Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономическая характеристика и биологические особенности новых таксонов морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономическая характеристика и биологические особенности новых таксонов морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий"

На правах рукописи

РОМАНЕНКО ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ ТАКСОНОВ МОРСКИХ АЭРОБНЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ ГАММАПРОТЕОБАКТЕРИЙ

03.00.07-Микробнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Научный консультант: профессор, доктор биологических наук В. В. Михайлов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук II. Б. Ившина доктор медицинских наук Н. Ф. Тимченко доктор биологических наук В. П. Булгаков

Ведущая организация:

Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН Защита состоится "9" июня 2004 г. в 10.00 час.

на заседании Диссертационного совета ДМ 005.005.03 при Тихоокеанском

институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022 г.

Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159.

Тел.:(4232)311430

Факс:(4232)314050

E-mail: piboc@stl.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Автореферат разослан апреля 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Состояние вопроса и актуальность проблемы. Морские аэробные гетеротрофные протеобактерии являются важным компонентом и играют существенную роль в биологических процессах экосистем Мирового океана. Следует отметить, что бактерии, обитающие в морской среде, в целом являются менее изученной группой по сравнению с наземными микроорганизмами. Несмотря на проводимые исследования, изучено менее 1% бактерий, изолированных из морской среды (Amann et ai, 1995; Fenical, 1993). Наши знания в области биологии и экологии даже культурабельных морских микроорганизмов остаются весьма ограниченными. Изучение биологического разнообразия морских гетеротрофных протеобактерии на основе анализа фено- и генотипических признаков и филогенетических связей с целью определения их систематического положения в системе микробного мира, а также исследования в области таксономии и систематики морских гаммапротеобактерий являются фундаментальными и имеют важное прикладное значение. Гаммапротеобактерий составляют один из пяти подклассов класса Proteobacteria, который был предложен Stackebrandt et al. (1988) для грамотрицательных микроорганизмов на основании данных сравнительного анализа сиквенса 16S рРНК, и представляет собой одну из основных филогенетических групп протеобактерии. В настоящее время предлагается повысить таксономический ранг класса Proteobacteria до статуса тип "Proteobacteria" и подклассы Proteobacteria рассматривать как классы: "Alphaproteobacteria", "Betaproteobacteria", "Gammaproteobacteria", "Deltaproteobacteria", "Epsilonproteobacteria", соответственно (Ludwig, Klenk, 2001). Результаты филогенетических исследований показали, что класс "Gammaproteobacteria" не является монофилетической группой, как считалось ранее, и включает "Betaproteobacteria" как одну из линий (Ludwig, Klenk, 2001).

Класс "Gammaproteobacteria" представлен разнообразными по физиологическим, метаболическим и экологическим характеристикам микроорганизмами и включает представителей 13 порядков и 20 семейств, которые в свою очередь содержат большое количество родов и видов бактерий.

Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии, составляющие объект настоящего исследования, в значительной мере представлены родами и видами семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae, и группы Oceanospirdlum в составе класса "Gammaproteobacteria". Многие представители этих семейств, в том числе, родов Alteromonas, Pseudoalteromonas, Glaciecola, Idiomanna, Colwellia, Marinomonas являются облигатными морскими прокариотами и составляют важный компонент биоценозов морской среды. Галофильные/галотолерантные и психрофильные или психротолерантные

свойства являются характерными для бактерий этих родов, особенно морских представителей родов Halomonas и Psychrobacter, и их изучение представляет интерес как в плане фундаментальных биологических исследований, так и в экологическом и практическом аспектах. Рутинная идентификация бактерий морской среды, в том числе представителей "Gammaproteobacteria", представляет трудности в связи с многообразием и изменчивостью их, морфологических и биохимических свойств, необходимостью подбора сред и условий культивирования, некоторых штаммов. В последние два десятилетия исследования в области систематики морских "Gammaproteobacteria" интенсивно развиваются благодаря широкому использованию молекулярных методов анализа и разработке полифазной таксономии бактерий (Colwell et al, 1970; Vandamme et al., 1996), о чем свидетельствуют описание новых или реклассификация уже известных родов и видов семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae, и группы Oceanospinllum, в связи с чем дальнейшее совершенствование систематики гаммапротеобактерий остается весьма актуальной задачей. Исследования показывают, что морские аэробные гетеротрофные микроорганизмы имеют значительный биотехнологический, потенциал, поскольку способны синтезировать разнообразные биологически активные вещества (БАВ) и могут служить продуцентами ферментов, деградирующих полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты (Austin, 1988; 1989; Tsujibo et al, 1998; Михайлов и др., 1999; Holmstrom, Kjelleberg, 1999). Сохранение микробного разнообразия в коллекциях культур является базисом, который необходим для развития морской микробиологии, биотехнологии, химии морских соединений. Фундаментальное изучение биологии и таксономии морских микробных сообществ является важным для оценки и понимания экологической роли аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в морских экосистемах.

Целью настоящей работы явилось выделение морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий и изучение их фенотипических свойств, геномных и филогенетических характеристик; изучение филогенетических взаимосвязей и установление таксономического статуса выделенных бактерий на основе метода полифазной таксономии; изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ; создание и поддержание коллекции морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как основы для фундаментального изучения микробного биоразнообразия и биотехнологического использования морских бактерий.

Задачи исследования. В данной работе проведено таксономическое изучение вновь выделенных аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий, изолированных из различных источников морской среды: открытых океанических вод, прибрежных донных осадков и образцов морского льда, ассоциаций с беспозвоночными, преимущественно асцидиями и губками. Проведены исследования по поиску бактериальных продуцентов гидролаз и тирозиназ, перспективных для биотехнологии.

Основные задачи:

1. Выделение культур новых аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий из морских источников различных биотопов морской среды, включая не исследуемые ранее и малоизученные источники выделения микроорганизмов.

2. Изучение выделенных бактерий на основе полифазной таксономии с использованием фенотипических, хемотаксономических, генетических и филогенетических методов.

3. Изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ.

4. Анализ полученных результатов, выявление и описание новых таксонов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерий, входящие в состав семейств Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae и группы Oceanospirillum, широко распространены в морских экосистемах и были изолированы из разнообразных биотопов Тихого и Индийского океанов, включая открытые океанические воды, прибрежные донные осадки и морской лед и микробные сообщества, ассоциированные с беспозвоночными животными.

2. Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерий характеризуются таксономическим разнообразием. На основе метода полифазной таксономии среди выделеных бактерий идентифированы и описаны новые представители известных родов Pseudolateromonas, Glaciecola, Marinomonas, Halomonas, Psychrobacter, Rheinheimera, и новых родов Нюш^Ый, Oceanisphaera и Reinekea в структуре гаммапротеобактерий.

3. Морские бактерии рода Pseudoalteroшonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз.

Научная новизна работы. Выявлено биологическое разнообразие исследуемых бактерий, получены новые знания в области биологии и таксономической структуры морских гаммапротеобактерий. Показано, что изученные бактерии принадлежат к родам

Pseudoalteromonas, Glaciecola, Alteromonas, Idiomarina, Halomonas, Psychrobacter, Marinomonas - представителям класса "Gammaproteobacteria", среди которых описано 13 новых видов и 3 новых рода в составе гаммапротеобактерий, что составляет вклад в таксономическую структуру этого класса. В составе семейства Alteromonadaceae описан новый род глубоководных бактерий Idiomarina, и два вида, /. zobellii и 1. abyssahs. В составе рода Pseudoalteromonas описаны новые виды P. agarivorans, и P. manniglutinosa. Описан вид "Alteromonas distinctd" и реклассифицирован как Pseudoalteromonas distincta. Показано, что штамм P. distincta КММ 63 8Т проявляет высокий уровень тирозиназной активности и может быть. использован как продуцент фермента тирозиназы. Вид Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodoms (Alteromonas tetraodonis Simidu et al.

1990) реклассифицирован как Pseudoalteromonas tetraodonis. Впервые выделена глубоководная бактерия "Alteromonas haloplanktis" KMM 223-продуцент фермента эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей полиуридиловую кислоту. Впервые обнаружены психротолерантные штаммы бактерий рода Glaciecola KMM 241Т и КММ 642, которые были описаны как новый вид, Glaciecola mesophila. Впервые исследованы бактерии, ассоциированные с асцидией Halocynthia aurantium, в числе которых впервые была обнаружена уникальная по морфологическим и молекулярным характеристикам галофильная бактерия, которая описана как новый вид бактерий рода Halomonas, Н. halocynthiae. В составе рода Psychrobacter впервые описано два новых вида галофильных бактерий, способных расти при 15% хлористого натрия, P. submannus и P. marincola. Исследования видового разнообразия и таксономии бактерий рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря, показали, что новые штаммы составляют филогенетически и генетически гетерогенную группу, которая включает бактерии, относящиеся к известным антарктическим видам, и отличные между собой и от других валидных видов геномовиды, представляющие, по-видимому, новые виды рода Psychrobacter. В составе бактерий группы Oceanospirdlum обнаружены и описаны новые таксоны: новый вид психрофильных бактерий рода Marinomonas и новый род и вид морских галофильных бактерий Oceanisphaera litorahs gen. nov., sp. nov. Новая бактерия описана как новый род и вид морских гаммапротеобактерий, Reinekea sedtmentorum, который не входит в состав какого-либо известного семейства. Глубоководная галотолерантная бактерия КММ 1406т описана как новый вид рода Rheinheimera, R. pacifica.

Практическое значение. Создана и поддерживается коллекция детально охарактеризованных морских гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как фундаментальная база для изучения микробного

разнообразия и биотехнологического использования гаммапротеобактерий в качестве продуцентов физиологически активных соединений. Показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; выделены и поддерживаются в рамках Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН штаммы-продуценты ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз. Штамм Pseudoalteromonas sp. ("Alteromonas haloplanktis ") KMM 223 запатентован в качестве продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы, действие и свойства фермента изучены.

Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН.

Благодарности. Исследования были поддержаны грантами РФФИ 02-04-49058 и Минпромнауки РФ 03-19 и 2-2.16. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю ТИБОХ ДВО РАН академику Г. Б. Елякову, директору ТИБОХ ДВО РАН академику В. А. Стонику, д.б.н., проф. В. В. Михайлову за всестороннюю поддержку в работе, искреннюю признательность Prof. Dr. E. Stackebrandt, Dr. P. Schumann, Dr. M. Uchino, Prof. Dr. T. Uchimura и другим коллегам за помощь в работе. Автор благодарит своих соавторов - сотрудников лабораторий микробиологии, химии пептидов, морской биохимии, химии углеводов, химии микробных метаболитов ТИБОХ ДВО РАН, Института микробиологии РАН им. С. Н. Виноградского, лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря ДВО РАН за сотрудничество.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", ТИНРО, Владивосток, (1988); International Science Conference "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East", Anchorage -Vladivostok, (1994); 9-th European Carbohydrate Symposium, Utrecht, Netherlands, (1997); Conference Oceanology International 97 Pacific Rim., Singapore, (1997); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, (1998); 8-th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Canada, (1998); 2-ом Международном симпозиуме "Химия и химическое образование", Владивосток, (2000); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока", Владивосток, (2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 статьи, 17 тезисов докладов, 1 патент, 1 монография, Глава в электронной версии международного микробиологического руководства "The Prokaryotes" (Springer-Verlag).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части: объектов и методов исследования (Глава 4), результатов и обсуждения (Главы 5-9), заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 221 странице машинописного текста и иллюстрированы 27 рисунками и 27 таблицами. Список цитируемой литературы включает 263 источника.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Обзор литературы представлен в главах 1-3. В главе 1 рассматриваются аспекты таксономии и классификации прокариот и метода полифазной таксономии как основы для исследований в области систематики протеобактерий. В главе 2 представлена таксономическая структура класса "Gammaproteobacteria". Дана таксономическая характеристика аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий, относящихся к семействам Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae и группе Oceanospirillum. В главе 3 охарактеризованы бактерии рода Pseudoalteromonas и родственные им бактерии как продуценты биологически активных веществ.

4. Объекты и методы исследования.

Объекты и источники выделения микроорганизмов. Объектом настоящего исследования были штаммы микроорганизмов различных таксономических групп, изолированные из образцов морской воды, донных осадков, морского льда, а также морских беспозвоночных животных, в основном, асцидий и губок, отобранных в Японском море, а также в дальневосточных морях и открытых водах Тихого и Индийского океанов в период 1985-2002 г.г. В работе были использованы типовые штаммы бактерий родов Alteromonas, Pseudoalteromonas, Psychrobacter, Marinomonas, Halomonas, Pseudomonas и другие, полученные из зарубежных коллекций культур микроорганизмов. Для выделения, и культивирования бактерий использовали среду Горбенко (1961); модифицированную среду Youshimizu-Kimura (1976) с добавлением естественной морской воды; а также Морской Агар 2216, Морской Бульон 2216 (Difco), Триптиказо-соевый агар (Serva) и другие. Физиолого-биохимические свойства бактерий изучали стандартными бактериологическими методами, описанными Baumann et al. (1972,1984); Smibert, Krieg (1994), а также согласно "Методам общей бактериологии" под редакцией Ф. Герхардта, 1984. Использовали следующие тест-системы для идентификации бактерий: API 20NE, API 32NE, API ZYM test kits (BioMerieux, Франция) и BIOLOG GN MicroPlate Method (Biolog, США). Гидролиз каррагинанов тестировали по методу Yaphe, Baxter (1955). Тип метаболизма и образование кислоты из Сахаров и

спиртов определяли на модифицированной для морских микроорганизмов среде Хью-Лейфсона (Leifson, 1963). Морфологические характеристики клеток изучали с использованием трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии. Состав жирных кислот определяли методом газо-жидкостной хроматографии как описано (Svetashev et al., 1995), а также в соответствии со стандартной процедурой Microbial Identification System (Sasser, 1990). Анализ фосфолипидов и изопреноидных хинонов проводили как описано (Schumann et al.,1997). Липополисахариды выделяли экстракцией сухих бактериальных клеток горячим водным фенолом по методу (Westphal, Jann, 1965). Определение нуклеотидного состава ДНК проводили методом термической денатурации (Marmur, Doty, 1962; Owen et al., 1969); для некоторых штаммов использовали ГЖХ согласно методике Mesbah et al. (1989). ДНК-ДНК гибридизацию проводили спектрофотометрическим методом реассоциации (De Ley et al., 1970). Экстракцию геномной ДНК, амплификацию 16S рибосомных ДНК генов посредством PCR-обработки и секвенирование PCR продуктов проводили как описано Rainey et al. (1996), а также в соответствии с методами Shida et al. (1997). 16S рДНК гены были амплифицированы с использованием универсальных праймеров и секвенированы с использованием a Taq Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Электрофорез продуктов секвенирования производился на анализаторе 310 DNA Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Филогенетический анализ. Полученные последовательности 16S рДНК прочитаны и сравнены с 16S рДНК последовательностями других бактерий с использованием программы Alignment Editor ae2 и баз данных GenBank/EMBL Database. Для построения филогенетических дендрограмм использовали метод Jukes & Cantor (1969), алгоритмы и статистические методы программы PHYLIP (Felsenstein, 1993). Нуклеазную активность определяли в стандартных условиях по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза субстратов: высокополимерной ДНК из селезенки крупного рогатого скота (НПО "Вектор", Россия); денатурированной ДНК, полученной из нативной ДНК кипячением в течение 30 минут с последующим быстрым охлаждением; высокополимерной дрожжевой РНК и синтетических одноцепочечных гомополирибонуклеотидов: Поли(У) (полиуридиловая кислота), Поли(А) (полиадениловая кислота), Поли(Ц) (полицитидиловая кислота) (НПО "Вектор", Россия). За единицу активности принимали количество фермента, приводящее к образованию 1 оптической единицы (А260) низкомолекулярных продуктов гидролиза соответствующего субстрата при длине оптического пути 1 см за 20 мин. инкубации при 37 °С. Концентрацию белка в растворе определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Эндонуклеазы рестрикции определяли в организации "Сибэнзим", г. Новосибирск, по методу (Дедков и др., 1990). Уровень тирозиназной активности в супернатанте разрушенных клеток и культуральной жидкости определяли спектрофотометрическим методом по образованию дофахрома из L-тирозина (Pomerantz, Murthy, 1974).

Результаты и обсуждение

5. Род Pseudoalteromonas и родственные бактерии семейства Alteromonadaceae

Род Pseudoalteromonas образован Gauthier et al. (1995) в результате ревизии рода Alteromonas, проведенной на основании филогенетического анализа сиквенса рРНК генов бактерий, относящихся к родам Alteromonas, Shewanella, Vibrio, и Pseudomonas. В настоящее время род Pseudoalteromonas является самым многочисленным по числу видов (более 30) в составе семейства Alteromonadaceae (Mikhailov et al., 2002). Бактерии этого рода наряду с представителями родов Alteromonas, Glaciecola, Idiomarina, и Colwellia широко распространены в морской среде и могут считаться облигатно морскими гаммапротеобактериями.

5.1. Новые виды агаролитических бактерий рода Pseudoalteromonas - P. agarivorans и P. mariniglutinosa

Род Pseudoalteromonas включает известные виды P. carrageenovora и P. atlantica (Akagawa-Matsushita et al., 1992b; Gauthier et al., 1995), обладающие способностью разлагать сложные полисахариды водорослей: агар и каррагинаны. Таксономическое исследование группы агаролитических Alteromonas-полобных бактерий, изолированных нами из морской воды и различных видов асцидий, показало, что новые изоляты КММ 255Т, КММ 232, КММ 644, и КММ 254 представляют однородную группу по физиолого-биохимическим и молекулярно-генетическим характеристиками, но отличаются по своим свойствам от P. carrageenovora, P. atlantica и других видов рода Pseudoalteromonas. Выделенные штаммы были способны гидролизовать агар, каррагинан, альгинат и другие полимерные молекулы и характеризовались морфологическими и биохимическими особенностями, включая наличие клеток с 2-4 полярными жгутиками (Рис. 1) и неспособность к образованию кислоты из глюкозы, а также слабую или отрицательную утилизацию глюкозы и других источников углерода. Основные клеточные жирные кислоты новых изолятов были определены как

что согласуется с данными по жирно-кислотному составу бактерий рода Pseudoalteromonas.

Рис. 1. Клетки бактерий Pseudoalteromonas agarivorans KMM 255Т.

Увеличение х 10000 и х40000, соответственно.

Филогенетический анализ показал уровень сходства 16S рДНК штамма KMM 255Т и типовых штаммов бактерий видов рода от 99,9% до 97,2% и его позицию в группе непигментированных видов рода Pseudoalteromonas (Рис. 2). Эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации определили ДНК-сходство с филогенетически близкими видами на уровне 19-51% как показано в Таблице 1. Полученные уровни ДНК-сходства являются значительно более низкими относительно 70% величины, принятой для разграничения бактерий на межвидовом уровне (Wayne et al., 1987; Stackebrandt, Goebel, 1994). Новый вид Pseudoalteromonas agarivorans был описан для данной группы агаролитических микроорганизмов, типовой штамм KMM 255Т.

В настоящее исследование был включен как референтный агаролитический штамм "Alteromonas marinoglutinosa" NCIMB 1770, полученный из Национальной коллекции промышленных и морских бактерий, Абердин, Великобритания (National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK). "Alteromonas marinoglutinosa" NCIMB 1770 (Berland et al., 1969) был изолирован из диатомовой водоросли Chaetoceros lauderi, собранной в морских водах Mаpсельского залива (Gulf Marseille), и идентифицирован как "Pseudomonas marinoglutinosa". Ранее в процессе генетических исследований методом ДНК-рРНК гибридизации Pseudomonas-подобных бактерий было установлено, что штамм " Pseudomonas marinoglutinosa" NCIMB 1770 принадлежит к роду Alteromonas (De Vos et al., 1989). Однако данный штамм не был включен в филогенетическое исследование (Gauthier et al, 1995) и таксономическое положение штамма NCIMB 1770 требовало дальнейшего изучения. Исследование морфологии, физиолого-биохимических и

Таблица 1. Уровни ДНК-ДНК гибридизации штаммов Pseudoalteromonas agarivorans Pseudoalteromonas mariniglutinosa и типовых штаммов бактерий рода Pseudoalteromonas. Н.о. - не определяли.

Штаммы Г+Цв ДНК, (моль%) ДНК-ДНК гибридизация (%):

Р. agartvorans КММ 255т Р. mariniglutmosa КММ 3635т

Р. agarivorans КММ 255' 43,8 16

Р. агатогат КММ 232 42,2 95 18

Р. agarivorans КММ 254 42,7 86 15

Р. agarivorans КММ 644 42,5 88 Н.о.

Р. е1уакски КММ 162т 39,5 29 45

Р. езрерапа 1АМ 12640т 43,2 41 16

Р. аЛаписа 1АМ 12376т 40,5 45 28

Р. сагга^еепоуога 1АМ 12622т 41,3 26 - 32

Р. ШорЫШ АТСС 14393т 42,7 29 15

Р. ипсИпа 1АМ 12922т 41,1 34 42

Р. 1е1гаос1оп151АМ 14160т 42,1 33 28'

Р. с/иНпсШ КММ 638Т 43,8 31 17

Р. шёгг/ааею 1АМ 13010т 41,7 19 Н.о.

Р. сПгеа КММ 216т 43,8 24 Н.о.

Р. ргускепз!* АСАМ 620т 39' И.о. 35

Р. marimglutinosa КММ 3635т 40,3 16

=ИС1МВ 1770т

По данным Во\\тпап, 1998,

хемотаксономических свойств штамма NCIMB 1770 показало, что бактерия NCIMB 1770 является по основным признакам типичным представителем рода Pseudoalteromonas, и в то же время отличается от других валидных видов наличием роста при 37 °С и по спектру утилизируемых субстратов (Табл. 2). В результате наших исследований была установлена филогенетическая позиция штамма NCIMB 1770, близкая к кластеру Р. prydzensis (Рис. 2). Результаты ДНК-ДНК гибридизации данного штамма с типовыми штаммами бактерий рода Pseudoalteromonas подтвердили статус штамма NCIMB 1770 как отдельного вида этого рода (Табл. 1).

ICC

—Pseudoaiteromonas marieelcrs KMM 636T (AF144036) 100 Г Pseudoaiteromonas marinigluOnosi KMM 3635T {AJ507251) '— Pseados/feronionaspfj'cöensis АСАМ 620T {U65855)

100

¿j- Pseudoa.'fewnonas /ssacftenten// KMM 3549T (AF316144} *~Pseudoait&vrmnas tetwknls IAM14160T (X82139) —Psaudoaiteromonas carrageenovara IAM 12662т (X82136) -fteudoa/iewnonase.^e/enaNCIMB2127TjX82143) Pseudoaiteromonas aSa mica 1AM129271 (X82134) " Pseudoaiteromonas agarivcraos KMM 255T (AJ4175S4) Г Pseudoaiteromonas e/yakovi KMM 162T (AFQ82562) Pseudoaiteromonas distMa KMM 638T (AFC82564) ~ РшШеюпхш umtina NCIMB 2128г (X8214C) Pseudoak'onmas ügri'aoens NCIMB 8614т (X82146) Pseudoaltenmnas fafcp/алШ ATCC 14393т (X67024) - Pseudoalieronmas antardica CECT 4664T (X98336)

Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 168 рДНК и показывающее положение Р. agarivorans КММ 255Т и Р. mariniglutinosa КММ 3635Т в составе рода Pseudoalteromonas. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на 100 нуклеотидов.

На основании полученных результатов предложено описание нового вида Pseudoaiteromonas mariniglutinosa sp. nov., nom. rev., comb, nov., типовой штамм NCIMB 1770T=KMM3635T.

5.2. Меланин-синтезнрующие бактерии рода Pseudoalteromonas и их особенности. 5.2.1. Реклассификация Alteromonas distincta как Pseudoalteromonas distincta.

Штамм КММ 638Т был выделен в 1991 году из образца морской неидентифицированной губки, обитающей на глубине 350 м в Беринговом море,

Таблица 2. Фенотипические характеристики Pseudoalteromonas agarivorans,

Psendoalteromonas mariniglutinosa и других видов рода Pseudoalteromonas.

Данные настоящего исследования и Akagawa-Matshushita et al. (1992b); Bowman (1998); Sawabe et al. (2000); Ivanova et al. (2002a). +, Положительная реакция; -, отрицательная реакция; В, вариабельная реакция между штаммами вида; Сл, слабая реакция; НД, нет данных.

Характеристики 1 I

3 с > о J • 1

2 § 1 I 1 S 1 С «С

а Е с а 1 w ! 1 ■В

в," й,' сС «с

Рост при 4 "С - - - - + + +

37 °С - + - - В - +

¿12%ШС1 - - - - - + +

Гидролиз:

Крахмала + + + - + + -

Агара + + + - - - -

Каррагинана + + В + - - -

Хитина - • - - - + +

Образование

кислоты из: О-Глюкозы • - - + + + + нд

О-Маннита - + + + + - НД

Утилизация:

О- Глюкозы Сл + + + + + НД

Р-Фруктозы - + + + - +

Ь-Арабинозы ■ + - - НД + НД

Маннозы Сл + - + + -

Сахарозы + + + + + +

Глицерина - + + в + -

Ь-Малата + - + - + НД

Цитрата + + + в + +

Бутирата - + - + + НД

Содержание Г+Ц в ДНК 42,2- 40,3 40,6- 39,5 38,5- 38-39 42,9-

(моль %) 43,8 41,7 38,9 43,3

в районе Командорских островов. На основании изучения фенотипических, генотипических свойств и ДНК-ДНК гибридизации описан в 1995 г. как новый вид бактерий рода Alteromonas, A. distincta. Филогенетическое изучение штамма КММ 638Т показало его принадлежность к роду Pseudoalteromonas, образованному в результате ревизии рода Alteromonas (Gauthier et al, 1995), в кластере непигментированных видов, который включает и типовой вид, P. haloplanktis (Рис. 2). Сравнительный анализ выявил высокие уровни сходства 16S рРНК (99,9-99,5%) штамма КММ 638Т и филогенетически близких видов P. elyakovii КММ 162Т, P. undina IAM 12922T, P.. atlantica IAM 12376Т, Р. espejiana IAM 12640T, P. nigrifaciens IAM 13010T. Уровни ДНК-ДНК гибридизации (Табл.

2, 3) не превышали 70% величины (Wayne et al, 1987), что подтвердило вывод о том, что штамм представляет отдельный вид рода. На основании комплекса полученных данных штамм КММ 63 8Т был реклассифицирован как Pseudoalteromonas distincta Р distincta КММ 638Т имеет ряд морфологических и биохимических особенностей способность образовывать латеральные жгутики в количестве от 1 до 7-9 (Рис 3), что впервые выявлено у бактерий этого рода, и накапливать в клетках меланино-подобный пигмент, диффундирующий в среду

Рис. 3. Бактерия Pseudoalteromonas distincta КММ 638Т Увеличение х25000

Пигмент образуется быстрее при температуре 4-15 °С и аэрации К особенностям этого вида можно отнести неспособность к образованию кислоты из Сахаров и спиртов и ограниченный спектр субстратов, используемых в качестве единственного источника углерода и энергии Бактерия является хемогетеротрофом, утилизирует аргинин и тирозин, продуцирует желатиназу, липазу, ДНК-азу, обладают оксидазной, каталазной и тирозиназной активностью Крахмал, хитин, М-ацетилглюкозамин, альгинат и агар не гидролизует Содержание Г+Ц в ДНК составляет 43, 8 моль% Уникальность бактерии КММ 638Т состоит также в том, что штамм проявляет высокий уровень тирозиназной активности и может быть использован как продуцент фермента тирозиназы

5.3. ДНК-ДНК сходство непигментированных видов рода Pseudoalteromonas. Реклассификация Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodonis как Pseudoalteromonas tetraodonis

Изучение ДНК-ДНК и филогенетических связей непигментированных видов рода Pseudoalteromonas (Табл 1,3, Рис 3) позволили реклассифицировать Pseudoalteromonas

haloplankhs subsp. tetraodoms (Akagawa-Matsushita et al., 1993) (Alteromonas tetraodoms Simidu et al. 1990) как Pseudoalteromonas tetraodoms. Уровень ДНК-ДНК сходства типовых штаммов P. haloplanktis и A. tetraodoms составил 48%, что свидетельствовало о том, что A. tetraodoms является самостоятельным видом рода Pseudoalteromonas и его таксономический статус должен быть восстановлен.

Таблица 3. Уровни ДНК-ДНК гибридизации типовых штаммов бактерий рода Pseudoalteromonas филогенетического кластера P. haloplanktis. Н о., не определяли.

Штаммы aH=o jjjS •§ 5 < 2 Si- ia J? л a a, < Is о с S a, а i § Si а,'2 I Sv ^.о «гз с»- G С VO и О В а, о с || § -a, S о 5 Н Е S 8$ о. S2

P. haloplanktis 30 100

АТСС 14393т

P. mgrifaciens 31 33 100

IAM 13010т

P. undma IAM 12922х 14 54 26 100

P. espejiana 33 21 16 47 100

IAM 12640т

P. antarctica Ho 19 49 29 31 100

СЕСТ 4664т

P. tetraodoms 17 48 Но 37 18 40 100

IAM 14160т

P. carrageenovora Ho 25 24 39 32 33 58 100

IAM 126621

"A.JuhgmecT 41 35 23 15 43 23 18 15

КММ2167

P. distmcta 100 30 31 16 33 Но 17 Но

KMM 63 8T

P. atlantica Ho 32 31 Но 54 Но Но Но

IAM 12927T

P. elyakovn 54 29 31 24 43 36 Но 38

KMM 162T

Pseudoalteromonas Ho «1 Но 17 21 Но 21 Но

sp KMM 223

Результаты молекулярно-генетических экспериментов были подтверждены различиями физиолого-биохимических свойств штаммов P. haloplanкtis subsp. tetraodoms IAM 14160 (Л-М), P. haloplanktis subsp. haloplanktis АТСС 14393Т и Alteromonas tetraodoms Simidu et 01. 1990 1ЛМ 14160Т, что позволило восстановить статус Р. haloplanktis АТСС 14393Т и Р. tetraodoms 1ЛМ 14160Т как самостоятельных видов.

5.4. Бактерии рода РзеМоаПеготопаз - продуценты ферментов 5.4.1. Бактерии рода Pseudoalteromonas - продуценты иуклеаз

Поиск бактерий-продуцентов биологически активных веществ, БАВ, и продуцентов ферментов нуклеинового обмена, в частности, показал, что среди Pseudoalteromonas-подобных бактерий обнаруживаются штаммы, продуцирующие нуклеазы. Проведенный нами скрининг 56 штаммов псевдоальтеромонад, ассоциированных с асцидиями и губками, выявил бактерии, продуцирующие эндонуклеазы рестрикции - изошизомеры известных рестриктаз. Специфичность обнаруженных ферментов была различной (Табл. 4).

Таблица 4. Бактерии рода Pseudoalteromonas - продуценты эндонуклеаз рестрикции.

Штамм Прототип эндонуклеазы рестрикции Сайт узнавания

КММ 256 ХЬа I ТСТАОА

КММ 742 £соЮ1 СС\УОО

КММ 743 5ак961 ОСМСС

КММ 773 ВаП ТССССА

КММ 510 Ыае\ ССССвС

Обнаружен штамм "Alteromonas haloplanktis" КММ 223, изолированный из образца морской воды (северо-западная часть Тихого Океана, глубина 1950 м). Из клеток бактерии КММ 223 выделен фермент, специфически расщепляющий полиуридиловую кислоту по эндонуклеазному механизму с образованием олигонуклеотидов с 5'-фосфатными концевыми группами. Фермент представляет собой белок субъединичного строения с молекулярной массой 52 кД. Проявляет максимальную активность в присутствии катионов Mg2+ и 0,2-0,5 М ШО. Оптимум рН 8,2-8,5. Штамм КММ 223 запатентован в качестве продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы и свойства фермента изучены.

5.4.2. Таксономические особенности глубоководной бактерии ""Alteromonas haloplanktis" KMM 223 - продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы.

Бактерия КММ 223 представляет интерес не только как продуцент уникального фермента, но и с точки зрения таксономической характеристики. Штамм КММ 223 был идентифицирован как "Alteromonas haloplanktis" на основании изучения его гено- и фенотипических свойств в 1987 г. Полученные позднее данные сравнительного филогенетического анализа сиквенса 16S рРНК гена КММ 223 показали наибольший процент сходства 97% с P. prydzensis и 98% с неидентифированным гидротермальным изолятом. Изучение нуклеотидного состава и уровня ДНК-ДНК гибридизации некоторых типовых штаммов непигментированных видов рода Pseudoalteromonas и КММ 223 показали, что процент ДНК-ДНК гибридизации был в пределах 17-48 % (Табл. 3). Результаты позволяют предположить, что штамм КММ 223 может представлять новый вид бактерий рода Pseudoalteromonas.

5.4 J. Тирозиназная активность бактерий рода Pseudoalteromonas.

При исследование тирозиназной активности Pseudoalteromonas-подобных

бактерий нами установлено, что более 40 % испытуемых штаммов проявили высокий уровень общей активности (3,3 -3,9 ед/мл) в культуральной жидкости. Около 50 % штаммов при сравнительно небольшой общей активности (1,5 - 2,5 ед/мл) показали высокую удельную активность 6,5-15,0 ед/мг белка. Активные штаммы были обнаружены как среди микроорганизмов, ассоциированных с беспозвоночными животными, так и среди свободноживущих бактерий. Среди активных штаммов рода Pseudoalteromonas были идентифицированы и описаны новые виды P. distincta КММ 638Т и P. agarivorans КММ 232. Из культуральной жидкости активных штаммов выделены тирозиназы с различной молекулярной массой: 30 000 Д (P. agarivorans КММ 232), 94 000 Д (Pseudoalteromonas sp. KMM 514). Из культуральной жидкости штамма Pseudoalteromonas sp. KMM 214 выделена тирозиназа с молекулярной массой 20 000 Д, а из клеток бактерий этого штамма выделена тирозиназа с молекулярной массой 67 000 Д, как и уже известная тирозиназа штамма 2-40 (Kelley et ah, 1990). Из клеток штамма КММ 638Т выделена тирозиназа с молекулярной массой 26 300 Д. Полученные данные свидетельствуют о том, бактерии рода Pseudoalteromonas, как непигментированные, так и синтезирующие меланоидные пигменты, продуцируют различные по локализации в клетке и молекулярной массе тирозиназы и могут служить перспективными источниками получения этих ферментов.

5.4.4. Биологическая активность бактерий рода Pseudoalteromonas, ассоциированных с асцидией Halocynth ia auran tium

Показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas составили основную группу микробного сообщества, ассоциированного с асцидией Halocynthia aurantium, и проявляли высокую гидролитическую активность: 100% псевдоальтеромонад синтезировали желатиназы, липазы, и ДНК-азы; 22% - амилазы, по 11% - хитин- и агаролитические ферменты. Показано, что псевдоальтеромонады, изолированные из Н. aurantium, являются продуцентами внутриклеточных специфических РНК-аз, рестриктаз и тирозиназ. Среди бактерий-ассоциантов рода Pseudoalteromonas обнаружен наибольший процент активных штаммов (81% и 84%), способных подавлять рост Proteus vulgaris и Candida albicans, соответственно.

5.5. Психрофильные бактерии рода Glaciecola и особенности нового вида Glaciecola mesophila

Таксономическое исследование группы агаролитических Alteromonas-подобных бактерий, изолированных из морской воды и различных видов беспозвоночных, показало, что штаммы представляют гетерогенную группу по физиолого-биохимическим и

Рис. 4. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, показывает позицию Glaciecola mesophila КММ 241Т в составе рода Glaciecola. Масштаб соответствует 10 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами указаны значения статистического "bootstrap" анализа.

молекулярно-гснетическим характеристикам. Две агаролитические Alteromonas-подобные бактерии КММ 241Т и КММ 642, изолированные из межтканевой жидкости асцидии Halocynthia aurantium и гомогената внутренних тканей губки Plocamia sp., соответственно, были близкими по ДНК-ДНК гибридизации (71%) как один геномовид. Штаммы отличались по многим характеристикам от агаролитических бактерий нового вида P. aganvorans. Филогенетический анализ показал, что штамм КММ 241Т относится к роду Glaciecola (Bowman et al, 1998b) и представляет отдельную филогенетическую ветвь в структуре этого рода (Рис. 4).

Установлено, что основные фенотипические и хемотаксономические характеристики штаммов КММ 241Т и КММ 642 согласуются с признаками рода Glaciecola. Бактерии являются овоидами или вибриоподобными клетками подвижными с помощью единственного полярного жгутика (Рис. 5), слабо галофильными, требуют для роста ионы натрия, не растут при 10% хлористого натрия в среде, основные жирные кислоты 16:0, w.lcolc, 18:lö)7c,молярный процент содержание Г+Ц в ДНК 44,6-44,8.

Особенными признаками, позволяющими дифференцировать бактерии рода Glaciecola, включая новые изоляты, от бактерий Alteromonas и Pseudoalteromonas являются отсутствие желатиназной, казеиназной и уреазной активностей, а также слабая реакция или отсутствие образования кислоты из Сахаров и утилизации Сахаров и других субстратов. Новые штаммы КММ 241Т и КММ 642 отличались от антарктических видов G. punicea и G. pallidula, которые характеризуются выраженными психрофильными свойствами, максимальной и минимальной температурами роста (7-35 °С), отсутствием

Рис. 5. Клетки бактерии Glaciecola mesophila КММ 241Т. Масштабная линейка: 0,5 мкм.

Таблица 5. Фенотипические признаки, дифференцирующие новый вид Glaciecola mesophila, бактерии рода Glaciecola и Alteromonas macleodii.

Результаты настоящего исследования и данные Bowman et al. (1998b); Baumann et al. (1984b, 1984c). " + ", положительная реакция; "-", отрицательная реакция; В+, вариабельная реакция между штаммами вида, реакция типового штамма положительная; В-, вариабельная реакция между штаммами вида, реакция типового штамма отрицательная; Сл, слабая реакция; НД, нет данных._

Признак Glaciecola mesophila Glaciecola punicea Glaciecola pallidula Alteromonas macleodii

KMM 241т КММ 642

Пигмент - - + + -

Рост при: 04 °С - - + + -

25 °С + + + +

35 "С + + - +

37 °С - - - +

Рост в 10%ЫаС1: - - - +

Гидролиз: Желатина - - - +

Казеина - - - +

Крахмала + + - В+ +

Агара, каррагинана + + - - -

Образование кислоты из:

О-глюкозы Сл Сл Сл Сл +

Сахарозы Сл - - - +

Мальтозы - - - Сл +

Утилизация:

Б- глюкозы + + - - +

Р-галактозы + - - - +

Мальтозы + + - - +

Целлобиозы + - - +

О-фрукгозы + - - +

Э-маннозы Сл - - -

Глицерина - - + +

Гликогена, декстрана + - + НД

Ацетата - - + +

ОЬ-Лактата - - + в+

О-Глю коната - - - +

Пирувата - - + +

Пропионата - - - +

а-глицерофосфата Сл В+ + НД .

Сукцината, фумарата - + - -

Ь-ссрииа + - - в-

Ь-малата, Ь-пролина - + - -

Ь-тирозина - в+ - +

Г+Ц в ДНК, моль% 44,8 44,6 44-46 40 44-47

пигментов, способностью гидролизовать агар и каррагинан, и утилизировать глюкозу, сахарозу, целлобиозу, мальтозу, галактозу, фруктозу, трегалозу, серии и

гидроксибутират (Табл. 5). Штаммы КММ 241Т и КММ 642 были описаны как новый вид бактерий рода Glaciecola, G. tnesophila.

5.6. Глубоководные бактерии рода Idiomarina

Штаммы бактерий были изолированы из образцов морской воды, отобранных в северо-западной части Тихого океана на глубине 4000 и 5000 метров в июле 1985 года. Выделенные бактерии КММ 227Т и КММ 231Т представляли собой грамотрицательные аэробные галофильные гетеротрофные микроорганизмы с дыхательным типом метаболизма. Молярный процент содержания Г+Ц в ДНК составил 48-50. Бактерии были палочковидными клетками подвижными с помощью одного полярного жгутика и имели характерные морфологические особенности: наличие фимбрий у бактерий штамма КММ 231Т и внешней оболочки на одном из полюсов клеток бактерий КММ 227Т. Выделенные бактерии по своим физиолого-биохимическим свойствам были близки представителям других родов аэробных гаммапротеобактерий Alteromonas, Pseudoalteromonas, Mannomonas, Halomonas, но в то же время имели ряд существенных различий, включая ограниченный спектр использования углеводов в качестве единственных источников углерода и- энергии и характерный состав клеточных жирных кислот (Табл. 6). Глубоководные штаммы содержали iso-разветвленные жирные кислоты (до 70%) с нечетным количеством атомов углерода. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рДНК генов показал, что бактерии близки между собой, формируют устойчивую отдельную монофилетическую ветвь и филогенетически удалены от других родов гаммапротеобактерий (Рис. 14). Уровень ДНК-сходства между штаммами КММ 227Т и КММ 231T составил 27%, что свидетельствует о принадлежности бактерий к разным видам согласно критерию Wayne et al. (1987). Различия между бактериями КММ 227Т и КММ 231Т на молекулярном уровне были подтверждены различиями в морфологии и фенотипических свойствах исследуемых бактерий, которые различались по способности гидролизовать хитин, казеин, росту при 15% NaCl, утилизации декстрина, гликогена, ацетата, L-пролина, глицерина, L-орнитина и по чувствительности к стрептомицину и гентамицину.

На основании полученных результатов было предложено классифицировать бактерии КММ 227Т и КММ 231Т как бактерии нового рода Idiomarina и двух новых видов /. abyssalis и /. zobellu, соответственно.

Таблица 6. Дифференциально-диагностические фенотипические характеристики бактерий рода Idiomarina и бактерий родов семейства Alteromonadaceae. По данным собственных исследований и Baumann et al. (1984b, c), Bowman et al. (1998a, b), Deming et al. (1988), Mikhailov et al. (2002), Macidn et al. (2001). Обозначения: +, положительная реакция ; -, отрицательная реакция; М, медленная реакция; А, аэробный, Ф-А, факультативно-анаэробный тип метаболизма; Сл, слабая реакция; В, вариабельная реакция между штаммами; НД, нет данных.

Признак Alteromonas Pseudoalteromonas Idiomarina Colwellia Glaciecola Thalassomonas

Особенности морфологии Фимбрии, внешняя оболочка Фимбрии

Пигментация - В - в + +

Тип метаболизма А А или Ф-А А А или Ф-А А А

Рост при №С1, % 1-10 1-12-15 0,6-15 1-6 1,5-5 2-4

Температура роста, °С 10-35-40 4-10-35-37 4-35 2 -10-26 -2-20 13-37

Гидролиз желатина + + + В - +

Утилизация И-глюкозы + в - В - Сл

Основные жирные кислоты 1б:1ш7с; 16:1м 7с; Isol5:0; 16:1ш7с; 16:1ю7с; 15:0;

16:0; 18:1 о>7с 16.0 Isol 7:0 16:0; 22:6 шЗ 16:0; 18:1 ш7с 16:0; 17:1м8с

Содержание Г+Ц в ДНК, моль % 44-47 37-50 48-50 35-46 40-46 48,4

5.7. Характеристика полисахаридов штаммов бактерий рода Pseudoalteromonas и Idiomarinazobellii

Проведенные структурные исследования О-специфических полисахаридов штаммов бактерий рода Pseudoalteromonas показали, что кислый разветвленный полисахарид из липополисахарида P. distincta КММ 638Т имеет следующее строение:

О-специфический полисахарид Pseudoalteromonas haloplanktis АТСС 14393Т имеет кислый характер и содержит остатки D-галактозы (D-Gal), 3-(М-ацетил^-аланил)амино-3,6 -дидезокси^-глюкозы [D-Qui3N(D-AlaAc)], 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси^-глюкозы (D-QuiNAc4NAc), 2-ацетамидо-2-дезокси^- и -L-галактуроновые кислоты (D- и L-GalNAcA). Это первый бактериальный полисахарид, который имеет в своем составе D-и L-изомеры 2-ацетамидо-2-дезоксигалактуроновой кислоты.

Изучена структура D-специфического полисахарида штамма Pseudoalteromonas sp. ("Alteromonas haloplanktis") КММ 223 - продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы. Установлено, что полисахарид содержит повторяющееся звено, состоящее из одного остатка L-идуроновой кислоты (L-IdoA) и по два остатка D-глюкуроновой кислоты (D-GlcA) и 2-ацетамидо-4[(8)-3-гидроксибутирамидо]-2,4,6-тридезокси-D-глюкозы [D-QuiNAc4N(S-3Hb)]. Один из кислых моносахаридов, L-идуроновая кислота, является известным компонентом гликозаминогликанов млекопитающих (дерматансульфата, гепарансульфата и гепарина), но неизвестен в бактериальных полисахаридах. Это первый случай нахождения L-идуроновой кислоты в липополисахариде.

Структура О-специфического полисахарида штамма Pseudoalteromonas agartvorans КММ 232 (S-форма) имеет дисахаридное повторяющееся звено, которое содержит остатки D-маннозы, L-рамнозы и сульфатную группу.

P. agarivorans KMM 232 является первой грамотрицательной бактерией, в составе О-специфического полисахарида которой обнаружена сульфатная группа О-специфический полисахарид из липополисахарида R-формы штамма P. agarivorans KMM 232 содержит остатки L-рамнозы, L-фукозамина, D-глюкозамина, D-маннозамина и треонина.

Исследован О-специфический полисахарид штамма Pseudoalteromonas mariniglutinosa NCIMB 1770T, содержащий D-галактозу, ^ацетил^-маннозамин и N-ацетил-D-глюкозамин в эквимолярном соотношении. На основании данных метилирования, периодатного окисления и 13С-ЯМР спектроскопии исходного и модифицированного полисахаридов установлена следующая структура трисахаридного повторяющегося звена О-специфического полисахарида:

->3)-a-D-Gal/>-<l-+3)-P-D-Glc/iNAc-(l->

При исследовании структуры О-специфического полисахарида Idiomarina zobellii KMM 231Т впервые были обнаружены два необычных аминосахара со свободными аминогруппами: 4-амино-4,6-дидезоксиглюкоза (Qui4N) и 2-амино-2-дезоксигулуроновая кислота (GulNA) в структуре О-специфического полисахарида, который имеет следующее строение:

-»3)-o-D-Quip4N-(l->4)-a-D-GIc/iA-(l->6)-a-D-GlcpNAc-(l->

Глава 6. Биологические особенности нового вида бактерий Halomonas halocynthiae -ассоцианта асцидии Halocynthia aurantium

Род Halomonas был описан Dobson, Franzmann, (1996) для объединения представителей четырех родов Deleya, Halomonas, Halovibrio, Volcaniella, и штамма Paracoccus halodenitrificans в один род Halomonas в составе семейства Halomonadaceae (Dobson, Franzmann, 1996). В настоящее время описано более 25 видов бактерий рода Halomonas. Уникальные свойства бактерий рода Halomonas - высокая толерантность к изменению солености и галофильность многих видов - способствуют широкому распространению этих микроорганизмов в природе.

В процессе изучения таксономического состава бактерий-ассоциантов асцидии Halocynthia aurantium обнаружена уникальная по морфологическим и молекулярным

характеристикам галофильная бактерия КММ 1376Т. При электронно-микроскопическом исследовании была выявлена уникальная морфология клеток, которые имеют внешние структуры, напоминающие фимбрии, что выявлено впервые у бактерий рода Halomonas. Кроме того, клетки и фимбрии покрыты толстой капсулой (Рис. 6). Бактерии проявляли галофильные и психротолерантные свойства и росли в присутствии 0,5-15% №С1; температурный интервал роста 7-35 °С. Молярный процент содержания Г+Ц в ДНК составил 54. Доминирующие жирные кислоты штамма КММ 1376Т включали 16:0 (23,4%), 16:1й>7с (28,3%), и 18:1ш9с (40,2%); жирные кислоты 10.0 (3,0%), 12:0 (2,8%), 15:0 (1,0%) и 12:0-З0Н (1,3%) определялись как минорные.

Рис 6. Микрофотография бактерии Halomonas halocynthiae КММ 1376Т. Стрелками показаны внешние структуры - фимбрии.

В составе фосфолипидов штамма КММ 1376Т были определены фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин, фосфатидилинозит и фосфатидилсерин. Сравнительный анализ 16S рДНК сиквенса штамма КММ 1376Т выявил уровень филогенетического сходства с видами рода Halomonas от 94,5 до 95,5%, и определил позицию штамма КММ 1376Т, близкую к подгруппе Я. subglaaescola, которая включает также виды Н. variabihs, H. aquamanna, H. mendiana, H. magadiensis, H. venusta, и Я. halodurans (Рис. 7). Показано, кластер Halomonas включает также виды рода Chromohalobacter (Arahal et al., 2001a; 20016), составляющие монофилетическую ветвь, что свидетельствует о гетерогенности бактерий группы Halomonas. Фенотипические и хемотаксономические отличия штамма КММ 1376Т от описания рода Halomonas (Dobson, Franzmann, 1996) состояли в отсутствии жгутиков и жирных цикло-кислот 17:0 и 19.0.

Рис. 7. Филогенетическая структура бактерий рода Halomonas и позиция нового вида Halomonas halocynthiae КММ 1376T. Масштаб: 5 нуклеотидных замен на 100 нуклеотидов.

Особенности штамма КММ 1376Т могут быть связаны с экологической нишей этих бактерий, изолированных из жаберной ткани пурпурной асцидии, где неподвижность и наличие дополнительных клеточных структур фимбрий необходимы для адаптации и прикрепления бактерий к тканям животного-хозяина. Штамм КММ 1376Т предложено классифицировать как новый вид бактерий рода Halomonas, Halomonas halocynthiae.

Глава 7. Психротолерантные бактерии рода Psychrobacter морской среды и их особенности.

7.1. Psychrobactersubmarinus и Psychrobacter marineóla - новые галофильные бактерии рода Psychrobacter

Бактерии рода Psychrobacter наряду с представителями родов Moraxella и Acinetobacter входят в состав семейства Moraxellaceae (Rossau et al., 1991). Род Psychrobacter Juni et Heym, 1986 включает грамотрицательные аэробные

оксидазоположительные неподвижные кокковидные бактерии. Бактерии этого рода являются психрофильными или психротолерантными и галотолерантными микроорганизмами. Специфические физиологические свойства бактерий рода Psychrobacter способствуют их широкому распространению в природе и выделению из морских (вода, донные осадки, рыбы), наземных (домашние птицы, пищевые продукты) источников (Kampfer et al, 2001; Yoon et al, 2003; Vela et al, 2003) и клинического материала. Благодаря адаптации к низким температурам окружающей среды психрофильные и психротолерантные бактерии способны обитать в холодных условиях экосистем Мирового Океана, о чем свидетельствует обнаружение многих видов рода Psychrobacter, P. uratrvorans, P. frigidicola, P. glacmcola (Bowman et al, 1996; Bowman et al., 1997b), P. paaficensis (Maruyama et al., 2000), P. marmcola, P. submarmus (Romanenko et al, 2002), P.fozii и Р. luti (Bozal etal, 2003).

В процессе изучения микробных сообществ морской среды две галофильные бактерии КММ 225Т и КММ 277Т были выделены из морской воды (открытые воды Тихого Океана, глубина 300м) и асцидии Polysyncraton sp, собранной в районе Индийского Океана. Характерным отличием новых морских изолятов были их галофильные свойства, и способность расти при 15% NaCl в среде. Толерантность к высокому содержанию хлористого натрия (15%) впервые обнаружена нами у бактерий этого рода, и, возможно, данная особенность обусловлена морской средой обитания исследуемых штаммов бактерий. Основные фено- и генотипические свойства выделенных бактерий были характерными для бактерий рода Psychrobacter (Табл.7).

Рис 8. Клетки бактерий Psychrobacter manncola КММ 277Т (а) и Psychrobacter submanms КММ 225Т (б). Масштабная линейка: (а), 0,25 мкм; (б), 0,5 мкм.

Рис 9. Филогенетическое древо построено на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 168 рДНК, показывает позицию штаммов КММ 225Т и КММ 227Т в составе рода Psychrobacter. Масштаб соответствует 10 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов.

Филогенетический анализ, основанный на различных алгоритмах показал, что оба штамма образуют отдельную, удаленную от других кластеров ветвь внутри бактерий рода

РяускгоЬаеГег (Рис. 9). Результаты ДНК-ДНК гибридизации штаммов КММ 225Т, КММ 277Т и типовых штаммов рода РхускгоЬасГег, включая типовой вид Р. тшоЫШ CIP 102557х, определили уровни ДНК-ДНК реассоциации в пределах 14-25% (Табл. 7).

Штаммы КММ 225Т и КММ 277Т отличались по морфологии клеток (Рис. 8) и по следующим признакам: рост при 4 °С, гидролиз Твина-40, образование кислоты из фруктозы и L-арабинозы, утилизация трегалозы, неспособность утилизировать а-гидроксибутират и р-гидроксибутират, присутствие 18:1а)7с (3,2%) в жирно-кислотном составе клеток и содержание ГЦ-пар оснований в ДНК (46,7 моль%).

Таблица 7. Уровни ДНК-ДНК сходства бактерий РхускгоЫасГег suЫmarinus КММ 225Т, Р^скгоЫасГгг тагтсо!а КММ 277Т и типовых бактерий рода PsychroЫacter.

Штаммы Г+Ц в ДНК, моль% ДНК-ДНК Сходство, %

КММ 2251 Р. ШтоЬИи С1Р 102557х

Р. ¡¡иЬтагтм КММ 2251 46,8 100 25

Р. таппсоШ КММ 277т 50,7 15 14

Р. ШтоЫЧзСХ? 102557т 45,7 25 100

Р. иШЫогаю С1Р 105100т 44,0 24 Н.о.

Р./прсИсо1а С1Р 105101х 41,7 20 И.о.

Р. фстсоЬ С1Р 105313х 44,7 22 22

И.о., не определяли.

На основании полученных результатов исследований фенотипических и молекулярных свойств бактерии КММ 225T и КММ 277Т были классифицированы как два новых вида в составе рода PsychroЫacter, Р. suЫmarinus sp. nov., и Р. тагтсо1а sp. nov., соответственно.

12. Видовое разнообразие и таксономическая характеристика бактерий - рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и грунта Японского моря.

Исследования показали, что бактерии рода Psychrobacter обитают в полярных регионах и многие виды психробактеров были выделены из образцов льда и орнитогенных почв Антарктики (Bowman et al, 1996; 1997b; Bozal et al, 2003). Проведенное нами таксономическое исследование 52 штаммов, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря, и идентифицированных как бактерии рода Psychrobacter, имело целью определение их видового разнообразия и биологических особенностей.

Секвенирование 16S рДНК и филогенетический анализ, эксперименты по ДНК-ДНК реассоциации в комплексе с изучением фенотипических признаков показали, что некоторые штаммы относятся к известным видам рода Psychrobacter, P. immobilis (штамм Pi2-10), P. urativorans (штаммы Pi2-28, Pi2-50, Pi46, и Pi54) (Табл. 8), P.fozii, (Pi2-30 и Pi2-40), P. glacincola (Pi29). Следует отметить, что бактерии видов P. urativorans, P. glacincola (Bowman et al., 1996; 1997b) и P. fozii (Bozal et al, 2003) были обнаружены ранее в районе Антарктиды и другие места обитания этих бактерий неизвестны. Филогенетический анализ показал, что отдельные группы штаммов Psychrobacter были филогенетически отличны от других видов бактерий рода Psychrobacter и между собой, образуя комплекс отдельных геномовидов, что подтвердили данные риботипирования и ДНК-ДНК гибридизации (Табл. 8). Исследование жирно-кислотного состава клеток показало наличие доминирующих жирных кислот 18:1а>9с, 17:1(1>8с, 16:loi7c/15¡ 2ОН, характерных для бактерий этого рода, и вместе с тем выявило различия между отдельными геномовидами (Табл. 9). При детальном изучении выделенных штаммов были обнаружены морфологические особенности (наличие межклеточных образований, похожих на пили или фимбрии). Физиолого-биохимические свойства: способность утилизировать адипат, фенилацетат, маннозу, слабая утилизация декстрана или гликогена, продукция индола, были выявлены впервые и ранее не обнаруживались у других видов психробактеров. Представители отдельных геномовидов характеризовались отличными фенотипическими признаками (Табл. 10), что позволяет предположить, что обнаруженные геномовиды, могут представлять новые виды бактерий рода Psychrobacter.

Большинство новых изолятов утилизировали L-арабинозу, в то время как этот признак является отрицательным для бактерий рода Psychrobacter, за исключением слабо положительной реакции P. faecahs (Табл. 9). Следует отметить, что все новые бактерии характеризовались липолитической активностью и способностью утилизировать соли

органических кислот, аминокислоты и их производные, включая, ацетат, глутаминовую, аспарагиновую кислоты, р-гидроксибутират, метилпируват, метилсукцинат и другие. Использование перечисленных химических соединений в качестве источников углерода и энергии свидетельствует об участии штаммов бактерий рода Р^сНгоЬа^ег - изолятов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря в деградации органического материала в морской воде прибрежной экосистемы при низких температурах, что имеет важное экологическое значение.

Таблица 8. Уровни ДНК-ДНК гибридизации изолятов морского льда и грунта Японского моря и типовых штаммов бактерий рода PsychroЬacter.

Штаммы Уровни ДНК-сходства (%)

SH .3

•S ^ О g 5 о 6 2 ■t о О С (Л ЦО ? 2 § ГЛ •г ¡л 8 - <ч 1 fS

S о ~ а. а; 0 о: G Ü ~ 60 Q. а; и ^ С/] Т СЧ г- СЧ

a, « a, О £ £ Di Е

Pi2-52 32 47 19

Pi2-1* 38 37 44 98

Pi2-51 55 56 24

Pi 2-33' 49 24 45 17 53 23

Pi2-20* 83

Pi2-25 85

Pi2-4 19 15 20 15

R7 33 100

127-6 66 36

R20* 95

Pi2-10 93

Pi2-28 85

Pi2-50 80

Pi46 75

Pi54 73

P. immobilis

CIP 102557T 25 32

Величины ДНК-ДНК реассоциации составляют для штаммов Pi2-1 и R20 (94%);

Pi2-13 и Pi2-33 (83%); Pi2-20 и Pi2-25 (88%), соответственно.

Таблица 9. Состав клеточных жирных кислот штаммов РзускгоЪа^вг, изолированных из образцов морского льда и

грунта Японского моря.

Жирная кислота Рй-1 «2-7 Я 20 Р12-33 ра-гз Р12-51 Р12-4 Р12-25 Р12-20 127-6 РП-52 Д7

10:0 2,45 3,51 2,97 3,70 4,55 4,51 2,81 2,78 2,90 3,53 2,68 2,85

11:01 0 0 0 0,29 0,51 0 1,27 1,40 1,27 0 0 0,69

12:0 2,35 3,24 3,15 0 0 0 0 0 0 3,71 2,88 2,64

12:0-3011 3,07 4,90 3,86 2,88 3,59 2,40 2,89 2,64 2,70 4,53 4,10 3,43

15:11/13:0 ЗОН 1,14 0,62 0,82 0,66 0,80 0 0 0 0 0,55 0,78 0,27

14:0 ЗОН/16:Ой 1,07 2,16 1,41 0,99 1,14 0 1,66 1,41 0 1,87 1,47 0

16:1 и7с/151 2011 8,71 5,55 13,37 12,89 9,70 11,98 13,75 14,45 15,52 15,61 11,06 6,62

16:0 1,93 1,38 3,05 2,09 1,46 6,05 2,95 2,82 1,23 3,44 3,53 0,76

17:01 1,42 0,96 0,49 1,54 2,21 0 7,22 7,23 8,99 0,68 0,61 1,88

17:1ш8 с 14,96 3,81 9,79 9,89 9,64 11,82 3,72 3,2 11,13 4,42 8,48 13,93

17:0 0,78 0 0,55 0,78 0,50 4,08 0 0 0 0,52 0,91 0,61

18:1<а9с 52,65 66,59 54,83 57,45 55,45 41,60 57,53 59,22 52,12 54,66 55,90 61,31

18:1<У7С 1,49 0,94 0,78 0,92 0,93 1,84 0 0 0 1,20 0,91 0,46

18:0 4,67 4,23 3,10 3,23 2,72 13,48 2,54 3,49 1,28 4,26 5,20 2,01

18:3<и6с (6,9,12) 0 0 0 0 2,00 2,25 1,40 0 0 0 0 0

Таблица 10. Фснотипическая характеристика новых изолятов и типовых бактерий рода РзускгоЬа^ег.

1, Pi2-1, Pi2-7, R20; 2, Pi2-33, Pi2-13; 3, Pi2-51; 4, Pi2-20, Pi2-4, Pi2-25; 5, Pi2-52; 6, R7; 7, P. immobilis; 8, P. urativorans; 9, P.fri&dicola; 10, P. phenylpyruvicus; 11, P. glacincola; 12, P. proteolyticus; 13, P.faecalis; 14, P. marincola; 15, P. submarinus; 16, P. pacficensis. Данные настоящего исследования и Bowman е/ а/. (1996, 1997b); Donner е/ al. (2001); Kampfer et al. (2002); Maruyama et al. (2000). (+), слабоположительная реакция; В+, вариабельная реакция между штаммами, типовой штамм положительный; В-, вариабельная реакция между штаммами, типовой штамм отрицательный; НД, нет данных.

Свойства 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рост при 30 "С + + + + + + + в+ + - + + + + +

35 °С + - + + + В+ - + - - + + + +

37 °С - - - + - + В+ - + - - + - - +

№С112 % + + - + - в+ + + + + +

Ншрат редукция - + - + - + в+ в- - B+ - + - -

Кислота из + - - - + + + - - - + - + +

Сахаров

Уреаза - + - в+ - - в+ в+ + в- + - +

Утилизация:

Ь-арабинозы + + в- + + - - - - -

Адипата - - - в+ - - - - - - •

Малата + + - + + + в+ + - + +

Цитрата - в+ - - • + в- - + + + -

Капрата - - - - - - - - - + + -

Пирувата - - + - + - + + + + + + НД

В- - + + - + - + + + в+ + + в-

гедроксибутирата

Ацетата - + + + + + в+ + + + + + в-

Пропионата - в+ - - + в+ - - + + + -

Ь-серина в- + - - в- - - - НД - -

Ь-феиипаланина - - в+ + в+ + + - - - - - НД

Ь-пролина - - - + + + + + НД - - - +

Ь-аланина - - - + - - + в+ + + - - в-

Ь-гистидина - - - + - - - в+ + + - - +

Г+ЦвДНК, 44,5- 44,2- 44,6 44,6- 44,8 45,2 44-47 44-46 41-42 43 43-44 43,6 44,1 50,7 46,8 44-45

моль % 45,4 45,2 44,9

Глава 8. Новые таксоны бактерий группы Oceanospirillum

8.1. Marinomonasprimoryensis - новый вид психрофильных бактерий рода

Marinomonas

Группа бактерий Oceanospirillum включает семь родов, Oceanospirillum (Hylemon et al 1973; Krieg, 1984), Balneatrix (Dauga et al, 1993), Neptunomonas (Hedlund et at, 1999), Marinomonas (Van Landschoot, DeLey, 1983), Marinobacterium (Gonzalez et al., 1997), Marinospirillum (Satomi et al., 1998), Oceanobacter (Satomi et al, 2002), которые составляют аэробные умеренно галофильные бактерии, некоторые из них имеют характерную изогнутую или спиралевидную форму клеток, и широко распространены в морской среде (Baumann et al., 1972; Hylemon et al. 1973). Бактерии рода Neptunomonas способны разлагать ароматические полициклические углеводороды и алканы (Hedlund et al, 1999).

Среди изолятов морского прибрежного льда выделены и охарактеризованы методами полифазной таксономии штаммы, классифицированные как новый вид психрофильных бактерий рода Marinomonas, Marinomonas primoryensis. Это первый случай описания нового вида психрофильных бактерий среди мариномонад. Характерной особенностью штаммов КММ 3633Т и КММ 3634 являются их психрофильные и галофильные свойства, а также синтез желтого внутриклеточного пигмента, диффундирующего в агар. Бактерии росли при температуре 4-30 °С с оптимумом 15-20 °С и не росли при 35 °С. Хемотаксономические характеристики содержание Г+Ц в ДНК 45,345,6 моль% и основные клеточные жирные кислоты 16:0, 16:l<u7С И 18:1а)7е, наряду с фенотипическими (Табл. 11) и филогенетическими данными, свидетельствуют о принадлежности бактерий к роду Marinomonas. Высокий уровень (92%) ДНК-ДНК гибридизации между штаммами КММ 3633Т и КММ 3634 соотносится с высокой степенью филогенетического сходства, что позволило сделать заключение о том, что штаммы составляют один вид в соответствии с критерием, предложенным Wayne et al. (1987). В тоже время степень дивергенции 16S рДНК сиквенсов (от 3,6% до 5,6%) исследуемых изолятов и валидно описанных видов Marinomonas - М. vaga, M. communis, и М. mediterranea - является достаточно высокой, что дает основание рассматривать штаммы КММ 3633Т и КММ 3634 как новый вид бактерий этого рода. Филогенетическая позиция нового вида в структуре рода Marinomonas показана на Рис. 10.

Таблица 11. Фенотипические характеристики бактерий КММ 3633Т, КММ 3634 и видов рода Mahnomonas.

Данные настоящего исследования и Baumann et al. (1972); Solano et al. (1997); Solano & Sanchez-Amat, (1999). Сокращения: +, положительная реакция; -, отрицательная реакция; Сл, слабая реакция; В, вариабельная реакция между штаммами; НД, нет данных.

Свойства КММ КММ М. М. М.

3633т 3634 communis vaga mediterránea

Пигмент Слабожелтый Слабожелтый - * Меланино-подобкый

Оксидаза + Сл + - -

Нитрагредукция - - - - +

Рост при:

4 °С + + - - -

35 °С - - + + -

40 °С - - + - -

Гидролиз:

Желатина - - - - +

Твина-80 - - - - +

Утилизация:

О-Глюкозы Сл + + + +

Мальтозы + + В в -

Ы-ацетил-О-

Глюкозамина + + - + НД

т-Гидрокси- + + + + -

бутирага

[--Аргинина - + + Сл НД

Содержание Г+Ц 45,3 45,6 46-48 47-49 46,3±0,9

в ДНК (моль %)

Рис. 10. Филогенетические взаимоотношения бактерий Marmomonas pnmoryensis КММ 3633Т, КММ 3634 и других гаммапротеобактерий, основанные на анализе 16S рРНК сиквенсов Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на 100 нуклеотидов Цифрами указаны значения статистического "bootstrap" анализа.

8. 2. Oceanispltaera litoralis gen. nov., sp. nov., новая галофильная гаммапротеобактерия из морских донных осадков.

Штамм КММ 3654Т, выделенный из образца морских осадков, был исследован фенотипическими и молекулярными методами. Выделенная бактерия представляет грамотрицательную гетеротрофную галофильную капсулированную протеобактерию, филогенетически удаленную от представителей родов Ferrimonas balearica DSM 9799T (Rossell6-Mora et al, 1995), Tolumonas auensis DSM 9799T (Fischer-Romero et al, 1996), и семейств Vibrionaceae, Enterobacteriaceae,viAeromonadaceae (<92% 16S рДНК-сходства) и умеренно близкую бактериям рода Oceammonas, О. doudorqffii DSM 7028т и О. baumannii АТСС 700832T (Brown et al, 2001) (Рис. 11).

Рис 11. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, в котором показана позиция нового рода и вида Oceanisphaera litoralis КММ 3654Т. Цифрами указаны значения статистического ("bootstrap") анализа. Масштаб: 2 нуклеотидные замены на 100 нуклеотидов.

Штамм КММ 3654Т отличался от филогенетически близких видов рода Oceammonas по морфологии, наличию пигментации, по слабой утилизации фенола, неспособности утилизировать многие источники углерода, и по составу фосфолипидов (высокое содержание дифосфатидилглицерина) и жирных кислот (Табл. 12).

Таблица 12. Фенотипические характеристики Oceanisphaera litoralis gen. nov., sp. nov. KMM 3654T и филогенетически близких видов рода Oceanimonas.

По данным настоящего исследования и данным Brown etal. (2001).

Свойства КММ3654' О. doudoroffii DSM 702ST О. baumannii GB6T

Размер клеток (мкм) 1,0-1,2 0,7-1,2x2,0-2,5 2,0 х 1,0

Температурный интервал роста 4-42 °С 10-41 °С 10-41 °С

Уреаза + - -

Утилизация:

Капрата - + +

Фенилацетата + - -

Глицерина - - +

Этанола - + +

Фенола Слабая + +

Галактозы - - +

Ь-пролина - + +

Ь-аланина - + +

Фосфолипиды, %:

Фосфатидилэтаноламин 43,7 51 74,4

Фосфатидилглицерин 46,9 49 22,4

Дифосфатидилглицерин 9,4 Следы 3,1

Жирные кислоты, %:

12:0 - 7 3

16:0 21,6 21,2 20

16:1 си 41,0 42,0 45

18:1с« 27,5 29,9 32

Содержание Г+Ц в ДНК, моль% 56,4 54 54

Рис 12 Микрофотография клеток бактерии КММ3654Т. Масштабная линейка 2мкм.

Особенностью штамма является образование клеточных аггрегатов, неподвижных скоплений клеток, что сопровождается образованием межклеточных фибриллярных структур, соединяющих клетки между собой (Рис. 12) Данная особенность может рассматриваться как адаптация микроорганизма к условиям обитания и играть существенную роль в процессах адгезии бактерий к твердым поверхностям в морской среде На основании данных, полученных в ходе полифазного исследования, бактерия КММ 3654Т была описана как новый род морских бактерий Oceanisphaera litoralis gen nov, sp nov. в составе гаммапротебактерий

9.1. Новый род гамма-протеобактерий Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov.

Бактерия КММ 3655Т, выделенная из образца морских осадков прибрежной зоны Залива Петра Великого Японского моря, оказалась уникальной по своим фенотипическим и филогенетическим свойствам Грамотрицательная гетеротрофная непигментированная бактерия КММ 3655Т характеризовалась способностью редуцировать нитраты, образовывать кислоту из углеводов в аэробных и анаэробных условиях, утилизировать ограниченный спектр источников углерода, отсутствием гидролитических ферментов (Табл 13)

Таблица 13. Признаки, дифференцирующие Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov. KMM 3655T от других родов и видов морских у -Proteobacteria.

Все бактерии подвижные и не продуцируют аргинин дигидролазу. +, Положительная реакция; -, отрицательная реакция; В, вариабельная реакция между штаммами или видами рода; Сл, слабая реакция; НД, нет данных. Данные настоящего исследования, а также Satomi et al. (2002); Golyshin et al. (2002); Rossell6-Mora et al. (1995); Venkateswaran et al. (1998,1999); Baumann et al. (1984c); Mikhailov et al. (2002).

Признак н VI vt VD S * OceanospmUum Oleiphilus messmensts Fernmonas balearica ö 5 23 с § 1 ео а & <3 1 £ Alteromonas

Нитратредукция + • + + + + -

Рост при 4 "С + - - - + - -

Рост при 40 °С - - - + + + В

Рост в 10% N301 - - + - - + +

Факультативно-анаэробный рост + - - + + + -

Гидролиз желатина - - - - + В +

Утилизация глюкозы + - - НД - Сл +

Необходимость ионов Ка+ для роста + + + + Сл - +

Основные жирные кислоты 16:0 16:1<а7с 18:1си7с НД 16:0, 16:1 а) 7с 16:1а»9с Isol5:0 17:ltu9c Isol5:0 16:0 16:1ю7с П:Шс Isol 5:0 16:1©7с 17:1а)8с 16:0 16:leu7c 18:lcu7c

Г+Ц в ДНК, моль% 51,1 45-50 49,0 54 52 52-55 44-47

Штамм КММ 3655Т не гидролизовал желатин, крахмал, Твин-40, Твин-80 и хитин. Особенностью клеток является быстрая потеря жгутиков и образование скоплений клеток. Бактерия КММ 3655Т обладала галофильными свойствами и росла в узком интервале содержания №С1 в среде: от 0,5 до 5%, с оптимумом 2-3% №01. Рост обнаруживали при температуре 4-37 °С, и рост отсутствовал при 40 °С. Анализ изопреноидных хинонов выявил убихинон Q8 как главный компонент. В составе фосфолипидов штамма КММ 3655Т обнаружены фосфатидилэтаноламин; фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин, фосфатидилинозит и один неизвестный фосфолипид Доминирующими жирными кислотами в клетках штамма КММ 3655Т были определены 16 0 (31,61%), 16'1<н7с (26,72%); и 18:1си7е (19,04%). Филогенетический анализ показал (Рис. 13), что бактерия не кластеризуется с представителями

100 г

100

£

- ftoUmdnapmtca (М21292)

(КюрЫияеаямтЮЮв» (AJ2951S4) - AUainwnii twhmrmts DSM11573 (Y12579)

• Kiaroiobacte-hpfoxarbomxlasliais ATCC1312 1AB021372I

— McwbulbifirhyivtylcusKttXWim (W8J38)

— Zoo\htkellagaiighwtmis 1С 20*4 (AYI30994) - KMM 3655* (AJ561121)

- clone 18 (AY172302)

-CUwellia тага 1CM 1008J (AB002630)

Alttrammas madecjli tAM 12920 (X82145)

— PscuJoalte/vmonas baclcnohtk-a 1AM12394 (D89929)

— Fmimonax bolearlco DSM 9799 (X93021)

— Shewamlla тишкааа АТССЖВ29 (AF00S24O - Hdnmona eltingala ATCC J3I73 (»7021)

U<rmsptrt!lm mjiiurulm IFO15450 tAB067W>

- Halnealhra alfHca C1PIU3589 (V17112) Oaanosptrillm Inmm 1Г015448 (M223H5)

- Mannomnnas ATCC 27119 (X6W25)

5%

Рис 13. Филогенетическое древо на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, показывающее положение штамма КММ 3655Т в составе гаммапротеобактерий. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами указаны значения статистического "bootstrap" анализа.

других родов и семейств и образует самостоятельную ветвь, значительно удаленную от других гаммапротеобактерий. Величины сходства 16S рДНК составили 90% с бактериями рода Oceanospinllum, и 88-89% с представителями родов Oleiphilus, Marmobacter, Alcamvorax и семейства Vibnonaceae. На основании полученных результатов полифазного таксономического изучения предчожено описать морскую бактерию КММ 3655Т как новый род гаммапротеобактерий, Reinekea sedimentorum.

92. Новый вид глубоководных галотолерантных бактерий Rheinheimerapaciflca.

Исследования таксономического состава штаммов микроорганизмов, изолированных из морской воды открытых вод Тихого Океана (отбор проб от поверхностного микрослоя 0,2 до 5000 метров), показали, что из 184 исследованных штаммов 75% составляют грамотрицательные неферментирующие бактерии, большинство из которых были идентифицированы как представители известных видов, или новых таксонов в составе гаммапротеобактерий. В процессе полифазного таксономического изучения штамма глубоководной бактерии КММ 1406T, одного из представителей доминирующей группы аэробных грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, были выявлены уникальные морфологические, физиологические и филогенетические характеристики, сочетание которых не позволяло отнести бактерию КММ 1406T к какому-либо известному таксону. Почти полное секвенирование 16S рДНК штамма КММ 1406T и сравнительный анализ полученной последовательности с 16S рДНК последовательностями других бактерий выявил наибольший уровень сходства в пределах от 96,8 до 97,4% с недавно описанной бактерией нового рода Rheinheimera balttca DSM 14885Т и неидентифицированными глубоководными изолятами НВТ 019, НТВ 010 и НТВ 021, выделенными и частично охарактеризованными Takami et al. (1999). Процент сходства 16S рДНК с Alishewanella fetalis CCUG 30811Т (Fonnesbech Vogel et al., 2000) составил 95,4. Филогенетические взаимоотношения штамма КММ 1406T и других представителей гаммапротеобактерий показаны в дендрограмме (Рис. 14). Клетки КММ 1406т были подвижными при помощи нескольких полярных или биполярных и латеральных жгутиков, среднее количество которых наблюдалось в пределах от 4 до 7. Выделенный штамм характеризовался как психро- и галотолерантный, поскольку рос при температуре 4-37 °С, рост не наблюдался при 40 или 41 °С; и ионы натрия не требовались для роста. Основные жирные кислоты штамма КММ 1406т включали следующие: 16:1ш9с (25,5%), 16.0 (19,1%), 18:1ш7с (15,7%), 17.0(8,1%), и 17.1й>8с (11,7%). Фенотипические характеристики, дифференцирующие бактерию КММ 1406т и филогенетически близкие

виды, представлены в Табл. 14. На основании данных полифазного исследования штамм КММ 1406T описан как новый вид рода Rheinheimera, Я pacifica.

Таблица 14. Фенотипические характеристики, дифференцирующие Rheinheimera pacifica КММ 1406х и филогенетически близкие виды Rheinheimera baltica DSM 14885T и Alishewanellafetalis CCUG 30811T.

+, Положительная реакция; -, отрицательная реакция; Сл, слабая реакция; НД, нет данных; HP, нет роста. По данным настоящего исследования, Brettar et al. (2002), и Fonnesbech Vogel et al. (2000). Все штаммы положительные по оксидазе, каталазе, желатиназе, росту при 3% NaCl в среде; и отрицательные по росту в 10 % NaCI, аргинин дигидролазе, уреазе, образованию кислоты из D-глюкозы и маннита; и утилизации D-маннозы, капрата, адипата, L-малата, фенилацетата и глюконата.

Признаки R. pacifica Я baltica A. fetalis

КММ 1406т DSM 14885т CCUG 308 UT

Пигмент - + ■

Наличие жгутиков:

Полярные + + -

Биполярные, латеральные + - -

Нитрат редукция - - +

Рост при температуре:

4 °С + + -

25 °С + + Сл

37 °С + ■ +

40 - 42°С - - +

Рост при концентрации ЫаС1:

0% + + -

6% + - +

8% + - +

Гидролиз:

Крахмала + + -

ДНК + НД HP

Эскулина + - +

ПНФГ + - -

Утилизация:

О-Глюкозы - + -

М-Ацетил гл ю козам ш I а + + -

Ь-Арабинозы + - -

Мальтозы + + Сл

Цитрата + - -

Содержание Г+Ц в ДНК 49,6 48,9 50,6

(моль %)

Источник выделения Морская вода, Поверхностные Ткани эмбриона

глубина 5000 м, морские воды, человека

Тихий Океан Балтийское море

Рис 14. Филогенетические взаимоотношения штамма КММ 1406T, бактерий рода Idiomarina и других представителей гаммапротеобактерий. Древо построено на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами указаны значения статистического "bootstrap" анализа

Заключение

Проведенные исследования показали, что аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии, относящиеся к семействам Alteromonadaceae, Moraxellaceae, Halomonadaceae и группе Oceanospirillum, широко распространены в морских экосистемах и характеризуются таксономическим разнообразием. Использование метода полифазной таксономии, что включает изучение фенотипических, хемотаксономических, генотипических свойств и филогенетических взаимосвязей исследуемых бактерий, позволило среди выделенных бактерий идентифицировать и описать новые таксоны 13 видов и 3 рода морских бактерий в структуре гаммапротеобактерии и реклассифицировать ранее известные виды.

Исследованы разнообразные источники морской среды, включая глубоководные, прибрежные донные осадки и морской лед, и микробные сообщества, ассоциированные с асцидиями и губками. Впервые проведенные исследования образцов морского льда прибрежной зоны Японского моря показали, что морской лед является источником видового разнообразия и выделения новых штаммов бактерий рода Psychrobacter и Marinomonas.

В процессе изучения выделенных бактерий выявлены биологические особенности -(что включает впервые выявленные особенности клеточной морфологии и жгутикования; культуральные свойства, хемотаксономические и физиолого-биологические характеристики) новых представителей родов Pseudolateromonas, Glaciecola, Marinomonas, Halomonas, Psychrobacter, Rheinheimera, и новых родов Idiomarina, Oceanisphaera и Reinekea. Впервые описан психрофильный вид рода Marinomonas, а в составе рода Glaciecola, включающего облигатно психрофильные бактерии, выявлен новый вид психротолерантных бактерий. Впервые описаны два вида галофильных бактерий рода Psychrobacter, проявляющих в отличие от других видов толерантность к высокому содержанию хлористого натрия в среде.

Получены новые сведения в области экологии морских гаммапротеобактерии. В процессе изучение таксономического разнообразия микроорганизмов, изолированных из образцов морского льда прибрежной зоны Японского моря, были идентифицированы бактерии видов P. urativorans, P. fozii и P. glacincola, которые ранее были обнаружены только в образцах льда в районе Антарктики (Bowman et ah, 1996; Bowman et al., 1997b; Bozal et al., 2003) и другие места обитания и источники выделения этих видов бактерий неизвестны.

Исследование углевод-содержащих полимеров клеточных стенок новых штаммов Pseudoalteromonas, типового P. haloplanktis АТСС 14393Т и /. zobellii KMM 231Т вьгявили

многообразие структур О-специфических полисахаридов и ранее неизвестные структурные компоненты в структуре полисахаридов, что представляет фундаментальное значение для понимания строения и взаимодействия клеток с окружающей средой. Впервые в структуре О-специфического полисахарида P. haloplanktis АТСС 14393Т обнаружены D- и L-изомеры 2-ацетамидо-2-дезоксигалактуроновой кислоты структуры. В структуре полисахарида бактерии нового вида P. agarrvorans KMM 232 впервые для грамотрицательных бактерий обнаружена сульфатная группа.

В ходе проведения скрининга морских микроорганизмов, способных продуцировать биологически активные вещества, показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и охарактеризованы новые представители морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий, изолированные из различных источников морской среды: открытых океанических вод, прибрежных донных осадков и образцов льда, и беспозвоночных животных. Выявлено таксономическое разнообразие и биологические особенности исследуемых бактерий, получены новые знания в области биологии и экологии морских гаммапротеобактерий.

2. На основе метода полифазной таксономии среди выделенных бактерий описано 13 новых видов, относящихся к родам Pseudolateromonas, Glaciecola, Marinomonas, Halomonas, Psychrobacter, Rhemheimera, и З новых рода Idiomarina, Oceanisphaera и Reinekea в структуре гаммапротеобактерий. 2 вида рода Pseudolateromonas реклассифицированы.

3. Создана коллекция детально охарактеризованных морских гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как фундаментальная база для изучения микробного биоразнообразия и биотехнологического потенциала гаммапротеобактерий - продуцентов физиологически активных соединений.

4. Поиск бактериальных продуцентов ферментов нуклеинового обмена и тирозиназ показал наличие штаммов, перспективных для биотехнологии. Бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз. Впервые выявлена глубоководная бактерия "Alteromonas haloplanktis" KMM

223-продуцент эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей полиуридиловую кислоту.

5. Впервые проведено изучение видового разнообразия психротолерантных бактерий рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря. Показано, что новые штаммы составляют филогенетически и генетически гетерогенную группу, которая включает бактерии известных видов рода Psychrobacter, обитающих в Антарктиде, и геномовиды, имеющие фенотипические различия и морфологические особенности, и представляющие, по-видимому, новые виды рода Psychrobacter.

Список публикаций по теме диссертации Экспериментальные статьи

1. Романенко Л. А., Михайлов В. В. Нуклеазная активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидиями // Микробиология. 1992. т. 61, в. 1, с. 131-133.

2. Иванова Е. П., Бакунина И. Ю., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Елякова Л. А., Парфенова В. В. Распространение хитин-разлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. 1992. № 3-4. С. 69-75.

3. Романенко Л. А., Зелепуга Е. А., Козловская Э. П., Михайлов В. В. Тирозиназная активность бактерий родаAIteromonas II Биология моря. 1994. т. 63, № 4, с. 260-263.

4. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Плисова Е. Ю., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Горшкова Н. М., Ивайловский В. В., Рассказов В. А. Распространение рибонуклеаз среди морских микроорганизмов //Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. т. 30, в. 3, с. 384388.

5. Романенко Л. А., Иванова Е. П., Лысенко А. М., Михайлов В. В. Некоторые особенности грамотрицательных агарлитических бактерий из морской среды // Микробиология. 1994. т. 63, в. 5, с. 940-944.

6. Романенко Л. А., Лысенко А. М., Михайлов В. В., Курика А. В. Новый вид буропигментированных агарлитических бактерий рода Alteromonas II Микробиология. 1994. т. 63, в. 6, с. 1081-1087.

7. Романенко Л. А. Биологическая характеристика штаммов морских бактерий рода Alteromonas - источников некоторых ферментов // Автореф. диссертации канд. биол. наук. Владивосток. ВГМИ Мин. Здравоохр. РФ. 1994. 23 С.

8. Романенко Л. А., Михайлов В. В., Лысенко А. М., Степаненко В. И. Новый вид меланин-синтезирующих бактерий рода Alteromonas II Микробиология. 1995. т. 64, № 1, с. 74-77.

9. Плисова Е. Ю., Романенко Л. А., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Рассказов В. А, Специфичность рибонуклеаз морских бактерий Alteromonas и Pseudomonas II Биология моря. 1996. Т. 22, № 2. С. 110-113.

Ю.Горшкова Р. П., Назаренко Е. Л., Исаков В. В., Зубков В. А., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Иванова Е. П. Структура глицерофосфатсодержащего полисахарида Pseudoalteromonas sp. KMM 639 // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24, № 11. С. 839841.

11. Терентьев Л. Л., Терентьева Н. А., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Распространение и свойства нуклеозидкиназ морских бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67, №4. С. 496-504.

12. Командрова Н. А., Томшич С. В., Исаков В. В., Романенко Л. А. Структура сульфатированного О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas marinoglutinosa KMM 232. // Биохимия. 1998. Т. 63, в. 10, с. 98-103.

13. Hanniffy О. М., Shashkov A. S., Senchenkova S. N.. Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Yu. A., Savage A. V. Structure of a highly acidic O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) containing L-iduronic acid and D-QuiNHb4NHb // Carbohydrate Research. 1998. vol. 307, №2, p. 291-298.

14. Ivanova E. P., Chun J., Romanenko L. A., Matte M. E., Mikhailov V. V., Frolova G. M., Huq A., Colwell R. R. Reclassification of Alteromonas distincta Romanenko et al 1995 as Pseudoalteromonas distincta comb. nov. // Int J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, part 1, p. 141-144.

15. Ivanova E. P., Romanenko L. A., Chun J., Matte M. H., Matte G. R., Mikhailov V. V., Svetashev V. I., Huq A., Maguel Т., Colwell R. R. Jdiomarina gen. nov., comprising novel indigenous deep-sea bacteria from the Pacific Ocean, including descriptions of two species, Idiomarina abyssalis sp. nov. and ldiomarina zobellii sp. nov. // Int. J. Syst Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, part 2, p. 901-907.

16. Командрова Н. А., Томшич С. В., Исаков В. В., Романенко Л. А. О-специфический полисахарид морской бактерии "Alteromonas marinoglutinosa" NCIMB 1770 // Биохимия. 2001. т. 66, в. 8, с. 1099-1103.

17. Ivanova E. P., Romanenko L. A., Matte M. E., Lysenko A. M., Simidu U., Kita-Tsukamoto K., Sawabe Т., Vysotskii M. V., Frolova G. M., Mikhailov V. V., Christen R., Colwell R. R. Retrieval of the species Alteromonas tetraodonis Simidu et al, 1990 as Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. and emendation description // Int. J. Syst Evol. Microbiol., 2001, vol. 51, pp. 1071-1078.

18. Романенко Л. А., Калиновская Н. И., Михайлов В. В. Таксономический состав и биологическая активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидией Halocynthia aurantmm IIБиология моря. 2001. т. 27, № 5, с. 334-339.

19. Muldoon, J., Shashkov A. S., Senchenkova S. N.,. Tomshich S. V, Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Yu. A., Savage A. V. Structure of an acidic polysaccharide from a marine bacterium Pseudoalteromonas distincta KMM 638 containing 5-acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-formamido-L-glycero-L-manno-nonulosonic acid // Carbohydrate Research. 2001. vol. 330, pp. 231-239.

20. Красикова И. Н., Капустина Н. В., Светашев В. И., Горшкова Р. П., Томшич С. В., Назаренко Е. Л., Командрова Н. А., Иванова Е. П., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Соловьева Т. Ф. Химическая характеристика липида А некоторых морских протеобактерий//Биохимия. 2001. т. 66, в. 9, с. 1286-1294.

21. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde M., Lysenko A. M., Mikhailov V. V., Stackebrandt Е. Psychrobacter submarinus sp. nov. and Psychrobacter marincola sp. nov., novel psychrotrophic halophiles from marine environments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, vol. 52,pp.l291-1297.

22. Бакунина И. Ю., Недашковская О. И., Алексеева С. А., Иванова Е. П., Романенко Л. А., Горшкова Н. М., Исаков В. В., Звягинцева Т. Н., Михайлов В. В. Особенности деградации фукоидана морскими протеобактериями Pseudoalteromonas citrea. Микробиология. 2002. Т. 71. № 1. С. 49-55.

23. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Halomonas halocynthiae sp. nov., a novel bacterium, isolated from the marine ascidian Halocynthia aurantmm IIInt. J. SysL Evol. Microbiol., 2002, vol. 52, pp. 1773-1782.

24. Romanenko L. A., Uchino M., Mikhailov V. V., Zhukova N. V., Uchimura T. Marinomonas pnmoryensis sp. nov., anew psychrophilic bacterium isolated from coastal sea-ice of the Sea ofJapan. Int. J. Syst Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 829-832.

25. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Rohde M., Lysenko A. M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Glaciecola mesophila sp. nov., a novel marine agar-digesting bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 647-651.

26. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Rohde M, Lysenko A. M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Pseudoalteromonas agarrvorans sp. nov., a novel marine agarolytic bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 125-131.

27. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Lysenko A. M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Assignment of 'Alteromonas marinoglutinosa' NCIMB 1770 to Pseudoalteromonas mariniglutmosa sp. nov., nom. rev., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53,pp. 1105-1109.

28. Romanenko L. A., Schumann P., Zhukova N. V., Rohde M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Oceanisphaera htoralis gen. nov., sp. nov., a novel halophilic bacterium from marine bottom sediments // Int J. Syst Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 1885-1888.

29. Romanenko L. A., Uchino M., Falsen E., Zhukova N. V., Mikhailov V. V., Uchimura T. Rheinheimera pacifica sp. nov., a novel halotolerant bacterium isolated from the Pacific deep-seawater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 1973-1977.

30. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde M., Mikhailov V. V., Stackebrandt E. Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov., a novel bacterium from marine coastal sediments // Int J. Syst Evol. Microbiol. 2004, in press.

Статьи в сборниках

31. Михайлов В. В., Потиевский Э. Г., Иванова Е. П., Романенко Л. А. 1987. Изучение бактериопланктона прибрежных и открытых вод Японского моря // Труды ДВНИИ, вып. 131, Вопросы мониторинга природной среды (Ред. Беленький B.C., Ткалин А.В.), Л. Гидрометеоиздат, с. 41-47.

32. Потиевский Э. Г., Михайлов В. В., Иванова Е. П., Романенко Л. А. 1987. Микробиологическое изучение нефтяного загрязнения прибрежных и открытых вод Японского моря // Ibidem, с. 21-24.

33. Еляков Г. Б., Кузнецова Т. А., Михайлов В. В., Мальцев И. И., Калиновская Н. И., Аффиятуллов Ш. Ш., Недашковская О. И., Шевченко Л. С, Сметанина О. Ф., Романенко Л. А. Распространение в морских симбионтных ассоциациях микроорганизмов, продуцирующих физиологически активные соединения. Сб. научных трудов «Морская микробиология», 1995, Изд-во Дальневосточного Ун-та, Владивосток (Ред. И. Е. Мишустина), с. 32-35.

34. Mikhailov V. V., Kuznetsova Т. A., Ivanova E. P., Romanenko L. A., Shevchenko L. S., Nedashkovskaya O. I., Gorshkova N. M., Elyakov G. B. The Collection of Marine Microorganisms as a base for fundamental and applied studies in marine microbiology and biotechnology // Proceeding of Conf. Oceanology International 97 Pacific Rim. Exhibition & Conference, 12-14 May, 1997, World Trade Centre, Singapore, v. 2 - Extending the Reach of Ocean Technologies, p. 77-92.

Монография

35. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Михайлов В. В. Морские протеобактерии семейства Alteromonadaceae. Владивосток: Дальнаука, 2001,125 стр. + 7стр. вкл.

Глава в руководстве "The Prokaryotes"

36. Mikhailov V. V., Romanenko L. A., Ivanova E. P. The Genus Alteromonas and Related Proteobacteria. In M. Dworkin et al. The Prokaryotes. Release 3.10, September, 27, 2002, Springer-Verlag NY (hup: //www.prokaryotes.com).

Патент РФ

37. Романенко Л. А., Плисова Е. Ю., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Рассказов В. А., Еляков Г. Б. Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы // Патент Российской Федерации № 2026347. 1995. БИ № 139.

Тезисы докладов

38. Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Плисова Е. Ю., Романенко Л. А., Рассказов В. А., Еляков Г. Б. Уридил-специфическая РНК-аза из морской бактерии // Тез. докл. Всесоюз. Совещ. "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", 1988, ТИНРО, Владивосток, 24-26 мая, с. 19-20.

39. Plisova E. Yu., Romanenko L. A., Fedosov Yu. V., Mikhailov V. V., Rasskasov V. A. Bacteria of genus Alteromonas are promising sources of specific ribonucleases //Abstr. Intern. Sci. Conf. "Bridges of Science between North America and the Russian Far East", Anchorage, Alaska, U.S.A., Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug. 29-Sept. 2,1994, p. 295.

40. Romanenko L. A., Mikhailov V. V., Lysenko A. M., Stepanenko V. I. A new melanin-synthesizing bacterium of the genus Alteromonas from marine sponge // 1994, Ibidem, p. 297.

41. Romanenko L. A., Zelepuga E. A., Kozlovskaya E. P., Mikhailov V. V. Tyrosinase activity of the melanin-synthesizing bacteria of the genus Alteromonas from marine animals // 1994, Ibidem, p. 296.

42.Hannify О. M., Shashkov A. S., Knirel Yu. A., Senchenkova S. N.. Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Savage A. V. Structural studies of the 0-specific polysaccharide from Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) by NMR spectroscopy // Abstr. 9th European Carbohydrate Symposium еигосагЬя Utrecht, Netherlands, July 6-11,1997, p. 291.

43. Krasikova I. N., Tomshich S. V., Bakholdina S. I., Romanenko L. A. Lipid A fatty acids from the marine Pseudoalteromonas haloplanktis bacteria // Abstr. East Sea Oceanography Conf. The 3rd Circum-Pacific International Symposium on Earth Environment, 14-15 October, 1997, Korea Inter-University Institute of Ocean Science, Pukyong National University, Pusan, Korea, p. 37.

44.Романенко Л. А., Вожжова Е. И., Монастырная М. М., Козловская Э. П. Протеолитическая активность морских бактерий // Тез. докл. Научной конф. ТИБОХ ДВО РАН Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Владивосток: Дальнаука, 1998, с. 70-71.

45. Романенко Л. А., Лысенко А. М., Фролова Г. М., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Физиолого-биохимические особенности глубоководной бактерии "Alteromonas haloplanktis" KMM 223, продуцирующей полиуридил-специфическую эндорибонуклеазу // Ibidem, 1998, с. 71-72.

46. Романенко Л.А., Зелепуга Е. А., Козловская Э. П., Михайлов В. В. Поиск продуцентов тирозиназ среди бактерий рода Pseudoalteromonas II Ibidem, 1998, с. 72-73.

47. Командрова Н. А., Томшич С. В., Романенко Л. А. Структурное исследование полисахаридов морской бактерии Pseudoalteromonas mannoglutmosa KMM 232 // Ibidem, 1998, с. 110-112.

48. Хоменко В. А, Фролова Г. М., Лихацкая Г. Н., Романенко Л. А., Соловьва Т. Ф. Порин-подобные белки из морских бактерий рода Pseudoalteromonas II Ibidem, 1998, с. 136137.

49. Терентьев Л. Л., Терентьева Н. А., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Связь между скоростью синтеза ДНК и уровнем активности нуклезидкиназ у морских бактерий // Ibidem, 1998, с. 155-156.

50. Mikhailov V. V., Romanenko L. A., Nedashkovskaya О. I., GorshkovaN. M., Ivanova E. P. Physiological peculiarities of microbial associations of Far-Eastern marine invertebrates // Microbial Biosystems. New Frontiers. Program & Abstracts Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), 9-14 August, 1998, Halifax, Nova Scotia, Canada, p. 235236.

51. Kuznetsova T. A., Mikhailov V. V., Kalinovskaya N. I., Afiyatullov Sh. Sh., Oleynikova G. K., Smetanina O. F., Ivanova E. P., Romanenko L. A., Shevchenko L. S., Pivkin M. V., Platunova O. M., Elyakov G. B. Marine heterotrophic microorganisms as the basis for the development of marine biotechnology // Absrtacts. 2nd International Symposium Chemistry and Chemical Education. 26-39 September 2000, Vladivostok, Russia. Far-Eastern Univ. Press, p. 219.

52. Zelepuga E. A., Romanenko L. A., Kozlovskaya E. P., Mikhailov V. V. Bacteria from marine environment as a source of DOPA and tyrosinases IIIbidem, 2000, p. 215.

53. Романенко Л. А., Лысенко А. М., Михайлов В. В. Особенности морского изолята Psychrobacter sp. KMM 225 // Тез. докл. конф. "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Владивосток, Дальнаука, 2001, с. 172174.

54. Романенко Л. А., Калиновская Н. И., Михайлов В. В. Характеристика микроорганизмов, ассоциированных с морской асцидией Halocynthia aurantium II Ibidem, 2001, с. 174-176.

Людмила Александровна РОМАНЕНКО

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ ТАКСОНОВ МОРСКИХ АЭРОБНЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ ГАММАПРОТЕОБАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

Тираж 100 экз.

Отпечатано в копировальном центре ЗАО "Фартоп" 690950, Владивосток, ул. Алеутская, 28

1- 82 3 3

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Романенко, Людмила Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Обзор литературы

Глава 1. Таксономия прокариот, современное состояние и основные методы исследования.

Глава 2. Таксономическая структура класса "Саттарго1еоЬас1епа" тип Рго1еоЬас1епа.

2.1. Семейство ЛИеготопайасеае.

2.2. Семейство МогахеИасеае

2.3. Семейство На1отопайасеае.

2.4. Бактерии группы ОсеапоярМИит (семейство "ОсеапохртИасеае").

Глава 3. Бактерии рода Рзеи^аНеготопая и родственные бактерии - продуценты вторичных метаболитов.

Экспериментальная часть.

Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1. Источники выделения бактерий.

4.2. Состав сред и условия культивирования микроорганизмов.

4.3. Физиолого-биохимические тесты.

4.4. Методы изучения морфологии.

4.5. Получение экстрактов клеток.

4.6. Исследование липидного состава и полисахаридов.

4.7. Изучение геномных характеристик.

4.7.1. Выделение ДНК, определение нуклеотидного состава и ДНК-ДНК гибридизации.

4.7.2. Риботипирование.

4.8. Секвенирование 16S рибосомных ДНК генов.

4.9. Филогенетический анализ.

4.10. Методы определения активности ферментов

4.10.1. Определение нуклеазной активности.

4.10.2. Определение тирозиназной активности.

4.11. Определение антагонистических свойств.

Результаты и обсуждение.

Глава 5. Род Pseudoalteromonas и родственные бактерии семейства Alteromonadaceae.

5.1. Характеристика новых видов агаролитических бактерий Pseudoalteromonas agarivorans и Pseudoalteromonas mariniglutinosa.

5.2. Меланин-синтезирующие бактерии рода Pseudoalteromonas и их особенности

5.2.1. Реклассификация Alteromonas distincta как Pseudoalteromonas distincta.

5.2.2. Таксономические особенности вида иAlteromonas fuliginea".

5.3. Уровни ДНК-ДНК сходства и филогенетические связи непигментированных видов рода Pseudoalteromonas. Реклассификация Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodonis как Pseudoalteromonas tetraodonis.

5.4. Бактерии рода Pseudoalteromonas — продуценты ферментов.

5.4.1. Бактерии рода Pseudoalteromonas - продуценты нуклеаз.

5.4.2. Таксономические особенности глубоководной бактерии "Alteromonas haloplanktis" КММ 223 - продуцента полиуридил-специфической эндорибону клеазы.

5.4.3. Тирозиназная активность бактерий рода Pseudoalteromonas.

5.4.4. Биологическая активность бактерий рода Pseudoalteromonas, ассоциированных с асцидией Halocynthia aurantium.

5.5. Психрофильные бактерии рода Glaciecola и особенности нового вида Glaciecola mesophila.

5.6. Глубоководные бактерии рода Idiomarina.

5.7. Характеристика полисахаридов штаммов бактерий рода

Pseudoalteromonas и Idiomarina zobellii.

Глава 6. Биологические особенности нового вида бактерий Halomonas halocynthiae - ассоцианта асцидии Halocynthia aurantium.

Глава 7. Психротолерантные бактерии рода Psychrobacter из морской среды и их особенности. t 7.1. Psychrobacter submarinus и Psychrobacter marineóla — новые галофильные бактерии рода Psychrobacter.

7.2. Видовое разнообразие и таксономическая характеристика бактерий рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и донных осадков Японского моря. щ

Глава 8. Новые таксоны бактерий группы Oceanospirillum.

8.1. Marinomonasprimoryensis - новый вид психрофильных бактерий рода Marinomonas.

8.2. Oceanisphaera litoralis gen. nov., sp. nov., галофильная гаммапротеобактерия из морских донных осадков.

Глава 9. Новые таксоны морских гаммапротеобактерий, не входящие в состав каких-либо известных семейств.

9.1. Новый род гамма-протеобактерий

Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov.

9. 2. Новый вид глубоководных галотолерантных бактерий

Rheinheimera pacifica sp. nov.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Таксономическая характеристика и биологические особенности новых таксонов морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий"

Морские микроорганизмы являются важным компонентом экосистем Мирового океана и играют существенную роль в биологических процессах морской среды. Морфологические и физиолого-биохимические свойства и особенности микроорганизмов, обитающих в морской среде, могут быть обусловлены специфическими условиями среды обитания, такими, как высокая концентрация ионов натрия, кальция, калия, магния, гидростатическое давление, низкие температуры, изменения солености и неравномерное поступление/распределение питательных веществ. Наши знания в области биологии и экологии даже культурабельных морских микроорганизмов остаются весьма ограниченными. Недостаточно известно о специфических, естественных и необходимых факторах роста морских бактерий, что во многих случаях вызывает проблемы, связанные с культивированием бактерий из морских источников, выделением чистых культур микроорганизмов и изучением их характеристик. Отмечено, что большинство прокариот обитают в океанической среде, и эта часть является наименее изученной в сравнении с наземными микроорганизмами (Whitman et al., 1998). Несмотря на проводимые исследования, изучено менее 1% бактерий, изолированных из морской среды (Amann et al., 1995; Fenical, 1993). Изучение биологического разнообразия на основе анализа фено-и генотипических признаков и филогенетических связей морских протеобактерий с целью определения их систематического положения в системе микробного мира, а также исследования в области таксономии и систематики морских гаммапротеобактерий являются фундаментальными и имеют важное прикладное значение. Класс Proteobacteria был предложен в 1988 г. Stackebrandt et al. (1988) для грамотрицательных микроорганизмов на основании данных сравнительного анализа сиквенса 16S рРНК и представляет собой одну из основных филогенетических групп. Класс Proteobacteria включает пять подклассов: альфа-, бета-, гамма-, дельта-, и эпсилон- Proteobacteria

Stackebrandt et al., 1988). В настоящее время предлагается повысить таксономический ранг класса Proteobacteria до статуса тип "Proteobacteria" и подклассы Proteobacteria рассматривать как классы: "Alphaproteobacteria", "Betaproteobacteria", "Gammaproteobacteria", "Deltaproteobacteria", "Epsilonproteobacteria", соответственно (Ludwig, Klenk, 2001). Класс "Gammaproteobacteria" представлен разнообразными по физиологическим, метаболическим и экологическим характеристикам микроорганизмами и включает представителей 13 порядков и 20 семейств, которые в свою очередь содержат большое количество родов и видов бактерий.

Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии в значительной мере представлены родами и видами семейств Alter omonadaceae, Moraxellaceae; Halomonadaceae; и группы Oceanospirillum, которые входят в состав класса "Gammaproteobacteria". Многие представители этих семейств, в том числе относящиеся к родам Alteromonas, Pseudoalteromonas, Glaciecola, Idiomarina, Colwellia, Marinomonas являются типичными или облигатными морскими прокариотами и составляют существенный компонент биоценозов морской среды. Исследование морских представителей галофильных/галотолерантных и психрофильных или психротолерантных бактерий родов Halomonas и Psychrobacter представляет интерес как в плане фундаментальных биологических исследований, так и в экологическом и практическом аспектах. Рутинная идентификация бактерий морской среды, в том числе представителей "Gammaproteobacteria", представляет трудности в связи с многообразием и изменчивостью их морфологических и биохимических свойств, необходимостью подбора сред и условий культивирования некоторых штаммов. В последние два десятилетия исследования в области систематики морских "Gammaproteobacteria" интенсивно развиваются благодаря широкому использованию молекулярных методов анализа и разработке полифазной таксономии бактерий (Colwell et al.t 1970; Vandamme et al., 1996), о чем свидетельствуют описание новых или реклассификация уже известных родов и видов семейств

Alteromonadaceae, Moraxellaceae\ Halomonadaceae; и группы Oceanospirillum, в связи с чем дальнейшее совершенствование систематики гаммапротеобактерий остается весьма актуальной задачей в настоящее время. Бактерии, изолированные из морской среды, способны синтезировать разнообразные биологически активные вещества (БАВ) и могут служить продуцентами ферментов, деградирующих полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты (Austin, 19S8, 1989; Tsujibo et al., 1998; Михайлов и др., 1999; Holmstrom, Kjelleberg, 1999). Сохранение микробного разнообразия в коллекциях культур является базисом, который необходим для развития морской микробиологии, биотехнологии, химии морских соединений. Одним из перспективных направлений биотехнологии следует отметить исследования морских биополимеров — ферментов и полисахаридов морских протеобактерий. Фундаментальное изучение биологии и таксономии представителей морских микробных сообществ является важным для оценки и понимания экологической роли аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в морских экосистемах.

Целью настоящей работы явилось выделение морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий и изучение их фенотипических свойств, геномных и филогенетических характеристик; изучение филогенетических взаимосвязей и установление таксономического статуса выделенных гаммапротеобактерий на основе метода полифазной таксономии; изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ; создание и поддержание коллекции морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как основы для фундаментального изучения микробного биоразнообразия и биотехнологического использования морских бактерий.

Основные задачи:

1. Выделение культур новых аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий из морских источников различных биотопов морской среды, включая не исследуемые ранее и малоизученные источники выделения микроорганизмов.

2. Изучение выделенных бактерий на основе полифазной таксономии с использованием фенотипических, хемотаксономических, генетических и филогенетических методов.

3. Изучение физиологических свойств и биотехнологического потенциала морских бактерий, скрининг штаммов-продуцентов ферментов и других биологически активных веществ

4. Анализ полученных результатов, выявление и описание новых таксонов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии, входящие в состав семейств

Аиеготопас1асеае, МогахеНасеае, На1отопас1асеае и группы ОсеапояркШит, широко распространены в морских экосистемах, и были изолированы из разнообразных биотопов Тихого и Индийского океанов, включая открытые океанические воды, прибрежные донные осадки и морской лед, и микробные сообщества, ассоциированные с беспозвоночными животными.

2. Морские аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии характеризуются таксономическим разнообразием. На основе метода полифазной таксономии среди выделеных бактерий идентифированы и описаны новые представители известных родов Psev.dolaterom.onas, С1аЫесо1а, Маг ¡по топая, На1о топая, РзускгоЪаМег, ЯкетИешега, и новых родов Ыютагта, Осеатяркаега и Кетекеа в структуре гаммапротеобактерий.

3. Морские бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз.

Научная новизна работы. Показано, что изученные бактерии принадлежат к родам Pseudoalteromonas, Glaciecola, Alteromonas, Idiomarina, Halomonas, Psychrobacter, Marinomonas - представителям класса "Gammaproteobacteria", среди которых описано 13 новых видов и 3 новых рода в составе гаммапротеобактерий, что составляет вклад в таксономическую структуру этого класса. В составе семейства Alteromonadaceae описан новый род глубоководных бактерий Idiomarina, и два вида, I. zobellii и I. abyssalis. В составе рода Pseudoalteromonas описаны новые виды Р. agarivorans и Р. mariniglutinosa. Описан новый вид "Alteromonas distincta" и реклассифицирован как Pseudoalteromonas distincta. Показано, что штамм Р. distincta КММ 638Т проявляет высокий уровень тирозиназной активности и может быть использован как продуцент фермента тирозиназы. Вид Pseudoalteromonas haloplanktis subsp. tetraodonis (.Alteromonas tetraodonis Simidu et al. 1990) реклассифицирован как Pseudoalteromonas tetraodonis. Впервые выделена глубоководная бактерия "Alteromonas haloplanktis" КММ 223-продуцент фермента эндорибонуклеазы, специфически расщепляющая полиуридиловую кислоту. Впервые обнаружены мезофильные штаммы бактерий рода Glaciecola КММ 241 и КММ 642, которые были описаны как новый вид Glaciecola mesophila.

Впервые исследованы бактерии, ассоциированные с асцидией Hálocynthia aurantium, в числе которых впервые была обнаружена уникальная по морфологическим и молекулярным характеристикам галофильная бактерия, которая описана как новый вид бактерий рода Halomonas, Н. halocynthiae.

В составе рода Psychrobacter впервые описано два новых вида галофильных бактерий, способных расти при 15% хлористого натрия, Р. submarinus и Р. marineóla.

Исследования видового разнообразия и таксономии бактерий рода Psychrobacter, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря, показали, что новые штаммы составляют филогенетически и генетически гетерогенную группу, которая включает известные антарктические виды и отличные между собой и от других валидных видов геномовиды, представляющие, по-видимому, новые виды рода Psychrobacter.

В составе бактерий группы Oceanospirillum обнаружены и описаны новые таксоны: новый вид психрофильных бактерий рода Marinomonas и новый род и вид морских галофильных бактерий Oceanisphaera litoralis gen. nov., sp. nov.

Новая бактерия описана как новый род и вид морских гаммапротеобактерий, Reinekea sedimentorum, который не входит в состав какого-либо известного семейства. Глубоководная галотолерантная бактерия КММ 1406т описана как новый вид рода Rheinheimera, R. pacifica.

Практическое значение. Создана и поддерживается коллекция детально охарактеризованных морских гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как фундаментальная база для изучения микробного разнообразия и биотехнологического потенциала гаммапротеобактерий - продуцентов физиологически активных соединений. Показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; выделены и поддерживаются в рамках Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН штаммы-продуценты ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз. Штамм Pseudoalteromonas sp. ("Alteromonas haloplanktis") КММ 223 запатентован в качестве продуцента полиуридил-специфической эндорибонуклеазы, механизм действия и свойства фермента изучены.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", ТИНРО, Владивосток, (1988); International Science Conference "Bridges of Sience between North America and the Russian Far East", Anchorage -Vladivostok, (1994); 9-th European Carbohydrate Symposium, Utrecht, Netherlands, (1997); Conference Oceanology International 97 Pacific Rim., Singapore, (1997); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии", Владивосток, (1998); 8-th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Canada, (1998); 2-ом Международном симпозиуме "Химия и химическое образование", Владивосток, (2000); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока", Владивосток, (2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 статьи, 17 тезисов докладов, 1 патент, 1 монография, Глава в электронной версии международного микробиологического руководства "The Prokaryotes" (Springer-Ver lag). Основные результаты исследований опубликованы в научных журналах: "Микробиология", "Прикладная биохимия и микробиология", "Биология моря", "Биоорганическая химия", "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology", "Carbohydrate Research".

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части: объектов и методов исследования (Глава 4), результатов и обсуждения (Главы 5-9), заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 221 странице машинописного текста и иллюстрированы 27 рисунками и 27 таблицами. Список литературы включает 263 источника.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Романенко, Людмила Александровна

Результаты исследования уровней ДНК-ДНК сходства среди непигментированных типовых штаммов псевдоальтеромонад (альтеромонад), проведенные в 1993 году и в последующие годы, не подтвердили результаты, полученные

Akagawa-Matsushita et al. (1993). Уровень ДНК-ДНК сходства типовых штаммов Р. haloplanktis и A. tetraodonis составил 48%, что свидетельствовало о том, что A. tetraodonis является самостоятельным видом рода Pseudoalteromonas и его таксономический статус должен быть восстановлен. Результаты были подтверждены повторными молекулярногенетическими экспериментами (Рис. 9) и изучением физиолого-биохимических свойств штаммов P. haloplanktis subsp. tetraodonis [Alteromonas] tetraodonis IAM 14160 (A-M) и

IAM 14160т, что позволило восстановить статус вида как Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. В процессе изучения таксономического положения Alteromonas tetraodonis были использованы три штамма: КММ 458 , любезно предоставленный нам У. Симиду, т

IAM 14160 (А-М), который предоставила М. Акагава-Матсушита и LAM 14160 , присланный Коллекцией Культур Института молекулярной и клеточной биологии, Токио, Япония, первый из которых был получен как Alteromonas tetraodonis, остальные - как штаммы P. haloplanktis subsp. tetraodonis. Полученные нами данные ясно показали, что штаммы КММ 458т и IAM 14160т почти неразличимы и представляют собой самостоятельный вид, как и было описано первоначально (Simidu et dl., 1990) с типовым штаммом Р. tetraodonis IAM 14160т (Simidu, Kita-Tsukamoto, Yasumoto, Yotsu 1990). Таксономический статус типового вида Р. haloplanktis subsp. haloplanktis был восстановлен как Р. haloplanktis.

К оригинальному описанию Alteromonas tetraodonis (Simidu et al., 1990), реклассифицированному как Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. были добавлены следующие характеристики. Бактерия Р. tetraodonis способна расти на средах, содержащих 1-7% NaCl. Утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, сахарозу, D-галактозу, DL-лактат, капроат, валерат, бутират, цитрат, фумарат, сукцинат, глутамат, ацетат, пируват, этанол, и L-тирозин; и неспособна утилизировать D-маннозу, лактозу, D-рибозу, D-ксилозу, D-арабинозу, D-рамнозу, глюконат, салицин, глицерин, а-кетоглутарат, мальтозу, маннит, L-гистидин, L-пролин, и D-малат. Чувствительна к ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, эритромицину, гентамицину, ванкомицину, тетрациклину, и карбенициллину. Не чувствительна к 0/129, линкомицину, и оксациллину. Бактерия содержит основные клеточные жирные кислоты 16:1g>7c, 16:0, 17:liü8c. Минорные жирные кислоты 15:0, 15:g>8c, 17:0, 18:1о/7с. Фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерин составляют 75,1 и 23,7 % от общего содержания фосфолипидов, соответственно. Бактерии не содержат кардиолипин и гликолипид.

В заключение следует отметить, что бактерии рода Pseudoalter omonas, охарактеризованные в Главе 5, представляют интерес не только как новые таксоны, но и как перспективные источники для биотехнологии, поскольку новые бактерии проявили высокий уровень ферментативной активности и могут использоваться как продуценты гликозидаз, тирозиназ, высокоспецифичных рибонуклеаз, а также эндонуклеаз рестрикции.

• * 41 « 4

82

- Заключение

Проведенные исследования показали, что аэробные гетеротрофные гаммапротеобактерии, относящиеся к семействам АкеготопаЛасеае, МогахеПасеае, На1отопас1асеае и группе ОсеапояртПит, широко распространены в морских экосистемах и характеризуются таксономическим разнообразием. Использование метода полифазной таксономии, что включает изучение фенотипических, хемотаксономических, генотипических свойств и филогенетических взаимосвязей исследуемых бактерий, позволило среди выделенных бактерий идентифицировать и описать новые виды и роды морских бактерий в структуре гаммапротеобактерий и реклассифицировать ранее известные виды

Исследованы разнообразные источники морской среды, включая глубоководные, прибрежные донные осадки и морской лед, и микробные сообщества, ассоциированные с асцидиями и губками. Впервые проведенные исследования образцов морского льда прибрежной зоны Японского моря показали, что морской'лед является источником видового разнообразия и выделения новых штаммов бактерий рода РзускгоЬаМег.

В процессе изучения выделенных бактерий выявлены биологические особенности (что включает впервые выявленные особенности клеточной морфологии и жгутикования; культуральные свойства, хемотаксономические и физиолого-биологические характеристики) новых представителей родов РзеийоШеготопах, С1асгесо1а, Магтотопаз, На1отопа$, РзусИгоЬаМег, ЯкетИешега, и новых родов Мютагта, Осеатзркаега и Яетекеа. Впервые описан психрофильный вид рода Маг то то паз, а в составе рода Ыас1есо1а, включающего облигатно психрофильные бактерии, выявлен новый вид психротолерантных бактерий. Впервые описаны два вида галофильных бактерий рода РзусИгоЬас(ег, проявляющих в отличие от других видов толерантность к высокому содержанию хлористого натрия в среде.

Получены новые сведения в области экологии морских гаммапротеобактерий. В процессе изучение таксономического разнообразия микроорганизмов, изолированных из образцов морского льда прибрежной зоны Японского моря, были идентифицированы бактерии видов P. urativorans, P. fozii и P. glacincola, которые ранее были обнаружены только в образцах льда в районе Антарктики (Bowman et al., 1996; Bowman et al., 1997b; Bozal et al., 2003) и другие места обитания и источники выделения этих видов бактерий неизвестны.

Исследование углевод-содержащих полимеров клеточных стенок новых штаммов Pseudoalteromonas, P. haloplanktis АТСС 14393 и I. zobellii выявили многообразие структур О-специфических полисахаридов и ранее неизвестные структурные компоненты, что представляет фундаментальное значение для понимания строения, функций и взаимодействия клеток с окружающей средой. В структуре О-специфического полисахарида Р. haloplanktis АТСС 14393х впервые обнаружены D- и L-изомеры 2-ацетамидо-2- дезоксигалактуроновой кислоты. В структуре полисахарида бактерии нового вида P. agarivorans КММ 232 впервые для грамотрицательных бактерий обнаружена сульфатная группа.

В ходе проведения скрининга выделенных морских микроорганизмов, способных продуцировать биологически активные вещества, показано, что бактерии рода Pseudoalteromonas проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз.

1. Выделены и охарактеризованы новые представители морских аэробных гетеротрофных гаммапротеобактерий, изолированные из различных источников морской среды: открытых океанических вод, прибрежных донных осадков и образцов льда, и беспозвоночных животных. Выявлено таксономическое разнообразие и биологические особенности исследуемых бактерий, получены новые знания в области биологии и экологии морских гаммапротеобактерий.

2. На основе метода полифазной таксономии среди выделенных бактерий описано 13 новых видов, относящихся к родам РзеийоШеготопаз, С1апесо1а, Магтотопаз, На1отопаз, РяусИгоЬаМег, ЯкетИетега, и 3 новых рода Мютагта, ОсеатзрИаега и Яетекеа в структуре гаммапротеобактерий. 2 вида рода РяеийоШеготопая реклассифицированы.

3. Создана коллекция детально охарактеризованных морских гаммапротеобактерий в рамках Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН как фундаментальная база для изучения микробного биоразнообразия и биотехнологического потенциала гаммапротеобактерий как продуцентов физиологически активных соединений.

4. Поиск бактериальных продуцентов ферментов нуклеинового обмена и тирозиназ показал наличие штаммов, перспективных для биотехнологии. Бактерии рода Рзеи^аИеготопаз проявляют высокий уровень гидролитической и тирозиназной активностей; являются продуцентами ферментов эндонуклеаз рестрикции и специфических рибонуклеаз. Впервые выявлена глубоководная бактерия "Акеготопаз

На1ор1апЫ8" КММ 223-продуцент фермента эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей полиуридиловую кислоту.

5. Впервые проведено изучение видового разнообразия и таксономии психротолерантных бактерий рода РзусИгоЬас(ег, изолированных из образцов морского льда и грунта прибрежной зоны Японского моря. Показано, что новые штаммы составляют филогенетически и генетически гетерогенную группу, которая включает известные антарктические виды рода РБускгоЬаМег и геномовиды, имеющие фенотипические различия и морфологические особенности, и представляющих, по-видимому, новые виды рода РзусИгоЬаШг.

Список публикаций по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Романенко Л. А., Михайлов В. В. Нуклеазная активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидиями. // Микробиология. 1992. т. 61, в. 1, с. 131-133. 2. Иванова Е. П., Бакунина И. Ю., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Елякова Л. А., Парфенова В. В. Распространение хитин-разлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. 1992. № 3-4. С. 69-75.

3. Романенко Л. А., Зелепуга Е. А., Козловская Э. П., Михайлов В. В. Тирозиназная активность бактерий рода Alteromonas. II Биология моря. 1994. т. 63, № 4, с. 260-263.

4. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Плисова Е. Ю., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Горшкова Н. М., Ивайловский В. В., Рассказов В. А. Распространение рибонуклеаз среди морских микроорганизмов. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. т. 30, в. 3, с. 384-388.

5. Романенко Л. А., Иванова Е. П., Лысенко А. М., Михайлов В. В. Некоторые особенности грамотрицательных агарлитических бактерий из морской среды. // Микробиология. 1994. т. 63, в. 5, с. 940-944.

6. Романенко Л. А., Лысенко А. М., Михайлов В. В., Курика А. В. Новый вид буропигментированных агарлитических бактерий рода Alteromonas. II Микробиология. 1994.т.63,в.6,с. 1081-1087.

7. Романенко Л. А. Биологическая характеристика штаммов морских бактерий рода Alteromonas - источников некоторых ферментов // Автореф. диссертации канд. биол. наук. Владивосток. ВГМИ Мин. Здравоохр.РФ.1994. 23 С.

8. Романенко JI. А., Михайлов В. В., Лысенко А. М., Степаненко В. И. Новый вид меланин-синтезирующих бактерий рода Alteromonas II Микробиология. 1995. т. 64, № 1, с. 74-77.

9. Плисова Е. Ю., Романенко Л. А., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Специфичность рибонуклеаз морских бактерий Alteromonas и Pseudomonas II Биология моря. 1996. Т. 22, №2. С. 110-113.

10. Горшкова Р. П., Назаренко Е. Л., Исаков В. В., Зубков В. А., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Иванова Е. П. Структура глицерофосфатсодержащего полисахарида Pseudoalteromonas sp. КММ 639 // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24, № 11. С. 839841.

11. Терентьев Л. Л., Терентьева Н. А., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Распространение и свойства нуклеозидкиназ морских бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67, №4. С. 496-504.

12. Командрова Н. А., Томшич С. В., Исаков В. В., Романенко Л. А. Структура сульфатированного О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas marinoglutinosa КММ 232. // Биохимия. 1998. Т. 63, в. 10, с. 98-103.

13. Hanniffy О. М., Shashkov A. S., Senchenkova S. N., Tomshich S. V., Komandrova N. A., Romanenko L. A., Knirel Yu. A., Savage A. V. Structure of a highly acidic O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) containing L-iduronic acid and D-QuiNHb4NHb // Carbohydrate Research. 1998. vol. 307, №2, p. 291-298.

14. Ivanova E. P., Chun J., Romanenko L. A., Matte M. E., Mikhailov V. V., Frolova G. M., Huq A., and Colwell R. R. Reclassification of Alteromonas distincta Romanenko et al. 1995 as Pseudoalteromonas distincta comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, part l,p. 141-144.

15. Ivanova E. P., Romanenko L. A., Chun J., Matte M. H., Matte G. R., Mikhailov V. V., Svetashev V. I., Huq A., Maguel Т., and Colwell R. R. Idiomarina gen. nov., comprising novel indigenous deep-sea bacteria from the Pacific Ocean, including descriptions of two species, Idiomarina abyssalis sp. nov. and Idiomarina zobellii sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, part 2, p. 901-907.

16. Командрова H. А., Томшич С. В., Исаков В. В., Романенко Л. А. О-специфический полисахарид морской бактерии "Alteromonas marinoglutinosa" NCIMB 1770 I I Биохимия. 2001. т. 66, в. 8, с. 1099-1103.

17. Ivanova Е. P., Romanenko L. A., Matte М. Е., Lysenko А. М., Simidu U., Kita-Tsukamoto К., Sawabe Т., Vysotskii М. V., Frolova G. М., Mikhailov V. V., Christen R., and Colwell R. R. Retrieval of the species Alteromonas tetraodonis Simidu et al., 1990 as Pseudoalteromonas tetraodonis comb. nov. and emendation description // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, vol. 51, pp. 1071-1078.

18. Романенко Л. А., Калиновская H. И., Михайлов В. В. Таксономический состав и биологическая активность микроорганизмов, ассоциированных с асцидией Halocynthia aurantium II Биология моря. 2001. т. 27, № 5, с. 334-339.

19. Muldoon, J., A. S. Shashkov, S. N. Senchenkova, S. V. Tomshich, N. A. Komandrova, L. A. Romanenko, Yu. A. Knirel, and A. V. Savage. Structure of an acidic polysaccharide from a marine bacterium Pseudoalteromonas distincta KMM 638 containing 5-acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-formamido-L-glycero-L-manno-nonulosonic acid // Carbohydrate Research. 2001. vol. 330, pp. 231-239.

20. Красикова И. H., Капустина Н. В., Светашев В. И., Горшкова Р. П., Томшич С. В., Назаренко Е. Л., Командрова Н. А., Иванова Е. П., Горшкова Н. М., Романенко Л. А., Михайлов В. В., Соловьева Т. Ф. Химическая характеристика липида А некоторых морских протеобактерий // Биохимия. 2001. т. 66, в. 9, с. 1286-1294.

21. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde М., Lysenko А. М., Mikhailov V. V., and Е. Stackebrandt. Psychrobacter submarinus sp. nov. and Psychrobacter marincola sp. nov., novel psychrotrophic halophiles from marine environments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, vol. 52, pp. 1291-1297.

22. Бакунина И. Ю., Недашковская О. И., Алексеева С. А., Иванова Е. П., Романенко Л. А., Горшкова Н. М., Исаков В. В., Звягинцева Т. Н., Михайлов В. В. Особенности деградации фукоидана морскими протеобактериями Pseudoalteromonas citrea. Микробиология. 2002. Т. 71. № 1. С. 49-55.

23. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde М., Mikhailov V. V., and Е. Stackebrandt. Halomonas halocynthiae sp. nov., a novel bacterium, isolated from the marine ascidian Halocynthia aurantium II Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, vol. 52, pp. 1773-1782.

24. Romanenko L. A., Uchino M., Mikhailov V. V., Zhukova N. V., and T. Uchimura. Marinomonas primoryensis sp. nov., a new psychrophilic bacterium isolated from coastal sea-ice of the Sea of Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 829-832.

25. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Rohde M., Lysenko A. M., Mikhailov V. V., and E. Stackebrandt. Glaciecola mesophila sp. nov., a novel marine agar-digesting bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 647-651.

26. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Rohde M, Lysenko A. M., Mikhailov V. V., and E. Stackebrandt. Pseudoalteromonas agarivorans sp. nov., a novel marine agarolytic bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 125-131.

27. Romanenko L. A., Zhukova N. V., Lysenko A. M., Mikhailov V. V., and E. Stackebrandt. Assignment of 'Alteromonas marinoglutinosa' NCIMB 1770 to Pseudoalteromonas mariniglutinosa sp. nov., nom. rev., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 1105-1109.

28. Romanenko L. A., Schumann P., Zhukova N. V., Rohde M., Mikhailov V. V., and E. Stackebrandt. Oceanisphaera litoralis gen. nov., sp. nov., a novel halophilic bacterium from marine bottom sediments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 1885-1888.

29. Romanenko L. A., Uchino M., Falsen E., Zhukova N. V., Mikhailov V. V., and T. Uchimura.

Rheinheimera pacifica sp. nov., a novel halotolerant bacterium isolated from the Pacific deepseawater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, vol. 53, pp. 1973-1977.

30. Romanenko L. A., Schumann P., Rohde M., Mikhailov V. V., and E. Stackebrandt. Reinekea sedimentorum gen. nov., sp. nov., a novel bacterium from marine coastal sediments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004, in press.

Статьи в сборниках

31. Михайлов В. В., Потиевский Э. Г., Иванова Е. П., Романенко Л. А. 1987. Изучение бактериопланктона прибрежных и открытых вод Японского моря. // Труды ДВНИИ, вып. 131, Вопросы мониторинга природной среды (Ред. Беленький B.C., Ткалин А.В.), Л. Гидрометеоиздат, с. 41-47.

32. Потиевский Э. Г., Михайлов В. В., Иванова Е. П., Романенко Л. А. 1987. Микробиологическое изучение нефтяного загрязнения прибрежных и открытых вод Японского моря. // Ibidem, с. 21-24.

33. Еляков Г. Б., Кузнецова Т. А., Михайлов В. В., Мальцев И. И., Калиновская Н. И., Аффиятуллов Ш. ILL, Недашковская О. И., Шевченко Л. С., Сметанина О. Ф., Романенко Л. А. Распространение в морских симбионтных ассоциациях микроорганизмов, продуцирующих физиологически активные соединения. Сб. научных трудов «Морская микробиология», 1995, Изд-во Дальневосточного Ун-та, Владивосток (Ред. И. Е. Мишустина), с. 32-35.

34. Mikhailov V. V., Kuznetsova Т. A., Ivanova Е. P., Romanenko L. A., Shevchenko L. S., Nedashkovskaya О. I., Gorshkova N. М., Elyakov G. В. The Collection of Marine Microorganisms as a base for fundamental and applied studies in marine microbiology and biotechnology. // Proceeding of Conf. Oceanology International 97 Pacific Rim. Exhibition & Conference, 12-14 May, 1997, World Trade Centre, Singapore, v. 2 - Extending the Reach of Ocean Technologies, p. 77-92.

Монография.

35. Иванова Е. П., Романенко JI. А., Михайлов В. В., Морские протеобактерии семейства Alteromonadaceae. Владивосток: Дальнаука, 2001, 125 стр. + 7стр. вкл.

Глава в руководстве "The Prokaryotes"

36. Mikhailov V.V., Romanenko L.A., Ivanova E. P. The Genus Alteromonas and Related Proteobacteria. In M. Dworkin et al. The Prokaryotes. Release 3.10, September, 27, 2002, Springer-Verlag NY (http: //www.prokaryotes.com).

Патент РФ

37. Романенко Л.А., Плисова Е.Ю., Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы. // Патент Российской Федерации № 2026347. 1995. БИ № 139.

Тезисы докладов.

38. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю., Романенко Л.А., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Уридил-специфическая РНК-аза из морской бактерии. // Тез. докл. Всесоюз. Совещ. "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", 1988, ТИНРО, Владивосток, 24-26 мая, с. 19-20.

39. Plisova E.Yu., Romanenko L.A., Fedosov Yu.V., Mikhailov V.V., Rasskasov V.A. Bacteria of genus Alteromonas are promising sources of specific ribonucleases. //Abstr. Intern. Sci. Conf. "Bridges of Science between North America and the Russian Far East", Anchorage, Alaska, U.S.A., Aug. 25-27, Vladivostok, Russia, Aug. 29-Sept. 2, 1994, p. 295.

40. Romanenko L.A., Mikhailov V.V., Lysenko A.M., Stepanenko V.I. A new melanin-synthesizing bacterium of the genus Alteromonas from marine sponge. // 1994, Ibidem, p. 297.

41. Romanenko L.A., Zelepuga E.A., Kozlovskaya E.P., Mikhailov V.V. Tyrosinase activity of the melanin-synthesizing bacteria of the genus Alteromonas from marine animals. // 1994, Ibidem, p. 296.

42. Hanniffy O.M., Shashkov A.S., Knirel Yu.A., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Savage A.V. Structural studies of the (3-specifIc polysaccharide from Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) by NMR spectroscopy. // Abstr. 9th European Carbohydrate Symposium eurocarbg Utrecht, Netherlands, July 6-11, 1997, p. 291.

43. Krasikova I.N., Tomshich S.V., Bakholdina S.I., Romanenko L.A. Lipid A fatty acids from the marine Pseudoalteromonas haloplanktis bacteria. // Abstr. East Sea Oceanography Conf. The 3rd Circum-Pacific International Symposium on Earth Environment, 14-15 October, 1997, Korea Inter-University Institute of Ocean Science, Pukyong National University, Pusan, Korea, p. 37.

44. Романенко Л.А., Вожжова Е.И., Монастырная M.M., Козловская Э.П. Протеолитическая активность морских бактерий. // Тез. докл. Научной конф. ТИБОХ ДВО РАН Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Владивосток: Дальнаука, 1998, с. 70-71.

45. Романенко Л.А., Лысенко A.M., Фролова Г.М., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Физиолого-биохимические особенности глубоководной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223, продуцирующей полиуридил-специфическую эндорибонуклеазу. // Ibidem, 1998, с. 71-72.

46. Романенко Л.А., Зелепуга Е.А., Козловская Э.П., Михайлов В.В. Поиск продуцентов тирозиназ среди бактерий рода Pseudoalteromonas. II Ibidem, 1998, с. 72-73.

47. Командрова Н.А., Томшич С.В., Романенко Л.А. Структурное исследование полисахаридов морской бактерии Pseudoalteromonas marinoglutinosa KMM 232. // Ibidem, 1998, с. 110-112.

48. Хоменко В.А, Фролова Г.М., Лихацкая Г.Н., Романенко Л.А., Соловьва Т.Ф. Порин-подобные белки из морских бактерий рода Pseudoalteromonas. И Ibidem, 1998, с. 136137.

49. Терентьев JI.JI., Терентьева Н.А., Романенко JI.A., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Связь между скоростью синтеза ДНК и уровнем активности нуклезидкиназ у морских бактерий. // Ibidem, 1998, с. 155-156.

50. Mikhailov V.V., Romanenko L.A., Nedashkovskaya О.I., Gorshkova N.M., Ivanova E.P. Physiological peculiarities of microbial associations of Far-Eastern marine invertebrates. // Microbial Biosystems. New Frontiers. Program & Abstracts Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), 9-14 August, 1998, Halifax, Nova Scotia, Canada, p. 235-236.

51. Kuznetsova T.A., Mikhailov V.V., Kalinovskaya N.I., Afiyatullov Sh.Sh., Oleynikova G.K., Smetanina O.F., Ivanova E.P., Romanenko L.A., Shevchenko L.S., Pivkin M.V., Platunova O.M., Elyakov G.B. Marine heterotrophic microorganisms as the basis for the development of marine biotechnology. // Absrtacts. 2nd International Symposium Chemistry and Chemical Education. 26-39 September 2000, Vladivostok, Russia. Far-Eastern Univ. Press, p. 219.

52. Zelepuga E.A., Romanenko L.A., Kozlovskaya E.P., Mikhailov V.V. Bacteria from marine environment as a source of DOPA and tyrosinases. // Ibidem, 2000, p. 215.

53. Романенко JI.A., Лысенко A.M., Михайлов В.В. Особенности морского изолята Psychrobacter sp. КММ 225 // Тез. докл. конф. "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Владивосток, Дальнаука, 2001, с. 172174.

54. Романенко Л.А., Калиновская Н.И., Михайлов В.В. Характеристика микроорганизмов, ассоциированных с морской асцидией Halocynthia aurantium. // Ibidem, 2001, с. 174176.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Романенко, Людмила Александровна, Владивосток

1..Безбородова С. И. Рибонуклеазы и родственные им белки, а также ингибиторы рибонуклеаз белковой природы // Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27, №3. С. 308-329.

2. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М.: Мир. 1986. 422 с.

3. Горбенко Ю. А. О наиболее благоприятном количестве "сухого питательного агара" в средах для культивирования морских гетеротрофных микроорганизмов // Микробиология. 1961. Т. 25, № 1. С. 168-172.

4. Дедков В. С., Зернов Ю. П., Речкунова И. А., Дегтярев С. X. Выявление водных микроорганизмов Черного моря — продуцентов эндонуклеаз рестрикции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1990. № 12. С. 17-19.

5. Методы общей бактериологии // Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир. 1984. Т. 1. 535 е., Т. 3.263 с.

6. Михайлов В. В., Кузнецова Т. А., Еляков Г. Б. Морские микроорганизмы и их вторичные метаболиты // Владивосток. Дальнаука. 1999. 132 с.

7. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Плисова Е. Ю., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Горшкова Н. М., Ивайловский В. В., Рассказов В. А. Распространение рибонуклеаз среди морских микроорганизмов // Прикл. биохим. микробиол. 1994. Т. 30, вып. 3. С. 384-388.

8. Иванова Е. П., Михайлов В. В. Новое семейство АиеготопснЗасеае Гат. поу., объединяющее группу морских аэробных протеобактерий // Микробиология. 2001. Т. 70. С. 15-23.

9. Иванова Е. П., Романенко Л. А., Михайлов В. В. Морские протеобактерии семейства Аиеготопас1асеае II Владивосток. Дальнаука. 2001. 125 с. + 7 с вкл.

10. Нуклеазы микроорганизмов // Ред. А. М. Безбородое. М.: Наука, 1974. 328 с.

11. Плисова Е. Ю., Романенко JI. А., Федосов Ю. В., Михайлов В. В., Рассказов В. А. Специфичность рибонуклеаз морских бактерий Alteromonas и Pseudomonas II Биология моря. 1996. Т. 22, № 2. С. 110-113.

12. Пширков С. Ю., Бойко О. И., Киприанова Е. А., Старовойтов И. И. Трансформация L-тирозина в L-диоксифенилаланин культурами Pseudomonas // Микробиология. 1982. Т. 51, № 2. С. 272-274.

13. Романенко JI. А., Михайлов В. В. Нуклеазная активность микроорганизмов, ассоциированных с морскими асцидиями // Микробиология. 1992. Т. 61, вып. 1. С. 131134.

14. Романенко JI. А., Иванова Е. П., Лысенко А. М., Михайлов В. В. Некоторые особенности грамотрицательных агарлитических бактерий из морской среды // Микробиология. 1994а. Т. 63, вып. 5. С. 940-944.

15. Романенко JI. А., Лысенко А. М., Михайлов В. В., Курика А. В. Новый вид • буропигментированных агарлитических бактерий рода Alteromonas II Микробиология.19946. Т. 63, вып. 6. С. 1081-1087.

16. Романенко Л. А., Зелепуга Е. А., Козловская Э. П., Михайлов В. В. Тирозиназная активность бактерий рода Alteromonas II Биология моря. 1994в. Т. 63, № 4. С. 260-263.

17. Фролова Г. М., Куриленко В. В., Иванова Е. П., Горшкова Н. М., Михайлов В. В. Особенности фосфолипидного состава морских протеобактерий рода Pseudoalteromonas И Микробиология. 2000. Т. 69, № 4. С. 506-510.

18. Янулайтис А. А. Ферменты рестрикции и их применение. М.: Наука. 1989. 203с.

19. Akagawa-Matsushita М., Yamada Y., Yamasato К. Characterization and identification of a restriction enzyme producing marine bacterium Deleya marina I AM 14114// Bull. JFCC. 1991. V. 7. P. 28-32.

20. Akagawa-Matsushita M., Itoh Т., Katayama Y., Kuraishi H., Yamasato K. Isoprenoid quinone composition of some marine Alteromonas, Marinomonas, Deleya, Pseudomonas and Shewanella species //J. Gen. Microbiol. 1992a. V. 138. P. 2275-2281.

21. Akagawa-Matsushita M., Matsuo M., Koga Y., Yamasato K. Alteromonas atlantica sp. nov. and Alteromonas carrageenovora sp. nov., bacteria that decompose algal polysaccharides // Int. J. Syst. Bacterid. 1992b. V. 42. P. 621-627.

22. Akagawa-Matsushita M., Koga Y, Yamasato K. DNA relatedness among nonpigmented species of Alteromonas and synonymy of Alteromonas haloplanktis (ZoBell and

23. Upham 1944) Reichelt and Baumann 1973 and Alteromonas tetraodonis Simidu et al. 1990 II Int. J. Syst. Bacterid. 1993. V. 43. P. 500-503.

24. Amann R. I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Reviews. 1995. V. 59, № l.P. 143-169.

25. Anderson R. J., Wolfe M. S., Faulkner D. J. Autotoxic antibiotic production by a marine Chromobacterium II Marine Biol. 1974. V. 27. P. 281-285.

26. AustinB. Marine Microbiology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988. 222 p.

27. Austin B. Novel pharmaceutical compounds from marine bacteria // J. Appl. Bacterid. 1989. V. 67. P. 461-470.

28. Ballester M., Ballester J. M., Belaich J. P. Isolation and characterization of a high molecular weight antibiotic produced a marine bacterium // Microb. Ecol. 1977. V. 3. P. 289303.

29. Baumann L, Baumann P., Mandel M., Allen R. D. Taxonomy of aerobic marine eubacteria // J. Bacteriol. 1972. V. 3. P. 402-429.

30. Baumann L., Bowditch R. D., Baumann P. Description of Deleya gen. nov. created to accommodate the marine species Alcaligenes aestus, A. pacificus, A. cupidus, A. venustus, and Pseudomonas marina II Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V. 33. P. 793-802.

31. Baumann P., Baumann L. Genus Photobacterium, Beijerinck 1889. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, pp. 539-544. Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. 1984. Baltimore: Williams & Wilkins.

32. Baumann P., Furniss A. L., Lee J. V. Genus Vibrio, Pacini 1854. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, pp. 518-538. Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. 1984a. Baltimore: Williams & Wilkins.

33. Baumann P., Baumann L., Bowditch R. D., Beaman B. Taxonomy of Alteromonas: A. nigrifaciens sp. nov. nom. rev.; A. macleodii; and A. haloplanktis I I Int. J. Syst. Bacteriol. 1984b. V. 34. P. 145-149.

34. Baumann P., Gauthier M. J., Baumann L. Genus Alteromonas Baumann, Baumann, Mandel and Allen 1972 11 Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. N. R. Krieg, J. G. Holt. 1984c. Baltimore: Williams & Wilkins Co. P. 343-352.

35. Bein S. J. A study of certain chromogenic bacteria isolated from "Red Tide" water with a description of anew species // Bull. Mar. Sci. Gulf Carrib. 1954. V 4. P. 110-119.

36. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology // Eds N. R. Krieg, J. G. Holt. Baltimore/London: Williams&Wilkins Co. 1984. V. 1. 964 p.

37. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology // Eds P. Sneath, N. Mair, M. E. Sharpe, J. G. Holt. Baltimore/London: Williams&Wilkins Co. 1986. V. 2. P. 965-1599.

38. Berland B. R., Bianchi M. G., Maestrini S. Y. Etude des bacteries associees aux Algues maries en culture. I. Determination preliminaire des especes // Marine Biol. 1969. V. 2. P. 350-355.

39. Bonar D. B., Weiner R. M., Colwell R. R. Microbial-invertebrate interactions and potential for biotechnology // Microb. Ecol. 1986. V. 12, № 1. P. 101-110.

40. Bowman J. P., Cavanagh J., Austin J. J., Sanderson K. Novel Psychrobacter species from Antarctic ornithogenic soils // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 841-848.

41. Bowman J. P., McCammon S. A., Brown M. V., Nichols D. S., McMeekin T. A. Diversity and association of psychrophilic bacteria in Antarctic sea ice // Appl. Environ. Microbiol. 1997a. V. 63. P. 3068-3078.

42. Bowman J. P., Nichols D. S., McMeekin T. A. Psychrobacter glacincola sp. nov., a halotolerant, psychrophilic bacterium isolated from Antarctic sea ice // Syst. Appl. Microbiol. 1997b. V. 20. P. 209-215.

43. Bowman J. P. Pseudoalteromonasprydzensis sp. nov., a psychrotrophic, halotolerant bacterium from Antarctic sea ice // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1037-1041.

44. Bozal N., Tudela E., Rossello-Mora R., Lalucat J., Guinea J. Pseudoalteromonas antarctica sp. nov., isolated from an Antarctic coastal environment // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 345-351.

45. Bradford M. M. A rapid and sensitive method to the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. N 2. P. 248-254.

46. Brettar I., Christen R., Hofle M. G. Rheinheimera baltica gen. nov., sp. nov., a blue-coloured bacterium isolated from the central Baltic Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P.1851-1857.

47. O.Brettar I., Christen R., Höfle M. G. Idiomarina baltica sp. nov., a marine bacterium with a high optimum growth temperature isolated from surface water of the central Baltic Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V.53. P. 407-413.

48. Buck J. D., Meyers S. P. "In vitro" inhibition of Rhodotorula minuta by variant of the marine bacterium Pseudomonas piscicida II Helgoland. Meeresuntersuch. 1966. V. 13. P. 171177.

49. Buck J. D., Meyers S. P., Leifson E. Pseudomonas (Flavobacterium) piscicida Bein comb. nov. //J. Bacteriol. 1963. V. 86. P. 1125-1126.

50. Burkholder P. R., Pfister R. M., Leitz F. H. Production of a pyrrole antibiotic by a marine bacterium // Appl. Microbiol. 1966. V. 14. P. 649-653.

51. Carr E. L., Kämpfer P., Patel B. K. C., Gürtler V., Seviour R. J. Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P.953.963.

52. Catlin B. W. Branhamaceae fam. nov., a proposed family to accommodate the genera Branhamella and Moraxella II Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 320-323.

53. Chan K. Y., Baumann L., Garza M. M., Baumann P. Two new species of Alteromonas: Alteromonas espejiana and Alteromonas undina II Int. J. Syst. Bacteriol. 1978. V. 28. P. 217-222.

54. Colwell R. R. Polyphasic taxonomy of the genera Vibrio: numerical taxonomy of Vibrionaceae, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibrio species // J. Bacteriol. 1970. V. 104. P. 410-433.

55. Cowan D. A. The marine biosphere: a global resource for biotechnology // TIBTECH. 1997. V. 15. P. 129-131.

56. D'Aoust J. Y., Kushner D. J. Vibrio psychroerythrus sp. nov.: classification of the psychrophilic marine bacterium, NRC 1004 //J. Bacteriol. 1972. V. 111. P. 340-342.

57. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Biochem. 1970. V. 12 P.133-142.

58. Deming J. W. Bacterial growth in deep-sea sediment trap and boxcore samples // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1985. V. 25. P. 305-312.

59. Deming J. W., Col well R. R. Barophilic bacteria associated with digestive tracts of abyssal holothurians//Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 50. P. 1002-1006.

60. Deming J. W., Somers L. K., Straube W. L., Schwartz D. G., MacDonnel M. T. Isolation of an obligately barophilic bacterium and description of a new genus, Colwellia gen. nov. // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V. 10. P. 152-160.

61. Deng J., Hamada Y., Shioiri T. Total synthesis of alterobactin A, a super siderophore from an open-ocean bacterium // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 7824-7825.

62. DeSoete G. A least square algorithm for fitting additive trees to proximity data // Psychrometrika. 1983. V. 48. P. 621-626.

63. Desnottes J.-F. New targets and strategies for the development of antibacterial agents //TIBTECH. 1996. V. 14. P. 134-140.

64. Donachie S. P., Hou S., Gregory T. S., Malahoff A., Alam M. Idiomarina loihiensis sp. nov., a halophilic gamma-Proteobacterium from the Lo'ihi submarine volcano, Hawai'i // Int. J. Evol. Syst. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1873-1879.

65. Donis-Keller H. PhyM: an RNase activity specific for U and A residues useful in RNA sequence analysis // Nucl. Acids Res.1980. V. 8, № 14. P. 3133-3142.

66. Duckworth A. W., Grant W. D., Jones B. E., Meijer D., Marquez M. C., Ventosa A. Halomonas magadii sp. nov., a new member of the genus Halomonas, isolated from a soda lake of the East African Rift Valley // Extremophiles. 2000. V. 4. P. 53-60.

67. Egan E., Holmstrom C., Kjelleberg S. Pseudoalteromonas ulvae sp. nov., a bacterium with antifouling activities isolated from the surface of a marine alga // Int. J. Evol. Syst. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1499-1504.

68. Elyakov G. B., Kuznetsova T. A., Mikhailov V. V., Maltsev I. I., Voinov V. G., Fedoreyev S. A. Brominated diphenyl ethers from a marine bacterium associated with the sponge Dysidea sp. // Experientia. 1991. V. 47. P. 632-633.

69. Enger O., Nygaard H., Solberg M., Schei G., Nielsen J. Characterization of Alteromonas denitrificans sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 416-421.

70. Euzeby J. P. Taxonomic note: necessary correction of specific and subspecific epithets according to Rules 12c and 13b of the International Code of Nomenclature of Bacteria (1990 Revision) // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1073-1075.

71. Faulkner D. J. Marine natural products // Nat Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 155-198.

72. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution. 1985. V. 39. P. 783-791.

73. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogenetic Inference Package) version 3.5.1. Department of Genetics. University of Washington. 1993. Seattle, USA.

74. Fenical W. Chemical studies of marine bacteria: developing a new resource // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 1673-1683.

75. Fischer-Romero C., Tindall B. J., Jiittner F. Tolumonas auensis gen. nov., sp. nov., a toluene-producing bacterium from anoxic sediments of a freshwater lake // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 183-188.

76. Fox G. E., Wisotzkey J. D., Jurtshuk P., JR. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to gaurantee species identity // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 166-170.

77. Franzmann P. D., Burton H. R., McMeekin T. A. Halomonas subglaciescola, a new species of halotolerant bacteria isolated from Antarctica // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 27-34.

78. Franzmann P. D., Wehmeyer U., Stackebrandt E. Halomonadaceae fam. nov., a new family of the class Proteobacteria to accommodate the genera Halomonas and Deleya II Syst. Appl. Microbiol. 1988. V. 11. P. 16-19.

79. Garriga M., Ehrmann M. A., Arnau J., Hugas M., Vogel R. F. Carnimonas nigrificans gen. nov., sp. nov., a bacterial causative agent for black spot formation on cured meat products // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 677-686.

80. Gauthier M. J. Alteromonas rubra sp. nov., a new marine antibiotic-producing bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976a. V. 26. P. 459-466.

81. Gauthier M. J. Morphological, physiological, and biochemical characteristics of some violet-pigmented bacteria isolated from seawater // Can. J. Microbiol. 1976b. V. 22. P. 138-149.

82. Gauthier M. J. Alteromonas citrea, a new Gram-negative, yellow-pigmented species from seawater // Int. J. Syst. Bacteriol. 1977. V. 27. P. 349-354.

83. Gauthier M. J. Validation of the name Alteromonas luteoviolacea II Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. V. 32. P. 82-86.

84. Gauthier M. J., Breittmayer V. A. A new antibiotic-producing bacterium from seawater: Alteromonas aurantia sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1979. V. 29. P. 366-372.

85. Gauthier M. J., Flatau G. N. Antibacterial activity of marine violet-pigmented Alteromonas with special reference to the productions of brominated compounds // Can. J. Microbiol. 1976. V. 22. P. 1612-1619.

86. GÍ11ÍS M., Vandamme P., De Vos P., Swings J., Kersters K. Polyphasic taxonomy. In: D. R. Boone, and R. W. Castenholz (Eds). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1.2001. Springer-Verlag, New York.

87. Gil-Turnes M. S., Hay M. E., Fenical W. Symbiotic marine bacteria chemically defend crustacean embryos from a pathogenic fungus // Science. 1989. V. 246. P. 117-118.

88. Gil-Turnes M. S., Fenical W. Embrios of Homarus americanus are protected by epibiotic bacteria // Biol. Bull. 1992. V. 182, № 1. P. 105-108.

89. Gürtler V., Mayall B. C. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 3-16.

90. Hamato N., Takano R., Kamei-Hayashi K., Imada C., Hara S. Leupeptins produced by the marine Alteromonas sp. B-10-31 // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. V. 56, № 8. P. 1316318.

91. Hebert A. M., Vreeland R. H. Phenotypic comparison of halotolerant bacteria: Halomonas halodurans sp. nov., nom. rev., comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 347-350.

92. Hedlund B. P., Geiselbrecht A. D., Bair T. J., Staley J. T. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a new marine bacterium, Neptunomonas naphthovorans gen. nov., sp. nov. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 251-259.

93. Holland G. S., Jamieson D. D., Reicheldt J. L., Viset G., Wells R. J. Aromatic acids from Alteromonas rubra II Chemistry and Industry. 1984. № 3. P. 3-8.

94. Holmström C., James S., Neilan B. A., White D. C., Kjelleberg S. Pseudoalteromonas tunicata sp. nov., a bacterium that produces antifouling agents // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1205-1212.

95. Holmström C., Kjelleberg S. Marine Pseudoalter omonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents // FEMS Microbiol. Ecol. 1999. V. 30. P. 285-293.

96. Hugenholtz R., Pace N. R. Identifying microbial diversity in the natural environment: a molecular phylogenetic approach // Trends in Biotechnology. 1996. V. 14, № 6. P. 190-197.

97. Hugenholtz R., Goebel B. M., Pace N. R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 4765-4774.

98. Isnansetyo A., Kamei Y. Pseudoalteromonas phenolica sp. nov., a novel marine bacterium that produces phenolic anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) substances // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 583-588.

99. Jannasch H. W., Wirsen C. O., Taylor C. D. Deep-sea bacteria: isolation in the absence of decompression// Science. 1982. V. 126. P. 1315-1317.

100. Jones D., Krieg N. R. Serology and chemotaxonomy // Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. N. R. Krieg, J. G. Holt. Baltimore: The Williams & Wilkins Co. 1984. V. l.P. 15-19.

101. Jukes T. H., Cantor C. R. Evolution of protein molecules // Mammalian Protein Metabolism / Ed. H. N. Munro. 1967. New York: Academic Press. P. 21-132.

102. Juni E., Heym G. A. Psychrobacter immobilis gen. nov., sp. nov.: genospecies composed of gram-negative, aerobic, oxidase-positive coccobacilli // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 388-391.

103. Kampfer P., Albrecht A., Buczolits S., Busse H. J. Psychrobacter faecalis sp. nov., a new species from a bioaerosol originating from pigeon faeces // Syst. Appl. Microbiol. 2001. V. 25. P. 31-36.

104. Kameyama T., Takahashi A., Karasawa S., Ishizuka M., Okami Y., Takeuchi T., Umezawa H. Bisucaberin, a new siderophore, sensitizing tumor cells to macrophage-mediated cytolysis. I. // J. Antibiotics. 1987. V. 40. P. 1664-1670.

105. Kelley S. K., Coyne V. E., Sledjeski D. D., Fuqua W. C., Weiner R. M. Identification of tyrosinase from a periphytic marine bacterium // FEMS Microbiol. Lett. 1990 V. 67, № 3. P. 275-280.

106. Kim D.-S., Kim C.-H. Reply. No ability to produce tetrodotoxin in bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2393-2394.

107. Kobayashi T., Imada C., Hiraishi A., Tsujibo H., Miyamoto K., Inamori Y., Hamada N., Watanabe E. Pseudoalteromonas sagamiensis sp. nov., a marine bacterium that produces protease inhibitors // Int. J. Evol. Syst. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1807-1811.

108. Kodama M., Ogata T., Sato S. Saxitoxin producing bacterium isolated from Protogonyaulax tamarensis II Red Tide. Biology, Environmental Science and Toxicology / Eds. T Okaichi., D.M. Anderson, T. Nemoto. Amsterdam: Elsevier, 1989. P. 363-366.

109. Kodama K., Shiozawa H., Ishii A. Alteromonas rava sp. nov., a marine bacterium that produces a new antibiotic, thiomarinol // Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. 1993. V. 45. P. 131136.

110. Kodjo A., Tounjum T., Richard Y., Bouvre K. Moraxella caprae sp. nov., a new member of the classical moraxellae with very close affinity to Moraxella bovis II Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 467-471.

111. Kodjo A., Richard Y., Tounjum T. Moraxella boevrei sp. nov., a new Moraxella species found in goats// Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 115-121.

112. Kon-ya K., Shimidzu N., Otaki N., Yokoyama A., Adachi K., Miki. W. Inhibitory effect of bacterial ubiquinones on the settling of barnacle, Baianus amphitrite II Experientia. 1995. V. 51. P.153-155.

113. Krieg N. R. Genus Oceanospirillum Hylemon, Wells, Krieg and Jannasch 1973 // Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. N. R. Krieg, J. G. Holt, 1984. Baltimore: Williams & Wilkins Co. P. 104-110.

114. Leifson E. Determination of carbohydrate metabolism of marine bacteria // J. Bacteriol. 1963. V. 85. P. 1183-1184.

115. Lemos M. L., Toranzo A. E., Baija J. L. Antibiotic activity of epiphytic bacteria isolated from intertidal seaweeds // Microb. Ecol. 1985. V. 11. P. 149-163.

116. Ludwig W., Schleifer K.-H. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis//FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 15. P. 155-173.

117. Ludwig W., Schleifer, K.-H. Phylogeny of Bacteria beyond the 16S rRNA standard // ASM News. 1999. V. 65. P. 752-757.

118. Ludwig W., Klenk H.-P. Overview: A phylogenetic backbone and taxonomic framework for prokaryotic systematic. In: D. R. Boone, R. W. Castenholz (Eds), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1. 2001. Springer-Verlag, New York.

119. MacDonell M. T., Colwell R. R. Phylogeny of the Vibrionaceae, and recommendation for two new genera, Listonella and Shewanella II Syst. Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 171-182.

120. Maciän M. C., Ludwig W., Schleifer K.-H., Garay E., Pujalte M. J. Thalassomonas viridans gen. nov., sp. nov., a novel marine y-proteobacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V.51.P. 1283-1289.

121. Maidak B. L., Olsen G. J., Larsen N., Overbeek R., McCaughey M. J., Woese C. R. A new version of RDP (Ribosomal Database Project) // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 109110.

122. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms //J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 208-218.

123. Marmur J., Doty P. Determinative of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature // J. Mol. Biol. 1962. V. 5, № 1. P. 109-118.

124. Matsumura K. No ability to produce tetrodotoxin in bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2393.

125. McLean M. W., Williamson F. B. Chi-carrageenase from Pseudomonas carrageenovora II Eur. J. Biochem. 1979. V. 93, N 3. P. 553-558.

126. Mesbah M., Premachandran U., Whitman W. B. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography // Int. J. Syst. Bacteriol. 1989. V. 39. P. 159-167.

127. Morita R. Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriol. Rev. 1975. V. 39. P. 144-167.

128. Mormile M. R., Romine M. F., Garcia M. T., Ventosa A., Bailey T. J., Peyton B. M. Halomonas campisalis sp. nov., a denitrifying, moderately haloalkaliphilic bacterium // Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 551-558.

129. Muller W. Endoribonuclease IV. A poly(A)-specific ribonucleases from chick oviduct. 1. Purification of the enzyme // Eur. J. Biochem. 1976. V. 70. P. 241-248.

130. Nair S., Simidu U. Distribution and significance of heterotrophic marine bacteria with antibacterial activity // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. P. 2957-2962.

131. Pace N. R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science. 1997. V. 276. P. 734-740.

132. Pace N. R. Microbial ecology and diversity // ASM News. 1999. V. 65, № 5. P. 328333.

133. Popoff M. Genus Aeromonas, Kluyver and Van Niel 1936. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 1984. Vol. 1, pp. 545-548. Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins.

134. Potin P., Barbeyron T., Bouget F. Y., Rochas C., Kloareg B. Biochemical characterization and molecular cloning of phycocolloid-modifying enzymes from marine bacteria and alga // Intern. Marine Biotechnol. Conf. Baltimore. 1991. P. 68.

135. Priest F. G., Goodfellow M., Shute L. A., Berkeley R. C. W. Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 69-71.

136. Quesada E., Ventosa A., Ruiz-Berraquero F., Ramos-Cormenzana A. Deleya halophila a new species of moderately halophilic bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. V. 34. P. 287-292.

137. Quintanilla M., Renart J. Purification and characterization of a novel UpN-specific . endoribonuclease VI from Artemia larvae // J. Biol. Chem. 1982. V. 257, № 21. P. 12594-12599.

138. Rinehart K. L., Gloer J. B., Huges R. G., Renis H. G. et al. Didemnins — antiviral and antitumor depsipeptides from a caribean tunicate 11 Science. 1981. V. 212, № 4497. P. 933-935.

139. Rossellö-Mora R. A., Ludwig W., Kämpfer P., Amann R., Schleifer K. H. Ferrimonas balearica gen. nov., spec, nov., a new marine facultative Fe(III)-reducing bacterium // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 196-202.

140. Rossellö-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39-67.

141. Rouhi A. M. Chemistry from unknown microbes // C&EN. 1999. Jan. 4. P. 21-23.

142. Saitou N., Nei M. The neighbor joining method: a new method for constructingphylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406-425.

143. Marinobacterium as Marinibacterium jannaschii comb. nov. and Marinibacterium stanieri comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 739-747.

144. Shigemori H., Bae M.-A., Yazawa K., Sasaki T., Kobayashi Y. Alteramide A, a new tetracyclic alkaloid from a bacterium Alteromonas sp. associated with the marine sponge Halichondria okadai II J. Org. Chem. 1992. V. 57. P. 4320-4323.

145. Shiozawa H., Takahashi S. Configuration studies on thiomarinol // J. Antibiotics.1994. V. 47, №7. P. 851-853.

146. Shiozawa H., Kagasaki T., Torokata A., Tanaka N., Fujimoto K., Hata T., Furukawa Y., Takahashi S. Thimarinols B and C, antimicrobial antibiotics produced by a marine bacterium // J. Antibiotics. 1995. V. 48, № 8. P. 907-909.

147. Simidu U., Kita-Tsukamoto K., Yasumoto T., Yotsu M. Taxonomy of four marine bacterial strains that produce tetrodotoxin // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P. 331-336.

148. Skerman V. B. D., McGowan V., Sneath P. H. A. (Editors): Approved Lists of Bacterial Names. Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. P. 225-420.

149. Sleigh M.A. Microbes in the Sea. Chichester, London: Wiley & Sons. 1987.264 P.

150. Schumann P., Prauser H., Rainey F. A., Stackebrandt E., Hirsch P. Friedmanniella antarctica gen. nov., sp. nov., an LL-diaminopimelic acid-containing actinomycete from Antarctic sand-stone // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 278-283.

151. Smibert R. M., Krieg N. R. Phenotypic characterization. In: Methods for General and Molecular Bacteriology, pp. 607-655. Edited by P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W. A. Wood, N. R. Krieg. 1994. Washington, DC: American Society for Microbiology.

152. Solano F., Garcia E., Perez de Egea E., Sanchez-Amat A. Isolation and characterization of strain MMB-1, a novel melanogenic marine bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3499-3506.

153. Solano F., Sanchez-Amat A. Studies on the relationships of melanogenic marine bacteria: proposal of Marinomonas mediterranea sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1241-1246.

154. Stackebrandt E., Murray R. G. E., Truper H. G. Proteobacteria classis nov., a name for the phylogenetic taxon that includes the purple bacteria and their relatives // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 321-325.

155. Stackebrandt E., Goebel B. M. Taxonomic Note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 846-849.

156. Stierle D. B, Stierle A. A. Pseudomonic acid derivatives from a marine bacterium // Experientia. 1992. V. 48. P. 1165-1169.

157. Sugahara I., Kohhashi K., Kimura T. Isolation and properties of a bacterium capable of inhibiting the growth of red tide plankton // 6th Inter. Symp. Microbiol. Ecol. Barcelona: Spain, 1992. P. 173.

158. Svetashev V. I., Vysotskii M. V., Ivanova E. P., Mikhailov V. V. Cellular fatty acids of Alteromonas species // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 37-43.

159. Takada Y., Ochiai T., Okuyama H., Nishi K., Sasaki S. An obligately psychrophilic bacterium isolated on the Hokkaido coast // J. Gen. Appl. Microbiol. 1979. V. 25. P. 11-19.

160. Takahashi A., Nakamura H., Kameyama T., Kurasawa S., Naganawa H., Okami Y., Takeuchi T., Umezawa H., Iitaka Y. Bisucaberin, a new siderophore, sensitizing tumor cells to macrophage-mediated cytolysis. II. // J. Antibiotics. 1987. V. 40. P. 1671-1676.

161. Takami H., Kobata K., Nagahama T., Masui N., Kobayashi H., Inoue A., Horikoshi K. Biodiversity in deep-sea sites located near the south part of Japan // Extremophiles. 1999. V. 3. P. 97-102.

162. The Prokaryotes. A Handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, applications / Eds. A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, H. Harber, K.-H. Schleifer. Berlin: Springer Verlag, 1992. V. II-III. P. 2111-3130.

163. Valderrama M. J., Quesada E., Bejar V., Ventosa A., Gutierrrez M. C., Ruiz-Berraquero F., Ramos-Cormenzana A. Deleya salina sp. nov., a moderately halophilic Gramnegative bacterium. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 34. P. 287-292.

164. Vandamme P., Pot B., Gillis M., De Vos P., Kersters K., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Reviews. 1996. V. 60, № 2. P. 407-438.

165. Van Landschoot A., De Ley J. Intra- and intergeneric similarities of the rRNA cistrons of Alteromonas, Marinomonas (Gen. nov.) and some other Gram-negative bacteria // J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 3057-3974.

166. Vela A. I., Collins M. D., Latre M. V., Mateos A., Moreno M. A., Hutson R., Dominguez L., Fernandez-Garayzabal J. F. Psychrobacter pulmonis sp. nov., isolated from the lungs of lambs // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 415-419.

167. Venkateswaran K., Dollhopf M. E., Aller R., Stackebrandt E., Nealson K. H. Shewanella amazonensis sp. nov., a novel metal-reducing facultative anaerobe from Amazonian shelf muds // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998.V.48. P. 965-972.

168. Venkateswaran K., Moser D. P., Dollhopf M. E. & 10 other authors. Polyphasic taxonomy of the genus Shewanella and description of Shewanella oneidensis sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P.705-724.

169. Venkateswaran K., Dohmoto N. Pseudoalteromonas peptidolytica sp. nov., a novel marine mussel-thread-degrading bacterium isolated from the Sea of Japan // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 565-574.

170. Ventosa A., Gutierrez M. C., Garcia M. T., Ruiz-Berraquero F. Classification of "Chromobacterium marismortui" in a new genus, Chromohalobacter gen. nov., as

171. Chromohalobacter marismortui comb, nov., nom. rev. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1989. V. 39. P. 382-386.

172. Vera J., Alvarez R., Murano E., Slebe J. C., Leon J. Identification of a marine agarolytic Pseudoalteromonas isolate and characterization of its extracellular agarase // Appl. Environ. Microb. 1998. V. 64. P. 4378-4383.

173. Vreeland R. H., Litchfield C. D., Martin E. L., Elliot E. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. P. 485-495.

174. Weiner R. M., Coyne V. E., Brayton P., West P., Raiken S. F. Alteromonas colwelliana sp. nov., an isolate from oyster habitats // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 240244.

175. Weiner R. M., Fuqua W. C., Coon S. L., Walch M., Colwell R. R. Tyrosinases, biofilms and oyster set // Abstr. Intern. Marine Biotechnol. Gonf. Baltimor, Maryland, U.S.A. 1991. P. 66.

176. Westphal O., Jann K. Methods Carbohydrate Chemistry. 1965. V. 5. P. 83-89.

177. White A. H. A bacterial discoloration of print butter // Sci. Agr. 1940. V. 20. P. 638645.

178. Whitman W. B., Coleman D. C., Wiebe W. J. Prokaryotes: the unseen majority. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6578-6583.

179. Wick M. M. L-DOPA methyl ester: prolongation of survival of neuroblastoma -bearing mice after treatment// Science. 1978. V.199,N. 4330. P. 775-776.

180. Woese C. R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. V. 51. P. 221-271.

181. Woese C. R., Kandler O., Wheelis M. L. Towards a natural system of organisms: proposal for domains Archaea, Bacteria, and Eucarya 11 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. V. 87. P. 4576-4579.

182. Woese C. R. Prokaryote systematics: the evolution of a science. In: The Prokaryotes. Second Edition. / Eds. A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, H. Harber, K.-H. Schleifer. 1992. V. 1. P. 3-18. Berlin. Springer-Verlag.

183. Woese C. R. There must be a prokaryote somewhere: microbiology's search for itself // Microbiol. Reviews. 1994. V. 58, № 1. P. 1-9.

184. Woodruff H. B. Natural products from microorganisms // Science. 1980. V. 208. N. 4449. P. 1225-1229.

185. Wratten S., Wolf M., Anderson R., Faulkner D. Antibiotic metabolites from a marine pseudomonad // Antimicrob. Agents Chemotherapy. 1977. V. 11. P. 411-414.

186. Yaphe W. The use of agarase from Pseudomonas atlantica in the identification of agar in marine algae (Rhodophyceae) // Can. J. Microbiol. 1957. V. 3, № 8. P. 987-993.

187. Yaphe W. Detection of marine alginolyticus bacteria // Nature. 1962. V.196, № 4859. P. 1120-1121.

188. Yaphe W., Baxter B. The enzymic hydrolysis of carrageenan // Appl. Microbiol. 1955. V.3. P. 380-383.

189. Yasumoto T., Yasumura D., Yotsu M., Michishita T., Endo A., Kotaki Y. Bacterial production of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. P. 793795.

190. Yayanos A. A., Dietz A. S., Van Boxtel R. Isolation of a deep-sea barophilic bacterium and some of its growth characteristics // Science. 1979. V. 205. P. 808-810.

191. Yi H., Bae K. S., Chun J. Thalassomonas ganghwensis sp. nov., isolated from tidal flat sediment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. IJSEM Papers in Press, published online 15 August 2003. DOI 10.1099/ijs.0.02748-0

192. Yoon J.-H., Choi S. H„ Lee K.-C., Kho Y. H., Kang K. H., Park Y.-H. Halomonas marisflavae sp. nov., a halophilic bacterium isolated from the Yellow Sea in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1171-1177.

193. Yoon J.-H., Kim I.-G., Kang K. H., Oh T.-K., Park Y.-H. Alteromonas marina sp. nov., isolated from sea water of the East Sea in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003a. V. 53, pp. 1625-1630.

194. Yoon J.-H., Kang K. H., Park Y.-H. Psychrobacter jeotgali sp. nov., isolated from jeotgal, a traditional Korean fermented seafood // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003b. V. 53. P. 449-454.

195. Yoshida H., Tanka Y., Nakayama K. Properties of tyrosinases from Pseudomonas melanogenum II Agr. Biol. Chem. 1974. V. 38, N. 3. P. 627-632.

196. Yoshimoto T., Yamamoto K., Tsuru D. Extracellular tyrosinase from Streptomyces sp. KY-543: purification and enzymatic properties // J. Biochem. 1985. V. 97. N. 6. P. 17471754.

197. Youshimizu M., Kimura T. Study of intestinal microflora of salmonids // Fish Pathol. 1976. V. 10, N. 2. P. 243-259.

198. Yumoto I., Kawasaki K., Iwata H., Matsuyama H., Okuyama H. Assignment of Vibrio sp. strain ABE-1 to Colwellia maris sp. nov., a new psychrophilic bacterium I I Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1357-1362.

199. Zeigler D. R. Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in bacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1893-1900.

200. ZoBell C. E. Marine Microbiology // Chronica Botanica Company. Waltham, USA, 1946.240p.

201. ZoBell C. E., Allen E. C. The significance of marine bacteria in the fouling of submerged surfaces //J. Bact. 1935. V. 29. P. 239-251.

202. ZoBell C. E., Upham H. C. A list of marine bacteria including descriptions of sixty new species // Bull. Scripps Inst. Oceanogr. Univ. Calif. Tech. Ser. 1944. V. 5. P. 239-292.