Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая характеристика штаммов морских бактерий рода ALTEROMONAS- источников некоторых ферментов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая характеристика штаммов морских бактерий рода ALTEROMONAS- источников некоторых ферментов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ вл^и^остщркий ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

РОМАНЕНКО ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА А1.ТЕ1ЮМОЫАЗ ИСТОЧНИКОВ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток — 1994

Диссертация выполнена в Тихоокеанском институте биооргакической химии ДВО РАН г.Владивостока.

Научный руководитель: Михайлов В.В. - кандидат биологических

наук.

Официальные оппоненты: Дзадзиева М.Ф. - доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии; Голодяев Г.П. -

кандидат биологических наук.

Ведущее учреждение, дающее внешний отзыв о научно-практической ценности работы - Институт микробиологии РАН, г.Москва.

на заседании Специализированного совета К.084.24.01 при Владивостокском Государственном медицинском институте по адресу: 690600 ГСП, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского института.

Защита

1994 г.

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук, доцент

Диго Р.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Морские гетеротрофные микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем и играют существенную роль в биологических процессах морской среды. Бактерии рода Alteromonas - типичные представители морских прокариот - составляют значительную часть бактериального комплекса морских биоценозов [Baumann et al., 1972; 1981; 1984].

Исследования показывают, что микроорганизмы морской среды и бактерии рода Alteromonas, в частности, способны синтезировать уникальные разнообразные физиологически активные вещества: антибиотики, токсины, витамины, ферменты, ^противовирусные н противоопухолевые вещества [Sieburth,. 1971; Okami et al., 1975; Okami, 1982; Okutani, 1984; Xamei et al., 1987; Nair, Simidu, 1987; Austin, 1988, 1989; Fenical, 1993].

Среди бактерий рода Alteromonas выделены штаммы-продуцеяты антибиотиков бромпиррола [Eurkholder et al., 1966] и изатина [Gil-Turnes et al., 1989]; тетродотоксина [Simidu et al., 1990]. Изучены альтеромонады - продуценты гидролитических ферментов: агараз [Yaphe, 1957; 1962], каррагиназ [Weigl, Yaphe, 1966], про-теазы [Dohmoto, Miyachi, 1991], хитиназы [Tsujibo et al., 1991].

Исследования показали, что бактерии рода Alteromonas могут служить источниками некоторых ферментов нуклеинового обмена: внеклеточной экзонукл'еазы [Wei et al., 1983], рестриктаз [Дедков et al., 1990], щелочной фосфатазы [Федосов et al., 1991]. Однако, нуклеазы морских бактерий, в том числе, рибонуклеазы альтеромонад изучены недостаточно. Исследований по специфическим эндорибонук-леазам бактерий рода Alteromonas не обнаружено. Малоизученной областью остаются и такие практически важные энзимы бактерий как тирозиназы. Описаны тирозиназы морских бактерий Alteromonas sp. 2-40 [Kelley et al., 1990] и Shewanella colwelliana [Weiner et al., 1991]. В связи с этим представляется перспективным дальнейшее изучение физиологичесхой активности бактерий рода Alteromonas с целью выделения штаммов-продуцентов нуклеаз и тирозиназ.

По мнению У.Феникала [Fenical, 1993], несмотря на проводимые исследования, достаточно полно изучено менее 1 % бактерий, изоли-

рованных из морской среды. Фундаментальное изучение биологии морских микроорганизмов, в том числе альтеромонад, является базисом для успешного развития морской микробиологии и биотехнологии, химии морских соединений.

В последнее десятилетие исследования по таксономии морских бактерий получили дальнейшее развитие [De Vos et al., 1989]. Охарактеризовано несколько новых видов альтеромонад A.tetraodonis [Simidu et al., 1990], A.carrageenovora и A.atlantica [Akagawa-Matsushita et al., 1991]. Однако генотаксономические исследования, в том числе результаты РНК-ДНК гибридизации [Van Landschoot, De Ley, 1983], свидетельствуют о гетерогенности видов бактерий этого рода, в связи с чем таксономическое направление в исследовании Морских альтеромонад и альтеромонадоподобных бактерий представляется перспективным.

Целью настоящей работы было изучение корфолого-биохими-ческих, генотипических свойств, исследование физиологической активности и таксономии морских бактерий рода Alteromonas; выделение и культивирование штаммов альтеромонад - источников некоторых ферментов.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Выделить из различных источников морской среды.и изучить морфологические, физиолого-биохимические и генотипические свойства культур бактерий рода Alteromonas.

2. Изучить физиологическую активность выделенных штаммов альтеромонад по следующим направлениям:

- исследование гидролитической активности;

- наличие антагонистических свойств;

- исследование внутриклеточной нуклеазной активности;

- определение уровня тирозиназной активности.

3. Определить таксономическое положение меланин-синтезирую-щего штамма бактерий Alteromonas sp. КММ 638.

4. Определить таксономическое положение 4-х буропигментиро-ванных агаролитических штаммов бактерий Alteromonas sp. КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Впервые изучена гидролитическая, нуклеазная, тирозиназная активность свободноживущих глубоководных штаммов бактерий рода /Alteromonas и бактерий-ассоциантов морских асцидий. Показано, что

бактерии рода Alteromonas обладают' высоким уровнем физиологической активности и могут служить источниками получения гидро-лаз, нуклеаз, рестриктаз, •тирозиназ. Впервые установлено, что альтеромонады проявляют высокий уровень активности специфических рибонуклеаз. Выделены и охарактеризованы штаммы-продуценты специфических эндорибонуклеаз и тирозиназ. Изучение фенотипических, генотипических свойств и ДНК-ДНК гибридизации бактерий штамма КММ 638, синтезирующих меланоидный пигмент, и 4-х буропигментирован-ных агаролитических бактерий КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504 показало, что выделенные бактерии, относятся, вероятно, к двум новым видам бактерий рода Alteromonas.

Практическая значимость работы.

Выделен штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 - продуцент полиуридил-специфической эндорибонуклеазы.Получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации по заявке 5056929 от 17 марта 1993 г. на изобретение "Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis - продуцент пояиуридил-эндорибонуклеазы".

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактерии рода Alteromonas обладают высоким уровнем гидролитической активности и способны синтезировать комплекс различных гидролаз.

2. Бактерии рода Alteromonas, ассоциированные с морскими асцидиями, проявляют антимикробную активность в отношении P.vulgaris, С.albicans, S.aureus.

3. Морские альтеромонады обладают внутриклеточной нуклеазной активностью и способны продуцировать нуклеазы, в том числе, специфические рибонуклеазы, а также эндонуклеазы рестрикции. Активные штаммы бактерий представлены видами A.haloplanktis, A.atlantica, A.fuliginea sp.nov.

'4. Глубоководный штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 -продуцент фермента, специфически расщепляющего полиуридиловую кислоту.

5.Бактерии рода Alteromonas могут служить источниками тирозиназ и проявляют высокий уровень тирозиназной активности в клетках и культуральной жидкости.

6. На основании изучения ДНК-ДНК гибридизации штамма бактерий КММ 638 и типовых альтеромонад выделенные бактерии могут быть отне-

сены к новому виду бактерий рода Alteromonas. Бактерии образуют латеральные жгутики и синтезируют меланоидный пигмент, диффундирующий в среду.

7. Изучение ДНК-ДНК гибридизации и физиолого-биохимнческих свойств буропигментированных агаролитических бактерий показало, что эти бактерии представляют, вероятно, новый вид альтеромонад.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзном совещании 11 Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана", ТИНРО, Владивосток, 1988 г.; Всесоюзной школе-конференции молодых ученых "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии"/Г-г.Алушта, 1990 г.; Научно-практической конференции ТИБОХ ДВО РАН, 1993 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Обьек и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов. Материалы изложены на 140 страницах машинописного текста, иллюстрированы 22 таблицами и 5 рисунками. Указатель литературы содержит 29 отечественных, и 153 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Обьекты к методы исследования.

рбьектами исследования служили 58 штаммов бактерий рода AlteroTnonas, выделенные из морской воды и беспозвоночных животных асцидий и губок.Источники выделения штаммов бактерий, районы и время отбора образцов морской воды и животных представлены в таблице 1. В работе использованы, типовые штаммы альтеромонад A.macleodii АТСС 27126 из коллекции Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного (г.Киев); A.nigrifaciens IAM 13010, А.tetraodonis IAM 14160, A.haloplanktis АТСС 14393 из коллекции культур микроорганизмов Института прикладной микробиологии Токийского Университета (Япония).

Отбор проб морской воды осуществляли с помощью батометров с пластиковым покрытием на глубинах от 75 до 5000 метров.Перед спуском батометры стерилизовали этиловым спиртом. Сбор животных асцидий выполнялся водолазами на глубинах 3-5 метров или драгированием. Вскрытие животных и приготовление гомогенатов проводили с соблюдением условий стерильности.

Таблица 1.

Источники выделения штаммов бактерий рода Alteromonas.

Источник выделения | Исследовано | Район и время отбора | штаммов |

асцидия Halocynthla. aurantiua

12

18' 7

асцидия Amarouciura translucidun 2

асцидия Clarelina molucensis

з

асцидия Polysyncratcn

sp. 1

асцидия

Didemnura sp.

2

губка Plocamia sp.

6

губка

14-104 1

морская вода

6

б.Троица Залив Петра Великого Японского моря

25.05.1990 24.10.1990

7.11.1992.

25.05.1990 Австралия, Индийский океан

33* 42 1 Ю.Ш. 134°37' В.Д . 26.03.1988

33' 41' Ю.Ш. 134° 28 ' В.Д. 26.03.1988 „

33° 42' Ю.Ш. 134' 40' В.Д.

26.03.1988 Командорские о-ва 55° 36 ' 9 с.т. 164* 54'0 в.Д.

24.08.1991 -----\\-------

24.08.1991

сев.-запад, часть Тихого океана 15" 00' с.т. 133"00' з.д. 28.06.1985-2 3.07.1985

Для выделения штаммов использовали метод прямого посева морской воды и гомогенатов животных на среду Горбенко [Горбенко, 1961] и модифицированную среду (Y-K) [Youshimizu, Kimura, 1976] с добавлением естественной морской воды следующего состава, (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; глюкоза - 1,0; К2НР04~ 0,2; MgS04- 0,05; морская вода - 750 мл; дистиллированная вода -250 мл; pH среды 7,5-7,8. Дальнейшее культивирование штаммов бактерий проводили на модифицированной среде Y-K в условиях аэрации на качалке (120 об/мин).

- б -

Морфологические, физиолого-биохимические, культуральные

свойства выделенных бактерий изучали согласно общепринятым микробиологическим и биохимическим методам ( Герхардт, 1964) .

Морфологию клеток и подвижность изучали с помощью обычной световой, фазово-контрастной и электронной микроскопии. Клетки исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе YEM-100.

Тип метаболизма бактерий определяли на модифицированной среде Хыо-Лейфсона для морских бактерий [Leifson, 1963]. Внеклеточную гидролитическую активность определяли на средах с добавлением субстратов: крахмала, коллоидного хитина, желатина, твина-80, ДНК, РНК (Baumannn et al., 1984). Агаролитические бактерии тестировали в жидкой минеральной среде по количеству восстанавливающих Сахаров колориметрическим 'методом (-Кочет-ков, 19-67) .

Изучение геномных характеристик проводили в Лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН (г.Москва)' под руководством к.б.н., ст.н.с. Лысенко A.M. Препараты ДНК выделяли по методу Мармура [Marmur, 1961).Нуклеотидный состав определяли методом термической денатурации [Marmur, Doty, 1962; Owen et al.,

1969].Гомологию ДНК изучали методом реассоциации [De Ley et al.,

1970]. Размеры генома бактерий определяли по кинетике реассоциации фрагментов ДНК спектрофотометрически [Gillis et al., 1970].

Идентификацию бактерий проводили по Определителю бактерий Берги [Bergey'r- Manual of Systematic Bacteriology, 1984]. Определение активности и выделение ферментов проводили "в Лаборатории, морской биохимии, Лаборатории химии ферментов и Лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН. Автор благодарит научных сотрудников м.н.с. Е.Ю. Плисову, ст.н.с., к.х.н. И.Н. Бакунину, м.н.с. Е.А. Зелепуга за участие в экспериментах.

Методы определения активности Ферментов.

Использовали супернатанты разрушенных бактериальных клеток различной степени очистки и культуральную жидкость. Клеточные экстракты получали с помощью ультразвукового дезинтегратора МЭЕ при частоте 22 кГц в течение 3 минут при t 0-4*С. Белок определя-

ли по методам Бредфорд [Bradford, 1976] и Лоури [Lowry et al., 1951].

Нуклеазиую активность определяли в стандартных условиях по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза субстратов высокополимерной ДНК (НПО "Биолар", г.Олайна), денатурированной ДНК (полученной из нативной ДНК кипяченнем в течении 3 0 мин. с последующим резким охлаждением), РНК-стандарта (НПО "Вектор", г.Новосибирск) и синтетических одноцепочечных гомополирибокуклео-тндов Поли(У) , Поли(Ц), Поли(А) (НПО "Вектор"). В супернатанте определяли концентрацию продуктов гидролиза субстрата по поглощению при 2 60 нм на спектрофотометре "Gilford". За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 20 мин. инкубации при 37 "с приводило к образованию 1 оптической единицы а260 низкомолекулярных продуктов гидролиза субстрата.

Эндонуклеазы рестрикции определяли в организации "Сибэнзим" (Бердск-Новосибирск) под руководством д.б.н. С.Х. Дегтярева. Штаммы бактерий выращивали на агаризованной среде Y-K. Продукта гидролиза ДНК анализировали электрофоретически в горизонтальном геле 1 % агарозы ("Sigma") [Дедков et al., 1990].

Для определения уровня тирозиназной активности бактерии выращивали на средах различного состава с добавлением морской воды и 1 % раствора сернокислой меди: среда- с тирозином (среда Т), среда с аргинином (среда А ) [Pomerantz, Murthy, 1974] ; среде Y-K (среда Y-K + Си) и среде Y-K без добавления раствора CuS04. Тиро-зиназную активность определяли спектрофотометрическим методом по образованию дофахрома из L-тирозина [Pomerantz, Murthy, 1974]. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования дофахрома из тирозина со скоростью 1 микрополь в минуту .Коэффициент молярной абсорбции дофахрома при 475 нм - 3700.

Исследование антимикробных свойств выделенных бактерий проводили на агаризованной среде Y-K штриховым методом. В качестве тест-микробов использовали штаммы бактерий E.coli К-13, Р. aeruginosa АТСС 27853, Р. vulgaris КММ 432, S. aureus АТСС 21027, С. albicans КММ 455, В. subtilis КММ 430. Антимикробная активность учитывалась как положительная, если зона угнетения роста тестовой культуры превышала 10 мм [Биргер О.М., 1982].

Экспериментальные данные обрабатывали статистическими методами [Плохинский, 1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Общая характеристика выделенных бактерий рода А1£еготопаз.

Выделенные бактерии являются аэробными гетеротрофными гра-мотрицательными микроорганизмами овоидной или палочковидной формы, подвижными с помощью одного полярного жгутика.Отдельные штаммы бактерий способны образовывать латеральные жгутики.Клетки бактерий одиночные, иногда встречаются в парах.Спор не образуют.Оксидазо - и каталазоположительные.Тип метаболизма дыхательный. Бактерии хорошо растут на средах, содержащих морскую воду или хлористый натрий в концентрации 1-6 % и не растут в отсутствии ионов натрия в питательной среде.

Температурный интерзал роста от 4* до 35"С, -при 40* С рост бактерий не отмечен.Интервал рН питательных сред в пределах 5,5 -9,5; оптимум рН = 7,0-8,5. На плотных питательных средах бактерии образуют гладкие, блестящие, прозрачные либо полупрозрачные, слизистые, непигментированные беловатые или "цвета, агара" колонии, 25 % штаммов бактерий способны синтезировать внутриклеточные сине-черные, бурые и желтые пигменты. Характерным свойством выделенных бактерий является слабая утилизация простых углеводов и спиртов. Менее половины выделенных бактерий были способны образовывать кислоту из глюкозы, маннозы, сахарозы, мальтозы и не утилизировали арабинозу, рамнозу, ксилозу, лактозу, мелибиозу, ман-нит. Все бактерии утилизировали цитрат натрия, аминокислоты аргинин и тирозин.

Изучение геномных характеристик выделенных штаммов бактерий показало, что молярный процент содержания Г+Ц пар в ДНК находится в пределах от 38,6 до 50,4. На основании вышеперечисленных признаков выделенные штаммы были идентифицированы как бактерии рода А^еготопаэ.

Гидролитическая активность.

Исследование гидролитической активности изученных штаммов бактерий рода А^еготопаэ показали, что 100 % альтеромонад расщепляли желатин, твин-80, ДНК, независимо от источника выделения бактерий. Значительно ниже было количество амилолитических,

хнтинолитических и агаролитических бактерий. Так, среди штаммов альтеромонад - ассоциантов асцидий и губок 43,8 + 6,5 % бактерий расщепляли крахмал. 22,9 +5,5 % альтеромонад синтезировали хити-нолитические ферменты, 27 ± 5,8% - проявили способность гидроли-зовать агар.

Штаммы альтеромонад, изолированные из морской воды , синтезировали, в основном, хитинолитические ферменты.Следует отметить, что все выделенные штаммы бактерий рода Alteromonas не проявили внеклеточную гидролитическую активность в отношении РНК. Штаммы альтеромонад, расщепляющие хитин и агар, проявили а-галактозидаз-ную и хитобиазную активность, особенно агаролитические штаммы. В нашем исследовании показано, что наличие комплекса различных гид-ролаз является характерной особенностью альтеромонад в сравнении с бактериями других таксономических групп. Бактерии рода Alteromonas способны активно вырабатывать гликозидазы, протеазы, липазы, агаразы и другие ферменты, гидролизующие все типы полимерных молекул.

Изучение антимикробной активности■

Следует отметить, что данных по выделению антибиотик-проду-цируюших бактерий из асцидий не обнаружено.В то же время установлено, что многие виды асцидий являются источниками антибиотиков и других физиологически-активных соединений [Rinehart et al., *

1981].В нашем исследовании высокую степень антимикробной активности проявили бактерии, ассоциированные с асцидиями: 80 ± 5,2 % штаммов были активны в отношении P. vulgaris, 71,1 + 5,9 % - угнетали рост С. albicans. Антагонистические свойства в отношении S. aureus выявлены у 11,2 ± 4,1 % штаммов альтеромонад-ассоциан-тов асцидий.Незначительная антибактериальная активность проявилась в отношении В. subtilis и Е. coli. Независимо от источника выделения выделенные бактерии рода Alteromonas не ингибировали рост P. aeruginosa. При исследовании бутанольных экстрактов куль-туральной жидкости испытуемых бактерий антимикробных свойств не выявлено, что свидетельствует о том, что активность тесно связана "с бактериальной клеткой, "а антибиотические вещества относятся, вероятно, к высокомолекулярным белковым соединениям.

Альтеромонады, изолированные из губок и морской воды, показали слабую антимикробную активность: около 50 % штаммов альтеро-монад ингибировали рост только С.albicans и P.vulgaris и были неактивны в отношении остальных тест-микроорганизмов.

Эти результаты согласуются с исследованиями японских авторов, которые показали, что активность прикрепленных бактерий была выше, чем свободноживущих, а максимальное число активных изолятов было выделено из зоопланктона и ракообразных, из них 81 % составили бактерии Pseudomonas/Alteromonas [Nair, Simidu, 1987). Наши исследования также выявили достаточно высокий уровень антибио-тик-продуцирующих штаммов рода Alteromonas (от 70% до 94% в зависимости от сезона), изолированных из асцидий Японского моря, что, возможно, является характерной особенностью штаммов-ассоци-антов данного биотопа.

Внутриклеточная нуклеазная активность.

Проведенный нами скрининг ферментов рестрикции среди 56 штаммов глубоководных и ассоциированных с асцидиями и губками альтеромонад, выявил 5 штаммов бактерий, способных синтезировать эндонуклеазы рестрикции. Специфичность обнаруженных ферментов была различной. Штамм КММ 256 продуцировал рестриктазу (TCTAGA) изошизомер Xbal; штамм КММ 742 - рестриктазу (CCWGG), которая является изошизомером EcoRII; штамм КММ 743 как источник фермента (GGNCC) может заменить S. aureus 96; а также штамм КММ 773 - продуцент рестриктазы (TGGCCA) изошизомера известной рестриктазы Ball и штамм бактерий КММ 510 - продуцент рестриктазы (GCCGGC) изошизомера Nael.

Было установлено, что испытуемые штаммы бактерий рода Alteromonas способны продуцировать нуклеазы, ассоциированные с клетками, расщепляющие различные нуклеазные субстраты. У штаммов, проявивших нуклеазную активность, скорость гидролиза субстрата Поли(У) была наиболее высокой в сравнении со скоростями гидролиза других одноцепочечных полирибонуклеотидов и нуклеиновых кислот. 31±7,4 % бактерий имели высокую удельную активность в отношении Поли(У) от 25 до 412 ед/мг белка. Видовой состав активных штаммов представлен, в основном, видами A.haloplanktis, включая типовой штамм, и A.atlantica. Был обнаружен штамм бактерий КММ 223, проя-

вивший уникальную активность при гидролизе полиуридиловой кислоты.

Характеристика штамма бактерий А. ИаХорХап^хэ КММ 223 -

продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы.

При исследовании внутриклеточной нуклеазной активности глубоководных морских микроорганизмов выделен штамм КММ 223 - продуцент фермента, специфически расщепляющего полиуридиловую кислоту. Штамм был выделен из пробы морской воды, отобранной в северо-западной части Тихого океана на глубине 1950 метров.

Выделенные бактерии являются типичными представителями бактерий . рода А^еготопаз. Не растут на средах, не содержащих хлористый натрий.Требуют для роста добавления в среду морской воды либо 1-6 % КаС1. Пигдента не образуют. Расщепляют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, сахарозу, арабннозу, не образуют кислоту из мальтозы, мелибиозы, рамнозы, ксилозы, лактозы, маннита. Разжижают желатин, гидролизуют твин-8 0, хитин, амилазу не образуют. Проявляют а-Нас-галактозаминидазную и р-Ыас-гексозаминидазную активность. Утилизируют ацетат натрия, тирозин, аргинин.

Молярный процент содержания Г+Ц в ДНК составляет 42,1. Уровень сходства в полинуклеотидных последовательностях ДНК штамма КММ 223 и типового штамма А.Ьа1ор1ап)сЫз составляет 61 % . Указанные фено- и генотипические признаки позволяют отнести штамм бактерий КММ 223 к виду А. Ьа1ор1апкЪ1Б.

Свойства эндорибонуклеазы А.Ьа1ор1ап^1з КММ 223.

В результате исследования специфичности по отношению к синтетическим гомополирибонуклеотидам и РНК показано, что эндорибо-нуклеаза штамма КММ 223 с высокой скоростью гидролизует полиуридиловую кислоту и практически не расщепляет Поли(А), Поли(Ц) и природные субстраты РНК, нативную и денатурированную ДНК.

Гидролиз осуществляется по эндонуклеазному типу с образованием конечных продуктов - пентануклеотидо'в с 5'- фосфатными концевыми группами.Фермент также гидролизует альтернирующие гомопо-лирибонуклеотиды - Поли (АУ) 4:6 и Поли (АУ) 9:1.Относительная скорость ферментного гидролиза этих субстратов уменьшается в следующем порядке: Поли У > Поли (АУ) 4:б> Поли (АУ) 9:1.Схема выделения эндорибонуклеазы представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Схема очистки полиуридил-эндорибонуклеазы штамма бактерий А.Ьа1ор1ап^1з КММ 223.

Процедура |Обьем|Концент-1 Общий | Активность | Степень|Выход

| 1 рация | белок | на Поли (У)| - |

| | белка | |------------1 очистки |

| мл | мг/мл | мг | ед/мг | ед | | % ___ _____ __ _ ___ белка

Экстракт 236 5 1180 66 78000 1 100

Бензоиламино-гептиламино-

сефароза 4В 864 0,3 50 300 75000 4,5 6 БЕАЕ-

^уореаг1 745 0,02 15 3000 45000 48 58

Концентрирование 38 0,3 12 3300 40000 50 51

Тирозиназная активность бактерий рода А^еготопаз.

Исследование тирозиназной активности бактерий рода А^еготопаэ показало, что более 40 % испытуемых штаммов проявили высокий уровень общей активности (3,3 -3,9 ед/мл) в культуральной жидкости.Активные штаммы были обнаружены как среди микроорганизмов, ассоциированных с беспозвоночными животными, так и среди свободноживущих бактерий. 50 % штаммов альтеромонад при сравнительно небольшой общей активности ( 1,5 - 2,5 ед/мл ) показали высокую удельную активность 6,5-15,0 ед/кг белка.

Культивирование на среде с аргинином способствовало значительному увеличению удельной тирозиназной активности бактерий и снижению образования пигмента в культуральной жидкости, что значительно облегчило процесс выделения ферментов.

Из культуральной жидкости некоторых активных штаммов выделены ферменты с различной молекулярной массой: тирозиназа штамма

КИИ 232 - 30 ООО Д, .тирозиназа штамма КММ 514 - 94 ООО Д.Из куль-туральной жидкости штамма КММ 214 выделена тирозиназа с молекулярной массой 20 ООО Д, а из клеток бактерий этого штамма выделена тирозиназа с молекулярной массой 67 ООО Д, как и уже известная тирозиназа штамма 2-40 [Kelley et al., 1990].

При проведении скрининга активности тирозинаэ среди бактерий рода Alteromonas обнаружены буропигментнрованные штаммы альтеромонад, синтезирующие меланоидные пигменты на пептонных средах и проявляющие высокий уровень тирозиназной активности (табл. 3) . Активные штаммы отличаются по свойствам от известных видов бактерий рода Alteromonas и образуют две группы. Первую группу составляют штаммы КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504, которые образуют внутриклеточный меланоидный пигмент и способны гидролнзовать агар, каррагинан, альгинат и другие полисахариды. Бактерии проявляют тирозиназную активность ( в клетках выше, чем в культураль-ной жидкости ) на комплексной пептонной среде с добавлением ионов меди (среда Y-K + Си) .

Вторая группа представлена единственным штаммом бактерий Alteromonas sp. КММ 638, который отличается от вышеописанных бактерий тем, что синтезирует на пептонной среде внутриклеточный диффундирующий в среду меланоидный пигмент, не гидролизует агар и другие полисахариды.На основании изучения фено-и генотипических свойств штамм описан как новый вид бактерий рода Alteromonas.

Следует отметить, что бактерии штамма КММ 638 проявляют высокий уровень тирозиназной активности в клетках при культивировании на средах, содержащих морскую воду, пептон или аргинин в небольшом количестве (0,1 -0,2 г/л) и не требуют специальных сред или добавления значительных количеств тирозина.Так, общая активность на среде с аргинином (табл. 3) превышает на порядок активность остальных испытуемых штаммов. Добавление ионов меди в среду Y-K ведет к увеличению общей ( с 12,0 до 63,0 ед/мл ), удельной (с 9,3 до 25,2 ед/мг белка ) активности в клетках этих бактерий. Из клеток бактерий штамма КММ 63 8 выделена тирозиназа с молекулярной массой 26 300 Д. В среде, содержащей тирозин ( 0,2 г/л ) и 1 % раствор сернокислой меди (1 мл/л) уровень общей активности штамма КММ 638 составляет 16,0 ед/мл, удельной 12,0 ед/мг белка, а без добавления ионов меди активность повышается - до 4 5,0 ед/мл и 18,7 ед/мг белка, соответственно.

Таблица 3.

Тирозиназная активность меланогенных штаммов бактерий рода А^еготопаэ .

1 Штаммы | 1 Обьект исследования | среда Т среда А | среда У-К | среда У-К + Си |

1 а | б а 1 б 1 а I б 1 а 1 б |

КММ 638 клетки культ.ж.* 16,0 2,3 12,0 14,0 90,1 2,4 12,8 15,0 12,0 1,0 9,3 0,9 63,0 1,2 25,2 | 1,0 |

КММ 216 клетки культ.ж. 3,5 2,8 1,6 9,5 4,2 2,8 1,9 13,7 2,4 0,9 1,1 1,0 3,8 2,1 1,6 | 2,4 |

КММ 250 клетки культ.ж. 3,5 1,8 1,6 3,1 3,2 2,2 1,5 5,8 1,5 0,8 0,8 0,8 3,4 2,3 1,6 | 2,4 |

КММ 256 клетки культ.ж. 3,5 2,5 1,5 15,0 3,0 2,5 1,6 10,5 1,8 0,9 0,9 0,9 3,9 2,0 1,7 | 2,2 |

КММ 504 клетки культ.ж. 3,9 1,7 1,8 4,6 2,1 2,2 1,5 8,8 3,1 0,9 1,3 0,7 2,8 2,1' 1,2 | 1,8 |

A.nigrifaciens 1АМ 13010 клетки культ.ж. 2,0 4,3 1,5 12,0 2,5 1,2 1,0 4,3 0,4 0,6 0,3 3,8 3,4 1,7 1,4 | 1,4 |

А.Ьа1ор1ап)сЬ1Е АТСС 14393 клетки культ.ж. 3,3 3,8 0,6 3,4 2,5 1,2 1,2 2,3 7,6 4,2 0,1 0,3 7,6 . 1,3 0,3 | 1-7 1

Примечание : а - общая активность, ед/мл; б - удельная активность, ед/мг белка; * - культуральная жидкость.

- 15 -

Таксономическая характеристика меланин-синтезирующего штамма бактерий рода А^еготопаэ КММ 638.

Из морской губки, "обитающей в районе Командорских островов на глубине 3 50 метров, выделен штамм бактерий КММ 638 рода А^еготопаэ. Выделенные бактерии отличаются от других альтеромо-над способностью образовывать латеральные жгутики (от 2 до 7) .

На комплексных средах бактерии образуют буропигментированные колонии и синтезируют меланино-подобный пигмент, диффундирующий в среду. Результаты ДНК-ДНК гибридизации показали, что уровень гомологии ДНК штамма бактерий КММ 638 и ДНК типовых альтеромонад А.п1дг1£ас1епз и А.ЪеЪгаоскя^э составляет 17-30 % (табл. 4) .

Таблица 4.

Нуклеотидный состав и уровень гомологии ДНК

штамма КММ 638 и типовых штаммов бактерий рода А^еготопаэ.

ШТАММЫ | Г+Ц | Уровень гомологии ДНК, % |

1 — моль % I КММ 638 А.11а1ор1ат1Н^з |

КММ 638 ' | 43,8 | 100

А.11а1ор1апк1;1з | АТСС 14393 | 42,7 | Н.о. 100 |

А.п1дг^ас1ег>з | 1АМ 13010 | 1 41,7 | 31 33 |

А^е1:гаосЗоп1з | 1АМ 14160 | 1 41,5 | 17 48 1

А.иас1еоеИ1 | АТСС 27126 | 1 45,3 | 10 12 1

А^езготопаэ эр. | КММ 504 | 1 41,5 | 41 35 |

Примечание: " н.о." - не определяли.

Большее сходство (41 %) отмечено с ДНК штамма бактерий КММ 504 А^еготопаэ эр. , который способен разлагать агар и образовывать внутриклеточный бурый пигмент .

Вид А. п1дгх£ас1епз является наиболее близким видом пигментированных альтеромонад, синтезирующих внутриклеточный меланоид-ный пигмент [Ваитаапп et а1., 1984]. Штамм КММ 638 имеет следующие отличительные признаки: образование латеральных жгутиков, наличие диффундирующего в среду меланоидного пигмента, рост при t 35" бактерии не образуют кислоту из углеводов, утилизируют аргинин, содержание Г+Ц в ДНК составляет 43,8. Указанные признаки и степень гомологии 31 % не позволяют отнести штамп КММ 638 к бактериям вида А.п1дг^ас1епз. Таким образом/ изучение фенотипических, генотипических свойств и ДНК-ДНК гибридизации показало, что штамм бактерий КММ 638 представляет, вероятно, новый вид бактерий рода А11его1г.опаз, который предлагается назвать А.£Н2-ЬапсЪа Бр.поу.

Описание штамма бактерий КММ 63 8.

Клетки палочковидной формы с закругленными концами. Средние размеры 0,90 мкм в диаметре и 2,53 мкм в длину. Подвижные с помощью одного или 2-4 полярно расположенных жгутиков. Способны образовывать от 1 до 7 латеральных жгутиков. Грамотрицательные. Спор и капсул не образуют.Строгие аэробы.Тип метаболизма дыхательный. Обладают оксидазной, каталазной и тирозиназной активностью. На плотных питательных средах образуют гладкие блестящие прозрачные либо полупрозрачные слизистые колонии с черным либо темно-бурым пигментом.Продуцируют бурый меланино-подобный пигмент, диффундирующий в среду.Пигмент образуется быстрее при температуре 4-15"С.

Бактерии хорошо растут на средах, содержащих морскую воду или хлористый натрий в концентрации 1-6 % .Не растут в отсутствии ионов натрия в питательной среде. Температурный интервал роста от 4 до 35"С; при 40"С не дают роста. Пределы рН питательных сред для роста от 5,5 до 9,5; оптимум рН 6,0-8,5. Хемоорганогетеротро-фы. Утилизируют аргинин и тирозин. Продуцируют желатиназу, липазу, ДНК-азу. Не усваивают спирты и сахара. Не гидролизуют крахмал, хитин, И-ацетилглюкозамин, альгинат, агар.

Содержание 1Ч-Ц в ДНК составляет 43,8 %.

Штамм выделен из морской глубоководной губки, обитающей в районе Командорских островов.

Таксономическая характеристика буропигментированных

агаролитических бактерий рода Alteromonas.

Из гомогенатов двух . видов морских асцидий Halocynthia aurantium,- Amaroucium pellucidum и губки Plocamia sp., обитающих в прибрежных районах Японского моря и Командорских островов, было выделено 4 штамма буропигментированных агаролитических бактерий, отнесенных к роду Alteromonas.Эта группа бактерий представляет интерес как новый таксон и перспективный биотехнологический объект, поскольку новые бактерии проявляют высокий уровень физиологической активности как продуценты нуклеаз, гликозидаз, тирози-наз. Штаммы КММ 216 и КММ 250 с высокой скоростью расщепляют РНК и синтетические гомополирибонуклеотиды. Штамм КММ 256 является продуцентом рестриктазы (TCTAGA) изошизомера Xbal.

Исследуемые штаммы по своим фено-и генотипическим признакам составляют гомогенную группу.Молярный процент содержания Г+Ц в ДНК - от 41,5 до 43,8. Уровень гомологии в первичной структуре ДНК 4 штаммов составляет 90 - 96 %.

Доказательством принадлежности новых штаммов к роду Alteromonas являются результаты ДНК-ДНК гибридизации с типовыми штаммами альтеромонад (табл.5). Наблюдаемые уровни гомологии с ДНК трех видов бактерий рода Alteromonas : A.haloplanKtis, A.nigrifaciens, A.tetraodonis составляют 25-35 % .Меньшее сходство в ДНК отмечено при гибридизации с ДНК A.macleodii, что подтверждает данные по РНК-ДНК гибридизации.

Основным отличием изучаемой группы бактерий от известных видов альтеромонад является способность гидролизовать агар и другие полисахариды и синтезировать внутриклеточный меланоидный пигмент. Из описанных видов альтеромонад, способных разлагать агар, наиболее близким является вид A.atlantica [Akagawa-Matsushita et al.f 1991]. Выделенные штаммы отличаются от бактерий A.atlantica по следующим характерным признакам. На комплексных средах образуют внутриклеточный меланоидный сине-черный либо бурый пигмент в течении 24-36 часов, пигмент образуется более интенсивно при температуре 4-15°С. Бактерии A. atlantica образуют полупрозрачные ко-

Таблица 5.

Нуклеотидный состав и уровень ДНК-ДНК гибридизации агаролитических буропигментированных штаммов и типовых бактерий рода А1Ъеготопаэ.

Штаммы Г+Ц Гомология в ДНК, % | Размер |

моль % КММ 504 | КММ 256 1 1 | генома, Д |

КММ 504 41,5 100 | 1 2,7 • 109 |

КММ 256 41,7 96 | 100 1 2,5 • 109 |

КММ 216 43,8 92 - | н.о. | 2,6 • 10Э '|

КММ 250 42,3 90 | 93 | н.о. |

A.haloplanktis 42,7 ---- ----1 - 35 | 30 1 ----- ---1 1 2,4 • 109 |

A.nigrifaciens 41,7 ---1 и.о. | 29 О | 3,6 • 1СГ I

А.tetraodonis 41,5 ---- 1 н.о. I 24 "1 — ~ —1 1 3,3 • 109 I

A.aacleodii 45,3 --- 1 н.о. I 16 "1 ------- 1 3,0 • 109 I

Примечание: " н.о." - не определяли.

лонии с желтоватым пигментом, отдельные штаммы образуют меланоид-ные пигменты только на среде с тирозином. Бактерии с высокой скоростью гидролизуют, кроме агара и других полисахаридов, карраги-нан. Для штаммов A.atlantica этот признак на уровне вида считается отрицательным. Испытуемые бактерии не образуют кислоту из простых Сахаров. Молярный процент содержания Г+Ц в ДНК новых штаммов выше и составляет 41,5 - 43,8; бактерий вида A.atlantica 40,6 - 41,7.

Сходными фенотипическими признаками характеризуется штамм 2-40 [Andrykovitch, Marx, 1988], но отличается способностью утилизировать хитин, N-ацетилглюкозамин, не расщепляет каррагинан.

образует кислоту из Сахаров, содержание ГШ в ДНК 45,66 моль % . Штамм 2-40 не описан как новый вид бактерий рода А^еготопаз. На основании описанных фенотипических и генотипических признаков и отличительных признаков от других альтеромонад штаммы бактерий КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504 могут быть отнесены к новому виду бактерий рода А^еготопаэ, который предлагается назвать А.£иИд1пеа гр.поу. (от латинского ГиНдхпеа - черно-коричневая) .

Описание штамма бактерий КММ 216.

Клетки палочковидной формы с закругленными концами 0,5-0,8 мкм в диаметре и 1,5-1,7 мкм в длину, одиночные, иногда в парах. Подвижные с помощью одного полярного жгутика. Грамотрицательные. Строгие аэробы.Спор не образуют. Обладают каталазной, оксидазной, тирозиназной, а- и Р~ галактозидазной активностью.

На комплексных Средах, -содержащих морскую воду или 1-6 % хлористого натрия, образуют гладкие, выпуклые, блестящие колонии с черно-синим либо бурым внутриклеточным пигментом 3-5 мм в диаметре. Пигмент меланиновой природы, образуется быстрее при температуре 4—150 С. Бактерии не растут без ионов натрия.Температурный интервал роста 4-35'С и не дают роста при 40 'С. Растут при рН 5,0-9,5; оптимум рН 6,5-8,5.

Хемоорганогетеротрофы. Используют в качестве источника углерода и энергии цитрат, капрат, фенилацетат, тирозин, аргинин. Разжижают желатин.Гидролизуют твин-80, ДНК, агар, каррагинан, альгинат, эскулин, крахмал. Не образуют кислоту из простых спиртов и Сахаров.Не расщепляют Л-ацетилглюкозамин, хитин, целлюлозу.

Содержание Г+Ц в ДНК составляет 41,5 - 43,8 моль %.

Штамм бактерий КММ 216 изолирован из гомогената пурпурной асцидии На1осуп-Ыа1а аигагЛл-ит, обитающей в прибрежных водах Залива Петра Великого Японского моря. Выделенные штаммы бактерий поддерживаются в Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского Института биоорганической химии ДВО РАН, г.Владивосток.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Бактерии рода А^еготопаз обладают высоким уровнем гидролитической активности и способны синтезировать комплекс различных гидролаз - желатиназы, липазы, ДНК-азы, амилазы, хитинолитические и агаролитические ферменты.

2. Бактерии рода А1Ъегошопаз, ассоциированные с морскими асцидиями, проявляют высокий уровень антимикробной активности в

- 20 -

отношении P. vulgaris, С. albicans, S. aureus.

3. Испытуемые штаммы альтеромонад способны продуцировать внутриклеточные нуклеазы, в том числе, специфические рибонуклеа-зы, а также эндонуклеазы рестрикции. Активные штаммы, выделенные из морской воды и асцидий, относятся к видам A.haloplanktis, A.atlantica и новому виду A.fuliginea sp.nov.

4. Выделен глубоководный штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 - продуцент фермента, специфически расщепляющего полиуридило-вую кислоту. Фермент имеет молекулярную массу 52 кД и состоит из 2-х полипептидных цепей с молекулярной массой по 26 кД каждая. Оптимум рН 8,2-8,5.Активность стимулируется катионами магния и высокой концентрацией NaCl (0,2-0,5 М).Гидролиз осуществляется по эндонуклеазному типу с образованием конечных продуктов - пента-нуклеотидов с 5' - фосфатными концевыми группами.

5. Альтеромонады могут использоваться как источники тирози-наз. Из клеток и культуральной жидкости выделены тирозиназы с различной молекулярной массой 30 кД, 94 кД, 20 кД и 67 кД.

6. Меланогенные альтеромонады проявляют высокую тирозиназную активность в клетках и культуральной жидкости. Общая и удельная активность штамма КММ 638 в клеточных экстрактах составила 9 0,1 ед/мл и 12,8 ед/мг белка, соответственно.При культивировании на средах, содержащих пептон и ионы меди, удельная активность повышается в 2 раза (25,2 ед/мг белка). Из клеток бактерии штамма ККМ 638 выделена тирозиназа с молекулярной массой 26 300 Д,

7. На основании изучения ДНК-ДНК гибридизации штамма бактерий КММ 63 8 и типовых альтеромонад показано, что выделенные бактерии представляют, вероятно, новый вид пигментированных бактерий рода Alteromonas. Бактерии образуют латеральные жгутики (от 2 до 7) и синтезируют меланоидный пигмент, диффундирующий в среду.

8. Изучение ДНК-ДНК гибридизации и физиолого-биохимических свойств буропигментированных агаролитических бактерий показало, что эти бактерии представляют, вероятно, новый вид альтеромонад.

Рекомендации для внедрения в науку и практику.

1. Штамм бактерий A.haloplanktis КММ 223 - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы.

2. Применение штамма меланин-продуцирующих бактерий КММ 638 -продуцента тирозиназы.

3. Использование штаммов альтеромонад - источников ■ эндонук-леаз рестрикции.

4. Использование реферата "Физиологическая активность и таксономия бактерий рода Alteromonas" в учебном процессе кафедры микробиологии ВГМИ.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. УридиЯ-специфическая РНК-аза из морской бактерии. Тез.докл.Всесоюз. совещ. "Биологически активные вещества гидроби-онтоз при комплексной утилизации ресурсов океана" - ТИНРО, Владивосток, 1988, С.19-20 ( соавт. Ю.В. Федосов, В.В. Михайлов, Е.Ю. Плисова, В.А. Рассказов, Г.Б. Еляков ).

2. Нуклеазная активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидияии. - Микробиология, 1992, т.61, вып.1, С.131-134 (соавт.

B. В. Михайлов ).

3. Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis - продуцент поли-уридил - эндорибонуклеазы.- Положительное решение о выдаче патента по заявке N 5056929 от 17.03.1993 на изобретение (соавт. Е.Ю. Плисова, Ю.В. Федосов, В.В. Михайлов, В.А. Рассказов, Г.Б. Еляков)

4. Распространение рибонуклеаз среди морских микроорганизмов. - Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т.30, вып.З,

C. 384-388 (соавт. Е.П. Иванова, Е.Ю. Плисова, Ю.В. Федосов, В.В. Михайлов, Н.М. Горшкова, В.В. Ивайловский, В.А. Рассказов).

5. Тирозиназная активность меланогенных бактерий рода Alteromonas. - Биология моря, 1994, т.20, N. 4, С.260-263 (соавт. Е.А. Зелепуга, Э.П. Козловская, В.В. Михайлов).

6. A new melanin-synthesizing bacterium of the genus Alteromonas from marine sponge.- Abst. 45th Arctic sci. conf."Bridges .of the science between North America and the Russian Far East" - Vladivostok, 1994, P.297 (co-authors V.V.Mikhailov, A.M.Lysenko, V.I.Stepanenko) .

7. Новый вид меланин-синтезирующих бактерий рода Alteromonas.- Микробиология, 1994, (в печати) (соавт. В.В. Михайлов, A.M. Лысенко, В.И.Степаненко).

8. Новый вид буропигментированных агаролитических бактерий рода Alteromonas.- Микробиология, 1994, (в печати) (соавт. A.M. Лысенко, В.В. Михайлов, А.В. Курика ).

Приложение 1,. Таблица 6.

Направления, методы и объем исследований бактерий.

N N| Направления | Методы | Обьем

п/п| исследований | исследования | работы

1 1 2 1 3 1 4

1. Изучение морфо-тинкториальных свойств

2. Изучение физиолого-биохимических характеристик

1. Определение подвижности методом "висячей капли" (Герхардт, 1984)

2. Электронная микроскопия клеток (Герхардт, 1984)

3. Окраска по Граму

310 определений

3 5 определений 124 реакции

4. О/Е-тест (Leifson Е., 1963)

5. Оксидазная (Коуасэ, 1956

и каталазная активность

6. Гидролитическая активность чашечным методом (Вашпапп et а1., 19 84)

с использованием субстратов:

- крахмала, агара, хитина,

- ДНК, РНК

- каррагинана, эскулика, альгината

7. Гликозидазная активность (Иванова еЪ а1., 1992)

8. О/129-тест (Ваитапп et а1., 1984,)

9. Изучение влияния биофизических факторов (рН, -к., содержание ЫаС1)

10. Образование кислоты из Сахаров и спиртов

124

реакции 192 определения 355 определений из них:

310 45

54 определения 58 определений 580 определений

1170 определений

3. Получение клеточных экстрактов

4. Изучение геномных характеристик

5. Определение активности ферментов

6. Статистическая

( О-глюкозы ; 0-ксилозы ; Ь-арабинозы ; маннозы ; Б-галактозы;

сахарозы ; мелибиозы ; лактозы ; мальтозы ; маннита )

11. Утилизация: цитрата; 430 опре-ацетата ; И-ацетилглюкозамина делений Ь-аргинина ; Ь-тирозина

12. Изучение меланоидных 6

пигментов штаммов (Ке11еу et а1., 1990)

13. изучение антагонисти- 348 опре-

ческих свойств делений (Шлегель, 1987)

14. Метод ультразвуковой 296 опре-

дезинтеграции делений

15. Обработка лизоцимом 84 опре-

и ЭДТА (Магтиг, 1961) деления

16. Определение белка

(Ьоугу е! а1., 1951; 324 опре-

Вга<3^гс1 М. , 1976) деления

17. Выделение ДНК 7 4 опре-(Магтиг, 1961) деления

18. Определение % Г+Ц в ДНК 74 опре-(0>?еп et а1., 1969) деления

19. ДНК-ДНК гибридизация 10 штампе Ьеу et а1., 1970); мов

20. Определение размера гено- 10 штамма ДНК (вИЦэ еЪ а1., 1970) мов

21. Нуклеазная активноств 993 олре-в клеточных экстрактах деления

(Безбородов, 1974)

23. Тирозиназная активность 194 опре-

(РотегапЪг, МиПЛу, 1974) деления обработка данных (Плохинский, 198 0)