Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-функциональная характеристика гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем Забайкалья

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-функциональная характеристика гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем Забайкалья"

005014634

РАДНАГУРУЕВА Арюна Арсалановна

ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ТЕРМАЛЬНЫХ И ЩЕЛОЧНЫХ ВОДНЫХ СИСТЕМ ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ-2012

005014634

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (ФГБУН ИОЭБ СО РАН)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Лаврентьева Елена Владимировна

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович

Семенов Александр Михайлович -

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Буянтуева Любовь Батомункуевна -

кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО БГУ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «26» марта 2012 г. в 11.30 ч. на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, Биолого-географический факультет, конференц-зал Факс: (3012) 210588 E-mail: d21202203Qmail.ru aryiina re&lmail. ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан </А% февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Шорноева Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В последние десятилетия микробные сообщества термальных и щелочных местообитаний находятся в центре внимания исследователей (Brock, 1978; Бонч-Осмоловская, 1999; Заварзин, 2004; Жилина, 2005; Горленко, 2004; Намсараев, 2006; Кевбрин, 2007). Изучение микроорганизмов из этих сообществ на молекулярном уровне позволило выявить новые метаболические пути и механизмы биохимической адаптации, что значительно обогатило современную фундаментальную микробиологию.

Термофильные и алкалофильные гидролитические бактерии представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп микроорганизмов и являются источником новых ферментов и метаболитов для промышленности и медицины. На данный момент известно большое число термо-/ алкалофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз полимерных субстратов - амилолитики (Krishnan и Chandra, 1983; Gupta et al., 2003), целлюлозолитики (Bergquist et al., 1999, Uhl и Daniel, 1999, Andrade et al., 2001, Kozina et al., 2009 и др.) и протеолитики. Большинство протео-литиков растут и используют в качестве источника углерода и энергии пептиды, благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений pH и температур (Klingeberg et al., 1995; Ward et al., 2002). В целом, в природных местообитаниях гидролитики занимают нишу первичных деструкторов, благодаря способности гетеротрофно расти на биополимерах различной природы (Кубланов, 2011).

Распространение аэробных органотрофных бактерий в водных системах Забайкалья ранее изучалось эпизодически (Храпцова и др., 1984; Намсараев, 2003; Nazina et al., 2004; Зайцева, 2004). Знания о видовом разнообразии и функциональной активности представителей аэробного микробного сообщества щелочных термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья были недавно пополнены (Базаржапов, 2005; Бабасанова, 2007; Шагжина, 2007; Митыпова, 2007).

Вместе с тем, к началу нашей работы изучены гидролитические ферменты только ограниченного числа микроорганизмов водных систем Забайкалья. Очевидно, что их разнообразие и метаболические свойства исследованы недостаточно, а биотехнологический потенциал микроорганизмов раскрыт далеко не полностью. Это делает актуальным проведение новых исследований, связанных с распространением, разнообразием и функциональной активностью бактерий в термофильных и алкалофильных микробных сообществах экстремальных водных систем Забайкалья.

Цель работы: изучить гидролитические бактерии и их функциональную роль в термальных и щелочных водных системах Забайкалья.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить распространение аэробных гидролитических бактерий в донных осадках и микробных матах термальных источников и содово-соленых озер;

• Выделить чистые культуры гидролитических микроорганизмов и определить их таксономическое положение;

• Изучить экофизиологические и биохимические свойства чистых культур;

• Выделить пептидазы гидролитических бактерий и изучить их свойства;

• Изучить функциональную роль гидролитических бактерий в микробном сообществе.

Научная новизна и практическая значимость. С помощью микробиологических и молекулярно-генетических методов выявлено распространение аэробных алкалотермофильных органотрофных бактерий-продуцентов пептидаз семейства ВасШасеае и РаешЬасШасеае в термальных источниках Байкальского региона.

Выделен и детально охарактеризован предположительно новый вид алкалотермофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «АпохуЬасШю эр. поу.;>. Показано, что данная бактерия является активным продуцентом термостабильной сериновой субтилизин-подобной пептидазы, имеющей оптимум активности при 50°С и рН 11,1.

Изученные пептидазы (сериновые субтилизин-подобного типа) апка-ло-/термофильных гидролитических бактерий обладают высокой температурной (от 23 до 60 °С) и рН стабильностью (от 6,3 до 11,4).

Впервые получены очищенные препараты пептидаз из источников Забайкалья, изучены их важнейшие физико-химические свойства. Впервые представлены данные по наличию ингибиторной активности пептидаз у бактерий содово-соленых озер Забайкалья.

Полученные результаты расширяют представления о разнообразии и экологическом значении гидролитических бактерий в экстремальных местообитаниях. Полученные очищенные препараты пептидаз могут найти практическое применение в биотехнологии, как ферменты устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганиз-

мов» (Москва, 2009); I International conference "Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook" (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 18 печатных работ.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Мо-лекулярно-биологическая часть работы проводилась в Центре «Биоинженерия» РАН г. Москва. Работа по изучению внеклеточных пептидаз проводилась в НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством д.б.н. Дунаевского Я.Е.

Объел» и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на /^"страницах машинописного текста, включает таблиц, рисунков. Библиография содержит«?// наименований, в т.ч. ■/}£- зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за общее научное руководство научному руководителю к.б.н. Е.В. Лаврентьевой и научному консультанту д.б.н., проф. Я.Е. Дунаевскому.

Автор выражает благодарность за помощь в работе и поддержку заведующему лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и всем сотрудникам лаборатории, заведующему лабораторией белков растений д.б.н., проф. М.А. Белозерскому и всем сотрудникам НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, а также к.б.н. Б.Б. Кузнецову (Центр «Биоинженерия» РАН).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке фантов РФФИ № 10-04-90798_моб_ст, № 10-04-93169_Монг_а, МО РФ РНП 2.1.1/2165.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения по разнообразию микробного сообщества термальных источников и содово-соленых озер, рассмотрены общие свойства гидролитиков и их гидролаз, приведена современная классификация гидролитических ферментов (пептидаз) по базе данных

МЕЯОРБ, представлены современные данные о роли внеклеточных пепти-даз в прокариотной клетке и функционировании микробного сообщества в экстремальных местообитаниях, особое внимание уделено механизмам адаптации микроорганизмов к высоким температурам и рН, а также представлены данные о биотехнологическом применении внеклеточных пепти-даз микроорганизмов.

Глава 2. Объекты и методы исследований

Объектами исследования являлись термальные источники Алла, Ум-хэй, Гарга, Сеюя, Гусиха, Уро и Горячинск, расположенные в Курумкан-ском, Баргузинском и Прибайкальском районах республики Бурятия. Температура воды на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (39 - 74°С). Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,1°С), Алла (70° С), Гусиха (72°С) и Гарга (74° С). Воды имели щелочную реакцию, значения рН варьировали от 8,1 до 9,7. Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива.

Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и микробных матов в летне-осенний период с 2008 по 2010 годы.

Предметом исследований служили гидролитические бактерии: (табл. 1): иг-6к, Вг-2-2к, Са-9-2к, А1-9-Г и Бе-Г, выделенные из микробных матов и донных осадков термальных источников Бурятии (Бабасанова и др., 2006) и 5 культур БКГ, К5К, К6К, ЦЗ" и Ыи", выделенные из донных отложений и воды содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур (Забайкалье) (Митыпова и др., 2005). Все штаммы получены из коллекции лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ.

Таблица 1

Физико-химическая характеристика местообитаний

Штамм Объест выделения т,"с пробы рн пробы Вид пробы

Оа-9-2" Гарга 57,4 8,2 мат

А1-9-Г Алла 61,5 9,75 мат

иг-6" Уро 62,0 8,7 мат

Вг-2-2" Большая речка 51,5 9,25 маг

Бе-Г Сеюя 49 9,7 мат

БКГ Соленое 22 9,9 Д.ос.

К.5" « 22 9,9 д.ос.

Кб" « 22 9,9 д.ос.

цз' « 22 9,9 Д.ос

N11" Нухэ-Нур 27 9.84 вода

Примечание: д.ос. - донные осадки;" - коллекционные культуры ИОЭБ СО РАН

Физико-химические методы исследования гидротерм

Определение физико-химических параметров воды, донных осадков в местах отбора проб проводили общепринятыми методами (Намсараев и др., 2006).

Содержание органического углерода (Сорг) в пробах определяли по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1980). Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Практикум по микробиологии, 2005). Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколоримет-ре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-1021 (Великобритания).

Методы учета численности и выделения накопительных и чистых культур гидролитических бактерий. Учет численности и выделение аэробных алкалотермофильных гидролитических бактерий проводили методом предельных разведений и высева на агар на среде Пфеннига следующего состава (г/л): NH4C1 - 0,3; KJH2P04 - 0,3; MgCl2 - 0,3; СаС12 - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; раствор микроэлементов по Липперту, Витману - 1 мл. В качестве субстратов вносили (в %): для протеолитиков - пептон (1,5); для амилолитиков - крахмал (1,5); для целлюлолитиков - полоску фильтровальной бумаги (1); для липолитиков - твин-80 (1,5). рН25С среды доводили бикарбонатно-карбонатным буфером до 8,5-9,5, температура инкубации для культур из содово-соленых озер составляла 37°С, для культур из термальных источников - 50°С.

Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопированием препаратов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000) и ультратонких срезах в электронном микроскопе Jeol JEM-100C (Япония).

Молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК проводили из биомассы бактерий (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система (Lane, 1991). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США).

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера с соавт. (Sanger at al, 1977) с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,US А). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью программного пакета BLAST (Camacho at al., 2009).

Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer and De Wächter, 1994).

Метагеномный анализ проведен на пиросеквенаторе Roche 454 GS-FLX Titanium (Южная Корея). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (ver 2.58).

Анализ жирных кислот. Состав жирных кислот анализировали на хроматографе Шерлок (Microbial Identification System, MIDI Inc, USA). Исследования выполнены в Национальном университете, Чанчон, Южная Корея.

Изучение физиолого-биохимических свойств гидролитических культур. Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате от 20 до 80°С. Диапазон рН25°с устанавливали с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия (от 6,0 до 11,0). Способность к использованию различных источников углерода проверяли на минеральной среде, в которую вносили испытуемые источники углерода в концентрации 0,5 - 1 % от объема среды. Биомассу бактерий определяли по изменению оптической плотности культуры при длине волны 560 нм. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста определяли общепринятыми методами (Практикум по микробиологии, 2005).

Определение общей активности пептидаз проводили на белковых субстратах: азоказеин и желатина. Для определения субстрат-специфичной активности использовали синтетические 20 мМ л-нитроанилидные субстраты, специфичные для определенных групп пептидаз - GIpAALpNa для субтилизин-подобных, GlpFpNa - химотрипсин-подобных, ВАРА - трипсин-подобных, GlpFApNa - цистеиновых, R-pNa, L-pNa, F-pNa, Y-pNa -аминопептидаз (Erlanger et al., 1961). Для выяснения природы функциональных групп активного центра использовали ингибиторы, специфичные для различных классов пептидаз: EDTA и о-фенантролин для металлопеп-тидаз, PMSF для сериновых пептидаз, IAA для цистеиновых пептидаз. Оптимум активности в зависимости от рН25°с определяли в 0,5М универсальном буфере в диапазоне pH 2,4 - 12. Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при значениях температуры от 23 до 80°С.

Выделение и очистка ферментов культур Se-1-Ю и Gor-10s проводили из препаратов культуральной жидкости бактерий методами диализа, ионообменной хроматографии на колонке Mono Q в режиме FPLC. Определение молекулярных масс ферментов проводили методом гель-хроматографии на Superdex 75.

Методы математического анализа. Все расчеты были проведены с использованием Ехсе12003 и пакета программ MathLabR2010а для Windows.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение Исследование химического состава нативных проб

Важным фактором, влияющим на активность и жизнедеятельность микробного сообщества, является качественный и количественный состав органического вещества в среде обитания.

В донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур обнаружено высокое содержание Сор,- (10,0-15,4 %). Основными источниками ОВ в изученных содовых озерах является фитопланктон и прибрежная растительность. Содержание белка было относительно низким (от 0,1 до 0,23 мг/см ) (Митыпова, 2007).

Общее содержание органического углерода в пробах исследованных термальных источников варьировало в пределах от 0,3% до 6,03% и зависело от вида пробы. Максимальные значения (5,57 и 6,03%) были отмечены в микробных матах гидротерм Гарга и Сеюя (табл. 2). Количество белка в исследуемых пробах составило от 1,1 (ист. Горячинск) до 4,36 мг/см (ист. Умхэй). В целом, отмечено, что концентрация органического вещества в микробных матах была выше, чем в донных осадках.

Таблица 2

Физико-химическая характеристика проб

Источник Вид пробы t,°c рН Белок, мг/см3 Сорг, % Содержание углерода ОВ, % на минеральную часть навески

Горячинск д.ос. 52 9,3 1,1 0,3 4,41

д.ос. 46 9,28 2,74 0,42 20,83

м.м 52,3 9,3 2,15 2,0 97,29

Гарга м.м 61 8,5 3,44 0,27 н.о

м.м 35 8,2 1,21 5,57 1362,85

Сеюя м.м 50 9,77 2,96 6,03 2711,76

Умх'зй м.м 40 9,64 4,36 1,61 36,16

д.ос. 40 9,64 2,02 0,46 19,65

Примечание: д.ос. - донные осадки; м.м - микробный мат; н.о - не определено

Сравнительный анализ содержания Сорг и белка микробных матов и донных осадков термальных источников показал, что удельное содержание ОВ выше в микробных матах, что может быть объяснено высокой интенсивностью продукционных процессов в матах в отличие от донных осадков (Jorgensen, Nelson, 1988; Navarrete et al., 2000; Заварзин, 1993, 2003).

Основные экологические параметры воды термальных источников Забайкалья были проанализированы с использованием метода главных ком-

понент (Geladi, 1989; Gorban, Zinovyev, 2010), что позволило определить наиболее важные факторы для функционирования системы.

Были определены четыре главные компоненты (PC - Principal Component), которые объясняют 94% наблюдаемых вариаций. РС1 объясняет 61% наблюдаемых параметров представляет собой рН и количество белка в нативных пробах. Наибольший вклад во вторую компоненту РС2 - 25% наблюдаемых изменений в среде, оказывают численность протеолитиков и тип пробы, состоящий из микробных матов и донных осадков. РСЗ (минерализация и содержание органического вещества) и РС4 (температура) имеют меньшее значение, объясняя 4,2% и 3,78% изменений, соответственно.

Анализ показал, что функционирование гидролитического микробного сообщества в первую очередь, регулируется такими факторами, как рН и содержание белка в пробах.

Численность гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем Забайкалья

В естественных местообитаниях гидролитические бактерии занимают нишу первичных деструкторов органического вещества.

Таблица 3

Численность аэробных протеолитических бактерий термальных источников, lg кл/см3

Объект Т,°С рн Протеолитики Амилолитики

пробы пробы д.ос. м.м. д.ос. м.м.

Гарга 55 8,67 4 6 3 4

70 8,5 4 - 2 -

Алла 70 9,44 3 4 2 3

65 9,2 - 5 - 3

45 8,33 5 5 2 4

40 9,19 5 - 3 .

Уро 43 8,8 5 - 2 -

46 9,19 - 4 - 3

63 9,04 - 5 - 2

Умхей 40 9,64 4 5 3 3

Горячинск 52 9,3 5 6 4 5

46 9,28 5 - 3 -

42,1 9,41 5 - 5 -

Сеюя 50 9,77 4 7 - 4

Соленое 22 9,9 8* - 6* -

Нухэ-Нур 27 9,84 6* - 6* -

Примечание: «-»- нет данных; *- данные Митыповой Т.Н.

Численность протеолитических бактерий в донных осадках и микробных матах варьировала в пределах от 1000 до 100 млн. кл/см3 (табл. 3). Наибольшее число микроорганизмов обнаружено в поверхностном мик-

робном мате источника Сеюя и в матах Гарги и Горячинск (до Ю^млн. кл/см3) и в донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур (до 100 млн. кл/см ).

Максимальное число бактерий (10 тыс. кл/см3), использующих в качестве основного субстрата - крахмал, зафиксировано в донных осадках и микробных матах источника Горячинск, оз. Соленое и Нухэ-Нур. Обнаружено, что численность аэробных протеолитиков и амилолитиков превышает численность липолитиков и ЦРБ в среднем на 2-4 порядка. Так максимальное количество липолитиков и целлюлозолитиков (анаэробы) достигало 100 кл/см3.

Таким образом, высокая численность разных физиологических групп бактерий указывает на широкое распространение первичной деструкцион-ной ветви микробного сообщества. Отмечено, что вследствие высоких концентраций белка и ОВ, численность бактерий-деструкторов выше в микробных матах, чем в донных осадках.

Выделение и характеристика гидролитических бакгтерип термальных водных систем Забайкалья

Из проб микробных матов и донных осадков термальных источников Бурятии: Гарга, Алла, Умхей, Сеюя и Горячинск было выделено 28 штаммов гидролитических бактерий (табл. 4).

Таблица 4

Характеристика штаммов, выделенных из термальных источников Забайкалья

Штамм Источник Вид пробы Физиологическая группа

8е-1-10 Сеюя м.м. Протеолигик

Сея-09

А7 Амилолитик

А8

Л7 Липапитик

Л8

11ш-09т Умхей м.м. Протеолигик

1)т-09к1 дос.

иш-0952

АН Алла дос. Амилолитик

А12 м.м.

Л12 Липолитик

Л13 д.ос.

Л15 м.м.

вог-Юв Горячинск дос. Протеолитик

йог-10-3 м.м.

Сог-10-1т

Сог-10-2

Продолжение табл. 4

Га-35 Гарга м.м. Протеолитик

А9 Амилолитик

А10

Л10 Липолитик

Al Уро песок Амилолитик

А2 м.м.

Л2 Липолитик

Л4

А5 д.ос. Амилолитик

Л5 Липолитик

Примечание: жирным шрифтом выделены штаммы с известным филогенетическим положением

Морфология. Клетки бактерий представлены различными спорообра-зующими грамположительными палочками, размеры которых варьировали в пределах от 0,5-4,96 х 1,1-16,6 мкм. Размеры спор составляли 1,13 - 1,57 мкм.

Экофизиология. Исследование экофизиологии, выделенных культур протеолитиков из термальных источников, показало, что они способны развиваться в широком диапазоне температур (23-60°С) и рН (7,6-10,0), проявляя свойства алкало- и термотолерантности. В соответствии с имеющимися классификациями бактерий в отношении температуры и рН, изученные штаммы распределились следующим образом:

• Штаммы бактерий-деструкторов (SKI", К5К, К6К, ЦЗК и NuK), выделенные из содово-соленых озер Забайкалья, характеризуются как мезо-филы с оптимумом роста в диапазоне от 23 до 30°С и оптимумом рН от 7,6 до 10;

• Большая группа штаммов (Gor-10-З, Сея-09, Um-09sl, Um-09s2, Gor-10-lm, Um-09m, Га-35 и Gor-10s), выделенных из термальных источников, характеризуются как термоалкалотолерантные, с оптимумом развития в диапазоне от 40 до 45°С и оптимумом рН от 7,5 до 9,5;

• Штаммы бактерий (Gor-10-2, Ur-6K, Br-2-2K, Ga-9-2K, Al-9-1* и Se-1K), выделенные из термальных источников, характеризуются как термоал-калофильные, с оптимумом роста в диапазоне от 50 до 60°С и оптимумом рН от 8,0 до 8,5.

Генотипическая характеристика. Методом пиросеквенирования по гену 16S рРНК микробного мата получены данные, характеризующие состав микробного сообщества.

В сообществе микробного мата, развивающегося при рН 9,47 и температуре 67°С в источнике Алла (2402 н.п., 80 OTE), доминируют филы Dei-nococcus - Thermus (45%) и Nitrospirae (36%). Proteobacteria и Firmicutes составляют 3 и 2%, соответственно. Cloroflexi и Cyanobacteria - формообразующие компоненты микробных матов, в структуре данного сообщества

занимают 3% и 0,37%, соответственно. Произведен анализ графиков, иллюстрирующие зависимость числа детектированных филотипов (т.е. числа кластеров) от числа проанализированных последовательностей (Марданов, 2010). Проведенная оценка таксономической сложности сообщества позволила показать разнообразие 83 видов бактерий.

Изучение видового разнообразия выделенных бактерий молекулярно-генетическим методом показало, что выделенные культуры относятся к родам Bacillus, Anoxybacillus и Paenibacillus.

Для анализа гена 16S рРНК было отобрано 3 штамма (Um-09m, Га-35 и Gor-10s). В результате было показано, что штамм Um-09m имеет 99,8 % сходства с Bacillus licheniformis штамм BPRIST006. Наибольшее сходство у культур Га-35 и Gor-10s выявлено с Paenibacillus dendritiformis штамм Р411 (100%).

Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах

Изучение биохимических параметров иативных образцов показало, что наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая активность при использовании в качестве субстрата желатины обнаружена в источнике Сеюя - от 0,13 до 1,02 ед. в донных осадках и от 0,36 до 1,09 ед. в микробных матах. Высокая ферментативная активность, вероятно, обусловлена тем, что в местах отбора проб, зафиксированы наибольшие количества органического вещества (до 6,03%) и численности гидролитических бактерий (от 10 тыс. до 10 млн. кл/см3). Активное разложение желатины было отмечено также в образцах источников Гусиха (0,12 - 0,51 ед.) и Алла (0,22 - 0,49 ед.). Пробы из источника Гарга имели незначительную активность по желатине (0,13 - 0,24 ед.), т.к. точки отбора проб находились на выходе источника и характеризовались низкими значениями Сорг (0,27%) и численности (до 10 тыс. кл/см3).

В образцах источников Алла, Умхей, Сею я обнаружена трипсин-подобная активность. Значения активности варьировали от следовых до 0,65 ед. Образцы источников Гарга и Гусиха характеризовались низкими значениями активности по данному субстрату (<0,12 ед.).

Таким образом, показана высокая вариабельность в распределении активности пептидаз в зависимости от типа образца. Высокие значения суб-тилизин-подобной активности обнаружены в микробных матах. Максимальные величины трипсин-подобной активности были определены, как в микробных матах, так и в донных осадках. Проведенные исследования показали высокую степень участия внеклеточных ферментов в нативных образцах в деструкции органического вещества в термальных источниках.

Внеклеточная протеолитическая активность гидролитических бактерий

В качестве источников секретируемых внеклеточных пептидаз использовали культуральные жидкости 9 алкало-термофильных штаммов йог-10-3, Сея-09, Сог-10-2, ит-ОЭвЦ ит-09з2, Сог-10-1т, иш-09т, Га-35 и Оог-10б, выделенных го микробных матов и донных осадков термальных источников Забайкалья и 10 органотрофных культур, предоставленных из коллекции ИОЭБ СО РАН (табл. 5).

Таблица 5

Краткая характеристика органотрофных культур

№ Штамм Место выделения/ источник выделения Таксономическая принадлежность* Отношение к02 Нш/ КаС1от

Из содово-соленых озер

1 Ыи" оз. Нухэ-Нур/ вода Sanguinoglea а!каШо1егат йеп. поу., эр. поу. 8А 0-7,5/0,51,5

2 8К1* оз. Соленое/ донные осадки ЬуаПкоУ1е!1а elongate 0еп. поу., Бр. поу. БА 0-7,5/3,0

3 ЦЗ" » ВасШж кгиЫгккае (100%) РАп 0-20,0/10,0

4 К5' » ВасШш ¡аИркПих (100%) РАп 0-20,0/3-7,5

5 Кб" » НЫотопаэ ациатаппа (99%) РАл 0-20,0/ 7,5-10,0

Из термальных источников

6 иг-6к Уро/ микробный мат ВасШш кет1се11и1о5о1уйсит С-11 (99 %) РАп 0-50/0

7 Вг-2-2" Большая речка/ микробный мат ВасШш ИсИет/огтгз ВВОС6 (97 %) Рап 0-50/0

8 Оа-9-2" Гарга/ микробный мат АпохуЪасШиэ АамйЪегтт ИБМ 2641 (226932) (95 %) РАп 0-20/0

9 А1-9-Г Алла/ донные осадки АпохуЬасШиз р1шксЫпоет15 АТ-2 (АВ234214) (96%) РАп 0-20/0

10 ве-!' Сеюя/ донные осадки АпохуЬасШиз ртксЫпоет^з АТ-2 (АВ234214) (95%) РАп 0-50/0

Примечание: Таксономическая принадлежность оценена на основании анализа последовательности гена 168 рРНК, в скобках указан % гомологии с ближайшим родственным организмом; БА - строгий аэроб; РАп - факультативный анаэроб.

Наиболее важным фактором определяющим активность внеклеточных ферментов является наличие в питательной среде оптимального субстрата в процессе роста культур. Нами проведено сравнительное изучение секреции внеклеточных пептидаз в зависимости от источника азота (триптон,

пептон, казеин, неорганический источник азота) и времени культивирования (от 12 до 96 ч). Установлено, что максимальная активность по азока-зеину у штаммов Um-09m, Га-35 и Gor-10s проявляется на среде с трипто-ном на 48-60 ч культивирования.

Максимальная активность для трипсин-подобных пептидаз по субстрату ВАРА обнаружена на 84 и 60 ч культивирования у штаммов бактерий SK1K и NuK, соответственно. У штаммов К5К, К6К и ЦЗК обнаружены следовые активности по данному субстрату. Изучение пептидазной активности на специфичном для субтилизин-подобных пептидаз субстрате - GlpAALpNa показало наличие у штамма ЦЗК и Ur-6" наиболее высокой внеклеточной протеолитической активности, которая составила 4,3 ед/мг белка (96 ч) и 3,24 ед/мг белка (12 ч). Максимум активности по этому же субстрату выявлены в штаммах Um-09m, Га-35 и Gor-10s (7,1; 3,7 и 12,6 ед/мг белка, соответственно). Полученные данные свидетельствуют о том, что существенный вклад в пептидазную активность культур ЦЗК, Ur-6K, Um-09m, Га-35 и Gor-10s, по-видимому, вносят пептидазы с субтилизин-подобной специфичностью. Показано, что культуры не гидролизуют субстраты, специфичные для химотрипсин-подобных и цистеиновых пептидаз, независимо от времени культивирования и источников органического азота.

Анализ внеклеточной протеолитической активности изученных штаммов свидетельствует о различной субстратной специфичности пептидаз у изученных штаммов бактерий.

С помощью использованных методов диализа и ионообменной хроматографии в условиях FPLC на колонке Mono Q (табл. 6) удалось частично очистить фермент с молекулярной массой 19-20 кДа, выделенный из куль-туральной жидкости Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s. Полученные активные фракции использовали для дальнейшей характеристики пептидазы.

Таблица 6.

Стадии очистки пептидазы, выделенной из культуральной жидкости

Paenibacillus dendritiformis штамм Gor- 10s

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед Удельная активность, ед./мг белка Степень очистки Выход, %

Культуральная жидкость 20,56 150,4 7,32 1,0 100

Диализ 9,53 119,8 12,57 1,7 58,2

Ионообменная хроматография 0,402 69,94 173,9 23,8 4,2

Ни ионообменная хроматография, ни гель-хроматография не выявили в культуральной жидкости присутствие еще какой-либо.пептидазы со сходной активностью.

Исследования физико-химических свойств ферментов были проведены на очищенном препарате сериновой пептидазы РаетЬасШт йеп(1гШ[огт[$ штамм Оог-Юб и в культуральных жидкостях штаммов 8КГ, N1/, К5к, Кб", ЦЗ", иг-6", Вг-2-2", Оа-9-2к, иш-09ш и Га-35 (рис. 1).

Г»-35(50С)

SKI" («о

№003 ~

Br-2-l'(«0 • .

(5oq

Um-09ni (4 t?C) Gor-10s(50C)

Рисунок 1. рН оптимум и стабильность активности пептидаз изученных штаммов (— - диапазон стабильности пептидаз;

в скобках даны оптимумы температуры)

,Рн

Анализ полученных результатов показал, что максимальная активность ферментов но гидролизу синтетического субстрата GlpAALpNa наблюдается для пептидаз штаммов Ur-6K, Br-2-2K, Ga-9-2K, Um-09m и Gor-10s при рН от 11,0 до 11,3, для пептидаз штаммов SK1K, NuK, ЦЗК и Га-35 при рН от 8,0 до 9,8. Все ферменты стабильны в широком диапазоне рН от 6,6 до 11,4. Температурные оптимумы пептидаз колеблются от 30 до 60°С. Полученные нами данные указывают на то, что секретируемые пептидазы изученных бактериальных штаммов имеют оптимум рН в щелочной области и рН стабильность, вполне покрывающую диапазон рН, свойственный местам их обитания.

Анализ функциональных групп активного центра показал, что в препаратах культуральной жидкости исследованных штаммов бактерий преимущественно содержатся пептидазы, относящиеся к классу сериновых пептидаз субтилизин-подобного типа, кроме штамма Um-09m, в культуральной жидкости которого содержится, по-крайней мере, два фермента, относящихся к классам сериновых и металлопептидаз.

Среди исследованных нами культур бактерий у штаммов SKI" и NuK, растущих на различных источниках азота, обнаружены высокие внеклеточные активности, ингибирующие субтилизиновые и цистеиновые пептидазы.

100 -j

П К ШК Каггоз П К Я+К 1WÍ03 состав среды

Рисунок 2. Внеклеточная ингибиторная активность субтилизиновых (а) и цистеиновых пептидаз (б) у культур SK1K

Так, субтилизин-ингибируюхцая активность у культуры SK1K (рис. 2) ярко выражена на средах с казеином (до 84% ингибирования), пеп-тон+казеин (до 69%) и пептоном до (59%), на среде с неорганическим источником азота ингибирующая активность была слабая и не превышала 9%. Культура NuK также показала высокую ингибирующую активность, но. в отличие от SK1K, на среде с пептоном активности не обнаружено. Низкий процент ингибирования обнаружен на среде с неорганическим источником азота только в первые часы культивирования.

Отличительной особенностью цистеин-ингибирующей активности у культур SKI" и NuK от субтилизин-ингибирующей являлась высокая активность на средах с неорганическим источником азота (73 и 81%). Причем высокий уровень ингибирования оставался практически неизменным в течение всего времени культивирования.

Обнаруженные нами высокие ингибиторные активности по отношению к сериновым и цистеиновым пептидазам у штаммов SK1K и NuK, возможно, защищают сами бактерии и их белковые субстраты от атаки экзогенных пептидаз, как в случае внеклеточного пептидазного ингибитора В. brevis (Shiga et al., 1995).

Определение молекулярных масс ингибиторов посредством гель-хроматографии показало, что исследованный препарат культуры NuK содержит, по меньшей мере, два ингибитора с молекулярными массами 60 и менее 10 кДа.

Новая факультативно-анаэробная эрганотрофная культура 8е-1-10 АпохуЬасШт эр. по\.

Из пробы поверхностного мата горячего источника Сеюя с температурой 50°С и значением рН 9,3 была выделена факультативно анаэробная грамлоложительная спорообразующая культура Бе-ЫО.

Морфология. Клетки представляют собой прямые палочки, грамполо-жительные, спорообразующие (рис. 3). Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько расширяя ее. Размер клеток 0,39 х 1,07 мкм. При росте на твердой среде образуют колонии 2-4 мм в диаметре, желтовато-молочного цвета. Факультативные анаэробы.

Рисунок 3. Морфология клеток (а) и ультратонкое строение (б, в, г - деление клетки; д - начало процесса спорообразования) микрофотографии (масштаб -1 um) штамма Se-1-l 0.

Физиологические свойства. Штамм Se-1-Ю активно и стабильно развивается при различных значениях температуры и pH. Культура является факультативным алкалофилом, растущим в области рИ от 6,05 до 10,3 с оптимумом 9,5-10,0, умеренным термофилом с оптимумом роста при температуре 50°С.

Состав жирных кислот. Доминирующие жирные кислоты штамма Se-1-10 были С,4:о (2,20%); iso-C15:0 (66,77%); anteiso-Ci5o (5,72%); C15-,w5c (1,63%); iso-C16:0 (3,23%); C16.0 (4,96%); iso-C,7.0 (7,90%); anteiso-C17.0 (4,19%).

Генотипическая характеристика. Результаты анализа сиквенса. гена 16S рРНК (1517 нуклеотидов) показали, что уровень сходства последовательностей исследуемого штамма Se-1-Ю и типовых штаммов Anoxybacil-lus flavithermus strain DSM 2641 (Z26932) и Апохуbacillus eryuanemis E ! 12 (GQ153549) составили 98,4 и 98,9%, соответственно (табл. 7).

Таблица 7

Сходство последовательностей штамма Бе-МО с ближайшими гомологами

Штамм Эе-ЫО АпохуЬасШш егуиапегин Е112 (0(2153549) АпохуЬасШш /ктНкегтш ИЗМ 2641Т (226932)

Штамм 8е-1-10 Ю 0,989 0,989

АпохуЬасШш егуиапепйз Е)12 (00153549) 0,989 Ю 0,984

АпохуЬасШшflavi!hermш ОЭМ 2641 (7.26932) 0,989 0,984 ГО

Полученные данные позволяют предположить, что штамм Бе-МО может являться представителем нового вида рода АпохуЪасНЫ Бр. поу.

591- АпохуЬасШш ер. («842661) 56Л АпохуЬасШш ер. (№27831)

ЧГ'

А У

32

76

53 [Г ШсиНит«! АпохуЬасШш ер. с1опе ше-з (АУ531640) 84 АпохуЬасШшАачПЫгтш п5м 26417 (г2б932) АпохуЬасШш ауйегетю ав04т (акю1963)

АпохуЬасШш ¿ОПе^ 02Тт (АУ122325) АпохуЬасШш хакпаШетхя А343т (ЕЦ326496)

941-АпохуЬасШш катсЬЛкепьгь ЖУК-К04Т (АР5Ю985)

-АпохуЬасШш Ьо^орежз шшсС (АМ409184)

апохуьасшш яр. бкз-з («3184212) АпохуЬасШш егттеюи еи21 «30153549) — 5е-1-10

'АпохуЬасШш ^¡ИсЫпет'^ к-1т (А)0Ю478) АпохуЬасШш tengchongensis т! 1т (Н438370) -АпохуЬасШш кез1апЬоИпеш15 К4Т

|-Аг,

«и

71|-/

941- .

Г~ Лт 91 i—

АпохуЬасШш СОМатШт 1,мо 218811 (ал551330) АпохуЬасШш атуЫуйсиз мюст (№18979) АпохуЬасШш \oinovskiensis тшзт (АВ1 юост

■ АпохуЬасШш гир1ет!$ обм 17127т(а1879076) -—-ВасШш яиЫШз 05мют (ал76351)

Рисунок 4. Дендрограмма филогенетического положения штамма Бе-1-10

На основании проведенных физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследований показано, что штамм Бе-ЬЮ отличается от ранее описанных видов рода АпохуЬасШш (размеры клеток, окраска колоний, способность к использованию лактозы, мальтозы, целлобиозы и по

профилю жирных кислот). Определение содержания Г+Ц пар и ДНК-ДНК-гибридизация находятся на стадии исследования.

Внеклеточная протеолитнческая активность штамма Se-1-lO

Изучена динамика накопления внеклеточной протеолитической активности фермента в процессе роста культуры Se-1-Ю. Показано, что максимальное накопление фермента в культуральной жидкости происходит в фазе замедления роста (48-60 ч). Штамм показал высокую активность 18,5 ед/мг белка, по специфичному для субтилизин-подобных пептидаз субстрату GlpAALpNa и белковому субстрату азоказеину.

Одним из наиболее важных факторов, определяющих активность внеклеточных ферментов, является наличие в питательной среде оптимального субстрата (Дунаевский и др., 1995). В присутствии легко метаболизи-руемых источников углерода: глюкоза, фруктоза, лактоза, ксилоза, рамно-за, синтез пептидаз резко снижался. При росте культуры на средах с трудно усваиваемыми источниками углерода и азота: дрожжевой экстракт, целлобиоза, триптон, активность, определяемая по гидролизу GlpAALpNa, была выше и достигала 0,44 ед.

В результате последовательной очистки фермента методами диализа и ионообменной хроматографии в условиях FPLC на колонке Mono Q внеклеточная пептидаза штамма Se-1-Ю была очищена в 42,7 раз. Выход составил около 1%.

Значения температуры и рН являются одними из важнейших факторов, влияющих на функционирование микробного сообщества

Как следует из приведенных данных, температурный оптимум пепти-дазы штамма Бе-ЫО АпохуЪасШт йр. поу. составляет 50°С, оптимум рН активности исследуемого штамма находится в щелочной области и составляет 8,0 - 11,4, с максимумом при рН 11,0, что, по-видимому, отражает адаптацию ферментативного аппарата штамма Бе-ЬЮ ЛпохуЬасШт Бр. поу. к обитанию в щелочных условиях.

Рисунок 5. рН и

температурные

оптимумы и

стабильности

пептидазы

Se-1-10

В 10 40 Я)

SO

Анализ функциональных групп активного центра пептидаз показал, что специфический ингибитор сериновых пептидаз PMSF полностью подавлял активность очищенного фермента штамма Se-1-lO. Специфические ингибиторы металлопептидаз (EDTA и о-фенантролин) и цистеиновых пептидаз (IAA) не влияли на активность пептидазы. Эти данные позволяют предположить отсутствие остатков цистеина в белковой глобуле, что является характерным для классических субтилизинов бацилл (Балабан и др., 2007). Таким образом, по типу ингибирования выделенная пептидаза штамма Se-1-10 Anoxybacillus sp.nov. относится к семейству субтилизин-подобных ферментов класса сериновых пептидаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что микробные сообщества термальных и щелочных водных систем Забайкалья являются полноценными функциональными системами, эффективно осуществляющие круговорот веществ в процессах продукции и деструкции органического вещества. (Солоноватые ..., 2009; Геохимическая деятельность..., 2011). Наличие органических и минеральных веществ, высокие значения температуры и pH в водной толще, донных отложениях и микробных матах способствует широкому распространению гидролитических термо- и алкалофильных микроорганизмов.

Результаты исследования показали, что в экстремальных водных системах Байкальского региона при температурах от 22 до 70°С и pH от 8,0 до 9,7 широко распространены аэробные органотрофные бактерии. Доминирующими физиологическими группами, как в донных осадках, так и в микробных матах были протеолитические бактерии (до 100 млн. кл/см3).

Выделенные и изученные нами алкалотолерантные гидролитические бактерии способны развиваться в широком диапазоне температур от 23 до 60°С и pH от 7,6 до 10,0. Полученные результаты показали границы приспособляемости и функционирования выделенных бактерий в экстремальных условиях гидротерм Бурятии. Среди определенных с помощью моле-кулярно-генетических методов бактерий выявлены представители родов Bacillus, Anoxybacillus и Paenibacillus. По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамм Se-1-10 отличается от ранее описанных видов рода Anoxybacillus, что позволяет отнести выделенный штамм к новому виду. Выделенные культуры в микробном сообществе занимают функциональное положение первичных деструкторов, осуществляющих гидролиз различных органических соединений.

Анализ активности микробного сообщества от экологических факторов в термальных источниках позволил выявить главные факторы (pH и содержание белка), влияющие на функционирование системы. Исследование пептидазной активности в пробах in situ показало, что микробное сообщество обладает различным спектром внеклеточных пептидаз, максимально

адаптированных к условиям обитания микроорганизмов, что отражает экологические и метаболические особенности микробного сообщества в термальных системах.

Полученные результаты по изучению внеклеточных пептидаз свидетельствуют о том, что исследованные штаммы обладают различной субстратной специфичностью. Изученные пептидазы алкапофильных и термофильных штаммов показали высокую рН и температурную стабильность, что возможно позволяет им активно функционировать в условиях термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья. Проведенные исследования показали присутствие в этих системах активных и разнообразных термофильных и алкалофильных протеолитиков, способных гид-ролизовать биополимеры (белковые соединения). Пептидазы этих бактерий по своим биохимическим характеристикам могут быть рекомендованы для применения в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. В щелочных термальных источниках Забайкалья широко распространены гидролитические бактерии, численность которых составляет от 10 до 100 млн. клеток/см3.

2. По результатам пиросеквенирования в микробном сообществе гидротермы Алла доминируют представители филумов Оетососсш-Пзегтиз, Мй-ОБртае, Рп^еоЬайепа, р1гт1сЩез и С1огоЯехь Выделенные культуры гидролитических факультативно-анаэробных бактерий принадлежат к семействам ВасШасеае/РаетЬасШасеае.

3. Из термального источника Сеюя выделен и описан предположительно новый вид алкалотермофильной органотрофной бактерии с 98,4% сходства с АпохуЬасШиз АтиИегтт и 98,9% с АпохуЬасШт егуиапет'ш, способной к росту при рН 6,0-10,3 и температуре 37-60°С.

4. По результатам анализа функциональных групп активного центра, физико-химических свойств и субстратной специфичности показано, что секретируемые ферменты относятся к сериновым пептидазам семейства субтилизина. Анализ очищенных препаратов пептидаз показал, что исследуемые ферменты отличаются высокой рН (6,5-11,5) и температурной стабильностью (23-60°С), что позволяет им в природе осуществлять деструкцию ОВ при смене экологических условий в экосистеме.

5. Штаммы бактерий из содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур обладают высокой ингибирующей активностью пептидаз, в отличие от термофильных бактерий.

6. Функциональная роль исследованных бактерий определяется субстратной специфичностью гидролитических ферментов и высокой метаболической активностью в отношении используемых субстратов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Козырева Л.П., Раднагуруева A.A.. Намсараев Б.Б. Внеклеточная протеолитическая активность бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья // Прикладная биохимия и микробиология,

2010. Т. 46. №6. С. 630-636.

2. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева A.A.. Намсараев Б.Б. Протеазная активность Bacillus hemicellulosolyticum // Вестник Бурят, госунивер., 2010. Вып. 4. «Биология, география». С. 99-101.

3. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Ii.В., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е. Взаимодействие протеаз с синтетическими химическими субстратами у термофильной бактерии Se-1-Ю // Вестник Бурят, госунивер., 2010. Вып. 3. «Химия, физика». С. 5-7.

4. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е. Биохимическая характеристика культуры Um-09m // Вестник Бурят, госунивер.,

2011. Вып. 3. «Химия, физика». С. 94-97.

5. Лаврентьева Е.В., Бабасанова О.Б., Раднагуруева A.A.. Намсараев Б.Б. Гидрохимические и биохимические характеристики гидротерм Баргузинской долины // Вестник Бурят, госунивер., 2008. Вып. 3. «Химия, физика». С. 19-24.

6. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е. Протеолитическая активность алкалофильных микроорганизмов водных систем Забайкалья. Вестник Бурят, госунивер., 2009. Вып. 4. «Биология, география». С. 98- 101.

7. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева A.A.. Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е. Биохимические характеристики микроорганизмов щелочных гидротерм Прибайкалья // Вестник Бурят, госунивер., 2009. Вып. 3. «Химия, физика». С. 11-14.

8. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность в природных образцах термальных источников Прибайкалья // Известия Иркутского госунивер., 2009. Сер. «Науки о Земле». Т. 2. №2. С. 162-166.

Монографии:

9. Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Раднагуруева A.A. Внеклеточная протеолитическая активность гало-алкалофильных бактерий // Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биология, 2009. Изд-во Бурят, госунивер.. С. 157166.

Тезисы:

10. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева A.A., Дунаевский Я.Е. Внеклеточная протеазная активность алкалофильных и алкалотолерантных бактерий содово-соленых озер Забайкалья // Материалы 6 Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск: Изд-во «МикроБио», 2-6 июня 2008. Т. 1. С. 326-328.

11. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева A.A. Внеклеточная протеазная активность алкалотолерантных бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья // Материалы 4 молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 20-22 октября 2008. С. 29-30.

12. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность в природных образцах термальных источников Прибайкалья II Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы фи-

зиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 24-27 декабря 2009. С. 156.

13. Lavrentieva E.V., Radnagurueva A.A.. Namsaraev B.B Characteristics of pro-teolitic bacteria from hydrothermal vent of Tsenkher (Central Mongolia) // 1 International conference "Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook". Ulaanbaatar. Mongolia, 7-10 april 2010. P. 21.

14. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева E.B. Биохимическая характеристика культуры Se-1-10, выделенной из термального источника Сея // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии». Улан-Удэ: Изд-во Бурят, госунивер., 27-28 мая 2010. С. 153.

15. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б. Внеклеточная про-теазная активность микроорганизмов гидротерм Байкальской рифтовой зоны // Материалы 17 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 12-15 апреля 2010. С. 167.

16. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б. Протеазная активность культуры Bacillus sp., выделенной из термального источника Сея (Северное Прибайкалье) // Актуальные аспекты современной микробиологии: материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2010. С. 56-58.

17. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева A.A., Дунаевский Я.Е. Гидролитическая активность микроорганизмов горячих источников Байкальской рифтовой зоны // Материалы международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний». Улан-Удэ и Улан-Батор: Изд-во Бурят, госунивер., 5-16 сентября 2011. С. 118-119.

18. Раднагуруева A.A.. Лаврентьева Е.В. Алкалотермофильные бактерии из горячих источников Байкальской рифтовой зоны // Материалы международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний». Улан-Удэ и Улан-Батор: Изд-во Бурят, госунивер., 5-16 сентября 2011.С. 152-153.

Подписано в печать 20.02.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100. Заказ № 34.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раднагуруева, Арюна Арсалановна, Улан-Удэ

61 12-3/723

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ СО РАН

На правах рукописи

РАДНАГУРУЕВА Арюна Арсалановна

ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ТЕРМАЛЬНЫХ И ЩЕЛОЧНЫХ

ВОДНЫХ СИСТЕМ ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология (биологические науки)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Е.В. Лаврентьева

Научный консультант: доктор биологических наук Я.Е. Дунаевский

Улан-Удэ-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Щелочные водные системы Забайкалья 11

1.1.1 Физико-химическая характеристика термальных и щелочных водных систем Забайкалья 11

1.1.2 Структура и функционирование микробных сообществ экстремальных экосистем 17

1.2 Адаптация микроорганизмов к экстремальным условиям 28

1.3 Общая характеристика и классификация гидролитических ферментов 33

1.3.1 Протеолитические ферменты 34

1.3.2 Целлюлозолититческие ферменты 43

1.4 Использование гидролитических бактерий и их ферментов в биотехнологии 44

1.5 Заключение к литературному обзору 46 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования 48

2.2. Методы исследования 51

2.2.1. Физико - химические методы 51

2.2.2. Методы учета численности и выделения чистых культур гидролитических микроорганизмов 52

2.2.3. Изучение экофизиологических свойств гидролитических бактерий 53

2.2.4. Методы молекулярно - генетического анализа 54

2.2.5. Методы определения внеклеточной протеолитической активности 55

2.2.6. Методы математического анализа 62

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Физико-химическая характеристика исследуемых водных систем Забайкалья 63

3.2. Химический состава донных осадков и микробных матов водных систем 65

3.3. Численность гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем Забайкалья 69

3.4. Эколого- биохимическая характеристика донных осадков и микробных матов термальных источников Забайкалья 72

3.4.1. Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах 73

3.4.2. Целлюлазная активность в нативных пробах 76

3.5. Характеристика филогенетического разнообразия микробного сообщества термальных источников Забайкалья 77

3.6. Характеристика гидролитических бактерий, выделенных из термальных источников Забайкалья 78

3.6.1. Морфологическая характеристика гидролитических бактерий 80

3.6.2. Генотипические свойства и филогенетическое положение культур-продуцентов пептидаз 85

3.6.3. Экофизиологическая характеристика гидролитических бактерий 87

3.7. Внеклеточная протеолитическая активность гидролитических бактерий водных систем Забайкалья 89

3.7.1. Изучение влияния состава среды на внеклеточную протеолити-ческую активность 89

3.7.2. Изучение субстратной специфичности гидролитических бактерий 90

3.7.3. Очистка фермента из РаетЪасШт (¡епс1гШ/огт1х штамм вог-Юв 92

3.7.4. Изучение физико-химических свойств ферментов 93

3.8. Новая факультативно-анаэробная органотрофная культура 8е-1-10

Anoxybacillus sp. nov 102

3.8.1. Морфологическая характеристика 102

3.8.2. Экофизиологическая характеристика 103

3.8.3. Филогенетическое положение штамма Se-1-10 107

3.8.4. Внеклеточная протеолитическая активность штамма Se-1-lO 108 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114 ВЫВОД 116 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 117 ПРИЛОЖЕНИЯ 147

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БРЗ - Байкальская рифтовая зона

КЖ - культуральная жидкость

ПААГ - полиакриламидный гель

TEMED - N,N,N ' ,N ' -тетраметилэтилендиамин

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

DMF - диметилформамид

DTT - дитиотреитол

FPLC - высокоскоростная жидкостная хроматография белков

Glp - пироглутамил-

pNA - п-нитроанилид

SDS - додецилсульфат натрия

Z - бензилоксикарбонил-

Ингибиторъг.

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота PMSF - фенилметилсульфонилфторид IAA - йодацетаамид Субстраты:

BS А - альбумин бычий сывороточный

ВАРА - Ыа-бензоил-БЬ-аргинил-п-нитроанилид-гидрохлорид GlpAALpNA - пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид GlpFpNA - пироглутамил-фенилаланил-п-нитроанилид GlpFApNa - пироглютамил-фенилаланил-аланин-п- нитроанилид L-Arg-pNa (R-pNa) - L-аргинил-п-нитроанилид L-Leu-pNa (L-pNa) - L-лейцил-п-нитроанилид L-Phe-pNa (F-pNa) - L-фенилаланил-п-нитроанилид L-Tyr-pNa (Y-pNa) - L-тирозил-п-нитроанилид

Под понятием «Вид пробы» принимали донные осадки (д.ос.) и микробные маты (м.м.)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В последние десятилетия микробные сообщества термальных и щелочных местообитаний находятся в центре внимания исследователей [Brock, 1978; Бонч-Осмоловская, 1999; Заварзин, 2004; Жилина, 2005; Горленко, 2004; Намсараев, 2006; Кевбрин, 2007]. Изучение микроорганизмов из этих сообществ на молекулярном уровне позволило выявить новые метаболические пути и механизмы биохимической адаптации, что значительно обогатило современную фундаментальную микробиологию.

Термофильные и алкалофильные гидролитические бактерии представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп микроорганизмов и являются источником новых ферментов и метаболитов для промышленности и медицины. На данный момент известно большое число термо-/ алкалофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз полимерных субстратов - амилолитики [Krishnan и Chandra, 1983; Gupta et al., 2003], целлюлозолитики [Bergquist et al., 1999, Uhl и Daniel, 1999, Andrade et al., 2001, Kozina et al., 2009 и др.] и протеолитики. Большинство протеолитиков растут и используют в качестве источника углерода и энергии пептиды, благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений pH и температур [Klingeberg et al., 1995; Ward et al., 2002]. В целом, в природных местообитаниях гидролитики занимают нишу первичных деструкторов, благодаря способности гетеротрофно расти на биополимерах различной природы [Кубланов, 2011].

Распространение аэробных органотрофных бактерий в водных системах Забайкалья ранее изучалось эпизодически [Храпцова и др., 1984; Намсараев, 2003; Nazina et al., 2004; Зайцева, 2004]. Знания о видовом разнообразии и функциональной активности представителей аэробного микробного сообщества щелочных термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья

были недавно пополнены [Базаржапов, 2005; Бабасанова, 2007; Шагжина, 2007; Митыпова, 2007].

Вместе с тем, к началу нашей работы изучены гидролитические ферменты только ограниченного числа микроорганизмов водных систем Забайкалья. Очевидно, что их разнообразие и метаболические свойства исследованы недостаточно, а биотехнологический потенциал микроорганизмов раскрыт далеко не полностью. Это делает актуальным проведение новых исследований, связанных с распространением, разнообразием и функциональной активностью бактерий в термофильных и алкалофильных микробных сообществах экстремальных водных систем Забайкалья.

Цель работы: изучить гидролитические бактерии и их функциональную роль в термальных и щелочных водных системах Забайкалья.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить распространение аэробных гидролитических бактерий в донных осадках и микробных матах термальных источников и содово-соленых озер;

• Выделить чистые культуры гидролитических микроорганизмов и определить их таксономическое положение;

• Изучить экофизиологические и биохимические свойства чистых культур;

• Выделить пептидазы гидролитических бактерий и изучить их свойства;

• Изучить функциональную роль гидролитических бактерий в микробном сообществе.

Научная новизна и практическая значимость

С помощью микробиологических и молекулярно-генетических методов выявлено распространение аэробных алкалотермофильных органотрофных бактерий-продуцентов пептидаз семейства ВасШасеае и РаешЬасЩасеае в термальных источниках Байкальского региона.

Выделен и детально охарактеризован предположительно новый вид ал-калотермофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «АпохуЬасШш бр. поу.». Показано, что данная бактерия является активным продуцентом термостабильной сериновой субтилизин-подобной пептидазы, имеющей оптимум активности при 50°С и рН 11,1.

Изученные пептидазы (сериновые субтилизин-подобного типа) алкало/термофильных гидролитических бактерий обладают высокой температурной (от 23 до 60°С) и рН стабильностью (от 6,3 до 11,4).

Впервые получены очищенные препараты пептидаз из источников Забайкалья, изучены их важнейшие физико-химические свойства. Впервые представлены данные по наличию ингибиторной активности пептидаз у бактерий содово-соленых озер Забайкалья.

Полученные результаты расширяют представления о разнообразии и экологическом значении гидролитических бактерий в экстремальных местообитаниях. Полученные очищенные препараты пептидаз могут найти практическое применение в биотехнологии, как ферменты устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гидролитические бактерии семейств ВасШасеае/РаешЬасШасеае микробных сообществ термальных и щелочных водных систем Забайкалья принимают активное участие в процессах деструкции сложных органических соединений и обладают высокой степенью устойчивости к воздействию экстремальных факторов среды обитания.

2. Выделенные бактерии являются продуцентами алкало- и термостабильных пептидаз, функциональная роль которых определяется субстратной специфичностью гидролитических ферментов и высокой метаболической активностью в отношении используемых субстратов.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); I International conference "Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook" (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ -Улан-Батор, 2011).

Публикации

По результатам исследований опубликовано 18 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц, 23 рисунков. Библиография содержит 223 наименований, в т.ч. 134 -зарубежных авторов.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителю к.б.н. Е.В. Лаврентьевой и консультанту д.б.н., проф. Я.Е. Дунаевскому за внимание, помощь при проведении работы, в интерпретации полученных результа-

тов и подготовке рукописи диссертационной работы. Искреннюю признательность автор приносит всем сотрудникам лаборатории микробиологии, а также отдельную благодарность заведующему лаборатории д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву за предоставление технической базы, помощь в освоении методик, содействие в процессе работы и поддержку. Автор выражает глубокую признательность заведующему лабораторией белков растений д.б.н., проф. М.А. Белозерскому и всем сотрудникам НИИ физико-химической биологии МГУ им. А.Н. Белозерского за помощь в проведении биохимических анализов, ценные советы и доброе отношение, к.б.н. Б.Б. Кузнецову (Центр «Биоинженерия» РАН), за помощь на отдельных этапах работы. Выражаю искреннюю благодарность семье и друзьям за поддержку.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 10-04-90798_моб_ст, № 10-04-93169_Монг_а, МО РФ РНП 2.1.1/2165.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Щелочные водные системы Забайкалья

1.1.1. Физико-химическая характеристика термальных и щелочных водных систем Забайкалья

К экстремальным местам обитания относятся места активной вулканической деятельности, содово-соленые озера, термальные источники [Brock, 1978; Герасименко, Заварзин, 1986; Нетрусов, 2004].

Щелочные термальные воды распространены в Центральной Азии, Индии, Восточной Сибири, Восточной и Южной Африке, Южной Америке, на западе США, в Европе, западных и восточных районах Исландии [Крайнов, Швец, 1980; Басков, Суриков, 1989; Соломин, Крайнов, 1998]. Большинство наземных термальных источников относится к азотному типу. Геохимический облик этих вод определяется процессами гидролитического разложения силикатов и потерей кислорода на окислительные процессы, вследствие чего в их газовом составе начинает преобладать азот и происходит частичное восстановление сульфатов с образованием гидросульфидных ионов [Перельман, 1972; Крайча, 1980].

Байкальская область термальных вод включает систему молодых риф-товых впадин и обрамляющие их древние горные образования. Основную роль в формировании здесь минеральных вод играют зоны глубинных разломов, контролирующие выходы термальных источников. Поэтому минеральные воды часто имеют высокую температуру - до 77°С, минерализация не превышает 1 г/дм , рН до 9,7. Гидрохимические данные свидетельствуют об инфильтрационном происхождении источников Байкальского региона [Барабанов и др., 1968; Борисенко и др., 1978; Крайнов, Швец, 1980]. Источники формируются в восстановительной обстановке вне зависимости от влияния магматических процессов, что отличает источники региона от источников областей активного вулканизма [Голубев, 1982].

В зависимости от глубины формирования и степени смешения с холодными водами температура термальных источников колеблется от 20 до 77°С. Температура воды зависит от того, вытекает ли она непосредственно из трещин в коренных породах, как, например, на источниках Алла (74-77°С), Гар-га (76°С), Горячинск (54°С), или проходит через толщу рыхлых озерно-аллювиальных и болотных отложений Кучигер (47°С).

Таблица 1

Физико-химические параметры азотных термальных источников Забайкалья

(N2 98-99 %) [Борисенко, Замана, 1978; Намсараев и др., 2006]

Название и местоположение источника Т,°С рН М, г/дм3 Содержание газов (% или мг/л), микроэлементов (мг/л) Формула химического состава

Горячинск (побережье Байкала) 42-54 8,9-9,0 0,5-0,64 НгБЮз 77-89 804-Ыа

Алла (бассейн р. Алла) 50-77 8,9-9,5 0,15-0,36 82" 12 НгБЮз 81 804-НС03-Ка

Уро (бассейн р. Уро) 54-69 8,8-9,2 0,17-0,26 НзБОД Н28Ю3 100 804-НС03-Ка

Умхей (бассейн р. Баргузин) 39-40 9,6-9,7 0,21-0,42 31 804-НС03-Ка

Сеюя (бассейн р. Баргузин) 35-55 9,3-9,7 0,29-0,30 Н28Ю3 64 НСОз- БОгИ-Ма

Гарга (Икатский хребет) 75-76 7,6-8,1 0,67 Н28Ю3 69 804-Ка

Гусиха (бассейн р. Баргузин) 55-72 8,2-8,3 0,47-0,48 Н28Юз 86 804-НС03-Ма

Кучигер (бассейн р. Баргузин) 47 9,7 0,37 Н28 0,03 804-Ма+К

Баргузинская впадина является одной из наиболее крупных впадин Байкальской рифтовой зоны. Выходы термальных источников приурочены к участкам пересечения глубинных активизированных зон фундамента поперечными разломами. Для Баргузинской впадины характерны две системы разломов. Аллинский и Умхейский источники связаны с Западно-Баргузинским разломом (правый борт), Гаргинский и Уринский - с Восточ-но-Баргузинским (левый борт). Сеюйский источник находится в Курумкан-ском районе Республики Бурятия у северо-восточного замыкания Баргузин-

ской долины на правом берегу р. Сеюя, в 4 км от ее устья. Горячинский источник выходит на поверхность на восточном берегу оз. Байкал, в 1,5 км от береговой линии, в широкой долине между Котковским и Туркинским хребтами. Гусихинский источник расположен на правом берегу р. Малая Гусиха. Все источники представляют собой щелочные кремнистые источники с преобладанием в газовом составе азота. Умхейский и Уринский источники проходят через рыхлые четвертичные отложения; Аллинский и Гаргинский -разгружаются непосредственно из трещинных зон в слабоизмененных гранитах, с формированием травертинов в местах выхода. Основной ионный состав растворов источников известен давно [Ломоносов, 1974; Борисенко, За-мана, 1978], но только в последние годы начали появляться сведения о содержании в водах микроэлементов [Чернявский и др., 2004; Огашпа е1 а1., 2007; ТгобЫп а1., 2008]. Однако эти данные пока еще скудны, и нам придется остановиться на составе гидротермальных растворов несколько подробнее, поскольку именно они и представляют питательную среду для микробных сообществ.

Воды Аллинского и Умхейского источников относятся к одному типу и по макрокомпонентному составу представляют НС03-804-1\[а. Общая мине-

•5 л

рализация 0,4-0,5 г/дм . Содержание - 35-46 мг/дм . Источники сероводо-

о

родные, содержание сероводорода в 2007 г. составляло от 8 до 13 мг/дм . Концентрации радона низкие — не б�