Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лектин красной водоросли Tichocarpus crinitus. Биологическая активность лектинов морских гидробионтов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Лектин красной водоросли Tichocarpus crinitus. Биологическая активность лектинов морских гидробионтов"

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВ Олег Викторович

Пектин красной водоросли ЪсЬосагриз сппЛив. Биологическая активность лектинов морских гидробионтов

03 00 04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3172226

Владивосток-2008 г

003172226

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель

доктор химических наук, старший научный сотрудник Лукьянов П А

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Васьковский В Е

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Новгородцева Т.П

Дальневосточный государственный университет

Защита состоится « 3 » июля 2008 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232) 314-050, e-mail science@piboc dvo ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН)

Текст автореферата размещен на сайте www piboc dvo ru

Автореферат разослан « 2 » июня 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук ЛЬ^^^

старший научный сотрудник Авилов С А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность В настоящее время в биохимических исследованиях все большее внимание уделяется лектинам Эти белки обратимо и с высокой специфичностью связываются с моно- и олигосахаридами, как с находящимися в растворе, так и с локализованными на клеточной поверхности .Пектины не проявляют каталитической активности и, в отличие от антител, не являются продуктами иммунного ответа (Лахтин, 1989)

Быстрое развитие исследований в области гликобиологии в последние двадцать лет позволило выявить ключевую роль лектинов в межклеточных взаимодействиях, что резко увеличило интерес к ним В настоящее время объем этих исследований и их характер позволяют говорить о самостоятельной области науки - лектинологии (Луцик и др , 1981)

Лектины принимают участие в самых тонких процессах на клеточном, субклеточном и органоидном уровнях в живых организмах Эти процессы включают клиренс гликопротеинов из циркуляторной системы, симбиотическую или патогенную адгезию микроорганизмов к тканям хозяина, специфическое связывание опухолевых клеток с клетками различных органов при метастазировании Характерной особенностью лектинов является их высокая специфичность к структуре углеводной компоненты биомолекул, например, к терминальным остаткам галактозы Следовательно, лектины могут эффективно использоваться для установления химической структуры углеводных детерминант и характеристики их распределения на клеточной поверхности Все шире используются лектины в качестве биохимических реагентов в экспериментальной цитохимии, диагностике некоторых заболеваний и, наконец, в биотехнологических процессах получения сложных углевод-содержащих веществ Благодаря уникальным биологическим свойствам, лектины находят применение в качестве противовирусных, антимикробных, иммуностимулирующих агентов (Лоенко и др , 1992)

Несмотря на то, что к настоящему времени лектины найдены во многих живых организмах, включая растения, вирусы и животных, поиск новых источников лектинов и их характеристика остаются актуальной задачей Изучение свойств и функций этих соединений вносит вклад в научные представления об углевод-белковом взаимодействии и открывает новые возможности для решения медико-биологических задач

Цель работы Целью данной работы является поиск новых источников лектинов среди дальневосточных водорослей, выделение лектина из водоросли Tichocarpus cnnitus, изучение его физико-химических свойств, исследование биологической активности нового лектина и ранее выделенных лектинов из морских беспозвоночных, разработка диагностических тест-систем на основе лектинов морских гидробионтов

Задачи исследования Для достижения цели были поставлены следующие задачи

1 провести поиск лектинов в экстрактах водорослей-макрофитов Японского моря,

2 выделить и охарактеризовать новый лектин из красной водоросли Tichocarpus crimtus (TCL),

3 определить митогенную, цитокин-индуцирующую, антимикробную активности лектинов, исследовать взаимодействие лектинов с фитопатогенными вирусами,

4 разработать метод твердофазного лектин-ферментного анализа на основе лектинов морских гидробионтов для выявления гликоформ углеводсодержащих антигенов

Положения, выносимые на защиту.

1 Среди дальневосточных водорослей-макрофитов найден перспективный источник лектинов - красная водоросль Т cnnitus

2 Лектин TCL, выделенный из Т cnnitus, по физико-химическим свойствам относится к термостабильным, Са2*-независимым лектинам, проявляющим специфичность к высокомолекулярным гликопротеинам

3 Пектины морских гидробионтов обладают биологической активностью митогенной, цитокин-индуцирующей, антимикробной, противовирусной

4 Тест-системы на основе TCL и пектина из мидии Crenomytilus grayanus (CGL) перспективны для диагностики онкопатологий

Научная новизна и практическая ценность работы Впервые проведен поиск лектинов в экстрактах дальневосточных водорослей-макрофитов Выделен в гомогенном состоянии и частично охарактеризован новый лектин TCL из красной водоросли Т cnnitus Впервые исследованы митогенная, цитокин-индуцирующая, антимикробная и антивирусная активности лектинов морских гидробионтов В эксперименте in vivo показана высокая антивирусная активность лектина CGL в отношении вируса огуречной мозаики, что позволяет рассматривать этот лектин в качестве перспективного экологически безопасного средства защиты растений от вирусов

Разработанные на основе лектинов морских гидробионтов тест-системы позволяют на ранних этапах диагностировать начавшийся онкологический процесс и могут быть рекомендованы для клинического использования

Апробация результатов Материалы диссертационной работы были представлены на 3-ем Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, 2003, Международном форуме по проблемам науки, техники и образования, Москва, 2003, 7-ой Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей», Владивосток, 2005, Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2006, Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, 2005, Ю"1 International conference on Applied Phycology, Kunming, China, 2005, Annual Conference of the Society for Glycobiology, USA, 2006, 21st Pacific Science Congress, Okinawa, Japan, 2007

Публикации По теме диссертации опубликовано 6 статей и 8 тезисов докладов

Объем и структура диссертации Работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 189 цитируемых работ Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 29 рисунков

Используемые сокращения. АКГ - альфа-1-кислый гликопротеин, ГА-гемагглютинирующая активность, ИЛ-6 - интерлейкин-6, ИФН-у - интерферону, ИФА - иммуноферментный анализ, ЛПС - липополисахарид, РЭА - раково-эмбриональный антиген, ТЛФА - твердофазный лектин-ферментный анализ, ФНО-а - фактор некроза опухоли-a, CGL - лектин из мидии Crenomytilus grayanus, DTL, DTL-A - лектины из асцидии Didemnum tematanum, Fet -фетуин, Fue - L-фукоза, Gal - D-галактоза, GalNAc - N-ацетил-О-галактозамин, Glc - D-глюкоза, GIcNAc - N-ацетил-О-глкжозамин, GlcLIA -глюкуроновая кислота, Man - D-манноза, MurNAc - N-ацетилмурамовая кислота, NANA - N-ацетилнейраминовая кислота, Ova - овальбумин, Ovo -овомукоид, PSM - муцин из желудка свиньи, SVL-1, SVL-2 - лектины из морского червя Serpula vermicularis, TCL - лектин из красной водоросли Tichocarpus ennitus

Автор выражает глубокую и искреннюю признательность научным руководителям кхн ИВ Чикаловец и дхн ПА Лукьянову за неоценимую помощь в проведении экспериментов, критику и внимание при написании работы, а также всем сотрудникам лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН за поддержку и ценные советы Автор благодарен директору ТИБОХ ДВО РАН академику Стонику В А за предоставленную возможность проведения исследований Выражает свою признательность к х н Сове В В за критику при оформлении автореферата Автор выражает благодарность за помощь при выполнении отдельных разделов работы сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН д б н Недашковской О И за предоставление культур микроорганизмов, д б н Реунову А В за проведение исследований по взаимодействию лектинов с фитовирусами методом электронной микроскопии, к б н Сергеевой О С за определение видовой принадлежности водорослей, Сидорину ЕВ и Корнейчук Н Г за определение изоэлектрической точки, сотрудникам лаборатории вирусологии БПИ ДВО РАН и, в частности, к б н Какарека Н Н за предоставление препаратов фитовирусов и изучение антивирусной активности лектинов in vivo Особую благодарность выражает академику Оводову ЮС- вдохновителю развития лектинологии в нашем институте

Работа выполнена при финансовой поддержке фантов ДВО РАН № 06-III-В-05-134, № 06-III-A-05-124, № 06-1-П12-040, НШ-5796 2006 4 и HUJ-2383 2008 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертации и показано ее научно-практическое значение

Первая глава - литературный обзор, в котором дана общая характеристика лектинов и их современная классификация Рассмотрены некоторые биологические активности лектинов Уделено внимание процессам перегликозилирования гликоконъюгатов при неопластической трансформации клетки Рассмотрены методы применения лектинов в различных областях

Во второй главе описаны объекты и методы исследования, использованные в работе

В третьей главе приведены основные результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН из морских беспозвоночных были выделены и охарактеризованы лектины, в том числе Са1/Са1ЫАс-специфичный лектин из мидии Сгепоту^Шэ дтуапив (СвЦ (ВеЬдоЛэеуа е! а1, 1998а), ФсМАсЯЗаМАс-специфичный лектин из асцидии ОкЗетпит fета(апит (ОТ1_-А) (Мо1сЬапоуа е( а1, 2005), С1сЫАс-специфичный лектин из этой же асцидии (ОН) (ВекэдоПэеуа е! а1, 1998Ь), маннан-связывающий БХ/Ы и С1сМАс-специфичный Б\/1--2 лектины из морского червя БегриШ vermlcularls (Мо1сИапоуа е1 а1, 2007)

Вместе с тем, поиск новых источников лектинов продолжает оставаться актуальной задачей Используя близость уникальной сырьевой базы Японского моря, было бы интересно исследовать лектинную активность в экстрактах водорослей, которые, как известно, относятся к числу сравнительно новых источников лектинов Выделение и изучение свойств лектина из водоросли позволило бы, с одной стороны, сравнить его активность с активностью выделенных ранее лектинов из морских беспозвоночных, а с другой - расширить спектр соединений, на основе которых могут быть созданы диагностические тест-системы для выявления перегликозилирования, связанного с различными патологическими процессами

1. Поиск лектинов в экстрактах морских водорослей

В качестве объектов исследования были выбраны водоросли, произрастающие в прибрежной зоне залива Петра Великого Японского моря Всего проанализировали 28 видов водорослей, относящихся к 3 отделам Лектинную активность определяли методом гемагглютинации (Табл 1)

Таблица 1 Лектинная активность экстрактов водорослей

Отдел, порядок, вид Титр ГА Титр ГА после обработки Р\/Р

Rhodophyta

Nemaliales

Nemalion vermiculare 1 2 н 0

Cryptonemiales

Bossiella cretacea 1 8 н 0

Grateloupia divaricata н а н о

Tichocarpus cnnitus 1 128 1 128

Grateloupia turuturu н а н 0

Gigartinales

Chondrus sp н а н 0

Ceramiales

Ceramium kondoi н а Н 0

Rhodomela mumta 1 4 н 0

Neorhodomela lanx н а н 0

Phaeophyta

Desmarestiales

Dichloria viridis 1 16 Н О

Laminariales

Chorda Шит 1 16 Н О

Undaria pinnatifida 1 64 11

Costaria costata 1 16 н О

Продолжение таблицы 1

Ralfsiales

Analipus japomcus 1 32 H 0

Chordariales

Leathesia difforms н а H 0

Chordaria flagelhformis 1 32 H 0

Dictyosiphonales

Punctana p/aniagmea н а H 0

Scytosiphonales

Scytosiphon lomentana н а H 0

Fucales

Cystosena crassipes 1 1024 н а

Cocophora langsdorfii 1 128 1 1

Sargassum miyabei 1 8192 н а

Sargassum pallidum 1 128 н а

Dictyotales

Dictyopteris divancata 1 64 1 1

Dictyota dichofoma н а H 0

Polysiphona nmorrown н а H 0

Chlorophyta

Siphonocladales

Chaetomorpha sp н а H 0

Siphonales

Codium fragile н а H 0

Ulvales

UIva femstrata 1 2 H 0

Примечание титр ГА характеризует последнее разведение лектин-содержащего раствора, при котором еще наблюдается ГА, н а - не агглютинирует, н о - не определяли

Дальнейший интерес представляли экстракты водорослей с титром 1 64 и выше

Интенсивная окраска экстрактов водорослей предполагала присутствие полифенолов (фпоротаннинов), которые, как известно, способны агглютинировать эритроциты Наиболее эффективным способом удаления полифенолов является обработка поливинилпирролидоном (PVP) После обработки PVP гемагглютинирующая активность сохранялась лишь в экстрактах трех видов бурых водорослей и красной водоросли Т cnnitus, что указывало на лектинную природу соединений, вызывающих агглютинацию эритроцитов, в то время как для остальных экстрактов наблюдалось полное исчезновение ГА Вероятно, активность этих экстрактов была обусловлена наличием полифенольных соединений, а не лектинов, как предполагалось ранее

Таким образом, для дальнейшего исследования был выбран распространенный в заливе Петра Великого вид красной водоросли Т cnnitus

2. Выделение и очистка лектина TCL из красной водоросли Т. crinitus

Схема выделения лектина включала несколько стадий осаждение белковых фракций из водно-солевого экстракта сульфатом аммония, гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе CL-4B (Ph-сефароза), гель-фильтрационная хроматография и последующая рехроматография активной

фракции на колонке Бирегс1ех 75 НРЗ 10/30. На каждой стадии выделения определялась ГА и содержание белка.

Рис. 1. Гидрофобная хроматография белковой фракции (75% насыщение сульфатом аммония) экстракта красной водоросли Т. отл/Туй на колонке (1,3x46 см) с РЬ-сефарозой С!_-4В.

0 .иНА..........................I.........................II.........тМ.Ли<'■'!'!■ 0

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 Номер фракции

Рис. 2. Гель-фильтрация активной фракции после гидрофобной хроматографии на колонке (1x30см) с 5ирегс!ех 75 Н1Ч 10/30.

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Номер фракции

9 11 13 15 17 19 21 23 25 Номер фракции

Рис. 3. Рехроматография ТСЬ на колонке с 5ирегс!ех 75 НИ 10/30.

— А280 ---.--Титр ГА

Белковую фракцию, полученную при сульфатном осаждении (75% насыщение), растворяли в 0,025 М трис буфере рН 7,4 (ТВ), содержащем 4 М ЫаС1, подвергали гидрофобной хроматографии на РИ-сефарозе С1--4В. Элюирование белков проводили ступенчатым градиентом ЫаС1 (от 4 М до 0 М) в ТВ (Рис. 1).

Фракции, соответствующие пику 3 на кривой элюции и обладающие ГА (ТВ с 0,15 М №С1), объединяли, концентрировали и хроматографировали на колонке с Эирегс1ех 75 НИ 10/30 (Рис. 2).

Фракция, соответствующая пику 1 (Рис. 2) и обладающая ГА, после рехроматографии на этой же колонке элюировалась одним симметричным пиком (Рис. 3.), что свидетельствует о чистоте выделенного лектина.

Таблица 2. Очистка лектина из красной водоросли Т. спп^цб

Стадия очистки

Общий белок*, мг

Общая ГА**

Специфическая ГА***

Экстракция Осаждение (ЫН4)2304 Хроматография на

Р1>сефарозе Хроматография на

ЭирегЬех 75 Рехроматография на Зирегс1ех 75

360 38

0,624

0,042

0,022

76800 20480

6144

512

384

213 539

9846

12190

17454

'Определен по методу Лоури (1о\д/гу е! а1., 1951) "Общая ГА = Титр ГА х \/0бЩий (мл) ""Специфическая ГА = Общая ГА / Общий белок (мг)

В итоге получали лектин со степенью очистки более чем 80 раз (Табл. 2). Выделенный лектин был гомогенным по данным БОБ-электрофореза (Рис. 4). Лектин имел молекулярную массу 41 кДа и являлся мономером, поскольку и в восстанавливающих, и в невосстанавливающих условиях давал идентичную полосу.

1

О

55 000 ОТ

43 000 *■», 34 000 ** 26 000

17 000 <

Рис. 4. БОБ-электрофорез в 12,5 % акриламидном геле:

1 - стандарты молекулярных масс;

2 - ТС1. в невосстанавливающих условиях; 11 000 И 3 - ТС1. в восстанавливающих условиях;

4 - исходный экстракт.

Большинство лектинов, выделенных из морских водорослей, имеют низкую молекулярную массу (4-17 кДа), однако известны лектины из некоторых видов морских водорослей, молекулярная масса которых близка к полученной для ТСЬ

3 Физико-химические свойства ТС1.

Аминокислотный состав ТСЬ (Табл 3) подобен составу лектинов из других водорослей и характеризуется повышенным содержанием кислых (глутаминовой и аспарагиновой) и гидроксиаминокислот (серина и треонина) и малым количеством основных аминокислот, что подтверждается величиной изоэлектрической точки - р1 4,93

По данным фенол-сернокислотного метода молекула ТС1. содержит 9,7% углеводов, следовательно, лектин является гликопротеином, как и некоторые другие лектины морских водорослей Сгаа1апа Ьигза-раз(опз, ЕпапЬос/аМа с1иреггеу1 и Саи1егра сиргеззо/без

Таблица 3 Аминокислотный состав лектина TCL

Аминокислота Содержание, % Аминокислота Содержание, %

Asp 7,43 Cys 4,94

Thr 9,04 Ile 4,15

Ser 15,56 Leu 5,89

Glu 9,14 Туг 2,89

Pro 8,59 Phe 2,99

Gly 1,76 His 0,69

Ala 8,84 Lys 5,47

Val 7,20 Arg 4,70

Met - Trp H 0

Примечание «-» - не обнаружено, н о - не определяли

Одной из важных характеристик лектинов является их углеводная специфичность Углеводную специфичность TCL изучали методом ингибирования ГА различными моносахаридами и гликопротеинами (Табл 4) Как видно из таблицы, гемагглютинирующая активность TCL не ингибировалась простыми моносахаридами, а подобно другим лектинам из водорослей, ингибировалась гликопротеинами Среди исследованных гликопротеинов лишь PSM и Fet являлись ингибиторами реакции гемагглютинации

Известно, что PSM содержит О-связанные углеводные цепи, Fet имеет как О-, так и N-связанные цепи Ova, Ovo, АКГ, содержащие только N-гликаны, не проявляли ингибирующей активности На основании этого можно сделать вывод, что ингибирующая активность обусловлена именно О-связанными углеводными цепями или цепями муцинового типа

Для определения рН-зависимости активности TCL проводили реакцию гемагглютинации лектина в буферах с разными рН Наилучшую активность лектин проявлял при рН 7,0-8,0, при рН 5,0-6,0 активность падала на 30%, на 50% уменьшалась при рН 9,0 При рН 4,0 и 10,0 ГА падала до нуля

Таблица 4 Определение углеводной специфичности TCL

Ингибиторы Минимальная концентрация, вызывающая ингибирование ГА, мг/мл

Gal н и

GalNAc н и

Glc н и

GlcNAc н и

Man н и

Fue н и

NANA н и

Ova н и

Ovo н и

АКГ н и

PSM 0,031

Fet 0,25

Примечание н и - не ингибирует

Для определения термостабильности TCL инкубировали при разных температурах в течение 30 минут, после чего определяли ГА При нагревании до 50°С активность лектина не менялась, при нагревании до 60°С активность падала на 20%, после инкубации при 90°С лектин продолжал агглютинировать, хотя активность уменьшалась вдвое Известно, что такая термостабильность встречается у лектинов из водорослей Подобной устойчивой активностью обладает лектин из красной водоросли Нурпеа japónica

Для определения пределов термостабильности TCL прогревали при 90°С в течение 60 минут ГА анализировали каждые 10 минут Уже через 10 минут активность падала вдвое, через 40 минут происходило резкое падение активности лектина, а через 60 минут лектин полностью инактивировался

Одной из важных характеристик лектинов является зависимость их активности от ионов двухвалентных металлов Для сохранения активности большинства лектинов красных водорослей не требуется присутствие ионов Однако активность некоторых лектинов из красных водорослей, как и большинства растительных лектинов, зависит от присутствия катионов Ca2t, Mn2t и Mg2* Нами показано, что TCL является металлонезависимым лектином, поскольку ни диализ против буферного раствора, содержащего трилон-Б, ни добавление двухвалентных катионов (кальция, магния) к реакционной смеси не изменяли ГА лектина

4 Митогенная активность лектинов

Некоторые лектины являются митогенами, активируя лимфоциты и индуцируя их деление Такие лектины проявляют свойства поликпональных активаторов, те они активируют лимфоциты, не различая их антигенной специфичности Это свойство лектинов используется для исследования передачи сигналов в клетках и анализа биохимических процессов, происходящих во время стимуляции лимфоцитов in vitro Наиболее изученными в этом плане являются лектины высших растений В настоящее

время показано, что кроме пектинов наземных растений митогенным потенциалом обладают и лектины морских водорослей Для морских беспозвоночных также имеются данные о выделении лектинов, обладающих митогенной активностью, но информация о таких лектинах ограничена

Нами были исследованы митогенные свойства TCL, а так же лектинов морских беспозвоночных (CGL, DTL-A, DTL, SVL-1, SVL-2) в сравнении с известным митогеном - конканавалином A (Con А) Для этого использовали МТТ-тест (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ), который заключается в способности митохондрий живых клеток окислять соль тетразолия до формазана, меняя цвет раствора с желтого на синий Оптическая плотность получаемого раствора зависит от степени активации клеток и замеряется на планшетном спектрофотометре

Только TCL и SVL-1 стимулировали рост лимфоцитов, однако в гораздо меньшей степени, чем известный растительный лектин конканавалин А Оптимальная для активации концентрация TCL совпадала с таковой для Con А (0,78 мкг/мл), однако активность была ниже почти на 50% SVL-1 активировал митоз лимфоцитов сильнее, чем лектин из красной водоросли и незначительно слабее Con А, однако это происходило при гораздо большей концентрации лектина - 25 мкг/мл Остальные лектины не оказывали значительного влияния во всем интервале концентраций (0,78-100 мкг/мл)

Таким образом, наибольший интерес для дальнейших исследований в этом направлении вызывает новый лектин из красной водоросли Хотя его митогенные свойства оказались и не столь сильными как у Con А, но, возможно, они будут значительнее при стимуляции клеток других млекопитающих Известно, что ответ лимфоцитов разных млекопитающих отличается в зависимости от источника митогена

5 Цитокин-индуцирующая активность лектинов

Для изучения цитокин-индуцирующей активности лектинов использовали клетки периферической крови доноров Исследовали способность лектинов вызывать продукцию провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6 и ИФН-у Уровень цитокинов определяли в супернатантах, полученных после инкубации клеток с лектинами в присутствии и отсутствие ЛПС, который является известным индуктором цитокинов и представляет собой основной компонент клеточных стенок грамотрицательных бактерий Концентрацию цитокинов определяли с помощью специфических тест-систем

Все исследуемые лектины вызывали повышение синтеза провоспалительных цитокинов, что может быть связано как с изменением их внутриклеточного синтеза, так и с их ускоренным высвобождением В максимальной концентрации все лектины, за исключением TCL, увеличивали продукцию ФНО-а в среднем в 4 раза В минимальной концентрации наилучшими индукторами этого цитокина оказались DTL, DTL-A и SVL-1 (Рис 5) Синтез ИЛ-6 вызывали практически одинаково все лектины, уровень цитокина увеличивался на 26-40% Лишь CGL в концентрации 5 мкг/мл снижал способность клеток к продукции ИЛ-6 на 8% Максимальный уровень ИФН-у наблюдался в присутствии лектина из мидии Концентрация цитокина возрастала более чем в 250 раз Другие лектины значительного эффекта не вызывали (Рис 5)

ИФН-у

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 О

и

ИФН-у

кУ > гУ > У

о ^ * ^

1400 п

1200 I 1000 ] 800 600 400 200

.V-

С л'

Рис. 5. Уровень продукции цитокинов клетками периферической крови доноров под действием лектинов без предварительной стимуляции ЛПС (А) и с добавлением ЛПС (Б). □- контроль без лектина, Ш- концентрация лектина 100 мкг/мл, ^ - концентрация лектина 5 мкг/мл

При активировании клеток ЛПС отмечено некоторое снижение уровней цитокинов при добавлении лектинов и только добавление Э\/Ы значительно (на 98%) снижало уровень интерферона-у при концентрации 5 мкг/мл.

Таким образом, наибольший интерес представляют лектины ССЦ Б\/1_-1 и ТС1-, иммуномодулирующее действие которых обусловлено не только

способностью вызывать продукцию цитокинов, но и снижать их гиперэкспрессию при эндотоксическом шоке

б Взаимодействие лектинов с микроорганизмами

Известно, что пектинам беспозвоночных часто отводится защитная функция Пектины морских беспозвоночных избирательно агглютинируют грамположительные и грамотрицательные бактерии, ассоциированные с морскими беспозвоночными в естественных условиях, и тем самым препятствуют дальнейшему распространению микроорганизмов (Kamiya, 1995)

Полагают, что лектины водорослей обладают сходными функциями Они вовлечены в процессы симбиоза и защиты водоросли, так же как и лектины высших растений

6 1 Агглютинация микроорганизмов пектинами

Было изучено взаимодействие CGL, DTL, DTL-A, TCL с некоторыми представителями грамположительных (Bacillus subtilis АТСС 6633т, Salinibactenum amurskyense КММ 3673т, Staphylococcus aureus АТСС 21027т) и грамотрицательных (Arembacter troitsensis КММ 3674т, Chryseobactenum scophthalmum CIP 104199т, Escherichia coli 3254, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853т) бактерий, а также клетками Candida albicans КММ 455

Суспензии микрооганизмов в равной концентрации смешивали с растворами лектинов и после инкубации визуально оценивали степень агрегации по трехбалльной системе (Табл 5)

Как видно из данных таблицы, лектины по-разному вызывали агглютинацию тест-культур Сопоставимые результаты показали CGL и DTL, которые агглютинировали одни и те же штаммы Наличие агглютинации свидетельствует о вероятной защитной функции этих лектинов в организме животных DTL-A агглютинировал только один штамм, a TCL не вызывал агрегации микробных клеток

6 2 Изучение связывания лектинов с микроорганизмами методом ТЛФА Отсутствие агглютинации не исключает взаимодействия лектинов с бактериями Чтобы определить наличие или отсутствие связывания лектинов с бактериями, использовали метод ТЛФА Он заключается во взаимодействии лектина, меченного пероксидазой, с микроорганизмами, адсорбированными на полистирольной поверхности

Как видно из рисунка 6, для всех лектинов отмечалось концентрационно-зависимое связывание с микроорганизмами

Уровень связывания лектинов с некоторыми штаммами микроорганизмов не всегда определялся наличием или отсутствием в их клеточных стенках специфичных для исследуемых лектинов моносахаридов (Рис 6, Табл 5) Возможно, это связано с тем, что моносахариды могут входить в состав углеводных цепей, недоступных для углевод-связывающего домена лектина

Таблица 5 Агглютинация микроорганизмов пектинами

Микроорганизмы Лектины

Штаммы Углеводы клеточной стенки CGL DTL DTL-A TCL

В subtihs GlcNAc, GalNAc, Gal, ManNAc, Glc, GlcUA +++ ++ + -

S amurskyense S aureus H 0 GlcNAc, MurNAc ++ +++ — —

A troitsensis H 0 - - - -

С scophthalmum E coli H 0 Glc, Gal, GlcNAc +++ +++ _

P aeruginosa С albicans Glc, Man, FucNAc GlcNAc, Man +++ ++ _

Примечание «+++», «++», «+» - отличная, хорошая и слабая агглютинация соответственно, «-» - отсутствие агглютинации, н о - не определено

С GL DTL

DTI-A TCL

Рис 6. Взаимодействие конъюгатов пектинов с микроорганизмами о- А troitsensis, □- В subtihs, А- С albicans, * - С scophthalmum, * - Е coli, ♦ -Р aeruginosa, + - S amurskyense, ■ - S aureus

6 3 Ингибирование связывания пектинов с микроорганизмами

Характер связывания пектинов с микроорганизмами определяли методом ингибирования с использованием ТЛФА

В качестве ингибиторов использовали коллаген (тип 1), гепарин, а также специфичные для пектинов моносахариды (Gal, GIcNAc и GalNAc) и гликопротеин PSM Выбор гепарина и коллагена в качестве ингибиторов объясняется наличием гепарин-связывающего домена у DTL-A и коллаген-связывающего домена у CGL, что было показано нами ранее Как видно из таблицы 6, связывание лектинов со всеми микроорганизмами ингибируют специфичные для данных лектинов моносахариды и гликопротеин PSM, в то время как гепарин и коллаген не обладали ингибирующим эффектом Это может свидетельствовать о том, что связывание лектинов с микроорганизмами происходит по механизму углевод-белкового взаимодействия

Таблица 6 Ингибирование связывания конъюгатов лектинов с _____микроорганизмами__

Микроорганизмы IC50 (мг/мл) CGL IC50 (мг/мл) DTL ICso (мг/мл) DTL-A IC50 (мг/мл) TCL

Gal Коллаген GIcNAc Коллаген GalNAc Гепарин PSM Коллаген

В subtilis 0,255 H и 0,235 H и 0,350 H и 0,620 H и

S amurskyense S aureus 1,0 0,287 H и H и 0,055 0,156 H и H и 0,525 1,70 H и H и 0,100 0,250 H и H и

A troitsensis 0,127 H и 0,057 H и >5 H и 0,495 H и

С scophthalmum E coli 0,250 0,205 H и H и 0,410 0,059 H и H и 4,30 1,08 H и H и 0,134 0,028 H и H и

P aeruginosa 0,261 H и 0,132 H и 1,00 H и 0,011 H и

С albicans 0,441 H и 0,097 H и 0,112 H и 0,660 H и

Примечание *1С5о - концентрация, необходимая для 50 % ингибирования связывания, н и - не ингибирует

6 4 Влияние лектинов на рост культур микроорганизмов Известно, что некоторые лектины влияют на рост культур микроорганизмов in vitro В связи с этим было исследовано влияние лектинов на рост тест-культур Микроорганизмы выращивали в культуральном планшете в присутствии лектинов, а результат регистрировали турбидиметрически Как видно из представленных результатов (Табл 7), лектины обладали как стимулирующим (> 100 %), так и ингибирующим (< 100 %) эффектами

Ингибирующей активностью обладали CGL и DTL, в концентрации 500 мкг/мл они ингибировали четыре и шесть микроорганизмов, соответственно из 8 исследованных Максимум ингибирующего эффекта достигался через 20 часов инкубации Оба лектина были неактивны в отношении бактерии С scophthalmum и гриба С albicans

Ранее было показано, что CGL и DTL агглютинируют бактерии В subtihs, S aureus и £ coli, чем, вероятно, и объясняется ингибирующий эффект этих лектинов

DTL-A и TCL не проявляли ингибирующего эффекта, а наоборот стимулировали рост некоторых микроорганизмов Так, DTL-A на всем периоде

инкубации стимулировал рост S aureus, Е coli и Р aeruginosa, a TCL - В subtilis и S aureus

Таблица 7 Влияние лектинов на рост культур микроорганизмов

Микроорганизмы CGL DTL DTL-A TCL

В subtilis 15 17 - 143

S amurskyense 13 24 - -

S aureus 32 51 113 119

A troitsensis - 14 - -

С scophthalmum - - - -

E coli 54 79 119 -

P aeruginosa - 33 116 -

С albicans - - - -

Примечание данные турбидиметрии в % (за 100% принят рост культуры микроорганизмов без лектинов), «-» - отсутствие влияния

Наличие ингибирующего эффекта, особенно в отношении морских бактерий S amurskyense (CGL, DTL) и A troitsensis (DTL), подтверждает ранее высказанное нами предположение о выполнении защитных функций этими лектинами в организме животных Интересно, что агглютинация не всегда сопровождалась ингибированием роста тест-культуры На специфичность и уровень взаимодействия между лектинами и рецепторами на поверхности микробной клетки влияет много факторов плотность рецепторов, время, молекулярная масса лектина и присутствие гидрофобных сайтов рядом с углеводным рецептором Возможно, взаимодействие лектинов с поверхностными рецепторами микроорганизмов приводит к изменению потока питательных веществ, в зависимости от этого проявляется ингибирующий или стимулирующий эффект

7. Взаимодействие лектинов с вирусами

Показано, что большинство вирусов животных содержат гликопротеины, которые играют важную роль в инфицировании клетки .Пектины способны взаимодействовать с рецепторами внешней поверхности некоторых вирусов, блокируя их проникновение в клетки человека и животных (Ogino et al, 1999) В настоящий момент данные о противовирусных свойствах лектинов ограничены В основном они касаются лектинов из высших растений Не так давно показано, что лектины из морских беспозвоночных (CGL, DTL, DTL-A, SVL-1, SVL-2) обладают противовирусным действием, ингибируя взаимодействие ВИЧ с клетками хозяина (Лукьянов и др, 2007) Основываясь на этих результатах, представляло интерес дальнейшее исследование взаимодействия выделенных лектинов как с вирусами человека, так и с фитопатогенными вирусами

Для изучения взаимодействия лектинов с вирусами нами были взяты штаммы типичных представителей сферических и нитевидных РНК-вирусов -вирус огуречной мозаики (ВОМ, 6 штаммов) и Y-вирус картофеля (YBK, 6 штаммов) Они являются одними из наиболее вредоносных и поражают повсеместно картофель, перец, табак, томат, в значительной степени снижая урожайность этих культур

Показано, что содержание и состав эндогенных лектинов изменяется в процессе формирования некрозов на листьях табака, инфицированных вирусом табачной мозаики (ВТМ). Вероятно, пектины определенным образом участвуют в противовирусной защите растения. Сведения о наличии углеводных структур в вирусах растений весьма ограничены. Гликопротеины в составе фитовирусов найдены у нескольких родов со сложным капсидом -рабдо-, тоспо-, фиджи- и, возможно, тенуивирусы (РеИИоЯ е1 а1., 1997) и у X-вируса картофеля (Тогг\п\ е1 а!., 1994).

Нами были исследованы молекулярные механизмы взаимодействия лектинов из морских гидробионтов с фитовирусами.

7.1. Изучение связывания пектинов с фитовирусами методом ТЛФА Для определения связывания лектинов с ВОМ и YBK адсорбировали вирусы на планшете для ИФА, затем вносили двукратные разведения конъюгатов лектинов (TCL, CGL, DTL, DTL-A, SVL-1 и SVL-2) с пероксидазной меткой. Как видно из рисунка 7, для всех лектинов отмечалось связывание с вирусами.

CGL DTL OTL-A SVL-1 SVL-2 TCL CGL DTL СШ.-А SVL-1 SVL-2 TCL

Рис. 7. Взаимодействие лектинов с ВОМ (А) и YBK (Б). Представлены усредненные данные по связыванию каждого лектина с шестью штаммами вирусов ±SD.

7.2. Ингибирование связывания лектинов с фитовирусами

Характер взаимодействия лектинов с вирусами определяли конкурентным методом ТЛФА по ингибированию их связывания специфичными гликопротеинами, моносахаридами и маннанами различной структуры.

Ингибирование связывания лектина с вирусами наблюдалось только для CGL и TCL. Это позволяет предположить, что механизм взаимодействия CGL с обоими вирусами, a TCL с ВОМ углевод-белковый. Взаимодействие остальных лектинов не отменялось специфичными для них ингибиторами, установление природы связывания требует дальнейших исследований.

Для выяснения характера связывания лектинов из мидии и водоросли с вирусами был определен углеводный состав ВОМ и YBK методом ПЖХ и Г7КХ-МС. Как в ВОМ, так и в YBK были обнаружены моносахариды: рибоза, манноза, глюкоза и галактоза. Рибоза входит в состав вирусной РНК,

остальные углеводы, возможно, являются компонентами капсидных гликоконъюгатов Ранее было показано гликозилирование капсидного белка вируса шарки (оспы) сливы, который, как и YBK, является членом рода Potyvirus (Fernandez-Fernandez et al, 2002)

Для дальнейшего изучения возможных механизмов связывания лектинов с фитовирусами мы исследовали взаимодействие CGL с дрожжевой и выделенной из ВОМ РНК, поскольку известно, что галектин-3, специфичный как и CGL к галактозе, может связываться с РНК и таким образом участвовать в регуляции сплайсинга РНК в ядре (Leffler, 1997) Наблюдалось концентрационно-зависимое связывание лектина как с дрожжевой, так и с вирусной РНК, которое отменялось специфичными моносахаридами, но не рибозой Возможно, взаимодействие CGL с фитовирусами обусловлено не связыванием с углеводными остатками, а вызывается полианионным взаимодействием с РНК Если углевод-связывающий домен лектина перекрывается с РНК-связывающим доменом, будет наблюдаться ингибирование связывания как специфичными для лектина моносахаридами, так и нуклеиновой кислотой

Похожие результаты получены и для TCL Показано, что связывание лектина со штаммами ВОМ отменяется дрожжевой РНК, что также может быть связано с полианионным взаимодействием

Электронная микроскопия препарата YBK в присутствии CGL показала явное сродство лектина к поверхности вируса При изучении снимков электронной микроскопии взаимодействия CGL с вирусом табачной мозаики, заведомо не имеющим в своем составе углеводов, было обнаружено, что лектин проявлял сродство только к частично поврежденным вирионам, вероятно, вследствие доступности вирусной РНК

Поскольку по данным ТЛФА наилучшее связывание CGL наблюдалось с ВОМ (Рис 7), представляло интерес исследовать действие лектина на вирус огуречной мозаики in vivo

7 3 Влияние CGL на развитие инфекции, индуцированной ВОМ Препарат штамма ВОМ из картофеля сорта Аноста (1 мг/мл) смешивали с пектином (1 мг/мл) в различных соотношениях В каждом варианте опыта инокулировали по 5 растений табака сорта Кстанти нк (по 0,1 мл смеси вируса с пектином на растение), в качестве контроля использовали ВОМ в тех же разведениях без лектина

Присутствие лектина в препарате ингибировало проявление внешних симптомов заболевания на листьях растений, а также препятствовало вирусобусловленному подавлению их роста

Для изучения накопления патогена в растениях проводили количественное выделение вируса Концентрация вируса в соке растений, определенная непрямым методом ИФА, была выше в контроле, чем в растениях, обработанных вирусом с лектином

Таким образом, полученные результаты показывают перспективность исследуемых лектинов, в первую очередь CGL, как потенциальных противовирусных препаратов

8 Исследование перегликозилирования углеводных цепей РЭА Многие белки млекопитающих гликозилированы Развитие ряда патологических состояний, включая появление неоплазий в организме, сопровождается нарушением процессов гликозилирования, изменением стереохимической конфигурации углеводной части жизненно важных гликоконъюгатов Изучение структуры, биосинтеза, регуляции и функции углеводных цепей гликоконъюгатов и выяснение причин их нарушения является новым и перспективным направлением в онкологии, позволяющим уточнять механизмы возникновения злокачественных новообразований, и, следовательно, намечать пути их диагностики и лечения Очищенные лектины могут быть удобным инструментом для разработки методов диагностики ряда заболеваний

Раково-змбриональный антиген (РЭА), известный онкомаркер, широко используется для диагностики опухоли толстого кишечника, рака легких, молочной железы, головы и шеи Кроме того, повышенный уровень этого антигена выявляется у больных холециститом, циррозом печени и даже у злостных курильщиков Известно, что при различных патологиях происходит нарушение синтеза углеводных цепей РЭА (Garcia et al, 1991) На основе выделенных нами лектинов был разработан метод ТЛФА для определения уровня РЭА в сыворотках крови онкопациентов и доноров

8 1 Разработка ТЛФА для определения уровня РЭА Для разработки ТЛФА на планшет адсорбировали антитела против РЭА Далее наносили в различных концентрациях стандарт РЭА Для ТЛФА мы использовали конъюгаты CGL, DTL и DTL-A с ферментной меткой При проведении анализа было выявлено прямое взаимодействие конъюгатов лектинов с углеводными цепями на Fc домене иммуноглобулинов G (lgGP3A), адсорбированных на планшете Для уменьшения связывания лектинов с lgGp9A мы обрабатывали иммуноглобулины периодатом натрия, при этом происходит окисление циклических углеводных структур, что приводит к уменьшению углевод-белкового взаимодействия (Петросян, Британ, 2006)

Были подобраны условия окисления, при которых максимально уменьшалось связывание между лектинами и lgGp3A, но при этом специфическое взаимодействие РЭА с окисленными иммуноглобулинами снижалось не более чем на 10% Найдено, что связывание CGL с антителами уменьшается уже через 15 минут, для остальных лектинов требуется окисление в течение часа

от

06- —DTL

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Концентрация стандарта РЭА нг/мл

Рис. 8 Калибровочный график определения РЭА методом ТЛФА с периодатно окисленными иммуноглобулинами

Как видно из рисунка 8, CGL и DTL-A показали концентрационно-зависимое связывание со стандартным РЭА, в то время как с DTL взаимодействия не наблюдалось

8 2 Определения уровня РЭА в сыворотках крови доноров и онкопациентов

С помощью разработанных тест-систем для определения РЭА нами проанализированы 39 сывороток крови онкологических больных и 39 сывороток доноров Для сравнения эти же образцы были изучены с помощью стандартного иммуноферментного анализа (ИФА)

Результаты эксперимента показали существенную разницу в связывании CGL с РЭА из сывороток крови онкологических больных и доноров (Табл 8) Средний уровень антигена, определенный по калибровочной кривой, в образцах со всеми видами онкопатологий был более чем в 2 раза выше по сравнению с уровнем у здоровых людей, причем минимальное значение для онкопатологии не перекрывалось с максимальным значением для нормы Такое увеличение связывания, вероятно, обусловлено появлением при заболевании большого количества терминальных остатков Gal или GalNAc, моносахаридов, специфичных для CGL Метод ТЛФА на основе CGL оказался более чувствительным по сравнению с обычным ИФА, так как последним методом не удалось выявить разницы в уровне РЭА при некоторых видах онкопатологий и в норме

Таблица 8 Определение уровня РЭА в сыворотках крови онкологических

больных и доноров методами ТЛФА и ИФА

Вид онкопатологии Кол-во образцов Сс o±SD, нг/мл

ИФА ТЛФА, CGL ТЛФА, DTL-A

Онкология молочной железы 19 2,1±1,9 375±108 1008±61

Онкология желудка Онкология кишечника 10 6 3,3±1,9 61,3±48,3 379±90 366±81 985±66 936±70

Онкология печени 2 2,0±0,7 421±99 1067±10

Онкология яичника 2 15,9±1,5 503±94 1007±31

Среднее значение по онкологии 39 16,9±10,9 409±94 1000±47

Норма 39 2,5±2,3 182±45 944±76

Уровень РЭА, определенный методом ТЛФА на основе ОТ1_-А, оказался гораздо выше по сравнению с уровнем антигена, выявленным лектином из мидии Известно, что углеводные цепи РЭА имеют строение, обычное для N -гликанов Число остатков Ы-ацетил-О-глюкозамина на молекулу РЭА колеблется от 113 до 236, а число остатков О-галактозы - от 96 до150 Однако для лектина из асцидии отсутствовала существенная разница во взаимодействии с РЭА при злокачественном заболевании и норме Возможное объяснение этому - специфичный для ОТ!_-А Ы-ацетил-О-глюкозамин не подвергается замене во время патологического процесса и, следовательно, не происходит изменения в связывании

Таким образом, показана перспективность разработанной тест-системы на основе СйЬ для диагностики онкопатологий

Контроль качества тест-системы по специфичности, воспроизводимости и достоверности удовлетворяет необходимым требованиям, т к коэффициент вариации во всех случаях не превышает 10%, и стандарт РЭА не показывает перекрестной реактивности с антигенами сыворотки крови Чувствительность метода составляет 10 нг/мл

9 Исследование общего лерегликозилирования гликоконъюгатов сыворотки крови при неопластической трансформации

Изменения в углеводном профиле, обусловленные злокачественной трансформацией клетки, показаны для целого ряда гликопротеинов Определение уровня лерегликозилирования гликоконъюгатов цельной сыворотки крови позволит проводить мониторинг начальных стадий патологического процесса в группе риска Благодаря уникальной углеводной специфичности, ТС1. способен связываться с гликопротеинами муцинового типа, которые, как известно, в больших количествах начинают синтезироваться при онкотрансформации клетки, поэтому на основе этого пектина был разработан метод ТЛФА Также в эксперименте использовали Св!. и ОТ1.-А Нами были проанализированы адсорбированные на планшете сыворотки крови здоровых людей (39) и онкологических больных (39) Для ТСЬ наблюдалась существенная разница в связывании с гпикоконъюгатами онкопациентов и здоровых людей Как показано в таблице 9, оптическая плотность при взаимодействии с сыворотками онкопациентов была в 2,6 раз выше, чем с сыворотками крови доноров Причем максимальное значение, полученное для контрольной группы, не перекрывалось с минимальным значением для онкопациентов При связывании с другими конъюгатами отношение Аоню/Адонор было меньше для ОТ1.-А оно было равно 2, для СЭЬ -1

Таблица 9 Взаимодействие пектинов с гпикоконъюгатами сыворотки крови

Лектин АомкО^^О АдОНОр^ЗЭ Отношение Аонко/Адонор

ТС1- 0,17± 0,04 0,065±0,01 2,6

ОТ1.-А 0,4±0,07 0,2±0,02 2

СО. 0,2±0,007 0,2±0,02 1

Примечание Ао„„, Адонор - средняя оптическая плотность реакционной смеси при 492

нм для онкологических больных и доноров соответственно

В настоящее время разработана целая серия тест-систем для выявления различных онкопатологий Однако определение уровня всех известных маркеров для каждого пациента не всегда является возможным В этой связи представляет интерес разработка методов диагностики, охватывающих как можно более широкий спектр онкозаболеваний Проведение такого анализа среди пациентов, имевших в анамнезе онкопатологию, позволит на ранних стадиях выявлять начавшийся патологический процесс и затем уже провести более детальное обследование с определением конкретных онкомаркеров

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработанных тест-систем на основе ТСЬ и ОТЬА для дальнейших исследований

ВЫВОДЫ

1 Проведен поиск лектинов в 28 видах водорослей-макрофитов Японского моря, в результате которого определен перспективный для дальнейших исследований вид красной водоросли

2 Из красной водоросли Tichocarpus cnnitus выделен и охарактеризован новый лектин TCL

3 Установлено, что TCL, а так же ранее выделенный лектин из морского червя Serpula vermicularis (SVL-1) обладают митогенной активностью

4 Показано, что все исследованные лектины индуцируют синтез цитокинов клетками периферической крови человека

5 Лектины из мидии Crenomytilus grayanus (CGL) и из асцидии Didemnum ternatanum (DTL) проявляет антибактериальные свойства в отношении некоторых штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий

6 Показано взаимодействие всех исследованных лектинов с фитовирусами Методом электронной микроскопии выявлено сродство CGL к вирионам Y-вируса картофеля В экспериментах in vivo установлено, что CGL обладает противовирусными свойствами в отношении вируса огуречной мозаики

7 Разработаны тест-системы на основе лектинов и показана их перспективность для диагностики онкологических заболеваний

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Чикаловец И В , Черников О В , Козыревская С А, Спиченкова Н Е , Михайлов В В Взаимодействие лектинов с морскими бактериями // Сборник научных трудов 3-его Международного симпозиума «Химия и химическое образование» Владивосток 2003 С 66-68

2 Какарека Н Н , Черников О В , Чикаловец И В , Молчанова В И , Курика А В , Волков Ю Г, Козловская 3 Н , Романова С А Взаимодействие лектинов из морских беспозвоночных с растительными вирусами // Труды Международного Форума по проблемам науки, техники и образования МоСжва 2003 С 110-112

3 Черников О В , Чикаловец И В , Молчанова В И , Курика А В , Какарека Н Н Исследование механизма связывания лектинов морских беспозвоночных с растительными вирусами II Материалы Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты» Саратов 2005 С 27-28

4 Черников О В , Чикаловец И В , Богданович Р Н , Молчанова В И Использование углевод-распознающих белков (лектинов) для диагностики онкопатологии трофобласта // Материалы 7-ой Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей» Владивосток 2005 С 164-166

5 Chernikov О, Chikalovets I, Molchanova V, Pavlova М Isolation and properties of lectin from red alga Tichocarpus cnnitus И Abstracts of 10th International conference on Applied Phycology Kunming, China 2005 P 146

6 Богданович Р Н , Чикаловец И В , Черников О В , Лукьянов П А Трофобластический бета 1-гликопротеин - маркер эмбрио- и канцерогенеза//Бюллетень ВСНЦСО РАМН 2005 №4 С 5-9

7 Li W, Wang J Н , Dong-Yun О Y , Molchanova V , Chicalovets I, Chemikov О , Belogortseva N , Lukyanov P , Zheng Y T Anti-human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Activity of lectins from ascidian Didemnum ternatanum II Glycobiology 2006 V 16(11) P 1159

8 Черников О В , Чикаловец И В , Молчанова В И , Лукьянов П А Новый лектин из красной водоросли Tichocarpus cnmtus Выделение и свойства // Тезисы докладов 2-ой региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» Владивосток 2006 С 60

9 Molchanova V , Chikalovets I, Chemikov О , Belogortseva N , Li W, Wang JH , Yang D-Y, Zheng Y-T, Lukyanov P A new lectin from the sea worm Serpula vermiculans isolation, characterization and anti-HIV activity II Comp Biochem Physiol С 2007 V 145 No 2 P 184-193

10 Лукьянов П A , Черников О В , Кобелев С С , Чикаловец И В , Молчанова В И, Ли В Углеводсвязывающие белки морских беспозвоночных // Биоорг химия 2007 Т 33 № 1 С 172-181

11 Chemikov О , Chikalovets I, Molchanova V, Lukyanov Р Purification and biological affects of lectin from the red marine alga Tichocarpus cnmtus II Abstracts of 21st Pacific Science Congress Okinawa, Japan 2007 P 127

12 Черников О В , Чикаловец И В , Молчанова В И , Павлова М А, Лукьянов П А Водоросли залива Петра Великого как источник лектинов // Биология моря 2007 Т 33 № 5 С 379-381

13 Какарека Н Н , Черников О В , Чикаловец И В , Молчанова В И , Курика А В , Волков Ю Г, Козловская 3 Н Изучение взаимодействия лектинов, выделенных из морских беспозвоночных, с вирусами растений и человека IIУсп совр биол 2007 Т 127 №5 С 452^57

14 Черников О В, Чикаловец И В, Молчанова В И, Лукьянов П А Биологическая активность лектинов морских гидробионтов // Вестник ДВО РАН 2007 №6 С 131-135

Лектин красной водоросли ТкИосагрт сгшМиь. Биологическая активность лектинов морских гидробионтов

ЧЕРНИКОВ Олег Викторович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 02 июня 2008 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Уел печ л 1 0 Зак № 15684

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел 36-26-16,55-95-31 утуу краски

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черников, Олег Викторович

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Общая характеристика и классификация лектинов.

1.2. Лектины морских гидробионтов.

1.3. Биологические функции лектииов.

1.4. Изменение углеводных структур гликоконыогатов при пеопластической трансформации.

1.5. Применение лектинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лектин красной водоросли Tichocarpus crinitus. Биологическая активность лектинов морских гидробионтов"

В 1888 году Г. Штильмарк впервые доложил о том, что экстракты касторовых бобов способны агглютинировать эритроциты различных животных. Было обнаружено, что экстракты семян содержат гемагглюгинирующие белки, названные агглютининами или гемагглютининами, а позже лектинами. Термин лектпп (от латинского legere — выбирать), введенный Бондом в 1954 году, означал, что вещества некоторых экстрактов семян (например, Phaseolus limensis, Ricinus communis) различали группы крови человека (Rudiger, Gabius, 2001; Sharon, Lis, 2004). Пектины - широко распространенные белки и гликопротеиньт, способные специфически и обратимо связывать углеводные структуры. Они пековалеггпго связываются с моно- и олигосахаридамн, как с находящимися в растворе, так и с локализованными на клеточной поверхности. За взаимодействие отвечают, в основном, гидрофобные взаимодействия и водородные связи, изредка вовлечены электростатические силы, так как большинство углеводов не обладают зарядом. Специфичность лектина определяется ингибированием моносахаридом (-ами) или простым олигосахаридом лектин-опосредованной реакции агглютинации пли преципитацип клеток. Специфические ингибиторы обычно эффективны в мнллимолярных концентрациях или даже ниже. Лектипы со схожей специфичностью в отношении моносахаридов могут отличаться в аффинности к дисахаридам, олигосахаридам или гликопрогеинам. Несмотря па то, что лектппы близки к антителам • по своей способности агглютинировать клетки, они отличаются от них тем, что не являются продуктами иммунной системы, структуры их разнообразны и их специфичность ограничивается углеводами (Лахтин, 1989).

Быстрое развитие исследований в области гликобиологии за последние двадцать лет позволило выявить ключевую роль лсктинов в межклеточных взаимодействиях, что резко увеличило интерес к лектипам, и в настоящее время масштабы этих исследований и их характер позволяют говорить о самостоятельной области науки - лектинологии (Луцик и др., 1981).

Лектипы принимают участие в самых топких процессах на клеточном, субклеточном и органном уровнях в живых оргаппзмах. Эти процессы включают клиренс гликопротеинов из циркуляторной системы, симбпотическую или патогенную адгезию микроорганизмов к тканям хозяина, специфическое связывание опухолевых клеток с клетками различных органов при метастазнровании (Лоенко и др., 1992; Beuth et al., 1995). Специфичность связывания лектинов с другими молекулами определяется характерной углеводной группой, например, терминальным остатком галактозы. В связи с этим один и тот же лектин может взаимодействовать с различными биомолекулами, содержащими данную углеводную группу. Таким образом, они играют важную роль в определении химической структуры углеводных детерминант и их распределения на клеточной поверхности (Akimoto et al., 1998). Лектины могут стать ценными биохимическими реагентами, использование которых получает свое развитие в экспериментальной цитохимии, диагностике некоторых заболеваний и, наконец, в биотехнологических процессах получения некоторых сложных углевод-содержащих веществ (Лоенко и др., 1992).

Хотя к настоящему времени лектины найдены во многих живых организмах, растениях, животных и микроорганизмах, поиск новых источников остается актуальной задачей, поскольку изучение свойств и функций лектинов вносит вклад в научные представления об углевод-белковом взаимодействии и открывает новые возможности для решения медико-биологнческих задач.

1. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черников, Олег Викторович

Выводы

1. Проведен поиск лектинов в 28 видах водорослей-макрофитов Японского моря, в результате которого определен перспективный для дальнейших исследований вид красной водоросли.

2. Из красной водоросли Tichocarpus crinitus выделен и охарактеризован новый лектин TCL.

3. Установлено, что TCL, а так же ранее выделенный лектин из морского червя Serpula vermicularis (SVL-1) обладают митогенной активностью.

4. Показано, что все исследованные лектины индуцируют синтез цитокинов клетками периферической крови человека.

5. Лектины из мидии Crenomytilus grayanus (CGL) и из асцидии Didemnum ternatanum (DTL) проявляет антибактериальные свойства в отношении, некоторых штаммов грамположительных и грамогрицательных бактерий.

6. Показано взаимодействие всех исследованных лектинов с фитовирусами. Методом электронной микроскопии выявлено сродство CGL к вирионам Y-вируса картофеля. В экспериментах in vivo установлено, что CGL обладает противовирусными свойствами в отношении вируса огуречной мозаики.

7. Разработаны тест-системы на основе лектинов и показана их перспективность для диагностики онкологических заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черников, Олег Викторович, Владивосток

1. Бабоша А.В. Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулировагшого вирусом табачной мозаики // Изв. акад. наук. Сер. биол. 2004. Т. 3. С. 319-325.

2. Богданович Р.Н., Чикаловец И.В., Черников О.В., Лукьянов П.А. Трофобластический бета 1-гликопротеип маркер эмбрио- и канцерогенеза // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2005. № 4. С. 5-9.

3. Бельков В.В. С-реактивный белок структура, функция, методы определения, клиническая значимость // Лаб. мед. 2006. № 8. С. 1-7.

4. Галич И.П., Евтушенко Н.В. Изменение гликозилирования при онкогенензе и развитии других патологических процессов // Онкология. 2003. Т. 5(1). С. 49.

5. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокипы н воспаление. 2003. № 3. С. 20-35.

6. Запорожец Т.С., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н., Молчанова В.И., Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Цитокининдуцирующая активность биополимеров морских гидробионтов // Мед. иммупол. 2004. Т. 6. № 1-2. С. 89-96.

7. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность // Клин. лаб. днагн. 1998. № 11. С. 21-32.

8. Королев Н.П. Лектины инструменты для исследования биологических мембран //

9. Лахтин В.М. Биотехнология лектинов // Биотехнология. 1989. Т. 5(6). С. 676-691. Лахтин В.М., Ямсков И.А. Лектины в исследовании рецепторов // Усп. хим. 1991.

10. Т. 60. №8. С. 1777-1916. Лоенко Ю.Н., Глазкова В.Е., Артюхов А.А., Оводова Р.Г. Лектины морскихбеспозвоночных // Усп. совр. биол. 1992. Т. 112. № 5-6. С. 785-794. Лукьянов П.А., Черников О.В., Кобелев С.С., Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Ли

11. B. Углеводсвязывающие белки морских беспозвоночных // Биоорг. химия. 2007. Т. 33. № 1.С. 172-181.

12. Полевщиков А.В. Лектины в защитных реакциях беспозвоночных // Журн. общ.биол. 1996а. Т. 57. № 6. С. 718-739. Полевщиков А.В. Лектины в защитных реакциях хордовых животных //

13. Иммунология. 19966. № 1. С. 48-56. Ролик И.С., Завадская А.И. Лектины омелы белой // Натуротерапия и гомеопатия. 2006. Т. 1.С. 14-24.

14. Хомутовский О.А., Луцик М.Д., Передерей О.Ф. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. Киев: Наукова думка, 1986. 373 с.

15. Хьюз Р. Гликопротеины. М.: Мир. 1985. 140 с.

16. Чикаловец И.В. Выделение, свойства и антигенная активность раково-эмбрионального антигена: Дисс. канд. хим. наук. Владивосток. 1990. 129 с.

17. Ainouz I.L., Sampaio A.H., Freitas A.L.P., Benevides N.M.B., Mapurunga S. Comparative study on hemagglutinins from the red algae Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion triquetrum IIR. Bras. Fisiol. Veg. 1995. V.7. No. 1. P. 15-19.

18. Akimoto Y., Imai Y., Hirabayashi I. Histochemistry and cytochemistry of endogenous animal lectins//Progr. Histochem. Cytochem. 1998. V.33. P. 1-92.

19. Alvarez C.P., Lasala F., Carrillo J., Miniz O., Corbi A.L., Delgado R. C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans // J. Virol. 2002. V. 76. No. 13. P. 6841-6844.

20. Antonyuk L.P., Ignatov V.V. The role of wheat germ agglutinin in plant-bacteria interactions: a hypothesis and the evidence in its support // Russ. J. Plant Physiol. 2001. V. 48. No. 3. P. 364-369.

21. Arason G.J. Lectins as defence molecules in vertebrates and invertebrates // Fish Shellfish Immunol. 1996. V. 6. P. 277-289.

22. Banerjee S., Chaki S., Bhowal J., Chatterjee B.P. Mucin binding mitogenic lectin from freshwater Indian gastropod Belamyia bengalensis: purification and molecular characterization//Arch. Boichem. Boiphys. 2004. V. 421. No. 1. P. 125-134.

23. Barrientos L.G., O'Keefe B.R., Bray M., Sanchez A., Gronenborn A.M., Boyd M.R. Cyanovirin-N binds to the viral surface glycoprotein, GP1,2 and inhibits infectivity of Ebola virus //Antiviral Res. 2003. V. 58. P. 47-56.

24. Bayne C.J. Phagocytosis and non-self recognition in invertebrates // Bioscience. 1990. V. 40. No. 10. P. 723-731.

25. Belogortseva N.I., Molchanova V.I., Kurika A.V., Skobun A.S., Glazkova V.E. Isolation and characterization of new GalNAc/Gal-specific lectin from the sea mussel Crenomytilus grayanus И Сотр. Biochem. Physiol. 1998a. V. 119. P. 45-50.

26. Belogortseva N.I., Molchanova V.I., Glazunov V., Evtushenko E., Luk'yanov P. N-Acetyl-D-glucosamine-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum II Biochim. Biophys. Acta. 1998b. V. 1380. No. 2. P. 249-256.

27. Benevides N.M.B., Holanda M.L., Melo F.R., Freitas A.L.P., Sampaio A.H. Purification, and partial characterization of a lectin from the red marine alga Enantiocladia duperreyill Bot. Mar. 1998. V.41. No. 5. P. 521-525.

28. Benevides N.M.B., Holanda M.L., Melo F.R., Pereira M.G., Monteiro A.C.O., Freitas A.L.P. Purification and partial characterization of a lectin from the marine green alga Caulera cupressoides II Bot. Mar. 2001. V. 41. P. 17-22.

29. Benz I., Schmidt M.A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria // Mol. Microbiol. 2002. V. 45. No. 2. P. 267-276.

30. Beuth J., Ко H.L., Pulverer G., Uhlenbruck G., Pichlmaier H. Importance of lectins for the prevention of bacterial infections and cancer metastases // Glycoconj. J. 1995. V. 12. P. 1-6.

31. Blixt O., Allin K., Pereira L., Datta A., Paulson J.C. Efficient chcmoenzymatic synthesis of O-linked sialyl oligosaccharides // Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. No. 20. P. 5739-5746.

32. Bloc A., Lucas R., Van Dijk E., Bilej M., Dunant Y., De Baetselier P., Beschin A. An invertebrate defense molecule activates membrane conductance in mammalian cells by means of its lectin-like domain // Dev. Сотр. Immunol. 2002. V. 26. No. 1. P. 35-.43.

33. Rev. Microbiol. 2004. V. 2. P. 109-122. Dmitricv B.A., Toukach F.V., ITolst O., Rietschel E.T., Ehlers S. Tertiary structure of Staphylococcus aureus cell wall murein // J. Bacterid. 2004. V. 186. No. 21. P. 7141-7148.

34. Dodd R.B., Drickamer K. Lectin-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity // Glycobiology. 2001. V. 11. No. 5. P. 71R-79R.

35. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton I.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350356.

36. Edge A.S., Spiro R.G. Presence of an O-glycosidically linked hexasaccharide in fctuin //

37. J. Biol. Chem. 1987. V. 262. No. 33. P. 16135-16141. Epstein J., Eichbaum Q., Sheriff S., Ezekowitz R.A.B. The collectins in innate immunity // Curr. Opin. Immunol. 1996. V. 8. No. 1. P. 29-35.

38. Fenical W. Halogenation in the Rhodophyta. A review // J. Phycol. 1975. V. 11. P. 245259.

39. Fernandez-Fernandez M.R., Camafeita E., Bonay P., Mendez E., Albar J.P., Garcia J.A. The capsid protein of a plant singl-stranded RNA virus is modified by O-linked N-acetylglucosamine //J. Biol. Chetn. 2002. V. 277. No. I. P. 135-140.

40. Freshney R.I. Culture of animal cells. A manual of basic technique. Wiley-Liss. 1994. 486 p.

41. Garcia M., Seigner C., Bastid C., Choux R., Payan M.J., Reggio II. Carcinoembryonic antigen has a different molecular weight in normal colon and in cancer cells due to N-glycosylation differences // Cancer Res. 1991. V. 51. P. 5679-5686.

42. Goldstein I.I., Hughes R.C., Monsigny M., Osawa Т., Sharon N. What should be called a lectin? //Nature. 1980. V. 285. No. 5760. P. 66.

43. Gorelik E., Galilir U., Raz A. On the Role of Cell Surface Carbohydrates and their Binding proteins (lectins) in tumor metastasis // Cancer Metastasis Rev. 2001. V. 20. No. 3-4. P. 245-277.

44. Hakomori S. Glycosylation defining cancer malignancy: new wine in an old bottle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. No. 16. P. 10231-10233.

45. Hartley C.A., Jackson D.C., Anders E.M. Two distinct serum mannose-binding lectins function as beta inhibitors of influenza virus: identification of bovine serum beta inhibitor as conglutinin // J. Virol. 1992. V. 66. No. 7. P. 4358-4363.

46. Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 561-566. Hori K., Matsubara K., Miyazawa K. Primary structures of two hemagglutinins from marine red alga, Hypnea japonica II Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1474. P. 226-236.

47. Jack D.L., Turner M.W. Anti-microbial activities of mannose-binding lectin // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31. P. 753-757.

48. Jimenez-Vega F., Sotelo-Mundo R.R., Ascencio F., Vargas-AIbores F. 1,3-p-D glucan binding protein (BGBP) from the white shrimp, Penaeus vannamei, is also a heparin binding protein // Fish Shellfish Immunol. 2002. V. 13. P. 171-181.

49. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake С., Ho S.K. Structures of disease-specific serum alpha-fetoprotein isoforms // Br. J. Cancer. 2000. V. 83. No. 10. P. 1330-1337.

50. Kakita H., Fukuoka S., Obika H., Kamishima H. Isolation and characterization of a fourth hemagglutinin from the red alga, Gracilaria verrucosa, from Japan // J. Agric. Food Chem. 1999. V. 11. P. 49-56.

51. Kamiya H. Possible multiple functions of the invertebrate humoral lectins // Fish Pathol. 1995. V. 30. No. 2. P. 129-139.

52. Kase Т., Suzuki Y., Kawai Т., Sakamoto Т., Ohtani K., Eda S., Maeda A., Okuno Y., Kurimura Т., Wakamiya N. Human mannan-binding lectin inhibits the infection of influenza A virus without complement // Immunology. 1999. V. 97. No. 3. P. 385392.

53. Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., Hirohara H., Hori K. The marine red alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins // J. Appl. Phycol. 1997. V. 9. No. 4. P. 331-338.

54. Kilar F., Vegvari A., Mod A. New set-up for capillary isoelectric focusing in uncoated capillaries // J. Chromatogr. 1998. V. 813. P. 349-360.

55. Kim G.H., Klotchkova T.A., West J.A. From protoplasm to swarmer: Regeneration of protoplasts from disintegrated cells of the multicellular marine green alga Microdictyon umbilicatum (Chlorophyta) // J. Phycol. 2002. V. 38. No. I. P. 174183.

56. Kinoshita N., Suzuki S., Matsuda Y., Taniguchi N. a-Fetoprotein antibody-lectin enzyme immunoassay to characterize sugar chains for the study of liver diseases // Clin. Chim. Acta. 1989. V. 179. No. 2. P. 143-151.

57. Klotchkova Т., Chah O.-K., West J., Kim G.FI. Cytochemical and ultrastructural studies on protoplast formation from disintegrated cells of the marine alga Chaetomorpha aerea (Chlorophyta) // Eur. J. Phycol. 2003. V. 38. No. 3. P. 205-216.

58. Koyama Y., Suzuki Т., Kajya A., Isemura M. Stimulation of IL-8 production by Aralia cordate lectin in human colon carcinoma Caco-2 cells // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. V. 69. No. 1. P. 202-205.

59. Machinami R., Oono Y. Carcinoembryonic antigen and lectin binding in the bile canalicular structures of hepatocellular carcinoma // Virchows. Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1987. V. 412. No. 2. P. 111-118.

60. Matsumoto A., Shikata K., Talceuchi F., Kolima N., Mizuochi T. Autoantibody activity of IgG rheumatoid factor increases with decreasing levels of galactosylation and sialylation // J. Biochem. 2000. V 128. P. 621-628.

61. McCoy P.I., Varani I.I., Goldstein I.I. Enzyme-linked lectin assay // Exp. Cell Res. 1984. V. 151. P. 96-103.

62. Merlde R.K., Poppe, I. Carbohydrate composition analysis of glycoconjagates by gas-liquid chromatography/mass spectrometry // Methods. Enzymol. 1994. V. 230. P. 1-15.

63. Molchanova V., Chikalovets I., Li W., Kobelev S., Kozyrevskaya S., Bogdanovich R., Howard E., Belogortseva N. New GlcNAc/GalNAc-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum II Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1723. No. I-3. P. 82-90.

64. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. 1983. V. 65. P. 5563.

65. Munoz A., Alonso В., Alvarez O., Llovo J. Lectin typing of five medically important Candida species // Mycoses. 2003. V. 46. P. 86-89.

66. Nagano C.S., Moreno F.B.M.B., Bloch C., Prates M.V., Calvete J.J., Sakcr-Sampaio S. Purfication and chararacterization of new lectin from the red marine aiga Hypnea musciformis 11 Protein Pept. Lett. 2002. V. 9. P. 159-165.

67. Naganuma Т., Ogawa T, Hirabayashi J., Kasai K., Kamiya H., Muramoto K. Isolation, characterization and molecular evolution of a novel pearl shell lectin from a marine bivalve, Pteriapenguin II Mol. Divers. 2006. V. 10. P. 607-618.

68. Nair S.V., Burandt M., Hutchinson A., Raison R.L., Rafitos D.A. A C-type lectin from the tunicate, Styela plicata, that modulates cellular activity // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2001. V. 129. No. 1. P. 11-24.

69. Nakagawa H., Yamaguchi C., Hayashi H. Biologically active substances from sea urchins // J. Nat. Toxins. 1997. V. 6. No. 2. 192-202.

70. Nakamura H., Moriya M. Purification and partial characterization of a lectin-like protein from the sea algae marine Laminaria diabolica that induces fertilization envelope formation in sea urchin eggs II Zool. Sci. 1999. V. 16. P. 247-253.

71. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. V. 22. No. 12. P. 1084-1091.

72. Ogino M., Yoshimatsu K., Ebihara H., Arikawa ,T. N-acetylgalactosamine (GalNAc)-specific lectins mediate enhancement of Hantaan virus infection // Arch. Virol. 1999. V. 144. No. 9. P. 1765-1777.

73. Okamoto R,, Hori K., Miyazawa K., Ito K. Isolation and characterization of a new hemagglutinin from the red alga Gracilaria bursa-pastoris II Experientia. 1990. V. 46. P. 975-977.

74. Oliveira S.R.M., Nascimento A.E., Lima M.E.P., Leite Y.F.M.M., Benevides N.M.B. Purification and characterisation of a lectin from the red marine alga Pterocladiella capillacea (S.G. Gmel.) Santel. & Hommers // Rev. Bras. Bot. 2002. V. 25. P. 397-403.

75. Ozeki Y., Yokota Y., Kato K.H., Titani K., Matsui T. Developmental expression of D-galactoside-binding lectin in sea urchin (Anthocidaris crassispina) eggs // Exp. Cell. Res. 1995. V. 216. No. 2. P. 318-24.

76. Pajic I., Kljajic Z., Dogovic N., Sladic D., Juranic Z., Gasic M.J. A novel lectin from the sponge Haliclona cratera: isolation, characterization and biological activity // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2002. V. 132. No. 2. P. 213-221.

77. Palukaitis P., Roossinck M.J., Dietzgen R.G., Francki R.I. Cucumber mosaic virus // Adv. Virus. Res. 1992. V. 41. P. 281-348.

78. Paul I., Mandal C., Allen A.K., Mandal C. Glycosylated molecular variants of C-reactive protein from the major carp Carta carta in fresh and polluted aquatic enviroments // Glycoconj. J. 2001. V. 18. P. 547-556.

79. Perez-Lorenzo S., Levy-Benshimol A., Gomez-Acevcdo S. Presence of lcctins, tannins and protease inhibitors in Venezuelan marine algae // Acta Cient. Vencz. 1998. V. 49. No. 3. P. 144-151.

80. Pesando D., Caram B. Screening of marine algae from the French Mediterranean coast for antibacterial and antifungal activity // Bot. Mar. 1984. V. 27. P. 381-386.

81. Pistole T.G. Interaction of bacteria and fungi with lectins and lectin-like substances // Ant. Rev. Microbiol. 1981. V. 35. P. 85-112.

82. Pohlmann S., Zhang J., Baribaud F., Chen Z., Leslie G.J., Lin G., Granelli-Piperno A., Doms R.W., Rice C.M., McKeating J.A. Hepatitis С virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR // J. Virol. 2003. V. 77. No. 7. P. 4070-4080.

83. Reading P.C., Morey L.S., Crouch E.C., Anders E.M. Collectin-mediated antiviral host defense of the lung: evidence from influenza virus infection of mice // J. Virol. 1997. V. 71. No. 11. P. 8204-8212.

84. Rini J.M. Lectin structure // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. V. 24. P. 551577.

85. Rogers D. J., Hori K. Marine algal lectins: new developments // Hydrobiologia. 1993. V. 260/261. P. 589-593.

86. Rudiger H., Gabius H-J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications //Glycoconj. J. 2001. V. 18. P. 589-613.

87. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Costa F.H.F., Ramos M.V. A new isolation procedure and further characterization of the lectin from the red marine alga Ptilota serrata II J. Appl. Phycol. 1998a. V. 10. P. 539-546.

88. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J. Isolation and characterization of the lectin from the green alga Ulva lactuta И Bot. Mar. 1998b. V. 41. No. 4. P. 427-433.

89. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J. A galactose-specific lectin from the red marine alga Ptilota filicina I/ Phytochem. 1998c. V. 48. P. 765-769.

90. Schmid C.E., Schroer N., Muller D.G. Female gamete membrane-glycoproteins potentially involved in gamete recognition in Ectocarpus siliculosns (Phaeophyceae) //Plant Sci. 1994. V.102. No. 1. P. 61-67.

91. Schrag J.D., Bergeron J.J., Li Y., Borisova S., Hahn M., Thomas D.Y., Cygler M. The structure of calnexin, an ER chaperone involved in quality control of protein folding // Mol. Cell. 2001. V. 8. P. 633-644.

92. Sharon N. Lectins: carbohydrate-specific reagents and biological recognition molecules // ' J. Biol. Chem. 2007. V. 282. No. 5. P. 2753-2764.

93. Sharon N., Lis H. Legume lectins: a large family of homologous proteins // FASEB J. 1990. V. 4. P. 3198-3208.

94. Sharon N., Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. V. 14. No. 11. P. 53R-62R.

95. Shiomi K., Yamanaka H., Kikuchi T. Purification and physicochemical properties of a hemagglutinin (GVA- 1) in the red alga Gracilaria verrucosa II Bull. Japan. Soc. Sci. Fish. 1981. V. 47. P. 1079-1084.

96. Shukla D.D., Ward C.W. Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the Potyvirus group // J. Gen. Virol. 1988. V. 69. No. 11. P. 2703-2710.

97. Stafford С.J., Callow J.A., Green J.R. Inhibition of fertilization in Facus (Phaephyceae) by a monoclonal-antibody that binds to domains on the egg ccll surface // J. Phycol. 1993. V. 29. No. 3. P. 325-330.

98. Staudacher E., Altmann F., Wilson I.B., Marz L. Fucose in N-glycans: from plant to man //Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1473. No. 1. P. 216-236.

99. Tai Т., Yamashita K., Ito S., Kobata A. Structures of the carbohydrate moiety of ovalbumin glycopeptide III and the difference in specificity of endo-(3-N-acetylglucosaminidases CII and H // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. No. 19. P. 66876694.

100. Tannet G.A., Butler P.G., Hutton T. Molecular characterization of Limulus polypfemus C-reactive protein // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. 314-326.

101. Taylor M.E. Evolution of a family of receptors containing multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains // Glycobiology. 1997. V. 7. P. R5-R8.

102. Thomson A.W., Lotze M.T. The Cytokine handbook / Ed. Thomson A.W., Lotze M.T. London, San Diego: «Academic Press». 2003. 1536 p.

103. Thomson S.P., Williams D.B. Delineation of the lectin site of the molecular chaperone calreticulin //Cell Stress Chaperones. 2005. V. 10. P. 242-251.

104. Toth G.B., Pavia H. Removal of dissolved brown algal phlorotannins using insoluble polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) // J. Chem. Ecol. 2001. V. 27. No. 9. P. 19011910.

105. Tozzini A.C., Elc В., Palva E.T., Hopp H.E. Potato virus X coat protein: a glycoprotein // Virology. 1994. V. 202. No. 2. P. 651-658.

106. Turner G.A. N-glycosylation of serum proteins in disease and its investigation using lectins // Clin. Chim. Acta. 1992. V. 208. P. 149-171.

107. Wrattens J., Faulkner D.J. Cyclic polysulfides from the red alga Chondrus californica I I

108. Yamazaki M. Antitumor and antimicrobial glycoproteins from sea hares // Сотр.

109. Biochem. Physiol. 1993. V. 105. No. 2. P. 141-146. Yoshida Y., Adachi E., Fukiya K., Iwai К., Tanaka K. Glycoprotein-specific ubiquitin ligases recognize N-glycans in unfolded substrates // EMBO Rep. 2005. V. 6. P. 239-244.