Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидролитические ферменты морских бактерий, модифицирующие биополимеры

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические ферменты морских бактерий, модифицирующие биополимеры"

На правах рукописи

Балабанова Лариса Анатольевна

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ БИОПОЛИМЕРЫ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗОБДТЗО

ВЛАДИВОСТОК - 2007

003064730

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Рассказов В. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Костецкнй Э. Я.

кандидат химических наук Новикова О. Д.

Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 27 сентября 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ. Факс: (4232)31-40-50. E-mail: science'fi'nihoc.d vo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН), с авторефератом - на сайте http://wvvw.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «» CiLtuc/)iCi 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н

Прокопенко Г. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Морские микроорганизмы являются основными поставщиками жизненно важных органических соединений в сложнейшей экосистеме Мирового океана благодаря экспрессии целого спектра уникальных ферментов, включая гидролазы, модифицирующие биополимеры. При этом существует дополнительный механизм индукции таких ферментов, зависящий от внешних факторов: стехиометрического состава C:N:P окружающей среды, глубины, температуры, а также фактической потребности других жителей сообщества. Особое строение функционально значимых участков белковых молекул таких ферментов легло в основу механизма адаптации морских микроорганизмов к условиям обитания, что привело в процессе эволюции к уменьшению количества межмолекулярных и внутримолекулярных связей. Такая стратегия позволила увеличить эффективность каталитической реакции за счет увеличения числа оборотов активных центров ферментов. На сегодняшний день изучено большое количество гидролаз наземных бактерий. Данные о структурах и функциях ферментов из морских объектов практически отсутствуют. Однако уже имеющиеся сведения указывают на преимущества ферментов морского происхождения, такие как высокая активность, низкий температурный оптимум, отсутствие примесей, устойчивость к химическим модификациям и длительному хранению. Так, щелочные фосфатазы (ЩФ) из морских арктических бактерий НК-47 и ТАВ5 (Kobori et al.,1984; Riña et al.,2000) отличаются от своих аналогов из наземных бактерий термолабильностью, поэтому легко выводятся из реакции дефосфорилирования нуклеиновых кислот (НК). Большой научно-практический интерес представляют и гликозидазы, широко используемые при исследовании антигенной структуры различных биологических объектов, в том числе клеток крови. Тем не менее на сегодняшний день среди известных бактерий наземного происхождения пока не выявлено подходящих продуцентов а-галактозидаз (а-гал), которые бы модифицировали эритроциты с различной групповой специфичностью и превращали их в эритроциты 0(1)-группы крови. Широкие возможности использования уникальных свойств ферментов морских микроорганизмов для целей биотехнологии и медицины определяют необходимость исследования их молекулярно-генетических характеристик и создания суперпродуцентов рекомбинантных белков.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке общего подхода к установлению структурно-функциональной организации и свойств молекул гидролаз морских бактерий, что необходимо для получения штаммов-продуцентов ценных рекомбинантных белков. Объектами исследования были выбраны гидролазы класса О-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, имеющие биотехнологическую ценность в

способности модифицировать биополимеры. В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести в морских бактериях скрининг гидролитических ферментов класса 0-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, модифицирующих соответственно полисахариды и нуклеиновые кислоты.

2. Выделить и изучить свойства а-гал из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701, катализирующей удаление групповой специфичности В(Ш)-группы крови человека.

3. Установить первичную структуру и построить теоретическую модель пространственной структуры а-гал из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701.

4. Выделить и изучить свойства ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.

5. Установить первичную структуру и построить теоретическую модель пространственной структуры ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.

6. Провести экспрессию ЩФ из морской бактерии Cobetia marina в клетках Escherichia coli. Научная новизна работы и научно-практическое значение. В работе впервые была получена информация о распределении и возможной роли ЩФ и гликозидаз морских бактерий в природе. Впервые были найдены и изучены ценные по своим физико-химическим свойствам гидролазы, модифицирующие биополимеры: а-гал Pseudoalteromonas sp. и ЩФ Cobetia marina. Впервые проведено клонирование структурных генов этих ферментов с использованием хромосомной ДНК, установлены и охарактеризованы их первичные и вторичные структуры. Впервые методом сравнительного моделирования получены и охарактеризованы теоретические модели пространственных структур а-гал Pseudoalteromonas sp. и ЩФ Cobetia marina. Впервые расчетными методами удалось осуществить совмещение третичных структур гликозидаз, принадлежащих к разным семействам (GH27 и GH36). На основании этих данных были сделаны предположения о функционально значимых участках в молекулах гидролаз и их роли в катализе. Впервые удалось экспрессировать в клетках Е. coli активную рекомбинантную ЩФ морской бактерии. Результаты этих исследований позволяют достичь конечной практической цели -применение ферментов морских бактерий и их рекомбинантных аналогов в создании жизненно и коммерчески важных биотехнологических продуктов, использующихся в медицине и генной инженерии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (2£5ссылок). Работа изложена на/££страницах, содержит 21 таблицу и 57 рисунков. Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 4-х международных конгрессах: 45th Arctic Sei. Conf. (Vladivostok, 1994); IX Pacific sei. Inter-

congr. «Sustainable development in the Pacific» (Taipei, 1998); Объед. междунар. науч. конф. (Казань, 2003); 31-st FEBS Congress "Molecules in health & disease" (Istanbul, 2006). По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи и 1 патент. Список сокращений: а-гал -а-галактозида, GH27 и GH36 - 0-гликозидгидролазы семейств 27 и 36, ЩФ -щелочная фосфатаза, НК -нуклеиновые кислоты, ДЭА -диэтаноламин, КД -спектр кругового дихроизма, а.о. -аминокислотный остаток, п.н. -пара нуклеотидов, ОРС -открытая рамка считывания для белка, Ме2+ - ионы двухвалентных металлов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий выделяли из морской воды, грунта, животных и водорослей, собранных во время экспедиционных рейсов НИС «Академик Опарин», а также на морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН в заливе Петра Великого Японского моря. Бактерии выращивали и идентифицировали с помощью общепринятых микробиологических методов (Williams & Wilkins, 1984). Определение гидролитической активности у микроорганизмов осуществляли по скорости гидролиза л-нитрофенилфосфата и п-нитрофенил-а-О-галактопиранозида на планшетах в соответствии с условиями проведения реакции для каждой гидролазы. N-концевую аминокислотную последовательность определяли на автоматическом секвенаторе белков Procise модели 492 ("Applied Biosystems", США) по программе производителя. Вторичную структуру белка определяли по спектру кругового дихроизма (КД) (Provencher & Glockner, 1981). Для определения эффективности действия а-гал на детерминанту В(Ш)-группы крови человека эритроциты отмывали физиологическим раствором и смешивали с раствором фермента в изотоническом 0,0 IM Na-фосфатном буфере (pH 7.3), после инкубации при 23°С отмывали 3 раза забуференным физиологическим раствором (pH 7.3), осаждали в течение 5 мин при 20°С 1000 об/мин. Осажденные эритроциты ресуспендировали в буфере и смешивали с сывороткой в сериях двойных разведений на планшетах. Через 1ч инкубации при комнатной температуре визуально производили считывание титра агглютинации.

Выделение геномной ДНК проводили фенольной экстракцией с использованием гуанидинизотиоцианата при pH 8,0. Гель-электрофорез ДНК, блоттинг по Саузерну, мечение 5'-концов EcoRI-фрагментов ДНК фага X с использованием ЩФ из Cobetia marina проводили по стандартным методикам (Sambrook et al., 1989). Амплификация специфических фрагментов на геномной ДНК проводили с вырожденными и ген-специфическими праймерами в амплификаторе «Eppendorf». Температура отжига праймеров рассчитывалась по формуле: (4GC+2AT)±5'C. Лигирование рестриктов ДНК в кольцо проводили в 150мкл инкубационной смеси, содержащей 50нг фрагментов ДНК, бмкл Т4ДНК-лигазы (Fermentas), и инкубировали 4ч при +6°С. Инвертированную ПЦР проводили в инкубационной смеси,

содержащей 5нг дотированных в кольцо рестриктов, ОДмкМ ген-специфических праймеров, 2,5мМ каждого дезоксинуклеотида, 1-2,5ед смеси ДНК-полимераз (Long PCR mix, «Fermentas»), Клонирование ДНК проводили с использованием InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit (Fermentas) согласно инструкции изготовителя. Трансформацию E.coli плазмидной ДНК проводили с использованием хлористого марганца (Hanahan, 1983). Выделение плазмидной ДНК из E.coli осуществляли методом щелочного лизиса (Мазин и др., 1990). Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера (Sambrook et al., 1989) на автоматическом анализаторе 310 (ABI PRISM, США). Экспрессию рекомбинантного белка проводили в клетках E.coli XL-Blue и BL21DE(+) с использованием вектора рЕТ22(Ь+) (Clontech, США) и гена, кодирующего белок морской бактерии, без собственной лидерной последовательности. Очистку рекомбинантного белка осуществляли методом афинной хроматографии на металлоафинной смоле TALON (Clontech, США).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программ GENERUNNER, CHROMAS. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью программы BLAST2 (http://\vww.ebi.ac.uk/blastaHA. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы ClustalWl.8 (http://www.cbi.ao.uk/chistalw/index.htm1'). Филогенетический анализ белков осуществляли с помощью программы Promlk (метод максимального правдоподобия с молекулярными часами) из пакета программ PHYLIP З.б (http://evolution.gs.w3shington.eda/phvlip.htmO. Статистическую надёжность узлов оценивали с использованием бутстреп-анализа (по 100 псевдореплик для каждого древа) (SEQBOOT, PHYLIP 3.6). Графические изображения построенных деревьев получали с помощью программ DRAW TREE и CONSENSUS (PHYLIP 3.6). Анализ возможной пространственной упаковки белка проводили на основании данных о первичной структуре с помощью серверов PHYRE (http://www.sbg-bio.i3. ac.uk/phvre/) и FUGUE (http://www-cryst.bioc.cam.nc.uk/~fugue/). Теоретические модели пространственных структур получали с помощью программы МОЕ (http://www.chcmcomp.com/) с использованием в качестве прототипов кристаллических структур известных белков (PDB; hlm:/7www.rcsb.org/pdb). Минимизацию энергии в вакууме полученных моделей проводили с помощью программы МОЕ (http://www.chemcomp.com/) и SPDBV (http://tw.expasy.org/spdbv/). Визуализацию и анализ теоретических структур молекул проводили с помощью программ Rasmol (Sayle & Milner-White, 1995), SPDBV, MOE и Molmol (Koradi et al., 1996). Определение ионоспецифичности металлосвязывающих сайтов в белке осуществляли методом создания статистических потенциалов для связывания различных белковых атомов с ионами двухвалентных металлов (Ме2+), используя структуры межатомных связей известных ЗО-структур. Потенциалы были рассчитаны с помощью

программы, разработанной на основе известного метода компьютерного конструирования структуры связи - MCRS (Monte Carlo Reference State) (McGreevy & Pusztai, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Скрининг гидролитической активности в морских бактериях и характеристика

штаммов

Штаммы-продуценты гидролитических ферментов были обнаружены почти во всех районах Мирового океана. Количество продуцентов зависело от источников выделения. Продуценты гидролаз встречались гораздо реже среди свободноживущих бактерий, чем среди штаммов, выделенных из морских животных. Доминирующими группами продуцентов а-гал были бактерии родов Pseudoalteromonas, Vibrio, Corynebacterium и Bacillus. От 20 до 75% псевдоалтеромонад, выделенных из проб грунта Охотского моря, животных, водорослей и воды Японского моря, продуцировали а-гал. Из большого количества продуцентов а-гал был выбран штамм бактерии рода Pseudoalteromonas (КММ701, ВКМ В-2135), который синтезировал высокоактивную внутриклеточную а-гал, способную катализировать отщепление углеводных компонент на поверхности эритроцитов крови группы В(Ш). Среди 200 штаммов-продуцентов ЩФ также доминировали бактерии, выделенные с поверхности морских животных и их внутренних органов. Они были представлены в основном микробными популяциями устриц, губок, голотурий, морского ежа и двустворчатых моллюсков, которые включали бактерии родов Aeromonas, Acinetobacter, Cytophaga-Flexibacter, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio. Наличием высокой исходной активности ЩФ отличался штамм КММ296 (ВКМ В-2021 Д), выделенный из целомической жидкости мидии Crenomytilus grayanus, который по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам был идентифицирован как бактерия рода Deleya (в дальнейшем Halomonas, теперь Cobetia) (Arahal et al., 2002). По нашему мнению, высокая частота встречаемости ассоциированных с мидиями штаммов, продуцирующих высокоактивные ЩФ, может указывать на наличие симбиотрофных отношений бактерий и моллюсков, при которых микробные ЩФ могут участвовать в росте и обновлении раковины моллюска.

2. Выделение и очистка а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701

В результате оптимизации схемы выделения а-гал из биомассы штамма Pseudoalteromonas sp.KMM701 был получен препарат фермента с удельной активностью 231ед./мг и высокой степенью очистки, что позволило провести определение N-концевой аминокислотной последовательности и вторичной структуры белка.

2.1. Молекулярные и ферментативные свойства а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701

Согласно результатам ДСН-электрофореза молекулярная масса а-гал составляет 80.5±2.5кДа,

тогда как по результатам гельфильтрации - 170+ЗкДа, что указывает на олигомерное строение функционально активного белка. В условиях ДСН-электрофореза исследуемый фермент мигрирует одним фронтом, что предполагает наличие двух идентичных субъединиц. Большинство известных а-гал обычно имеют тетраменую структуру (Halstead et al„ 2000; Kobayashi, 2001).

Помимо расщепления а-1,6-0-галактозидных связей а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 катализирует расщепление а-1,3- и а-1,4-гликозидных связей в олигосахаридах, таких как мелибиоза, дисахарид Galal,3Gal, а также удаление галактозы с невосстанавливающего конца трисахарида Galal,3(Fucal,2)Gal. Способность катализировать расщепление концевых а-1,3-галактозидных связей представляет особую ценность для гематологии, т.к. именно такой связью обладают концевые углеводные компоненты эритроцитов человека, определяющих группу крови. Гликозидазы с такой специфичностью встречаются в природе довольно редко - из литературных данных известно всего несколько примеров (Vosnidou et al., 1998; Varbanets et al., 2001). а-гал Pseudoalteromonas sp. KMM701 проявляет наиболее высокую активность при рН7.0-7.9, что выгодно отличает ее от других а-гал, используемых для трансфузии крови. На сегодняшний день для успешной ферментативной конверсии эритроцитов человека группы В(Ш) в группу 0(1) используется а-гал из зеленых зерен кофе (Kruskall et al., 2000; Olsson et al., 2004). Ho свойство этого фермента проявлять активность в кислой области рН создает проблемы с целостностью эритроцитов, инкубируемых в этих условиях. Процедура включает на первом этапе отмывание эритроцитов в Na-фосфат-цитратном буфере (рН5.5-5.6), в котором при 26°С в течение 2,25ч происходит ферментативное удаление групповых детерминант с помощью а-гал зерен кофе. После проведения реакции эритроциты вновь переводят в физиологический раствор (рН7.3-7.4). После таких манипуляций остается лишь 70-75% функционально пригодных эритроцитов. Несмотря на то, что бактериальные а-гал из наземных источников часто имеют нейтральный рН-оптимум, их использование для целей трансфузии крови ограничивает проблема токсичности и, как следствие, гемолиза эритроцитов (Kruskall et al., 2000). Следует отметить, что низкий температурный оптимум действия а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 также благоприятно влияет на жизнестойкость эритроцитов (20-22° С). При такой температуре фермент остается стабильным в течение более 24ч, однако инкубация фермента при 37'С в течение 10 мин приводит к полной потере активности. Кроме того, а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 обеспечивает более высокую по сравнению с аналогами эффективность ферментативного катализа за счет увеличения числа оборотов фермента, что характерно для психрофильных

ферментов (Hauksson et al., 2000). Так, число оборотов а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 (&а»=27800тт"1)в 3 раза превышает число оборотов а-гал Thermotoga neapolitana и почти в два раза - а-гал Phanerochaete chrysosporium (King et al., 1998; Brumer III et al., 1999). Обработка а-гал Pseudoalteromonas sp. KMM701 в количестве 0,24ед/мл суспензии 15-20% эритроцитов в растворе 0,9% NaCl (рН 7,3) в течение Зч при 20°С приводит к полной инактивации серологической активности эритроцитов В(Ш) -группы при отсутствии гемагглютинации и протеазной активности,, что во много раз превышает эффективность а-гал зерен кофе в оптимальных условиях.

2.2. Первичная и вторичная структуры а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701

Методами молекулярного клонирования в бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701 был обнаружен и выделен кодирующий участок гена а-гал, соответствующий ОРС для белка длиной 2130 п.н. и кодирующий полипептидную цепь из 710 а.о. (код DQ530422, GenBank). Отсутствие в аминокислотной последовательности сигнального пептида подтверждает внутриклеточную локализацию белка. Зрелая форма белка имеет расчетные Мг=80.050кДа и р/=5.6, что соответствует экспериментальным данным. N-концевая последовательность также совпадает с результатами химического анализа N-концевого пептида молекулы белка. Первичная структура а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 включает 44.13mol% пар G+C и характеризуется высоким содержание отрицательно заряженных и незаряженных полярных и неполярных а.о., таких как Leu (10.28%), Ser (7.89%), Val (7.04%), А1а(7.04%), Glu(6,90%).

Сравнительный анализ множества аминокислотных последовательностей гомологичных белков показал, что а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 принадлежит к GH36 и имеет 51% идентичности и 70% гомологии с ближайшим гомологом из океанической бактерии Pseudoalteromonas atlantica (Q15PJ9) (Рис.1). Каталитический домен а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 включает участок полипептидной цепи с 296 по 576 а.о. В целом, при выравнивании последовательностей GH27 и GH36 найдено очень небольшое количество идентичных а.о.. Внутри семейства GH36 также наблюдаются многочисленные аминокислотные замены, особенно в местах предполагаемой конформационной подвижности молекулы. Известно, что в молекулах холодоустойчивых ферментов в таких местах повышенное содержание Gly, тогда как у термостабильных ферментов молекула обладает более жесткой структурой, поскольку насыщена остатками Pro (Olufsen et al., 2005). Таким образом, самыми консервативными а.о. у всех представителей GH27 и GH36 остаются три каталитических остатка Asp в активном центре (Рис. 1). Недавнее исследование кристаллической структуры комплекса активного центра а-гал риса, относящейся к GH27, с D-галактозой позволило установить роль каждого Asp в катализе, где Aspl85 выступает в качестве сопряженной кислоты/основания, a Aspl30 действует как нуклеофил (Hart et al.,

2000: Fujimoto et al., 2003). Этим каталитическим остаткам в а-гал риса соответствуют Asp45 I и Asp519 в активном центре а-гал Pseudocdteromonas зр. КММ701 (Рис. I ).

221 sie

317 337 58 53

Т.maritima ------DHLVTRGDFSEVEEMEJWI AEH-BFIPGIWTAPFË V£ETSDVÍlffiЯсЙУУкЁм SSO

F. KMM 701 RaCELSY^m>ïi;XY|0 (^E WIDHVNSLQ^räl^FXFEMraPD SFIYRAIIDWVÏ.S S - 106

D TAGLGDWYVDKAFÏÏE GL 1 FVIEHVKAQQLEFSLWFE BEMVNPD SDL YRQHPEWVLGN - 106

DRAALGDWYTDEQKYPTTGLMPV1NHVKSLGMEFGIWVEipEKItfPD ¡jï}IiETRLffPDWILSM- 396

Cotise SrabicaRDSQG-NLVPKQSTFFEGIKALADY^GIMLKLOVYSDÀ------------*__________________96

HDSQG-NFVPUKQTFSSGIKMADYVriËKGLKLGIÏSDA--------------------— 96

F.atlantica S.coli

S jü jm. JO. л> H¿4

Г.marítima GSFKMAÏMIWBKKIÏ---ÍLUJI.SKDEVLHWblTILE'SSUaíMS----ÏHÏTKljFLFAG 331

F. KKM 701 -----........-EUïtEQLS FRNQtiVU3LTRS3 WEYIiYKAIDDILVEYPTJK¥IKW№1NRDI '.

t. atlántica ----------EVSKQllICKMÛLVMLSEPEVEEÏblEîaDSLLSE'iD-ISÏVKÂtJRDL 15 6

Я. coli ----------PGYSQ ET SRYQYVLM LH IPEÄFD Y IYKRFLWLLGE H P - VDfvKWHKblHE L 115

Coffee «rabiej-----------GTQTCSKQMPGSLßHEEQDAKTFASWGV----------DÎLKïÏhC---132

Kice -----------G-TeTCSXTMPG51J>HEEl2>VKTFASWG\'----------DKJfigNe---132

-&-т

JL

HI J

ti

T. mari tina F. КИМ 701 F, atlanfcica Ж. coli

AVPGERKKSÏTflaMBKG--IETIHKAVGEOSFILGÇGSPL------LPAVGCVDGAXI 303

HHAGNFD GKPAVHQÇÎLALYÏLL 1E R IKAAHEGLE IE S CE SGGARVD YGVLA11TDRVHTSD 516 NHQGNHS GKPGGHNÇ IHAVYRLLDÍCLÍlEAHfQVI^E SCñSGGGRJJJYGVLARTDRVÍiíTSD 516 VQAG-HEGRAAAI^TR2FYHI¿I)LLRERFPHVSiFSSCASGGGRIDFEVLKRTHKFÄASD 503 Cot£ee a^abicalONNISP-----KEF.YFI---MEf^LLKSGB.SIPFSLCEI-raDEDPATHA-raîVGHSVfKT- 182

Ri.ce

NDAGRSV-

-MERTraR—i MSHAMKTYGKHIFFBLCEHGKENPATWA-GRMGNEWRT- 182

№

Bs

T.majritima P. KMM 701 P. atlantica E. coli

H15

G BTTAPFWGEH IEDNGA-|штшп1 IRYFMHDRF-WLMD PDCL ILKEEKÏDLTQKE 112 ^^AlURLE I QRGC$ FFFÍf S S VMGAÍÍVG PRDCHITGRNVS lEMRAAVStlFGHMG IEMDFR 576

míAI^RCTIQRt^YFFPPEVMÍAHICiHRECHATFEQHEIAI^GLTALróm^LELDPV 5 61

Cot toe a rabí ca TfS IDDSWS SMT—£¡IÍADMHDKWASYA0--------EGGW-NDPDMLEV-ÓKGGMTTT-E 230

R±ce IGSIADNWGSMT — SEADENDQWAAYWÍ--------PGGW-HDPDMLEV-SNG®tSEA-E 230

i 4L — h m s . « nu --—^ï^S ^уьу i_i—^ £

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей каталитического домепа а-гал

Р.КММ701 (DQ530422) с каталитическими доменами а-гал P. ailantica (Q15lJJ9): Еcolí

(Р]6551| Т. marítima (Q33SÍ5); Coffe arabica (Q42656)\ Опт sativa (Riœ. Q9FXT4). A.o..

участвующие в катализе, обозначены черным цветом; идентичные а.о. -серым цветом.

Элементы вторичной структуры й-гал Т.marítima и риса представлены соответственно вверху

и внизу алай мента; (у) -гамма-повороты, (р) -бетта-по вороты, (Н) -ы-спи рал п. -бетта-

шгшльки, -связи между остатками Cys, strands -р-слои.

гнил —rvpkh гва;с swyhyfldltwe e tlknl------kuujfpfevfçiB

701 -QREKAR—PMKYHTiiE GIYFDHDVDTI,KCIADKV-----¿LPLGIERFVLg

'tica -VHDKPR'—PVHYNTHE □ 1YFNHDVDTLKDLAERA-----AEMGAERFVlSj

- -EQKLR—PVHLHTWE GIYFHHMPDYIMQMAERA-----AALGVERF Iii?

<¡rabl caUHGLSI T PEMGWNSWK HFSCNliDE KL I RE TADAMAS KGIAAbGYKY IMlj?

FENGLGR1 РОИвШЕИМHFYCGI NE Q11 RE IAD AL VNTGXJUÍLGYQYVH I?

JAYEKDIG-IG^FKEPEW JGWFIGHUD

:grnd

Третий каталитический остаток, соответствующий Asp51 а-гал риса, замещен на Glu338. Это первый и пока единственный случай замены каталитического остатка Asp на Glu у а-гал. Однако существует общая тенденция замещения Asp у термофилов на Glu у психрофилов наряду с увеличением содержания полярных а.о., особенно Ser (Methé et al., 2005). Такая замена в аминокислотной последовательности ведет к уменьшению температуры переходного' состояния, при котором происходит разворачивание третичной и вторичной структур молекулы белка с одновременной его инактивацией, т.е. уменьшению термостабильности фермента (Zavodsky et al., 1998). Консервативным у а-гал является также Тгр341, который, по всей вероятности, прилегая к карбоксильным группам каталитического Glu338, принимает участие в поддержании его протонированного состояния. Консервативный Тгр307, расположенный на расстоянии 30 а.о. от маркерного для GH36 участка - DD(G/C)W (Рис. 1), также играет важную роль для проявления каталитической активности фермента. В экспериментах по направленному мутагенезу этого остатка было показано, что активность мутанта сохраняется лишь при его замене на ароматические а.о., например, на Туг (Maranville & Zhu, 2000). Предполагают, что Тгр307 вносит существенный вклад в создание гидрофобного микроклимата в этом районе молекулы, необходимого для протонирования каталитических Asp (или Glu) при невысокой концентрации Н+ в среде.

Исследование спектра КД а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 в УФ области (190-240нм), который отражает содержание элементов вторичной структуры в молекуле белка, показало наличие как а-спиралей, так и ß-складчатых элементов. Очевидно, что исследуемый белок принадлежит к a+ß-классу (Venyaminov & Vassilenko, 1994). Содержание элементов вторичной структуры, рассчитанное по спектру КД, совпадают с расчетными данными, полученными с помощью программ SCRATCH и MOLMOL на основании анализа первичной структуры. Из Рис.1 видно, что элементы вторичной структуры в активном центре всех а-гал идентичны, за исключением того, что длина аминокислотной цепи каталитического домена GH36 больше, чем у GH27, поэтому у них большее содержание элементов вторичной структуры.

2.3. Структурные особенности а-гал 27 и 36 семейств (GH27 и GH36).

При построение модели пространственной структуры исследуемой а-гал в качестве прототипов были использованы кристаллические структуры известных белков GH27 и GH36. Однако при совмещении упаковок полных аминокислотных последовательностей GH27 и GH36 в пространстве возникли некоторые трудности, связанные не только с низкой степенью гомологии первичных структур ферментов, но, в большей степени, со стереохимическими различиями в пространственной организации их молекул. Так, каталитический домен GH27 расположен ближе к N-концу белковой молекулы, тогда как

каталитический домен ОН36 сильно смещен к С-концу. Кроме того, 01127 имеют меньшие по размеру субъединицы и меньшую степень олигомеризации активных форм. С помощью графического пакета программ МОЕ нами впервые были удач ко совмсщсны в пространстве две молекулы ферментов разных семейств, что позволило продемонстрировать различия их упаковок (Рис.2а). Как видно из Рис.2, оба белка имеют двухсменную структуру. Консервативные каталитические домены в виде {|3/а)5-бочонков совпадают в пространстве у молекул обоих семейств (Рис.26). Неконсервативные домены ОН27 и ОН36, именуемые «Греческим ключом», также похожи, т.к. состоят из восьми антипараллельных р-слоев, но в пространстве они ориентированы в противоположном направлении относительно друг друга (Рис2а).

а 6

Рис. 1 л) Суиерпозиши 3-D структур GH27 (1) и GK36 (2) 5) Структура агтязиого центра GK27 риса (ко; PDS 1UAS) (слева) н суперпозиция активных деятров о-гал риса (Offi?) к а-ггл Tcnnaroga maritima (GH36) иод ?DE 1ZY9) (cnpasi)

Консервативные а.о. к активном центре а-гал риса - нуклеофильный Aspl 30 и кислота/основание - Aspl Й5. совмещены в пространстве с каталитическими Asp327 и AspjS"? в а-гал Г. maritima (Рис.26). Таким образом, помимо гомологии а.о. у представителей Gl 127 и GH36 сравнение доменной организации И идентичность упаковок активных центров дает основание утверждать, что глихозидазы этих семейств имеют общее происхождение и механизм действия.

2.4. Пространственная структура а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 До настоящего времени не было получено ни одного удовлетворительного результата по установлению полной структуры G1136, за исключением а-гал термофильной бактерии Т. maritima, которая имеет низкую степень идентичности (26%) е а-гал Pseudoalteromonas Sp КММ701. Недавно были успешно кристаллизованы еще две термоетабильные а-гал (Foucault et al., 2U06). Однако исследователи ие смогли интерпретировать результаты по причине образования кристаллов необычной для известных белков формы. Кроме того, авторам не удалось построить даже теоретические модели структур своих белков из-за низкой

гомологии С а-гал Т. maritima - единственной а-гал из GII36 с установленной структурой. После- тото, как нам впервые удалась получить супсрпоэитшю Пространственных структур GM27 и GI136, с помощью программы МОЕ была построена модель пространственной структуры а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 (Рис.3).

Рис. }. Мозель пространственной структуры а-гал Pstmhalreromonas sp. КММ 701. построенная за основе кристаллической структуры а-гал Т. maritima 1ZY9 (слева). Справа покиаиа сулерпоэипия кагалнтнчккнх лоненов а-гал Pteudonkeromomv, sp. КММ 701 (темный) и а-гал рнсп 1UAS (светлый).

В качестве прототипа была использована пространственная структура а-гал 7. maritima (IZY9 в PDB) (Wilson, 2005). Построение пространственной модели активного центра а-гал Pseudoalteromonas sp. KMM70I осуществляли ка основе структуры прототипа из риса (1UAS в 141 В) (Fujimoto et al., 2003). Несмотря на низкую степень идентичности структуры исследуемой а-гал с установленными на сегодняшний день кристаллическими структурами GH27 и GII36, результаты анализа гипотетической упаковки молекулы, полученные с сервера Phyre, Доказали 100% вероятность сс совпадения с упаковкой GI-136 из Т. maritima при E-vulue = 1.2с'23 и с упаковкой GH27 из риса при E-value = 1.2с"'1. I'lo результатам сервера HJGUE вероятность совпадения упаковки исследуемого белка с прототипом из Т. maritima 12Y9 составляет 99% со значением Z SCORE = 40,16. Минимальная ннутренняя энергия построенной модели в вакууме составила (-30769.584) kJ/rnöL Моде;гь третичной структуры а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 выявила ближе к С-кокцу белка наличие каталитического домена, сформированного структурой в виде (ß/a)s-бочонка, п N-küHtieRoro домена, состоящего из антяшраллелъшх ß-слосв (упаковка типа ß-сэндвича). Значение отклонения (RMSD) между основными атомами модели а-гал Pseudoalteromonas sp. KMM70I и прототипа из Т. maritima составило 1.24Ä. Из Рис.3, видно, что каталитический домен а-гал Pseudoalteromonas sp. KMM7Q1 сформирован теми же а.о„

что и в прототипе, кроме Glu338 вместо каталитического Asp51 в а-гал риса. Это указывает на то, что данные остатки в а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 (Glu338, Asp451, Asp519) осуществляют те же функции в каталитических реакциях, что и Asp51, 130, 185 в а-гал риса (Fujimoto et al., 2003).

2.S. Филогенетический анализ а-гал

Филогенетический анализ а-гал был проведен на основе сравнительного анализа как полных аминокислотных последовательностей тридцати двух представителей GH27 и GH36, так и последовательностей их каталитических доменов, определенных программой SMART (http://smart.emhl-heidelberg.de). При изучении топологии полученного дерева было выявлено, что все а-гал из GH27 образуют общий кластер с бутстреп-поддержкой 100%, куда входят преимущественно белки эукариот (Рис. 4). Расположение бактериальных генов а-гал в кластере белков GH27 крайне неустойчиво и они не образуют подкластеры, а встречаются среди ветвей в одиночном порядке и с низкой бутстреп-поддержкой, например, Cellvibrio mixtus (33/53%), Streptomyces coelicolor (53/56%) (Рис.4). Одно из наиболее вероятных объяснений такой топологии бактериальных генов GH27 - их эукариотическое происхождение. В геномы некоторых групп прокариот они могли попасть путем нескольких горизонтальных переносов. По всей видимости, аналогично происходила и эволюция генов, кодирующих а-гал из GH36, только в обратном направлении - от бактерий к эукариотам, поскольку в кластере GH36 встречаются лишь единичные ветви, соответствующие эукариотическим генам а-гал, в основном это гены грибов. В отличие от GH27, семейство GH36 является дивергентным и не образует четко очерченных кластеров, так как все представители семейства GH36 имеют степень гомологии аминокислотных последовательностей не более 70% даже среди близкородственных видов, как в примере с а-гал морских бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 и Pseudoalteromonas atlantica (см. выше). Однако семейство GH36 можно разделить на две большие группы: бактериальные а-гал (мелибиазы) и далеко отстоящие от них щелочные а-гал растений, а-гал археи Sulfolobus solfataricus программа поместила во внешнюю прикорневую группу ферментов независимо от заданных параметров построения филогенетического дерева. Топология а-гал морских у-протеобактерий рода Pseudoalteromonas на филограмме указывает на их ближайшее родство с а-гал наземных мезофилов семейства Enterobacteriales в кластере бактериальных ферментов. Однако вероятность такой дивергенции не достаточно велика (бутстреп-поддержка 68/57%). Возможно, существует какой-либо промежуточный неучтенный гомолог на пути эволюции между этими бактериями. Различия в результатах, полученных при филогенетическом анализе полных аминокислотных последовательностей а-гал и их каталитических доменов трудно объяснить, т.к. не всегда усеченные до каталитических

доме ни в последовательности имеют более высокую бутс треп-поддержку, как логично было

бы предположить.

'ЕгугкгоЬисгег Нгоги1М№?\И'АЬ

■РвеиЛжПтнпои а V пр. КММ70) тцяшя

I Егн'Ыги ' ..¡"'о агя '0<'' Бмс1ипша евД/Р16}а

Ч,-"I

I—■—. Гг/

7 }■' шо

Нкгт тЫ/к-и^ЦТМСОЗ

ЛЬчгНч омутЬуъга/0»е$Х4 /ерибы/ ■ &я0вщ)/са

■ ВагШт каМигяш/ ЛИ

£.171 Л.Л|/, ■ ('.V ЧЛ/ .^

-—— . пцсг/О 91'и24 £

]|МЛОи Тг!с1н>11егма гг^УфШ Г |.

7"пгй/Т/еушшн ./ Г< I Г.| 1 Л гр!и\{:1гн ¡шеггоха 5 У }Г: пш1 ¿1нп! УЙ*пен! ¡ЬсгтирЬИиЫ {¡ЯСЕА У________________

Ц щ 'Э т

Ш'ИЮ

-Нот" Щ)1Гт/Р0б2Ш1Я46 -

-Мвтох70ШК ТВ ^■ШНяциИаЩШ44

_Сг)к>Ма »иш№6<!Т41

__¡м/рв/фГХШ (Ш

-- Са//к агаЫев/ЦЛбЗб

331?}

5136

■ С кшй кк&Л*»И СЛ2/ЛГШ1 М

-Ттнаш итМАРШШ

|74/ $ 0(1 £

-Цц1/а1аЬа.\ .\и1/ишпси^971: Ы (архея!

"

II

. «ч

! ШШ Г'"1- 1усареп1от еисФмит.'{)95Р0$ Ч*щи герннЫ д£ТЯУ9

Рис. 4. Филогенетическое дерево и-гал семейств СН2 7 и ОИ36, построенное методом максимального правдоподобия с молекулярными часами (шаХ1шит ^Ы'ЙККЙ «ЛЬ )Т]о1сси1аг с1оск). Бутстреп-поддержка кластеров указана в основании узлов (%): значение слева -анализ полных последовательностей а.о., справа-анализ каталитических доменов.

Эволюция белков, по всей видимости, сопровождалась множественными дупликациями и элиминациями, а также горизонтальным переносом, как целых генов, так и небольших их фрагментов Это привело также к тому, что топология филогенетического дерева бачков может сильно отличаться от топологии дерева соответствующих видов, построенного на основе анализа 168 РНК. Таким образом, в силу полифилогеничкости СН36 и большой вариабельности сочетания а.о. в их первичной и третичной структурах, изучение новых представителей данного семейства позволит понять, как структурно-функциональное

различие ферментов может в одно и то же время сочетаться с универсальностью механизма каталитического действия.

3. Выделение и очистка ЩФ Cobefía marina На сегодняшний день лишь ограниченное количество ЩФ используются как инструмент в общей практике: ЩФ из бактерии Е. coli, кишечника теленка и арктической креветки Pandaius borealis flittp:/Avww.biotec.as/: http://wvw.worthington-biocliem.eom/: litlp://wwvv.biozvme.com/). ЩФ из E.coli способна эффективно катализировать гидролиз 5'-фосфатных концов молекул ДНК, РНК, олигонуклеотидов, поэтому ее используют, в основном, на первом этапе двухстадийного ферментативного синтеза меченых у 5'-концов молекул НК. При этом удельная активность гомогенного и свободного от нуклеазных примесей препарата не высока и составляет бОед/мг (McComb et al.,1979). Удельная активность ЩФ из кишечника теленка или креветки может достигать до 6000-8500ед/мг белка, поэтому широко используется в качестве маркерного фермента для получения коньюгатов Jg-фермент в методе ELISA (Егоров и др., 1991). Однако тесная связь ЩФ эукариот с фосфодиэстеразной активностью ограничивает возможность их применения в структурно-функциональных исследованиях НК. Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ была выделена ЩФ из морской бактерии Alteromonas macleodii КММ160 (Коллекция микроорганизмов ТИБОХ), которая отличалась высокой удельной активностью, достигающей 6000-7000ед/мг белка, и полностью инактивировалась при 55-60'С в присутствии 2-меркаптоэтанола или ДТТ (Федосов и др., 1991). Тем не менее, ее применение в иммунологических анализах оказалось проблематичным, потому что терялась активность при химической модификации и длительном хранении. В процессе дальнейшего поиска морских бактериальных продуцентов ЩФ в целомической жидкости дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus был обнаружен штамм бактерии Cobetia marina КММ296, способный синтезировать ЩФ с высокой удельной активностью. В отличие от штамма Alteromonas macleodii КММ160, штамм Cobetia marina КММ296 в аналогичных условиях дает больший выход общей фосфатазной активности с 1л питательной среды, а также фермент с более высокой удельной активностью, которая уже на первом этапе достигает 40ед/мг, а после очистки - 14000-15000 ДЭА ед/мг белка.

3.1. Молекулярные и ферментативные свойства ЩФ Cobetia marina Молекулярная масса нативной ЩФ Cobetia marina, определенная методом гельфильтрации, составила 62±2кДа. Это значение соответствует данным, полученным после проведения ДСН-ПААГ электрофореза фермента - 55кДа. На основании полученных данных можно предположить, что нативный фермент имеет мономерное строение с молекулярной массой субъединицы 55-62кДа. Как правило, ЩФ различного происхождения представляют

собой димеры, состоящие из идентичных субъединиц, которые ассоциируют перед проявлением каталитической активности (Poltorak et al., 1999). Отличия между димерами ЩФ из разных источников могут заключаться лишь в количестве S-S связей, участвующих в олигомеризации. Так, фермент из холодоустойчивой арктической трески представляет собой две гомологичные субъединицы, соединенные между собой всего одной S-S связью, что позволяет, по мнению авторов, увеличивать динамику катализа при низких температурах (Boulanger & Kantrowitz, 2003; Asgeirsson et al., 2003). Фермент из морской психрофильной бактерии Vibrio sp. вообще не имеет S-S связей и является первым примером, показывающим возможность существования мономерной формы ЩФ в природе (Asgeirsson et al., 2001).

ЩФ Cobetia marina проявляет максимальную активность при рН10,3 в 1,0М ДЭА-буфере. Такой крайний щелочной оптимум показан для ЩФ из гепатопанкреаса креветки -10,4, и термофильных бактерий Pyrococcus abissy и Meiothermus rubber - 11,0 (Nilsen et al., 2001; Zappa et al., 2001). Кроме того, ЩФ Cobetia marina проявляет высокую устойчивость к изменениям рН и сохраняет активность после 15мин инкубации в широком интервале рН 6,0 - 11,0. Оптимальный температурный режим для проявления максимальной активности фермента - 50°С. Прединкубация фермента в течение 15мин в интервале температур 20-50°С практически не влияет на стабильность, тогда как прединкубация при 55-60"С резко снижает фосфатазную активность от 20 до 80% от исходной величины. Полная инактивация ЩФ достигается после 2мин прогревания инкубационной смеси фермента при 65°С в присутствии ЮмМ ДТТ. Таким образом, ЩФ Cobetia marina является термолабильной по сравнению с аналогичными ферментами из мезофильных и термофильных источников.

Кроме того, для проявления активности ЩФ Cobetia marina не требуется присутствия катионов двухвалентных металлов (Ме2+), а добавление 5-1 ОмМ ЭДТА в инкубационную смесь не приводит к заметному уменьшению активности. Отсутствие ингибирующего эффекта ЭДТА на активность ЩФ может указывать на экранирование активного центра фермента элементами третичной структуры, защищающими прочно связанные с активным центром Ме2+ от хелатирующего агента. Если учесть тот факт, что для проявления активности большинству ЩФ требуется олигомеризация субъединиц, которая не может происходить без экзогенного Ме2+, то быстрый ингибирующий эффект ЭДТА по отношению ко всем ЩФ объясняется связыванием в первую очередь этого экзогенного Ме2+ и, как следствие, диссоциацией фермента на неактивные мономеры. При этом связанные ионы внутри активных центров самих субъединиц (ионы Zn2+), скорее всего, остаются труднодоступными для хелатирующих агентов. Так, ЩФ Vibrio sp. ингибировалась ЭДТА только после долгой прединкубации - более 1ч (Hauksson et al., 2000). Таким образом, обнаруженная нами ЩФ Cobetia marina является вторым после ЩФ Vibrio sp. примером

мономерного существования ЩФ, чья активность не зависит от экзогенных ионов Ме2+. Известно, что активность фермента может также зависеть от моновалентных катионов в среде, обеспечивающих оптимальную ионную силу. Присутствие NaCl или KCl в концентрации 0,2-0,ЗМ увеличивает активность ЩФ Cobetia marina в О,IM Трис-НС1 (рН9.5). Существует мнение, что увеличение ионной силы в пределах 0,05-0,ЗМ ослабляет электростатические взаимодействия, обеспечивая более высокую скорость диссоциации нековалентносвязанного фосфата в активном центре (Рое et al., 1993). Снижение каталитической активности под влиянием тиоловых реагентов, таких как р-хлормеркуриобензоат, ДТТ и 2-меркаптоэтанол, указывает на наличие значимых SH-групп в ЩФ Cobetia marina. р-Хлормеркуриобензоат в концентрации 0,1-2,0мМ подавляет активность фермента на 85 -100%; 2-меркаптоэтанол и ДТТ в концентрации ЮмМ -соответственно на 70 и 95%. Как известно, ингибирующий эффект на индуцибельные ЩФ оказывает и конечный продукт реакции дефосфорилирования - пирофосфат (P¡) (McComb et al., 1977; Ammerman & Azam, 1985). Исследование чувствительности ЩФ Cobetia marina к P¡ показало его относительную устойчивость к увеличивающейся концентрации конечного продукта реакции - до 100 мкМ. Согласно последним данным в морской среде существуют источники конституитивных ЩФ, которые также не ингибируются большими концентрациями Р,. Это, как правило, ЩФ, продуцируемые как самими беспозвоночными, так и микроорганизмами-симбиотрофами, сосуществующими с беспозвоночными, которые участвуют в перманентных процессах минерализации их экзоскелета (Hoppe, 2003).

Результаты исследования специфичности ЩФ Cobetia marina показали, что фермент является классической неспецифической фосфомоноэстеразой, т.к. с одинаковой скоростью расщепляет р-НФФ, 5'-АМФ, 5'-ЦМФ и 5'-дЦМФ. Такие фосфаты как 1-глицерофосфат, 5'-ГМФ, 5'-УМФ, З'-АМФ, АДФ, АТФ, АДФ, глюкозо-6-фосфат и 2-глицерофосфат гидролизуются с помощью фермента в 2-8 раз медленнее. Циклические фосфаты под действием фермента не гидролизуются. Способность ЩФ Cobetia marina отщеплять 5'-концевой фосфат с высокой эффективностью позволила нам использовать фермент в процедуре введения меченого фосфора 32Р в 5'-конец фрагментов ДНК. Проведение основного этапа данного метода - дефосфорилирование фрагментов ДНК обработкой ЩФ Cobetia marina вместо ЩФ Е. coli, показало гораздо более высокую эффективность дефосфорилирования 5'-концов ЕсоМ-фрагментов ДНК после инкубации с нашим ферментом, что позволяет в дальнейшем более эффективно вводить метку 32Р.

3.2. Первичная и вторичная структуры ЩФ Cobetia marina

Методами молекулярного клонирования в бактерии Cobetia marina КММ296 был обнаружен и выделен структурный ген, состоящий из 1605 п.н. ОРС для предшественника

белка и кодирующий полипептидную цепь из 535 а.о. (код DQ530422, GenBank). Наличие сигнального пептида, состоящего из 32 а.о., подтверждает периплазматическую локализацию фермента. Зрелый белок имеет расчетные Мг=54,370Да и р/=4.56, что согласуется с экспериментальными данными. ОРС имеет в своем составе высокое содержание пар G+C (56.64 mol%), а также высокое содержание неполярных и незаряженных полярных а.о., таких как Ala (11.33%), Gly (8,75%), Leu (8.55%), Asp (7,36%), Ser (6.76%), Val (6,56%), Thr (6,36%). В полученной аминокислотной последовательности было обнаружено, что N-конец белка на 100% совпадает с N-концом недавно охарактеризованной мономерной ЩФ Vibrio sp. (Asgeirsson et al., 2001). К настоящему времени экспериментально была показана возможность получения рекомбинантного мономера E.coli, сохраняющего ферментативную активность без образования димера за счет единственной аминокислотной замены Т59А, которая локализуется в третичной структуре на поверхности молекулы в области взаимодействия двух субъединиц (Boulanger & Kantrowitz, 2003). В ЩФ Cobetia marina позиции Т59 в ЩФ Е. coli соответствует позиция G20. Кроме того, при сравнении элементов вторичной структуры с другими ЩФ мы обнаружили, что в N-конце ЩФ морской бактерии отсутствует одна a-спираль, участвующая в образовании димера.

Сравнительный анализ всех первичных структур ЩФ показал нам, что ближайшими и единственными гомологами мономерной ЩФ Cobetia marina являются несколько ферментов из морских психрофильных бактерий: Vibrio G15-21, Psychromonas ingrahamii, Hahella chejuuensis (53-70% идентичности и 67-82% гомологии), среди которых только у ЩФ из Vibrio G15-21 были частично исследованы биохимические и каталитические свойства (Hauksson et al., 2000). Помимо укороченного N-конца, ЩФ Cobetia marina и ее морские гомологи имеют необычный С-конец, который сильно отличается по составу а.о. и длине, за счет чего обладает большей гидрофобностью по сравнению с другими бактериальными ЩФ. Необычным является и факт наличия всего одного остатка Cys67 в молекуле белка, что указывает на отсутствие ковалентных внутри- и межмолекулярных связей. Тенденция к высокому содержанию гидрофобных а.о., как и к уменьшению количества а-спиральных структур в молекуле, является одним из приемов холодовой адаптации ферментов морских бактерий (Рис.5). Это ведет к уменьшению электростатических взаимодействий, и наряду с уменьшением количества внутри- и межмолекулярных связей, как следствие, - к увеличению эффективности каталитической реакции при низкой температуре (Murakawa et al., 2002; Suzuki et al., 2005).

Консервативные для всех ЩФ структурные элементы ограничиваются лишь небольшим числом эссенциальных а.о., которые либо непосредственно, либо косвенно принимают участие в катализе. Это места связывания ионов металлов: Zn-1 (координируется

в ЩФ E.coli/Cobetia marina тремя а.о. - D327/273, Н331/277 и Н412/417) и Zn-2 (координируется соответственно D369/315, Н370/316 и D51/12), обозначаемые как металлосвязывающие сайты Ml и М2. Эти сайты идентичны для всех ЩФ, в которых ион Zn-2 имеет связь с нуклеофильным Ser в активном центре. Координационный сайт МЗ может иметь единичные аминокислотные различия между ферментами, которые ведут, предположительно, к различиям в ионоспецифичности данного сайта. Так, в ЩФ E.coli в сайте МЗ в момент димеризации связывается и координируется ион Mg2+ при непосредственном участии D51, Т155, Е322 и при косвенном участии D153, D327, К328. В ЩФ Cobetia marina этим а.о. соответствуют D12, Т118, Е268 и HI 16, D273, W274. В первичной структуре ЩФ Cobetia marina наблюдается дополнительная петля из 63 а.о., соответствующая участку полипептидной цепи между остатками N391 и Т392 в ЩФ E.coli. В ЩФ Vibrio sp. эта петля, по мнению авторов, в пространстве расположена близко к поверхности белковой молекулы, что может препятствовать ассоциации субъединиц и образованию димера (Asgeirsson et al., 2001). В экспериментах по мутагенезу ЩФ из E.coli и кишечника крысы было показано, что а.о. в МЗ являются определяющими для кы и Км (Le Du et al., 2002; Harada et al., 2005). Так, двойная мутация в МЗ у ЩФ E.coli - D153H/K328H, приводила к получению фермента с более высокими коэффициентами кш и Км, имел меньшую термостабильность и более высокий рН-оптимум. Следует отметить, что недавние кристаллографические исследования ЩФ из арктической креветки Pandalus borealis также выявили необычную для этого класса ферментов структуру - вместо двух ионов Zn2+ и одного иона Mg2+ все три металлосвязывающих сайта занимает триада Zn2+ (de Backer et al., 2002). ЩФ креветки представляет собой еще один пример холодовой адаптации структуры фермента, когда субстратсвязывающий а.о. активного центра - Argl62 (Argl29 в ЩФ Cobetia marina), не всегда находится в состоянии связывания субстрата ('non-docked'). Так как высвобождение P¡ является самым медленным этапом в механизме действия фермента при щелочном рН, то изменение степени сродства и связывания P¡ может регулировать число оборота активных центров фермента (кы) (Wang et al., 2005).

3.3. Пространственная структура ЩФ Cobetia marina Теоретическая модель пространственной структуры ЩФ Cobetia marina была построена с использованием в качестве прототипа кристаллической структуры ЩФ из арктической креветки Pandalus borealis (код PDB 1К7Н) на основании наибольшей гомологии из всех выявленных 3D-CTpyKTyp. Величина отклонения Са-атомов модели от прототипа составила 2,7Â (RMSD). Минимальная внутренняя энергия построенной модели в вакууме составила (-20000)kJ/mol. Анализ теоретической пространственной структуры показал высокую оценку качества модели (model score=1.00) при E-value = 9е"75, что является

Хорошим результатом, учитывая степень идентичности с прототипом - не более 27,5%. Суперпозицию пространственных структур двух сравниваемых ферментов удалось пронести с помощью программы МОЕ, используя фрагмент последовательности ЩФ Со be tía marina с I no -166 а.о.. По результатам сервера Motmol молекула ЩФ Cobelia marina имеет а/(5-СТруктуру в виде трехслойного [i-сэндвича с преобладанием неупорядоченных структур (74,9%). Наибольшие различия в структурах фосфатаз наблюдаются н больших внешних петлях и a-спиралях, особенно в области связывания мономеров в про тотипе (Рис,5).

молекулы мономера ЩФ Cobetia marina; 3 - внесши пеглк ЩФ Cobena marina в области связывания субьединии в лимере ЩФ арктической креветки (В): Днмерная форма ЩФ арктической крезетки.

Анализ расположения каталитических участков в пространственной структуре исследуемой ЩФ и внутримолекулярных свяжи показал, что, несмотря на идентичность топологии функционально значимых а.о., количество всех видов внутримолекулярных связей у нее гораздо меньше, чем в молекуле прототипа. Однако солевых мостиков между а.о, активного центра больше, что, возможно, является дополнительной защитой атомов Me* внутри активного центра от денатурирующих агентов. Компьютерный до кип г ЩФ Cobetia marina с конкурентным ингибитором показал, что вход в полость активного центра ШФ Cobelia marina образуют положительно заряженные а.о. - His277 и IIis4l7, которые в совокупности с атомами Aral29 являются мощной ловушкой для отрицательно заряженного фосфата или его аналога. Необычным является близкое расположение к субстрату Glu317, т.к. при сравнении первичных структур он совпадает с далеко отстоящим от активного центра А1а324 в ЩФ Е.соН, связанным с М§г~ в МЗ через молекулу воды. Для определения количества Ме н ионоспенифичности условных металлосвязываюших сайтов в ЩФ Cobetia

Ряс. 5.

Суперпсишш ЩФ" Cobetia

manna и ЩФ

,арктической

креветки (1К7Н) (А): 1- К-конеи молекул«

мономера ЩФ

арктической

креветки: ¡ - С-кснеч молекулы мономера ЩФ арктической креветки: Г- N-кснеи молекулы мономера ЩФ Cobetia marina: 2' -С-конец

marina были получены компьютерные пробы, заполняющие пространство структуры с мелким шагом (0.4А для всей структуры и 0.1-0,2А для окрестности интересующих нас а.о.), которые находятся не ближе J.75.A к любому атому белка, и не дальше, чем 4.5Á, по крайней мере, от одного белкового атома (Рис.б). При детальном исследовании предполагаемых металлосвязывающих сайтов была выявлена высоко-вероятностная область связывания Zn3\ где свободно помещается цинковая пара. Также существует вероятность того, что в данной Области поместился бы и третий однако если оставить в пробе только Aspl2, Thrl 18 и Glu268, образующие условный сайт МЗ. то вблизи Thrl 18 и Glu268 сайты связывания Zn2"1 не обнаружены, а третий Aspl2 уже входит в состав другого Zn" -связывающего сайта. Координация Mg2+ в области МЗ у ЩФ Cobetia marina маловероятна, т.к. расстояния между эггомами указанных а.о. слитком малы для тото, чтобы мог поместиться такой ион.

Рис. б. Компьютерная модель пространства структура 1ДФ Cobetta marina для определения вероятности связывания 7xr~ но всей молекуле бельа (слева); для определения вероятности связывание Za' e области а.о.. образующих сайт МЗ (справа) Белычи язракамн обозначены атомы а.о. предположительно металл ос вягыв аюшнх сайтов, во где которых наблюдается высоко-вероятно стнал область связывания Zu""

3.4. Экспрессия ЩФ Cobetia marina в клетках 1С. coli

Для создания экспрессную щей конструкции на основе геномной ДИК Cobetia marina был аммлнфицпрован кодирующий участок гена ЩФ, не имеющий собственной сигнальной последовательности, с использованием двух гсгг-спецггфичсекггх праймеров, содержащих на концах дополнительные последовательности сайтов рестрикции EcoRl и líindíll для лигйрования в вектор рЕТ22Ь (+), Вектор имеет собственную N-концевую сигнальную последовательность, специфичную дм E.coli. с целью направления рекомбинантного белка в периплазму клетки, а также С-котшеную последовательность, кодирующую шесть гистиданов, для выделения рекомбинантного белка с помощью аффинного металл о содержаще го сорбента. Однако электрофор сгич с ский анализ белков

рекомбинантного штамма показал, что рекомбинантная ЩФ аккумулируется в бактериальных тельцах включения. Выход очищенного денатурированного в 8М мочевине рекомбинантного белка составил 50% от общего белка водонерастворимой фракции. Рекомбинантный белок иммобилизировали на колонке с металлоафинной смолой и освобождали от мочевины разведением суспензии смолы с иммобилизованной ЩФ 100-кратным объемом глицинового буфера. Рекомбинантный белок оставляли на ночь для его рефолдинга с последующей элюцией имидазольным буфером. Несмотря на мономерную структуру и отсутствие дисульфидных связей, для получения активной формы белка существуют какие-то препятствия. Возможно, причина кроется в негативном влиянии на правильную укладку дополнительного терминального С-конца из шести гистидинов, либо в отсутствии процессинга предшественника в условиях гетерологической экспрессии в чужеродной клетке (Nesmeyanova et al., 1997; Kojima et al., 2005). После проведения 12ч диализа полученного препарата против буфера, содержащего 1мМ Zn2+, удалось получить фермент, проявляющий 10-15% от активности нерекомбинантной ЩФ. Ионы Zn2+, по всей вероятности, служат кофактором для осуществления правильного рефолдинга рекомбинантного мономера, который по каким-то причинам не прошел в клетках E.coli (Gudiksen et al., 2004; Bushmarina et al., 2006).

3.5. Филогенетический анализ ЩФ Проведенный филогенетический анализ 43 представителей ЩФ показал, что их можно разделить на четыре основных типа, а именно: бактериальные фосфат-независимые ЩФ; ферменты эукаритического происхождения; ферменты морских грамм-отрицательных у-протеобактерий; и группа, включающая все остальные бактериальные ЩФ, которые представляют самый обширный клан (Рис.7). ЩФ морских у-протеобактерий, включая ЩФ Cobetia marina, образуют на филогенетическом древе обособленный кластер бактериальных ЩФ, который с точки зрения эволюции, по-видимому, существовал параллельно с остальными бактериальными ЩФ и имел автономное развитие. Однако на существование общего предка может указывать то, что мономерная форма ЩФ появилась позже в результате дивергенции прародительского гена на каком-то этапе эволюции в момент адаптации к суровым условиям существования бактериальной клетки при низких температурах и скудном питании. ЩФ археобактерии Haloarcula marismortui и цианобактерии Anabena variabilis на дереве образуют прикорневую базальную ветвь. Однако ферменты некоторых архей, например, представителей родов Thermococcales и Methanosarcinales, оказались среди бактериальных ЩФ более позднего развития. Этот факт еще раз подтверждает гипотезу о том, что латеральный перенос генов, конвергенция или обмен между бактериями и археями играют важную эволюционную роль в комплексной

адаптации к среде обитания (Deppenmeier et al., 2002; Mongodin et al., 2005). Интересно отметить, что программа поместила рядом' с кланом ЩФ эукариот ветвь с несколькими бактериальными ЩФ, которые известны как человеческие патогены, чьи геномы веками сосуществовали с геномами высших организмов, поэтому не исключено, что причина такой близкой топологии бактериальных и человеческих генов такая же, что и у архей -латеральный перенос генов.

I___— лгоаггжв/Bos taurus

•^—joisвз/Human placenta ■AJZ96089/ Pandalus borealis •Агоеа?4в/ Drosophila melanogaster Л1А46062/Rabtonia solanacearum (Pseudomonas) Х044вв/Escherichia coli АХ004081/Pseudomonas aeruginosa

•DQ43eaoa/Cobetia marina

•лгшоы/Vibrio G15-21 •BA000031/ Vibrio parahemolyticus qsaioooo/psychromonas mgrahamn

срооозох/Shetvanella denitrificans cpoooißs/Hahella chejuensis_

П

AAPF010000/Mycobacterium vanbaaienii

•imoaos/Lactobacillus delbrueckii •aiqi taao/ Streptococcus faecalis ■AP008934/Staphylococcus saprophytics CB9S4347/ Pseudoalteromonas A3190667/Sheaanetla sp. S1B1 axo 17340/ Idiom arin a loihiertsis crooQisa/Salinibacter rubber

• ab 114*88/Glomus intraradices CR3809S4/ Candida glabrata •Aioosieo/ Halo bacterium saünarum (Arhaea)

•AXOi7333/Bacillus luchineformis A10168X7/Clostridium tetani •AI008364/Methanosarcina mazei (Arhaea) •BM00004/ Bacillus halodurans •BAOOOOS8/ Oceanobacillus iheyensis •AEQ10K1Z/ Pyrococcus furiesus (Arhaea) ■Asooosix/Termatoga maritima

GPocooM/Pelodictyon luteolum (Chlorobium) AAAW04coooo4/Desulfitobacterium hafnies (Clostridia) ■Tt8018/Antarctic bacterium TABS •AJ309sea/Thermus thermophilus 3

MD01000081/StigmaieUa aurantlaca

■ЛГ1678*1/Chryseobacterium meningosepticum L38230/Zymomonas mobilis •aapuo 1000001/Flavobacierium johnsoniae

CP0001 if/ Anabena variabilis (green-blue aigae) ■AJi7874o/Streptomyces griseus •ATS96297/ HaloarcuUt marismortui (Arhaea)

4

Рис. 7. Филогенетическое дерево репрезентативной выборки щелочных фосфатаз. Бутстреп-поддержка указана в узлах кластеров (%).

ВЫВОДЫ

I. Выявлено, что бактерии родов Pseudoalteromonas, Vibrio, Corynebacterium и Bacillus являются перспективными продуцентами а-гал. Впервые в морской бактерии Pseudoalteromonas sp. (КММ701, ВКМ В-2135Д) была обнаружена внутриклеточная а-гал, способная с высокой эффективностью катализировать отщепление а-1,3-связанного

остатка галактозы с невосстанавливающего конца детерминанты В(Ш)-группы крови человека, что приводит к модификации эритроцитов в 0(1)-группу. Получен препарат а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 с удельной активностью 231ед./мг и молекулярной массой белка 170±ЗкДа (80.5кДа субъединица). Обработка таким препаратом в количестве 0,24ед/мл суспензии 15-20% эритроцитов в растворе 0,9% NaCl (pH 7,3) в течение Зч при 20°С приводит к полной инактивации серологической активности эритроцитов В(Ш)-группы при отсутствии гемагглютинации и протеазной активности.

2. Впервые установлена структура а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701, принадлежащей к семейству GH36, на основании которой была построена теоретическая модель пространственной структуры и проведен анализ возможных каталитических участков фермента. Показано, что а.о. Glu338, Asp451, Asp519 образуют активный центр фермента и осуществляют те же функции в каталитических реакциях, что и Asp51, 130, 185 в а-гал риса, принадлежащей к семейству GH27. Впервые с помощью расчетных методов осуществлена суперпозиция третичных структур О-гликозидгидролаз GH27 и GH36, показавшая различия в пространственной организации их молекул наряду со сходством механизма каталитического действия. Проведен филогенетический анализ О-гликозидгидролаз GH27 и GH36, который показал многообразие структур и общность происхождения их представителей.

3. Выявлено, что бактерии родов Aeromonas, Acinetobacter, Cytophaga-Flexibacter, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio являются перспективными продуцентами ЩФ. Впервые в целомической жидкости мидии Crenomytilus grayanus был обнаружен штамм морской бактерии Cobetia marina (КММ296, ВКМ В-2021 Д) -продуцент периплазматической ЩФ с очень высокой исходной активностью. Получен препарат ЩФ Cobetia marina с удельной активностью 14000-15000 ДЭА ед/мг, молекулярной массой белка 55кДа, pH-оптимумом 10.3, температурным оптимумом 40-45°С, устойчивый к хранению и химическим модификациям. Фермент имеет большую эффективность при дефосфорилировании 5'-концов фрагментов ДНК по сравнению с ЩФ E.coli. Фермент выводится из реакции при нагревании 60°С в течение 10-15мин в присутствии 10мМ ДДТ.

4. Впервые установлена первичная структура мономерной ЩФ Cobetia marina, построена теоретическая модель пространственной структуры и проведен анализ возможных каталитических участков ЩФ. Впервые с помощью расчетных методов была определена ионоспецифичность условных металлосвязывающих сайтов ЩФ Cobetia marina. Проведен филогенетический анализ ЩФ, который показал, что ЩФ морских у-протеобактерий представляют самостоятельный клан ферментов, дивергированный от

общего предка, и имеющий параллельное, автономное развитие по отношению к остальным бактериальным ЩФ.

5. Впервые на примере анализа структуры и свойств О-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз показана одна из стратегий холодовой адаптации морских бактерий за счет уменьшения количества внутри- и межмолекулярных связей в молекулах гидролаз и, как следствие, уменьшения аффинности субстратов и увеличения эффективности каталитических реакций.

6. Впервые получен рекомбинантный белок ЩФ Cobetia marina, проявляющий ферментативную активность после конформационного созревания в результате инкубирования с 1мМ Zn2+.

Работа была поддержана грантами РФФИ № 05-08-50285, 06-04-48540-а, 05-04-49881, 03-04-49534, FEBRAS 06-III-A-05-123 и программой Фундаментальных исследований Президиума Российской Академии наук "Молекулярная и клеточная биология" проект "Новые природные биорегуляторы морского и наземного происхождения".

Публикации по теме диссертации:

1.Иванова Е.П., Плисова Е.Ю., Балабанова Л.А., Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Штамм бактерии Deleya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы// Патент РФ № 2077577. БИ № 11. 20.04.1997.

2.Иванова Е.П., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю., Балабанова Л.А., Светашев В.В., Высоцкий М.В., Степаненко В.И., Рассказов В.А. Характеристика морской бактерии Deleya marina-продуцента высоко активной щелочной фосфатазы, ассоциированной с моллюском Crenomytilus grayanus// Биология моря. 1994. Т. 20. С.340-345.

3.Plisova E.Y., Balabanova L.A., Ivanova Е.Р., Kozhemyako V. В., Mikhailov V. V., Agafonova E.V. and Rasskazov V.A. A highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia// Mar. Biotechnol. 2005. V.7, Iss.3. P.173-178.

4.Balabanova L.A., Likhatskaya G.N., Bakunina I.Ju., Petruk S.V., Kozhemyako V.B. Rasskazov V.A. Primary structure and homology modeling of the novel alpha-D-galactosidase from marine bacterium// 31s1 FEBS Congress "Molecules in health & disease", Istanbul: 2006. FEBS journal. V. 273. P. 262.

5. Rasskazov V.A., Menzorova N.M., Balabanova L.A., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Pivkin M.V., Plisova E.Ju., Sibirtzev Ju.T., Terentyev L.L., Terentyeva N.A. Highly specific nucleases and phosphatases of marine organisms as new tools for molecular biology // Тр. Объед. междунар. науч. конф. "Новая геометрия природы: Математика, механика, геофизика, астрономия и биология", Казань: 2003. Т. 2: Биология. Медицина. С. 279-283.

6.Rasskazov V.A., Menzorova N.M., Balabanova L.A., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Plisova E.Ju., Sibirtzev Ju.T., Savoskina E.V., Terentyev L.L., Terentyeva N.A. Highly specific nucleases and phosphatases of marine organisms as new tools for genetic engineering and biotechnology // IX Pacific sci. Inter-congr. "Sustainable development in the Pacific". Acad. Sinica, Taipei: abstracts. 1998. P.132.

7. Plisova E.Ju., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Mikhailov V. V., Fedosov Yu.V. High-active alkaline phosphatase from marine bacteria Deleya marina// 45th Arctic Sci. Conf., Vladivostok: Dalnauka. 1994. P.294.

Соискатель:

Балабанова Л. A.

Балабанова Лариса Анатольевна

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ БИОПОЛИМЕРЫ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА

АВТОРЕФЕРАТ

Зак. ¡к 124п. Формат 60*84 '/„,. Уел п л. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано к печати 22.08.07 г. Печать офсетная с оригннхпа заказчика

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор» 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская 46/50 Тел.: 32-70-49

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Балабанова, Лариса Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И РОЛЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ.

2. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ ПОЛИСАХАРИДЫ.

2.1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ.

2.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ.

2.3. СУБСТРАТЫО-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ.

2.4. а-ГАЛАКГОЗИДАЗЫ.

2.4.1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ а-ГАЛАКТОЗИДАЗ.

2.4.2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА а-ГАЛАКТОЗИДАЗ.

2.4.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА а-ГАЛАКТОЗИДАЗ.

2.4.4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ а-ГАЛАКТОЗИДАЗ.

3. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ.

3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НУКЛЕАЗ.

3.2. СУБСТРАТЫ НУКЛЕАЗ.

3.3. ЩЕЛОЧНЫЕ ФОСФАТАЗЫ.

3.3.1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ.

3.3.2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ.

3.3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ.

3.3.4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. СКРИНИНГ О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ И ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ В МОРСКИХ БАКТЕРИЯХ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ.

2. а-ГАЛАКТОЗИДАЗА ИЗ МОРСКОЙ БАКТЕРИИ РВЕиООАЬТЕЯОМОЫАВ БР.

2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ PSEUDOALTEROMONAS SP.

2.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА а-ГАЛАКГОЗИДАЗЫ PSEUDOALTEROMONAS SP.

2.3. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА а-ГАЛАКГОЗИДАЗЫ PSEUDOALTEROMONAS SP.

2.4. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ PSEUDOALTEROMONAS SP.

2.5. СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИа-ГАЛАКТОЗИДАЗ 27 И36 СЕМЕЙСТВ.

2. б. МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

PSEUDOALTEROMONAS SP.

2.7. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ а-ГАЛАКТОЗИДАЗ.

3. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА ИЗ МОРСКОЙ БАКТЕРИИ COBETIA MARINA.

3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ COBETIA MARINA.

3.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ COBETIA MARINA.

3.3. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ СОВЕТЫ MARINA.

3.4. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ СОВЕТЫ MARINA.

3.5. ЭКСПРЕССИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ СОВЕТЫ MARINA.

3.6. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидролитические ферменты морских бактерий, модифицирующие биополимеры"

Морские микроорганизмы всегда были и будут объектом фундаментальных исследований в самых разных областях науки. Несмотря на то, что Океан еще мало изучен, очевидно, что именно морская микробиота играет ключевую роль в классической цепи круговорота энергии и вещества, превращая их в источники необходимых элементов на высших трофических уровнях [1]. Другими словами, микробиота обладает набором таких биологических инструментов, как экзо- и эндоферменты, которые участвуют во всех биохимических процессах, - от синтеза простейших органических соединений до деградации и утилизации высокомолекулярных органических остатков в морской воде (ДНК, РНК, белков, полисахаридов) (Рис.1). К тому же ферменты морских микроорганизмов в процессе эволюции были адаптированы к условиям крайних значений температур, давления, солнечной энергии, концентрации солей и дефицита источников питания [2-41. Эти факты являются краеугольным камнем в понимании структурно-функциональных особенностей макромолекул, производимых морскими микроорганизмами. В целом, изучение молекулярно-генетического состава любой морской бакгерии вносит определенный вклад в понимание процессов метаболизма, физиологии, механизмов адаптации всех участников биологического сообщества. Более того разнообразие генетического материала в морской среде, его эволюционная динамика и пластичность, участие в экологических процессах оказывает глобальный эффект на скорость круговорота энергии и материи в океане равно как и на биогеохимический круговорот, состав атмосферы и

МкгоЬй! 1оа6 тЪ климат Земли в целом [5-6[.

На сегодняшний день изучены свойства, клонированы гены и определены структуры большого количества ферментов наземных бактерий, грибов и растений, среди которых около 30% составляют гидролазы. Данные о структурах и функциях таких же ферментов из морских

Рис. 1. Роль морской микробиоты в круговороте веществ. объектов практически отсутствуют, а было бы полезно пополнить такого рода информацию и прояснить многие вопросы - например, насколько богато структурное разнообразие гидролитических ферментов в природе, как отражается на их свойствах и функциях и зависит ли от мест обитания их источников? Интересно отметить что, несмотря на многообразие первичных структур гидролаз в природе, существует весьма ограниченное число структур каталитических центров, которые являются трехмерным продуктом сворачивания полипептидной цепи белка. Вероятно, существует определенный алгоритм сборки таких структур, позволяющий в нужной точке пространства локализовать необходимую функциональную группу белка. Этот алгоритм определяется в свою очередь первичной последовательностью аминокислот и может быть назван условно вторичным кодом. Почему природа оказалась столь скудна на разнообразие каталитических структур? Можно высказать предположение, что возникновение эффективных каталитических структур - событие в высшей степени редкое. Возникшие эволюционным или случайным образом структуры природа «запомнила» и научилась использовать во всем многообразии обсуждаемых классов ферментов [7]. Возможно, ответ на вопрос о первопричине возникновения ограниченного числа типов эффективных каталитических структур кроется именно в море - колыбели всей жизни на Земле. С появлением первой информации о первичной структуре некоторых ферментов из морских микроорганизмов и сравнительном анализе их с наземными аналогами стало появляться представление о молекулярных механизмах, определяющих столь необычные физико-химические свойства ферментов морского происхождения как высокая удельная активность, устойчивость к неблагоприятным факторам - высокой солености, давлению, низким температурам. Это объясняется особым строением функционально значимых участков белковых молекул, которое легло в основу механизма адаптации микроорганизмов к суровым условиям обитания в морской среде. Одна из стратегий такой адаптации заключается в уменьшении количества межмолекулярных и внутримолекулярных связей в молекулах ферментов, что позволяет увеличивать эффективность каталитической реакции за счет увеличения числа оборотов их активных центров [2-3].

Традиционные схемы получения информации о биоразнообразии морских бактерий и продуктах экспрессии их генов включают в первую очередь скрининг, отбор и тестирование огромного количества материала. Но это трудоемкий и затратный процесс для достижения конечной антропогенной цели большинства этих исследований - создание жизненно и коммерчески важных биотехнологических продуктов для использования в медицине, пищевой промышленности и генной инженерии. Сейчас уже существует технология рекомбинантных ДНК, позволяющая получать в больших количествах как ценные низкомолекулярные вещества, так и макромолекулы, в том числе и различные гидролитические ферменты, используемые для модификации биополимеров, которые в естественных условиях синтезируются в минимальных количествах [8].

Так, щелочные фосфатазы (ЩФ) бактерий являются широко распространенными в природе ферментами, катализирующими удаление 5'-фосфатных групп в полимерных молекулах нуклеиновых кислот и их мономерных предшественниках, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, что определяет их важную роль в метаболизме нуклеиновых кислот и круговороте фосфора в симбиотическом сообществе [9-10]. Практический интерес к ЩФ объясняется их широким использованием в генной инженерии для дефосфорилирования ДНК перед лигированием; в гибридизационной технике при хемилюминесцентном мечении генов для получения конъюгатов с олигонуклеотидами; для создания генетических конструкций на основе гена щелочной фосфатазы (векторов, плазмид-реперов); в медицине для получения иммуноконъюгатов; в диагностике для получения рекомбинантных диагностических антител к клеточным рецепторам с целью создания реперных белков и т.д. [11-13]. Существуют немало наземных источников ЩФ, но выделенные из них ферменты имеют ряд недостатков, таких как низкая активность, примеси диэстеразной активности, неустойчивость к химическим модификациям и длительному хранению [14].

Большой научно-практический интерес представляют и гликозидазы, широко используемые при исследовании антигенной структуры различных биологических объектов, в том числе клеток крови [15]. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов человека а-галактозидазой, что позволяет из эритроцитов с различной групповой специфичностью получать эритроциты 0(1)-группы крови ("универсальный донор") [16]. Литературные данные указывают на то, что в отличие от гликозидаз эукариотического происхождения, ферменты бактерий действуют в условиях нейтральных рН, физиологичных для эритроцитов [17]. Однако на сегодняшний день среди известных бактерий наземного происхождения пока не выявили подходящих продуцентов а-галактозидаз с требуемой специфичностью и оптимумом рН.

Несмотря на то, что данные о структурах и функциях гидролаз из морских бактерий практически отсутствуют, уже имеющиеся сведения указывают на их преимущества перед известными аналогами [14, 16, 19]. Так как они синтезируются в основном в глубоководных акваториях, являясь основными поставщиками фосфора, азота и углерода, можно предположить, что суровые условия обитания повлияли на их функциональные особенности и свойства, например способность к каталитическому расщеплению, приводящему к модификации сложных биополимеров, которые имеют в своем составе нуклеиновые кислоты, полисахариды и другие субстраты - составляющие важных биологических субстанций [9-10,18-20].

Таким образом, широкие возможности использования уникальных свойств ферментов морских микроорганизмов для целей биотехнологии и медицины определяют необходимость исследования их молекулярно-генетических характеристик и создания суперпродуцентов ценных рекомбинантных белков.

Цель настоящей работы заключалась в разработке общего подхода к установлению структурно-функциональной организации и свойств молекул гидролаз морских бактерий. Объектами исследования были выбраны гидролазы класса Огликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, имеющие биотехнологическую ценность в способности модифицировать биополимеры. В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести в морских бактериях скрининг гидролитических ферментов класса О-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, модифицирующих соответственно полисахариды и нуклеиновые кислоты.

2. Выделить и изучить свойства а-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701, катализирующей удаление групповой специфичности В(Ш)-группы крови человека с трансформацией эритроцитов в 0(1)-группу крови.

3. Установить первичную структуру и построить теоретическую модель пространственной структуры а-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalter omonas sp. КММ701.

4. Выделить и изучить свойства ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.

5. Установить первичную структуру и построить теоретическую модель пространственной структуры ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.

6. Провести экспрессию ЩФ из морской бактерии Cobetia marina в клетках Escherichia coli.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И РОЛЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ МОРСКИХ

БАКТЕРИЙ

Ферменты из морских источников, благодаря своим необычным биохимическим свойствам, продолжают привлекать интерес многих исследователей [21]. Большая часть обитателей морского сообщества, в том числе морские бактерии, приспособлены к жизнедеятельности при низких температурных режимах, особенно в глубоководных и донных зонах акваторий. В процессе адаптации морские бактерии научились вырабатывать внеклеточные высокомолекулярные соединения, помогающие им формировать колонии (биопленки) и обеспечивать криопротекцию клеток. С другой стороны такие бактерии должны обладать способностью частично или полностью разрушать эти высокомолекулярные соединения для продолжения своего жизненного цикла. Учитывая все трудности выживания в такой среде, не удивительно, что морские бактерии синтезируют уникальные ферменты, в том числе и гидролазы, модифицирующие биополимеры. [20-27]. В морской среде можно встретить большой спектр гидролитических ферментов, включающих внеклеточные ферменты в растворимых фракциях и ферменты, ассоциированные с нерастворимыми в воде частицами [28-30]. И, если для водорослей и морских животных определяющим фактором, регулирующим экспрессию тех или иных ферментов, является соотношение внутренних концентраций С:№Р, то для морских бактерий существует еще и дополнительный механизм индукции ферментов, зависящий от внешних факторов: стехиометрического состава С:И:Р окружающей среды, доминирования тех или иных обитателей морского сообщества, глубины, солености, температуры, а также фактической потребности в первичных элементах высших организмов-хозяев [10-11,31].

Кроме того, большинство ферментов морских организмов, находясь в условиях высокого давления, вязкости, солености и низкой температуры, выработали ряд внутримолекулярных механизмов, увеличивающих эффективность каталитической реакции (к^/Км) за счет повышения числа оборотов активных центров (¿каО-Каталитические показатели гидролаз из психрофильных источников могут во много раз превышать показатели мезофильных аналогов [32-35].

Комплексные исследования биогеоценозов показали, что бактерии, имеющие симбиотрофные отношения с другими членами сообщества, способны продуцировать более высокоактивные ферменты, чем свободноживущие бактерии [10, 36-37]. Интересным оказался и тот факт, что гидролитические ферменты встречаются в большом количестве в очень глубоководных придонных и эвтрофных зонах акваторий, несмотря на относительно высокое содержание в этих местах органических остатков. Это объясняется несколькими причинами: во-первых, оседающие на дно частицы могут быть уже ассоциированы с ферментами и таким образом являться их поставщиками в глубоководные слои [10, 38]. Во-вторых, экспрессия ферментов морских бактерий, возможно, не лимитируется повышенным содержанием субстратов, так как бактериальная часть сообщества играет роль и генератора и основного потребителя эссенциальных элементов, высвобождающихся из деградирующих органических остатков [39-40]. Некоторые исследователи считают, что экспрессия неиндуцибельных ферментов в бактериях, независящая от концентрации субстратов в окружающей среде, является показателем того, что эти бактерии живут в условиях симбиоза [41]. И, наконец, уже известно, что адаптированные к низким температурам ферменты имеют такую структуру, которая обеспечивает пониженное сродство молекулы фермента к субстрату и его аналогам, благодаря чему увеличивается показатель Км, но отсюда вытекает и индифферентность молекул фермента к высокой концентрации продуктов реакции в инкубационной среде. Это один из механизмов холодовой адаптации, когда незначительные аминокислотные замены в первичной структуре фермента приводят к уменьшению количества межмолекулярных и/или внутримолекулярных ковалентных связей в четвертичной структуре, что увеличивает подвижность слабо связанных между собой субъединиц [42-43]. Недавно было установлено, что уменьшение количества межатомных связей в молекулах щелочных фосфатаз психрофильных морских бактерий привело к более глобальной реорганизации структуры вплоть до существования функционального белка в мономерной форме, тогда как все остальные ЩФ не могут проявлять активность без дополнительного этапа образования димера [3,44].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Балабанова, Лариса Анатольевна

выводы

1. Выявлено, что бактерии родов Pseudoalteromonas, Vibrio, Corynebacterium и Bacillus являются перспективными продуцентами а-гал. Впервые в морской бактерии Pseudoalteromonas sp. (КММ701, ВКМ В-2135Д) была обнаружена внутриклеточная а-гал, способная с высокой эффективностью катализировать отщепление а-1,3-связанного остатка галактозы с невосстанавливающего конца детерминанты В(Ш)-группы крови человека, что приводит к модификации эритроцитов в 0(1)-группу. Получен препарат а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701 с удельной активностью 231ед./мг и молекулярной массой белка 170±ЗкДа (80.5кДа субъединица). Обработка таким препаратом в количестве 0,24ед/мл суспензии 15-20% эритроцитов в растворе 0,9% NaCl (рН 7,3) в течение Зч при 20°С приводит к полной инактивации серологической активности эритроцитов В(1П)-группы при отсутствии гемагглютинации и протеазной активности.

2. Впервые установлена структура а-гал Pseudoalteromonas sp. КММ701, принадлежащей к семейству GH36, на основании которой была построена теоретическая модель пространственной структуры и проведен анализ возможных каталитических участков фермента. Показано, что а.о. Glu338, Asp451, Asp519 образуют активный центр фермента и осуществляют те же функции в каталитических реакциях, что и Asp51, 130, 185 в а-гал риса, принадлежащей к семейству GH27. Впервые с помощью расчетных методов осуществлена суперпозиция третичных структур О-гликозидгидролаз GH27 и GH36, показавшая различия в пространственной организации их молекул наряду со сходством механизма каталитического действия. Проведен филогенетический анализ О-гликозидгидролаз GH27 и GH36, который показал многообразие структур и общность происхождения их представителей.

3. Выявлено, что бактерии родов Aeromonas, Acinetobacter, Cytophaga-Flexibacter, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio являются перспективными продуцентами ЩФ. Впервые в целомической жидкости мидии Crenomytilus grayanus был обнаружен штамм морской бактерии Cobetia marina (КММ296, ВКМ В-2021 Д) -продуцент периплазматической ЩФ с очень высокой исходной активностью. Получен препарат ЩФ Cobetia marina с удельной активностью 14000-15000 ДЭА ед/мг, молекулярной массой белка 55кДа, рН-оптимумом 10.3, температурным оптимумом 40-45°С, устойчивый к хранению и химическим модификациям. Фермент имеет большую эффективность при дефосфорилировании 5'-концов фрагментов ДНК по сравнению с ЩФ E.coli. Фермент выводится из реакции при нагревании 60°С в течение 10-15мин в присутствии ЮмМ ДЦТ.

4. Впервые установлена первичная структура мономерной ЩФ Cobetia marina, построена теоретическая модель пространственной структуры и проведен анализ возможных каталитических участков ЩФ. Впервые с помощью расчетных методов была определена ионоспецифичность условных металлосвязывающих сайтов ЩФ Cobetia marina. Проведен филогенетический анализ ЩФ, который показал, что ЩФ морских у-протеобактерий представляют самостоятельный клан ферментов, дивергированный от общего предка, и имеющий параллельное, автономное развитие по отношению к остальным бактериальным ЩФ.

5. Впервые на примере анализа структуры и свойств 0-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз показана одна из стратегий холодовой адаптации морских бактерий за счет уменьшения количества внутри- и межмолекулярных связей в молекулах гидролаз и, как следствие, уменьшения аффинности субстратов и увеличения эффективности каталитических реакций.

6. Впервые получен рекомбинантный белок ЩФ Cobetia marina, проявляющий ферментативную активность после конформационного созревания в результате инкубирования с 1мМ Zn2+.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балабанова, Лариса Анатольевна, Владивосток

1. Arrigo K.R. Marine microorganisms and global nutrient cycles // Nature. 2005. Vol. 437. P. 349-355.

2. Rina M., Pozidis C., Mavromatis K., Tzanodaskalaki M., Kokkinidis M. and Bouriotis V. Alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5. Properties and psychrophilic adaptations // Eur. J. Biochcm. 2000. Vol. 267. P. 1230-1238.

3. Asgcirsson В., Andresson O.S. Primary structure of cold-adapted alkaline phosphatase from a Vibrio sp. as a deduced from the nucleotide gene sequence // Biochim. Biophys. Act. 2001. Vol. 1549. P. 99-111.

4. Turkiewicz M., Kur J., Biakowska A., Cieliski H., Kalinowska H., Bielecki S. Antarctic marine bacterium Pseudomonas sp. 22b as a source of cold-adapted (1-galactosidase // Biomol. Eng. 2003. Vol. 20. N 4-6. P. 317-324.

5. DeLong E.F., Karl D.M. Genomic perspectives in microbial oceanography // Nature. 2005. Vol. 437. P. 336-342.

6. Suttlc C.A. Viruses in the sea // Nature. 2005. Vol. 437. P. 356-361.

7. Варфоломеев С.Д., Пожитков A.E. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа// Вести. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. Т.41. № 3. С. 147-156.

8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир, 2002. -589 с.

9. Bjorkman К., Karl D. Bioavailability of inorganic and organic phosphorus compounds to natural assemblages of microorganisms in Hawaiian coastal waters // Marine Ecol. Prog. Ser. 1994. Vol. 111. P.265-273.

10. Hoppe H-G. Phosphatase activity in the sea // Hydrobiologia. 2003. Vol. 493. P. 187-200.

11. McComb R.B., Bowers G.N., Posen S. Alkaline Phosphatase. NY: Plenum Press, 1979. -986 p.

12. Boulain J.C, Ducancel F. Expression of Recombinant Alkaline Phosphatase Conjugates in Escherichia coli // Methods Mol. Biol. 2004. Vol. 267. P. 101-112.

13. Plisova E.Yu., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Agafonova E.V., Rasskazov V.A. A highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina // Mar. Biotechnol. 2005. Vol. 7. N 3. P. 173-178.

14. Scigelova M., Singh S., Crout D.H.G. Glycosidases a great synthetic tool // J. Mol. Catal. B. 1988. V. 6. P. 438-494.

15. Olsson M.L., Hill C.A., Vega H, Liu Q.P., Stroud M.R., Valdinocci J., Moon S., Clausen H., Kruskall M.S. Universal red blood cells enzymatic conversion of blood group A and В antigens // Trans, clin. biol. 2004. Vol. 11. P. 33-39.

16. Paul J.H., Jeffrey W.H. Cannon J.P. Production of dissolved DNA, RNA, and protein by microbial populations in a Florida reservoir // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. P. 29572962.

17. Михайлов B.B., Терснтьев Л.Л., Терентьева H.A. Морские микроорганизмы и их ферменты. Владивосток: Дальнаука. 2004. - 227 с.

18. Marx J.C., Blaise V., Collins Т., D'Amico S., Delille D., Gratia E., Hoyoux A., Huston A.L., Sonan G., Feller G., Gerday C. A perspective on cold enzymes: current knowledge and frequently asked questions // Cell. Mol. Biol. 2004. Vol. 50. P. 643-655.

19. Tamburini C., Garcin J., Ragot M. and Bianchi A. Biopolymer hydrolysis and bacterial production under ambient hydrostatic pressure through a 2000m water column in the NW Mediterranean // Deep-Sea Res. 2002. Vol. 49 (II). P. 2109-2123.

20. Takami II., Takaki Y., Uchiyama I. Genome sequence of Oceanobacillus iheyensis isolated from the Ihcya Ridge and its unexpected adaptive capabilities to extreme environments // Nuc. Acid Res. 2002. Vol. 30. No. 18. P. 3927-3935.

21. Jeong H., Yim J.H., Lee Ch., Choi S-H., Park Y.K., Yoon S.H. et al. Genomic blueprint of Hahella chejuensis, a marine microbe producing an algicidal agent // Nuc. Acid Res. Vol. 33. No. 22. P. 7066-7073.

22. Middelboe M., Sondergaard M., Letarte Y. and Borch N.H. 1995. Attached and free-living bacteria: production and polymer hydrolysis during a Diatom bloom. Microb Ecol 29,21-248.

23. Martinez J. and Azam F. Periplasmic aminopeptidase and alkaline phosphatase activities in a marine bacterium: implication for substrate processing in the sea // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1993. Vol. 93. P. 89-97.

24. Naush M., Pollehne F. and Kerstan E. Extracellular enzyme activities in relation to hydrodinamics in the Pomeranian Bight (southern Baltic Sea) // Microb. Ecol. 1998. Vol. 36. P. 251-258.

25. Sala M.M., Kamer M., Ann L, and Marrase C. Measurement of ectocnzyme activities as an indication of inorganic nutrient imbalance in microbial communities // AquaL Microb. Ecol. 2001. Vol. 23. P. 301-311.

26. Asgcirsson B., Hauksson J.B. and Gunnarsson H. Dissociation and unfolding of cold-active alkaline phosphatase from Atlantic cod in the presence of guanidinium chloride // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 6403-6412.

27. Mavromatis K., Tsigos I., Kokkinidis M., and Bouriotis V. Exploring the role of a glycine cluster in cold adaptation of an alkaline phosphatase // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 23302335.

28. Georlette D., Blaise V., Collins Т., D'Amico S., Gratia E., Hoyoux A., Marx J.C., Sonan G., Feller G., Gerday C. Some like it cold: biocatalysis at low temperatures // FEMS Microbiol. Rev.2004. Vol. 28. P. 25-42.

29. Olufsen M., SmaJas A.O., Мое E., and Brandsdal B.O. Increased flexibility as a strategy for cold adaptation // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. № 18. P. 18042-18048.

30. Smith D.C., Simon M., Alldredge A.L. and Azam F. Intense hydrolytic enzyme activity on marine aggregates and implications for rapid particle dissolution // Nature. 1992. Vol. 359. P. 139-142.

31. Paerl H.W., and Merkel, S.M. Differential phosphorus assimilation in attached vs. unattached microorganisms//Arch. Hydrobiol. 1982. Vol. 93. P. 125-134.

32. Azam F. and Cho B.C. Bacterial utilization of organic matter in the sea. In: Ecology of microbial communities. -UK: Cambridge University Press, 1987. P. 261-281.

33. Aono Т., Maldonado-Mcndoza I.E., Dewbre G.R., Harrison MJ. and Saito M. Expression of alkaline phosphatase genes in arbuscular mycorrhizas // New Phytol. 2004. Vol. 162. P. 525.

34. Asgeirsson В., Neilsen B.N., Hojrup P. Amino acid sequence of the cold-active alkaline phosphatase from Atlantic cod (Gadus morhua) // Сотр. Biochem. Physiol. B. 2003. Vol. 136. P. 45-60.

35. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. 1995. Vol. 3. P. 853-859.

36. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. 1995. Vol. 3. P. 853-859.

37. Koshland D. E. J. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions // Biol. Rev. 1953. Vol. 28. P. 416-436.

38. Vernon C.A. The mechanisms of hydrolysis of glycosides and their relevance to enzyme-catalyzed reactions//Proc. R. Soc. Ser. B. 1967. Vol. 167. P. 389-401.

39. Sinnott M. L. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transferase // Chem. Rev. 1990. Vol. 90. P. 1171-1202.

40. Henrissat B. A. Classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities // Biochem. J. 1991. Vol. 280. P. 309-316.

41. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. Vol. 293. P. 781-788.

42. Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Biochem. J. 1996. Vol. 316. P. 695-696.

43. Coutinho P.M., Henrissat B. 1999. Carbohydrate-Active Enzymes server at URL:http://afmb.cnrs-mrs.fr/~ca7A/CA7T/index.html.

44. Rigden DJ. Iterative database searches demonstrate that glycoside hydrolase families 27, 31, 36 and 66 share a common evolutionary origin with family 13 // FEBS Lett. 2002. Vol. 523. P. 17-22.

45. Naumoff D.G. Phylogenetic Analysis of a-Galactosidases of the GH27 Family // J. Mol. Biol. 2003. Vol. 38. P. 388-399.

46. Rigden D J., Jedrzejas MJ, de Mello L.V. Identification and analysis of catalytic TIM barrel domains in seven further glycoside hydrolase families // FEBS Lett. 2003. Vol. 544. P. 103-111.

47. Dey P.M., Biochemistry of a-galactosidic linkages in the plant kingdom // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1980. Vol. 37. P. 283-371.

48. French D. The rafTinose family of oligo-saccharides. In: Adv. Carbohydr. Chem. 9. NY: Academic Press, - 1954. P. 149.

49. Haibach F., Hata J., Mitra M., Dhar M., Harmata M., Sun P., Smith D. Purification and characterization of a Coffea canephora a-D-galactosidase isozyme // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 181. P. 1564-1571.

50. Zhu A, Goldstein J. Cloning and functional expression of a cDNA encoding coffee bean alpha-galactosidase // Gene. 1994. Vol. 140. № 2. P. 227-231.

51. Dhar M., Mitra M., Hata J., Butnariu O., Smith D. Purification and characterization of

52. Phaseolus vulgaris a-D-galactosidase isozymes // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. Vol. 34. P. 1055-1062.

53. Guimaraes V.M., de Rezende S.T., Moreira M.A., de Barros E.G., Felix C.R. Characterization of a-galactosidases from germinating soybean seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides // Phytochemistry. 2001. Vol. 58. P. 67-73.

54. Marraccini P., Rogers W.J., Caillet V., Deshayes A., Granato D., Lausanne F., Lechat S., Pridmore D., Petiard V. Biochemical and molecular characterization of alpha-D-galactosidase from coffee beans // Plant Physiol. Biochem. 2005. Vol. 43. P. 909-920.

55. Lee R-H., Lin M-C., Chen S-C. A novel alkaline a-galactosidase gene is involved in rice leaf senescence // Plant Mol. Biol. 2004. Vol. 55. P. 281-295.

56. Chinen I., Nakamura T., Fukuda N. Purification and properties of a-galactosidase from immature stalks of Saccharum officinarum (sugar cane) // J. Biochem. 1981. Vol. 90. P. 14531461.

57. Kang PLC., Lee S.H. Chaxacteristics of an a-galactosidase associated with grape flesh // Phytochemistry. 2001. Vol. 58. P. 213.

58. Feurtado J. A., Banik M., Bewley J. D. The cloning and characterization of a-galactosidasepresent during and following germination of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) seed // J. Exp. Bot. 2001. Vol. 52. P. 1239-49.

59. Kim, W.D, Kobayashi O., Kaneko S., Sakakibara Y., Park G. G., Kusakabe, I., Tanaka, H., Kobayashi H. a-Galactosidase from cultured rice ( Oryza sativa L. var. Nipponbare) cells. // Phytochemistry. 2002. Vol. 61. P. 621-630.

60. Keller F., Pharr M. Metabolism of carbohydrates in sinks and sources: galactosyl-sucrose oligosaccharides. In: Photoassimilate Distribution in Plants and Crops (Zamski, E. and SchafTer, A.A., eds). NY: Marcel Dekker, 1996. -P. 157-184.

61. SchafTer A.A., Pharr D.M. and Madore M. Cucurbits. In: Photoassimilate Distribution in Plants and Crops (Zamski, E. and SchafTer. A.A., eds). NY: Marcel Dekker, 1996. -P. 729-757.

62. Rackis J. Flatulence caused by soy and its control through processing // J. Am. Oil Chem. 1981. Vol. 58. P. 503-509.

63. Soh Ch-P., Ali Z.M., and Lazan H. Characterization of an a-galactosidase with potential relevance to ripening related texture changes // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 242-254.

64. Dey P. M. Transgalactosylation activity of sweet almond a-galactosidase: synthesis of saccharides // Phytochemistry. 1979. Vol. 18. P. 35.

65. Strobel G.A. Toxin binding protein of sugar cane, its role in the plant // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1974. Vol. 71. P. 4234.

66. Feldt-Rasmussen U., Rasmussen A.K., Mersebach H., Rosenberg K.M., Hasholt L., Sorensen S.A. Fabry disease a metabolic disorder with a challenge for endocrinologists? // Horm. Res. 2002. Vol. 58. P. 259-65.

67. Szmigielski S. An improved method for histochemical demonstration of P-glucuronidase and a-galactosidase activity in bone marrow and blood cells // J. Lab. Clin. Med. 1966. Vol. 67. P. 709.

68. Subba R.FL and Pieringer R.A. Metabolism of glyceride glycolipids-IV: Enzymatic hydrolysis of monogalactosyl and digalactosyl diglycerides in rat brain // J. Neurochem. 1970. Vol. 17. P. 483.

69. Russell R.R., Aduse-Opoku B.J., Sutcliffe I.C., Tao L. and. Ferretti J.J. A binding protein dependent transport system in Streptococcus mutans responsible for multiple sugar metabolisms //J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267 4631-4637.

70. Saier M. H., Chauvaux Jr., Cook S., Deutscher G. M., Paulsen J., Reizer I. T., Ye J.J. Catabolite repression and inducer control in Gram-positive bacteria // Microbiology. 1996. Vol. 142. P. 217.

71. Pardee A. An inducible mechanism for accumulation of melibiose in E. coli // J. Bacterid. 1957. Vol. 73. P. 376-385.

72. Orskov I., Orskov F. Plasmid determined H2S character in E. coli and its relation to plasmidcarried raffinose fermentation and tetracycline resistance characters // J. Gen. Microbiol. 1973. Vol. 77. P. 487-499.

73. Schmid K., Schmitt R. Raffinose metabolism in E. coli K12 // Eur. J. Biochem. 1976. Vol. 67. P. 95-104.

74. Muiznieks I., Rostoks N., Schmitt R. Efficient control of raf gene expression by CAP and two Raf repressors that bend DNA in opposite directions // Biol. Chem. 1999. Vol. 380. P. 19-29.

75. Rosenow C., Maniar M., Trias J. Regulation of the a-galactosidase activity in Streptococcus pneumoniae: characterization of the raffinose utilization system // Genome Res. 1999. Vol. 9. P. 1189-97.

76. Coombs J., Brenchley J. E. Characterization of two new glycosyl hydrolases from the lactic acid bacterium Carnobacterium piscícola strain BA // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 5094-5099.

77. Boucher I., Vadeboncoeur C., Moineau S. Characterization of genes involved in the metabolism of alpha-galactosides by Lactococcus rafifinolactis // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69. P. 4049-4056.

78. Silvestroni A., Connes C., Sesma F., De Giori G., S., Piard J., C. Characterization of the melA locus for a-galactosidase in Lactobacillus plantarum // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 8. P. 5464-5471.

79. Post-Beittenmiller M.A., Hamilton R.W., Hopper J.E. Regulation of basal and induced levels of the MEL1 transcript in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cellular Biol. 1984. Vol. 4. P. 1238.

80. Talbot G., Sygusch J. Purification and characterization of thermostable ß-mannanase anda-galactosidase from Bacillus stearothermophilus // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. P. 3505-3510.

81. Shibuya H., Kobayashi H., Sato T., Kim W.S., Yoshida S., Kaneko S., Kasamo K., Kusakabe I. Purification, characterization, and cDNA cloning of a novel a-galactosidase from Mortierellavinacea// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. Vol. 61. P. 592-598.

82. King M.R., Yernool D.A., Eveleigh D.E., Chassy B.M. Thermostable a-galactosidase from Thermotoga neapolitana cloning, sequencing and expression // FEMS Microbiol. Lett 1998. Vol. 163. P. 37-42.

83. Nagao Y., Nakada T., Imoto M., Shimamoto T., Sakai S., Tsuda M., Tsuchiya T., Purification and analysis of the structure of a-galactosidase from Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commuru 1988. Vol. 151. P. 236-241.

84. Ademark P., Larsson M., Tjerneld F., and Stalbrand H. Multiple a-galactosidases from Aspergillus niger : Purification, Characterization and Substrate specificity // Enzyme. Microb. Technol. 2001. Vol. 29. P. 441-448.

85. Zeilinger S., Kristufek D., Arisan-Atac L, Hodits R., Kubicek C.P. Conditions of formation, purification, and characterization of an a-galactosidase of Trichoderma reesei RUT C-30 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 1347-1353.

86. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биоетшетика. -М:ФАИР-ПРЕСС, 1999. -720 с.

87. Dey P.M. and Pridham J.B. Biochemistry of a-galactosidases // Adv. Enzymol. 1972. Vol. 36. P. 91.

88. Agnantiari G., Christakopoulos P., Kekos D., Macris B. J. A purified б-galactosidase from

89. Aspergillus niger with enhanced kinetic characteristics // Acta Biotechnol. 1991. Vol. 11. P. 479484.

90. Pederson D.M., Goodman R.E. Isozymes of a-galactosidase from Bacillus stearothermophilus // Can. J. Microbiol. 1980. Vol. 26. P. 978-984.

91. Dey P.M. Characteristic features of an a-galactosidase from mung beans (Vigna radiata) // Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 140. P. 385-390.

92. Varbanets D.L., Malanchuk V.M., BuglovaT.T.,and Kuhlmann R.A., Penicilliumsp.23 a-galactosidase: purification and substrate specificity // Carbohydr. Poly. 2001. Vol. 44. P. 357363.

93. Fujimoto Z., Kaneko S., Momma M., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of rice alpha-galactosidase complexed with D-galactose // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 2031320318.

94. Garman S.C., Hannick L., Zhu A., Garboczi D.N. The 1.9 A structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases // Structure. 2002. Vol. 10. P. 425-434.

95. Wilson IA. Crystal structure of alpha-galactosidase (ec 3.2.1.22) (melibiase) (tml 192) from Thermotoga maritima at 2.34 A resolution, Joint Center for Structural Genomics (JCSG). 2005.http://\vAVAv.rcsb.org/pdb/cgi/explore.cei?pdbId:=lZY9).

96. Gote M.M., Khan M.I. and Khire J.M. Active site directed chemical modification of a-5146): Involvement of lysine, tryptophan and carboxylate residues in catalytic site // Enzyme Microb. Technol. 2007. Vol. 40. P. 1312-1320.

97. Бернхард С. Структура и функция ферментов. -М: Мир, 1971.-334 с.

98. Мецлер Д. Биохимия. -М: Мир, 1980. Т. 2. -606 с.

99. Wilcox D.E. Binuclear Metallohydrolases // Chem. Rev. 1996. Vol. 96. P. 2435-2458.

100. Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфороорганических нейротоксинов // Успехи биол. хим. 2004. Т. 44. С. 307-340.

101. Chung 1 S.J. and Verdine G.L. Structures of End Products Resulting from Lesion Processing by a DNA Glycoylase/lyase // Chem. Biol. 2004. Vol. 11. P. 1643-1649.

102. Комов В.П., Шведова B.H. Биохимия. M: Дрофа, 2004. -С. 454.

103. Lam E., Fukuda H. and Greenberg J. Endonucleases // Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 44. P. 387-397.

104. Aoyagia S., Sugiyamaa M., Fukuda H. BEN1 and ZEN1 cDNAs encoding SI-type DNases that are associated with programmed cell death in plants // FEBS Lett. 1998. Vol. 429. P. 134138.

105. Zhang J. and Xu M. Apoptotic DNA fragmentation and tissue homeostasis // Trends Cell Biol. Vol.12.

106. Mai-Prochnow A., Evans F., Dalisay-Saludes D., Stelzer S., Egan S., James S., Webb J.S. and Kjelleberg S. Biofilm Development and Cell Death in the Marine Bacterium Pseudoalteromonas tunicata II Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70. P. 3232-3238.

107. Федосов. Ю.В., Михайлов B.B., Жигалина И.И., Иванова Е.П., Кожемяко В.Б., Оноприенко Н.В., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. A highly active alkaline phosphatase from marine bacteria // Док. Акад. Наук СССР, Т. 320. С. 485-487.

108. Иванова Е.П., Фролова Г.М., Михайлов В.В., Горшкова Н.М. Special screening of alkaline phosphatase of bacterial origins // Ж. Прикл. Биохим. Микробиол. Т. 28. С. 726-730.

109. Gonzales de Canales ML., Martin Rio M.P. Enzymes in marine invertebrates // Rev. Int. Oceanogr. Med. 1985. Vol. 59-60. P. 9-1.

110. Chen Q-X., Zheng W-Z., Lin J-Y., Shi Y., Xie W-Z., Zhou H-M. Effect of metal ions on the activity of green crab (Scylla serrata) alkaline phosphatase // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000. Vol. 32. P. 879-885.

111. Xiao R., Xie L-P., Lin J-Y., Li C-H., Chenc Q-X., Zhoua X-M., Zhang R-Q. Purification and enzymatic characterization of alkaline phosphatase from Pinctada fucata ИJ .Mol. Cat. B. 2002. Vol. 17. P. 65-74.

112. Krivanek J.O. Alkaline phosphatase activity in the developing slime mold, Dictiostelium discoideum raper// J.Exp. Zool. 1956. Vol. 133. P. 459.

113. Lim C-H., Ozkanca, Flint K.P. The effect of osmotic stress on survival and alkaline phosphatase activity of Aeromonas hydrophila // FEMS Microbiol. Lett. 1996. Vol. 137. P. 1924.

114. Gauthier M.J., Flatau G.N., Clement R.L. Influence of phosphate ions and alkaline phosphatase activity of cells on the survival of Escherichia coli in sea water // Microb. Ecol. 1990. Vol. 20. P. 245-251.

115. Анисимова E.B. Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны. Дис. . канд. биол. наук. Пущино. 2006. -108 с.

116. Manes Т., Hoylaerts, Muller R., Lottspeich, Holke W., Millan J.L. Genetic Complexity, Structure, and Characterization of Highly Active Bovine Intestinal Alkaline Phosphatases // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 23353-23360.

117. Harada Т., Koyama I., Matsunaga Т., Kikuno A., Kasahara Т., Hassimoto M., Alpers D.H., and Komoda T. Characterization of structural and catalytic difference in rat intestinal alkaline phosphatase isozymes // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 2477.

118. Гринштейн C.B., Кост O.A. Структурно-функциональные особености мембранных белков // Усп. биол. хим. 2001. Т. 41. С. 77—104.

119. Nesmeyanova М.А., Kalinin А.Е., Karamyshev A.L., Mikhaleva N.I. and Krupyanko V.I. Overproduction, secretion, isolation and properties of recombinant alkaline phosphatase encoded in Escherichia coli И Process Biochem. 1997. Vol. 32. P. 1-7.

120. Angelina S., Moreno R., Gouffi 1С, Santini C-LM Yamagishi A., Berenguer J., Wu L-F. Export of Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin-arginin translocation pathway in Escherichia coli // FEBS Lett. 2001. Vol. 506. P. 103-107.

121. Moura R.S., Martin J.F., Martin A., Liras P. Substrate analysis and molecular cloning of the extracellular alkaline phosphatase of Streptomyces griseus II Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 1525-1533.

122. Kriakov J., Lee S.h., Jacobs W.R. Identification of a regulated alkaline phosphatase, a cell surface-associated lipoprotein, in Mycobacterium smegmatis // J. Bacteriol. 2003. P. 4983-4991.

123. Berg PE. Cloning and characterization of the Escherichia coli gene coding for alkaline phosphatase // J. Bacteriol. 1981. Vol. 146. P. 660-667.

124. Antelmann H., Scharf C. and Hecker M. Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus subtilis: proteomics and transcriptional analysis // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 4478-4490.

125. Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria // J. Cell. Biochem. 1993. Vol. 51. P. 47-54.

126. Aguena M., Yagil E. and Spira B. Transcriptional analysis of the pst operon of Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 2002. Vol. 268. P. 518-524.

127. Qi Y., Kobayashi Y. and Hulett F.M. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the Pho regulon// J. Bacteriol. 1997. Vol. 179. P. 2534-2539.

128. Novak R., Cauwels A., Charpentier E. and Tuomanen E. Identification of a Streptococcus pneumoniae gene locus encoding proteins of an ABC phosphate transporter and a two-component regulatory system I I J. Bacterid. 1999. Vol. 181. P. 1126-1133.

129. Nikata T., Sakai Y., Shibat K., Kato J., Kuroda A. and Ohtake H. Molecular analysis of the phosphate-specific transport (pst) operon of Pseudomonas aeruginosa H Mol. Gen. Genet. 1996. Vol. 250. P. 692-698.

130. Fischer R-J., Oehmcke S., Meyer U., Mix M., Schwarz K., Fiedler T. and Bahl H. Transcription of the pst Operon of Clostridium acetobutylicum Is Dependent on Phosphate Concentration and pH // J. Bacterid. 2006. Vol. 188. P. 5469-5478.

131. Prägai Z., Allenby N.E.E., O'Connor N., Dubrac S., Rapoport G., Msadek T. and Harwood C.R. Transcriptional Regulation of the phoPR Operon in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 1182-1190.

132. Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Kajava A.V., Ksenzenko V.N. and Nesmeyanova M.A. Processing of Escherichia coli alkaline phosphatase: role of the primary structure of the signal peptide cleavage region // J.Mol.Biol. 1998. Vol. 277. P. 859-870.

133. Sargent F., Gohlke U., De Leeuw E., Stanley N.R., Palmer T., Saibil H.R. and and Berks B.C. Purified components of the Escherichia coli Tat protein transport system form a double-layered ring structure // Eur. J. Biochem. 2001. Vol. 268. P. 3361-3367.

134. Bhatti A.R., Alvi A., Chaudhry G.R. Evidence on the presence of two distinct alkaline phosphatases in Serratia marcescens II FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 182. P. 131-135.

135. Wagner K.U., Masepohl B., Pistorius E.K. The cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 contains a second alkaline phosphatase encoded byphoVII Microbiology. 1995. Vol. 141. P. 3049-3058.

136. Mudrik ZJ. Decomposition of organic and solubilisation of inorganic phosphorus compounds by bacteria isolated from a marine sandy beach // Mar. Biol. 2004. Vol. 145. P. 1227-1234.

137. De Prada P. and Brenchley J.E. Purification and Characterization of Two Extracellular Alkaline Phosphatases by a Psychrophilic Arthrobacter Isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 2928-2931.

138. Gomez P.F., Ingram L.O. Cloning, sequencing and characterization of the alkaline phosphatase gene (phoD) from Zymomonas mobilis IIFEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 125. P. 237-246.

139. Wojciechowski C.L., Cardia J.P. and Kantrowitz E.R. Alkaline phosphatase from the hyperthermophilic bacterium T. maritima requires cobalt for activity // Protein Sci. 2002. Vol. 11. P. 903-911.

140. Boulanger R.R. and Kantrowitz E.R. Characterization of a Monomelic Escherichia coli Alkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 23497-23501.

141. Zappa S., Rolland J-L., Flament D., Gueguen Y., Boudrant J., and Dietrich J. Characterization of a Highly Thermostable Alkaline Phosphatase from the Euryarchaeon Pyrococcus abyssi II Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 10:4504-4511.

142. Coleman J.E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1992. Vol. 21. P. 441-83.

143. Рое R.W., Sangadala V.S., Brewer J.M. Effects of various salts on the steady-state enzymatic-activity of Esherichia coli alkaline-phosphatase // J. Inorg. Biochem. 1993. Vol. 50. P. 173-180.

144. Nilsen I.W. Thermolabile alkaline phosphatase from Northern shrimp (Padalus borealis): protein and cDNA sequence analyses // Сотр. Biochem. Physiol. B. 2001. Vol. 129. P. 853-861.

145. Hauksson B.J., Andresson O.S., Asgeirsson. Heat-labile bacterial alkaline phosphatase from a marine Vibrio sp. // Enzyme Microb. Technol. 2000. Vol. 27. P. 66-73.

146. Murphy J.E. and Kantrowitz E.R. Why are mammaline alkaline phosphatases much more active than bacterial alkaline phosphatases? // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12. P. 351-357.

147. Murakawa Т., Yamagata H., Tsuruta H. and Aizono Y. Cloning of Cold-active Alkaline Phosphatase Gene of a Psychrophile, Shewanella sp., and Expression of the Recombinant Enzyme // Biosc. Biotech. Biochem. 2002. Vol. 66. P. 754-761.

148. Зернов Ю.П., Дедков B.C., Антонова Ю.А., Михненкова H.A., Дегтярев. Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina Р2 // Биотехнология, 2005. № 2. С. 38-43.

149. Kozlenkov A., Manes Т., Hoylaerts M.F. and Millan J.L. Function Assignment to Conserved Residues in Mammalian Alkaline Phosphatases // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 22992-22999.

150. Kobori H., Sullivan C.W., Shizya H. Heat-labile alkaline phosphatase from Antarctic bacteria: rapid 5'-end-labeling of nucleic acids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 6691-6695.

151. Chattopadhyaya M.K., Devi K.U., Gopishankar Y., Shivaji S. Thermolabile alkaline phosphatase from Sphingobacterium antarcticus a psychrotrophic bacteria from Antarctica // Polar. Biol. 1995. Vol. 15. P. 215-219.

152. Yan Sh.L., Liu Y.L., Tian X.J., Zhang Y.X. and Zhou H.M. Effect of Extraneous Zinc on Calf Intestinal Alkaline Phosphatase//J. Prot. Chem. 2003. Vol. 22. P. 371-375.

153. KoboriH., TagaN. Extracellular alkaline phosphatase from marine bacteria: purification and properties of extracellular phosphatase from a marine Pseudomonas sp // Can. J. Microbiol. 1980. Vol. 26. P. 833-838.

154. Donella-Deana A., Ostojic S., Pinna L.A. and Barbaric S. Specific dephosphorylation of phosphopeptides by the yeast alkaline phosphatase encoded by PH08 gene // Biochim. Biophis. Act. 1993. Vol. 1177. P. 221-228.

155. Stec B., Holtz K.M., Kantrowitz E.R. A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 299. P. 1303-1311.

156. Derman A.I. and Beckwith J. Escherichia coli alkaline phosphatase fails to acquire disulfide bonds when retained in the cytoplasm //J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 7719-7722.

157. Akiyama Y. and Ito K. Folding and assembly of bacterial alkaline phosphatase in vitro and in vivo //J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 8146-8150.

158. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc metallochemistry in biochemistry. Zinc metallochemistry in biochemistry. EXS. Vol. 32. P. 6493-6500.

159. Cathala G., Brunei C., Chappelet-Tordo, Lazdunski M. Bovine kidney alkaline phosphatase. Catalytic properties, subunit interactions in the catalytic process, and mechanism of Mg2+ stimulation //J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 6046-6053.

160. Holtz K.M., Stec B., Myers J.K., Antonelli S.M., Widlanski T.S., Kantrowitz E.R. Alternate modes of binding in two crystal structures of alkaline phosphatase-inhibitor complexes // Protein Sci. 2000. Vol. 9. P. 907-915.

161. Williams and Wilkins. Bergey's manual of systematic bacteriology. Baltimore, London, 1984.-P. 141-199.

162. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

163. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of the bacteriophageT7//Nature. 1970. Vol.227. P.680-685.

164. ChenP.S., Toribar, Ir.T.Y., Warne, H. Microdetermination of phosphorus // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 1756-1758.

165. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. -М: Высшая школа, 1991.

166. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. -NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

167. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol. 18. P. 2714-2723.

168. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis // J. Mol. Model. 2001. Vol. 7. P. 306-317.

169. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K. MOLMOL: a program for display 713 and analysis of macromolecular structures //J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14. P. 51-55.

170. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism//Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 33.

171. Sayle R. A., Milner-Whit, E. J. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20.374-376.

172. McHugh D.J. Production and utilization of products from commercial seaweeds // FAO Fish. Techn. Pap. 1987. Vol. 288. P. 189.

173. Hata D.J. and Smith D.S. Blood group В degrading activity of Ruminococcus gnavus alpha-galactosidase // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2004. Vol. 32. P. 263-274.

174. Brumer III H., Sims P.F.G. and Sinnot M.L. Lignocellulose degradation by Phanerochaete chrysosporium: purification and characterization of the main a-galactosidase // Biochem. J. Vol. 339. P. 43-53.

175. Chien S-F., Lin-Chu M. The conversion of group В red blood cells into group О by an a-galactosidase from taro (Colocacia esculenta) II Carbohydr. Res. 1991. Vol. 217. P. 191-200.

176. Phillips R., Smith D. Characterization of coifea canephora alpha-D-galactosidase blood group В activity // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1996. Vol. 24. P. 489-502.

177. McGlynn P. and Lloyd R.G. RecG helicase activity at three- and four-strand DNA structures //Nuc. Acids Res. 1999. Vol. 27. P. 3049-3056.

178. Комов В.П., Шведова B.H. Биохимия, гл. «Репарация ДНК». -М:Дрофа, 2004. -С. 454.

179. Zavodszky P., Kardos J., Svingor A., Petsko G. A. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 7406-7411.

180. Maranville E. and Zhu A. Assessment of amino-acid substitutions at tryptophan 16 in a-galactosidase // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 1495-1501.

181. Kachurin A.M., Golubev A.M., Geisow M.M., Veselkina O.S., Isaeva-Ivanova L.S., Neustroev K.N. Role of methionine in the active site of alpha-galactosidase from Trichoderma reesei // Biochem. J. 1995. Vol. 308. P. 955-964.

182. Venyaminov S.Yu., Vassilenko K.S. Determination of protein tertiary structure class from circular dichroism spectra//Anal. Biochem. 1994. Vol. 222. P. 176-184.

183. Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Fiser A., Rost B. and Sali A. Reliability of assessment of protein structure prediction methods // Structure. 2002. Vol. 10. P. 435-440.

184. Olsen R.L., Overbo K., Myrnes B. Alkaline phosphatase from the hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): a dimeric enzyme with catalitically active subunits // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1991. Vol. 99. P. 755-761.

185. Торчинский Ю.М. (под ред. Браунштейна А. Е.). Сера в белках. М:Наука, 1977. - С. 150-158.

186. Ammerman J.W., Azam F. Bacterial 5'-nucleotidase in aquatic ecosystems: a novel mechanism of phosphorus regeneration // Science. 1985. Vol. 227. P. 1338-1340.

187. Cotner J.B., Wetzel R.G. 5'-Nucleotidase activity in a eutrophic lake and an oligotrophic lake // Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol. 57. P. 1306-1312.

188. Wojciechowski Ch.L. and Kantrowitz E.R. Altering of the Metal Specificity of Escherichia coli Alkaline Phosphatase // J. Biol. Chem 2002. Vol. 277. P. 50476-50481.

189. Wang J., Stieglitz FLA., Kantrowitz E.R. Metal specificity is correlated with two crucial active site residues in Escherichia coli alkaline phosphatase // Biochemistry. 2005. Vol. 44. P. 8378-86.

190. Dinner A.R., Sali A., Smith L.J., Dobson C.M., Karplus M: Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25. P. 331-339.

191. McGreevy R.L., Pusztai L. Reverse Monte Carlo simulation: a new technique for the determination of disordered structures // Molec. Simul. 1988. Vol. 1. P. 359- 367.

192. Kojima M., Ayabe K., Ueda H. Importance of Terminal Residues on Circularly Permutated Escherichia coli Alkaline Phosphatase with High Specific Activity // J. Biosci. Bioengin Vol 100. P. 197-202.

193. Bushmarina, N.A., Blanchet, C.E., Vernier, G., and Forge, V. (2006) Co factor effects on the protein folding reaction: Acceleration of a-lactalbumin refolding by metal ions. Prot Sci 15:659671.

194. Janeway C.M., Xu X., Murphy J.E., Chaidaroglou A., Kantrowitz E.R. Magnesium in the active site of Escherichia coli alkaline phosphatase is important for both structural stabilization and catalysis // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 1601-1609.

195. Babor M., Greenblatt H.M., Edelman M., Sobolev V. Flexibility of Metal Binding Sites in Proteins on a Database Scale // Proteins. 2005. Vol. 59. P. 221-230.

196. Zalatan J.G, Herschlag D. Alkaline phosphatase mono- and diesterase reactions: comparative transition state analysis // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol.128. P. 1293-1303.

197. Hoylaerts M.F., Ding L., Narisawa S., Van Kerckhoven S., Millan J.L. Mammalian alkaline phosphatase catalysis requires active site structure stabilization via the N-terminal amino acid microenvironment // Biochemistry. 2006. Vol. 45. P. 9756-9766.

198. Orhanovic S., Bucevic-Popovic V., Pavela-Vrancic M., Vujaklija D., Gamulin V. Effect of a T81A mutation at the subunit interface on catalytic properties of alkaline phosphatase from Escherichia coli // Int. J. Biol. Macromol. 2006. Vol. 40. P. 54-58.

199. Galperin M.Y., Jedrzejas M.J. Conserved core structure and active site residues in alkaline phosphatase superfamily enzymes // Protein: Struct. Func. Gen. 2001. Vol. 45. P. 318 324.

200. Ma L. and Kantrowitz E.R. Mutations at histidine 412 alter zinc binding and eliminate transferase activity in Escherichia coli alkaline phosphatase // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 31614-31619.247.

201. Xu X, Kantrowitz ER. A water-mediated salt link in the catalytic site of Escherichia coli alkaline phosphatase may influence activity // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 7789-7796.

202. Анисимова B.E., Ребриков Д.В., Жулидов П.А., Староверов Д.Б., С.А. Лукьянов, А.С. Щеглов. Ренатурация, активация и практическое использование рекомбинантной дуплекс-специфичной нуклеазы камчатского краба //Биохимия. 2006.Т. 71. С. 636 644.

203. Mustak A. Kaderbhai, Hazel М. Davey and Naheed N. Kaderbhai. A directed evolution strategy for optimized export of recombinant proteins reveals critical determinants for preprotein discharge //Protein Sci. 2004. Vol. 13. P. 2458-2469.

204. Martinez-Martinez I, Navarro-Fernandez J, Lozada-Ramirez JD, Garcia-Carmona F, Sanchez-Ferrer A. Maximization of production of his-tagged glycine oxidase and its M261 mutant proteins. Biotechnol Prog. 2006 May-Jun;22(3):647-52.

205. Rest J.S. and Mindell D.P. Retroids in Archaea: Phylogeny and Lateral Origins // Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 1134-1142.

206. ScheefTE.D. and Bourne P.E. Application of protein structure alignments to iterated hidden Markov model protocols for structure prediction // BMC Bioinformatics. 2006. Vol. 7. P. 410 doi.TO.l 186/1471-2105-7-410.

207. Sheehan D., O'Sullivan S. Homology modeling of milk enzymes using on-line resources: Insights to structure-function and evolutionary relationships // Int. Dairy J. 2006. Vol. 16. P. 701706.

208. Tsai J, Bonneau R, Morozov AV, Kuhlman B, Rohl CA, Baker D: An improved protein decoy set for testing energy functions for protein structure prediction. Proteins 2003,53(1);76-87.

209. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nuc. Acids Res. 2000. Vol. 28. P. 235-242.