морских экосистем. Выявление особенностей распространения бактериальных продуцентов гликозидаз может способствовать более успешному поиску данных ферментов. Фундаментальное значение имеет описание нового для ситематики морских микроорганизмов рода бактерий Arenariobacter, отнесенного нами к семейству Flavobacteriaceae, и нового вида A. latericius. Полученные, охарактеризованные и запатентованные гликозидазы используются в структурных и биохимических исследованиях и могут быть основой для биотехнологического производства ферментов с заданной субстратной специфичностью. Изучение энзиматического воздействия на клеточные антигены открывает возможность направленного

изменения антигенной структуры биологических материалов при условии применения ферментов с точно установленной субстратной специфичностью, а-Гал также могут быть использованы для гидролиза а-галактозидных связей, присутствующих в раффинозе, мелибиозе и стахиозе. Эти сахара, обычно встречающиеся в сое, не метаболизируются человеческим организмом в связи с -отсутствием а-Гал в желудочно-кишечном тракте, что вызывает дискомфорт пищеварения и является главным ограничением потребления продуктов из семян бобовых растений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Таксономическая структура морских микроорганизмов - продуцентов,, а-галактозидаз и а-Мацетилгалактозаминидаз отражает доминирование грамотрицательных бактерий родов Pseudoalteromonas и Vibrio, среди грамположительных бактерий - представителей родов Bacillus и Corynebacterium.

2. Продуцентов а-галактозидаз и а-Кацетилгалактозаминидаз следует искать среди микроорганизмов-ассоциантов морских животных.

3. Микроорганизмы-продуценты а-галактозидаз преобладают в бореальных областях, бактерии, синтезирующие высоко активные а-1Чацетилгалактозаминидазы - в тропических районах Мирового Океана.

4. Характеристика штамма морских бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 -продуцента а-галактозидазы (К.Ф. 3.2.1.22).

5. Описание представителя нового рода Arenariobacter gen. nov. и нового вида Arenariobacter latericius sp. nov. КММ 426т - продуцента a-N-ацетилгалактозаминидазы (К.Ф. 3.2.1.49).

Апробация работы

Основные положения работы доложены на International Science Conf. "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East" (Ancorage, Alaska, U.S.A., Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug.29 - Sept.2, 1994), International Conf. of the- North Pacific Marine Science Organization (PICES) "Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas" (Vladivostok, Russia, June 19-24, 1995), II Дальневосточной региональной конференции с всероссийским участием "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке (27-29 апреля, Владивосток, 1998), научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 1998), Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8) (Halifax, Canada, Aug. 9-14, 1998).

Публикации

Материалы диссертации изложены в 11 печатных работах, получено положительное решение на выдачу патента РФ «Штамм морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 - продуцент а-галактозидазы».

Автор выражает глубокую признательность своим руководителям д.б.н. В.В. Михайлову и к.б.н. Е.П. Ивановой, а также академику Г.Б. Елякову. Автор благодарит своих соавторов: сотрудников лаборатории микробиологии, лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Бакунину И.Ю. и Сову В.В., Гематологического научного центра РАМН (г. Москва) Кульмана P.A., Института органической химии РАН (г. Москва) Лихошерстова Л.М. и Мартынову М.Д., лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН д.б.н. В.И. Светашева и к.х.н. М.В. Высоцкого, а также зарубежных коллег.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Особенности океанических экосистем как среды обитания морских микроорганизмов

Мировой океан, занимающий более 70% поверхности Земли, х точки зрения микробиолога представляет собой огромный комплекс, состоящий из разнообразных групп жизненных форм, испытывающих воздействия экстремальных факторов окружающей среды: давления, температуры, солености (Fenical, 1993 ; Austin, 1988). Хотя распространение различных групп морских микроорганизмов недостаточно хорошо изучено, литературные данные свидетельствуют о том, что микробное население Мирового океана охватывает большинство известных таксонов микроорганизмов. Многие таксономические группы микроорганизмов, выделенные из водной толщи, относятся к микробным формам, живущим и на наземных субстратах, благодаря способности этих организмов приспосабливаться к изменяющимся условиям среды при попадании с моря на сушу, или наоборот. Однако большинство бактерий открытого океана - облигатно морские формы. Многие морские гетеротрофные микроорганизмы, поддерживаемые в лабораторных условиях, способны расти только на богатых органических питательных средах и не может достаточно активно расти ex situ, так как в лабораторных условиях трудно подобрать уровень питательных веществ, соответствующий океанической среде.

Для выявления облигатно морских микроорганизмов было предложено несколько критериев (Крисс, 1976; Zobell, 1946). Один из них, основанный на создании в питательной среде концентрации и состава солей, отвечающих их содержанию в океанской воде, нашел свое подтверждение в работах современных микробиологов. При перемещении устриц в прибрежные, менее соленые, воды наблюдалось резкое уменьшение численности Vibrio vulnificus, вызывающего вибриоз этих моллюсков (Motes, DePaola, 1996). Было показано, что потребность

морских бактерий в ионах Na+ отражает определенные функции Na+. Например, для Alteromonas haloplanktis ионы Na+ необходимы для транспорта неметаболизируемых аналогов а-аминоизобутириловой кислоты (а-АИБ), D-глюкозы и ряда других метаболитов (Droniuk et al., 1987): Vibrio fischen и Vibrio alginolyticus также необходимы ионы Na+ для транспорта а-АИБ, сахарозы и аминокислот (Tokuda et al., 1982). Клетки морских, бактерий подобно ряду других прокариотных и эукариотных клеток обладают Na+/H+ антипорами, которые выполняют функцию натриевого насоса и регулируют цитоплазматический потенциал pH (Krulwich, 1983). Получены данные, показывающие, что наличие Na+ в цитоплазме А. haloplanktis, V. fischeri, V. natriegens и Photobacterium phosphoreum, служит для окисления НАДФ и генерации энергии окислением НАД-связанных субстратов (Khanna а/., 1984).

Температура морской воды также может быть лимитирующим фактором для численности микроорганизмов. Так, штаммы V. vulnificus не удавалось изолировать в феврале и марте при температуре воды ниже 8°С, в то время как в другие месяцы, когда температура воды превышала 8°С, эти бактерии составляли до 8% от общей численности культурабельных гетеротрофных микроорганизмов (Wright et al., 1996; DePaola et al, 1998). Морские психротрофные бактерии новых видов псевдоальтеромонад Р. antarctica (Bozal et al., 1997) и P. prydzensis (Bowman, 1998), выделенные в антарктических прибрежных водах, наоборот, предпочитают низкие температуры, причем высказывается предположение, что их численность особенно велика именно в этих экосистемах.

Способность микроорганизмов к размножению в океане и нахождение их в морской воде в значит