Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аэробные органотрофные бактерии щелочных гидротерм Байкальского региона

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Аэробные органотрофные бактерии щелочных гидротерм Байкальского региона"

На правах рукописи

003058130

БАБАСАНОВА Ольга Бадмажаповна

АЭРОБНЫЕ ОРГАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА

03 00 16 - экология 03 00 07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ, 2007

003058130

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель Научный консультант Официальные оппоненты

Ведущая организация

кандидат биологических наук Бархутова Дарима Дондоковна

кандидат биологических наук Намсараев Зоригто Баирович

доктор биологических наук Вайнштейн Михаил Борисович

кандидат биологических наук Гайнутдинова Елена Александровна

Институт природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН

Защита состоится «15» мая 2007г в 14 ч на заседании Диссертационного совета Д 212 022 03 в Бурятском государственном университете по адресу 670000, Улан-Удэ, ул Смолина, 24а, биолого-географический факультет, конференц-зал Факс (3012)211593 Ь-ша11 ЬаЬаБапоуа @тай ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках БНЦ СО РАН и Бурятского государственного университета

Автореферат разослан «/£» апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н А Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Щелочные гпдротермы Байкальского региона являются экстремальными экосистемами, представляющими значительный интерес, как для фундаментальных исследований, так и для потенциальных практических применений В связи с постоянством химического состава и температуры воды горячие источники являются удобными модельными системами для изучения экологии обитающих в них организмов (Brock et al, 1971, Логинова, Егорова, 1977)

Распространение аэробных органотрофных термофильных бактерий изучалось микробиологами в термальных источниках Камчатки, Центральной Азии, Индии, Южной Америки, запада США, Европы, Исландии (Wiegel, 1998, Pikuta, 2000 Spanevello, Yamamoto, 2002 Kevbnn et al, 2004, Кевбрин и др , 2005) Имеются работы по изучению ферментов аэробных термофилов, выделенных из различных высокотемпературных систем (Hawumba et al, 2002, Nascimento, Martins, 2003)

Термофильные аэробные алкалофильные и алкалоюлерантные бактерии как продуценты промышленно значимых ферментов, подобно другим экстремофилам, привлекательны повышенной устойчивостью промышленных штаммов к контаминации посторонней микрофлорой, что крайне важно в производстве стандартизованного ферментного препарата (Кевбрин, 2003) Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что обьясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов Внеклеточные протеазы присутствуют у различных микроорганизмов Они играют ключевую роль в использовании микроорганизмами органических субстратов (Ward, 1985)

В настоящее время изучен видовой состав цианобактерий и аноксигенных фототрофных бактерий щелочных термальных источников и зон Байкальского региона Проведены исследования активности продукционных и деструкционных процессов в цианобактериальных матах (Компанцева, Горленко, 1988, Юрков и др , 1991, Брянская, 2002, Намсараев, 2003) Распространение аэробных термофилов в щелочных гидротермах Байкальского региона ранее изучалось эпизодически (Храпиова и др , 1984, Намсараев, 2003, Nazma et al, 2004, Зайцева, 2004) Изучены внеклеточные протеазы разных видов аэробных: термофильных микроскопических грибов, выделенных из гидротерм Прибайкалья (Лаврентьева, Дунаевский, 2003, Базаржапов, 2005) Вместе с этим к началу нашей работы практически полностью отсутствовали исследования, касающиеся внеклеточной протеолитической активности аэробных органотрофных термофильных бактерий из термальных щелочных источников Байкальского региона

Целью работы являлось изучение аэробных органотрофных микроорганизмов щелочных гидротерм Байкальского региона Задачи исследования.

1 Изучить распространение аэробных органотрофных термофильных бактерий в донных осадках и микробных матах гидротерм

2 Выделить чистые культуры аэробных органотрофных термофилов и исследован ь экофизиологические и биохимические свойства

3 Определить видовую принадлежность полученных культур с помощью молекулярно-генетических методов

4 Исследовать внеклеточную протеолитическую активность выделенных бактерии

Научная новизна и практическая значимость. С помощью микробиологических методов выявлено широкое распространение аэробных ор1 анотрофных бактерий в щелочных гидротермах Байкальского региона Выделен и детально охарактеризован новый вид алкалотолерантной термофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «АпохуЬааПия топ%о11ет18» Показано, что данная бактерия секретирует гермостабильную сериновую субтилизин-подобную протеазу, имеющую оптимум активности при 65°С и рН 10,510,8 В целом результаты диссертации расширяют представления о видовом разнообразии и функциональной активности представителей аэробного микробного сообщества щелочных термальных источников Байкальского региона Кроме того, новые микроорганизмы, обитающие при экстремальных значениях температуры и рН, являются потенциальными источниками новых ферментов, ценных для использования в производствах, требующих повышенных температур и значений рН среды Результаты исследований могут быть использованы в биотехнологии, бальнеологических исследованиях, а также учебном процессе при изучении микробиологии и экологии

Апробация работы Результаты исследований доложены автором ежегодных Межрегиональных конференциях «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона глазами молодежи» г Улан-Удэ (20042005), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), ежегодной научно-практическои конференции преподавателей, аспирантов и студентов ВСГТУ, Улан-Удэ (2005-2006) и на Международной научной конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006)

Публикации. По результатам исследования опубликовано 14 работ Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах, включая таблиц и рисунков Диссертация состоит

из разделов "Введение", «Обзор литературы», "Экспериментальная часть", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы" ( наименований)

Благодарности. Автор глубоко признателен д б н, проф Б Б Намсараеву, к б н Бархутовой Д Д и к б н Намсараеву 3 Б за постоянное внимание, помощь и полезные советы Автор выражает благодарность д б н, проф В М Горленко и сотрудникам Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН, д б н Дунаевскому Я Е и сотрудникам лаборатории растительных белков НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ, к б н А М Лысенко (ИНМИ РАН), к б н В Н Акимову (ИБФМ РАН), всем коллегам, родным и друзьям за содействие и поддержку при выполнении диссертационной работы

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №03-04-48047 и 05-4-97215, Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», Интеграционного грантов Президиума СО РАН №170, 24 (2006г), Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 гг) и проекта молодых ученых СО РАН «Разнообразие и функционирование микробного сообщества в щелочных водных экосистемах Забайкалья»

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись слабоминерализованные (до 1 г/л) азотные гидротермы Байкальского региона, расположенные в Курумканском и Баргузинском районах Республики Бурятия и в Архангайском и Баянхонгорском аймаках Монголии (табл 1) Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и микробных матов в летне-осенний период с 2002 по 2005 год

Таблица 1 Местоположение и физико-химическая характеристика гидротерм Прибайкалья и Центральной Монголии

Источник Местоположение Т,"С рН

Апла Баргузинский хребет 70 8,9-9,9

Бочьшая речка Баргузинский хребет 61,4 9,28-9 8

Кучигер Баргузинский хребет 47,3 9,4-9,6

Учхэй Долина реки Баргузин 46 9,1

Гарга Икатский хребет 72,5 В,2

Уро Икатский хребет 69,1 8,7-9,0

Сея Икатский хребет 45-49 9,3-9,7

Психа Гочондинский хребет 71,5 8,2-8,4

Горячинск Побережье оз Байкал 42-43 8,9-9,0

Цэнхэр Архангайский аймак 84 9,8

Шивэрт Архангайский аймак 56 10,4-10,6

Хужнрт Архангайский аймак 49,1 106

Шаргулжут Баянхонгорский аймак 87-90 8,0-8,6

Хурамт Баянхонгорский аймак 54 9,2

Максимальные значения температуры (84-90°С) зафиксированы в воде источников Шаргулжут и Цэнхэр Температура воды в точках отбора проб на выходе и по изливу термальных вод в изученных источниках варьировала от 35 до 90°С Значения рН изменялись от слабо-щелочных 8,0-8,6 в воде источников Гарга, Гусиха и Шарагулжут до сильнощелочных 10,4-10,6 в гидротермах Шивэрт и Хужирт

Методы исследования В местах отбора проб температуру воды измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия) рН среды определяли потенциометрически при помощи полевого рН-метра рНер (Португалия) Значение общей минерализации определяли портативным тестер-кондуктометром TDS-4

Содержание органического углерода (Сорг) в пробах определяли по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1980) Определение содержания белка проводили по реакции с кумасси синим (Методы общей бактериологии, 1984) Углеводы определяли по реакции с дифениламином и соляной кислотой (Методы химии углеводов, 1967, Захарова, Косенко, 1982) Определение липидов проводили по модифицированной методике Блайя и Дайэра (Кейтс, 1975) Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-1021 (Великобритания) Для определения содержания зольных элементов пробы сжигали в печи при температуре 550°С (Аринушкина, 1980)

Учет численности и выделение аэробных термофильных бактерий различных физиологических групп проводили методом предельных разведений и высева на агар на модифицированной среде Пфеннига следующего состава (г/л) NH4C1 - 0,4, КН2Р04 - 0,5, NaN03 - 0,4, MgCl2 -0,2, Na2S04 - 0,5, NaCI - 0,5, KC1 - 0,5, дрожжевой экстракт -0,1, раствор микроэлементов по Липперту, Витману - 1 мл, витамин В12 - 20 мкг В качестве субстратов вносили (в %) для протеолитиков — пептон (1,5), для амилолитиков - крахмал (1,5), для целлюлолитиков - полоску фильтровальной бумаги (1), для липолитиков - твин-40 (1,5), для сахаролитиков - глюкозу (1,5) рН среды доводили 0,1 М раствором NaOH до 7,5-8,5 при 25°С, температура инкубации 55°С Общую численность микроорганизмов (ОЧМ) определяли методом Разумова на мембранных фильтрах (Романенко, 1974) Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и споро образование изучали микроскопированием образцов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000)

Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате по описанной ранее методике (Юрков и др, 1991) Диапазон рН определяли с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия Диапазон развития при разной минерализации среды

определяли с разными концентрациями хлорида натрия Способность к использованию различных источников углерода проверяли на средах содержащих 0,1 г/л дрожжевого экстракта, в которую вносили испытуемые источники углерода в концентрации 1 г/л Биомассу бактерий определяли по изменению оптической плотности культуры при длине волны 650 нм на фотометре КФК-20 Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста определяли общепринятыми методами (Герхардт, 1984)

Активность внеклеточных протеолитических ферментов определяли с помощью метода Эрлангера с соавторами, используя 5 мМ синтетические субстраты ]Ч-бензоил-Ь-аргинил-п-нитроанилид (БАПА, субстрат трипсин-подобных протеиназ), пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП, субстрат химотрипсин- и субтилизин-подобных ферментов), а также субстраты аминопептидаз фенилаланил-п-нитроанилид (ФПА) и L-лейцин-п-нитроанилид (ЛПА) Для определения оптимума рН секретируемой протеазы был использованы 0,02 М растворы цитратно-фосфатного и глицин- NaOH буферов в диапазоне рН от 2 до 13 Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при значениях температуры от 30 до 90°С Для выяснения природы функциональных групп активного центра использовались ингибиторы сериновых протеаз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) и химо-трипсин-подобных протеаз - ТФСК

Выделение и очистка ДНК проведены в ИНМИ РАН (г Москва) по стандартным методам (Marmur, 1961) Содержание ГЦ в ДНК определяли по температуре плавления ДНК, гомологию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Ley, 1970) Амплификация и секвенирование генов 16S рРНК проведены в ИБФМ РАН (г Пущино) и в ЛИН СО РАН (г Иркутск) Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили путем поиска гомологичных последовательностей в Genbank с помощью поисковой программы NCBI BLAST (http // www nebí nlm nih gov) Филогенетическое дерево было построено с использованием пакета программ TREECON W по методу объединения ближайших соседей

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Химический состав микробных матов и донных осадков гидротерм. Для количественного и качественного определения органического вещества (ОВ) в изучаемых гидротермах был изучен химический состав микробных матов и донных отложений, а именно определено содержание органического углерода (Сорг), золы, углеводов и белка (табл 2, 3)

Таблица 2 Химический состав микробных матов гидротерм (в % от сухого веса)

Гидротерма Сорг Зола Углеводы Белок

Шаргулжут 18,09 68,72 13,05 5,61

Цэихэр 20,50 81,69 17,00 9,12

Шивэрт 13,50 96,16 13,70 7,36

Хужирт 9,50 89,59 13,00 7,97

Гусиха 31,35 75 10 24,77 12,43

Уро 26,20 68,73 24,70 13,42

Гарга 25,78 64,22 21,15 11,12

Сея 25,15 64,31 24,73 15,79

Алла 16,78 64,22 16,10 6,72

Кучигер 23,86 57,34 20,23 11,45

Учхэй 19,60 90,40 9,5 9,45

*- использование различных методов при определении химического состава может приводить к ошибке при суммировании, доходящей до 10 % Тем не менее, это позволяет сравнивать источники по каждому отдельному параметру между собой

Микробные маты характеризовались высоким содержанием Сорг, достигавшим 31,35% Максимальное количество Сорг отмечено в матах ист Гусиха, развивающихся при высоких температурах (71,5°С) С учетом того, что содержание углерода в глюкозе составляет порядка 40%, можно предположить, что общее содержание ОВ в исследованных матах будет находиться в пределах 25-75% Большая часть ОВ матов представлена углеводами Максимальное содержание углеводов зафиксировано в матах источников Гусиха, Сея и Уро Содержание углеводов в матах, основу которых составляли цианобактерии, близко к содержанию углеводов в накопительных культурах цианобактерий Согласно литературным данным цианобактерии могут накапливать от 17 до 43% углеводов В отдельных случаях общее содержание углеводов в цианобактериях достигало 70% (Барашков, 1965,1972, Гусев, Никитина, 1979) В природных условиях ослизнение микробных матов за счет образования микроорганизмами углеводсодержащих экзополимеров происходит как правило при неблагоприятных условиях окружающей среды (высоких значениях температуры и рН) (Заварзин, 1993, Баг^аг, Оьшап, 1972, Пирог и др, 1998)

Содержание белка в микробных матах термальных источников варьировало от 5,61 до 15,79% В микробных матах отмечено низкое содержание липидов Их количество не превышало 2% от сухой массы мата Исследованные маты характеризовались высоким содержанием золы (до 96,16%)

Содержание органического углерода в донных отложениях исследованных гидротерм изменяется в пределах от 1,5% до 10,3% Высокое содержание Сорг (10,3%) в пробе ила источника Кучигер может быть объяснено тем, что местность выхода термальных вод сильно заболочена и покрыта зарослями растительности

Таблица 3 Химический состав донных осадков гидротерм (в % от сухого веса)*

Гидротерма Сорг Зола Углеводы Белок

Алла 5,00 92,30 1,80 5,12

Кучигер 10,30 89,64 8,50 3,7

Умхей 8,50 81,45 5,00 7,36

Цэнхэр камни 1,50 90,47 0,40 1,12

ил 9,50 88,79 6,40 8,2

Шивэрт 7,50 99,98 1,30 2,43

Хужирт 3,42 99,77 0,80 0,97

Шаргулжут 9,00 98,34 5,80 3,45

*- испочьзование различных методов при определении химического состава может приводить к ошибке при суммировании, доходящей до 10 % Тем не менее, это позволяет сравнивать источники по каждому отдельному параметру между собой

Наиболее низкие концентрации установлены в илах источников Цэнхэр и Хужирт (1,5 и 3,42%) Пониженные концентрации Сорг выявлены в источниках, выходящих непосредственно го трещин в породах, при отсутствии в месте выхода почвенного слоя и заболоченностей Максимальное количество белка составило 8,5% в иле Кучигерского источника Белка в среднем в илах больше, чем углеводов — это можно объяснить тем, что мертвая биомасса бактерий и другие источники белка аллохтонного происхождения оседают на дно и накапливаются, образуя слой осадков (Современная микробиология, 2005) Содержание углеводов в осадках варьировало от 0,4 до 8,5%, что на порядок меньше содержания углеводов в микробных матах Очень высокие значения зольности (до 99,98%) свидетельствуют о накоплении в илах неорганических соединений

Сравнительный анализ содержания Сорг матов и донных осадков термальных источников показал, что удельное содержание ОВ выше в микробных матах гидротерм

Распространение аэробных термофильных органотрофных бактерий в щелочных термальных источниках Известно, что на первом этапе деструкции ОВ основная роль принадлежит аэробным бактериям, осуществляющим гидролиз В них следует различать группировки сахаролитических, протеолитических, липолитических организмов, использующих соответственно полимеры углеводов, азотистых соединений, липидов и продукты их гидролиза Численность основных физиологических групп бактерий, участвующих в аэробной деструкции органического вещества, была определена в донных отложениях и микробных матах источников

Доминирующими физиологическими группами как в илах, так и в матах были протеолитические бактерии, максимальные численности которых достигали 1 млн кл/мл

Табтица 4 Максимальная численность аэробных термофильных бактерий в илах и микробных матах гидротерм, 1ц, кл/мл

Гидротерма т,"с рН Численность термофитьных аэробных бакте эий в илах

Протео литики Сахаро литики Амило литики Липоли тики Целлюто литики

Шаргулжут 90 8,0 5 2 1 3 1

87 8,0 5 2 1 3 1

72 8,0 6 2 2 1 2

67 8,0 6 3 2 3 2

59 8 1 6 4 3 3 2

Цэнхэр 83,7 9,8 5 4 1 3 2

80,3 9,8 6 4 2 2 1

Гарга 72,5 8,2 4 4 3 1 1

Гусиха 71,5 8,4 3 3 3 1 1

Алла 70 9,9 6 4 3 3 2

Уро 64 8,9 3 3 1 2 2

Щивэрт 56 10,4 5 4 2 3 2

Хурамт 54,7 9,2 3 3 2 3 2

Кучигер 47,3 96 3 3 3 1 4

Умхэй 46 9,1 4 4 3 2 2

Горячинск 43 9,0 3 3 3 2 2

Хужирт 37 10,6 2 2 2 1 3

Гидротерча т,"с рН Численность термофильных аэробных бактерий в матах

Протео питики Сахаро литики Амило литики Липоли тики Целлюло литики

Г>си\а 66 9 82 4 4 3 2 1

Уро 62 8 7 3 4 2 2 1

Шаргулжут 52 8,0 4 4 3 3 2

36 8 3 2 4 3 1 3

45 8,3 3 3 3 1 1

35 8 1 4 3 3 2 3

59 86 4 5 3 1 1

Сея 49 9,7 5 5 4 2 2

45 9,3 5 5 4 3 3

Горячинск 42 8,9 5 5 4 3 2

Кучигер 40 9,4 2 4 2 1 1

Апга 38 8,9 4 3 2 2 2

Нибольшее количество аэробных протеолитических бактерий выявлено в донных осадках источников Шаргулжут, Цэнхэр и Алла в выходах с температурами 59-72°С В высокотемпературных выходах (83,7-90°С) количество этих бактерий было на порядок ниже, т к данный температурный диапазон является областью развития гипертермофилов Исследуемые нами бактерии, выделенные при 55°С, вероятно способны переживать высокую температуру в источнике В источнике Хужирт зафиксировано наименьшее количество протеолитических бактерий (100 кл/мл), что вероятно объясняется малым содержанием белка (0,8 мг белка/кг сухого вещества) в пробе ила

Количество бактерий, гидролизующих углеводы, варьировало от 10 до 100 тыс кл/мл Наибольшее число бактерий-сахаролитиков (100 тыс кл/мл) наблюдали в микробных матах источников Сея и Шаргулжут Практически во всех источниках численность сахаролитических гидролитиков была на порядок выше в микробных матах, чем в донных отложениях Вероятно, это связано с тем, что большая часть ОВ матов представлена углеводами (9,5-24,77%)

Максимальное число бактерий (10 тыс кл/мл), использующих в качестве основного субстрата — крахмал, зафиксировано в микробных матах источника Сея развивающихся при температурах 45-49°С Данный температурный диапазон являлся оптимальным для развития амилолитических гидролитиков В донных осадках численность бактерий-амилолитиков снижалась на 1-2 порядка Выделенные бактерии проявили высокую активность по расщеплению крахмального агара, 92% культур показали хорошо выраженные зоны просветления (от 5 до11 мм)

Число липолитических бактерий достигало 1000 кл/мл, что, вероятно, объясняется низким содержанием доступных липидов в водоемах В целом, картина распространения бактерий-липолитиков в микробных матах и донных отложениях одинакова Липолитические бактерии, выделенные из высокотемпературных источников Шаргулжут и Цэнхэр, были морфологически однородны и представлены споровыми палочками В культурах гидротерм Сея, Алла и Хурамт доминировали длинные цепочки бактерий

Количество бактерий-целлюлолитиков, колебалось от 10 до 10 тыс кл/мл как в микробных матах, так и в донных осадках Наибольшее их количество зафиксировано в илах источника Кучигер, выходы которого расположены в болотистой местности покрытой растительностью Наблюдалась количественная зависимость распространения аэробных целлюлолитиков от температуры в источниках При повышении температуры от 47,3 до 72,5°С численность этих микроорганизмов снижалась на 1-2 порядка Выявленная группа бактерий в основном представлена подвижными спорообразующими палочками

Общая численность микроорганизмов (ОЧМ) была определена в водной толще и донных осадках изучаемых гидротерм и колебалась от 3,46 до 81,56 млн кл/мл Максимальные значения ОЧМ в донных отложениях (55,36-75,12 млн. кл/мл) были отмечены в источниках Алла, Кучигер, Шивэрт и Шаргулжут в температурном диапазоне от 38 до 59°С, содержание оргашиеского углерода варьировало от 5,0 до 9,0% от сухой массы ила) Минимальные значения ОЧМ в донных отложениях (4,9717,24 млн кл/мл) зафиксированы в высокотемпературных гидротермах Гусиха и Уро (66,9-71,5°С), и в иле источника Хужирт (37°С) с низким содержанием ОВ (3,42 % от сухой массы ила)

В водной толще источников общее число бактерий составляет 4,3659,27 млн кл/мл В пробе воды низкотемпературного источника Кучигер наблюдалось максимальное количество бактерий 81,56 млн кл/мл Содержание бактерий в воде высокотемпературных источников Гарга и Цэнхэр незначительное - 13,47 - 23,86 млн кл/мл Низкое содержание бактерий отмечено в воде источника Хужирт - 4,36 млн кл/мл.

Выделение и описание аэробных органотрофных бактерий Из

органотрофных культур с устойчивым ростом, полученных из щелочных гидротерм Прибайкалья Гарга, Гусиха, Алла, Уро, Сея, Большая речка и Кучигер было выделено 23 штамма аэробных термофильных бактерий Краткая характеристика выделенных штаммов представлена в таблице 5

Таблица 5 Характеристика выделенных культур аэробных органотрофных бактерий

Штамм Гидротерма Вид пробы Физиопогич группа Оптимум т, "С Оптимум рн

Оа-1-1 Гарга мат Протеолитик 45 8,3

Оа-9-2 57 8,5

вя-б Амилолитик 60 8,5

Ои-1 Гусиха Протеолитик 49 8,0

Ои-2 60 8,1

А! Алла ил Протеопитик 45 8,0

А2 50 8,1

АЗ 49 8,0

А4 50 8,5

А5 49 8,5

А1-9-1 мат 49 8,0

иг-4 Уро Сахаролитик 45 8,5

иг-5 Протеолитик 49 8,0

иг-6 46 8,0

Вг-2-1 Большая речка 50 8,2

Вг-2-2 50 8,2

8е-1 Сея 49 8,2

Бе-З 52 8,3

8е-4 ил Липолитик 50 8,2

Бе-5 Амилолитик 45 8,5

Бе-б-] 45 8,4

Бе-б-г 49 8,5

Ки-3 Кучигер ил Целчюлолитик 45 8,0

Клетки бактерий представлены спорообразующими палочками, размеры которых варьируют в пределах от 0,9-2,3 х 1,9-8,4 мкм Размеры спор составляют 0,8-0,9 х 0,9-1,2 мкм Все штаммы являются умеренными термофилами с диапазоном роста от 37 до 75°С и оптимумом 45-60°С Диапазон рН для роста - от 6,0 до 9,5, оптимум рН - 8,0-8,5 Оптимальной

концентрацией NaCl (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л

Культуры использовали широкий спектр субстратов арабинозу, галактозу, глюкозу, маннит, фруктозу, раффинозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, дульцит, инозит, пептон, дрожжевой экстракт, крахмал и глицерин Рамноза, лактоза и сорбит не использовались Все организмы были способны к брожению на глюкозе и сахарозе, но не сбраживали лактат, рамнозу, пептон, крахмал и целлюлозу Тесты на каталазу и оксидазу положительные, не продуцировали аммиак, индол и сероводород На безазотистой среде Эшби роста не проявляли По физиолого-биохимическим свойствам все штаммы близки к видам Bacillus, Anoxybacillus

Все выделенные штаммы были протестированы на наличие ферментативной активности Все культуры проявили высокую протеазную активность (активно разжижали желатиновые диски) при 55°С Липазную активность определяли при температуре 55°С Всего 14 организмов показали способность расщеплять субстрат твин-40 При этом диаметр зон омыления варьировал от 6 до 15 мм Высокую активность проявили бактерии по расщеплению крахмального агара, суммарно 19 из 22 штаммов показали различные зоны просветления (от 5 до 11 мм) Казеиназной активностью обладают только 9 изолятов, хотя на среде с пептоном отмечен рост у всех изолятов Эндоцеллюлазной активностью обладают 3 изолята Ur-6, Br-2-l и Ки-3 Каталазная и оксидазная активности отмечены у всех штаммов Таким образом, можно заключить, что выделенные штаммы аэробных органотрофных бактерий проявили потенциальную протеазную, липазную, амилазную, казеиназную, эндоцеллюлазную, каталазную и оксидазную активности Все аэробно выделенные в культуру органотрофные бактерии способны к анаэробному росту за счет брожения, что позволяет им осуществлять разложение OB в условиях резких суточных колебаний 02

Для анализа гена 16S рРНК было отобрано 5 штаммов (Ga-1-1, Ur-6, А2, Вг-2-2 и Se-1) В результате было показано, что штамм Ga-1-l имеет 100 % сходства с Anoxybacillus sp AF-04-1 Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyticum C-ll (99 %) Изоляты Вг-2-2 и А2 на 97 и 99%, соответственно, близки к В licheniformis BBDC6 У штамма Se-1 обнаружено 95 % сходства с А pushchtnoensis АТ-2

Культуры, выделенные из гидротерм с комбинацией наиболее экстремальных значений температуры и pH, привлекли внимание и были исследованы более детально

Новая а л кал отол ер а нт на я термофильная органотрофная бактерии

«AnoxybaciUus mongoliensis». Из проб ила низкоминерализованных щелочных гидротерм Центральной Монголии Хужирт (Huzhirt), Шиверт (Shivert) и Цэнхэр (Tsenher) с температурами 37-841)С и значениями рН 9,810,6 было выделено 10 штаммов аэробных термофильных бактерий-Пробы культивировали при 55аС, без перемешивания. Чистые культуры были получены путем высева суспензии микроорганизмов на агар и последующих пересевов.

На поверхности агаризованной среды бактерии формировали округлые колонии диаметром 2-4 мм, кремовые, имеющие выпуклый профиль, ровные края и однородную структуру. Клетки имели форму прямых палочек, как правило одиночных или в парах (рис.2). В конце фазы замедленною роста наблюдали появление проспор, спорулирующих клеток и отдельно лежащих спор. Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько расширяя ее. Клетки имели размеры 1,2-1,5 х 4,5-10,6 мкм. Окраска по Граму положительная.

Рис.2, Морфология клеток штамма TV Масштабная метка 5 мкм.

Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста от 37 до 75с'С и оптимумом 58-61°С. Диапазон рН от 6,0 до 10,5, оптимум рН 7,08,5. Оптимальной концентрацией NaCl (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Бактерии способны в аэробных условиях утилизировать широкий спектр органических соединений: арабинозу, ксилозу, рибозу, глюкозу, маннит, фруктозу, рамнозу, раффинозу, сахарозу, инозит, глутамат, лактат, пиру ват, ацетат, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат кгзеина, крахмал и углеводороды. Галактоза, дульцит, манноза, сорбит, лактоза, мальтоза, глицерин и гликолят культурами не использовались. Организмы способны к брожению на глюкозе и сахарозе, не сбраживали глутамат, лактат, пируват, рибозу, рамнозу, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол.

Уровень ДНК-ДНК гомологии у всех 10-ти выделенных штаммов составил от 72 до 99% (табл.6). Таким образом, выделенные нами штаммы могут быть отнесены к одному виду.

Результаты айагсгоа смкаенса гена 16S рРНК (5527 муклеотидой) штаммов Т4, S3 и Н5 показали, что штаммы принадлежат к группе Clostridium/lktcilius грам-положительных бактерий, роду Anoxybacilius.

!__

Таблица 6 ДНК-ДНК гомология между выделенными штаммами

Штамм ГЦ мол % Гомочогия ДНК (%)

Н1 Н2 Н5 Н6 S1 S2 S4 11 Т4 Т5

Н1 43 8 100

Н2 44 2 99 100

Н5 44 2 95 98 100

Н6 44 0 98 97 95 100

S1 44 2 98 100

S2 44,4 97 100

S4 44,6 98 98 100

1 1 44 4 100

Т4 44 2 72 100

Т5 44 2 98 99 96 100

Результаты анализа нуклеотидного состава ДНК показали, что содержание ГЦ пар в ДНК штамма Т4 составляло 44,2 мол%, что было близким к А ршИсИтоепт (42,2 мол%) и А Аа\'о1кггтт (41,6 мол%) (табл 7)

Табтица 7 ДНК-ДНК гомология между штаммами Anoxybacillus и штаммами Т4 и Н5

Штамм Содержание Г+Ц (мол %) ДНК-ДНК сходство, %

КГ DSM 264 Г Т4 Н5

A pushchmoensis К11 42 2 100

A Jlavathei mus DSM 2641т 41 6 58,8 100

14 44,2 28 38 100

Н5 44,2 31 47 72 100

Результаты ДНК-ДНК гибридизации выявили низкий процент гомологии ДНК для штамма Т4 и типовых штаммов A flavothermus (38 %) и A pushchinoensis (28 %), что свидетельствует о таксономической обособленности Т4 от этих видов Уровень гомологии ДНК между типовыми штаммами A flavothermus и A pushchinoensis составляет 58,8%

По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамм Т4 является новым видом рода Anoxybacillm В таблице 8 приведены отличительные признаки видов данного рода

На основании проведенных исследований мы предлагаеми отнести выделенные штаммы к новому виду бактерий под названием «A noxybacillus т он gol ¡ensis»

Таблица 8 Физиолого-биохимическиесвойства штамма«Л гоои^о/ге/т?» Т4 и некоторых других представителей рода АпохуЬасШия

Признак 1 2 3 4 5 7

Ширина 1,2-1,5 0,85 0,4-0,5 0,55 1,0 0,75

клеток, м км 4,5-10,6 2,3-7,1 2,5-3,0 4,6 2,5-8,8 5,0

Длина клеток,

мкм

Подвижность - + - + + +

Форма спор Овальная Нд Круглая Круглая Овальная Круглая

Температура

роста

(°С) 37-75 30-72 37-66 30-70 37-66 40-70

Интервал 60 60-65 62 50 57-62 55-60

Оптимум

рН роста

Интервал 6,0-10,0 5,5-9,0 8,0-10,5 6,0-11,0 5,7-9,9 6,0-10 0

Оптимум 7,0-8 5 Нд 9,5-9,7 7,5-8,5 6,8-8,5 7,5-8,0

Пигментация - + - - - -

Каталаза + + - + - +

Оксид аза + + Нд + - +

Субстраты1

Галактоза - +2 (-) Нд + (-) Нд

Сорбит - + (-) Нд -(-) Нд

Мальтоза - + Нд + + (+) Нд

Желатин + - + -(-) +

Обозначения штаммов 1 - штамм «Л топ°оИет'т» Т4, 2 - В Аауо&егтиз П8М 2641т (Нетеп е1 а1, 1982), 3 - А ршксЬпоети К1Т (Р1кта е1 а1, 2000), 4 - А ауйегети АВ04Т (Ои^ег е! а1, 2004), 5 - А катсУкНкепш БВМ 14988 (КеуЬпп ^ а1, 2005), 7 -А gonensls 02т (ВеМш й а1, 2003)

1 - аэробное и анаэробное использование субстрата, без скобок и в скобках соответственно

2 - измеряли как Р-галактозидазную активность

Все штаммы росли на глюкозе и сахарозе +, наличие свойства, -, отсутствие свойства, Н д - нет данных

ОД

84 83

Anoxybacülus piishchinoemis АТ-2

Т4

65 } Anoxybacillus flavothermus DSM 2641 jqq ¡L Anoxybacülm kestanbolinensis K2

[64

99

86

100

71

Anoxybacillus ayderensis AB04 Anoxybacillus kamchatkensis JW/VK-KG4 - Anoxybacillus vomovskiensis TH13 100 Г thermoalkalophihis DSM 6866

L

Geobacillus sp T38

-Bacillus fumarwh R-14705

Escherichia coll

РисЗ Филогенетическое дерево последовательностей штамма Т4 <сAnoxybacülus mongoliensis» Построено на основе анализа фра! мента гена 16S рРНК с помощью метода объединения ближайших соседей (NJ) Вероятностная поддержка отдельных узлов оценивалась с помощью бутстрэп-анализа, приведены значения выше 50% Шкала соответствует 0,1 нуклеотидных замен на сайт

Внеклеточная протеолитическая активность Исследование секреции внеклеточных протеаз у разных видов термофильных бактерий дает возможность выявить природные изоляты с высокой ферментативной активностью и различными спектрами секретируемых внеклеточных протеаз Нами была проверена секретируемая протеолитическая активность 12 и 24-часовых культур 4-х штаммов Bacillus sp (AI, A3, A4 и А5) , штамма В licheniformis А2, выделенных из термального источника Алла, и 10-ти штаммов «А mongoliensis» (Hl, Н2, Н5, Н6, Sl, S2, S4, Т1, Т4 и Т5) с использованием синтетических субстратов БАПА, ГААЛП, ФПА и ЛПА Отмечено повышение удельной активности у 24-часовых культур по сравнению с 12-часовыми Вероятно, это связано с увеличением продукции внеклеточной протеазы после экспоненциальной фазы роста, которая для выделенных культур составила 12-14 часов

Большинство исследуемых штаммов проявили низкую активность секреции трипсинподобных протеаз по БАПА) Относительно протеазной

активности по субстрату ЛГ1А следует отметить, что наибольшие значения активности проявились у культур АЗ, А4 и А5. Максимальную активность по субстрату ФПА проявили штаммы АI, А2, Н5, Н6, 81 и ТЗ. Способность образования специфичных протеаз является результатом адаптации изучаемых штаммов к экстремальным условиям обитания.

Культуры АЗ, А5 и ТЗ проявили

наибольшую активность при использовании в качестве субстрата ГААЛП; максимальные значения активности отмечены у штамма Т4 (рис.4).

Д1 А2 АЗ А4 А5 Н5 Н6 31 54 ТЗ Т4

Было изучено влияние температуры и рН на эту активность и стабильность соответствующей внеклеточной протеазы, секретируемой штаммом Т4. Фермент имеет оптимум рН ¡0,5-30.8; стабилен в интервале рН от б до II (рис 5). Температурный оптимум протеазы около 65МС, фермент сохранял до 45% активности при температурах до 75°С (рис 6).

Рис.4. Оптимум температуры (А) и стабильности (■) протеазы, секретируемой штаммом Т4 при 374;» течение 24 ч.

00, 410 од ММ

0.4

0,2|

а 3 4 5 6 7 0 Э 10 11 12

рН

Рис. 5. Оптимум рН (А) и стабильности (■) протеазы, секретируемой штаммом Т» при 37°С в течение 24- ч.

00, 410 им

2 I 1.6 ■ 1,2 0,8

Рис. 4, Активность суточных культур по ГААЛП

0.4

°0 50 61) 70 80

Температура °С

Активность исследуемого фермента полностью ингибировалась ФМСФ - специфическим ингибитором сериновых протеаз При этом ТФХК, ингибитор химотрипсин-подобных ферментов, оказался неэффективен по отношению к этой активности Исходя из результатов иш ибиторного анализа и субстратной специфичности можно предположить, что секретируемый фермент «Anoxybacillw, mongollensis» относится к классу сериновых протеаз субтилизин-подобного типа

Термостабильные ферменты находят применение в различных областях биотехнологии - от индустриального производства гидролитических ферментов для детергентов до использования термостабильных ферментов обмена нуклеиновых кислот в генетических и молекулярно-биологических исследованиях (Kristjansson et al, 1989, Sünna et al, 1997, Vielle, Zeikus, 2001 и др ) Протеазы из алкалофильных бактерий применяются при дублении кожи, в пивоварении и производстве специфических детергентов Протеазы составляют около 60% от количества всех производимых ферментов (Nunes, Martins, 2001, Singh, 2001, Zeikus et al, 1998) Бактериачьные протеазы являются наиболее значимыми, по сравнению с протеазами животного и грибного происхождения (Ward, 1985) Проведенные исследования показали, что исследуемые штаммы Bacillus sp, В lichemfoimis и «A mongohensis» являются активными продуцентами внеклеточных сериновых протеаз, которые могут быть использованы в производствах, требующих повышенных температур и значений pH среды

ВЫВОДЫ

1 Термофильные аэробные органотрофные бактерии были выявлены в щелочных гидротермах Байкальского региона при температурах от 35 до 90°С и pH от 8,0 до 10,6

2 Показано доминирование в исследуемых источниках протеолитических и сахаролитических групп бактерий с максимальными численностями свыше 100 тысяч кл/мл Максимальные численности ам ^политических и целлюлозоразлагающих бактерий не превышали 10 тысяч кл/мл

3 Выделенные аэробные органотрофные культуры являются спорообразующими алкапотолерантными факультативно-анаэробными термофилами принадлежащими к группе Clostridium/Bacillus грам-положительных бактерий Выделенные штаммы обладают широким спектром гидролитических ферментов и вероятно обеспечивают в сообществе функции первичных деструкторов

4 Из щелочных гидротерм Монголии выделен новый вид алкалотолерантной термофильной факультативно-анаэробной органотрофной бактерии «АпохуЬасШт тощо]1ет1в», способной к росту при рН 6,0-10,0 и температуре 37-75°С

5 Типовой штамм «А то^сИетк» Т4 является активным продуцентом термостабильных внеклеточных щелочных протеолитических ферментов, относящихся к классу субтилизинподобных сериновых протеаз, имеющих оптимум активности при 65°С и рН 10,5-10,8

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1 Бабасанова О Б Распространение аэробных термофильных бактерий в высокотемпературной гидротерме Шаргулжут /ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова // Тезисы «Биология - наука XXI века 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых -Пущино,2004 - С 140

2 Бабасанова О Б Распространение термофильных липолитических бактерий в гидротермах Байкальского региона /ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова // Материалы Межрегиональной научной конференции «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона глазами молодежи» -Улан-Удэ Изд-во БГУ,2004 -С 78-79

3 Бабасанова О Б Микробное сообщество высокотемпературного источника Шаргулжут / ОБ Бабасанова, А В Брянская, Д Д Бархутова // Материалы Межрегиональной научной конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» - Иркутск, 2004 - С 105-108

4 Бабасанова О Б Гидролитические бактерии гидротерм Шаргулжут, Хурамт и Хужирт (Монголия) /ОБ Бабасанова // Материалы VIII Международной научной конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» - Абакан, 2004 - С 122

5 Бабасанова О Б Аэробные термофильные бактерии гидротермы Шаргулжут (Монголия) /ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова // Вестник БГУ Серия 2 Биология -Вып7 - Улан-Удэ, 2005 - С 155-159

6 Бабасанова О Б Термофильные протеолитические и сахаролитические бактерии щелочных гидротерм Центральной Монголии / ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова // Тезисы «Биология - наука XXI века 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых — Пущино,2005 - С 181

7 Бабасанова О Б Новая факультативно анаэробная бактерия рода Anoxybacíllits, выделенная из щелочного термального источника Монголии /ОБ Бабасанова, 3 Б Намсараев // Тезисы Всероссийской

молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» - Москва, ИНМИ РАН, 2005 - С 6-7

8 Бабасанова О Б Функциональное разнообразие аэробных термофильных бактерий, выделенных из гидротерм Центральной Монголии / Б С Цыренов, О Б Бабасанова // Материалы IX Международной научной конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» - Абакан, 2005 — С 150

9 Бабасанова О Б Выделение и описание термофильных Bacillus из гидротерм Монголии /ОБ Бабасанова, С В Зайцева, Д Д Бархутова // Материалы Межрегиональной научной конференции «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона глазами молодежи» - Улан-Удэ Изд-во БГУ -2005 - С 12-13

10 Бабасанова О Б Внеклеточная протеазная активность термофильных бактерий из щелочных термальных источников Бурятии и Монголии / О Б Бабасанова, Д Д Бархутова // Сборник научных трудов Серия Химия и биологически активные вещества - Вып 10 - Улан-Удэ Изд-во ВСГТУ, 2006 - С 83-90

11 Бабасанова О Б Физиолого-биохимические свойства термофильных органотрофных бактерий, выделенных из гидротерм Бурятии /ОБ Бабасанова, 3 Б Намсараев, Д Д Бархутова // Тезисы Всероссийской молодежной школа-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» - Москва, ИНМИ РАН, 2006 - С 47-48

12 Бабасанова О Б Биоразнообразие аэробных гетеротрофных бактерий в гидротермах Бурятии и Монголии / С В Зайцева, О Б Бабасанова // Тезисы Международной научной конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» - Улан-Удэ, 2006 - С 44

13 Бабасанова О Б Аэробные термофильные бактерии — липолитики щелочных гидротерм Байкальского региона / ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова // Сборник научных трудов Серия Химия и биологически активные природные соединения - Вып 12 -Улан-Удэ Изд-во ВСГТУ, 2007 - С 28-29

14 Бабасанова ОБ Аэробные органотрофы из щелочных термальных источников Байкальского региона /ОБ Бабасанова, Д Д Бархутова, 3 Б Намсараев // Тезисы Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире взгляд научной молодежи» — Улан-Удэ Изд-во БНЦ СО РАН, 2007 - С 131-132

Подписано в печать 1104 2007 Формат 60x84 1/16 Уел печ л Объем 1,27 Тираж 100 Заказ №> 2052

Издатеньство Бурятского госуниверситета 670000, Улан-Удэ, уч Смолина 24а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабасанова, Ольга Бадмажаповна

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химическая характеристика щелочных гидротерм

1.2 Микробные сообщества щелочных гидротерм

1.3. Состав органического вещества (ОВ) и скорости продукционно-деструкционных процессов в микробных матах щелочных гидротерм

1.4. Аэробные органотрофные бактерии щелочных гидротерм

1.5 Биотехнологический потенциал алкалотермофильных бактерий

1.5.1 Механизмы адаптации ферментативных систем к высоким значениям температуры и рН

1.5.2 Промышленное применение ферментов, продуцируемых алкалотермофильными бактериями

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Физико-химические методы

2.3 Методы учета, культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов

2.4 Методы определения ферментативной активности 37 2.4.1 Методы определения внеклеточной протеолитической активности

2.5 Методы определения скорости микробных процессов аппликационным методом

2.6 Молекулярно-генетические методы

2.7 Статистические методы 40 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. Экологические условия обитания микроорганизмов щелочных 41 гидротерм Байкальского региона

3.1 Физико-химическая характеристика исследуемых гидротерм

3.2 Содержание ОВ и минеральных соединений в микробных матах и донных осадках

4. Участие микроорганизмов в аэробной деструкции ОВ 48 4. 1 Распространение аэробных органотрофных бактерий в донных осадках и микробных матах щелочных гидротерм 48 4.2 Скорости микробных процессов разложения ОВ

5. Исследование чистых культур аэробных органотрофных бактерий, выделенных из щелочных гидротерм Байкальского региона

5.1 Выделение и описание аэробных органотрофных бактерий из щелочных гидротерм Бурятии

5.1.1 Морфология

5.1.2 Экофизиологические характеристики

5.1.3 Внеклеточная ферментативная активность

5.1.4 Генотипические свойства и филогенетическое положение

5.2 Новая алкалотолерантная термофильная факультативно анаэробная органотрофная бактерия «Anoxybacillus mongoliensis»

5.2.1 Морфология

5.2.2 Экофизиологические характеристики

5.2.3 Генотипические свойства и филогенетическое положение

5.2.4 Диагноз вида «Anoxybacillus mongoliensis»

5.3 Внеклеточная протеолитическая активность выделенных культур 83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89 ВЫВОДЫ 93 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 94 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробные органотрофные бактерии щелочных гидротерм Байкальского региона"

Актуальность проблемы. Щелочные гидротермы Байкальского региона являются экстремальными экосистемами, представляющими значительный интерес, как для фундаментальных исследований, так и для потенциальных практических применений. В связи с постоянством химического состава и температуры воды горячие источники являются удобными модельными системами для изучения экологии обитающих в них организмов (Brock et al., 1971; Логинова, Егорова, 1977).

Распространение аэробных органотрофных термофильных бактерий изучалось микробиологами в термальных источниках Камчатки, Центральной Азии, Индии, Южной Америки, запада США, Европы, Исландии (Kevbrin et al., 2004; Marteinsson et al., 2001; Wiegel, 1998; Yamamoto et al., 1998). Имеются работы по изучению ферментов аэробных термофилов, выделенных из различных высокотемпературных систем (Hawumba et al., 2002; Nascimento, Martins, 2003).

Термофильные аэробные алкалофильные и алкалотолерантные бактерии как продуценты промышленно значимых ферментов, подобно другим экстремофилам, привлекательны повышенной устойчивостью промышленных штаммов к контаминации посторонней микрофлорой, что крайне важно в производстве стандартизованного ферментного препарата (Кевбрин, 2003); Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов. Внеклеточные протеазы присутствуют у различных микроорганизмов. Они играют ключевую роль в использовании микроорганизмами органических субстратов (Ward, 1985).

В настоящее время изучен видовой состав цианобактерий и аноксигенных фототрофных бактерий щелочных термальных источников и зон Байкальского региона. Проведены исследования активности продукционных и деструкционных процессов в цианобактериальных матах (Брянская и др., 2006; Компанцева, Горленко, 1988; Намсараев, 2003; Юрков и др., 1991). Распространение аэробных термофилов в щелочных гидротермах Байкальского региона ранее изучалось эпизодически (Nazina et al., 2004; Зайцева, 2004; Намсараев, 2003; Храпцова и др., 1984). Изучены внеклеточные протеазы разных видов аэробных термофильных микроскопических грибов, выделенных из гидротерм Прибайкалья (Лаврентьева, Дунаевский, 2003; Базаржапов, 2005). Исследования, касающиеся внеклеточной протеолитической активности аэробных органотрофных термофильных бактерий из термальных щелочных источников Байкальского региона, практически полностью отсутствовали.

Целью работы являлось изучение аэробных органотрофных микроорганизмов щелочных гидротерм Байкальского региона. Задачи исследования:

1. Изучить распространение аэробных органотрофных термофильных бактерий в донных осадках и микробных матах гидротерм.

2. Выделить чистые культуры аэробных органотрофных термофилов и исследовать экофизиологические и биохимические свойства.

3. Определить видовую принадлежность полученных культур с помощью молекулярно-генетических методов.

4. Исследовать внеклеточную протеолитическую активность выделенных бактерий.

Научная новизна и практическая значимость. С помощью микробиологических методов выявлено широкое распространение аэробных органотрофных бактерий в щелочных гидротермах Байкальского региона. Выделен и детально охарактеризован новый вид алкалотолерантпой термофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «Anoxybacillus mongoliensis». Показано, что данная бактерия секретирует термостабильную сериновую субтилизин-подобную протеазу, имеющую оптимум активности при и рН 10,510,8. В целом результаты диссертации расширяют представления о видовом разнообразии и функциональной активности представителей аэробного микробного сообщества щелочных термальных источников Байкальского региона. Кроме того, новые микроорганизмы, обитающие при экстремальных значениях температуры и рН, являются потенциальными источниками новых ферментов, ценных для использования в производствах, требующих повышенных температур и значений рН среды. Результаты исследований могут быть использованы в биотехнологии, бальнеологических исследованиях, а также учебном процессе при изучении микробиологии и экологии.

Апробация работы. Результаты исследований доложены автором на ежегодных Межрегиональных конференциях «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона глазами молодежи» г. Улан-Удэ (20042005), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), ежегодной научно-практической конференции преподавателей, аспирантов и студентов ВСГТУ, Улан-Удэ (2005-2006) и на Международной научной конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 14 работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 118 страницах, включая 20 таблиц и 21 рисунок. Диссертация состоит из разделов "Введение", «Обзор литературы», "Экспериментальная часть", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы" (167 наименований).

Благодарности. Автор глубоко признателен д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву, к.б.н. Бархутовой Д.Д. и к.б.н. Намсараеву З.Б. за постоянное внимание, помощь и полезные советы. Автор выражает благодарность д.б.н., проф. В.М. Горленко и сотрудникам Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН, д.б.н. Дунаевскому Я.Е. и сотрудникам лаборатории растительных белков НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, к.б.н. A.M. Лысенко (ИНМИ РАН), к.б.н. В.Н. Акимову (ИБФМ РАН), всем коллегам, родным и друзьям за содействие и поддержку при выполнении диссертационной работы.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №03-04-48047 и 05-4-97215; Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы»; Интеграционного грантов Президиума СО РАН №170, 24 (2006г.); Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 гг.) и проекта молодых ученых СО РАН «Разнообразие и функционирование микробного сообщества в щелочных водных экосистемах Забайкалья».

Заключение Диссертация по теме "Экология", Бабасанова, Ольга Бадмажаповна

ВЫВОДЫ

1. Термофильные аэробные органотрофные бактерии были выявлены в щелочных гидротермах Байкальского региона при температурах от 35 до 90°С и рН от 8,0 до 10,6.

2. Показано доминирование в исследуемых источниках протеолитических и сахаролитических групп бактерий с максимальными численностями свыше 100 тысяч кл/мл. Максимальные численности амилолитических и целлюлозоразлагающих бактерий не превышали 10 тысяч кл/мл.

3. Выделенные аэробные органотрофные культуры являются спорообразующими алкалотолерантными факультативно-анаэробными термофилами принадлежащими к группе Clostridium/Bacillus грам-положительных бактерий. Выделенные штаммы обладают широким спектром гидролитических ферментов и вероятно обеспечивают в сообществе функции первичных деструкторов.

4. Из щелочных гидротерм Монголии выделен новый вид алкалотолерантной термофильной факультативно-анаэробной органотрофной бактерии «Anoxybacillus mongoliensis», способной к росту при рН 6,0-10,0 и температуре 37-75°С.

5. Типовой штамм «А. mongoliensis» Т4 является активным продуцентом термостабильных внеклеточных щелочных протеолитических ферментов, относящихся к классу субтилизинподобных сериновых протеаз, имеющих оптимум активности при 65°С и рН 10,5-10,8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аэробные органотрофные бактерии играют важную роль в цикле углерода гидротермальных системах и имеют значительный биотехнологический потенциал. Тем не менее, в щелочных гидротермах Байкальского региона их распространение, видовой состав и ферментативная активность ранее изучались эпизодически (Храпцова и др., 1984; Намсараев, 2003; Nazina et al., 2004; Зайцева, 2004).

Исследования были проведены в слабоминерализованных (до 1 г/л) азотных щелочных гидротермах Байкальского региона, расположенных в Курумканском и Баргузинском районах Республики Бурятия и в Архангайском и Баянхонгорском аймаках Монголии. Изучаемые гидротермы характеризовались различным температурным режимом (от 35 до 90°С) и различной - от слабо-щелочной 8,0 до сильно-щелочной реакцией среды 10,6.

Сравнительный анализ содержания Сорг матов и донных осадков термальных источников показал, что удельное содержание ОВ выше в микробных матах. Максимальное количество Сорг, достигавшее 31,35% от сухого веса, отмечено в матах гидротермы Гусиха, развивающихся при высоких температурах (71,5°С). Большая часть ОВ матов представлена углеводами. Содержание углеводов в матах, основу которых составляли цианобактерии, близко к содержанию углеводов в накопительных культурах цианобактерий. В илах ОВ в среднем белка больше, чем углеводов - вероятно это можно объяснить тем, что мертвая биомасса бактерий и другие источники белка аллохтонного происхождения оседают на дно и накапливаются, образуя слой осадков (Ленгелер и др., 2005). Содержание углеводов в осадках варьировало от 0,4 до 8,5%, что на порядок меньше содержания углеводов в микробных матах. Содержание углеводов в осадках варьировало от 0,4 до 8,5%, что на порядок меньше содержания углеводов в микробных матах.

Исследования интенсивности микробного разложения белка и целлюлозы в гидротермах показали, что среднесуточная скорость разложения белка в донных осадках и микробных матах изменялась от 0,12 до 1,77 % в сутки. Максимальные значения этого процесса выявлены в илах источников Кучигер с температурой воды 40°С и Шаргулжут, отобранном при температуре 90°С. В микробных матах источников скорость разложения белка была ниже и составляла (при температурах 40-61,5°С) 0,45-0,54% в сутки. Скорость разложения целлюлозы в исследуемых источниках была ниже скорости разложения белка и составляла 0,1- 0,87% в сутки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабасанова, Ольга Бадмажаповна, Улан-Удэ

1. Александров В.Я. Клетка, макромолекула, температура. Л.: Наука, 1975.-324 с.

2. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Наука, 1980.-487 с.

3. Барабанов Л.Н., Дислер В.Н. Азотные термы СССР/ Отв. Ред. Д.г-м.н. В.В.Иванов. М: Геоминвод ЦНИИ КиФ, 1968.-120с.

4. Барашков Т.К. Химия водорослей. М.: Изд-во АН СССР, 1965.144 с.

5. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М.: Пищевая промышленность, 1972. - 336 с.

6. Басков Е.А., Суриков С.Н. Гидротермы Земли. Л.: Недра, 1989.245 с.

7. Бархутова Д.Д. Влияние экологических условий на распространение и активность бактерий-деструкторов в сероводородных источниках Прибайкалья: Автореф. дис. канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2000. - 23 с.

8. Бонч-Осмоловская Е.А. Восстановление молекулярной серы в термальных альгобактериальных сообществах кальдеры Узон (Камчатка) / Биология термофильных микроорганизмов. М.: Наука, 1986. - С. 112113.

9. Бонч-Осмоловская Е.А. Термофильные микроорганизмы в морских гидротермальных системах. С. 131-140. / Биология гидротермальных систем. Под ред. А.В. Гебрук, К.Н. Несис, А.П. Кузнецов, A.M. Сагалевич.

10. М., КМК Press, 2002, 543 с.

11. Бонч-Осмоловская Е.А. Экстремофильные микроорганизмы. С.49-60. / Экология микроорганизмов. Под ред. А.И. Нетруеова. М.: Академия, 2004, 272 с.

12. Борисенко И.М., Замана JI.B. Минеральные воды Бурятской АССР. Улан-Удэ: Бурятское книжное изд-во, 1978. -162 с.

13. Брянская А.В. Намсараев З.Б., Калашникова О.М., Бархутова Д.Д., Намсараев Б.Б., Горленко В.М. Биогеохимические процессы в альгобактериальных матах щелочного термального Уринского источника // Микробиология.- 2006.- Т.75,- С. 1-11.

14. Геохимия подземных минеральных вод Монгольской Народной Республики / Отв. ред. д.г.-м.н. Е.В.Пиннекер. Новосибирск: Наука, 1976. - С.27-36.

15. Герасименко JI.M., Ушатинская Г.Т. Цианобактерии, циано-бактериальные сообщества, маты, биопленки // Бактериальная палеонтология. Под ред. АЛО. Розанова. М.: ПИН РАН, МГУ, 2002. - С. 36-47.

16. Голубев В.А. Тепловые и химические характеристики гидротермальных систем Байкальской рифтовой зоны // Сов. геология. 1982. №10. С. 100-108.

17. Горленко В.М. Экология водных микроорганизмов. С.60-71 / Экология микроорганизмов. Под ред. А.И. Нетруеова. М.: Академия, 2004, 272с.

18. Горленко В.М., Бонч-Осмоловская Е.А. Формирование микробных матов в горячих источниках и активность продукционных и деструкционных процессов // Кальдерные микроорганизмы. М: Наука. 1989.

19. Горленко В.М., Компанцева Е.И., Пучкова Н.Н. Влияние температуры на распространение фототрофных бактерий в термальных источниках//Микробиология. 1985. Т. 54. №5. С. 848.

20. Горленко В.М., Старынин Д.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Качалкин

21. B.И. Продукционные процессы в микробных сообществах горячего источника Термофильного // Микробиология. 1987. - Т. 56. - Вып. 5. - С. 872-878.

22. Гусев М.В., Никитина К.А. Цианобактерии (физиология и метаболизм). М.: Наука, 1979.

23. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука, 1984.- 199с.

24. Заварзин Г.А. Биоразнообразие как часть биосферно-геосферной системы возникновения порядка из хаоса // Методология биологии: новые идеи (синергетика, семиотика, коэволюция). Отв. Ред. О.Е. Баксанский. -М.: Эдиториал УРСС, 2001.

25. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука. - 2003. - С. 67-102.

26. Заварзин Г.А. Развитие микробиальных сообществ в истории Земли // Проблемы доантропогенной эволюции биосферы. М.: Наука. - 1993.1. C. 212-222.

27. Заварзин Г.А. Становление биосферы // Микробиология. 1997. Т.66. с.725-734.

28. Заварзин Г.А., Карпов Г.А., Бонч-Осмоловская Е.А. Кальдерные микроорганизмы. -М.: Наука. 1989. - 120 с.

29. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию: учебное пособие. М.: Книжный дом «Университет», 2001.-256 с.

30. ЗайцеваС.В. Влияние экологических условий на распространение и активность бактерий-деструкторов щелочных гидротерм СевероВосточного Прибайкалья. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2004.- 19 с.

31. Захарова И.Я., Косенко JT.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, Наукова Думка. - 1982. - С. 36-37.

32. Калашникова О.М. Продукция и состав органического вещества циано-бактериальных матов щелочных водных экосистем Забайкалья. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2006. - 23 с.

33. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Изд-во Мир, 1981.-520 с.

34. Кевбрин В.В. Биотехнологический потенциал термофильных алкалофильных микроорганизмов // Сб.: Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных экосистем Центральной Азии. Улан-Удэ. - 2003. - С. 70.

35. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. - 1975. - С. 10

36. Компанцева Е.И., Горленко. В.М. Фототрофные сообщества в некоторых термальных источниках озера Байкал // Микробиология. 1988. Т. 57. №5. С. 841-846.

37. Крайнов С.Р., Швец В.М. Основы геохимии подземных вод. М.: Недра, 1980.

38. Крайча Я. Газы в подземных водах. М.: "Недра", 1980.

39. Кузнецов С. И. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в озерах. М.: Изд-во АН СССР.- 1952,- 300с.

40. Куликов Г.В., Жевлаков А.В., Бондаренко С.С. Минеральныелечебные воды СССР: справочник.- М.: Недра, 1991. 399 с.

41. Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е. Мицелиальные грибы -продуценты внеклеточных протеаз // Сб.: Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных экосистем Центральной Азии. Улан-Удэ. - 2003. - С. 84-86.

42. Ленгелер Й., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология:1. KJ

43. Прокариоты: В 2-х томах. Пер. с англ. / под. ред. И. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005.- 695с.

44. Лобарева Л.С., Степанов В.М. // Успехи биологической химии. -1978.-Т. 19.-С. 83-102.

45. Логинова Л.Г. Физиологические особенности термофильных микрорганизмов // Успехи микробиологии. М.: Наука. 1971.-№7.-С. 108120.

46. Логинова Л.Г., Головачева Р.С., Егорова Л.А. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах. М.: Наука, 1966.- 265 с.

47. Логинова Л.Г., Егорова Л.А. Анаэробные термофильные бактерии. -М.: Наука, 1982.- 100 с.

48. Логинова Л.Г., Егорова Л.А. Новые формы термофильных бактерий. -М.: Наука, 1977.- 175 с.

49. Ломоносов И.С. Геохимия и формирование современных гидротерм Байкальскойрифтовой зоны. -Новосибирск.: Наука, 1974.

50. Методы общей бактериологии в 3-х т.: пер. с англ./ Под. ред. Ф.Герхардта и др. Т.З, М.: Мир, 1984.- 264 с.

51. Методы химии углеводов. Под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Мир. 1967.-С. 23-24.

52. Намсараев Б.Б., Качалкин В.И., Дулов Л.Е., Обжиров А.И. Бактериальное окисление СН4 в районах мелководных газогидротерм Западной окраины Тихого океана // Микробиология. 1995. - Т. 64. - С. 125-132.

53. Намсараев З.Б. Микробные сообщества щелочных гидротерм. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Москва. - 2003. - 23 с.

54. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бархутова Д.Д. Микробные сообщества щелочных гидротерм.- Новосибирск: Изд-во СО РАН.- 2006.

55. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бурюхаев С.П., Юрков В.В. Структура и биогеохимическая активность фототрофных сообществ щелочного Большереченского термального источника // Микробиология.- 2003.- Т.72.- С. 228-238.

56. Носова Л.М., Гельцер Ю.Т. Определение протеолитической активности дерново-подзолистой и дерновой почв методом фотобумажной автографии //В кн.: Микроорганизмы как компоненты биогеоценоза. М.: Наука, 1984. - С. 153-156.

57. Пиннекер Е.В., Писарский С.И., Ломоносов И.С. и др. Гидрогеология Прибайкалья. М.: Наука, 1980. - 168 с.

58. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Влияние факторов внешней среды на образование и свойства экзополисахаридов

59. Acinetobacter sp // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34.

60. Попова Н.А., Николаев Ю.А., Турова Т.П., Лысенко A.M., Осипов. Г.А., Верховцева Н.В., Паников Н.С. Geobacillus uralicus новый вид термофильных бактерий // Микробиология.- Т.71.- №3.- С. 391-398.

61. Практикум по микробиологии. Под ред. А.И. Нетрусова.- М.: Изд. центр «Академия»,- 2005.- 608 с.

62. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. 3-е изд. М.: Недра, 1970.

63. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. Л.: Наука, 1974.- 194 с.

64. Руденская Т.Н., Остерман А.Л., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из Trichoderma lignorum II Биохимия. 1980. - Т. 45. № 4. - С. 710-716.

65. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова.- М.: Изд-во МГУ.- 1985. 224 с.

66. Соломин Г.А., Крайнов С.Р. Щелочные составляющие природных и сточных щелочных вод, геохимические процессы их нейтрализации кислыми и околонейтральными подземными водами // Геохимия. 1998. №2. С.183-201.

67. Старынин Д.А., Горленко В.М., Иванов М.В., Карначук О.В., Намсараев Б.Б. Альгобактериальные маты бухты Кратерной // Биология моря.- 1989. N3. - С.70-77.

68. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Агропромиздат, 1987. - С.165-166.

69. Храпцова Г.И., Цаплина И.А., Серегина Л.М., Логинова Л.Г. Термофильные бактерии горячих источников Бурятии // Микробиология. 1984. Т.53. Вып.1. с. 137-141.

70. Цурикова Н. В., Нефедова Л. И., Костылева Е.В., Звенигородский В.И.,

71. Ясиновский В. Г., Воейкова Т.А., Синицин А.П. Получение активного штамма Bacillus licheniformis продуцента термостабильной а-амилазы // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Т. 38.- С. 502-508.

72. Юрков В.В., Горленко В.М., Митюшина JI.JL, Старынин Д.А. Влияние лимитирующих факторов на структуру фототрофных сообществ в Болынереченских термальных источниках // Микробиология. 1991. Т. 60. №6. С.129-138.

73. Adams М., Kelly R. Finding and using thermophilic enzymes // Treds Biotechnol, 1998.- V.16.- P. 329-332.

74. Adams, M. W. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100°C. Annu. Rev. Microbiol. 1994.- V.47.- P. 627-658.

75. Alexandrov, V. Y. Cells, molecules and temperature. Translated from the Russian by tsernstam. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 1977.

76. Alfredsson G.A., Kristjansson J.K. Ecology, distribution and isolation of Thermus / Thermus Species: Biothechnology Handbooks Series.- Plenum Press.- London.- P. 43-66.

77. Allen M.B. The thermophilic aerobic sporoforming bacteria. Bacteriol. Revs. 1953.-V.17.- P.125-173.

78. Awramik S.M.// Mikrobial mats: Stromatolites / Eds Cohen Y., Castenholz RW. Halvorson H.O. N.Y.: Alan R. Liss, 1984. 22 p.

79. Baross J.A., Hoffman S.E. Submarine hydrothermal vents and associated gradient environments as sites for the origin and evolution of life // Origins of life. 1985.-V. 15.-P. 327-345.

80. Belduz AO, Dulger S, Demirbag Z. Anoxybacillus gonensis sp. nov., a moderately thermophilic, xylose-utilizing, endospore-forming bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V.53. P. 1315-1320.

81. Brock T. D. The road to Yellowstone—and beyond. Annu. Rev. Microbiol. 1995.-V.49.-P.1-28.

82. Brock T.D. Life at high temperatures. Science. 1967a.- V.158.- P. 1012-1019.

83. Brock T.D. Micro-organisms adapted to high temperatures // Nature. 1967b.- V. 214.- P.882-885.

84. Brock T.D. Relationship between standing crop and primary productivity along a hot spring thermal gradient // Ecology. 1967c.- V. 48. P. 566-571.

85. Brock T.D. Thermophilic microorganisms and life at high temperatures. New York: Springer-Verlag, 1978.

86. Brock T.D., Brock M.L. The measurement of chlorofill, primary productivity, photophosphorylation, and macromolecules in benthic algal mats // Limnology and Oceanography. 1967.- V.12.- P.600-605.

87. Brock T.D., Brock M.L., Bott T.L., Edwards M.R. Microbial life at 90°C: the sulfur bacteria of Boulder spring// J. Bacterid. 1971.- V.107.- P.303-314.

88. Castenholz R.W. Composition of hot spring microbial mats: a summary // In Cohen, Castenholz and Halvorson (Eds), Microbial Mats: Stromatolites. 1984. Alan R. Liss, New York. P. 101 -119.

89. Castenholz R.W. Thermophilic blue-green algae and the thermal environment // Bacteriol. Rewiews. 1969.- V. 33.- P. 476-504.

90. Castenholz R.W., Pierson B.K. Ecology of thermophilic anoxygenic phototrophs // In Blankenship, Madigan, Bauer (eds): Anoxygenic photosynthetic bacteria. 1995. Kluvver Academic publishers. Netherlands. P.87-103.

91. Chen Ch. Meiothermus rosaceus sp. nov. isolated from Tengchong hot spring in Yunnan, China // FEMS Microb. Lett. 2002.- V.216.- P.263-268.

92. Chung A.P., Rainey F.A., Valente M., Nobre M.F., da Costa M.S. Thermus igniterrae sp. nov. and Thermus antranikianii sp. nov., two new species from Iceland// Int.J. Syst. Evol. Microbiol.- 2000.- V.50.- P. 209-217

93. Cross C.A. Function and regulation of the heat chock proteins / In. Neidhardt F.C., Cutriss R. (edsj. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology.- 2hd edn. Washington; DC: ASM press.- 1996.- P. 13821399.

94. DeBlois S., Weigel J. Cellulolytic vestiges of the xylanase activity in a new strictly xylanolytic thermophile Clostridium sp. // Biotechnol. Lett.- 1995-V. 17.- P. 89-94

95. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Biochem. 1970. V.12. P.133

96. Dominguez A., Sahroman A., Fucinos P. Quantification of intra- and extra-cellular thermophilic lipase/esterase production by Thermus sp. Biotecnol. Lett. 2004.- V. 26.- P. 705-708.

97. Dulger S, Demirbag Z, Belduz A.O. Anoxybacillus ayderensis sp. nov. and Anoxybacillus kestanbolensis sp. nov. I I Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V.54. P. 1499-1503.

98. Ferris M.J., Nold S.C., Revsbech N.P., Ward D.M. Population structure and physiological changes within a hot spring microbial mat community following disturbance//Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. p. 1367-1374.

99. Hartl F., Hlodan R., Langer T. Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations // Trends Biochem. Sci.- 1994.- V. 19.- P. 20-25.

100. Hawumba J., Theron J., Brpzel V. Thermophilic protease-producing Geobacillus from Buranga Hot Springs in Western Uganda // Current Micribiol. 2002.-V. 45.- P. 144-150.

101. Hecker M., Schumann W., Volker U. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilus // Mol. Microbiol.- 1996.- V. 19.- P. 417-428.

102. Heinen U.J., Heinen W. Characteristics and properties of a caldoactive bacterium producing extracellular enzymes and 2 related strains// Arch. Microbiol.- 1972.- V. 82.- P. 1-23

103. Heinen W., Lauwers, A.M., Mulders, J.W.M. Bacillus flavothermus, a newly isolated facultative thermophile.//Antonie van Leeuwenhoek.- 1982.-V.48.- P. 265

104. Hjorleifsdottir S., Skrinisdottir S., Hreggvidsson G.O., Hoist O., Kritjansson J.K. Species composition of cultivated and noncultivated bacteria from short filaments in an Icelandic hot spring at 88°C. // Microbial Ecology-2001.-V. 42.-P. 117-125

105. Huber H., Stetter K.O. Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology.// Journal of Biothechnology- 1998.- V. 64.- P.39-52

106. Jannash h.W., Wirsen C.O. Morphological survey of microbial mats near deep-sea thermal vents // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.41. P.528-538.

107. Jorgensen B.B., Nelson D.C. Bacterial zonation, photosynthesis and spectral light distribution in the hot spring microbial mats of Iceland // Microbial Ecology. 1988. - V. 16. - P. 133

108. Kevbrin V, Ronanek S., Wiegel J. Alkalithermophiles: a double challenge from extreme environments. Kluver Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 2004. P. 395-412.

109. Kevbrin V, Zengler K, Lysenko A, Wiegel J. Anoxybacillus kamchatkensis sp. nov., a novel thermophilic facultative aerobic bacterium with a broad pH optimum from the Geyser valley, Kamchatka // Extremophiles. 2005.- V. 9.- P. 391-398.

110. Konopka A. Accumulation and utilization of polysaccharide by hot-spring phototrophs during a light-dark transition // FEMS Microb. Ecol. 1992.-V. 102.- P.27-32.

111. Kristjansson J.K., Hreggvidson G.O., Grant W.D. Taxonomy of Extremophiles / Applied Microbial Systematics. Kluwer Academic Publishers.-The Netherlands.-2000.- P. 231-291.

112. Krienitz L., Ballot A., Kotut K., Wiegand C., Putz S., Metcalf J.S., Codd G.A., Pflugmacher S. Contribution of hot spring cyanobacteria to the mysterious deaths of Lesser Flamingos at Lake Bogoria, Kenya // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V.43. p.141

113. Kuhl M., Fenchel T. Artificial cyanobacterial mats: growth, structure, and vertical zonation patterns // Microbial Ecology . 2000. - V. 40. - P. 7584.

114. Kumar C.G., Takagi M.P., Jany K.D. Novel alkaline serine proteases from alkalophilic Bacillus spp. Purification and some properties.- Proc. Biochem., 1999.- V.34.-P.441-449.

115. Marmur J. A procedure for the isolation DNA from microorganisms // J. Molecular. Biol. 1961. V.3. P.208.

116. Moers M.E., barter S.R. Neutral monosaccharides from a hypersaline tropical environment: applications to the characterization of modern and ancient ecosystems // Geochimica et cosmochimica acta. 1993. - Vol. 57.

117. Nascimento W., Martins M. Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp. // Bras. J. Microbiol. 2004.- V.35.- P. 91-96.

118. Nisbet E.G. RNA, hydrothermal systems, zeolites and the origin of life // Episodes. 1986. V. 9. p. 83-89.

119. Nold S.C., Kopczynsky E.D., Ward D.M. Cultivation of aerobic chemoorganotrophic proteobacteria and gram-positive bacteria from a hot spring microbial mat // Appl. Envir. Microbiol. 1996. V.62. N.2. p. 3917-3921.

120. Nunes A., Martins M. Isolation, properties and kinetics of grouth of a thermophilic Bacillus // Bras. J. Microbiol. 2001,- V.32.- P. 271-275.

121. Onstott T.C. Phelps T.J., Colwell F.S. Observations pertaining to the origin and ecology of microorganisms recovered from deep subsurface Taylorsville Basin, Virginia // Geomicrobiol. J. 1998. V.15. P. 353-385.

122. Owen R.J., Hill L.R. Lapage S.P. Determination of DNA base composition from melting profiles in dilute buffers. Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503.

123. Pastor M., Lorda G., Balatti A. Protease obtention using Bacillus subtilus 3411 and amaranth seed meal medium at different aeration rates // Bras. J. Microbiol. 2001,- V.32.-P. 1-8.

124. Priest f. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus II Bacterid. Rev.- 1977.- V.41.- P. 711-753.

125. Rahman R., Rasak C., Ampom K. Purification and characterization of a heat-stable alkaline protease from Bacillus stearothermophilus F1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994.- V. 40.- p. 822-827.

126. Reysenbach A.L., Ehringer M., Hershberger K. Microbial diversity at 83°C in Calcite Springs, Yellowstone National Park: another environment where the Aquificales and "Korarchaeota" coexist.// Extremophiles. 2000.- V. 4.- P. 61-67.

127. Reysenbach A.L., Wickham G.S., Pace N.R. Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament community in Octopus Spring, Yellowstone National Park.// Appl. Environ. Microbiol. 1994.- V. 60.- P. 2113-2119.

128. Revsbech N.P., Ward D.M. Microelectrode studies of interstitial water chemistry and photosynthetic activity in a hot spring microbial mat // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48. №2. P. 270-275.

129. Rhee J. New thermophilic and thermostable esterase // Appl. Environ. Microbiol. 2005.- V. 71.- P. 817-825.

130. Richardson L.L., Castenholz R.W. Enhanced survival of the cyanobacterium Oscillatoria terebrifonnis in darkness under anaerobic conditions// Appl. Environ. Microbiol. V. 1987.-V.53.- P.2151-2158.

131. Rougeaux H., Guezennec M., Lydia Mao Che, Payri С., Deslandes E., Guezennec J. Microbial communities and exopolysaccharides from Polynesian mats // Marine Biotechnology.- 2001. Vol.3. - P. 181 - 187.

132. Sangar V.K., Dugan P.R. Polysaccharide produced by Anacystis nidulans: its ecological implication //Applied microbiology. . 1972. - Vol. 24. - Nov. - P. 732-734.

133. Santegoeds C.M., Nold S.C., Ward D.M. Denaturating gradient gel electrophoresis used to monitor the enrichment culture of aerobic chemoorganotrophic bacteria from a hot spring cyanobacterial mat // Appl. Envir. Microbiol. 1996.- V.62.- P. 3922-3928.

134. Singh J., Batra N., Sobti C. Serine alkaline proteases from a newly isolated Bacillus sp. //Proc. Biochem. 2001,- V.36.- P. 781-785.

135. Slonczewski J., Foster J. pH-regulated genes and survival at extreme pH. 1996.- Washington. DC. ASM press.- P. 1539-1549.

136. Sonnleitner В., Fiechter A. Advantages of using thermophiles in biotechnological processes: expectations and reality // Trends Biotechnol. 1983.-V. l.-P. 74-80.

137. Stal L.J., Reed R.H. Low R.H. Low-molecular mass carbohydrate accumulation in cyanobacteria from a marine microbial mat in response to salt // FEMS Microbiology letters. 1987. - Vol. 45. - № 3. - P. 305-312.

138. Stetter К. O. Hyperthermophiles in the history of life./ Evolution of hydrothermal ecosystems on Earth.- 1996a.- P. 1-10

139. Stetter К. O. Hyperthermophilic prokaryotes.// FEMS Microbiol. Rev.-1996b.-V. 18.- P. 149-158

140. Stetter K.O. Diversity of extremely thermophilic Archaebacteria / Thermophiles: general, molecular and applied. 1986.-P. 39-74. New York, Wiley.

141. Stetter K.O., Fiala G., Huber G., Huber R., Sereger A. Hyperthermophilic microorganisms. FEMS Microbiol. Rev.- 1990.-V. 75.- P. 117-124

142. Truper H.G., Schlegel H.G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae. I. Quantative measurements on growing cells of Chromatium okenii. //Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. And Serol. 1964. V.30. №3. P. 225

143. Van de Peer Y and De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput Appl Biosci. 1994.- V.10.- P.569.

144. Walter M.R., McLoughlin S., Drinnan A.N., Farmer J.D. Palaeontology of Devonian thermal spring deposits, Drummond Basin, Australia // Alcheringa. 1998.- V. 22.- P. 285-314.

145. Ward D.M., Beck E., Revsbech N.P., Sandbeck K.A., Winfrey M.R. Decomposition of hot spring microbial mats // In Microbial mats: Stromatolites. 1984.-P. 191-214.

146. Ward D.M., Ferris M.J., Nold S.C., Bateson M.M. A natural view of microbial biodiversity within hot spring cyanobacterial mat communities // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998,- V. 62,- P.1353-1370.

147. Ward O.P. Proteolytic enzymes. In. M. Moo-Young Editor. Comprehencive Biotechnol.1985.- V.3.- P. 789-818.

148. Wickstrom C.E., Castenholz R.W. Dynamics of cyanobacterial and ostracod interactions in an Oregon hot spring // Ecology. 1985.- V.66.- P. 10241041.

149. Wiegel J. Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles // Extremophiles. 1998.- V.2. P. 257-267.

150. Woese C. R. Bacterial evolution // Microbial Reviews.- 1987.- V.51, №2.-P. 221-271.

151. Yamamoto H., Hiraishi A., Kato K., Chiura H.X., Maki Y., Shimizu A. Phylogenetic evidence for the existence of novel thermophilic bacteria in hot-spring sulfur-turf microbial mats in Japan // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. p.1680-1687.

152. Yura Т., Nagai H., Mort H. Regulation of the heat-shock response in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1994.-V.47. P.321-350.

153. Zeikus J., Vielle C., Savchenko A. Thermozymes: Biotechnology and structure-function relationship // Extremophiles.- 1998.- V.I.- P. 2-13.

154. Zeng Y.B., Ward D.M., Brassell S.C., Eglinton G. Biogeochemistry of hot spring environments. Lipid composition of Yellowstone (Wyoming, USA) cyanobacterial and Chloroflexus mats // Chemical Geology. 1992. - V. 95. -P. 327-345.

155. Zillig W., Holz D., Klenk G. The archaebacterium Thermococcus celer represents a novel genus within the thermophilic branch of the Archaebacteria // Systematic and Applied Microbiology.- 1983.- V.4 P. 88-94.

156. Zuber H. Thermophilic bacterium. Chem. Unserer. Zeit. 1979.- V. 13.-P. 165-175.