Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ-АССОЦИАНТОВ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ-АССОЦИАНТОВ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS"

д-зсзу^г

ОРДЕНА ЯЕНЖА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДВГОШ НАУК УКРАШСИОЙ ССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ІНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И 1 БИРУСОЛОГИИ им. Д.К.ЗАБОЖЙНОГО

На правах рукописи

ИВАНОВА Етна Петровне

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИЕНОСТЬ ШКР00РГ№ИЗШВ-АСС0ЦИАНТ0В ИЦЦИИ Сгепояфїііи» 8Г«увпив

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации.к* соискание ученой степени кандидата биологических иаук

Киев - 199)

Ребота выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО АН СССР

Научный руководитель Офнцнмыше оппонента:

кандидат биологических няуя В.В.Михайлов

доктор биологических наук Е. А.Ккпрнакодо

доктор медицинских наук. З.П.Васпренко

Ведущее учреждение

Институт физиологии и биохимии микроорганизмов АН СССР

ированногосовета Д. 016.06. (

Зацкта диссертации состоится

і_часов на ааседаким Специализированного ¿овета Д.016.06.01

при Інституте микробиологии и вирусологии им, Д, К.Заболотного АН УОСР по адресу: 252 ГСП, г.Киов-143, ул.Заболотного, І&4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт« микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР.

Автореферат разослан "

I991 года.

Учетй секретарь Специализирован-ног« совета, кандидат биологических

щук (/ІиЭ. А. Коваленко

Шр

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Последнее десятилетие характеризуется значительным прогрессом мопской биотехнологии и гостом интереса к физиологически активным соединениям modckmx микроорганизмов. Антибиотики , токсины, полисахарида, фешенты и их ингибиторы. гтооткво- ■ опухолевые и противовигуеные вещества - таков далеко не полный перечень соединений, выделенных из микробов - обитателей Типового Океана (Austin, 1989, Hoguanl at si., 1566, Taoigucni end shlna-ban,I960), Особое место занимают сведи этих продуцентов микроорганизмы - ассоцианты морских животных - модлазков рыб. губок и других гидробионтов. Недавно было показано, что ряд уникальных биологически активных веществ синтезируется не макрогндообионтами океана, а их симбионткыми микроорганизмами,

Микробный ценоз Мирового океана, являясь его неотъемлемой составной часть», представляет собой сообщество раэнообоазкейших популяций микроорганизмов, которые Формировались на протяжения длительного периода эволюции. Биоценозы океана, как древнейшие на земле, включают особые, иногда лишь им присущие таксоны микроорганизмов. Биологические особенности микрофлоры многих морских гидообионтов до настоящего времени изучена крайне слабо.

Разрозненные публикации, касающиеся симбионтных гетеротрофных микроорганизмов, не дают целостной картины об их систематическом положении, биохимической активности,-функциях в организме хозяина, их трофических, энергетических, пространственных взаимоотношениях.

Двустворчатый моллюск CrenowytHuB erayanus широко распространен в птбреяной полосе Японского моря, заселяя разнообразные природные и антропогенные субстрата. Способ литания животных, как активных Фильтратеdoв морской среды, способствует формированию у мидий уникальных микробных сообществ, обладающих активными ферментативными системами.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа была предпринята с цель» дать максимально полную экологическую, морфологическую, физколого-бнсхимическуя, биотехнологическую характеристику аэробных к факультативно анаэробных гетеротрофных микроорганизмов мидии ' Crenomytij.ua groyanua с помощью ■■■ ' . унифицированных методов. Для реализации этой цели необходимо было решить следующие задачи;

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЛУ'}:-ДЯ С.-;ЗЛИОТЕКА ч>*;. г ^л.скакадемии

I.Описать сезонную динамику численности микроорганизмов в течение теплых месяцев года,

2,Выявить закономерности распространения отдельны* таксономичес ких групп микроорганизмов в различных анатомических тканях моллюска и 1» окружающей морской воде,

3,Исследовать способность бактерий-дссоциангов и микроорганизмов морской «оды синтезировать ряд гидролитических ферментов, рас-ыеглпкщих природные лонимеры.

4.Выяснить возможности ассоциативной микрофлоры мидии сгепсту-tilus егоуэпиз к синтезу антимикробных, противоопухолевых, цито-токсических и других физиологически активных соединений.

5.Провести отбор среди изученных микроорганизмов продуцентов физиологически активных веществ, перспективных для биотехнологии.

Наууная_ новизна. Впервые установлено таксономическое положение и охарактеризована в игроком плане ферментативная активность микроорганизмов, населяюцих ткани мидии Crvnoniytiius егеугшиз , а также морскую воду - среду обитания моллюска. Показано, что микроорганиз— ш, населящг'е различные анатомические ткани мидии, превосходят по своей численности) таксономическому разнообразию, ферментативной и антибиотической активности микроорганизмы морской воды. Из штамма МИКрООрГаКИЗМ£-агСОЦИанта МИДИИ Altorcmonas ir.aclecdii получена л охарактеризована щелочная фосфатача с активностью<5 олее 5000 единиц на I мг белка, установлена зависимость биосинтеза фермента от присутствия в среде морской воды или ионов Na+. Из этого же продуцента пццелена инвуцированная^-1-З-глюканаэа, впервые найденная у морских бактерий.Получены новые данные о жнрнокислотнок составе микроорганизмов рода Alfceroiiones.

Теоретическая значимость.Изучение систематического положения морских микроорганизмов-ассоциантов и их способности синтезировать физиологически активные вещества может дать фундаментальную информации о роли ассоциативной микрофлеры в жизнедеятельности гедробионт онтов и в конечном счете, - функционировании морских экосистем.

Практическая ценноеть.Получение данные характеризуют биологию промыслового моллюска Crenonytilus grayanun , а выделенные из него штаммы - продуценты щелочной фосфатазы, ^-I-3-глюканазы - представляют ценность как объекты биотехнологии.Разработанные экспресс«методы для определения активности хитиназ и щелочных фосфятаэ .могут быть использованы в лабораторных исследованиях.

s

Aivgptizpy.x та Доты. Материала диссертации были ттоедставлены на ХУ Всесоизной коррекции "Биосинтез Ферментов микроорганизмами" (Тасхеет, ISS8), на I Всесоазкой вхоле-конЬерендаи "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии" (Алушта, 1990).

Публикации. По теме диссертации огубдиковано 7 работ и одно авторсхое свидетельство,

Объект работы. Диссертация состоит из 8 глав, включая обзор литературы и експериментальну» часть, заключения и выводов. Ока изложена на 160 страницах маиинолисного текста, включает 26 таблиц и 18 рисунков. Список ллтеватуш содержит 183 наименования.

С0ДЕЕШИ2 РАЕОИ ГЛАВА 2. Материалы и метода исследований

і Объектом исследования слугоии атаммы бактерий, выделенные наш из различных анатомических частей дальневосточного двустворчатого моллюска - мидии Creaoeytilua erayanua, и микроорганизмы, выделенные из роды в местах обитания животных.

Исследования проводил» с конца апреля по сентябрь включительно в I96&-I989 гг. на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО АН СССР. Мидии и ыосску» воду отбирали в бухте Тооиса залива Петра Великого Японского моря на глубинах 3-9 метров. Выделение бактерий проводили путем лисам на плотные питательные среда - глокозо-яептонну» с дрожжевым екстрактом (I), предложенную японскими авторами (Vouebinizu, Кіии-

1976) и модифицированную нами, и среду Горбенко (ti) (Горбенко, 1961) (г/л): сухой рыбопептонный'питательный агар (гидролиза* кильки) - 5,морская вода - 1000 мл, рН - 7,5.

Общее количество микроорганизмов определяли методом зпяЬлуо-ресцентной микроскопия (фяуорохоом - йиуооескамин, Serva). Выделанные 450 лтаммов бактерий были идентифицированы до рода (некоторые штамма довида) согласно Определители бактерий Берги, таксономической схеме для морских грамотрицателыых бактерий Оливера (Oliver, 1982) и некоторых других работ по систематике микроорганизмов (Нестеренко и др., 1935, Etwra, Sakal, 1970).

Наряду с выделенными нами морскими микроорганизмами исследовались типовые штаммы: Alteromonas maoleodll АТСС 27126, Vibrio fluvialls AQ 0002.

Методы изучения Экологических свойств бактерий. У бактерий . исследовали окшсху по Грану, характер подвижности, способность к аэробной и анаэробной ферментации глюкозы на модифицированной для морских бактерий среда Хью-Лейфсока (Lei fa on, 3963).

Способность бактерий к синтезу пигментов изучали на среде Кинга(К1п£ et al. , 1954).

Для обнаружение делто-эеленого флуоресцирующего пигмента использовали среду Шцуха и Комагата (Iianka.Komagata , IS63).

Двя постановки оксдаэной реакции по Ковачу использовали приготовленный ex tcapare 1% водный раствор солянокислого диметил- ' парафениленди амина.

Способность бактерий х денитрификации изучали на среде Гаузе I {Гаузе, 1958) с глицерином и 155 кно^ под слоен голодного агара.

Гидролиз желатина, крахмала, твин&-80 изучали общепринятыми методами (Blazeviо, Ededer, 1975).

Наличие внеклеточных нуклеаэ определяли по ускоренному методу Смята с соавторши (saith #t si., 1969) с использованием хроыоген-шх субссретов: метилового зеленого и толуидиног.ого синего.

' Хитинаэну» активность определяли параллельно двумя методами: "чашечным" (с коллоидным хитином в голодном агаре) и "ускоренным", используя в качестве субстрата п -нитрофенил-íf -ацетил-^ -D-глюяоэа-ьтиид. Планшеты с культурами и субстратом инкубировали лрк комнатной температуре до 24 часов. При положительном результате развивалась желтая окраска, интенсивность которой оценивали по трехбалльной шкале, •

Активность щелочной фоофатаэы ДО) определяли по количеству образующегося в процессе ферментативной реакции п-нитрофенола при использовании в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата динатриевой соли (ШЕФ). i

Активность р -1,3-глюханаза определяли по возрастанию содержания восстанавливающих Сахаров,

Метопы изучения антибиотических; свойств бактерий* Антагонизм бактерий изучали "методами штрихов" и "методом агаровых блоков" по отношения К тест-микробам: Staphylococcus aureus Bacillus

eubtilie, Candida albicans. Pa»udomo»aa'aeruginosa, Escherichia' coli, Proteus vulgaris, Peniolllium nigulosum. при температуре, оптимальной для роста тест—организмов.

Цитотоксичность цультуральных жвдкостей и их экстрактов изуча-

ли, добавляя их к суспензиям клеток Эрлиха, лиыфацитов или эритроцитов в мккроялеЙтах.Киэнэспособность клеток определяли в помощью 0»5i растзора трипанового синего.

Гемолитическая активность препаратов оценивалось качественно по способности вызывать гемолиз эритроцитов.

С целью оптимизации состава питательной среды для выращивания-штампа-продуцента щелочной фосфатазы были составлены матрица планирования полного факторного эксперимента по трем и четырем фаято-, рам, варьируемым на двух уровнях (Максимов, Егоров, 1969).

ГЛАВА 3, Таксономические исследования штаммов-ассоциантов мидии и сроды ее обитания.

Общая численность микроорганизмов, выделенных из воды в местах обитания мидий, измеренная методом эпифлуоресцентной микроскопии, колебалась от 2,3"Ю3 до 4,8*10" кл/мл.

Число гетероггрофов, определенное прямим высевом, было в наших опытах на один-два порядка ниже, чем при микроскопическом методе изучения.Более высокие показатели общего числа бактерий, полученные прямыми микроскопическими методами, свидетельствуют о том, что лишь некоторая часть гетеротрофных бактерий морских экосистем может расти на искусственных питательных средах.

Полученные данные свидетельствукт о том, что общая численность микроорганизмов, выделенных из морской веда, увеличивалась о апреля по сентябрь .А налогичная закономерность была свойственна и для микроорганизмов, ассоциированных с целошчесхой жидкостью, мантией к желудком мидий, однако у них наблюдалось более резкое нарастание к максимальной величине - 10е кл/кл в сентябре {табл.1).

Общее количество микроорганизмов, выделенное из различнчх анатомических частей мидии, существенно превосходило их количество в морской веде {табл.1).

Так, поданным эп»флуоресцентной микроскопии, на.протяжении сентября обцее количество микроорганизмов, выделенных из мантии, превосходило их.численность в морокой воде в 1,1 - 4,3 раза. Более многочисленным было микробное население желудю и целоми-' ческой жидкости мидии.

Таблица I*

Общая численность микроорганизмов мидии я морской вода, определенная методом епифлуоре ецентной микроскопии и прямым ваее-воы на питательные среды

Количество микроорганизмов кл/ид, кл/г,

_определенное?

метолом эпкфлуорео- методом высева на центной микроскопии среды _I_П

Морская вода: апрель ишь июль сентябрь 3.0.I03 1,2.10® 1,0.I07 4.8.I07 х.г-ю2 3,2-Ю4 I.o.I06 3,8*10® 1,0.10й 2,8.I0j 1,0.Ю5 I,0*I06

М » I И К! Целомическая жидкость - апрель кюнъ июль сентябрь 8.I.I03 9,6*10 1,1.Ю7 2,0*1С? 7,6* I02 1,5*10® 4,0.10® 1,0*107 2,3'Ю2 6,0'I02 4,0*10® 2,0*10®

Мантия: апрель •ТлЖЬ ишь сентябрь 3.5.I03 4,8.10® 6.0.I07 2,1'ltr . 9,1.I02 2,0.10® 5,0-10® 3,8-Ю7 5,7* Г02 3,2.1с4 1,0*10® 3,5.10^

К е л у д о К1 апрель июнь июль сентябрь 2,3-Ю5 8,0-Ю5 2,2-I07 i.e.icP 7,4. IÖ2 1,9.10® 6,0*10® 2,0-Ю7 5,0-Ю2 1,5'Ю4 3,4*10® 2,0*10®

Полученные данные позволяв» предположить наличке у Сг«по«чг*1-1ив кгауааиэ автохтонной михро$лоры.

Задачей наших дальнейикх исследований выло изучение биологи* ческкх свойств выделенных микроорганизмов и их идентификация до рода или семейства.

Кэоляты из морской води Сияя в большинстве съоем неферм актирующими грамотрицательными, оксидазоположительными, подвитыми палочками, относящимися к родам ?а«иаотм1ав-л1*аго1попав. Довольно часто вадедялись бактерии родов -Ао1п«гоЪас Ь*г-Ыогл«11а, в наиболее теплые периоды года возрастало количество грамотрицательных ферментирующих бактерий семейства 1Г1Ъг1опаве«а,

Бактерии, ассоциированные с различными анатомическими частями мидии, отличались большим видовым разнообразием. Наряду с представителями родов Рв еиа отодаа-а егоэюави здесь присутствовал» вибрионы, энтеробактерки, бациллы» ажтиномицеты, дремот. Максимальное количество микроорганизмов было выделено нами из целомичесхой жидкости. Преобладали вибрионы (29,9?), ?е еи(1 отопав-А егокопаа (17,^). Эти же группа бактерий доминировали в мантии и желудке, а штаммы ВесШиа в желудке составляли максимальное количество - до 30,6^ (табл.2). 10,иэолятов не удалось идентифицировать используемыми методами.

Таблица 2.

Таксономическое положение свободноживуцих микроорганизмов, выделенных из морской вода,и бактерий-ассоциактоа мидии

Род или семейство Морская вода Целоки-ческая жилгость Мантия Келудок

Раеийотопаэ- ' 29*(зз,о)** 30(17,9) 12(11,5) 10(10,2)

АЗЛеготопаа

26 (30,21 50(29,9) 24(23,0) 25(25,5)

А«гошопаа а (2,з) 2(1,2) К0.9) 1(1,0)

Ас1п«*ОЪвОгвГ-

' КогймИа 5 (5,6) 5(2,2) 7(6,7) 1(1,0)

Р1а уоЪа с 1; «г1ит 10 (11,6) 10(6,9) 9(6,7) 5(5,1)

Еп1:егоЪае1«г 0 7(4,2) 6(5,6) 5(5,1)

Вас111из 8 (9,3) а(12,5) 17(16,3) 30(30,6)

Актиномицеты;

1((1,1) 12(7,1) 6(5,8) 3(5,7)

С огупвЪао* «г1мт

Н1сгосоосиз 3(3,4) И(б,6) 10(9,6) 10(10,2)

Продолжение таблицы 2.

Род или семейство Морская вода Целоми- ческая ртдкость Наития Келудок

б^ргоцуеев 0 2(1,2) 1(0,9) 2(2,0)

Дрсяаси 0 10(5,9) 5(4,8) 0

Не идентифицированы 2(2,3) 7(4,2) 6(5,8) 6(6,1)

Всего изучено штаммов 86 167 104 96

Примечание: * - число иаолятов,

** - процент от общего числа выделенных штаммов.

ГЛАВА 4. Физиологические особенности микробных популяций

мидии.

ГЧщрр лирические бешенты. В таблице 3 представлена сведение о наличии у исследуемых микроорганизмов ферментов, гидролизущих три наиболее важных класса соединений: белки (желатиназы), жиры (липазы), углеводссдержащие субстраты (амилазы).

Из таблиц» вддно, что наиболее активными продуцентами гидро-лаз были микроорганизмы РОДОВ ТПЪзЛо, ВаоШиа, Рввц«отопав-А1Лего-гаопаа,

Таблица 3.

Гидролитическая активность микроорганизмов различных систематических груш, выделенных из мидии

Число * Наличие гидролитических фер-

нзучегашх' ментов

штаммов Липазы Амилазы Протеи-наэы

Ра«иёооопа8-

А^еголопаа 81 39 (48)* 16 (19,7) 12 (14,8)

У1ЬтЛо 125 44 (35,2) 50 (40) 21 (16,6)

Авготонаа 6 I (16,6) " I (16.6) 0 ,

Еп * ег оЪа с 1 ег 18 а (И) I (5,5) 0

34 7 (38,7) 6 (17,6) 0

Бас1Х1иэ те 25 (34,7) 13 (17,3) 22 (29,3)

Шегососсив 34 7 (20,6) 10 (29,4) 6 ■

Коринеформы 22 7 (31,6) 5 (22,7) I (4,5)

Дроажк 16 6 (40) I (6,6) 3 (20)

Примечание: * - процент активных итанмов.

Обширной группой продуцентов амилолитических ферментов явились

вибрионы. Способностью к гидролизу твина-60 обладали от II до 4656 представителей различных таксономических групп, среди них наиболее активными липодитиками были бактерии группы РнеиЛото-ваа-А1гвгопопаа . Активный вклад в гидролиз белковых субстратов среди микроорганизмев-ассоциантов мидии вносят бациллы (29,3^5 активных продуцентов протеаэ). У исследованных штаммов энтеробактеров, микрококков мы не выявили ферментов, гидролизу»-щах желатин.

Продуценты амилаз, желатиназ, липаз чаще обнаруживались среди микроорганизмов-ассоциантов мидии, чем среди штаммов, выделенных из морской воды. Более того среди представителей одних И тех же таксонов, выделенных из среда обитания и тканей мидии, последние проявляли более высокую ферментативную активность, Нежно предположить, что »та активность симбионтных бактерий дополняет функции органов и тканей макроорганизма-гидробионта.

Сезонность образования гидролитических Ферментов микробным сообпеством мидии. С.егауапиа обитает на небольших глубинах, где температура воды достигает максимальных значений в августе-сентябре. Именно этот период характеризует максимальную пищевую метаболическую активность моллюска.

Из диаграммы, представленной на рис.1, видно, что среди микроорганизмов группы Рвви<1опопаз-А1*вгою(маав, населяодкх ткани мидии, формы, обладающие максимальной амилолитичесхой, липополити-ческой, протеолитической активностью, преобладали в июне. Видимо, ети условия были благоприятными для развития психрофильных видов рассматриваемой группы. Гидролитически активные вида васИХив ВРР., преобладали в июне-июле и в несколько меньшей степени -в сентябре. В то же время максимум распространения активных продуцентов гидролаз среди вибрионов приходится на июль-сентябрь -наиболее теплые месяцы. Создается впечатление, что динамика втих популяция, сменяющих одна другу» в тканях моллюска в различные сезоны, также является результатом оволюции и обеспечивает оптимальные условия жизнедеятельности как для ассоциативной микрофлоры моллюска, так и для самого животного-гидробионта.

jajaiLl—cl

n

п п to

протеси»«

я

УII IX

і? її

piil,

УІ1 IX

і

IX

ЇУ її ЇІІ IX

Рис. 1. Дитлиіи удельного eeee (і І> оиполиитчее»*, «лияота-

ткчеекя я протвэллмчеекм мтнены* мирраоргщиэиов.

Е3553" Vibrio СІП]* I'ie'uiioMOM- G33- AautUu»

ALterQmcn**

і осн ординат -1

мо ооя авснжи) - месяца: ІЇ - апрель, У1 - июнь,

' УН - июль, IX - седаяСи».

Ферменты углеводного оомана.,КйсУ№тоя не. то, что хитинапы играют ввжнейагую роль в экологии многих морских бактерий.Микроорган« ниэда-асооци&нты мидии, выделанные из желудка, не обладали хнгл~ наэами. В то же время свободу охи вущие бактерии, в особенности рпе представители Vitirto spp. ,изолированные из морской вода, показали высокий уровень ферментативной активности. Эти данные согласуются О недавней работой (Wayasieb.Saaoter ,1907) о роли бактерий в хкткнаакей и хмтсби&зной активностях желудочно-кишечного тракт« американской устрицы. Авторы показали, что названный ферменти сАмостоятально синтезируются в х русталике

моллска и, таким образом, бактериальные хитиназы не нужны животному-хозяину.

В то же время преобладание в морской вода (но не в тканях ми-' дим) штаммов микроорганизмов» синтезирующих хитиназы, является экологически целесообразным и обеспечивает деградацию хитина - этого широко распространенного в Мировом океане органического материала.■

Распространение щелочных йосбтгаз.У морских микроорганизмов It^t по сути не изучены, еще менее известно об их распространении у бактерий, ассоциированных с двустворчатыми моллюсками.

Из морской воды - среди обитания мидии - продуценты ЩФ Практически не выделялись ( исключение составили несколько штаммов Vibrio spp. u Pseudomonas spp. в июле). Продуценты фермента в основном ассоциировались с различными органами моллюсков.

Наиболее активно продуцировали ЩФ штаммы, выделенные из целомической жидкости на протяжении всех месяцев эксперимента, из желудка - в июле. Pun авторов (Varuto, Раtil, , 1971) связывают высокую активность ЩФ в мантии с роль» фосфатазных ферментов в процессах образования раковины, в желудке с увеличением пищевой метаболической активности в теплые месяцы года. Вероятно, этими же причинами обусловливается фосфатаэиая активность у наших штампов, изолированных из мантии» целомической жидкости и желудка.

В таксономическом отношении наиболее активными продуцентами. ' Щ<Е сказались представители семейств Vibrionaceae, Pseudonona-daceaa и рода Baeill-us (РИС.2).

Тем не менее Pseudomonas u Bacillus были более активны весной, бактерии родов Vibrio, Enterobacter - в более теплые месяцыÍ

Наиболее высокая активность Щ4 отмечена у бактерий, выделенных из целомической жидкости и желудка и преимущественно принадлежащих к родам vibrio, Басilia» (около ЗОЇ активных штаммов от есех изолятов).Pseudomonas , Enterobacter (20Í и 15%, соответ-

ственно) .

Нуклеазная активность микроорганизмов значительно варьировала в зависимости от систематического положения микроорганизма. Например, 27,5Ä представителей рода Vibrio, синтезировали ДНКаэы, а 8,7* - РНКазні 1Ъ% исследованных штаммов Bacillus spp. продуцировали' ЩКаэы, 25Ї - РНКазы.Шталы дрожжей, выделенные ранним летом, ока-' залис» активными продуцентами ДГИаэ.Микроорганизмы, отнеоеннь>е к другим таксонам» не обладали: «уклвазной едтивнодтью.

Vibrio

ш

tíftCillu*

0

ш d ra D _

Kicroeoí=u. Коринефор»« Дроин

Рис. 2. Распространение продуценте» целочшх poetara;) н

реЗЛИЧ№* групли WHItpOOpTUIrtMOl, ДОДОеННЫХ ИЗ МЛД'ЛИ.

Сеетдне стоив**» - cymapioe чцело пани» отдельных таксокоин-иескик групп; эавггросо ванные - число длимое, покаэАмих яктмв-моеть е втк* группах.

Синтез антибиотиков и других биологическиа^тивных^ роеди-нений. Результаты изучения антагонистических свойств выделендах микроорганизмов представлены в таблице 4. Наиболее активными антагонистами грамположителькых бактерий были штаммы Beolllus эрр. - около 5056 всех исследованных культур этого рода ннгибировали рост стафиллококков и бацилл, им уступали штаммы Vibrio врр. и ПатоЬаоX erlum . Значительно слабее антагонистические свойства

были выражены против грамотрицательных микроорганизмов. Этой ОСОбеННОСТЬЮ Обладали единичные ШШ1МЫ роДОВ стопа»-АИего-

аопав (8,5£ антагонистов). Среди представителей почти всех таксономических групп бактерий были обнаружены антагонисты патогенны* дрожжей.

Таблица 4.

Антагонистические свойства микроорганизмов, выделенных из различных анатомических тканей мидии и морской воды

Всего % штаммов. актианых*в отношении: Систематическое изуче- staphy- Beeil- Each»- Prot»- Candida

положение но штаммов loeoc- CUfl iU- reus lus mibtills richia coll ue vulgar! a albicans

Tibjpio 125 15,2 6,4 4 2,4 16,0

Pseudomonas Alteromonas 81 2,5 8,6 16,1 0

Bacillus ' 75 45,9 39,2 1,4 5,6 12,8

Enterobacter 18 11,0 5,5 5,5 0 ie,6

FlavObac t erium 34 17,4 17,4 0 e 17,4

Aeromonas 6 . 0 0 0 0 83,0

Micrococcus 34 5,6 0 0 0 2,9

Cor™ebacterlum-Arthrobacter 22 9,1 4,5 . 4.5 4,5 0

Дрожки 14 21,0 0 7.0 ' С ■ ' 0

* - активными считались штаммы, если зона ингибирования роста тест-организма больше 1,5 см и более.

Антагонистические свойства были сильнее выражены у штаммов бактерий - ассоциантов мидии, чем у штаммов, выделенных и» морской вода. Бутанольные экстракты куиьтуральшх жидкостей отобранных штаммов-продуцентов обладали, нараду с антимикробными, цито-токсичзскнми и гемолитическими свойствами.

Полученные данные свидетельствуют о том, что микроорганизмы, ассоциированные с мидией СгеаощуЗДЦиа егауапид, обладают мощным биосинтетическям потенциалом, включающим как комплекс ферментов, гидролизующих природные полимеры, так и синтез антибиотиков я токсинов. Изученные свойства микробной ассоциации, сложившейся в процессе длительной эволюции, выгодны для оргакизыа-гядробионта и позволяют рассматривать ассоциативную микрофлору мидии сгеаоту«-

lue grayaaua кан перспективный источник получения продуцентов новых физиологических соединений.

ГЛАВА S. Штамм Alt«on»onas naclcodil 40 ко - продуцент щелочной фосфатазы

Штамм KJ.SJ-162 (40 MC) был отобран по признаку наибольшей удельной фосфатазной активности по п-нитрофенилфоо^ату. из 450 штаммов различных морских микроорганизмов.

По своим важнейшим свойствам штамм <40 MC хорошо укладывается в диагноз морского вида Alteromonas macleodit и обнаруживает -значительное феноткпическое сходство с типовым штаммов этого вида. Некоторые отличия наблюдаются вГЦ-содержании ДЖ (38,6 и 44,2 соответственно). Значительный интерес представляет жирнокислотный состав штамма 40 MC (табл.5), в частности набор 3-оксикислот -

Таблица 5.

Жиряокислотный состав клеток штамма

Штамм Жирные кислоты. %

10:0 £11:0 11:0 12:0 112:0 12:0 13:0 13:0 14:0 14:1 -ЗОН 2:011 -ЗОН -ЗОН -ЗОН

40 Ю 2.7ЕЗ 0.31 1.82 1.67 3.02 7.22 0.31 0.43 1:1 0.39

Штамм Жирные кислоты, %

15:0 15:1 15:0 16:0 16:1 17.0 117:1 17:1 18:0 18:1 X -ЗОН

40 MC 3.7 1.87 0.52 21.3926^38 3.86 7.32 1.73 6.27 7.67 0.24

- важных таксономических маркеров, характерных компонентов липи-да А. Как видно из таблицы, липид А. табеса 11 содержит 5 различных оксикислот, в том числе и изораэветвленные, содержащие от 10. до 15 атомов углерода.

ГЛАВА 6. Условия биосинтеза, выделение и характеристика

щелочной фосфатазы ИЗ А1геготопаз тао1ео£1±'40 КС

Перспектива широкого использования в лабораторной практике и медицине пел очно Я фосфатазы, продуцируемой штаммом КММ-162 (40 МС), диктовала необходимость получения высокоактивного препарата фермента и упрощение его технологии. С этой цель» была проведена оптимизация питательной среда с использованием метода математнчвй-

кого планирования експерименте, что позволило повысить \*г.. ферментативную активность приблизительно в б раз (с 5 до ЭО единиц ва мг белка).

Для получения щелочной фосфатовы штамм-продуцент выращивали на питательной среде, отделяли биомассу от культуралъноЯ яцдкоети

0 последутщим выделением целевого продукта водной экстракцией ыик-робных клеток, Сйрой ферментативный препарат подвергали двуетадий-кой очистке: сначала ионообменной хроматографией на анионообмен-нике, затем гидрофобной хроматографией с проведением инактивации примесных активностей сопутствующих ферментов между стадиями очистки.

Проведенные исследования позволили очистить щелочную фосфатазу в 1075 раз. Фермент с удельной активность» 6000-6700 ед/мр белка свободен от чуклеазных примесей и по данным ДШ-злектрофореза представляет собой гомогенный препарат и состоит из двух идентичных полипептидных цепей, молекулярный вес каждой из которых равен 45000 Д. Щелочная фосфатаза 40 МС проявляет активность в широком диапазоне рН 7,5-11,0 с максимумом при рН 9,5-9,6 в присутствии

1 мМ МЄС12 •

Инкубация фермента в течение 15 мин в интервале температур от 25° до 60°С практически не снижает фоофатазную активность.

В таблице 6 приведены сравнительные данные дня штамма 40 НС ' и описанного в литературе продуцента щелочной фосфатази - антарктической морской бактерии НК 47 (КоЪог! «ї «і ., 1984) .

Таблица 6.

Характеристика штамма антарктической морской бактерии НК 47 и штамма АНгеговопаа шасісоАіі 40 МС по продукции щелочной фоофатааы

Продуктивность штамма по Штамм антаркти- Штамм белку и ферментативной ческой морской жтеїеоаіі

Количество сырого белка на 1л культуральной жидкости,мг Удельная активность, ед/мг -белка/мин 22 5,6 120 6,5-7,1

Общая активность (продуктивность), единицы активности на I л культуры 123 780-650

Штамм Аііеготопаа таоїеоііі КЫ.!-40 КС - рысОКОахТиВКЫЯ продуцент щелочной фосфатази - защитен авторским свидетельством М489162»

Сермент в активностью 4000 и более единиц на I мг белка изготовляется небольшими партиями в Тихоокеанском институте биоорганической химии дао АН СССР и реализуется по заявкам научно-исследовательских учреждений как внутри страны, так и за свободноконвертируемую валюту.

ГЛАВА 7. йедуцированная £-1,3-глюканаза из А11егогг.опав

тао1«ойII

В процессе изучения биосинтеза Мелочной фосфатазы штаммом А» пас 1 войн 40 КС в ряде экспериментов в питательную среду вносили в качестве источника углерода полисахариды морского лроисхояще-ния: ламинарии (^-1,3-глхжан) и пустулан (£-1,3-глюкан). При внесении в среду ламикарина биосинтез щелочной фосфатаэы возрастал в 15-16 раз.

Анализ биомассы и культуральной жидкости показал, что в этих условиях штамм продуцирует еще и^-1,3-глюканазу - фермент, рас-. щепляшиЯ £ -1,3-связи в ламинарине и смешанных глюканах. Этот фермент, близкий по свойствам и типу действия эцдо-^-1,3-глюканазам -пищеварительным ферментам морских беспозвоночных, выделен из морского микроорганизма впервые. Можно предположить, что симбионтные микроорганизмы, способные продуцировать -I,3-глюканазу, могут принимать участие в усвоении моллюском продуктов питания,

ВЫВОДЫ

1. Изучена сезонная динамика общей численности микроорганизмов в различных анатомических частях мидии С.егауапив и морской веде - среде обитания моллюсков. При определении методами впифлуо-ресцентной микроскопии и посева на агаризованныо среды число микроорганизмов в морской воде возрастало с апреля по сентябрь с 10? до 10 кл/мл и с 102 до 10& кл/мл.соответственно. Общее количество микроорганизмов, выявленное в мантии, желудке и целомической жидкости мидии существенно превосходило таковое в морской воде и также возрастало с апреля по сентябрь, достигая 10е кя/р ткани,

2. Среди 450 штаммов микроорганизмов, выделенных из морской воды и тканей мидии, преобладали представители родов У1Ъг1о-Им»о-

Ьа^еПит, Ра виЛотопав-А1геготопеа и ВасШиз, им уступали ПО численности знтеробактерии, флавобактерии, роды Аеговопаа, АеШе-*оЬв°г'г, Ногами» ( актиномицеты и дрояжи, включая более широкий спектр микроорганизмов различных таксономических групп,чем микроорганизмы морской вода.

3. Продуцента гидролитических ферментов (амкяаэ, желатинаэ, липаз, да&з и ШКаз) чаще обнаруживались среди бактерий-ассоцаан-тов мидий, чем среди штаммов, выделенных из морской веда; при этом их ферментативная активность была выше. Наиболее активными продуцентами гидролаэ были штаммы Vibrio, Bacillus,Alteromonaа . Выявлена сезонность в преобладании в тканях мидии гидролитически активных форм микроорганизмов различных таксономических групп,

4, Штаммы микроорганизмов, синтезирующих хитиназы, преобладали в морской воде, но не в тканях мидии, что, по-видимому, связано с широким распространением хитинового материала в этой среде и с наличием у мидии самостоятельных ферментативных систем, гидролк-зущих хитин.

5. Установлена преимущественная локализация продуцентов щелочной фосфатазы среди микроорганизмов, населяющих ткани мидии, а также рост их активности в летние месяцы, что свидетельствует о сим-биотрефных отношениях между животными и исследуемыми микроорганизмами.

6, .Среди ассоциативной микрофлоры мадии отобран штамм Alteromonas macl«odii 40 КС - продуцент высокоактивной щелочной фосфатазы и индуцированной ,3-глюканазы. Последняя впервые выделена из морского микроорганизма. Максимальный выход и активность щелочной фосфатазы наблюдались на средах с ламинарином, для проявления активности фермента необходимы ионы Na+.

По материалам диссертации опубликовано;

. I. Потиввский Э.Г., Михайлов В.В,, Иванова Е.П,, Романенко Л.А, "Изучение бактериоплактона прибрежных и открытых вод Японского моря". Труды Д6НИИ, 1937, вып.131, с.21-24.

2. Михайлов В.В., Кочкин A.B., Иванова Е.П. "Сравнительное изучение микроорганизмов мидии". Микробиология. Т.57, вып.1, 1980, с Л 56-157.

3. Федосов D.B., Михайлов В.В., Жигалина И.И., Иванова Е.П., Сова В.В., Елякова Л.А., Рассказов В.А."Сравнительное изучение образования "щелочной фоофатазы культурой морской бактерии". Сб. "Биосинтез ферментов микроорганизмов". 1988. Ташкент. Иэд-во SAH.

4. Федосов C.B., Михайлов В.В., Яигалрна И.И., Иванова Е.П., Рассказов В.А., Езяков Г.Б. "Штамм А о Lue tobtet »г ер. 40 1ÍC - продуцент щелочной фосфатаэы и способ получения щелочной фосфатазы". А/С » I489162 от 27.04.I9C8.

го

5. Сова В.В., Светащева Т.Г.» Елякова Л.А., Иванова Е.П., Оедосов Ю.В, "Индуцированная^ -I, З-глюканаэа из морской бактерии 40 НС".Меед,сб. "Морская микробиология".1991, В.1, в печати.

6. Петров А.А., Иванова Е.П., Федосов О.В., Ких&Ялоа В.В. "Перспективный метод получения нукла оз вдов". Тез.докл. Всесоюзной конф."Биологически активные вещества морских гидробионтов',,ТИНРО, Вл-ток,сент. 1991.

7. Федосов В.В. ,Михайлов В.8., Жигалина И.И. > Иванова Е.П., Кожемяко В.Н., Рассказов В.А., Еляков Г.В."Высокоактивная щелочная фосфатаза из морской бактерии".ДАН, 1991, в печати.

Подписано » печать I5.II.Wr фори»* 60x0^/16 »1 »._™»£.Ч "»^тiíl^..ЙrJ'P!«^РО^Тя?т .3«к»? » Отпеч»т«мо ЦУСИІ К® "плолмвипроем" Г.КявВ ,С»*С«ГвЯЄ*ОГО ,]