Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие анаэробных термофильных микроорганизмов морских гидротермальных полей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие анаэробных термофильных микроорганизмов морских гидротермальных полей"

Российская Академия Наук Институт Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

На ирамах рукописи

} МИРОШНИЧЕНКО Маргарита Леонтьевна

БИОРАЗНООБРАЗИЕ АНАЭРОБНЫХ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МОРСКИХ ГИДРОТЕРМАЛЬНЫХ ПОЛЕЙ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ

бесплатный ЯКЗЕМПЛЯР _

МОСКВА-2005

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Л.В. Калакуцкий Доктор биологических наук, профессор В.В. Михайлов

Доктор биологических наук A.B. Гебрук

Ведущая организация - кафедра микробиологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " " 2005 г. в 14 ч.

на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 по защите диссертаций при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312 Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Диссертация разослана " " 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Никитин

2оо9-Ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Присутствие и необычайное феноттшческое разнообразие термофильных прокариот в природных вулканических местообитаниях было отмечено еще в 1955 г. С.И. Кузнецовым при исследовании горячих источников Камчатки (Кузнецов, 1955). Однако интенсивное исследование термофильных микробных сообществ было инициировано работами Т. Брока (Brock, 1978), впервые исследовавшего микрофлору горячих источников Йеллоустоунского Национального Парка (США). Устойчивый интерес к термофильным прокариотам определяется причинами, связанными как с фундаментальной, так и с прикладной наукой. Современные термофильные микробные сообщества гидротермальных систем считаются аналогами древнейших биоценозов Земли (Stetter, 1996; Reysenbach, 2002); эта гипотеза базируется как на филогенетических данных (термофильные и гипертермофильные микроорганизмы представляют собой наиболее глубокие филогенетические ветви универсального дерева жизни (Woese, 1998)), так и на данных палеобиологии и геохимии, свидетельствующих о древности гидротермальных систем (Богданов, 2001; Reysenbach, 2001, 2002). Не меньший интерес для фундаментальной пауки, в частности, химии биополимеров, представляют ферменты и нуклеиновые кислоты термофильных прокариот, а также механизмы, обуславливающие их термостабильность. С этим связан и прикладной аспект исследования биоразнообразия термофилов: термостабильные ферменты находят применение в различных областях биотехнологии - от индустриального производства гидролитических ферментов для детергентов до использования термостабильных ферментов обмена нуклеиновых кислот в генетических и молекулярно-биологических исследованиях (Kristjansson et al., 1989; Sunna et al., 1997; Vieille, Zeikus, 2001 и др.).

Естественными местообитаниями термофильных микробных сообществ в современной биосфере являются гидротермальные (континентальные и подводные) системы вулканического происхождения, а также глубинные подземные горизонты, где высокая температура постоянно поддерживается за счет геотермальной энергии Земли. К настоящему времени наиболее изученными следует считать термофильные микробные сообщества наземных гидротерм, что объясняется их наибольшей доступностью для исследователей. Оттуда выделено и охарактеризовано большое число новых фото-, лито-и органотрофных термофильных прокариот, исследовано их участие в биогеохимических циклах элементов, метаболизм и возможности применения в биотехнологии (см. напр.,

2

ч

Brock, 1978; Заварзин с соавт., 1989, и др.). Подземные биотопы, практически недоступные, изучены в основном на примере высокотемпературных нефтяных месторождений (ZoBell, 1947; Кузнецов с соавт., 1962; Назина, Розанова, 1974 и др.). Среди местообитаний термофильных прокариот морские гидротермы занимают особое место благодаря уникальности их физико-химических характеристик (резкие градиенты основных физико-химических параметров, гидростатическое давление и др.). Интенсивное исследование микробных сообществ морских гидротерм началось после сенсационного открытия глубоководных гидротермальных источников (Lonsdale, 1977; Corliss, Ballard, 1977) и связанных с ними биоценозов, энергетической основой которых являются хемолитоавтотрофные микроорганизмы (Jannasch, 1983, 1985; Karl, 1995). Усилия микробиологов ведущих лабораторий мира привели к выделению ряда эндемичных таксонов термофильных архей и бактерий (Stetter et al., 1988,1990; Segerer et al., 1986, 1991; Huber et aL, 1995, 1997; Antoine et al., 1997; L'Haridon et al., 1998) При этом, однако, исследования микробных сообществ глубоководных морских гидротерм молекулярно-биологическими методами указывали на то, что представления о биоразнообразии обитающих в них термофильных прокариот далеки от полноты и многие ведущие таксоны остаются неизученными.

Таким образом, морские гидротермы следует рассматривать как важный ресурс новых термофильных прокариот. Исследованию их филогенетического и метаболического разнообразия посвящена настоящая работа.

Состояние проблемы

Морские гидротермальные системы представлены глубоководными (находящимися на глубине от 500 до 5000 м) и мелководными (расположенными в шельфовой зоне) гидротермами. Несмотря на то, что как глубоководные, так и мелководные гидротермы являются проявлениями единого вулканического процесса на дне океана, они имеют ряд отличительных особенностей. Глубоководные щяротермы расположены преимущественно в районах океанических рифтов открытого океана в зонах срединно-океанического и задугового спрединга. Геология и геохимия этих структур изучена и описана во многих обзорах и монографиях (Монин и др., 1985; Лисицын и др., 1989,1990; Богданов, 1997 и др). Для микробиологических исследований уникальность глубоководного гидротермального биотопа определяют:

(1) отсутствие солнечного света и, соответственно, фотосинтеза на глубинах, характерных для глубоководных гидротерм (500-5500 м);

(2) состав и физико-химические особенности гидротермального флюида (температура около 350°С, низкий рН, высокие концентрации тяжелых металлов и растворенных газов: метана, сероводорода, углекислоты, водорода);

(3) резкие температурные и окислительно-восстановительные градиенты в коротком пространственном и/или временном диапазоне, которые создаются за счет перемешивания перегретого и восстановленного флюида с холодной оксигенированной океанической водой и способствуют формированию разнообразных микрониш для микроорганизмов (Van Dover, 2000; Prieur, 2002).

Мелководные морские гидротермы представляют собой выходы вулканических растворов с температурой от 10 до 98°С на глубине до 200 м преимущественно в местах разломов в фундаментах вулканической постройки на дне бухт и заливов (Тарасов, 1999). Гидротермальный флюид мелководных гидротерм отличается от глубоководного, поскольку образуется не только из океанической, но и из метеорной воды, несущей органическое вещество и другие биогенные элементы. Постоянный приток органического вещества в зоны мелководной гидротермальной активности идет также в результате терригенного стока и из поверхностных зон морской воды, где идут интенсивные процессы фотосинтеза. Поступление органического вещества в зоны мелководной гидротермальной активности происходит в результате седиментации и вертикальной конвективной диффузии, создаваемой высокотемпературными источниками.

Таким образом, сильное влияние терригенных факторов вместе с доступностью солнечной энергии являются основными отличиями мелководных гидротермальных систем от глубоководных.

В микробной популяции глубоководных гидротерм можно условно выделить три группы микроорганизмов (Karl, 1995)' (1) мезофильные и умеренно-термофильные эндо -и экзосимбионты, связанные с гидротермальной фауной; (2) мезофильные нссимбиотические микроорганизмы; (3) свободноживущие термофильные прокариоты.

Эндосимбионты гидротермальных беспозвоночных животных - хемолитотрофные тиоавтотрофы и метанотрофы, пока не поддаются лабораторному культивированию и были изучены непрямыми методами (Cavanaugh et al., 1981, 1987; Гальченко и др., 1988, 1992 и др.). Эписимбионтные бактерии в наибольшей степени были исследованы для полихеты Alvinella pompejana и креветки Rimicaris exoculata, эндемиков глубоководных гидротерм (Haddat et al., 1995, Van Dover et al., 1988, Gebruk et al., 1993 и др.).

Свободноживущих мезофильных микроорганизмов из морских гидротерм было описано немного, несмотря на то, что зоны, находящиеся в температурном диапазоне 15-

45°С (зоны диффузного высачивания), являются пространственно гораздо более масштабными, чем местообитания истинных термофилов. Скорее всего, это связано с субъективной причиной - большему вниманию, уделявшемуся термофильным и гипертермофильным микроорганизмам.

Свободноживущие термофильные прокариоты составляют к настоящему времени наиболее исследованную и необычайно филогенетически и метаболически разнообразную группу микроорганизмов, обитающих в морских гидротермах Последнее объясняется не только множественностью источников энергии, характерной для гидротермальных биотопов, но и разнообразием физико-химических условий, создаваемым сильнейшими градиентами температуры, pH и редокс-потенциала в зонах разгрузки гидротермального флюида.

Основным донором электронов в анаэробных условиях, которые характерны для высокотемпературных зон гидротермальной активности, является водород, содержащийся в гидротермальном флюиде. Акцепторами электронов при окислении водорода служат сера, нитрат, сульфат, или ССЬ. К микроорганизмам, осуществляющим анаэробпое окисление водорода, относятся гипертермофильные археи пор. Methanococcales, Methanopyrales, Archaeoglobales (Zhao et al., 1988; Kurr et al., 1991; Stetter et al., 1988), бактерии p. Desulfurobacterium (L'Haridon et al., 1998), a также большинство представителей Epsilonproteobacteria (Miroshnichenko et al., 2001; Alain et al., 2002; Takai et al. и др.) Микроаэрофильное окисление водорода было описано для представителей p. Persephonella - эндемика глубоководных гидротерм (Götz et al., 2002).

В мезофильных условиях преобладают аэробные процессы. Донором электронов для процессов аэробного окисления являются, прежде всего, сероводород, растворенный в гидротермальном флюиде, а также элементная сера и ее восстановленные соединения. Помимо эндосимбиотических хемолитогрофов, окисление серных соединений в глубоководных гидротермах осуществляют: (1) литоавтотрофные нитчатые бактерии pp. Beggiatoa и Thiothrix, нередко образующие мощные бактериальные маты (Jannasch et al., 1989; Nelson, 1989); (2) многочисленные факультативно хемолитотрофные и гетеротрофные бактерии pp. Thiobacillus, Thiothrix и др. (Ruby et al, 1981; Durand et al., 1994); (3) облигатно хемолитотрофные бактерии Thiobacillus hydrothermatis (Durand et al., 1993) и Thiomicrospira crunogena (Jannasch et al„ 1985).

Вклад анаэробных микроорганизмов в первичную продукцию органического вещества значительно ниже, чем аэробных литоавтотрофов, поскольку концентрация водорода в гидротермальном флюиде, как правило, на порядок ниже, чем концентрация

сульфида (Jannasch, 1995; Van Dover, 2000), а зоны гидротермальной активности с доступными для микроорганизмов кислородом и сульфидом многократно превосходят по площади анаэробные. Термодинамические расчеты показали, что энергетический вклад всех прочих, помимо окисления сульфида, микробиологических процессов составляет не более 4% (McColm & Shock, 1997)

Некоторые из термофильных гидротермальных микроорганизмов способны к органотрофному росту, как правило, анаэробному, за счет сбраживания органических субстратов или их окисления в процессе анаэробного дыхания. Так, органотрофный метаболизм характерен для большинства анаэробных гипертермофильных архей, выделенных из глубоководных гидротерм. Основными субстратами для этих микроорганизмов являются пептиды, образующиеся, вероятно, при разложении биогенных остатков. Экстремально термофильные бактерии с бродильным типом обмена (pp. Thermosipho, Thermotoga, Marinitoga) характеризуются более низкими по сравнению с археями температурами роста; предпочтительными для них субстратами являются сахара и полисахариды.

К началу нашей работы в 1988 г. сведения о микробном разнообразии и экологической роли термофильных микроорганизмов морских гидротермальных полей были весьма ограничены. В результате совместных американо-германских экспедиций из глубоководных и мелководных гидротерм были выделены первые экстремально-термофильные микроорганизмы, в основном относящихся к царству архей (Fiala & Stetter, 1986; Stetter et aL, 1988,1990; Segerer et al, 1986,1991; Huber et al., 1995,1997). Почти все они являлись анаэробами с бродильным типом обмена. Список термофильных бактерий из морских гидротерм к этому времени исчерпывался лишь одним представителем р. Thermotoga, также характеризующимся бродильным метаболизмом (Antoine et al., 1997). В целом, количество микроорганизмов, выделенных из морских гидротерм в чистые культуры, было невелико, а сведения об их экологической роли фрагментарны. Многие физиологические группы термофильных прокариот не были представлены; сведения о функциональном разнообразии термофилов в морских гидротермах были ограниченными. Несмотря на то, что были исследованы микробиологические процессы циклов углерода и серы в мезофильных зонах, окружающих глубоководные морские гидротермы (Пименов с соавт., 2000; Лейн, Пименов, 2002; Гальченко, 2002), отсутствовала информация об этих же процессах в умеренно- и высокотемпературных зонах мелководных и глубоководных гидротермальных полей. Все это затрудняло понимание взаимосвязей в микробных сообществах морских гидротермальных полей.

Молекулярно-биологические методы, основанные на детекции специфичных генов 16S рРНК и широко применяемые в последнее время для изучения микробных сообществ морских гидротерм, не только подтвердили результаты культуральных методов, но и продемонстрировали в морских гидротермах существование значительно большего филогенетического разнообразия микроорганизмов (Jeanthon, 2000; Reysenbach et al., 2000; Sievert et al., 2000). С помощью этих подходов были найдены новые архейные филотипы, относящиеся к неизвестным таксонам, пока не поддающимся культивированию, определены количественные соотношения представителей разных филогенетических групп (Nercessian et al., 2003; Согге et al., 2001; Takai et al., 2001), изучено распределение микроорганизмов в различных температурных зонах гидротермальных полей и активных сульфидных построек (Takai et al., 2004; Schrenk et al., 2003).

Большой интерес вызывали данные, полученные при исследовании библиотек клонов генов 16S рРНК, полученных из нативной ДНК, выделенной непосредственно из гидротермальных образцов. В 1985 году появились первые сообщения (Moyer et al., 1995) о присутствии в микробных сообществах глубоководных гидротерм Epsilonproteobacteria - группы, большая часть представителей которой к тому времени были известны как энтеропатогенные микроорганизмы человека и/или животных. В многочисленных последующих работах, где использовались аналогичные подходы к исследованию структуры микробных сообществ, было показано, что Epsilonproteobacteria не только присутствуют, но и являются доминирующей по численности и разнообразию группой микроорганизмов во всех изученных глубоководных гидротермальных сообществах Восточно-Тихоокеанского Поднятия (ВТП), Средянно-Атлантического (САХ) и Центрального Индийского Хребтов (Harmsen et al., 1997, Reysenbach et al., 2000, Hoek et al, 2003). Epsilonproteobacteria были обнаружены в гидротермальных и негидротермальных осадках, микробных матах гидротермальных полей, гидротермальном плюме, на поверхностях беспозвоночных гидротермальных животных, а также в "in situ growth chamber" - современном аналоге стекол обрастания. (Li et al., 1999; Teske et al., 2002; Сагу et al., 1997; Reysenbach et al, 2000)). Филотипы этой группы микроорганизмов составляли от 40 до 98 % последовательностей в библиотеках клонов генов 16S рРНК, полученных для исследованных образцов (Polz & Cavanaugh, 1995; Согге et al., 2001). Высокая численность Epsilonproteobacteria в глубоководных гидротермах была продемонстрирована также и прямыми методами, основанными на молекулярно-биологических подходах - с помощью градиентного денатурирующего гель-

электрофореза, количественной ПЦР, РНК-РНК гибридизации (Reysenbach et al., 2000; Longenecker & Reysenbach, 2001; Takai et al., 2001).

Филогенетический анализ показал, что некоторые филотипы гидротермальных Epsilonproteobacteria имели высокое сходство со свободноживущими представителями группы Campylobacter-Sulfospirillum (Campbell et al., 2001). При этом подавляющее большинство некультивируемых Epsilonproteobacteria не имело филогенетических родственников среди описанных к тому времени микроорганизмов. В 2001 году многочисленные клоны Epsilonproteobacteria были классифицированы и объединены в 6 филогенетических подгрупп, А, В, С, D, Е, F (Corre et al., 2000). Однако все попытки культивировать Epsilonproteobacteria из глубоководных гидротерм оставались безуспешными, и долгое время исследование этих микроорганизмов проводилось с использованием лишь некультуральных методов исследования (электронная микроскопия, DGGE, FISH).

До недавнего времени представители подкласса Epsilonproteobacteria были известны главным образом как патогенные для эукариотных организмов бактерии, обитающие в желудочно-кишечной или урогенитальной системах человека и животных и вызывающие серьезные заболевания (pp. Campylobacter, Helicobacter, Wolinella, Arcobacter). Эта весьма гетерогенная группа микроорганизмов включала б родов и около 50 видов грамотрицательных микроаэрофильных и/или анаэробных хемоорганогетеротрофных или хемолитотрофных бактерий. Использование современных молекулярно-биологических подходов значительно расширило представления о распространенности Epsilonproteobacteria. С помощью олигонуклеотидных зондов они были детектированы в пробах подземных отложений, нефтяных месторождений, очистных сооружений (Gevertz et al., 2000, Li et al., 1999; Watanabe et al., 2000; Snaidr et al., 1997). Все известные к началу нашей работы свободноживущие Epsilonproteobacteria, не связанные с гидротермальными местообитаниями, участвовали в цикле серы, либо восстанавливая серу, либо окисляя сульфид. Другой распространенной характеристикой негидротермальных Epsilonproteobacteria являлась их способность, помимо серного дыхания, использовать другие акцепторы электронов - кислород (в микроаэрофильных условиях), тиосульфат, нитрат, Ar+5, Se^, Mn+4, Fe+3 (Oremland, 1994; Laverman, 1995, Finster et al., 1997; Stolz et al., 1999; Alain, 2002). Эти свойства в определенной степени можно было попытаться экстраполировать на Epsilonproteobacteria, обитающих в глубоководных гидротермах. Однако точную информацию о физиологии и экологической роли глубоководных

Epsilonproteobacteria могло дать только получение и исследование чистых культур этих организмов.

Цели и задачи работы

Основной целью нашей работы было изучение разнообразия термофильных микробных сообществ мелководных и глубоководных морских гидротерм. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать распространение и численность представителей основных физиологических групп термофильных прокариот в мелководных и глубоководных морских гидротермах.

2. Выделить доминирующие микроорганизмы, уделяя особое внимание представителям новых для морских гидротерм физиологических групп.

3. Охарактеризовать фепотипические особенности и филогенетическое положение новых изолятов.

4. Исследовать явление барофилии у термофильных бактерий, выделенных из глубоководных гидротерм.

5. Провести сравнительный анализ результатов исследования микробного разнообразия морских гидротермальных полей, полученных с помощью культуральных, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов.

6. На основании полученных данных о функциональном разнообразии термофильных прокариот определить их место и роль в микробных системах морских гидротермальных полей.

Научная новизна и значимость работы

Впервые выделены в чистую культуру и охарактеризованы термофильные представители класса Epsilonproteobacteria, являющиеся доминирующим компонентом микробных сообществ глубоководных гидротерм и потенциальными продуцентами органического вещества в этой системе. Описан новый порядок Nautiliales класса Epsilonproteobacteria, включающий литоавтотрофных водород-использующих умеренно-термофильных бактерий. Описан новый род Nautilia и новый вид Caminibacter profundus

Выделен и охарактеризован термофильный род и вид Caldithrix abyssi, обитающий в глубоководных гидротермах. Caldithrix abyssi представляет собой новую филогенетическую ветвь домена Bacteria и отличается способностью как к органотрофному росту, так и к литотрофии с молекулярным водородом.

Выделен и описан новый род Hippea maritima, включающий умеренно-термофильных литотрофных сероредуцируюгцих бактерий из мелководных гидротерм и образующий вместе с р. Desulfitrella филогенетическую ветвь уровня подкласса.

Из глубоководных гидротерм выделены и описаны новые роды сем. Thermaceae (рр. Oceanithermus и Vulcanithermus), являющиеся первыми микроаэрофилами и водород-использующими литотрофами в этом семействе.

Выделены и охарактеризованы умеренно-термофильные бактерии, относящиеся к новому виду Deferribacter abyssi и осуществляющие диссимиляционную железоредукцию в глубоководных гидротермах.

Из глубоководных гидротерм выделена первая термофильно-барофильная бактерия, Marinitoga piezophila; изучено влияние гидростатического давления на рост и морфологию этой бактерии.

Из морских гидротерм выделены и охарактеризованы три новых вида анаэробных термофильных архей р. Thermococcus. Thermococcus stetteri, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus pacificus Исследована зависимость метаболизма экстремально-термофильных архей р. Thermococcus от присутствия элементной серы и водорода.

Разработан экспресс-метод таксономической идентификации представителей сем. Thermococcales, основанный на иммунохимическом определении антигенных детерминант клеточных стенок. Впервые исследована устойчивость термофильных архей к гамма-радиации.

С помощью радиоизотопных методов определены основные метаболические группы микроорганизмов, участвующих в круговороте углерода и серы в мелководных гидротермах юго-западной и западной части Тихого Океана и глубоководных гидротермах ВТП, а также получены данные о существования в этих биотопах новых групп термофильных прокариот.

Практическая значимость работы

Описаны и узаконены новый порядок, новое семейство, б новых родов, 10 новых видов термофильных и гипертермофильных бактерий и архей, обитающих в морских гидротермах. Создана коллекция новых термофильных микроорганизмов, которая может быть использована для целей биотехнологии, включающая, в частности, гипертермофильных архей, развивающихся при температурах 80-100°С и являющихся потенциальными продуцентами термостабильных ферментов различных классов -

гидролаз, ферментов обмена нуклеиновых кислот и др. Разработан метод экспресс-идентификации архей пор. Thermococcales.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных конференциях:

1. International Conference "Thermophiles-96" (Афины, США, 1996)

2. International Conference "Thermophiles -98" (Брест, Франция, 1998)

3. International Congress "Extremophiles-99" (Гамбург, Германия, 1999)

4. International Conference "Thermophiles-2000" (Нью Дели, Индия, 2000)

5. International Conference "Biology of deep-sea hydrothermal vents" (Брест, Франция, 2001)

6. International Congress "Extremophiles-02" (Неаполь, Италия, 2002)

7. FEMS Congress of European microbiologists (Любляна, Словения, 2003)

8. International Conference "Thermophiles-03" (Экзетер, Англия, 2003)

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 44 печатных работах' 27 экспериментальных статьях, 2 обзорах, 14 тезисах и 1 совместной монографии.

Место проведения работы

Основная часть работы проводилась в Институте Микробиологии РАН им С. Н. Виноградского: с 1988 по 1996 г. в лаборатории микробных сообществ под руководством члена-корреспондента РАН профессора Г.А. Заварзина, а с 1996 г. в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ под руководством д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской. Работа по выделению ряда микроорганизмов из глубоководных гидротерм, а также по исследованию барофильных микроорганизмов была выполнена в лаборатории морской микробиологии Европейского Института Моря (Брест, Франция), руководимой проф. Д. Прийером. Филогенетические и хемотаксономические исследования проводились в Немецкой Коллекции Микроорганизмов (DSMZ, Брауншвейг, Германия) в сотрудничестве с проф. Э. Штакебрандгом, Ф. Рейни, Б. Тиндалем и С. Спринтом. Электронно-микроскопические исследования проводились в ИНМИ РАН совместно с H.A. Кострикиной или в Институте биофизики РАН совместно с Г.М. Гонгадзе. В отдельных этапах работы принимали участие Б.Б. Намсараев (Институт биологии СО РАН, Улан-Уде), Н.В. Пименов (ИНМИ РАН), И.И. Русанов (ИНМИ РАН),

H.A. Черных (ИНМИ РАН), Т.П. Турова (ИНМИ РАН), A.C. Костюкова (Институт белка РАН), К. Жантон и С. Л'Аридон (Институт Моря, Брест, Франция). Полевые исследования выполнялись в 18-м рейсе НИС РАН «Академик Несмеянов» под руководством д.б.н. В.Г. Тарасова совместно с ИО РАН и ДВНЦ. Автор выражает глубокую признательность всем упомянутым участникам работы, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ за дружескую поддержку и участие в этой работе. Особенную благодарность автор приносит Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе на всех ее этапах и Г.А. Заварзину за ценные критические замечания и большую помощь в интерпретации и изложении материалов диссертации.

Основные защищаемые положения

1. Органотрофные гипертермофильные археи р. Thermococcus являются постоянным компонентом высокотемпературных микробных сообществ морских гидротерм, выполняя функцию первичных деструкторов органического вещества.

2. Наряду с гипертермофильными археями в морских гидротермах присутствуют умеренно-термофильные бактерии, представляющие новые филогенетические ветви.

3. Выделение новых термофильных прокариот позволяет дать фенотипическую характеристику и определить экологическую роль представителей новых таксонов, ранее многократно детектированных молекулярными методами.

4. Многие умеренно-термофильные бактерии из морских гидротерм являются водород-использующими литотрофами, осуществляющими анаэробное дыхание с восстановлением серы, нитрата или железа, или микроаэрофильный рост. Часть из них способны к автотрофному росту, и могут осуществлять первичную продукцию органического вещества в гидротермах.

5. В морских гидротермах присутствуют бактерии, способные к анаэробному окислению ацетата и завершению, тем самым, процесса минерализации органического вещества в гидротермах.

6. В глубоководных морских гидротермах обитают термофильные бактерии, рост и морфология которых зависят от гидростатического давления.

7. Применение радиоизотопных методов позволяет детектировать новые физиологические группы термофильных прокариот, расширяя, тем самым, представление об их разнообразии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В основу работы положены результаты исследований разнообразия термофильных микробных сообществ морских гидротерм, проводимых автором с 1988 года (мелководные гидротермы) и с 1999 года (глубоководные гидротермы).

Образцы для исследования мелководных гидротерм юго-западной части Тихого Океана и бухты Кратерная были получены при участии автора в рейсе НИС «Академик Несмеянов» в 1990 году (Табл. 1).

Образцы из глубоководных гидротерм были получены от сотрудника лаборатории морской микробиологии Н.В. Пименова, участвовавшего в 41 рейсе НИС «Академик Келдыш» в 1998 году и предоставившего пробы, отобранные им на гидротермальном поле Логачев САХ, а также от сотрудников лаборатории гипертермофильных микробных сообществ, работавших в рейсе AMISTAD в 1999 году в гидротермальном районе ВТП и от французских коллег, участвовавших в рейсе IRIS в 2001 году в гидротермальные районы Рейнбоу и Менез Гвен САХ (Табл. 2).

Таблица 1. Исследованные районы мелководной гидротермальной

активности

Географические районы Объекты

Курильские острова (о-в Янкича) Бухта Кратерная

Остров Новая Британия (Папуа Новая Гвинея) Бухта Матупи

Новая Зеландия Остров Уэйл

Остров Уайт

Залив Пленти

Таблица 2. Исследованные районы глубоководной гидротермальной активности

Географические районы Координаты Глубина, м

Менез Гвен (САХ) 37° 5Г с.ш., 31е 31' з.д. 840-865

Рейнбоу (САХ) 36° 13' с.ш., 33° 54' з.д. 2260-2350

Поле Логачева (САХ) 14° 45' с.ш., 44° 58' з.д. 2930-3050

ВТП 12° 48' с.ш, 103° 56' з.д. 2600

Для определения численности и выделения чистых культур анаэробных морских микроорганизмов использовали минеральный фон бикарбонатной среды Пфеннига (Pfennig, 1965) с добавлением в нее 25-30 г/л морской соли или NaCl для создания ионной силы, соответствующей морской воде, или среду MG (Balch, 1979) с микроэлементами (Balch, 1979) и витаминами (Wolin et al., 1963). Среды готовились в соответствии с анаэробной методикой (Hungate, 1966; Жилина и Заварзин, 1978). В некоторых случаях использовались среды, приготовленные без добавления восстановителя. Чистые культуры выделяли методом предельных разведений на жидкой или твердой среде. При работе с умеренно-термофильными микроорганизмами в качестве твердой среды использовали 2.5-3 % агар, при выделении гипертермофильных микроорганизмов - 0.8-1.2 % джельрайт (Gelrite, Sigma). Численность анаэробных микроорганизмов определялась методом серийных разведений.

Примененные в работе электронно-микроскопические, аналитические, биохимические и молекулярно-биологические методы описаны в соответствующих публикациях. Интенсивность основных микробиологических процессов оценивали по скоростям сероредукции, сульфатредукции и метаногенеза, которые определяли радиоизотопными методами (Беляев, Иванов, 1975; Лауринавичус, Беляев, 1978; Бонч-Осмоловская с соавт., 1993).

Результаты

Часть 1. Мелководные гидротермы

В 1990 году в составе экспедиции 18-го рейса НИС «Академик Несмеянов» нами были проведены исследования структуры термофильных микробных сообществ мелководных гидротерм юго-западной части Тихого Океана (Новая Зеландия, Новая Гвинея), а также бухты Кратерная (Курильские острова). Была определена численность микроорганизмов, использующих различные субстраты, выделены и охарактеризованы отдельные представители микробных сообществ, использованы радиоизотопные методы определения скорости процессов сульфат- и сероредукции и метаногенеза.

Пробы для исследования (Табл. 3) отбирались на глубине от 0.1 до 42 м, в местах активной гидротермальной деятельности, о чем свидетельствовала повышенная температура.

1.1, Численность анаэробных термофильных прокариот в мелководных гидротермах Тихого Океана

Численность термофильных прокариот в образцах из мелководных гидротерм, способных к анаэробному росту при 55 - 90°С, на средах с различными источниками энергии, оказалась очень высокой. В большинстве исследованных проб присутствовали органотрофные микроорганизмы, субстратом для которых являлся пептон. Присутствовавшая в среде элементная сера при росте этих микроорганизмов восстанавливалась в сероводород. В высокотемпературных пробах (87 и 90°С) численность сероредуцирующих органоторофов достигала 106 клеток/мл осадков. Клетки этих экстремально-термофильных микроорганизмов представляли собой кокки неправильной формы. Роста литотрофных гипертермофилов, использующих молекулярный водород, получить не удалось.

При более низких температурах культивирования (55 и 75°С) в накопительных культурах, использующих пептон и глюкозу, независимо от присутствия серы преобладали клетки палочковидной формы, нередко с чехлами, типичными для бактерий сем. Thermutoga¡es. При температуре культивирования 55°С спектр субстратов, используемых анаэробными термофилами в присутствии элементной серы, значительно расширялся: рост микроорганизмов был отмечен на несбраживаемых субстратах, органических кислотах и спиртах. Особенно высокая численность микроорганизмов (105

клеток/мл осадков) при росте с ацетатом или водородом с элементной серой была отмечена в накопительных культурах из бухты Матупи, инкубированных при 55°С. Клетки этих микроорганизмов представляли собой короткие подвижные палочки. В дальнейшем они были выделены в чистые культуры и охарактеризованы.

Таблица 3. Характеристики точек отбора проб из районов мелководной гидротермальной активности

Станция Точка Глубина Тип осадка Т,"С pH

Новая Зеландия, залив Пленти, вулканическая воронка П-4 40 Серый ил 81 5.5

Новая Зеландия, о-в Уэйл, литораль, источник Wh-2 0.1 Песок 85 6.5

Папуа Новая Гвинея, бухта Матупи, литораль М-2 0.1 Песок 55 6.5

подводный источник М-12 27 Бурые обрастания 70 6.3

М-6 15 Песок 81 4

М-10 25 Бурый ил 75 6.5

Курильские о-ва, бухта Кратерная прибрежный котел К-4 0.2 Серый ил 90 6.5

литораль К-1 0.1 Песок 55 6.5

1.2. Литотрофные термофильные прокариоты из мелководных гидротерм

Три штамма анаэробных термофильных сероредуцирующих бактерий, выделенных из мелководных гидротерм Тихого Океана, оказались представителями нового рода Hippea gen. nov.

Hippea maritima gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al, 1990) Короткие подвижные палочки с одним полярным жгутиком (Рис. 1). Клеточная стенка грамотрицательная. Умеренный термофил, растущий при температурах 40-65°С (оптимум 52-54°С). Нейтрофил или умеренный ацидофил, растущий при pH 5.4-6.5 (оптимум 6 0).

Для роста требуется 2.5-3.0% NaC!. Облигатный анаэроб. Окисляет ацетат и насыщенные жирные кислоты в процессе сероредукции Способен к литогетеротрофному росту с молекулярным водородом как источником энергии, серой как акцептором электронов и СО2 как источником углерода. Некоторые штаммы способны к окислению этанола в присутствие серы. Продуктами окисления перечисленных субстратов являются H2S и СОг. Для роста необходимо 200 мг/л дрожжевого экстракта. Содержание Г+С оснований в геномной ДНК 40 мол %. Типовой штамм МНгТ (DSM 10411т) бьи выделен из мелководного гидротермального источника литоральной зоны бухты Матупи (Папуа Новая Гвинея). Обитает также в мелководных гидротермах Залива Пленти (Новая Зеландия).

I < 'л (-<

гЩ'';

Рис. 1 Препараты целых клеток Hippea maritima, окрашенных ФВК. Маркер 0.5 мкм.

Ближайшим филогенетическим родственником Hippea оказалась Desulfitrella acettvorans (уровень сходства 16S рДНК 87 %) - бактерия, населяющая континентальные термальные местообитания, также богатые органическим веществом и серой (Bonch-Osmolovskaya et al., 1990). H maritima имеет с представителями р. Desulfurella ряд сходных фенотипических характеристик, однако является облигатно морским организмом и, в отличие от своих континентальных аналогов, не способна к литоавтотрофному росту. Вместе с представителями рода Desulfurella, род Hippea представляет новую филогенетическую ветвь уровня подкласса в пределах класса Proteobacteria (Рис. 2).

—— Desulfovibrio hatophüus

-Desulfovibrio desulfuncans

-Desulfovibrio vulgaris

r- -Desulfomonile lledfel

-Syntrophobecter wolimi

L__ -Desullobulbus propionicus

-Desulfobacterium autotrophicum

Desulfurella acetvorans Desulfurella multipotens Desulfurella kamchatkienais Desulfurella ртрютса I. Hlppea maritima

■ Wotinelle sucdnogenes

t ...... i Campytobsder jejunl

' Agmbactenum tumefaciens

- Rhodopseudomonas palustris

—————— Escherichia coli

r——— Rhodocydus purpureus ————— Alcaligenes faecalis

_10%_

Рис. 2. Филогенетическое положение Hippen maritima.

U. Органотрофные термофильные прокариоты из мелководных гидротерм

Гипертермофильные микроорганизмы с коккоидными клетками, развивавшиеся на средах с пептоном в присутствие элементной серы были выделены в чистую культуру и охарактеризованы.

Из проб бухты Кратерная были выделены и описаны три штамма нового вида экстремально-термофильных архей Thermococcus stetteri.

Thermococcus Stetten sp.nov. (Miroshnichenko et al., 1990). Клетки типового штамма представляют собой неподвижные кокки неправильной формы и варьирующих размеров (1-2 мкм в диаметре) (Рис. 3). Растет в диапазоне температур от 55 до 94°С оптимумом 73-75°С, в диапазоне pH 5.7-7.2 с оптимумом 6.5 и при оптимальной концентрации NaCl 2.5 %. Использует в качестве субстратов белковые субстраты. Облигатный сероредуктор. При росте образует более, чем 20 мМ H2S, а также СО2, ацетат, изобутират и изовалерат. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 50.2 мол%. Типовой штамм К-3 (DSM 5262т). Выделен из мелководного сольфатарного поля бухты Кратерная (архипелаг Ушшпир, Курильские о-ва).

Два штамма, выделенных из того же местообитания и отнесенных к тому же виду, имели подвижные клетки со жгутиками и отличались более высокими температурными характеристиками (температурный диапазон роста 75-98°С).

Нами была изучена ультраструктура клеточной стенки Т. Stetten. Впервые для архей р. Thermococcus было показано, что она состоит из двойного слоя белковых глобул (S-слои) и содержит два основных белка с молекулярным весом 80.000 и 210.000 Да. Оказалось, что кроме двойного S-слоя, примыкающего к наружной части клеточной мембраны, клетки Т. stetteri имеют также внутренние слои (I-слои), прикрепленные к цитоплазматической мембране изнутри. Вероятно, S- и I-слои стабилизируют структуру клеточной стенки этого экстремально-термофильного микроорганизма и, возможно, важны для ее избирательной проницаемости.

Из пробы высокотемпературной литоральной гидротермы на о-ве Уэйл (Новая Зеландия) и высокотемпературных донных осадков залива Пленти (Новая Зеландия) были выделены еще два новых представителя р. Thermococcus - Thermococcus gorgonarius и Thermococcus pacificus.

Thermococcus gorgonarius. sp nov. (Miroshnichenko et al., 1998). Неправильные кокки 0.3-1.2 мкм в диаметре с полярно расположенными жгутиками. Клеточная стенка состоит из двух слоев субъединиц. Клетки имеют простекообразные выросты и окружены тонкой сетью фимбрий с диаметром 3-3 5 нм (Рис. 4). Облигатный анаэроб. Архея Растет при температурах 68-95°С (оптимум 80-88°С), pH 5.8-8.5 (оптимум 6.5-7.2). Использует для роста пептиды, отмечен слабый рост на пирувате. Элементная сера стимулирует рост. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 50.6 мол %. Типовой штамм W-12 (DSM 10395т).

Выделен из пробы песка высокотемпературной мелководной гидротермы о-ва Уэйл (Новая Зеландия).

ТНегтососсш раЫ/1сиз зр. поу. (Ми-овкисЬепко е1 а1, 1998). Неправильные кокки 0.7-1.0 мкм в диаметре, подвижные, с пучком полярно расположенных жгутиков (Рис. 5). Клеточная стенка состоит из одного слоя субьединиц. Облигатный анаэроб. Архея. Растет при температурах 70-95 °С с оптимумом 80-88 °С, при рН 6.0-8.0 с оптимумом рН 6.5. Использует пептиды и крахмал в качестве субстратов. Элементная сера значительно стимулирует рост. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 53.3 мол % Типовой штамм Р-4 ДОМ 10394т). Выделен из образца высокотемпературных донных осадков (глубина 40 м) залива Пленти (Новая Зеландия).

Еще два организма с типичными для представителей р. ТИегтососсш фенотипическими характеристиками были выделены из мелководных гидротерм залива Пленти (штамм MW) и бухты Матупи (штамм Р-2-3). Для идентификации этих культур был использован разработанный нами иммунохимический метод, описанный ниже; с его помощью пггамм М\У был отнесен к ранее известному виду Т. ШогаШ, а штамм Р-2-3 определен как Т. расфсш.

Следует заметить, что если к началу нашей работы р. ТИегтососсш состоял лишь из двух видов, выделенных из морских гидротерм, то к настоящему времени он насчитывает более 20 представителей, обнаруженных не только в морских (Кегсе^ап й а1., 2004, ЯеувепЬасЬ е1 а1„ 2000), но и в подземных (1,'Нап<1оп е1 а1, 1995; МповМсЬепко й а1, 1998) и континентальных (Яошти5 ег а1, 1997) местообитаниях. Поэтому актуальной является задача разработки способа быстрого видового определения этих микроорганизмов.

Рнс.3

Ряс. 4

Рис. 3. Thermococcus Stetten: ультратонкий срез клеток, показывающий двойной S-слой (а); реплика клеток, полученная методом замораживання-скалываиия и показывающая белковые глобулы S-слоя (б); латеральная проекция S-слоя, фазовый контраст (в); ультратонкне срезы клеток, показывающие внутренние слои, прикрепленные к цнтоплазматяческой мембране (г, д, е). Маркер для (а) 0.5 мкм; маркер для (а-в, г, е) 0.1 мкм.

Ряс. 4. Препараты целых клеток Thermococcus gorgonorius, окрашенных ФВК.

(а, 6, в) - клетки с простекамя.

(г, д) - клетки со жгутиками и фнмбрнями.

Маркер- 0.1 мкм.

Рнс. 5. Препараты целых клеток Thermococcus pacißcus, окрашенных ФВК (а); ультратонкие срезы (б).

Маркер 0.1 мкм.

1.4. Идентификация новых представителей сем. 7Ъ еттососсасеае

Для быстрой таксономической идентификации архей сем. ТЪегтососсасеае нами был разработан экспресс-метод, основанный на иммунохимической идентификации антигенных детерминант клеточных стенок. С помощью этого метода было определено не только таксономическое положение штаммов MW и Р-2-3, но также 10 чистых культур, полученных ранее В. Светличным из мелководных гидротерм Курильских островов (штаммы К1А, К1В, Е1, Е2, Е4, Е6, ЭЫАМ, ЭЫВ, 2104,2705) и глубоководных гидротерм Гуаймас (штаммы 2-1614 и 7-1519). 5 штаммов, выделенных из глубоководных гидротерм (штаммы вЕЗ, СЕ6, СЕ20, ОЕ21, ОЕ25), были получены от В. Мартеинссона (Университет Бреста, Франция). Данные по иммуноблотгингу клеток неидентифицированных штаммов с антисыворотками на 9 типовых штаммов видов сем ТЪегтососсасеае представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4,13 неидентифицированных штаммов дали положительную реакцию с 4 антисыворотками: культуры Z-1614, 8ЫАМ, БЫВ были определены нами как штаммы Т. ШогаГк. Е1, Е4, и 2705 прореагировали с антисывороткой на Т скИопорИа^. Штаммы К1А, К1В, ЕЗ, Еб, 2104 были идентифицированы как Т &еаеп, а культура Р-2-3 -как штамм Т. расфсиз. Эти результаты были подтверждены высоким уровнем ДНК-ДНК гомологии некоторых из идентифицированных и типовых штаммов (Табл. 5).

1.5. Влияние гамма-радиации и ультрафиолета на рост гипертермофильных архей.

Была исследована устойчивость к у-радиации клеток Т &еПеп Показано, что при умеренных дозах радиации (Ш50 и ЬОад ) клетки Г 5Гг«еп в 12-25 раз более устойчивы, чем клетки Е. соП, однако в 2-2.5 раза менее чувствительны, чем клетки Оетососсш гас!юс1игаю (Рис. 6). Величины 1Л35о и ЦЭад были получены при облучении дозами 5-6 кГр. Дозы 8-9 кГр приводили к гибели клеток Г ¡¡еНеп до 10"3% и ниже и были сублетальными. Резистентность клеток Т Мепег1 к ультрафиолетовому облучению была ниже, чем у Е соП. Полученные данные свидетельствуют о существовании определенного типа защиты ДНК клеток архей. Можно предположить, что ДНК архей хорошо защищена от однонитевых разрывов, которые возникают при у-облучении, и плохо - от пиримидиновых димеров, которые образуются после действия УФ-света.

Таблица 4. Результаты иммуноблоттиига клеток нсидентифицированных штаммов с антисыворотками

Штамм Антисыворотка к

Ругососст /игшив Т.се1ег ТМеИеп а I ! 1 I •5 к Трер1опорШш Т.ргсфтАш Т.^ог^опапш Трасфсш

бЕЗ - - - - - ■ - - -

йЕб - - - - - - ± ± ±

СЕ20 - ± ± ± ± - - - -

ОЕ21 - -

ОЕ25 - - - - - - - -

г-1614 - - - + - - - - -

г-1519 - - - - - - - - -

Р-2-3 - - - - - - - - +

- - - + - - - - -

К1А - - + - - - ± - -

К1В - - + - ± - - - ±

Е1 - - - -+ + - - - -

ЕЗ - - - - - - - - -

Е4 - - - - + - - - -

Е6 - - + - - - - - -

БЫАМ - - - + ± - - - -

выв - - - + ± • - - -

2104 - - + - - - - - -

2705 - - -+ - + - - -

Примечание: (+) - сильная реакция; (±) - слабая реакция; (-) - нет реакции

Таблица 5. Результаты ДНК-ДНК гибридизации между новыми и реперными штаммами р. ТИегтососсга

Штаммы % ДНК-ДНК гибридизации с

Т litoralis Т. stetteri

Z-1614 71 н.о.

MW 69 н.о.

К1В н.о. 97

Т. litoralis 100 н.о.

Т. stetteri н.о. 100

Примечание: и.о. - не определялся

Выживание, %

Доза радиации, кГр

Рис. 6. Кривая выживаемости Tkermococcus Stetten в сравнении с Deinococcus radiodurans и Echerlchta coli после облучения.

Таким образом, исследование разнообразия анаэробных термофильных микроорганизмов, обитающих в мелководных морских гидротермах, с помощью культуральных подходов, показало, что среди них присутствуют как бактерии, так и археи, развивающиеся в широком диапазоне температур. Среди гипертермофилов доминировали анаэробные органотрофные археи р. ТИегтососсю. Несмотря на то, что при лабораторном культивировании они нуждались в акцепторе электронов (сере), в природных экосистемах они, скорее всего, существуют за счет брожения. Образующийся при этом водород потребляется другими микроорганизмами и/или улетает, не оказывая на метаболизм архей р. 7Ъегтпососст ингибирующего действия Умеренно-термофильные бактерии представлены новым родом Шрреа. Эти организмы способны к литотрофному росту с молекулярным водородом в присутствие серы как акцептора электронов, а также к полному окислению продуктов брожения органотрофных микроорганизмов. Можно предположить, что в богатых органическим веществом экосистемах мелководных гидротерм они замыкают анаэробный цикл углерода

Дополнительная информация о метаболическом разнообразии термофильных прокариот в мелководных гидротермах была получена с помощью радиоизотопного определения активности различных физиологических групп прокариот.

1.6. Детекция термофильных прокариот в мелководных гидротермах с помощью радиоизотопных методов

Основными источниками органического вещества в мелководных гидротермах является фотосинтезирующие бентосные микроводоросли и цианобактерии, а в некоторых случаях еще и терригенный сток со склонов вулканов (Тарасов, 1999). Исследования, проведенные в зонах мелководной гидротермальной активности Юго-Западной части Тихого Океана и бухты Кратерная, показали, что скорости минерализации до СОг равномерно меченых по 14С целлюлозы, белка и глюкозы, были весьма высоки, хотя и различны для разных гидротерм (Табл. 6).

Особенно высокие скорости микробных деструкционных процессов, в частности, процесса разложения целлюлозы, были отмечены в бухте Матупи, что, вероятно, связано с поступлением в гидротермальные зоны органического вещества прибрежной растительности.

Организмы, осуществляющие разложение целлюлозы в мелководных гидротермах, несмотря на высокие скорости, зафиксированные нами для этого процесса, до последнего времени выделены не были. Однако недавно доказательства их существования были получены с помощью молекулярных методов. Так, в результате оценки разнообразия микробного сообщества мелководного источника в бухте Палеохори (о-в Милос, Греция) с помощью градиентного гель-электрофореза, были получены последовательности, имеющие высокое сходство (99 %) с последовательностями 168 рРНК гена термофильной целлюлозолитической бактерии СаЫкеПиИозггир^г 1ас!оасеНсш. (в^еуей а1, 2ООО). В этой же работе приводятся данные о присутствии микроорганизмов, относящихся к кластеру Cytophaga-Flavobacterium.

Таблица 6. Скорость минерализации целлюлозы, белка и глюкозы

Номер станции П-4 ТУЬ2 Мб М-2-1 М10] М102 М12 К1 К4

Т, °С 85 85 81 55 75 85 70 55 90

Интенсивность сероредукции, мг в/ кг^сут'1 0 0 - 5740 0 0.21 - 940 0.51

Интенсивность сульфатредукции, мг 85/ кг'сут'1 0.45 - 0.25 - 0.18 0.28 - - -

Интенсивность метаногенеза, мкл СНУкг-'сут1 из С02+Н2 10.9 - - - 0.42 4.69 0.22 - 0

ацетата 30.5 - - - 29.4 0.79 - - 0

Скорость разложения, мг С/кг "'сут'1 целлюлозы 10.9 0 7.78 - 36.4 27.2 26.1 1.63 0.14

белка 0.003 - 3.4 - 0.6 11.9 0.9 0.82 0.01

глюкозы 0.02 - - - 0.2 - 0 01 - -

Минерализация белковых веществ и полисахаридов в высокотемпературных мелководных гидротермах происходит с участием органотрофных гипертермофильных архей и термофильных бактерий, высокая численность которых в мелководных гидротермах была показана нами культуральными методами.

Полное анаэробное разложение продуктов брожения органического вещества в мелководных гидротермах с температурой 55-85°С происходит при участии сульфат- и сероредукторов и метаногенов. Соответствующие процессы были детектированы нами с помощью радиоизотопных методов, и лишь частично подтверждены выделением соответствующих накопительных и чистых культур. Так, несмотря на то, что из исследованных образцов сульфатредуцирующие организмы нами выделены не были, радиоизотопные методы указывают на значимость сульфатредукции в микробных сообществах мелководных гидротерм. В частности, максимальная интенсивность сульфатредукции была отмечена для умеренно-температурных иловых отложений залива Пленти (Табл. 6). Впоследствии из мелководных гидротерм, помимо экстремально-термофильной сульфатредуцирующей археи Archaeoglobus fulgidus, окисляющей молекулярный водород (Stetter et al., 1988), была выделена умеренно-термофильная бактерия Desulfacinum hydrothermale (Sievert et al., 2000), способная к полному окислению широкого спектра простых органических соединений, длинноцепочечных жирных кислот, а также молекулярного водорода в присутствие сульфата, тиосульфата или сульфита. В горячих (85°С) мелководных гидротермах залива Пленти нами был зафиксирован высокотемпературный ацетокластический метаногенез (Табл. 6). Этот же процесс был отмечен и для гидротерм бухты Матупи, причем из ацетата образовывалось 75 % метана. Микроорганизмы, способные к образованию метана из ацетата выделены пока только из умеренно-термофильных местообитаний - термофильных метантенков (Methanosarcina) и термофильных цианобактериальных матов (Methanothrix =Methanosaeta) и являются умеренными термофилами (Ножевникова, Ягодина, 1982; Ножевникова и др., 1986). Однако высокотемпературный (>80°С) ацетокластический метаногенез в лабораторных условиях до сих пор не воспроизведен, поэтому детекция этого процесса с помощью радиоизотопных методов представляет большой интерес.

Интенсивность бактериальной сероредукции в мелководных гидротермах Западной части Тихого Океана выражалась различными цифрами в зависимости от расположения гидротермального источника. Особенно интенсивен этот процесс был в литоральной зоне, где во время приливов и отливов происходит смена окислительно-восстановительных условий, обеспечивающая регенерацию серы. В нашей работе было показано присутствие в мелководных гидротермах многокомпонентного сообщества бактерий с серным дыханием и выделены чистые культуры сероредуцирующих организмов.

Часть 2: Глубоководные гидротермы

2.1. Численность анаэробных термофильных прокариот в глубоководных

гидротермах

Образцы для исследования были получены в ходе экспедиций в районы глубоководной гидротермальной активности ВТП (французские экспедиции AMISTAD в 1999г. и DUS в 2001 г.), а также САХ (российская экспедиция в 1998 г.) В образцах гидротермальных участков ВТП была определена численность органотрофных микроорганизмов, метаногенов, литотрофных сульфат- и сероредукторов. Определения проводились для образцов внутренней части сульфидной постройки, внешней ее части, а также для образцов фрагментов трубок Alvinella pompejana. Оценка численности анаэробных органотрофных прокариот проводилась методом серийных разведений на среде Пфеннига с 3 % NaCl с добавлением 0.5 % пептона и 1 % элементной серы, при 65, 80 и 90°С. Для определения численности литотрофных прокариот использовалась та же среда с Н2/СО2 (80:20) в газовой фазе с добавлением 0.01 % дрожжевого экстракта, при тех же температурах.

Из таблицы 7 видно, что в первичных накопительных культурах, полученных из внутренней, наиболее высокотемпературной части гидротермальной постройки доминировали органотрофпые кокки, фенотипически сходные с представителями пор. Thermococcáles. В меньшем количестве здесь также присутствовали водород-окисляющие сероредукторы. В накопительных культурах, полученных из внешней части постройки, к перечисленным выше микроорганизмам добавляются литотрофные сульфатредукторы, растущие при Т° 80 и 65°С. В микробных сообществах, ассоциированных с беспозвоночными полихетами Alvinella pompejana, численность органотрофных микроорганизмов достигала наибольших значений (107-108 клеток/мл). Здесь же максимальной была и численность литотрофных серо- и сульфатредукторов.

2.2. Выделение и характеристика литотрофных термофильных прокариот из

глубоководных гидротерм

При изучении разнообразия термофильных прокариот в глубоководных гидротермах основным объектом наших исследований стали умерено термофильные

анаэробные литотрофы - группа, до того времени практически не исследованная. Нами был выделен ряд новых представителей водород-использующих термофильных бактерий.

Таблица 7. Численность представителей основных метаболических групп термофильных прокариот в образцах из глубоководных гидротерм ВТП

Образец Субстрат/ акцептор Температура инкубации, °С Последнее разведение с ростом Морфология доминирующих форм

Внутренняя часть постройки пептон 99 105 Неправильные кокки

и и 80 104 Правильные кокки

н н2 II Нет роста

н Н2 + 8042' и п

л Нг + в0 102 кокки

» пептон 65 104 Крупные палочки, кокки

п н2 п Нет роста

II Нг + вОА2" II "

II Нг + в0 102 Кокки разных размеров

Внешняя часть постройки пептон 90 ю4 Неправильные кокки

н и 80 103 Правильные кокки

н Н2 Н Нет роста

н Нг + вО/ II 102 Мелкие кокки

и Нг + Б0 II 103 Мелкие кокки

к пептон 65 103 кокки

и н2 II ю2 Тонкие палочки

Н2 + 3042" 102 вибрионы

Нг + в0 102 Палочки и кокки

Фрагменты трубок АШпеИа пептон 80 108 Подвижные кокки

п н2 II 103 Кокки и тонкие палочки

II Нг + 8042" 106 кокки

II Нг + в0 ю5 кокки

II пептон 65 ю7 Подвижные палочки с чехлами

Из фрагментов трубок полихеты Alvinella pompe]ana, эндемичного обитателя глубоководных гидротерм Восточно-Тихоокеанского Поднятия, была выделена литоавтотрофная бактерия, представляющая новый род Nautilia.

Nautilia lithotrophica gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al., 2002). Короткие подвижные палочки (0.4-0.7 мкм х 1.1-2 Омкм) с одним полярным жгутиком и грамотрицательной клеточной стенкой (Рис. 7). Облигатный анаэроб. Умеренный термофил, растущий при температурах 37-68°С (оптимум 53°С). Нейтрофил, растущий при рН 6.4-7.4 с оптимумом 6.8 -7.0. Растет при концентрации NaCl 0.8-5.0% с оптимумом 3.0 %. Использует для роста молекулярный водород или формиат как источники энергии, элементную серу как акцептор электронов и СОг как источник углерода. Способен к слабому росту с сульфитом как акцептором электронов Содержание Г+С оснований в геномной ДНК 34.7 мол %. Типовой штамм 525т (DSM 13520т). Выделен из фрагментов трубок Alvinella pompejana, отобранных на гидротермальном поле Восточно-Тихоокеанского Поднятия (13°N).

N. lithotrophica является первым представителем термофильных Epsílonproteobacteria, обитающих в глубоководных гидротермах, выделенным в чистую культуру. До этого широкое распространение Epsílonproteobacteria было показано молекулярными методами. В работе Hoek et al. (2003) эти бактерии были обнаружены в образцах сульфидных построек активного гидротермального поля Центрального Индийского Хребта (поле Эдмонт, глубина 3290 м). Исследование микробного разнообразия этих образцов показало, что более 90% бактериальных филотипов относятся к Epsílonproteobacteria, причем 40 % из них практически идентичны последовательности гена 16S рРНК N. lithotrophica. Культура, филогенетически родственная N. lithotrophica была также недавно выделена из микробного сообщества, колонизировавшего in situ титановую камеру, установленную в умеренно-температурной зоне гидротермального поля Дженезис (Восточно-Тихоокеанское Поднятие) (Alain et aL, 2004). В отличие от N lithotrophica, новый изолят восстанавливал не только серу, но и тиосульфат.

a* va - б

Рис. 7. Препараты целых клеток Nautilia tithotrophica, окрашенных ФВК (а); ультратонкий срез (б). Маркер 0.5 мкм.

Еще один новый представитель Epsilonproteobacteria был обнаружен нами в пробах, полученных из "in situ growth chamber", размещенной на гидротермальном поле Срединно-Атлантического Хребта. Этот изолят представлял новый вид к p. Caminibacter.

Caminibacter profundus sp.nov. (Miroshnichenko et al., 2004) Подвижные палочки (1.2-1.5 мкм x 0.5 мкм) с одним полярным жгутиком (Рис.8). Клеточная стенка грамотрицательная. Неспорообразующий. Анаэроб или микроаэрофил. Умеренный термофил, растущий в диапазоне температур 45-65°С (оптимум 55°С). Нейтрофил, растущий при рН 6.5-7.4 (оптимум 6.9-7.1). Растет в диапазоне концентраций NaCl 0.55 % (оптимум 3 %). Облигатный хемолитоавтотроф, использующий Нг как единственный источник энергии, элементную серу, нитрат или кислород как акцепторы электронов и СОг как источник углерода. Сероводород или аммоний являются продуктами восстановления соответственно серы или нитрата. Содержание Г+С оснований геномной ДНК типового штамма 32.1 мол%. Ближайший филогенетический родственник Caminibacter hydrogeniphilus (сходство последовательностей генов I6S рДНК 94.9%). Типовой штамм CRT (DSM 15016т, JCM 11957т) был выделен из микробного сообщества камеры обрастания, размещенной на гидротермальном поле Срединно-Атлантического Хребта (23° N).

Caminibacter profundus является новым видом p. Caminibacter, описанным французскими исследователями (Alain et al, 2002) вслед за p. Nautilia С. profundus имеет важные фенотипические отличия от типового вида этого рода С. hydrogenlphllus - он отличается облигатной автотрофией и способностью к микроаэрофильному росту.

Рис. 8. Препараты клеток Caminibacter profundus, окрашенных ФВК

(а); ультратонкий срез с увеличенным фрагментом клеточной стенки

(б). Маркер 0.5 мкм.

Класс Epsilonproteobacteria представляет собой группу Грам-отрицательных мезофильных микроаэрофильных и/или анаэробных хемоорганогетеротрофных или хемолитотрофных бактерий, многие из которых являются патогенными для эукариотных организмов. До обнаружения представителей этого класса в глубоководных гидротермах он был представлен одним порядком Campylobacterales, состоящим из двух семейств Campylobacteraceae и Helicobacteraceae (Табл.8). Основываясь на филогенетических данных (уровень сходства последовательностей генов 16 рРНК бактерий рр. Nautilia и Caminibacter с представителями пор. Campylobacterales не превышает 83%), а также фенотипических и геномных различиях, мы предложили новый порядок Nautiliales, состоящий к настоящему времени из единственного семейства Nautiliaceae (Рис. 9).

Согласно классификации некультивируемых клонов глубоководных Epsilonproteobacteria, предложенной Corre (2000), представители pp. Nautilia и Caminlbacter относятся к группе D. Еще один недавно описанный представитель этого же филогенетического кластера, Lebetimonas acidiphila (Takai et al., 2004), за исключением слабой ацидофилии (рН0Пт 5.2) не имеет других существенных отличий в физиологии и метаболизме по сравнению с ранее описанными видами пор. Nautiliales. Несколько штаммов, относящихся к этому порядку , были выделены, но не узаконены (Campbell et al., 2002, Alain et al., 2003).

Таблица 8. Различия между семействами Nautiliaceae fam.nov., Campylobacteraceae {Campylobacter, Arcobacter, Sulfospirillum, Thiovolum) (Vandamme & De Ley, 1991; Vandamme et aL, 1991, La Riviere & Schmidt, 1992, Schumacher et al., 1992, Luijten et al., в печати) и Helicobacteraceae (Helicobacter, WolmeUa) (Tanner et al., 1981; Vandamme et al., 1991).

Порядок Nautuliales Campylobacterales

Семейство Nautiliaceae Сатру1оЬас1егасеае "НеИсоЬас1егасеае "

Морфология Палочки Спиралевидные, искривленные или 8-образные палочки Спиралевидные, искривленные или прямые палочки

Отношение к кислороду Облигатные анаэробы или микроаэрофилы Микроаэрофилы, некоторые штаммы аэробы или анаэробы Анаэробы или микроаэрофилы

Использование Нг + - + или -

Акцепторы электронов при анаэробном росте S°,N03',02 02,АГ+5*, Эе'6*, Б0* Ог, фумарат

Метаболизм Хемолитотрофы или миксотрофы Хемоорганотрофы, 8и1/о$рт11ит миксотрофы, 1Ыо\>о1ит хемолитотрофы Хемоорганотрофы или миксотрофы

Термофилия + - -

%в+С 29-35 28-49 35-46

Примечание: * восстанавливается Sulfospirillum spp.

Deautfövibrlo tbsulfiiricam Str. ATCC2774 (MM 113)

Рагаспсавdenllrificans so. ATCC17741T(YI6»7)

MelhytoLoccm capsulata Str. BalhT (X72771)

Hvdragemphüm thermahtteaitts str ТН-1т (AB009829)

-Sulfknmonm ШШюрЬка яг OK I От (AB088431)

Strain G025-I (AB09I295)

—ТЬюткпщнга (ienUnficam to. DSMI2SI' (L40808) Süifiirtcunvmktgtcnsestr YK-IT<AB053»5I)

-Helicobacter pylon str. ATCC43504T (1101130)

ИЫЫИа этксиижетга str. 602W1 (M88I59)

-Bacterouies wvofvttcits str ATTC333«?T(L0432I)

Campylobacter faxu str АТСС27374т (M63012)

C- Arcobacttr ntlntfigtlis str. CC'UQI5i93T(LU627) Arcabucttr ayaerophtlm Str. CCUG17S0Ir (U4624)

1-Strain Am-N (AF3S7m)

1— Strain EX-18.1 (AF35719»)

-Sitlfurtupirilhtm arcachonenst Str. F1F6T(Y115«I)

Sul/urospirilhtm deieytarmm str. 5175 (Y1367I) Sulfttrmum hthotruphkttm str 42BKTT (AB09I292)

Older:

Campylobacterales

Strain E9S37-1 (AB09I300) Hydmgemmonas thermophtla str. EPI-SS-IW (AB№S049) Strain BKB55-1 (AB09I294)

Environment^ clone S17sBacl7 (AF299122)

Environmental clone SI 7sBac 1« (AF299121) Strain BISS-t (AB09I296) Strain MISS-1 (AB09I304)

- Camrnitaaer hydrogtriphitm str. AMU I6r (AJ30965S) Cammbacursp str. AMI) IS (AJ309654) CtmlMilmcarpnfluuha str. CRT (AJS65464)

*».-Naultliasp str. Ara-H(AF357197)

P-MMilla MMmpUcm Mr. 525* (AJ40437«)

'-NtMtlta sp. strain EX-112 (AF357196)

— Strain B455-1 (AB09I297)

Lcbctimanas acUtplula str Pd55T(ABI67820)

Order: Nautiliales

Рис. 9. Дендрограмма, построенная на основании сравнения последовательностей генов 1бв рРНК н показывающая филогенетическое положение пор. МаиШШех ог! не», (по Така! й а£, 2004).

К настоящему времени выделены и охарактеризованы Epsilonproteobacteria из глубоководных гидротермальных полей Центрального Индийского Хребта и Срединного разлома Окинава (Takai, et al., 2004; Iganaki et al., 2003, 2004). Они являются представителями других филогенетических кластеров системы Corre (подгрупп А,В, F, и С). Однако, несмотря на филогенетические различия (все они представляют собой новые роды), эти микроорганизмы имеют много общего в физиологии - это умеренно-термофильные или мезофильные анаэробные/микроаэрофильные водород-окисляющие литоавтотрофы, использующие серу или нитрат в качестве акцепторов электронов. Исключение составляет Sulfiirimonas autotrophica, окисляющий сульфид, серу или тиосульфат (Iganaki et al., 2003).

Таким образом, основными отличительными характеристиками новой, широко распространенной в глубоководных гидротермах группы Epsilonproteobacteria, являются литоавтотрофия и термофилия. Высокий потенциал метаболического разнообразия этих микроорганизмов безусловно создает им преимущества в различных природных биотопах. Было показано, что именно эта группа бактерий является микроорганизмами-пионерами, колонизирующими поверхности вновь образующихся сульфидных построек и создающими условия для последующего их заселения гидротермальными животными (Alain et al., 2004). Будучи литоавтотрофами, Epsilonproteobacteria являются первичными продуцентами органического вещества в анаэробных зонах глубоководных биотопов. Обобщая данные, полученные нами и другими исследователями, можно предположить, что Epsilonproteobacteria являются одним из важнейших компонентов микробного сообщества глубоководных гидротерм.

Многие исследователи отмечали присутствие вибрионов в накопительных культурах из глубоководных гидротерм. Нам впервые удалось выделить эти

микроорганизмы в чистую культуру. Новый организм был отнесен к новому виду Deferribacter abyssi sp. nov.

Drferribacter abyssi sp. nov. (Miroshnichenko et al., 2003) (Рис. 10,11). Клетки подвижные короткие палочки прямые или в форме вибрионов длиной 1.5-2.0 мкм и с диаметром 0.4-0.5 мкм с одним полярным жгутиком (Рис. 10). Клеточная стенка грамотрицательная. Анаэроб. Умеренный термофил, растущий в температурном диапазоне от 45 до 65°С с оптимумом при 60°С. Нейтрофил, растет при рН 6.0-7 2 с оптимумом 6.5-6.7. Морской микроорганизм, растущий при концентрации NaCl 1.0-5.0 %

Mî.i yl-ч ¿í il •>,-

«■ч .»«м j

* -i» 1 ' y*? ;>>'

(оптимум 3 %). Растет хемолитоавтотрофно, используя водород как донор электронов элементную серу или нитрат как акцепторы электронов и СОг как источник углерода. Сера и нитрат восстанавливаются, соответственно, в сероводород и нитрит. Растет литогетеротрофно (в присутствие 50 мг/л дрожжевого экстракта) с окисным железом, которое восстанавливается в магнетит. Способен к анаэробному окислению ацетата, пирувата, сукцината и белковых субстратов при использовании серы, нитрата или Fe<+3) как акцепторов электронов. Не способен к брожению. Содержание Г+С оснований геномной ДНК типового штамма 30.8 мол %. Типовой штамм JRT (DSM 14873, JCMT 11955т). Выделен из образца гидротермального поля Рейнбоу Срединно-Атлантического Хребта (36° 16'N,33° 54' W).

Еще один штамм Deferribacter abyssi (штамм DR), фенотипически сходный с типовым, был выделен из образца гидротермальной постройки поля Менез Гвен, расположенном также на САХ (37° 50' N,31° 50' W). Ранее присутствие термофильных Ре+3-восстанавливающих микроорганизмов р Deferribacter в глубоководных гидротермах ВТП было показано Слободкиным с соавт. (2001) путем анализа накопительных железовосстанавливающих культур с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза.

Deferribacter abyssi окрашенных ФВК (а); ультратонкий срез (б).

Рис. 10. Препарат целых клеток

Маркер 0.S мкм.

Flexistipes lirrusarabici DSM 49A7 (М5ЯЗ i)

100

100

Deferribacter abyssl - Deferribacter ¡hemophilus BMA1T (U75602)

Deferribacter destdfuricans DSM 14783Т(АЬ086060)

100

Geovibrio ihiophlus AAFU3T (AJ299402) ■ Geovibriofernreducens PAL-1T (X95744) - Demtrovibrio acehphlus N2460T(Af 146526)

Aquifex pyrcphiha DSM 6858T(MS354S)

10»

Рис. 11. Филогенетическое положение Deferribacter abyssL

2.3. Выделение и характеристика органотрофных термофильных прокариот из глубоководных гидротерм

Пористая структура некоторых активных курильщиков образует микрониши, где оксшенироваыная морская вода нагревается до 60-70°С, создавая условия для развития умеренно-термофильных аэробных и микроаэрофильных организмов. К началу наших исследований из глубоководных гидротерм бассейна Гуаймас был выделен лишь один аэробный микроорганизм, ТЪегтш ЛегторЫЫ, повсеместно распространенный в континентальных и шельфовых термальных местообитаниях (МайетвБоп й а!., 1999).

Новые представители сем. ТИегтасеае, выделенные нами из глубоководных гидротерм, отличаются рядом необычных для этого семейства свойств.

Oceanithermus profundus gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al., 2003) Неподвижные палочки шириной 0.5 -0 7 чкм вариабельной длины (Рис. 12) Для старых культур характерно образование филаментов и сферических тел. Клеточная стенка

грамотрицательная. Неспорообразующий. Умеренный термофил, растущий при температурах 40-68 °С с оптимумом 60 °С. Нейтрофил, оптимум рН 7.5. Растет при концентрации NaCl 1.0-5.0 % с оптимумом 3 0 %. Микроаэрофил, растет при концентрациях кислорода ниже 6 %. Оксидаза и каталаза присутствуют. Окисляет углеводы, крахмал, белковые субстраты, органические кислоты и спирты. Способен к анаэробному росту с нитратом, который восстанавливается в нитрит. Способен к хемолитогетеротрофному росту с водородом. Содержание Г+С оснований в ДНК 62.9 мол %. Согласно данным филогенетического анализа 16S рДНК, является новым родом ветви Deinococcus-Thermus. Типовой штамм 506т (DSM 14977т, ВКМ В-2274т) был выделен из образца гидротермальной постройки Восточно-Тихоокеанского Поднятия (13° N).

К настоящему времени выделен и описан еще один вид p. Oceanithermus, О desulfurans, который отличается способностью использовать в качестве акцепторов электронов не только питрат, но также нитрит и элементную серу (Mori et al, 2004)

Vulcanithermus mediatlanticus gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al., 2003) Неподвижные грамотрицательные палочки различной длины шириной 0.6-0.7мкм (Рис. 13). Неспорообразующий. Растет в температурном диапазоне 37-80°С с оптимумом 70®С при рН 5.5-8.4 с оптимумом 6.7. Оптимальная концентрация NaCl 3 %. Растет хемоорганогетеротрофно, используя углеводы, белковые субстраты, органические кислоты и спирты; акцепторами электронов при этом служат нитрат или кислород. Микроаэрофил. Оптимальная для роста концентрация кислорода 4-8 % при перемешивании. Способен к аэробному росту. Факультативный литогетеротроф, использующий молекулярный водород как источник энергии. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 68.4 мол%. Является новым родом ветви Deinococcus-Thermus Типовой штамм TRT (DSM 14978т, ВКМ В-2292т, JCM 11956т). Выделен из образца гидротермальной постройки поля Рейнбоу Срединно-Атлантического Хребта (36° 14' N).

Таким образом, V. mediatlanticus, в отличие от О. profundus, является экстремально-термофильным микроорганизмом и способен к росту на воздухе. При этом оптимальными для роста обоих новых представителя сем Thermaceae являются микроаэрофильные условия.

Рис. 12 Рис. 13.

Рис. 12. Препараты целых клеток Oceanithermus profundus, окрашенных ФВК (а); ультратонкий срез (б). Маркер 0.5 мкм.

Рис. 13. Препараты целых клеток Vulcanithermus mediatlanticus, окрашенных ФВК (а); ультратонкий срез (б). Маркер 0.5 мкм.

Новые представители сем. Thermaceae (Рис. 14), имея ряд типичных для этого семейства характеристик (морфология клеточной стенки, хемоорганотрофный рост в присутствии нитрата, использование широкого спектра органических субстратов, геномные характеристики), отличаются от них способностью к литотрофному росту с водородом, микроаэрофилией, и облигатной зависимостью от NaCl. Множественность метаболических путей новых представителей сем. Thermaceae позволяют им хорошо адаптироваться к быстро меняющимся условиям глубоководных гидротерм. Эти бактерии способны расти в широком диапазоне концентраций кислорода, а в анаэробных условиях использовать нитрат как терминальный акцептор электронов Спектр используемых этими микроорганизмами субстратов очень широк и включает не только органические вещества, но и несбраживаемые субстраты (ацетат, пропионат) - продукты метаболизма органотрофных архей и бактерий. В отсутствие органических субстратов О profundus и V mediatlanticus могут расти литотрофно, используя водород гидротермального флюида

-Miiatherrrus ruber ЖС35948T (Z15059)

- Thermus aquaticusflfiCC25104T (L09SS)

-Kfarimthermus hydrotherrralis Т?(АШ79Щ

74i Q_Oceanithermus profundus strain 506T (Aj430S86)

—~ I- Vulcanithermus mediatlanticus TRT

66 - I2moc&cusraaSoakrarKDSM20539r(Y11332)

,-ThermotogarmritirnaüSm 109^1774)

-Fe^cbbacterimmchsummx:35(Oi(bS9\77)

-Dictyoglomu5thermptolun£m396f(XE9m)

——— Aqufixfyrq?hilusDSM685tf(№3S48)

iff/.

Рис. 14. Филогенетическое положение pp. Oceanithrmus и Vulcanithermus

К восстановлению нитрата в процессе роста оказался способным также другой новый организм, выделенный из глубоководных гидротерм поля Логачев САХ-облигатно-анаэробная термофильная бактерия Caldithrix abyssi.

Caldithrix abyssi gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al, 2002). Клетки грамотрицательные тонкие палочки шириной 0.2-0.35 мкм вариабельной длины (Рис. 15). Неспорообразующий. Умеренный термофил и нейтрофил. Растет при температуре 40-70°С оптимумом при 60"С и в диапазоне pH 5.8-7.8 с оптимумом 6.8-7 0. Оптимальная для роста концентрация NaCl 2.5%. Хемоорганогетеротроф, способный к сбраживанию пирувата, казаминовых кислот и белковых субстратов. Способен к литогетеротрофному росту с молекулярным водородом или ацетатом в присутствие нитрата. Нитрат в процессе денитрификации восстанавливается в аммоний. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 42.5%. Типовой штамм LF13T (DSM 13497т, ВКМ В-22861) Выделен из образца

глубоководной сульфидной постройки поля Логачев Средтгно-Атлантического Хребта (14° 45'N44° 59'

Рис. 15. Препараты целых клеток СаШкпх аЬу$$1, окрашенных ФВК (а, в); ультратонкий срез с увеличенным фрагментом клеточной стенки (б). Маркер 0.5 мкм.

СаМиНгЬс аЬуя51 является одним из уникальных с позиций филогении микроорганизмов, представляющая новую филогенетическую ветвь в царстве Бактерий. Уровень сходства 168 рДНК гена С. «¿ум/ с известными микроорганизмами не превышает 82.3 % (Рис. 16). Существование единственного близкородственного С. аЬузп организма было показано Сивертом с соавт. (2002) при исследовании библиотеки клонов генов 16Б рРНК из природного образца, взятого с глубины 10-20 мм на расстоянии 1.23 м от центра мелководной гидротермы бухты Палеохори (острова Милос, Греция). Последовательность фрагмента 16в рДНК клона МЬ-5 имеет 98 % сходства с геном 168 рРНК С аЬуа!. Клон МЬ-5 представляет доминирующий компонент микробного сообщества исследованного образца. Ранее те же авторы отмечали отсутствие кислорода в более глубоких слоях грунта гидротермального источника, и быстрое увеличение температуры с глубиной ^¡еуеЛ « а1, 1999). Поэтому, несмотря на принципиально различные источники выделения С аЬуШ и организма, представленного клоном МЬ-5, основные физико-химические характеристики их местообитаний могут быть сходными.

Thermodesulfobacterium

Archaea

Рис. 16. Филогенетическое дерево, показывающее положение Caldithrix abyssi в домене Бактерий.

Еще один облигатно-анаэробный термофильный микроорганизм,"Thalassobacillus modestocaldus", был обнаружен нами в гидротермальных образцах Срединно-Атлантического Хребта.

"Thalassobacillus modestocaldus" gen. nov., sp. nov. (Miroshnichenko et al, в печати). Палочки шириной 0 2-0.3 мкм вариабельной длины с грамположительной клеточной стенкой (Рис. 17). Спорообразукяций. Растет в диапазоне температур 35-70 °С (оптимум 55 °С) и диапазоне pH 6.0-8.5 (оптимум 6.8-7.2). Нуждается для роста в NaCl (оптимальная концентрация NaCl 3 %). Строгий анаэроб. Использует для роста разнообразные органические субстраты (белки, углеводы, органические кислоты и спирты), окисляя их в присутствие нитрата. Нитрат в процессе роста восстанавливается в нитрит. Способен к литогетеротрофному росту с водородом. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 34.5 mol%.

Филогенетический анализ последовательности 16S рРНК гена показал, что новый микроорганизм относится к группе Bacillus (Рис. 18). Наиболее близкими филогенетическими родственниками этого нового микрооганизма являются Bacillus hortii (уровень сходства нуклеотидных последовательностей 16S рРНК составляет 92 %) и

Bacillus halodurans (91.8%). До сих пор единственным термофильным анаэробным представителем группы Bacillus являлась Bacillus infermts, выделенная из высокотемпературного глубинного местообитания (Boone et al., 1995). Филогенетически этот микроорганизм далек от "Thalassobacillus modestocaldus"', они различаются также и фенотипически, так как В. infernus, помимо нитрата, восстанавливает ряд других неорганических акцепторов электрона, но к литотрофному росту с молекулярным водородом не способна.

Рис. 17. Препараты целых клеток "Thalassobacillus modestocaldus окрашенных ФВК. Маркер 0.5 мкм.

Из глубоководных гидротерм в чистые культуры были также выделены микроорганизмы, которые после анализа последовательностей 16S рРНК генов были отнесены к описанным ранее видам Thermoanaerobacter siderophilus (Slobodkin et al., 1999) и Thermotoga maritima (Huber et al., 1987). Оба эти вида представлены термофильными анаэробными органотрофными бактериями, сбраживающими широкий спектр белковых и углеводных субстратов.

Полученные нами и другими авторами данные свидетельствуют о большом филогенетическом и метаболическом разнообразии прокариот в термофильных микробных сообществах глубоководных пздротерм. Микроорганизмы этих уникальных местообитаний представлены как высокоспециализированными литоавтотрофными бактериями, использующими энергию восстановленных соединений и газов гидротермального флюида, так и хемоорганотрофными видами, использующими органическое вещество биогенных остатков. Из глубоководных гидротерм нами были выделены также микроорганизмы, способные как к органотрофному, так и к

литогетеротрофному росту с водородом в присутствии серы, железа и нитрата, которые ранее не удавалось выявить на стандартных средах для органтрофов.

-Mcyclobactlbls actdocaldartus DSM44?

-Ammortphihs axalaücus RaOX- 1T

- Thermobacilhis xylanityttcus XEr

- Pcaanibacllius pojpmpxa DSM 36r

-AneurinibactUui anewrrslyticus DSM 5562r

--- Bievtbacillus bretis DSM 30r

"Thalassobacillus modestocaldus"

-Bacillus bortt DSM 12751'

-Amphlbadlhis xylanus DSM 662$

-Basilius pseudoftmus DSM 8715T

I— Bacillus pseuk/cäccäophilus DSM 8725r 1— Bacillus alcalophilus DSM 485r

-Bacillus halodurans DSM 497T

- Bacillus claistt DSM 8716r

г-Bacillus darbt D EM 8720T

'-Bacillus agarafhaerens DSM 872 Г

-AnoybacilliB pusfUnoensis DSM 2641T

г- Sacchstrococcus themophihis ATCC 43125r

I- Geobaallus stearothemophihisDSM 22T

- Bacillus sphxricus DSM 2?

-Barths ctreus ATCC 14579r

-Bacillus clrctiansV3A 11T

- Bacillus subülis ssp suMflfcDSMltf

- Thermtcarus aegipticus DSM 12793r

0 05

Рис. 18. Филогенетическое положение "Thalassobacillus modestocaldus" на основании сравнения 16S рРНК генов микроорганизмов группы Bacillus.

2.4. Исследование барофилии на примере новой барофильной термофильной

бактерии Marintioga piezophila.

Характерным для глубоководных гидротерм глубинам от 800 до 5000 м соответствует гидростатическое давление 8-50 МПа. Разными авторами была отмечена различная реакция глубоководных термофильных микроорганизмов на повышение давления. Деминг и Баросс (1993) определяют 4 типа таких реакций: для баротолерантных микроорганизмов скорость роста не зависит от давления; рост барофююв стимулируется при повышении давления; для барочувствительных организмов повышение давления приводит к ухудшению параметров роста (снижению урожая и увеличению времени удвоения); облигатные барофилы могут расти только при повышенном давлении.

Объектами исследований по изучению влияния гидростатического давления на микроорганизмы служили либо психрофильные бактерии - обитатели больших глубин, не связанных с гидротермальной активностью, либо гипертермофильные археи из глубоководных гидротерм - представители p. Tkermococcus и метаногены.

Мы исследовали реакцию на изменение давления термофильных бактерий нового вида p. Marinitoga, выделенного и описанного нами из образцов глубоководной гидротермальной постройки Восточно-Тихоокеанского Поднятия.

Marinitoga piezophila sp. nov. (Alain, et al., 2003). При оптимальных условиях роста клетки - палочки (1-1.5x0.5 мкм) с грамотрицательной клеточной стенкой и тогой. Подвижные, имеют полярно расположенные жгутики. Облигатный анаэроб. Растет в диапазоне температур 40-75 °С с оптимумом 65 °С, диапазоне рН 5.0-8.0 с оптимумом 6.0, и диапазоне солености 1-5 % с оптимумом 3 %. Пьезофил во всем температурном диапазоне роста. Оптимальное давление 40 МПа. При росте с меньшим давлением клетки деформировались: короткие подвижные палочки, характерные для давления 40 МПа, при 1 атм становились длинными скрученными нитями (Рис. 19). Время удвоения при оптимальных температуре и давлении 21 мин; максимальный урожай клеток 5.6x10® клеток/мл. Облигатный хемоорганогетеротроф. Растет на полимерных белковых субстратах и некоторых углеводах в присутствие дрожжевого экстракта. L-цистин и элементная сера значительно стимулируют рост, но не являются абсолютно необходимыми. Содержание Г+Ц оснований в ДНК 29 мол%. Уровень сходства

последовательностей 16S рРНК гена с типовым видом рода Marinitoga caminí 94%. Выделен из образца гидротермальной постройки Восточно-Тихоокеанского Поднятия (13° N) с глубины 2630 м под давлением ЗОМПа и температуре 65°С Типовой штамм КАЗТ (DSM 14283х, JCM11233T)

Рис. 19. MaтinUoga ркгорМ1а\ а - морфология клеток под сканирующим микроскопом (а - маркер 1 мкм) и в фазово-контрастном световом микроскопе (Ь - маркер 10 мкм, с, й - маркер 1 мкм). Клетки культивировались под давлением 40 МПа (а, Ь), 10 МПа (с), атмосферном давлении (ё).

Аналогичные наблюдаемым нами морфологические изменения были отмечены при изотермической декомпрессии психрофильных облигатно барофильных бактерий (штамм МТ-41) из Марианской Впадины (Уауапоз е1 а1, 1981). Для термофильных бактерий подобные изменения морфологии были описаны впервые. Было показано, что при повышении гидростатического давления скорость роста М. ркгоркИа возрастает и достигает оптимума при 40 МПа (Рис. 20,21). При 60 МПа рост этого организма отсутствовал. При культивировании при 40 МПа минимальная температура роста уменьшалась на 5°С, тогда как оптимальная и максимальная температуры роста не изменялись. Таким образом, согласно приведенной выше классификации, М ргегорИНа является первой термофильно-барофильной (пьезофильной) бактерией, выделенной из глубоководных гидротерм.

50 в0

Температура ("С)

Рис. 20. Влияние температуры и давления на удельную скорость роста И.рЬяорНиа (А)-40 МПа; (■) - 0,3 МПа; (•) - 0,3 МПа, культура, адаптированная к атмосферному давлению.

0 20 40 60 80

Гидростатическое давление (МПа)

Рис. 21. Влияние гидростатического давления на удельную скорость роста М. р1ецорШа.

2.3. Детекция термофильных прокариот в глубоководных гидротермах с помощью радиоизотопных методов

Дополнительная информация о физиологических группах микроорганизмов, присутствующих в гидротермах, была получена с помощью радиоизотопных методов. В образцах гидротермальных построек, а также фрагментов трубок обитающих на них полихет p. Alvinella радиоизотопными методами in situ были определены скорости основных микробных процессов, связанных с циклами углерода и серы: литотрофного и ацетокластического метаногенеза, окисления ацетата до СОг и сульфатредукции (Табл. 9). Наибольшая скорость литотрофного метаногенеза была отмечена для образцов гидротермальных построек, инкубированных при 100°С. Этот процесс могут осуществлять представители гипертермофильных метаногенов p. Methanopyrus, выделенные из глубоководных гидротерм (Kurr et al., 1991).

Таблица 9. Скорости микробиологических процессов в образцах глубоководных гидротерм ВТП

Образец Т инкуб.," Окисление ацетата Д0СО2, мг С л''день'' Скорость сульфатредукции, мг S л"1 день"1 Скорость литотрофного метаногенеза, мкг С л'день'1 Скорость ацетокластичес-кого

С Исходный образец £ Ацетат Исходный образец X + метаногенеза, мкг С л"1 день"1

АМ-03, образец постройки+вода, 60-80°С 80 4.85 0 250 0 1 13.6 0.1

65 2.36 0 3.8 23.6 2.8

АМ-05, вода, 65°С 65 1.43 0 135 0 0 0 0

АМ-06, вода, 80°С 80 0.87 0 0 0 0 3.2 0

АМ-10, образец постройки+вода, 300°С 80 0.72 0 - - 0.39 - 2.6

АМ-12, вода, 344°С 80 <0.2 0 - - 0 - 0

АМ-15, образец постройки+вода, 305°С 80 2.84 0 - - 0.14 - 0.06

90 1.46 0 - - 0.16 - 8

100 1.21 0 - - 14.4 - 2.7

Ш.-\6,АЫпе11а +вода 80 35 0 200 0 0.09 - 62.2

АМ-17, АЫпеПа +вода 80 25 0 0 0 0.11 0.84 130

Примечание:"-нет данных.

В геотермальных системах происходит процесс абиогенной термолитической сульфатредукции, создающий высокий уровень фона. Однако, при добавлении Н2 к образцам гидротермальных построек, инкубированным при 80°С, была детектирована интенсивная бактериальная сульфатредукция (Табл.9), осуществлять которую могли

гипертермофильные сульфатредудирующие археи р. Archaeoglobus (Burggraf et al., 1990), выделенные из глубоководных гидротерм.

Нами был впервые зарегистрирован процесс высокотемпературного ацетокластического метаногенеза в глубоководных гидротермах. Этот процесс был особенно интенсивным в образцах Alvinella sp. (Табл. 9). Скорость полного окисления ацетата также достигала наибольших значений в образцах Alvinella spp., что указывает на возможность полной деструкции органического вещества микробным сообществом, ассоциированным с Alvinella.

Таким образом, радиоизотопные эксперименты, помимо абсолютных скоростей микробиологических процессов, дают дополнительную информацию о присутствии и активности в гидротермах различных физиологических групп термофильных микроорганизмов, как уже выделенных, так и пока неизвестных (высокотемпературные ацетокластические метаногены).

Заключение

Несмотря на то, что как глубоководные так и мелководные гидротермы являются проявлениями единого вулканического процесса на дне океана, на населяющие их микробные сообщества воздействуют принципиально разные факторы. Мелководные биотопы - это открытые системы, имеющие постоянный приток органического вещества как в результате терригенного стока в периоды дождей, так и из поверхностных водных слоев, где идут интенсивные процессы фотосинтеза. Следствием большого количества органического вещества в мелководных гидротермах являются высокие скорости его деструкции и высокая численность органотрофных архей и бактерий, что и было показано в нашей работе.

Напротив, в глубоководных гидротермальных районах основой трофической цепи является хемосинтез. Большей его эффективности, вероятно, способствует и характерное для больших глубин высокое гидростатическое давление, повышающее растворимость и парциальное давление вулканических газов, используемых литотрофными микроорганизмами.

Более половины всех родов, выделенных из морских гидротерм, представлено литоавтотрофными микроорганизмами, из них 70 % - роды-эндемики глубоководных гидротерм (Табл. 10).

Таблица 10. Сравнение таксономического и метаболического разнообразия термофильных микроорганизмов мелководных и глубоководных гидротерм.

Тип местообитания Глубоководные гидротермы Мелководные гидротермы

Общее число родов 42 25

Число эндемичных родов 30 13

Анаэробы Облигатные 35 18

Факультативные 6 4

Аэробы 1 3

Литотрофы Литоавтотрофы 24 (17 эндемичных) 15 (6 эндемичных)

Литогетеротрофы 4 1

Облигатные органотрофы 14 9

Основным субстратом для анаэробных и микроаэрофильных литоавтотрофов из морских гидротерм является водород гидротермального флюида. Все выделенные нами из глубоководных гидротерм микроорганизмы, - это либо облигатные (рр. МаыЧИа, СатЫЬас1ег, ОфтЬаМег), либо факультативные (рр. СсЛМНгЬс, УикапНИегтш, ОсеатЛегтиз, "ТЪаккзоЬасШю ") водород-окисляющие литотрофы (Табл. 11), которые могут рассматриваться как продуценты органического вещества в анаэробных или микроаэрофильных условиях. В то же время большая часть этих организмов является и потенциальными деструкторами органического вещества, сбраживая его (СаЫНЪгЬс аЬуязГ), или окисляя в присутствии различных акцепторов электронов (бактерии рр. Бе/етЬааег, СаМИИтЬс, УикапиИегтш, ОсеапиЪегтш, "ТЪа1ск.юЬасШш").

Особенностью метаболизма многих выделенных нами из морских глубоководных гидротерм анаэробных термофильных микроорганизмов, является способность использовать нитрат в качестве акцептора электронов. Нитрат в процессе дыхания восстанавливается в нитрит (рр. Бе/етЬшег, УыкатЖегтш, ОсеапНИегтия, "ТЪаЫзоЬасНЫ ") или аммоний (рр. СаШИгЬс, СатМЬасгег).

Таблица 11. Основные свойства новых термофильных прокариот из морских гидротерм, описанных в данной работе

Род Вид Местообитание Отношение к Ог Использование н2 Акцепторы электрона Органо-трофный рост

Hippea gen. nov H. maritima sp.nov. МГ, бухта Матупи Анаэроб + в0 +

Thermococcus T. stetteri sp.nov. МГ, бухта Кратерная Анаэроб - - +

T. gorgonarius sp.nov. МГ, о-в Уэйл Анаэроб - - +

T. paciflcus sp.nov. МГ, залив Пленти Анаэроб - - +

Nautilia gen nov N .litotrophica sp.nov. ГГ, ВТП Анаэроб + в0 -

Caminibacter C. profundus sp.nov. ГГ, САХ Микроаэро-фил, факультативный анаэроб + в0, Шз' -

Deferribacter D. abyssi sp.nov. ГТ.САХ Анаэроб + 8е, N01', Ре+3 -

Oceanithermus gen. nov. 0. profundus sp nov ГГ, ВТП Михроаэро-фил, факультативный анаэроб + N03", Оз -

Vulcanithermus gennov. V. mediatlanticus sp.nov ГГ, САХ Микроаэро-фил, факультативный анаэроб + Шз",02 -

Caldithrix gen nov. C. abyssi sp.nov. ГГ,ВТП Анаэроб + Ш3" +

"Thalassobacillus gen. nov." "T. modestocaldus" sp.nov. ГТ, САХ Анаэроб + N03* -

Примечание: МГ- мелководные гидротермы; ГГ- глубоководные гидротермы

Происхождение нитрата в глубоководных гидротермальных полях на сегодняшний день остается не выясненным: нитрат отсутствует в гидротермальном флюиде и концентрации его в океанической воде очень низки. Можно предположить присутствие в морских гидротермальных биоценозах нитрифицирующих микроорганизмов, окисляющих аммоний органических остатков и гидротермального флюида в нитрат. Однако такие организмы пока не были выделены.

При сравнении таксономического разнообразия термофильных микробных сообществ мелководных и глубоководных гидротерм (на основании данных, полученных культуральными методами) видно, что глубоководные гидротермы превосходят мелководные не только по общему количеству родов микроорганизмов, но и по числу эндемичных родов (Табл. 10). Так, для мелководных гидротермальных зон описаны 13 эндемичных родов термофильных и гипертермофильных архей и бактерий, в то время как в глубоководных гидротермах насчитывается 30 эндемичных родов. Микроорганизмы единственного к настоящему времени эндемичного таксона высокого ранга, пор. ЫашШЫея, также были выделены из глубоководных биотопов.

Причина меньшего количества микроорганизмов, выделенных из мелководных гидротерм, по-видимому, имеет субъективный характер - эти местообитания исследовались значительно менее интенсивно на фоне изучения глубоководных гидротермальных полей.

Кроме большого количества эндемичных таксонов, из глубоководных гидротерм выделены и космополитичные виды архей и бактерий, населяющих этот биотоп наряду не только с мелководными, но также наземными и подземными термальными местообитаниями (рр. ТИегтососсш, ТИегтсигрИо, 1ЪегтоапаегоЬас1ег и ТНегтш). Некоторые филогенетически близкие организмы были обнаружены как в глубоководных, так и в мелководных шдротермах (рр. СаЫИЪпх, ТЬегтощЬпо, ЗХаркуШкегтт, ^тсоссиз, МеСИапоЖегтососсш).

Сравнение микробного разнообразия в мелководных гидротермах и наземных горячих источниках отражает сходство этих экосистем. Гидротермальный флюид мелководных гидротерм имеет состав, сходный с флюидом континентальных горячих источников, отличаясь от него лишь повышенной соленостью. В отличие от гидротермального флюида глубоководных гидротерм, во флюиде континентальных и мелководных гидротерм изначально присутствует органическое вещество, поступающее с

метеорными водами. Сходство этих биотопов подтверждается присутствием филогенетически родственных микроорганизмов. Так, сероредуцирующая бактерия Hippea maritima, выделенная из мелководных гидротерм бухты Матупи, филогенетически близка к представителям p. Desulfiirella, широко распространенного в континентальных гидротермах Камчатки и Новой Зеландии (Bonch-Osmolovskaya et al., 1990; Miroshnichenko et al., 1994, 1998). В мелководных гидротермах Курильских островов молекулярными методами были детектированы археи р Desulfiirococcus, до сих пор выделяемые только из горячих континентальных источников (Перевалова и др., 2003).

Термофильные микроорганизмы, близкородственные морским, обнаружены также в подземных местообитаниях. В частности, гипертермофильная архея Thermococcus sibiricus была выделена нами из высокотемпературных пластовых вод Самотлорского нефтяного месторождения в Западной Сибири (Miroshnichenko et al., 2001). Из проб того же месторождения нами был выделен Thermosipho geolei (L'Haridon et al., 2001), новый вид рода Thermosipho, также ранее обнаруженного в морских гидротермах с помощью культуральных и молекулярных методов. Другим примером является распространение представителей p. Deferribacter. Типовой вид этого рода Deferribacter thermophilus был выделен из проб нефтяного месторождения (Greene et al., 1986), тогда как D. abyssi (Miroshnichenko et al., 2003) и D. desulfuricans (Takai et al., 2003) - обитатели глубоководных гидротерм.

Обнаружение одних и тех же микроорганизмов в глубоководных и подземных местообитаниях является одним из аргументов в пользу гипотезы подземной биосферы, предложенной Деминг и Бароссом в 1993 году. На основании ряда геохимических и микробиологических данных авторы предложили идею существования биосферы, находящейся под океанической корой (subvert biosphere) - экосистемы, соединяющей участки океанических рифтов под поверхностью коры и населенной термофильными микроорганизмами. Согласно этой гипотезе, черные курильщики являются "окнами" в подземную биосферу.

Выводы

1. В глубоководных и мелководных морских гидротермах установлено широкое распространение и активное участие в циклах углерода и серы термофильных сероредуцирующих бактерий, способных к литотрофному росту с молекулярным водородом. В глубоководных гидротермах они представлены новым порядком Nautiliales. Бактерии порядка Nautiliales являются первыми термофильными представителями класса Epsilonproteobacteria. В мелководных гидротермах сероредуцирующие бактерии представлены р. Hippea, входящим в новую ветвь уровня подкласса в классе Proteobacteria.

2. В глубоководных морских гидротермах выявлено широкое разнообразие термофильных литотрофных нитратредукторов, представленных новыми родами Caldithrix, Thalassobacillus, Oceanithermus и Vulcanithermus. Род Caldithrix представляет собой отдельную филогенетическую ветвь в царстве бактерий. Роды Oceanithermus и Vulcanithermus являются первыми водород-использующими литотрофами и первыми микроаэрофилами в сем. Thermaceae.

3. Новый вид термофильных железоредуцирующих бактерий Deferribacter abyssi, выделенный из глубоководных гидротерм, способен к восстановлению различных акцепторов электронов, окисляя при этом широкий спектр энергетических субстратов. Возможно участие этой группы микроорганизмов как в продукционных процессах, так и в терминальных реакциях анаэробной деструкции органического вещества в морских глубоководных гидротермах.

4. Показано, что важным компонентом термофильных микробных сообществ морских гидротерм являются гипертермофильные органотрофные археи. Из мелководных гидротерм Западной части Тихого Океана выделены и охарактеризованы 3 новых вида р. Thermococcus• Т stetteri, Т paciflcus, Т gorgonarius. Разработан экпресс-метод видовой идентификации представителей р. Thermococcus. Показана их высокая устойчивость к гамма-радиации.

5 Из глубоководных гидротерм Восточного Тихоокеанского Поднятия выделена первая термобарофильная бактерия Marinitoga piezophila sp. nov., для которой показана зависимость морфологии и скорости роста от гидростатического давления.

6. Результаты исследования основных микробиологических процессов в морских гидротермах, проведенные с помощью радиоизотопных методов, подтверждают активное функционирование физиологических групп, детектируемых культуральными методами, а также указывают на присутствие в морских гидротермах новых физиологических групп микроорганизмов, пока не поддающихся лабораторному культивированию.

7. Значительная часть термофильных микроорганизмов морских гидротерм представлена строгими или факультативными анаэробами с литотрофным типом метаболизма, которые могут служить первичными продуцентами органического вещества в анаэробных условиях. Органотрофные термофильные микроорганизмы, обнаруженные в морских гидротермах, осуществляют гидролиз, брожение и полную минерализацию органического вещества в анаэробных условиях, замыкая анаэробный цикл углерода.

8. В морских глубоководных гидротермах степень таксономического разнообразия и эндемизма выделенных к настоящему времени термофильных микроорганизмов выше, чем в мелководных гидротермах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи

1 Мирошниченко М.Л., Бонч-Осмоловская Е.А, Алексеев В.А. Экстремально-термофильные бактерии из бухты Кратерная. Биология Моря, 1989, 3, 77-83.

2. Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya Е.А., Neuner A., Kostrikina N.A., Chernych N.A., Alekseev V.A. Thermococcus stetteri sp. nov., a new extremely thermophilic marine sulfur-metabolizing archaebacterium System. Appl. Microbiol. 1989,12, 257-262.

3. Бонч-Осмоловская E.A., Светличный B.A., Мирошниченко М.Л., Аксенова Е.Ю., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Распространение и характеристика экстремально-термофильных архебактерий из бухты Кратерная. 1991. В кн. Мелководные газогидротермы и экосистема бухты Кратерной. ч. 2 стр. 4-20.

4. Gongadze G.M., Kostyukova A.Yu., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A Regular proteinaceaous layers of Thermococcus stetteri. Current Microbiol., 1993, 27, 5-9.

5. Копылов B.M., Бонч-Осмоловская E.A., Светличный B.A., Мирошниченко М.Л., Скобкин B.C. Гамма-устойчивость и ультрафиолетовая чувствительность экстремально-термофильных архебактерий и эубактерий. Микробиология, 1993, 62, 90-95.

6. Miroshnichenko M.L., Gongadze G.M., Lysenko A.M., Bonch-Osmolovskaya E.A. Desuljurella mutipotens sp. nov., a new sulfur-respiring thermophilic eubacterium from Raoul Island (Kermadcc archipelago, New Zealand). Arch. Microbiol., 1993,60,88-93.

7. Бонч-Осмоловская E.A., Мирошниченко M.JI., Пикута E.B., Сорокин Д.Ю., Намсараев Б.Б. Бактериальная сероредукция в мелководных гидротермах Юго-Западной части Тихого океана. Микробиология, 1993, 62, 564-573.

8. Мирошниченко М.Л. Кострикина Н.А., Хиппе Г., Слободкин А.И., Бонч-Осмоловская Е.А. Биоразнообразие повых сероредуцирующих бактерий: новые субстраты и места обитания. Микробиология, 1998,67, 5,680-686.

9. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л. Влияние молекулярного водорода и элементной серы на метаболизм экстремально-термофильных бактерий рода Thermococcus. Микробиология, 1994,63,777-782.

10. Намсараев Б.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Пикута Е.В., Качалкин В.И., Миллер Ю.В., Пропп Л.И., Тарасов В.Г. Микробиологические процессы круговорота углерода в мелководных гидротермах Юго-Западной окраины Тихого океана. Микробиология, 1994,63,100-111.

11. Miroshnichenko ML., Chernyh N.A., Kostyukova N.A., Rainey F.A. Thermococcus gorgonarius sp nov and Thermococcus paciflcus sp. nov., new hyperthermophilic marine archaea from New Zealand hot vents. Int. J System. Bacteriol., 1998, 48,23-29.

12. Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A., Rainey F.A., Hippe H., Bonch-Osmolovskaya E.A. Desuljurella kamchatkensis sp. nov. and Desuljurellapropiomca sp. nov., new thermophilic sulfur-reducing bacteria from Kamchatka hot vents. Int. J. System Bacteriol., 1998,48,475479.

13. Bannikova G.E., Varlamov V.P., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of thermostable phosphatase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus

paciftcus by immobilized metal affinity chromatography. Biochem. Mol. Biol. Intern., 1998, 44,363-370.

14. Miroshnichenko M.L, Rainey F.A, Rhode M, Bonch-Osmolovskaya E.A. Hippeia maritima gen. nov. and sp. nov. represents a new genus of thermophilic sulfur-reducing bacteria from submarine hot vents. Int. J. System. Bacterid., 1999,49,1033-1038.

15. Kostyukova A.S, Gongadze G.M, Polosina Y.S, Bonch-Osmolovskaya E.A, Miroshnichenko M.L, Chernyh N.A, Obraztsova M.V, Svetlichny V.A, Messner P, Sleytr U, Jeanthone C, Prieur D. Investigation of sturucture and antigenic capasities of Thermococcales cell envelopes. Extremophiles, 1999,3,239-245.

16. Slobodkin A.I, Jeanthon C, L'Haridon S, Nazina T.N, Miroshnichenko M.L, Bonch-Osmolovskaya E.A. Dissimilatory reduction of Fe(III) by thermophilic bacteria and archaea in deep subsurface petroleum reservoirs of Western Siberia. Current Microbiol, 1999, 39, 99-102.

17. Miroshnichenko M.L, Hippe H, Stackebrandt E, Kostrikina N.A, Chernyh N.A, Jeanthon C, Nazina T.N, Belyaev S S, Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of hyperthermophilic Archaea in Western Siberia high temperature oil reservoir and characterization of Thermococcus sibiricus sp. nov. Extremophiles, 2001, 5, 85-91.

18. Alain K, Marteinsson V.T, Miroshnichenko M.L, Bonch-Osmolovskaya E.A, Prieur D, Binien J.-L. Marinitoga piezophila sp. nov, a rod-shaped thermo-piezophilic bacterium isolated under high hydrostatic pressure from a deep-sea hydrothermal vent. Intern. J. System. Evol. Microbiol, 2002, 52,1331-1339.

19. Haridon S, Miroshnichenko M. L, Hippe H, Fardeau M.-L, Bonch-Osmolovskaya E.A, Stackebrandt E, Jeanthon C. Thermosipho geolei sp. nov, a thermophilic bacterium isolated from a continental petroleum reservoir in Western Siberia. Intern. J. System. Evol. Microbiol, 2002,52,1327-1334.

20. Miroshnichenko M.L, Kostrikina N.A, L'Haridon S, Jeanthon S, Hippe S, Stackebrandt E, Bonch-Osmolovskaya E.A, Nautilia lithotrophica gen. nov, sp. nov, a thermophilic sulfur-reducing epsilon proteobacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Intern J. System. Evol. Microbiol, 2002, 52,1299-1304.

21. Miroshnichenko M.L, Kostrikina N.A, Chernyh N.A, Pimenov N.V, Tourova T.P, Antipov A.N, Spring S, Stackebrandt E, Bonch-Osmolovskaya E.A. Caldithrix abyssi gen. nov, sp. nov, a nitrate-reducing, thermophilic, anaerobic bacterium isolated from a Mid-

Atlantic Ridge hydrothermal vent, represents a novel bacterial lineage. Intern. J. System. Evol. Microbiol., 2003, 53,323-329.

22. Miroshnichenko M.L., LHaridon S., Jeanthon C., Antipov A.N., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tindall В., Schumann P., Spring S., Stackebrandt E„ Bonch-Osmolovskaya E.A. Oceantthermus profundus gen. nov., sp. nov., a thermophilic, microaerophilic facultatively chemolithoheterotrophic bacterium from a deep-sea hydrothermal vent. Intern. J. System. Evol. Microbiol., 2003,53,747-752.

23. Miroshnichenko M.L., LHaridon S., Nersessian O., Antipov A.N., Kostrikina N.A., Tindall В., Schumann P., Spring S., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C. Vulcanithermus mediatlanticus gen. nov., sp. nov., a novel memeber of the family Thermaceae from a deep-sea hot vent. Intern. J. System. Evol. Microbiol., 2003, 53, 11431148.

24. Парфенова H.B., Смольянинова H.C., Фалалеева М.И, Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Епринцев А.Т. Выделение малатдегидрогеназы из термофильных бактерий Vulcanithermus mediatlanticus и изучение ее субъединичного строения. Сборник «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». Вып.5, Воронеж, 2003.

25. Miroshnichenko M.L., Slobodkin A.I., Kostrikina N.A., LHaridon S., Nercessian O., Spring S., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C. Deferribacter abyssi sp. nov. - a new anaerobic thermophilic bacterium from the deep-sea hydrothermal vents of the Mid-Atlantic Ridge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53,1637-1641.

26. Miroshnichenko M.L., LHaridon S., Schumann P., Spring S., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C., Stackebrandt E. Caminibacter profundus sp.nov., isolated from a deep-sea hydrothermal vent, representing a novel thermophilic bacterium of the Nautiliales ord. nov., Nautiliaceae fam. nov., class "Epsilonproteobacteria" Int. J. System. Evol. Microbiol., 2004,54:41-45.

27. Miroshnichenko M.L., LHaridon S., Kostrikina N.A., Tindall В., Spring S., Schumann P., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E A., Jeanthon C. Thalassobacillus modestocaldus gen.nov., sp. nov., a strictly anaerobic nitrate-reducing bacterium from deep-sea hydrothermal vents. Extremophiles, в печати.

Обзоры

1. Мирошниченко М.Л. Термофильные микробные сообщества глубоководных гидротерм. Микробиология, 2004,73,5-18.

2. Бонч-Осмоловская, Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г., Слободкин А.И. Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, Выпуск 12, Москва, Наука, 2004.

Тезисы конференций

1. Obraztsova M.V., Kostyukova A.S., Polosina Y.S., Miroshnichenko M.L., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Identification of hyperthermophilic organotrophic marine archaea by immunochemical analyses. Thermophiles'98. International Conference, Brest, France, 1998. Absracts. B-P10.

2. Miroshnichenko M.L., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Kostrikina N.A., Pimenov N.A., Stepanov A.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of a novel anaerobic thermophilic bacterium from deep-sea hydrothermal field of Mid-Atlantic Ridge. Abstracts of 3rd International Congress on Extremophiles, Sept. 2000, Hamburg, Germany, p.71.

3. Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A., Jeanthon C., L'Haridon S., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A. Novel moderately thermophilic bacteria from the deep-sea hot vents. In: 2nd Symposium on deep-sea hydrothermal vent biology, Brest, France, October 8-12, 2001, p. 198.

4. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L, Sokolova T.G., Zavarzina D.G.. Slobodkin A.I.. Novel anaerobic lithotrophic thermophilic procaryotes from terrestrial and deep-sea volcanic habitats. In: International Conference "Thermophiles 2001", New Delhi (India), December, p. 3.

5. Alain K., Marteinsson V.T., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Prieur D., Birrien J-L. Marinitoga piezophila sp.nov., a rod-shaped thermo-piezophilic bacterium isolated under high hydrostatic pressure from a hydrostatic pressure from a deep-sea hydrothermal vent. In: International Conference "Thermophiles 2001", New Delhi (India), December, p. 44.

6. Miroshnichenko M.L., Jeanthon С., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A. A novel thermophilic bacterium from the deep-sea hydrothermal environment of East-Pacific Rise In: International Conference "Thermophiles 2001", New Delhi (India), December, p.47

7. Bonch-Osmolovskaya E.A., Pimenov N.V., Rusanov I.I., Miroshnichenko M.L., Jeanthon C. Acetate oxidation in terrestrial and deep-sea thermal habitats. In: The 4th International Congress on Extremophiles. Naples, September, 2002, p. 139.

8. Miroshnichenko M.L., LHaridon S., Nersessian O., Spring S., Stackebrandt E., Scumann P., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C. Phylogenetic and metabolic diversity at deep-sea hydrothemal vents. In: The 4th International Congress on Extremophiles. Naples, September, 2002, p. 164.

9. Fedosov D.V., Podkopaeva D A., Grabovich M.Y., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. Carbon metabolism and dissimilatory nitrate reduction of novel thermophile Caldithirx abyssi. In: The 4th International Congress on Extremophiles, Naples, September, 2002, p. 374.

10. Miroshnichenko M.L., Haridon S., Schumann P., Spring S., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C., Stackebrandt E. Nautiliales ord. nov.-a new order within the class Epsilonproteobacteria. In: International conference "Thermophiles", Exeter (England), 2003, p. 105.

11. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Zavarzina D.G., Pimenov., Haridon S., Jeanthon C. Cultured and uncultured acetate-metabolizing thermophilic anaerobes In: International conference "Thermophiles", Exeter (England), 2003, p. 82.

12. Бонч-Осмоловская E.A., Мирошниченко МЛ., Соколова Т.Г., Заварзина Д.Г., Пименов Н.В., Черных Н.А., Лебединский А.В. Разнообразие термофильных прокариот в вулканических и подземных местообитаниях. Международная конференция Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем. Улан-Удэ, 2003.

13. Bonch-Osmolovskaya Е.А., Miroshnichenko M.L., Zavarzina D.G., Sokolova T.G., Slobodkin A.I. Metaboliic diversity of anaerobic moderately thermophilic bacteria from terrestrial and deep-sea vulcanic habitats. In: 1 FEMS Congress of European Microbiologosts, Ljubljana (Slovenia), 2003, p. 41.

14. Miroshnichenko M.L., Haridon S., Nersessian O., Schumann P., Spring S., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C. Novel thermophilic bacteria from deep-sea

hydrothermal vents. In: 1 FEMS Congress of European Microbiologosts, Ljubljana (Slovenia), 2003, p. 180.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 24.11.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 3,5. Тираж 100 экз. Заказ 1174. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

»2 7 2 5 1

РНБ Русский фонд

2005-4 49959