Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность и механизм действия биополимеров из морских организмов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лоенко, Юрий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Морские биополимеры (биохимическая характеристика, биологическая активность).52. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Изучение биологической активности митилана.

2.2.1.1. Противоопухолевая активность.

2.2.1.2.Антибактериальная активность.

2.2.1.3. Лектиновая активность.

2.2.2. Противоопухолевая активность и механизм действия кораллана.

2.2.3. Производные хитоолигосахаридов как противоопухолевые иммуномодуляторы.

2.2.4. Антибактериальная и иммуномодулирующая активность фукоидана.

2.2.5. Ингибирующее влияние уронофукана на ВИЧ-инфекцию и . развитие вирусиндуцированного лейкоза Раушера.

2.2.6. Изучение биологической активности зостерина.

2.2.6.1. Изучение фармакокинетики зостерина.

2.2.6.2. Иммуномодулирующая активность зостерина.

2.2.6.4. Антибактериальная активность зостерина.

2.2.6.5. Противоопухолевая активность зостерина.

2.2.6.6. Радиозащитная и антигеморрагическая активность зостерина.

2.2.6.7. Гипохолестеринемическая активность зостерина.

2.2.6.8. Влияние зостерина на эрозивноязвенный процесс, клинические штаммы Helicobacter pylori и активность пищеварительных ферментов.

2.2.6.9. Влияние зостерина на транссудационно-резорбтивную функцию брюшины.

2.2.6.10. Геропротекторные свойства зостерина.

2.2.6.11. Антидотные свойства зостерина.

2.2.6.11.1. Антидотные свойства при свинцовой интоксикации в хроническом эксперименте.

2.2.6.11.2. Антидотные свойства комбинированных форм с лекарственными растениями при свинцовой интоксикации в эксперименте.

2.2.6.11.3. Применение антидотной терапии на производстве Усть-Каменогорского свинцово-цинкового комбината.

2.2.6.11.4. Применение антидотной терапии на производстве свинцового завода "Дальполиметалл".

2.2.6.11.5. Антидотные (радиозащитные) свойства при радионуклид ной интоксикации в эксперименте.

2.2.6.12. Комбинированные формы зостерина в парафармации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическая активность и механизм действия биополимеров из морских организмов"

Среди возобновляемых биохимических ресурсов Мирового океана некоторые группы растительных и животных организмов более чем другие распространены или доминируют на больших территориях, что составляет предмет особого интереса со стороны химиков и биохимиков, исследующих возможности выделения биологически активных веществ, а также пути и способы создания на их основе новых лекарственных средств. К таким группам организмов нужно отнести прежде всего некоторые виды морских водорослей (Algae) и морских цветковых растений - морские травы (CQu.Zosteraceae), такие виды донных животных организмов, как двустворчатые моллюски (Bivalvia), иглокожие (Echinodermata), губки (.Porifera) и др. Успехи в развитии морской биотехнологии и ее основы - химии морских природных соединений - могут быть достигнуты только при фундаментальном изучении биологии и биохимии морских организмов, а также разностороннем исследовании биологической активности их структурных компонентов, метаболитов и других биохимических соединений. В ряду морских природных соединений несомненный интерес представляют группы биополимеров, составляющих структурную основу живых организмов и участвующих практически во всех процессах их жизнедеятельности. К таковым относятся белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и смешанные биополимеры - гликопротеиды, липопротеиды, протеогликаны и т.д. Исследование морских биополимеров в качестве биологически активных веществ представляет интерес со многих точек зрения. Можно выделить три наиболее актуальные и интересные направления исследований в этой области: 1) изучение спектра биологической активности индивидуальных морских биополимеров, включая выяснение их биохимической роли в организме продуценте; 2) изучение тропности и механизма биологического действия морских биополимеров; 3) разработка новых биохимических препаратов и фармацевтических средств на основе морских биополимеров.

Цель и задачи исследования - детальное изучение биологической активности и механизма действия индивидуальных биополимеров морских организмов (митилан, кораллан, фукоидан, уронофукан, хитоолигосахариды, зостерин); изучение возможностей применения морских биополимеров в комбинации с известными лекарственными средствами для достижения аддитивного эффекта; биохимическая характеристика эндогенных лектинов мидии Японского моря Crenomytilus grayanus; определение функциональной роли лектинов мидии С. grayanus в организме-продуценте; изучение сорбционных и антидотных свойств углеводного биополимера зостерина в условиях эксперимента и клинических испытаний при угрозе свинцовой интоксикации у людей, а 4 также экспериментальное оптимизирование его антидотных свойств; разработка комбинированных зостеринсодержащих парафармацевтических средств.

Научная новизна работы. Впервые подробно изучена биологическая активность и механизм действия ряда морских биополимеров животного и растительного происхождения. Показана перспективность исследования комбинированных форм морских биополимеров и известных лекарственных средств. Установлено, что спектр биологической активности сложного высокомолекулярного комплекса - митилана зависит от индивидуального и совокупного вклада отдельных его компонентов: белковой и полисахаридной природы. Получены данные о локализации и функциональной роли лектинов (Л-1 и Л-2) в организме-продуценте (мидия С^гауапш). Определена углеводная (для Л1 и Л2) и молекулярно-эпитопная (для Л-1) специфичность лектинов. Экспериментально доказано, что модификация сульфатированного протеогликана-кораллана приводит к повышению его биодоступности и оптимизации целевого эффекта. С учетом особенностей химической структуры и механизма действия уронофукана сделан вывод о перспективности поиска аналогичных соединений среди морских организмов, действующих по принципу блокирования в системе: вирус-»мишень. Исследованы сорбционные и антидотные свойства зостерина, позволившие рекомендовать его в качестве профилактического и лечебного средства при избыточном поступлении и накоплении в организме тяжелых металлов. Изучена фармакокинетика меченого Н-зостерина, где с учетом молекулярно-массового распределения сделан вывод о его двунаправленном антидотном действии: энтеросорбционном и гуморальносорбционном. Исследования по изучению контактного взаимодействия зостерина и пищеварительных ферментов позволяют прогнозировать отсутствие или наличие негативных побочных эффектов при длительном применении зостерина в качестве элемента выделительной терапии. Осуществлены новые подходы к использованию зостерина в различных комбинациях с лекарственными растениями, в том числе с реликтами Дальневосточной флоры.

На защиту выносятся следующие положения: 1. Морские биополимеры выступают как многофункциональные биологически активные вещества, где наряду с основным направлением действия (например, противоопухолевым; иммуномодулирующим; детоксикационным; антивирусным; антибактериальным и т.д.) отмечаются и другие, сопряженные с основным, положительные эффекты; 2. Морские биополимеры представляют интерес, по крайней мере, в трех номинациях: лекарственные средства; биохимические препараты; биологически активные добавки (БАД). 5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

МОРСКИЕ БИОПОЛИМЕРЫ (БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ)

1.1. ПОЛИСАХАРИДЫ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ И ТРАВ

В Мировом океане ежегодно продуцируется более 550 млрд тонн сырой массы водорослей и трав [215]. Многие виды морских растений применяются в пищевых целях, в традиционной и нетрадиционной медицине. Население стран Восточной Азии (Китай, КНДР, Южная Корея, Япония) и Филиппин издавна регулярно употребляет в пищу как дикорастущие, так и культивируемые морские водоросли. По-видимому, интерес к морским растениям как к сырью для производства деликатесных продуктов питания обусловлен не только пищевым фактором, но и интуитивной потребностью человека в оздоровительном мероприятии такого рода. Так, еще в XIII в. в Китае был издан указ, обязывающий всех граждан употреблять определенное количество морской капусты в качестве диетического средства для поддержания здоровья [174].

В последние годы особенно резко возросло количество публикаций, посвященных изучению полезных свойств морских полисахаридов. Очевидно, этому процессу способствуют (если не движут его) возросшие возможности технологий быстрого разделения и очистки высокомолекулярных компонентов.

Из полисахаридов красных водорослей хорошо изучены и охарактеризованы сульфатированные галактаны. Они встречаются только в этих видах водорослей и не имеют аналогов среди других растительных полисахаридов [218]. Наиболее значимая информация о биологической активности сульфатированных галактанов относится к полисахаридам группы каррагинана, где известны две предельные структуры, обозначаемые греческими буквами "каппа" и "йота". Еще несколько обнаруженных структур относятся к негелеобразующим каррагинанам. В настоящее время пищевая промышленность использует около 70% коммерчески производимых каррагинанов; средняя потребность человека в этих продуктах составляет приблизительно 250 мг/день [23].

В качестве биологически активных веществ каррагинаны используются для воспроизведения модели асептического воспаления, которая приобрела всеобщее распространение и применяется в большинстве работ по изысканию новых противовоспалительных средств[226]. Механизмы провоспалительного действия каррагинанов связаны с высвобождением гистамина и серотонина [28], полипептида брадикинина [117], а также метаболитов арахидоновой кислоты [130,128, ]. Как и другие 6 сульфатированные полисахариды, каррагинаны влияют на свертываемость крови [123]. Заслуживают внимания данные об иммунотропной активности каррагинанов. Известно, что они оказывают избирательное цитотоксическое действие на макрофаги [22]. Это свойство полисахаридов широко используют для "блокады" функции макрофагов в экспериментальных системах in vivo [220]. Неоднозначно влияние каррагинанов на показатели иммунологической реактивности организма. Так, по одним литературным данным, они подавляют реакции гиперчувствительности замедленного типа и антителогенез у животных [139], а по другим - являются митогенами в отношении В-лимфоцитов [56] и стимулируют образование антител [29]. В последнем случае эффект стимуляции рассматривался как результат угнетения в организме популяций супрессорных клеток. Есть сообщение, что каррагинаны усиливают процессы синтеза в фибробластах in vitro [150]. Тем не менее в других исследованиях они подавляли пролиферативную способность фибробластов [151,55]. Биологическая активность каррагинанов во многом зависит от их структуры и молекулярной массы. Например, при биоиспытании каппа- и лямбда-каррагинанов на антиметастатическую активность оказалось, что только ляг^ца-каррагинан подавлял образование метастазов [24]. Из двух видов каррагинана ("каппа" и "йота") в тесте по включению ^Н-тимидина в ДНК фибробластов человека ингибирующий эффект обнаруживал только каппа-каррагинан [142]. Недавно появились сообщения об анти-HIV активности каррагинанов [9]. Было показано, в частности, что лямбда- и каппа-каррагинаны ингибируют активность обратной транскриптазы и подавляют HIV инфекцию in vitro [92].

Описание биологической активности следует дополнить данными, в которых отмечено стимулирующее влияние, поступающих с пищей каррагинанов на химически индуцируемый канцерогенез у крыс [148,7,8]. Это тем более важно учитывать, поскольку каррагинаны используются в качестве пищевой добавки и как противоязвенные средства [93,214].

Из многих видов красных водорослей получают агар, представляющий собой смесь сульфатированных полисахаридов - агарозы и агаропектина. Биополимер агароза состоит из чередующихся остактов D-галактозы и 3,6-ангидро-Ь-лактозы [206]. Сведения о биологической активности указанного полисахарида немногочисленны. Отметим некоторые из них. Парентеральное введение агара мышам в дозе 200 или 2000 мкг за 24 ч до заражения микробной культурой повышало фагоцитарную активность макрофагов [178]. При изучении стимуляции макрофагов агарозой in vitro установлено, что агароза интернализировалась и частично транспортировалась в перинуклеарную зону макрофагов. Возможно, стимуляция макрофагов агарозой могла быть связана с активацией комплемента в фагосомах [58].

Бурые водоросли - это многоклеточные растения; своим названием они обязаны присутствующему в них бурому пигменту фукоксантину. Из наиболее ценных и распространенных полисахаридов бурых водорослей заслуживает внимания альгиновая кислота, содержащаяся во всех крупных бурых водорослях в количестве до 40% от массы сухого вещества [167]. Альгиновые кислоты являются полианионами и представляют собой линейные молекулы [219], построенные из двух мономеров - остатков P-D-маннуроновой и a-L-галактуроновой кислот, связанных 1-4-связями. Важнейшими источниками получения альгинатов (солевые формы альгиновой кислоты) являются Macrocystis pyrifera, Laminaria cloustoni (syn. L.hyperborea), L.digitata, L.saccharina, L.japonica, Noreocystis luetkeana и Ascophylhim nodosum.

Среди публикаций о биологической активности альгинатов преобладают исследования, касающиеся вопросов выведения из организма человека радиоактивных элементов. Обзор литературных данных показал, что основные моменты детоксицирующего действия альгинатов натрия при радионуклидной интоксикации можно свести к следующему [164]:

- действие альгинатов натрия зависит от ботанического вида водорослей-продуцентов, соотношения в полисахаридах D-маннуроновой и L-гулуроновой кислот и наличия свободных карбоксилов (натрий легко обменивается) в гулуроновом фрагменте макромолекулы;

- частичный гидролиз и фракционирование нативных альгинатов способствуют повышению "захватывающей" активности полисахарида;

- альгинаты имеют тенденцию сохраняться в кишечнике человека даже после прекращения их интенсивного применения и оказывают действие в течение 1-2 нед.; препараты альгиновой кислоты в качестве антидотов радионуклидов у людей применяют в виде 5-10%-ных растворов.

Альгиновая кислота образует нерастворимые соли с различными ионами металлов. Специфическая прочность связывания зависит от соотношения в молекуле полисахарида D-маннуроновой и L-гулуроновой кислот. У альгиновой кислоты из Laminaria digitata с высоким соотношением названных кислот сродство с металлом распределяется в следующем порядке: Pb>Cu>Cd>Ba>Sr>Ca>Co=Ni=Zn=Mn>Mg. В то же время у альгиновой кислоты из Laminaria hyperborea (низкое соотношение кислот) порядок распределения несколько иной: Pb>Cu> Ba>Sr> Cd>Ca>Co=Ni=Zn=Mn>Mg [93]. Высокое сродство препаратов альгиновой кислоты к ионам свинца нашло свое отражение и в биологическом эксперименте [195]. Поскольку металлосвязывающая активность альгинатов зависит от их структуры, важно учитывать перспективы использования данного свойства полисахаридов для селективного выведения из организма тех или иных ионов металлов [93]. По-видимому, адсорбционные комплексообразующие свойства полианионных полисахаридов во многом определяют механизмы их биологического эффекта. Это и способность альгиновой кислоты (при интраназальном введении) предохранять мышей от заражения вирусами А и В инфлюэнцы, и применение альгината кальция в качестве гемостатического средства, равно как и применение других гемостатических альгинатных материалов, и т.д. [217,229]. Технологически простыми являются разработки биополимерных покрытий на раны и ожоги у людей. Альгинат натрия - основа таких покрытий - безвреден, полностью рассасывается в организме, стимулирует процессы заживления и легко сочетается с различными лекарственными добавками. Первое отечественное альгинатное покрытие - альгипор (смешанная натриево-кальциевая соль альгиновой кислоты с фурацилином) - ускоряет заживление ожогов, трофических язв и пролежней, а также очищение ран, снижая их инфицированность, уменьшает интоксикацию организма и способствует благоприятному течению раневого процесса [227]. Разрабатываются альгинатные препараты для остановки желудочно-кишечных кровотечений, лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. В основе действия таких препаратов лежит способность образовывать защитную пленку, препятствующую диспепсии и воспалению [23]. Альгиновая кислота и ее водорастворимые соли нашли применение в фармацевтической промышленности в качестве средств, улучшающих распадаемость твердых лекарственных форм в желудочно-кишечном тракте [162].

Среди водорослей, в особенности бурых, обнаружены продуценты биологически активных субстанций, обладающих противоопухолевым действием [64,133,94]. Есть опыт применения морской бурой водоросли, так называемой "морской капусты" (виды Laminaria), в онкологической практике: у ряда онкологических больных стабилизировался опухолевый процесс, продлевалась жизнь неоперабельных больных с опухолями желудка, пищевода, легких, молочной железы с метастазами и прочими аналогичными заболеваниями [174].

В 1959 г. M.Belkin с соавторами начали изучение морских бурых водорослей с целью обнаружения в них полисахаридов, обладающих противоопухолевой активностью. В этом плане было проведено испытание альгината натрия, выделенного из бурой водоросли ламинарии. При введении полисахарида мышам, пораженным асцитной формой саркомы 37, в опухолевых клетках отмечались атипические изменения, которые выражались в их набухании и вакуолизации [12]. Есть сообщение о способности альгинатов препятствовать химически индуцированному канцерогенезу у крыс [152]. Вместе с тем в другом исследовании альгинат натрия, полученный из бурой водоросли Macrocystis pyrifera, не обнаруживал противоопухолевого эффекта [81].

Анализируя полученные результаты, исследователи пришли к выводу, что антибластомная активность препаратов альгиновой кислоты зависит не только от вида экспериментальной опухолевой модели, но и от источника получения водорослевых полисахаридов [37]. Недавно японскими исследователями [94] было подтверждено (при пероральном способе введения препарата) противоопухолевое действие альгината натрия (источник -Ecklonia cava) и его фрагментов, полученных при частичном кислотном гидролизе. Полисахариды вводили через зонд ежедневно в течение 14 дней до трансплантации опухолевого материала и 14 дней после. Как считают исследователи, слабый, но положительный противоопухолевый эффект полисахаридов обусловлен степенью полианионных свойств. Однако М- и G-альгинатные фрагменты были практически не активны, несмотря на их полианионные свойства. Предполагается, что активность полимеров зависит не только от этих свойств, но также и от состояния надмолекулярных структур.

Другие полисахариды бурых водорослей - фукоиданы, или фукансульфаты, также имеют ряд интересных свойств, характеризующих эти полимеры как биологически активные вещества. Фукоиданы определяются в водорослях обычно по содержанию в гидролизатах L-фукозы, которая является главным моносахаридом в составе вышеназванных полисахаридов [219]. Полисахариды специфичны, и в других водорослях, так же как и альгиновые кислоты, не встречаются [167].

В последнее время особое внимание исследователей обращено к сульфатированным полисахаридам водорослей в связи с их ярко выраженной антикоагулянтной активностью [27,137]. Актуальность поиска таких соединений связана в первую очередь с профилактикой и лечением тромбоэмболий, вызванных осложнениями многих заболеваний и хирургическим вмешательством. Из литературы известно, что в результате фракционирования удалось получить препараты фукоидана, которые по антикоагулянтной активности не уступают или превосходят гепарин. Это -полисахариды из бурых водорослей Sargassum linifolium [2], Dictyota dichotoma [1], Padina pavoniax[52], Eisenia bicyclis [144] и Laminaria religiosa [79].

Тщательное изучение антикоагулянтных свойств полисахаридов морских водорослей проводится российскими исследователями. В данных работах источниками фукоиданов служили бурые водоросли Японского моря. Антикоагулянтный эффект оценивался in vivo и in vitro [208]. Наименее токсичными оказались полисахариды с низкой метахроматической и антикоагулянтной активностью. Внутривенное введение фукоиданов сопровождалось транзиторной тромбоцитопенией, независимой от выраженности антикоагулянтного эффекта. Механизм антикоагулянтного действия фукоиданов реализуется посредством ингибирования активности факторов "внутреннего" пути свертывания крови - XI, XII и VII, а не через антитромбин III (АТ-111), как это происходит в случае гепарина [209]. Авторы заключают, что фукоиданы могут быть эффективны при антикоагулянтной терапии у больных с врожденным и приобретенным дефицитом АТ-111. Мори с соавторами [86], изучая полисахариды бурой водоросли Undaria pinnatifida, обнаружил зависимость антикоагулянтной активности (в том числе и способности снижать содержание липопротеидов в сыворотке крови) от молярного соотношения входящих в их состав фукозы и галактозы.

Фукоиданы как природные полиэлектролиты обладают высокой степенью сродства с двухвалентными катионами тяжелых металлов. Это обстоятельство, в частности, нашло свое отражение в исследованиях, касающихся вопросов выведения свинца из организма [77]. Различия в ионосвязывающих свойствах фукоиданов зависят от конкретного источника их получения. Установлено [98,99], что фукоидан, экстрагированный из бурой водоросли Ascophyllum nodosum, связывает двухвалентные катионы в следующей последовательности: Pb>Ba>Cd>Sr>Cu>Fe> Co>Zn>Mg>Mn>Cr>Ni>Hg>Ca. Здесь важно отметить слабую специфичность фукоидана к ионам кальция, поскольку последние играют существенную роль в жизнедеятельности организма. В эксперименте на животных сочетанное введение свинца и исследуемого фукоидана приводило к значительному снижению всасывания свинца и поступления его в организм. Биологическая активность фукоидана из Ascophyllum nodosum зависела от вязкости его растворов, а также от наличия и положения в полимерной молекуле функциональных групп.

Заслуживают внимания исследования, касающиеся противоопухолевых свойств фукоиданов. В серии экспериментов [136,153-158] из различных видов бурых водорослей (Sargassum fulvellum, Laminaria angustata var.longissima, Eisenia bicyclis и др.) были выделены полисахаридные фракции, обладающие противоопухолевой активностью. Каждая фракция содержала значительное количество L-фукозы и обнаруживала противоопухолевое действие в отношении мышиной лейкемии L1210. Установлено, что именно фукоиданы - компоненты полисахаридной фракции из Eisenia bicyclis - отвечают за противоопухолевую активность [144,157]. Из Sargassum kjellmanianum получен ряд фукозосодержащих фракций с противоопухолевым эффектом при асцитной форме саркомы 180 [91]. Примечательно, что дополнительное сульфатирование фукоидана из этого же вида водоросли может приводить к усилению его противоопухолевой активности [156]. Из Laminaria religiosa также получен фукоидан, обладающий выраженным противоопухолевым действием [79]. Однако эффект регистрировался лишь в отдаленные сроки после прививки мышам саркомы 180. Так, на 18-й день показатель массы опухолей у животных, получавших фукоидан, даже превышал таковой в контрольной группе, но на 35-й день эффект торможения роста саркомы 180 составлял 90,4%. Обсуждая механизм противоопухолевого действия, авторы полагают, что фукоидан элиминирует саркоматозные клетки с прокоагулянтной активностью. Небезинтересны также работы [24,25], анализирующие антиметастатические свойства фукоидана из бурой водоросли Fucus vesiculosus. Была установлена прямая корреляция между антиметастатическим эффектом фукоидана и его способностью ингибировать эндогликозидазную активность опухолевых клеток, которая способствует эмиграции последних в здоровые ткани.

Известны данные об угнетающем действии сульфатированных полисахаридов морских водорослей на РНК- и ДНК-содержащие вирусы [30]. В этом плане фукоиданы не являются исключением. Недавно установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Macrocestis pyrifera и F.vesiculosus ингибируют цитопатическое действие вируса везикулярного стоматита [80]. В эксперименте in vitro фукоидан из водоросли Pelvetia fastigiata (молекулярная масса около 100 кДа) ингибировал взаимодействие поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к HBsAg (anti-HBsAg), что является важным прогнозом в предупреждении поражений (иммунными факторами) инфицированных тканей и органов. Взятые для сравнительного изучения фукоиданы из Fucus disticus и F. vesiculosus оказывали аналогичное действие [146]. Актуальность исследований в этой области обусловлена возросшим количеством (около 200 млн чел. в мире) хронических носителей вируса гепатита В, так называемого сывороточного гепатита. Как выяснилось, процесс ингибирования взаимодействия HBsAg и anti-HBsAg прямо пропорционален молекулярной массе сульфатированных полисахаридов. Высказано предположение, что полисахариды, имеющие короткую полимерную цепь, не способны формировать в молекуле стабильную двойную спираль, необходимую для реализации ингибирующего эффекта при взаимодействии HBsAg и anti-HBsAg [146]. Исключительно важными являются результаты работ, указывающие на перспективность поиска сульфатированных полисахаридов [57,45] обладающих в условиях in vitro селективным ингибирующим действием на вирус иммунодефицита человека (HIV). Как и другие сульфатированные полисахариды, фукоиданы блокируют процесс узнавания и

12 связывания между гликопротеином оболочки gpl20HIV и клеточным рецептором CD4 [9,26]. Следует добавить, что антиШУ активность сульфатированных полисахаридов не коррелирует с их антикоагулянтными свойствами и, вероятнее всего, эти два эффекта взаимонезависимы. Обнадеживающие данные получены японскими исследователями [131], установившими синергизм анти-ШУ эффекта in vitro при сочетанном применении фукоидана с азидотимидином. Для клинического применения были рассчитаны дозы, а именно 0,1 мкг/мл фукоидана и 0,014 мкМ азидотимидина. Создание такой концентрации препаратов в сыворотке крови больных AIDS вполне достижимо. Считают, что использование фукоидана в комбинации с азидотимидином значительно снизит побочные эффекты, возникающие в ходе лечения больных.

Из морских бурых водорослей порядка Laminariales выделен полисахарид ламинарин, представляющий по своей химической структуре 1—>3;1—»ö-ß-D-глюкан. Изучение биологической активности полисахарида показало его способность повышать неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных при развитии инфекционного и опухолевого процессов [221]. Имеется сообщение о гипогликемическом действии ламинарина. Эффект наблюдался [149] как у нормальных животных, так и у животных с аллоксан-индуцированным диабетом. В целях повышения биологической активности ламинарина путем ферментативной трансформации (1—>3-ß-D-глюканазами из морских беспозвоночных) был получен глюкан, отличающийся от исходного по молекулярной массе и соотношению 1—>3 и 1-»6-Р-0-связанных глюкозных остатков [179]. Новый 1-»3; l-^ö-ß-D-глюкан, названный "трансламом", оказывал более выраженное влияние на различные звенья иммунной системы. Было показано, что транслам защищал в 100% случаев животных от смертельной генерализованной инфекции [180] и обнаруживал стимулирующее действие на популяцию клеток стволовой фракции кроветворения [181].

Из информации о полисахаридах зеленых водорослей можно выделить работу индийских исследователей об антикоагулянтных свойствах нового сульфатированного полисахарида из Cladophora socialis [147]. Ими установлено, что в состав полисахарида входят галактоза, арабиноза и ксилоза. Антикоагулянтная активность полисахарида была в 4 раза ниже активности гепарина.

Морские травы принадлежат к цветковым растениям. Из морских трав ctu.Zosteraceae (Zostera asiaticaMiki syn.Z.pacifica auct, Z.marina L, Z.noltii Hormen syn. Z. nana Roth, виды Phyllospadix Hook) выделен полисахарид, получивший название зостерин [184]. Основу его молекулы составляет линейная цепь из а-1,4-связанных

13 остатков D-галактуроновой кислоты [264]. Впервые интерес к зостерину как к биологически активному веществу был вызван его антидотным действием при интоксикации свинцом [195,196]. В эксперименте на животных зостерин оказывал модулирующий эффект на иммунобиологическую реактивность организма. Это выражалось в стимулирующем влиянии на состояние ретикулоэндотелиальной системы, индукции выхода в перитонеальную полость мышей макрофагов, увеличении числа клеток, образующих антитела, и отсутствии ингибирующего действия на активность монооксигенез печени [192].

В других исследованиях показана эффективность применения зостерина как гиполипидемического средства для первичной профилактики атеросклероза [228]. Включение зостерина в лечебные комплексы усиливает их гиполипидемический эффект в среднем на 10-15%, что послужило основанием использования зостерина при восстановительном лечении ишемической болезни сердца [185]. Исследована эффективность применения зостерина [17] в комплексном лечении больных с заболеваниямми опорно-двигательного аппарата (обменно-дистрофической этиологии).

Приведенная информационная сводка дает представление о ходе современных исследований в области биологически активных полисахаридов морских водорослей и трав. Для выяснения связи между строением и свойствами вышеназванных биополимеров нужны дальнейшие их химические и фармакологические исследования. Не подлежит сомнению, что изыскания биологически активных полисахаридов морских водорослей и трав были бы значительно результативнее при условии расширения исследований и привлечения соответствующих специалистов.

1.2. БИОПОЛИМЕРЫ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Морские беспозвоночные, в частности моллюски, в глубокой древности применялись китайской народной медициной для лечения "рака" (цит. по 72), но только в последние десятилетия морские организмы как источник самых различных биологически активных веществ стали объектом всестороннего изучения [211,163]. Хорошо известно, что злокачественные новообразования сравнительно редко встречаются у морских беспозвоночных [100]. По-видимому, у последних существуют механизмы, которые препятствуют образованию опухолей и связаны с противоопухолевыми соединениями или стимуляторами фагоцитоза, обусловливающими неспецифическую резистентность организма [205]. Это обстоятельство легло в основу поиска препаратов с антиопухолевой

14 активностью с использованием морских беспозвоночных в качестве объектов такого поиска.

В 1964 г. сотрудница лаборатории Сент-Дьерди А.С.Шмейер [124,125] впервые выделила из широко распространенного съедобного двустворчатого моллюска Mercenaria mercenaria содержащий углевод биополимерный препарат (названный ею мерценином), который обладал выраженной ингибирующей активностью в отношении саркомы 180 и карциномы Кребс-2. Так, из 45 опытных мышей, обработанных после подкожно имплантированной карциномы Кребс-2 мерценином на четвертый день и затем обрабатываемых ежедневно в течение 7 дней, к 180-му дню выжила 41, тогда как из 45 мышей контрольной группы случаев выживания до 180 дней не отмечалось. В то же время по окончанию лечебного курса вес опухолей составлял у контрольных мышей 2450±125, у опытных животных - 620+49 мг (189, 146). Другие исследователи [72] наблюдали терапевтический эффект у хомяков на опухолях, индуцированных аденовирусом 12 и вирусом sv-40 при введении экстракта из моллюска М. mercenaria непосредственно в опухоль или в область вокруг неё. Характерно, что биопрепараты оказывают профилактическое действие на вирусный и химический канцерогенез [72]. Изучение острой токсичности мерценина на мышах показало, что при внутривенном введении его ЛД50 составляет около 680 мг/кг, а при пероральном -более 10 г/кг. Однако in vitro злокачественные клетки Hela и КВ чувствительны к цитотоксическому эффекту мерценина. Данное обстоятельство, по-видимому, связано с белковой компонентой препарата. Кроме мерценина, были изучены водные экстракты из устрицы Ostrea virginica, трубача Busycon canaliculatum, морской улитки Helix ар. и таких моллюсков, как S.trombua gigaa, Муа arenería, Spiula solidasima [125,129]. Все экстракты в той или иной степени обнаруживали антиопухолевую активность. Интересно, что в летние месяцы содержание мерценина в M.mercenaria в 8-9 раз превышает его содержание, приходящееся на остальное время года. Данный феномен нашел простое объяснение: выращивание моллюсков в подогретой морской воде даёт значительно больший выход мерценина [72]. Дальнейшее химическое изучение мерценина показало, что последний представляет собой биополимер, состоящий из полисахаридного компонента, белка, фосфата и неидентифицированного материала [126]. При этом, как полагают исследователи, мерценин является гомогенным препаратом, состоящим из двух прочно связанных компонентов.

В других исследованиях установлена антимикробная и противовирусная активность водного экстракта целого моллюска и частично очищенного экстракта печени

15

M.mercenaria [68-71]. Были выделены вещества, получившие название - паолины. Они представляют собой [101] гликопротеины с молекулярной массой от 8 до 20 кДа. Как оказалось, паолины из печени моллюска обладают более высокой антимикробной активностью [74,75].

Осуществляя широкую программу поиска препаратов против неоплазийного роста, группа японских исследователей [118] в 1978 г. использовала в качестве объекта распространенный в Японском море двустворчатый моллюск - гребешок Patinopecten yessoensis. В результате обработки моллюска были получены 4 фракции, из которых наибольшей активностью обладает 4-я фракция. Активным началом является пептидогликан с мол. массой около 100 кД. Испытуемые фракции вводили в опухолевый очаг на 7, 9, 11-й дни после прививки, когда средний диаметр опухолевого узла достигал 6 мм. Оценку эффективности проведенного лечения осуществляли на 35-й день после подкожной инокуляции 6-106 клеток карциномы Эрлиха или саркомы 180. Наиболее эффективная 4-я фракция в дозе 200 мг/ кг ингибирует рост саркомы 180 на 93,7% и в дозе 150 мг/кг тормозит развитие карциномы Эрлиха на 73,5%. Показано, что пептидогликановая фракция не обладает прямым цитотоксическим действием на опухолевые клетки [118].

В 1984 г. японские исследователи запатентовали способы выделения из морского гребешка противоопухолевых гликопротеинов с молекулярной массой около 5 кДа и 470кДа [119,120]. Низкомолекулярный глико протеин (м.м. 5 кДа) не обладает цитотоксическим действием, но обнаруживает высокую противоопухолевую активность вплоть до полного излечения экспериментальных животных, пораженных лейкозом SN-36, ретикулоклеточной саркомой NTF, индуцированной метилхолантреном, фибросар комой и солидной карциномой Эрлиха [119]. Глико протеин с высокой молекулярной массой (470 кДа) также не цитотоксичен и обладает широким спектром противоопухолевой активности. Важно отметить, что эффект наблюдается при любых маршрутах его введения, в том числе и при наружном применении [120]. В последующем исследовании теми же авторами патентов из морского гребешка был выделен и охарактеризован противоопухолевый глико протеин DC-1 с молекулярной массой 90 кДа. В состав гликопротеина входит 16,8% углеводов, 64,5% протеина, 2,7% липида, 1% минеральных веществ и следовые количества нуклеиновых кислот [121]. Как показали исследования, действующим началом гликопротеина DC-1 является углевод, в состав которого входят М-ацетил-О-глюкозамин, М-ацетил-Б-галактозамин, L-фукоза, D-галактоза, D- манноза, D-глюкоза. При изучении механизма противоопухолевого действия гликопротеина установлено резкое снижение его активности у тимусэктомированных мышей, пораженных саркомой 180, а также стимулирующее действие на цитотоксическую активность макрофагов мышей [121].

Из мантии двустворчатого моллюска Tridacna Squmosa выделен углеводбелковый биополимер, обладающий противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью. Биополимер подавляет рост саркомы 37 и карциномы Эрлиха в среднем на 60%. Его оптимальная лечебная доза - 80 мг/кг, является в тоже время дозой максимально стимулирующей антителогенез [191]. Отсутствие прямого цитотоксического действия биополимера на опухолевые клетки позволили сделать авторам вывод об опосредованном его действии через иммуно-биологические реакции на развитие опухолевого процесса.

Противоопухолевый гликопротеин выделен из целомической жидкости моллюска Dolabella auricularia [160,65]. Гликопротеин, получивший название долабелланин С, имеет молекулярную массу 215 кДа, состоит из трех субъединиц с молекулярной массой 70 кДа и содержит 11% углеводов. Долабелланин избирательно лизирует in vitro опухолевые клетки, тогда как нормальные клетки (эритроциты и лейкоциты) не чувствительны к его цитотоксическому действию. В более поздних исследованиях было показано, что другой гликопротеин моллюска долабелланин А таюке обладает противоопухолевой активностью. Кроме того, этот гликопротеин обладает фунгицидной активностью, полностью подавляя рост грибов в концентрации 2 мкг/мл [53].

Активные полимеры выделены из голотурий семейства; иглокожих. Из высушенной стенки тела Holothuria leucospilota были получены 2 фукозосодержащих кислых полисахарида HL-S и HL-P. Последний идентифицирован как сульфатированный мукополисахарид, a HL-S - как протеогликан, содержащий сульфат фукозана. Наиболее активным биогликаном оказался мукополисахарид HL-P, который значительно подавлял развитие опухолей у мышей [34]. В последние годы японские исследователи провели серию работ по изучению механизмов антикоагулянтного действия деполимеризованного голотурийного глюкозаминоглюкана [84,89,90].

Приведем краткую информационную сводку о биополимере хитозане, относящегося к классу полисахаридов хитина. Структурная формула хитина состоит из неразветвленной цепи Р-(1,4)-связанных остатков 1М-ацетил-0-глюкозамина. Хитозан - N-деацетилированная форма хитина. В настоящее время хитин и хитозан получают из с: панцирей крабов и криветок, в США из панцирей крабов, а в Индии из покрова криветок. Хитин и хитозан эффективны как диетическая волокнистая масса и используются в качестве структурообразователей [169]. Интерес к хитину и хитозану, как биологически активным веществам, резко возрос в последнее время в связи с использованием их

17 модифицированных форм (в основном, олигомерных) для корригирования различных биологических функций организма.

Селективное сульфатирование хитиновых производных придает последним антикоагулянтные свойства, а также способность препятствовать процессу метастазирования [141]. Считают, что одно из производных хитина (О-сульфатированный 6-О-карбоксиметил-хитин) бифункционально подавляет метастазирование меланомных клеток: ингибирует гепариназу и коллагеназу. При этом, как отмечают исследователи, отсутствует эффект прямого ингибирования самих опухолевых клеток.

Ряд работ посвящен изучению биологической активности олигосахаридов хитозана. Рост-подавляющий эффект в отношении экспериментальной солидной опухоли МеШ-А установлен для гекса-]\Г-ацетилхитогексозы и хитогексозы [140]. Механизм противоопухолевого действия указанных олигосахаридов связан с их способностью индуцировать продукцию интерлейкинов, включая интерлейкины 1 и 2, а также с увеличением пролиферации цитолитических Т-лимфоцитов. 1М-ацетилхито-олигосахариды (тетра-К-ацетилхитотетроза и гепта-Ы-ацетилхитогептоза) выступают в качестве активаторов фагоцитов у мышей. Олигосахарид гекса-К-ацетилхитогексоза стимулирует кандидоцидную активность клеток перитонеального экссудата [134]. Таким образом различные производные олигосахаридов представляют широкий простор для направленного поиска соединений с заданной активностью.

1.3. ЛЕКТИНЫ И АГГЛЮТИНИНЫ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ И

БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

К лектинам относятся белки неиммуноглобулиновой природы, способные к специфическому узнаванию и обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов [67]. Агглютининами называют вещества, способные вызвать агрегацию (агглютинацию) микроорганизмов, эритроцитов и других типов клеток. Некоторые из белков-агглютининов являются потенциальными лектинами. Иногда термин "агглютинины" используют в более широком смысле слова, включая в него и термин "лектины". Лектины представляют собой большую гетерогенную группу информационных молекул с различными свойствами и варьирующими физиологическими функциями. Резко возросший в последнее время интерес к белкам этой группы объясняется тем, что с их помощью можно выявлять различия в архитектонике клеточных поверхностей, мембран нормальных и раковых клеток; их

18 можно использовать также в качестве регуляторов биопроцессов и физиологически активных веществ.

Большой интерес для медицины представляют конъюгаты лектинов с антителами, ферментами, антибиотиками и другими лекарственными препаратами. Перспективным направлением является получение и использование лектинов, обладающих лекарственными свойствами. Например, получены патенты на применение лектинов при лечении кожных экзем [222], раковых заболеваний [177], а также вирусных и микробных инфекций [116].

Вместе с тем, поскольку углевод-белковое узнавание играет ведущую роль в формировании многоклеточных организмов и межвидовых сообществ [196], исследование лектинов как компонентов узнающей системы имеет большое общебиологическое значение.

Поиск лектинов в различных видах морских растений успешно проводится в Ирландии, в организмах морских животных - в Мексике, а наиболее тщательный скрининг, охватывающий широкий спектр морских гидробионтов; осуществляется японскими исследователями [63]. В настоящем обзоре проанализированы результаты исследований наиболее охарактеризованных лектинов морских водорослей и беспозвоночных.

1.3.1. Морские водоросли

Несмотря на то, что впервые присутствие гемагглютининов в морских водорослях было обнаружено еще в 1966 г. [17], они не заинтересовали исследователей, и только в 1975 г. [13] внимание биохимиков вновь было обращено к этим объектам. Исследование лектинов морских водорослей позволило доказать их практическую ценность, и в настоящее время фирма «Sigma» (США) наладила производство а-галактозоспецифичного лектина из морской красной водоросли Ptilota plumosa (L.) С. Ag. и лектина из морской зеленой водоросли Codium fragile (Sur.) Hariot.

Зеленые водоросли

В 1975 г. две группы исследователей обнаружили присутствие агглютининов в экстрактах морской зеленой водоросли Codium fragile [13,66]. В последующем была предпринята попытка изолировать и охарактеризовать агглютинины из других подвидов этой водоросли: С. fragile subsp. atlanticum, С. fragile subsp. tomentosoides [111,113]. Установлено, что экстракты С. fragile способны вызывать неспецифическую агглютинацию нативных эритроцитов человека. Однако при обработке эритроцитов папаином наблюдается скачкообразное возрастание специфичности агглютининов. Из

19 широкого круга moho, ди- и трисахаридов, испытанных в реакции по отмене лектин-индуцированной клеточной агглютинации, высокоспецифичным для обоих лектинов оказался N-ацетил-а-О-галактозамин. Его минимальная ингибирующая концентрация составила 6.25 мМ. Помимо этого, агглютинин из С. fragile subsp. atlanticum специфичен к N-ацетил-а-О-глюкозамину. Оба лектина сохраняют свою активность при изменении температуры в пределах от 4 до 45 °С а также при изменении значений рН (между рН 4.5 и рН 9.5). Лектины имеют молекулярную массу 60 кДа и состоят из четырех одинаковых (15 кДа) субъединиц, соединенных дисульфидными связями [114]. В таблице А приведен аминокислотный состав очищенных лектинов. Лектины из С. fragile сохраняют свою активность в отсутствие бивалентных катионов. Общее содержание углеводов для лектина из С. fragile subsp. atlanticum составляло 13.1 %, а для лектина из С. fragile subsp. tomentosoides -11.9 %.

Таблица А

Аминокислотный состав лектинов из зеленой водоросли Codium fragile (Sur.) Hariot [114]

Содержание аминокислот Содержание аминокислот

Аминокислоты в лектинах, мол.% Аминокислоты в лектинах, мол.%

S.fragile S.fragile S.fragile S.fragile subsp. subsp. subsp. subsp. atlanticum tomentosoides atlanticum tomentosoides

Основные: Нейтральные: аргинин 4.98 4.63 аланин 8,01 8.53 гистидин 1.05 1.03 глицин 11.79 12.32 лизин 3.39 3.37 изолейцин 3.94 3.56 лейцин 5.38 6.12

Кислые: метионин 0.73 0.72 аспарагиновая фенилаланин 6.97 6.86 кислота 7.31 8.60 пролин 5.66 5.53 глутаминовая серин 3.19 2.41 кислота 13.17 13.36 треонин 5.70 5.60 тирозин 6.30 7.78 валин 12.39 9.60

Агглютинины обнаружены в таких видах зеленых водорослей, как Ulva lactuca £.[13], Bryopsis hypnoides Lannour., B. plumosa (Huds.) Ag., Codium fomenlosum (Huds.) Stackh. и С. vermilara (Oliv.) Delle Chiaje [107]. Получены также интересные результаты при изучении шести видов зеленых водорослей, произрастающих в прибрежных водах Японии [46]. Гемагглютинирующую активность экстрактов этих видов проверяли на тест-объекте, включающем широкий набор различных видов эритроцитов: кролика, лошади, барана, утки, курицы и человека. Агглютинины из В. hypnoides и С. fragile агрегируют

20 все виды эритроцитов (значения титров 1 : 32 - 1 : 4096). Экстракт из Ulva arasakii проявляет, хотя и при низком значении титров (1 : 4), специфичность к А и О-группам эритроцитов человека. В то же время против эритроцитов кролика установлены более высокие титры (1 : 512). Нужно сказать, что титры гемагглютинирующей активности экстрактов из японских видов водорослей C.fragile и B.hypnoides [46] превышают значения титров активности, зарегистрированный в исследованиях других лабораторий [13,15,107]. Возможно, настоящий феномен зависит от места сбора водорослей и среды их обитания, т. е. от географических факторов, которые в целом могут оказывать влияние на синтез гемагглютининов в зеленых водорослях.

Недавно из экстракта зеленой водоросли Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni выделены четыре агглютинина, названные бунинами А, В, С и D [47]. В способ получения агглютининов входят такие этапы, как осаждение сульфатом аммония, гельфильтрация и хроматофокусирование. Бунины А, В, С и D вызывают реакцию агглютинации с трипсинизированными эритроцитами кролика. Агглютинация эритроцитов сильно ингибируется гликопротеинами с N-гликозидными олигосахаридными цепями, обогащенными остатками маннозы. Исследователи полагают [47], что бунины избирательно узнают гликопротеины, имеющие N-гликозидные цепи высокоманнозного типа, а именно структуру а-(1—>6) связанной полиманнозы и (или) маннотриозы в основной N-гликозидной сахарной цепи дрожжевого маннана. Такая избирательность действия предполагает использование бунинов в качестве реагентов для распознавания сложных углеводных структур.

По химической характеристике А, В, С и D представляют мономерные индивидуальные гликопротеины, имеющие схожий аминокислотный состав с различным количественным содержанием, отдельных аминокислот (табл.В). Несмотря на то что бунины мало отличаются в отношении углевод-связующей активности, они имеют различные изоэлектрические точки, т. е. являются изоагглютининами, а не комбинацией субъединиц одного лектина [47].

В ходе скрининга гемагглютинины найдены и в ряде других видов зеленых водорослей [87,51], но пока лишь только некоторые из них охарактеризованы физико-химически и как биологически активные субстанции.

21

Таблица В.

Аминокислотный состав бунинов А,В,С и D, выделенных из экстракта зеленой водоросли

Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni

Аминокислота Содержание аминокислот в бунинах, мол. %

А В С D

Аспарагиновая кислота 10.8 10.8 11.6 11.4

Треонин 4.6 5.6 5.5 4.6

Серин 10.1 13.1 12.5 7.6

Глутаминовая кислота 11.5 11.6 10.0 15.0

Пролин 6.6 5.5 6.6 4.0

Глицин 14.1 13.3 13.4 15.4

Алании 7.2 7.7 6.6 7.9

Валин 6.0 5.3 4.0 5.4

Цистин 0.6 0.6 0.9 0.8

Метионин 1.4 1.6 2.7 2.3

Изолейцин 4.2 4.8 4.5 5.6

Лейцин 6.0 4.8 2.9 4.1

Тирозин 3.0 3.5 5.2 4.5

Фенилаланин 1.7 2.3 1.5 1.5

Лизин 5.8 6.0 7.6 6.5

Гистидин 1.6 1.5 1.4 0.3

Аргинин 4.8 3.2 3.1 3.2

Бурые водоросли

Среди агглютининов, найденных в бурых водорослях, наиболее полно охарактеризован агглютинин из Fucus vesiculosis L. [35]. По химической структуре он является мукополисахаридом (содержание углеводов до 90%) с молекулярной массой около 2-106 дальтон. Его изоэлектрическая точка соответствует 3.2. Этот агглютинин не имеет субъединичной структуры и содержит 1.23% S, 0.24% Са и 0.06% Р. Агглютинирующая активность мукополисахарида в отношении эритроцитов барана ингибируется только гликопротеинами, олигосахаридные цепи которых аналогичны олигосахаридам, входящим в состав гликопротеинов мембран эритроцитов. На основании результатов, полученных при последовательной деградации олигосахаридных цепей гликозидами, сделан вывод о том, что лигандами для рецепции агглютинина служат внутренние маннозные участки олигосахаридов. Авторы отнесли агглютинин к лектин-подобным молекулам с комплексной углеводной специфичностью.

В одном из исследований обнаружено наличие агглютининов в 28 видах бурых водорослей [33]. По способности изученных экстрактов вызывать агглютинацию различных типов эритроцитов последние распределяются в следующем порядке: эритроциты кролика - 100 %, барана - 71%, цыпленка - 64%, морской свинки - 39%, человека - 3%, лошади - 25%, теленка -21 % [33]. Полученные гемагглютинины, по

22 мнению авторов, являются полифенолами. Степень агглютинирующей активности некоторых изученных бурых водорослей может быть использована как хемосистематический признак.

В бурых водорослях и ранее было отмечено содержание большого количества полифенолов[102], наличие которых, по-видимому, и обусловливало гемагглютинирующую активность получаемых экстрактов [112]. В специальном исследовании было установлено [16], что при блокаде активности полифенолов агглютинирующее действие экстрактов из бурых водорослей заметно снижается. Таким образом, реакция гемагглютинации отчасти могла быть вызвана присутствием полифенолов.

Значительный интерес к изучению лектинов проявили шведские ученые, осуществлявшие скрининг низкомолекулярных и макромолекулярных веществ в различных видах морских гидробионтов [4,73]. Ими испытаны лиофилизованные водные экстракты из ряда бурых и красных водорослей [5]. Гемагглютинирующая активность отмечена в основном у бурых водорослей. С одной стороны, селективную активность в отношении эритроцитов О-группы крови человека проявляют экстракты из Ascophyllum nodosum (L.) Le Jol. и Halidrys siliquosa (L.) Lyngb. С другой стороны, экстракты из Laminaria digitata (Huds.) Lamour. и L. saccharina (L.) Lamour. одинаково хорошо агглютинируют эритроциты О, А и В-группы. Однако углеводная специфичность агглютининов из Laminaria, digitata оказалась смешанного типа, так как агглютинация эритроцитов ингибируется глюкозой, ксилозой, галактозой, глюкуроновой кислотой, N-ацетилглюкозамином, а также N-ацетилнейраминовой кислотой. Практически все экстракты из бурых водорослей, вызывающие реакцию гемагглютинации, способны агглютинировать лимфоциты мышей, стимулируя при этом их пролиферативные потенции. В табл. С суммированы данные о действии водных экстрактов из ряда видов бурых водорослей на некоторые линии опухолевых клеток in vitro [5]. Сильное угнетающее действие на опухолевый рост оказывают экстракты из Fucus serratos L., а экстракты из Ascophyllum nodosum, наоборот способствуют росту злокачественных клеток. Учитывая высокую агглютинирующую активность экстрактов из водорослей в отношении эритроцитов человека, исследователи надеялись использовать это свойство для идентификации некоторых подгрупп крови. Однако такая попытка, осуществленная на 36 образцах крови, оказалась несостоятельной.

Таблица С

Влияние водных экстрактов из бурых водорослей на пролиферацию и агглютинацию злокачественных клеток

Вид Агглютинация включение ^Н-тимидина

К 562 УАСI МОЬТ 4 ЯАЛ и 266 Х63 К 562 УАС I МОЬТ 4 БАШ1 КАЛ ШЗЬ 5 Ь 1210 и 266 Х63

Бисив зеггаЛиэ Ь. Оа 4+Ь с + 0 0 41 41 41 41 41 41 / /

АБСОрЬуИиш nodosum (Ь.) Ье М - 0 0 / - - 0 1 4Бе 0 0 0 0 0 °1

НаМгуэ siliquosa (Ь.) Ьуп^Ь. - 0 0 / 2- - И 1 0 0 0 0 0 0 1

Ьаттапа (Ниёэ.) Ьатоиг. 0 3+ 2- 2+ - 0 И 1 0 0 0 0 0 0 0

Ь.БассЬаппа (Ь.) Ьашоиг. 0 0 0 + 4- 0 1\ 1 0 0 0 0 0 0 0

Примечание: Оа - нет активности; +ь - степень агглютинации опухолевых клеток (+, 2+, 3+, 4+), растущих индивидуально; степень дезагглютинации опухолевых клеток (-, 2-, 3-, 4-), растущих в кластерах; \л - степень ингибирования клеточного роста; в* - степень стимуляции клеточного роста; / - не испытывалось.

24

Красные водоросли Среди других видов морских водорослей наиболее тщательному скринингу были подвергнуты красные водоросли [32,76,51]. Как указывает G.A.Ingram [54], около 25% исследованных видов красных водорослей содержат агглютинины. Первый достаточно хорошо охарактеризованный агглютинин выделен из красной водоросли Ptilota plumosa (Huds.) C.Ag.[14], Особенность этого агглютинина - специфичность к эритроцитам В-группы крови человека. Ферментативная обработка эритроцитов, в частности проназой и папаином (табл.Б), значительно усиливает компетентность эритроцитов В-группы к действию агглютинина из B.plumosa. Добавление в инкубационную среду бычьего альбумина также повышает анти-В-реактивность, но приводит к росту неспецифической агглютинации [106].

Таблица D.

Значения титров реакции агглютинации экстракта из красной водоросли Ptilota plumosa (Huds.) С. Ag. с ферментативно обработанными эритроцитами

Фермент Группа крови (эритроциты)

А В О

Нативные эритроциты (контроль) 1 2 1 : 8 1 2

Трипсин 1 4 1 : 128 1 4

Фицин 1 4 1 : 512 1 8

Проназа 1 8 1 : 1024 1 8

Нейраминидаза 1 4 1 : 256 1 4

Бромелин 1 4 1 : 512 1 4

Папаин 1 2 1 : 1024 1 8

Наиболее сильным ингибитором реакции гемагглютинации (табл.Е) выступает п-нитрофенил-а-Б-галактозид. Характерно, что в случае получения экстракта из предварительно высушенного сырья Р.plumosa его анти-В-специфичность уменьшается. Данный феномен авторы объясняют аффинностью лектинов к присутствующим в клеточной стенке водоросли олигосахаридам и полисахаридам, в состав которых входит a-связанная галактоза. Любопытна трактовка механизмов, обеспечивающих слабую перекрестную чувствительность эритроцитов А и О-группы крови человека к агглютинину из P.plumosa. Авторы считают, что такая чувствительность обусловлена либо за счет пассивной адсорбции на эритроцитах липополисахаридов (например, из Escherihia coli Ogg) с B-активностью, либо за счет реакции деацетилирования N-ацетил-О-галактозамина, которая приводит к трансформации A-антигена в B-подобный антиген.

25

Таблица Е

Ингибирование углеводами реакции гемагглютинации, вызванной экстрактом из красной водоросли Ptilota Plumosa (Huds.) C.Ag. [106]

В ещество-ингибитор Титр ингибиро-вания гемагглютинации Вещество-ингибитор Титр ингибиро-вания гемагглютинации п-Нитрофенил-a-D- 1 : 64 Метил-a-D- галактозид 1 : 4 галактозид

Салицин 1 : 16 D-Галактоза 1 :2

Мальтоза 1 : 16 D-Глюкоза 1 : 2

L-Фукоза 1 : 16 L-Арабиноза 1 : 2

Трегалоза 1 : 8 L-Рамноза 1 : 1

Целлобиоза 1 : 8 N-Ацетил-О- 1 : 1 глюкозамин

Мелибиоза 1 : 8 Фруктоза 1 : 1

Сахароза 1 : 4 D-Манноза

N-Anerara-D- галактозамин

Примечание: Прочерк - не ингибирует.

Агглютинин из Р.plumosa, названный анти-В-лектином [108], состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 65 и 170 кДа. Для сохранения функциональной структуры лектина важны бивалентные катионы. Оптимальный интервал для проявления гемагглютинирующей активности лектина лежит между значениями pH 6.3 и 7.6. Как выяснилось, дисульфидные связи не играют существенной роли в структурных свойствах молекул лектина [108,109].

Из другого вида красной водоросли - Agardhiella ternera (J.Ag.) Schmitz выделен и охарактеризован агглютинин, активным компонентом которого является ß-структурированный протеин с молекулярной массой 12-13 кДа [127]. Протеин агглютинирует эритроциты морской свинки, мыши, кролика, а также лимфоциты мыши и хомяка. Кроме того, в тестах с двумя видами лейкемических клеток мышей (L5178Y и LI210) он избирательно агглютинировал клетки L 5178 Y. Так как моносахариды не ингибируют реакции агглютинации эритроцитов, исследователи полагают, что данный агглютинин специфичен более протяженной структуре, чем структуре простых Сахаров. В протеине содержатся в большом количестве глицин, серин, аланин, треонин (табл.Б); кроме того, он сохраняет активность при нагревании до 50°С в течение 30 мин и даже после кратковременного нагревания до 90°С.

26

Таблица F

Аминокислотный состав ß-структурированного протеина агглютинина из красной водоросли Agardhiella ternera (J.Ag.) Schmitz

Аминокислота Содержание, Аминокислота Содержание, мол % мол.%

Аспарагиновая кислота 9.2 Метионин 2.2

Треонин 7.0 Изолейцин 2.7

Серин 11.7 Лейцин 3.4

Глутаминовая кислота 4.2 Тирозин 3.2

Пролин 5.6 Фенилаланин 5.7

Глицин 18.4 Триптофан 4.3

Алании 10.4 Лизин 2.6

Валин 7.3 Гистидин 0

Цистин (половина) 0.3 Аргинин 2.2

Активность протеина сохраняется в широком интервале значений pH (4-10) и не зависит от присутствия бивалентных катионов [127]. Аналогичный агглютинин выделен из красной водоросли Cystoclonium purpureum (Huds.) Batt. Он состоит из двух одинаковых по молекулярной массе (6 кДа) субъединиц. Как и агглютинин из A. tennera, лектин из С. purpureum избирательно взаимодействует с мышиными лейкемическими клетками L5178Y (в концентрации 30 мкг/мл). Учитывая такую селективность, предлагается использовать агглютинины из красных водорослей в качестве инструментов для идентификации различий в мембранной структуре лейкемических клеток [59]. Агглютинин из С. purpureum агглютинирует и другие типы клеток (табл. G).

В другом виде красной водоросли - Palmana palmata (L.) О. Kuntze [61] найден агглютинин, который взаимодействует с эритроцитами кролика и лошади, а также с энзим-обработанными эритроцитами человека. Лектин избирательно агглютинирует мышиные лейкемические клетки L 5178 Y и сохраняет свою активность между значениями pH 6 и 10. Активный компонент данного агглютинина представлен гликопротеином, имеющим молекулярную массу 43 кДа, причем последний состоит из двух субъединиц равного размера (20 кДа). Активность агглютинина подавляется высокими концентрациями N-ацетилнейраминовой и D-глюкуроновой кислот. Гликопротеин из Р. palmata содержит большое количество серина, глицина и аспарагиновой кислоты.

Гемагглютинины водорослей для проявления активности, как правило, не требуют добавления к инкубационной среде альбумина, хотя последний может усиливать их

Таблица G.

Минимальная агглютинирующая концентрация агглютинина из красной водоросли Cystoclonium purpureum (Huds.) Batt.

Клетки Минимальная Клетки Минимальная и микроорганизмы агглютинирующая и микроорганизмы агглютинирующ концентрация, ая концентрация, мкг протеина/мл мкг протеина/мл

Эритроциты: Мышиные леикемические клетки:

Морской свинки 0.6 L5178Y 30 кролика 2.5 L1210 мыши 10.2 Морские бактерии: лошади 80 Microcyclus marinius 80 барана - Vibrio alginolyticus человека: Pseudomonas sp.

А-группа 40 Морские дрожжи

В-группа 40 Metschnik owia reukaufii

О-группа 20 Морской гриб

Лимфоциты: Dendryphiella salina морской свинки 18 Обыкновенные дрожжи мыши 10 Candida albicans

Примечание. Прочерк - активность проверялась при концентрации агглютинина 1000 мкг/мл. действие. Необычный в этом плане агглютинин получен из красной водоросли БоНегга скогёаШ (С. Ag.) I. А§. Он проявляет активность только в присутствии альбуминах [110]. ■/ Способность экстракта из Б. скоМаМз агглютинировать эритроциты человека независимо от их групповой принадлежности косвенно свидетельствует о том, что у всех типов эритроцитов есть общий рецептор для гемагглютинина. Лектин-индуцированная клеточная агглютинация подавляется сиалогликопротеинами фетуина, а также бычьим и свиным муцином. По мнению авторов, лектин связывается преимущественно с рецептором, имеющим дисахаридный остаток: О- (2—>6)-глюкозидсиаловая кислота, связанная с 2-ацетамидо-2-дезокси-0-галактопиранозой. Молекулярная масса лектина 35 кДа. Для получения лектинов, специфичных сиаловой кислоте, в основном используется гемолимфа крабов, но последняя не всегда доступна. Подобные лектины, по данным некоторых исследователей [110] могут быть получены из водоросли 4b.chorda.lis, культивируемой в лабораторных условиях. Среди лектинов красных водорослей несомненный интерес .представляют четыре электрофоретически гомогенных агглютинина, полученные из Нурпеа }аротсо Тапака [48]. Выделение агглютининов осуществляется обычными методами (водноэтанольная экстракция, осаждение 80%-ным сульфатом аммония, ионообменная хроматография на БЕАЕ-Тоуореаг! 650 Б, гель-хроматография на сефадексах 0-200 и 0-75). Агглютинины получили название гипнины

А, В, С и В. Гипнин А является мономерным пептидом (молекулярная масса 42 кД, изоэлектрическая точка 4.3), содержащим большое количество серина и глицина; ТМ- и С-терминальные аминокислоты представлены соответственно тирозином и серином. Полагают, что гипнины С и В могут быть димерными или тримерными формами гипнина А, тогда как гипнин Б совершенно отличен от остальных. Все тестируемые гипнины агглютинируют эритроциты кролика и лошади (табл. Н), причем, агглютинирующая активность заметно возрастает в системе с трипсинизированными эритроцитами кролика.

Таблица Н.

Минимальная агглютинирующая концентрация (в мкг протеина/мл) гипнинов А,В,С и D из красной водоросли Нурпеа japónica Тапака

Клетки или микроорганизмы Гипнины

А В С D

Эритроциты кролика 3.12 5.25 7.5 35.0

То же (трипсинизированные) 0.003 0.011 0.03 0.136

Эритроциты лошади 22.5 10.5 7.5 70

-"- барана 250 42 15 70

-"- цыпленка 31 42 15 70

-"- человека:

А-группа 500 42 15 70

В-группа 500 42 15 70

О-группа 500 42 15 70

Морские бактерии:

Vibrio sp. ±500* - -

Pseudomonas sp. ±500* - -

Мышиные раковые клетки F МЗА 0.32 - -

Примечание: * - слабая или негативная агглютинация; прочерк - определения не проводили.

Гипнин А сильно агглютинируют мышиные опухолевые клетки F МЗА, но не обнаруживает активности в тестах с морскими бактериями Vibrio sp. и Pseudomonas sp.

48]. Агглютинины Н. japónica специфичны гликопротеинам с N-гликозидными сахарными цепями сложного типа и гликопептидной фракции из фетуина. Ни один из взятых моносахаридов не ингибирует гемагглютинирующего действия гипнинов А, В^ С и D. Исследователи полагают, что гипнин А, как и гипнины В, С и D, узнает в коре маннана ветвления по ходу N-гликозидной сахарной цепи. Такая избирательность открывает перспективу использования гипнинов при изучении углеводных структур. Недавно описан митогенный лектин из красной водоросли Carpopeltis fiahe Hata (Holmes) Okamura

49]. Этот лектин, названный карнином, представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 25 кДа. Он содержит большое количество глицина и аспарагина,

29 что собственно присуще агглютининам, полученным не только из водорослей, но также из наземных растений. Карнин сильно агглютинирует интактные эритроциты кролика, мыши и лошади. Активность карнина ингибируется гликопротеинами с N-гликозидными углеводными цепями: трансферрином, фетуином и oq-кислым гликопротеином. По своему ингибирующему действию фетуин в 30 раз уступает десиалированной форме фетуина (асиалофетуину). Овомукоид и овальбумин не снижают активности карнина.

Установлено, что манноолигозиды дрожжевого маннана, полученные ацетолизом N-гликозидного гликопептида или N, N'-диацетилхитобиозы не Были эффективны как ингибиторы [49]. Это объясняется тем, что образованные при ацетолизе [расщепляющем в ' основной цепи дрожжевого маннана только а-(1—>6)-связь] манноолигозы (маннобиоза, маннотриоза, маннотетроза) составлены из а-(1->2)- и а-(1—>3)-связанных боковых цепей. Исследователи считают, что карнин узнает маннотриозный участок в коре N-гликозидной сахарной цепи и ос-(1—>6)-связанную полиманнозу. Таким образом, подобно лектинам из Нурпеа japónica [48] и Boodlea coacta [47] карнин может найти применение в качестве реагента при исследовании сложных углеводных структур. Интересно, что карнин - это первый химически охарактеризованный лектин из морских водорослей с митогенной активностью.

Три агглютинина выделены из красной водоросли Solieria robusta (Grev.) Kylin [50]. Эти новые белки, названные солнинами А, В и С, представляют собой мономерные гликопротеины с одинаковой молекулярной массой - 23 кДа (при гельфильтрации) и 29 кДа (при SDS-электрофорезе), но с разными значениями изоэлектрических точек - 4.3, 4.2, 4.1, соответственно. Из аминокислот в составе этих агглютининов преобладают глицин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Солнины сильно агглютинируют эритроциты кролика, но неспособны агглютинировать эритроциты человека и мышиные опухолевые клетки F МЗА. Гемагглютинирующая активность солнинов подавлялась гликопротеинами, несущими N-гликозидные сахарные цепи. Как и агглютинин из Carpopeltis flabellata, солнины проявляет митогенную активность. В опытах in vitro установлено ингибирующее действие изоагглютининов из S. robusta на лейкемические клетки мыши L1210 и опухолевые клетки F МЗА [50].

Обращают на себя внимание работы, рассматривающие сезонные различия гемагглютинирующей активности лектинов морских водорослей. Из красной водоросли Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenf выделено три гемагглютинина, имеющих молекулярную массу 300-400, 100 кДа (изоэлектрическая точка 4.2) и 45 кДа (изоэлектрическая точка 4.7). Гемагглютинины с высокой молекулярной массой (300-400

30 и 100 кДа) продуцировались этой водорослью в декабре, феврале и марте, в ноябре продукция их была слабой или отсутствовала совсем. Гемагглютинин с низкой молекулярной массой (45 кДа) был обнаружен в водоросли в период от ноября до марта следующего года [138].

Из экстракта красной водоросли 'Пскосагрш сптШ (С5те1.) 11ирг. посредством ионообменной хроматографии и рехроматографии на БЕЛЕ-целлюлозе получен агглютинин с молекулярной массой 26 кДа [210]. С помощью аминокислотного и углеводного анализов было установлено, что в состав данного агглютинина входит до 32 % углеводов. Полученный агглютинин - гликопротеин агглютинировал эритроциты кролика, крысы и клетки карциномы Эрлиха. Он термостабилен (полностью теряет активность после кипячения в течение 30 мин), устойчив к действию комплексона этилендиаминтетраацетата (ЭДТА). Углеводная специфичность гемагглютинина из Т. сггпИин не установлена.

Интерес к изучению лектинов и агглютининов из морских красных водорослей объясняется тем, что эта группа водорослей богата не только разнообразием видов, но и разнообразием индивидуальных свойств содержащихся в них биополимеров [32,115].

Из 270 видов морских водорослей 105 обладают гемагглютинирующгй активностью [50]. Однако наиболее полно охарактеризованы агглютинины лишь из 11 видов. Необходимо отметить, что в отличие от лектинов наземных растений, имеющих субъединичную структуру и специфичность к моносахаридам, лектины водорослей имеют меньшую молекулярную массу, как правило, мономерны и не аффинны к моносахаридным остаткам. Из трех отделов водорослей (зеленые - СМогорИуШ, бурые -РИаеорИу1а, красные - ЯИос1орИу(а), исследованных на присутствие лектинов и агглютининов, наиболее широко изучены красные водоросли, поскольку эта группа растений богата не только разнообразием видов, но и разнообразием индивидуальных свойств содержащихся в них биополимеров. По-видимому, лектины выполняют определенную функцию в клетках всех видов морских водорослей. При оптимизации биологических тест-систем японским исследователям удалось среди 31 вида морских водорослей выявить 27 видов, продуцирующих гемагглютинины [51]. Это свидетельствует о том, что при адекватных методах выявления агглютининов список последних может быть значительно расширен.

Безусловно многие виды водорослей изучены еще далеко не полностью. Предстоит очень большая работа биохимиков не только по выявлению лектинов и агглютининов, но и по установлению их структур, аффинности, а также той

31 физиологической функции, которую они выполняют в жизнедеятельности морских водорослей.

1.3.2. Морские беспозвоночные

Губки

Губки Axinellapolypoides содержат по крайней мере пять различных лектинов [21]. Два из них удалось выделить и охарактеризовать. Лектины различаются по молекулярной массе (15 и 21 кДа), аминокислотному составу, электрофоретической подвижности и содержат до 0,5% гексоз [18]. Двухвалентные катионы, включенные в структуру лектинов, не удаляются ЭДТА, что затрудняет выводы о роли Са2+ в сохранении функций этих белков. Оба лектина в большей степени специфичны к олигосахаридам с ßl~-»6-связанной терминальной D-галактозой, чем к олигосахаридам, в которых стерео изомер D-галактозы представлен а-аномером [19]. Один из исследуемых лектинов А. polypoides является митогенным белком, активность которого сравнима с такими известными растительными митогенами, как фитогемагглютинин и конканавалин А.

Из губки Aaptos papillata получены три лектина (1,11,III). По данным электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, лектин 1 дает две полосы, соответствующие молекулярным массам 12 и 21 кДа, в то время как лектины II и III имеют только одну полосу - 16 кДа [19]. Лектин 1 взаимодействует с группоспецифичными веществами крови человека, содержащими терминальные остатки N-ацетилглюкозамина. Лектины II и III преципитируют с гликопротеинами, углеводная компонента которых имеет в своем составе терминальные N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин или остатки сиаловых кислот.

Специфичные к D-галактозе гемагглютинины найдены в губке Dysidea herbacea [63]. Основным компонентом агглютинирующей фракции является белок ДНА-1 с молекулярной массой 26кДа. Белок способен диссоциировать на субъединицы равного размера (14кДа). По данным аминокислотного анализа, лектин содержит большие количества остатков глутаминовой и аспарагиновой кислоты. Отсутствие полу-цистеина указывает на то, что субъединицы ДНА-1 соединены нековалентной связью. Белок ДНА-1 взаимодействует с эритроцитами человека (АВО-групп), кролика и сперматозоидами морской звезды Asterina pectinifera. Среди ряда Сахаров, испытанных в реакции по отмене гемагглютинируюшей активности ДНА-1, лучшими ингибиторами оказались галактоза и лактоза. Вместе с тем D-глюкуроновая кислота, хорошо известный ингибитор агрегирующего фактора губок, в данной реакции обнаруживает слабую активность.

32

Установлено, что агглютинирующая активность белка ДНА-1 не зависит от двухвалентных катионов [63].

Какова вероятность обнаружения гемагглютининов в губках? Среди 48 видов, изученных в ходе скрининга губок, около 42% продуценты гемагглютининов [82]. Однако только четыре из них (Haliclona sp., Cinachyra tenuifolia, Callyspongia viridis, Terpios zeteki) отличались высокой активностью. Выделенные из Haliclona sp. и Cinachyra tenuifolia и очищенные гемаглютинины ингибируются лактозой/р-0-галактозил-(1—>4)-а-D-глюкоза), но не мелибиозой (Р-0-галактозил-(1—>6)-а-Б-глюкоза), что указывает на специфичность этих лектинов к олигосахаридам, содержащим терминальные остатки |3-1,4-связанной D-галактозы. Молекулярная масса обоих лектинов, соответствующая 24 (Haliclona sp.) и 22 кДа дальтон (Cinachyra tenuifolia), сравнима с молекулярной массой описанных выше лектинов из А. polypoides, А. papillata и D. herbacea.

Членистоногие

Еще в 1903 г. Ногучи [95] обнаружил присутствие агглютининов в гемолимфе мечехвоста Limulus polyphemus. Активность компонента, вызывающего агглютинацию эритроцитов млекопитающих, ингибировалась сиалосодержащими олигосахаридами, но не самими сиаловыми кислотами. Агглютинирующий компонент, являющийся сиалоспецифичным лектином, получил название лимулин. По химической структуре он представляет собой белок с молекулярной массой 400 тыс. дальтон, требующий для проявления активности присутствия Са2+ [78]. Этот белок может диссоциировать на комплексы молекул А- В (молекулярная масса 40 кДа), которые в свою очередь способны диссоциировать на А- и В-субьединицы с молекулярной массой соответственно 18 и 24 кДа. На основании структурного анализа и электронной микроскопии авторы работ [104] считают, что нативная молекула лектина состоит из 12 А-В-комплексов, уложенных в два параллельных гексагональных кольца, причем агрегация комплексов не требует участия ковалентных связей. Более тщательное изучение лимулина показало его специфичность к гликопротеинам, содержащим дисахарид-М-ацетилнейраминовая кислота-а-2—»3(6)-N-ацетилгалактозамин, а также к ганглиозидам, компонентом которых является N-гликолилнейраминовая кислота [105].

Установлено [104], что лимулин по химической структуре и функциональным свойствам сходен с С-реактивным белком (реактант острой фазы воспаления) млекопитающих. Содержание такого С-реактивного белка в гемолимфе L. polyphemus составляет 5 мг/мл, тогда как у человека даже в фазе острого воспаления только 0,1 мг/мл. По-видимому, высокие концентрации лимулина в организме L. polyphemus указывают на важность тех биологических функций, которые несет этот белок.

Недавно сиалоспецифичный лектин был обнаружен в гемолимфе шести видов калифорнийских прибрежных крабов [103]. Наибольший уровень лектина отмечен в лимфе краба Cancer antennarius. В нативном состоянии это димерный белок. Молекулярная масса субьединицы очищенного лектина составляет 36 кДа. Как и лимулин, лектин С. antennarius относится к кальцийзависимым белкам. В отличие от других известных сиалоспецифичных лектинов, проявляющих широкий круг специфичности к сиаловым кислотам (в семейство сиаловых кислот входит более 20 производных N-ацетилнейраминовой и N-гликолилнейраминовой кислот), лектин С. anteiinarius специфичен только к группе 9-О-ацетил- и 4-0-ацетилсиаловых кислот. В морской воде - среде обитания крабов встречается ряд бактерий, включая E.coli Kl. Из двух форм E.coli К.1 гемолимфа C.antennarius избирательно агглютинирует штамм бактерий, антигены которого содержат О-ацетилсиаловую кислоту [103]. В этой связи лектин может выступать в качестве опсонина, т.е. фактора, связывающего микроорганизмы и тем самым способствующего поглощению клетками гемолимфы беспозвоночного. Нужно отметить важную роль О-ацетильных групп в биологических системах: они могут влиять на ферментативные реакции при катаболизме гликоконъюгатов, снижать или ингибировать активность бактериальных и вирусных сиалидаз, а также изменять иммуногенность сиалоконъюгатов [22]. У млекопитающих О-ацетилсиаловые кислоты обнаруживают широкое видо- и тканеспецифическое распределение [60]. Таким образом, лектин из гемолимфы С. aniennarius может быть использован в качестве биорегулятора или инструмента для изучения локализации и распределения в биологических объектах гликоконъюгатов, содержащих О-ацетилсиаловую кислоту.

Проблематичен вопрос, каким образом один, а не группа различных агглютининов эффективно распознает то обилие биологического материала, с которым контактирует беспозвоночное. С этой целью на примере морского беспозвоночного Homarus americanus было продемонстрировано, что агглютинины, присутствующие в гемолимфе животного, являются гетерогенной популяцией белков [40]. Из множества агглютининов, циркулирующих в гемолимфе Н. americanus, удалось выделить и охарактеризовать два индивидуальных агглютинина, которые существенно различались по молекулярной массе и углеводной специфичности. Это агглютинин LAg-1 (константа седиментации 19 S) и агглютинин LAg-2 (константа седиментации II S), специфичные соответственно к N-ацетилнейраминовой кислоте и N-ацетилгалактозамину [41,42]. Оба агглютинина

34 диссоциируют на субъединицы равного размера (молекулярная масса 55 кДа) и требуют для проявления своей активности присутствия

Наличие гетерогенных агглютининов отмечено и у морских желудей Balanus (Megabalanus) roseus. Агглютинины, получившие название BRA-1 (молекулярная масса 200 кДа), BRA-2 (120 кДа) и BRA-3 (43 кДа), выделены из целомической жидкости животного [62]. Их гемагглютинирующая активность в различной степени ингибировалась D-галактозой, D-лактозой, а также D-галактуроновой, D-глюкуроновой и N-ацетилнейраминовой кислотами. Исключение составляет агглютинин BRA-3; он не ингибируется лактозой. Целомическая жидкость Balanus balanoides содержит агглютинин, представляющий собой гликопротеин с молекулярной массой 300 кДа [96]. Агглютинин состоит из трех различных субъединиц. Молекулярная масса главных его субъединиц соответствует 70 кДа, Гемагглютинирующая активность очищенного агглютинина ингибируется D-галактуроновой, D-глюкуроновой и N-ацетилнейраминовой кислотами. Есть сообщение о способности лектинов из морских желудей, B.roseus и В. balanoides индуцировать in vitro в кооперации с макрофагами мышей лизис опухолевых клеток [169]. Лектин B.roseus обнаружил также противоопухолевую активность в экспериментах in vivo. Предполагается, что опухолевые клетки распознаются через углеводные лиганды клеточной мембраны, в том числе через лиганды, входящие в состав опухолеассоциированного антигена, а некоторые лектины животных участвуют в опосредованном макрофагами цитолизе и отторжении неоплазийных тканей.

Моллюски

Изучение лектинов моллюсков представляет значительный интерес в связи с имеющимися данными об их противоопухолевой, противовирусной и противомикробной активности.

Первое сообщение о присутствии гемагглютининов в гемолимфе мидии Myíilus edulis было представлено в 1976 г. Харди и др. [43]. Таких агглютининов оказалось два. Как было установлено, один из них - агглютинин-лизин - обладает гемолитическим действием в отношении различных видов эритроцитов позвоночных. При этом оптимум его активности регистрируется при рН 7-9; при рН 5 активность полностью ингибируется. Оба агглютинина кальцийзависимые белки. Присутствие в тест-системе N-ацетилнейраминовой кислоты или сиалосодержащих гликопротеинов - муцина подчелюстной железы быка и фетуина - ингибирует индуцированную лектином агглютинацию эритроцитов человека. Из гомогената тканей М. edulis был выделен еще один галактозоспецифичный лектин [97]. Молекулярная масса очищенного лектина (по данным электрофореза в додецилсульфате натрия) составляет 18 кДа. Он стабилен при нагревании до 35°, агглютинирует эритроциты человека и кролика. В составе лектина не обнаружено углеводов.

Сиалоспецифичные лектины выделены из мидии видов Mytilus galloprovincialis, Mytilus edulis, Mytilus perna, Mytilus californeanus, Mytilus smaragdinus. Лектины получали с помощью аффинной хроматографии на бромцианактивированной сефарозе, связанной с муцином поджелудочной железы быка. Они представляют собой полипептиды с молекулярной массой от 14,5 кДа до 30,0 кДа [116]. На основе одного из сиалоспецифичных лектинов были разработаны лекарственные препараты, обладающие антибактериальной активностью широкого спектра действия, а также способ получения иммунной сыворотки, активной против некоторых вирусов гриппа.

Из пищеварительной железы моллюска Placopecten magellanicus [20] выделен лектин, имеющий две характерные особенности. Во-первых, он термостабилен, его агглютинирующий титр не снижается после нагревания раствора при 100°С в течение 1 часа. Во-вторых, лектин устойчив к действию протеолитических ферментов, таких как протеиназа К, проназа, трипсин. Его молекулярная масса соответствует 14 кДа. Лектин агглютинирует эритроциты человека, барана, грамотрицательные бактерии. Он специфичен к фетуину, тиреоглобулину, кислому гликопротеину человека, содержащему N-ацетилнейраминовую кислоту.

Лектин из гемолимфы двустворчатого моллюска устрицы Crassostrea virginica является гликопротеином, состоящим из субъединиц с молекулярной массой 20 кДа. Лектин специфичен к D-галактозамину, N-ацетилгалактозамину, N-ацетилглюкозамину и выполняет функцию опсонина. Методом иммунофлуоресценции показано, что лектин присутствует на наружной поверхности клеточной мембраны гемоцитов C.virginica. Сделан также вывод о серологическом подобии лектинов гемолимфы и гемоцитов. Лектин гемоцитов играет роль рецептора мембран в распознавании инородных тел [3]. Из гемолимфы устрицы Pinctada fucata martensis выделен лектин, который имеет молекулярную массу 440 кДа и состоит из 22 субьединиц с молекулярной массой 20 кДа [135]. Очищенный лектин галактозоспецифичен, поскольку из ряда Сахаров D-галактоза и N-ацетилгалактозамин обнаруживают наибольшее сродство к этому лектину. Хорошо известен и достаточно подробно изучен лектин двустворчатого моллюска Tridacna maxima, названный тридакнином [10,11]. Лектин специфичен к D-галактозе и представляет собой гликопротеин (содержание углеводов до 70%) с молекулярной массой 500 кДа. Он агглютинирует эритроциты человека, кролика, морской свинки, крысы,

36 свиньи и цыпленка Тридакнин обнаружен во всех видах моллюсков сем. Tridacnidae. [143].

В моллюске Neptúnea intersculpta выявлено три вида лектинов - NIA, NIB, NIC. Лектин NIA структурно подобен другим лектинам моллюска, однако в его составе не обнаружено углеводов. Гемагглютинирующая активность специфически ингибируется лактозой. Лектин NEB состоит из трех субъединиц (молекулярная масса 61, 66 и 68 кДа) и содержит высокое количество кислых аминокислот [132]. Гемагглютинирующая активность сохраняется при 45°, ингибируется лактозой, N-ацетилгалактозамином и D-галактозой. Лектин NIC является гликопротеином (содержит 2,5% нейтральных полисахаридов) и представляет собой октамер (молекулярная масса 112 кДа), состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой 14 кДа. Хотя по аминокислотному составу лектин NIC близок к лектинам NIA и NIB, содержание в нем таких аминокислот, как серин, глицин и валин, значительно выше. Лектин специфичен к лактозе, галактозе и N-ацетилгалактозамину.

Содержат лектины гемолимфа, гонады и оплодотворенные яйца заднежаберного моллюска Aplysia [39,40]. Из яиц японского вида Aplysia kurodai выделен лектин с молекулярной массой 70 кДа [60]. Нативную форму лектина составляют шесть субъединиц с молекулярной массой 13 кДа. Специфическая гемагглютинация ингибируется D-галактуроновой кислотой. В отличие от большинства других агглютининов морских беспозвоночных лектин A.kurodai устойчив к обработке трипсином или проназой, что в свою очередь свидетельствует об отсутствии в его молекуле участка для ферментативной атаки названных выше белков. Гонады и оплодотворенные яйца другого вида морского зайца A.depilans также содержат специфичный к D-галактуроновой кислоте и D-галактозидам лектин [39]. Последний представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 55-60 кДа. В то же время лектин из гемолимфы A.depilans специфичен к N-ацетилнейраминовой кислоте и некоторым аминосахарам [40]. Представляет интерес работа [161] по изучению взаимодействия лектинов гонад и гемолимфы Aplysia с бактериями. Установлено, в частности, что лектин гонад и лектин гемолимфы взаимодействуют с некоторыми штаммами E.coli, Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa. Оба лектина хорошо взаимодействуют как с бактериями, ассоциированными с самим моллюском, так и с бактериями, обитающими в морской среде (Vibrio harveyi и Photobacterium leiognathí).

37

Иглокожие

Целомическая жидкость морских ежей АЫкоайапз сгазягзрта, РхеийосеМгоЫъ йергехнт и Нетгсеп1го1т рикИегптш обнаруживает гемагглютинирующие свойства. Из целомической жидкости Асгаяямрша удалось выделить гемагглютинин - белок с молекулярной массой 300 кДа [38]. В отсутствие он утрачивает связывающую активность по отношению к эритроцитам человека. Гемагглютинин А. сгс^18рта оказался мультимерным белком, каждая субъединица которого (молекулярная масса 26 кДа) состоит из двух одинаковых по молекулярной массе (13 кДа) полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. Гемагглютинин не обнаруживает специфичности к моносахаридам. Вместе с тем присутствие в инкубационной среде триптических фрагментов мембран эритроцитов человека ингибирует его активность. В данном случае взаимодействующей структурой фрагментов является щелочнолабильная углеводная цепь рМ-ацетилнейраминовая кислота- (а2->3 ) галактоза-((51 —>3)-Ы-ацетилнейраминовая кислота-(а2—>6)-К-ацетилгалактозамин->серин (или треонин)], в которой наиболее важным специфическим участком, подавляющим индуцированную лектином гемагглютинацию, выступает дисахаридная структура: галактоза (р1—>3) К-ацетилгалактозамин-1—»серин (или треонин).

На основании вышеприведенной информации о лектинах и агглютининах морских водорослей и беспозвоночных можно сделать общебиологическое заключение. При переходе от простейших к многоклеточным организмам, когда возможности биохимического совершенствования были в основном уже исчерпаны, прогресс в организации живого сместился в сторону морфологии, а иерархия, интеграция и узнавание стали качественно новыми атрибутами в развитии живой материи. Явление узнавания типа лиганд - рецептор, при котором взаимодействие поверхностей устанавливается при стерической дополнительности (комплементарности), имело первостепенное значение. Авторы работы [212] полагают, что лиганд-рецепторные взаимодействия не были жизненно необходимыми механизмами на ранних стадиях филогенеза, но стали таковыми на стадии образования ассоциатов клеток. Процесс установления лиганд-рецепторных взаимоотношений в ходе эволюции не известен, поэтому особый интерес приобретают факты, способствующие пониманию сути этого процесса. Такие углеводраспознающие молекулы, как лектины, встречаются на всех уровнях организации живого. С помощью высокочувствительных методов установлено, что лектины чрезвычайно широко распространены не только в пределах вида, но и в органах и тканях дифференцированных организмов. Например, у млекопитающих

38 лектины обнаружены в печени, легких, сердце, клетках имунной системы, поджелудочной железе, мышцах, плазме крови, матке, сперматозоидах, яйцеклетках и эмбрионах [188].

Лектины широко распространены среди различных групп морских беспозвоночных [21,36,83,105,116,212]. У наиболее примитивных представителей - губок и кольчатых червей лектины имеют молекулярную массу, не превышающую 40 кДа и, как правило, представляют собой мономерные или ассоциированные в димерные формы белки [82]. Уже среди лектинов членистоногих - организмов, ведущих активный образ жизни, появляются мультимерные белки с молекулярной массой 450 кДа. На примере членистоногого Homarus americcinus установлено, что агглютинины представляют в гемолимфе гетерогенную популяцию белков [241]. У моллюсков и иглокожих лектины выступают в качестве широкой гетерогенной популяции как мультимерных, так и моно-или димерных белков.

Как следует из материалов настоящего обзора, у морских беспозвоночных лектины встречаются в основном на поверхностях мукоидных клеток губок (примитивные формы беспозвоночных) и в таких жизненно важных системах целомических беспозвоночных, как защитная (иммунная) и репродуктивная (половая). В первом случае у целомических животных организм с помощью лектинов сортирует состав эндогенной среды на «свое» и «чужое», во втором, вероятно, осуществляет контроль за развитием репродуктивных органов [186]. И, наконец, у морских беспозвоночных отмечено участие лектинов в метаморфозе личинки, что свидетельствует о каких-то весьма тонких механизмах, посредством которых эти информационные белки избирательно и в свое время воздействуют на компетентные им углеводные структуры.

Хотелось бы выделить и тот факт, что у лектинов морских беспозвоночных, так же как и у лектинов высших растений и позвоночных животных, наблюдается тенденция большего сродства к Р-аномерным формам углеводов, нежели к их а-аномерам. По мере возрастания таксономической и анатомической сложности морских беспозвоночных возрастает гетерогенность лектинов, среди которых появляются сложные мультимерные формы, образующие четвертичные структуры. По мнению некоторых авторов мультимерность (и, как следствие, увеличение молекулярной массы) в структуре лектинов беспозвоночных необходима для усиления их действия и, вероятно, может служить важным фактором в молекулярной эволюции некоторых белков. Сравнительный анализ лектинов растительных организмов показал аналогичную закономерность: в отличие от лектинов наземных растений, имеющих субьединичную структуру и специфичность к моно- и олигосахаридам, лектины более древней группы растений - морских водорослей

40

2. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лоенко, Юрий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Изучен спектр биологической активности ряда морских биополимеров животного и растительного происхождения. Общим свойством исследуемых биополимеров является способность ингибировать рост злокачественных новообразований, модулировать реакции иммунитета, а также препятствовать росту вирусов и бактерий. Механизм биологического действия биополимеров реализуется на молекулярно-клеточном и системном уровнях.

2. Способность митилана повышать биологическую реактивность организма-опухоле-носителя. а также положительно влиять на его иммунологическую реактивность (стимуляция иммуногенеза, митогенная активность in vitro и in vivo, усиление фагоцитарной и цитостатической активности макрофагов), сочетается с другой необычной способностью этого биополимера: оказывать прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки. Настоящий феномен обусловлен разнонаправленным характером действия структурных компонентов митилана, что по сути и определяет его как противоопухолевый препарат сложного механизма действия. Показана принципиальная возможность усиления митиланом противоопухолевой активности известных противоопухолевых цитостатиков.

3. Определена углеводная и молекулярно-эпитопная специфичность лектинов мидии C.Grayamis. На основании изучения иммунобиологических и адгезивных свойств лектинов сделан вывод о перспективности их использования в качестве биохимических препаратов: для диагностики злокачественных новоообразований (Л-1) и культивирования поверхностно-зависимых клеток (JI-2).

4. Установлено, что биопродуцентами лектинов Л-1 и Л-2 в организме мидии C.grayanus являются целомоциты. На основании данных по избирательному взаимодействию Л-1 и Л-2 с различными микроорганизмами, в том числе ассоциированными с мидией, сделан вывод о существенной роли исследуемых лектинов в регуляции таксономического и количественного состава микробного комплекса организма-хозяина.

5. Механизм противоопухолевого действия кораллана лежит в комплексе реактивных изменений организма-опухоленосителя, включающих в себя иммуномодуляцию, усиление степени макрофагальной инфильтрации опухолевого очага и активизацию ретикуло-эндотелиальной системы. Направленная модификация физико-химических

192 характеристик кораллана приводит к снижению вязкости его растворов, токсичности и аллергогенности.

6. Методология получения новых производных хитоолигосахаридов является перспективным направлением создания высокоэффективных водорастворимых и малотоксичных противоопухолевых соединений.

7. Исследование кинетики антибактериальной активности сульфатированного полисахарида фукоидана, а также действие его на гуморальный и клеточный иммунитет позволяет отнести фукоидан к поколению препаратов с ассоциированной антибактериальной и иммуномодулирующей активностью. Сульфатированный олигосахарид уронофукан, полученный из того же природного источника (бурая водоросль Laminaria japónica) препятствует развитию ВИЧ-инфекции in vitro путем прямой нейтрализации вируса и ингибиции его адсорбции на клетках мишенях, а также подавлением активности обратной транскриптазы. При этом уронофукан обладает анти-ВИЧ активностью в концентрациях более, чем в 100 раз низких, чем его антикоагуляционная активность (высокая антикоагуляционная активность - главное ограничение на пути использования сульфатированных полисахаридов).

8. Полисахарид зостерин обнаруживает свойства высокоактивного энтеросорбента: связывает и выводит из организма ионы тяжелых металлов, радионуклиды, патогенные микроорганизмы (включая их прямое ингибирование). Сорбционные свойства зостерина вносят существенный вклад в проявление таких видов активности, как антидотная, гипохолестеринемическая, антибактериальная, противоязвенная и геропротекторная. Полученные данные по распределению меченого 3Н-зостерина в организме животных позволяют сделать вывод о двунаправленном антидотном действии зостерина: энтеросорбционном и гуморальносорбционном (в частности, гемосорбционном).

9. Солевые формы зостерина (аммонийная, натриевая и калиевая) превышают антидотное действие зостерина (наиболее активная форма - аммонийная), однако для того, чтобы составить альтернативу зостерину необходимо их тщательное исследование на биодоступность, токсичность и другие критерии физиологичности.

Ю.Применение антидотной терапии среди рабочих свинцово-цинковых производств показало, что зостерин нормализует наиболее показательные биохимические признаки свинцовой интоксикации, снижает концентрацию свинца в крови, повышая его

194

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Освоение биохимических ресурсов Мирового океана переживает сейчас период подъема, что является новой качественной основой для биотехнологических работ, а также путей и способов создания лекарственных средств. Судя по результатам проведенных исследований, морские биополимеры выступают как многофункциональные биологически активные вещества, где наряду с основным направлением действия (например, противоопухолевым; иммуномодулирующим; детоксикационным; антивирусным; антибактериальным и т.д.) отмечаются и другие, сопряженные с основным, положительные эффекты. В свою очередь, в зависимости от задач и целей использования конкретного биополимера решается его судьба как биологически активного агента. В некоторых исследованиях прослеживается прямая связь между биологической активностью биополимера и его функциональной ролью как биохимического соединения непосредственно в организме-продуценте. Малая токсичность морских биополимеров может служить объективной предпосылкой их успешного исследования в предклинике и клинической практике.

Сегодня, благодаря развитию сотрудничества ученых разных стран, активно разрабатываются и практически внедряются биологически активные добавки, позволяющие успешно решать ряд проблем, связанных с профилактикой и лечением многих заболеваний. Несмотря на широкий круг веществ, используемых при создании современных биологически активных добавок, все они, как правило, получены из растительных и животных организмов наземного происхождения. Практически невостребованные для этих целей биологически активные вещества морских организмов, в частности морские биополимеры, отличаются от веществ наземных организмов как химическим строением, так и особенностями биологического действия. Уникальные химические структуры и необычно высокая биологическая активность морских биополимеров привлекают сегодня к этим веществам все большее внимание.

Научно обоснованное применение морских биополимеров в сочетании с известными веществами наземного происхождения открывает перспективы создания биологически активных добавок нового поколения - с более широким и эффективным спектром биологического действия.

Не приходится сомневаться в том, что всестороннее изучение морских биополимеров принесет немало интересных открытий. Успех на этом пути может быть достигнут только при фундаментальном изучении биохимии морских организмов и разностороннем исследовании биологической активности их структурных компонентов.

191

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лоенко, Юрий Николаевич, Владивосток

1. Abdel-Fattah A.F., Hussein M.M., Fouad S.T. Carbohydrates of the brown seaweed Dictyota dichotoma 1. Phytochemistry. 1978. Vol. 17, №4. P.741-743.

2. Abdel-Fattah A.F., Hussein M.M., Salem H.M. Studies of the purification and some properties of sargassan, a sulphated heteropolysaccharide from Sargassum linifolium II Carbohydr. Res., 1974. Vol. 33, №1.P.9-17.

3. Acton R.T., Bennett J.C., Evans E.E., Schrohenloher R.E. Physical and chemical characterization of an oyster haemagglutinin // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244, №15. P.4128-4145.

4. Andersson L., Lidgren G., Bohlin L. et al. Studies of swedish marine organisms. 1. Screening of biological activity//Acta Pharm. Suec. 1983. Vol. 20, №6. P.401-414.

5. Andersson L., Lidgren G., Bohlin L. et al. Studies of swedish marine organisms. V. A screening for lectin-like activity // Acta Pharm. Suec. 1986. Vol. 23, №2. P.91-100.

6. Andrew P.W., Lowrie D.B., Peters T.J. Properties and localization of rabbit alveolar macrophage 5'-nucleotidase//Enzyme. 1980. Vol. 25, 33. P.188-195.

7. Arakawa S., Ito M., Tejima S. Promoter function of carrageenan on development of colonic tumors induced by 1,2-dimethylhydrazine in rats // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1988. Vol. 34, №6. P.577-585.

8. Baba M., Nakajima M., Schols D. et al. Pentosan polysulfate, a sulfated oligosaccharide, is a potent and selective anti-HIV agent in vitro // Antiviral Res. 1988. Vol. 9, №6. P.335-343.

9. O.Baldo B.A., Uhlenbruck G. Purification of tridaonin, a novel anti-(3(l—>6) digalactose precipitin from a haemolymph of Tridacna maxima (Roding) I IFEBS Lett. 1975. Vol. 55, №1. P.25-29.

10. Baldo B.A., Sawyer W.H., Stick R.V., Uhlenbruck G. Purification and characterization of a galactan-reactive agglutinin from the clam Tridacna maxima (Roding) and study its combining site//Biochem. J. 1978. Vol. 175, №2. P.467-477.

11. MBlunden G., Rogers D.J. An anti-B-haemagglutinin from the red alga Ptilota plumosa // Food-drugs from the sea. Washington. 1976. P.252-257.

12. Blunden G., Rogers D.J., Farnham W.F. Hemagglutinins in British marine algae and their possible taxonomic value // Modern approaches to the taxonomy of red and brown algae. London, 1978. P.21-45.

13. Blunden G., Rogers D.J., Loveless R.W., Patel A.V. Haemagglutinins in marine algae lectins or phenols // Lectins. Berlin; New York. 1986. Vol. 5. P. 139-145.

14. J.Boyd W.C., Almodvar L.C., Boyd L.C. Agglutinis in marine algae for human erytrocytes // Transfusion (Philadelphia). 1966. Vol. 6. №1. P.82.

15. S.Bretting H., Kabat E.A. Purification and characterization of the agglutinins from the sponge Axinella polypoides and a study of their combining sites // Biochemistry. 1976. Vol. 15, №15. P.3228-3236.

16. Bretting H., Kabat E.A., Liao J., Pereria E.A. Purification and characterization of the agglutinis from the sponge Aaptos papillata and a study of their combining sites // Biochemistry. 1976. Vol. 15, №23. P.5029-5038.

17. Brown R.G., Gill S.S. Lectin and method for the extraction there from scallop // PCT WO 88/04303: (1988). Изобрет. стран мира. 1989. Вып. 60. №2. С.29.

18. Buck F., Luth С., Jacobs G., Bretting H. Comparative investigation on the amino acid sequences of the different isolectins from the sponge Axinella polypoides (Schmidt) // Abstr. 12th internat. lectin conf. Davis, 1990. P. 16.

19. Catanzaro P. J., Schwartz H. J., Graham R. C. Spectrum and possible mechanism of carrageenon cytotoxicity // Am. J. Pathol. 1971. Vol. 64, №2. P. 387-399.

20. Colwell R. R., Pariser E. R., Sinskey A. J. Biotechnology of marine polysaccharides. Washington, 1985.

21. Coombe D. R., Parish C. R., Ramshaw 1. A., Snowden J. M. Analysis of the inhibition of tumour metastasis by sulphated polysaccharides//Int. J. Cancer, 1987b. №39. P. 82-88.196

22. De Clercq E. Sulfated polysaccharides: an interesting approach toward the chemotherapy of AIDS // International symposium on antiviral chemotherapy. Porto Cervo, Sardinia, Italy, 1989. P. 34.

23. Deacon-Smith R.A., Lee-Potter J. P., Rogers D. J. Anticoagulant activity in extracts of british marine algae // Bot. Mar. 1985. Vol. 28, №8. P. 333-338.

24. Di Rosa M., Giroud J. P., Willoughby D. A. Studies of the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine // J. Pathol. 1971. Vol. 104, №1. P. 15-29.

25. Dolfi A., Lupetti M., Giannese F. Toxic effect of carrageenan on lymphoid-follicle associated epithelialcells of the bursa of fabricius of chickens // Cell. Tis. Re., 1981. Vol. 221, №1. P. 6775.

26. Ehresmann D.W., Deig E.F., Hatch M.T. Antiviral properties of algal polysaccharides and related compounds // Marine Algae in Pharmaceutical Science. Berlin, 1979. P.293-301.

27. E1-Nakeeb M.A., Yousef R.T. Study of the antimicrobial action of pectin // Planta med., 1970. Vol. 18, №195. P.201-209.

28. Fabregas J., Llovo J., Munoz A. Hemagglutinins in red seaweeds // Bot. Mar. 1985. Vol. 28. №12. P.517-520.

29. Fabregas J., Munoz A., Llovo J. Hemagglutinins in brown seaweeds // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1986. Vol.97, №2. P.213-219.

30. Fan H., Chen J., Lu P., Hao X., Li H. Acidic polysaccharides from Holothuria leucospilota (Brandt.) // Yaoxue Xuebao, 1983. Vol. 18, №3. P.203-208.

31. Ferreiros C.M., Criado M.T. Purification and partial characterization of a Fucus vesiculosus agglutinin//Rev. Esp. Fisiol. 1983. Vol. 39. №1. P.51-60.

32. Fragkiadakis G., Stratakis E. Characterization of hemolymph lectins in the prawn Parapenaeus longirostris // J/ Invert. Path. 1995. Vol. 65. №2. P. 111-117.

33. Fujihara M., Lizima N., Yamamoto Y., Nagumo T. Purification and chemical and physical characterization of an antitumor polysaccharide from the brown seaweed Sargassum fulvellum // Carbohydr. Res. 1984. Vol. 125. №1. P.97-106.

34. Giga Y., Suton K., Atsushi I. A new multimeric hemagglutinin from the coelomic fluid of the sea urchin Anthocidciris crcissispina //Biochemistry. 1985. Vol. 24, №16. P.4461-4467.

35. Gilboa-Garber N., Mizrahi L., Susswein A.J. Detection of lectin in the reproductive system and hemolymph from species of the sea hare Aplysia // Mar. Biol. Lett. 1984. Vol. 5, №2. P.105-114.197

36. Hall J.L., Rowlands D.T. Heterogenity of lobster agglutinin II. Specificity of agglutinin-erytrocyte binding // Biochemistry. 1974. Vol. 13, № 4. P.828-832.

37. Hardy S.W., Fletcher T.C., Gerie L.M. Factors in haemolymph of the mussel, Mytilus edulis L., of possible significance as defence mechanisms // Biochem. Soc. Trans. 1976. Vol. 4, №3. P.473-475.

38. Haskill J.S., Elliot B.E., Kerbell R., Axelrad M.A., Eidinger D. Classification of thymus-derived and marrow-derived lymphocytes by demonstration of their antigenbinding characteristics//J. Exp. Med., 1972. Vol. 135, №6. P. 1410-1415.

39. Hirabayashi K., Iwata S., Ito M. et al. Inhibitory effect of a lichen polysaccharide sulfate, GE-. 3-S, on the replication of human immunodeficiency virus (HIV) in vitro // Chem/ Pharm. 1989. Vol. 37, №9. P.2410-2412.

40. Hori K., Miyazawa K., Ito K. Hemagglutinins in marine algae // Bull. Japan. Soc. Sci. Fish. 1981. Vol. 47. №6. P.793-798.

41. Hori K., Miyazawa K., Ito K. Isolation and characterization of glycoconjugate-specific isoagglutinins from a marine green alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni // Bot. Mar. 1986a. Vol. 29, №4. P.323-328.

42. Hori K. Miyazawa K., Fusetani N. et al. Hypnins: low-molecular weight peptidic agglutinins isolated from a marine red alga, Hypnea japónica //Biochim. Biophys. Acta. 1986b. Vol. 873, № 2. P. 228-236.

43. Hori K., Matsuda H., Miyazawa K., Ito K.A mitogenic agglutinin from the red alga Carpopeltisflabellata//Phytochemistry. 1987. Vol. 26. №5. P. 1335-1338.

44. Ingram G.A. Lectins and lectin-like molecules in lower plants. 1. Marine algae // Dev. Comp. Immunol. 1985. Vol. 9, №1. P. 1-10.

45. Ito M., Baba M., Sato A. et al. Inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on the replication of human immunodeficiency virus (HIV) in vitro // Antivir. res. 1987. Vol. 7, №6. P. 361-367.

46. Johnson E., Bogwald J., Seljelid R. Evidense that agarose must be internalized to stimulate mouse macrophages in vitro // Scand. J. Immunol. 1982. Vol. 16, № 6. P. 525-530.

47. Kamiya H., Shiomi K., Shimizu Y. Marine biopolymers with cell specificity-lll-agglutinins in the red alga Cystocloniaum purpureum: isolation and characterization//!. Nat. -Prod. 1980. Vol. 43, №1. P. 136-139.

48. Kamiya H., Shimizu Y. A natural agglutinin inhibitable by D-galacturonic acid in the sea hare Aplysia eggs: characterization and purification // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1981. Vol. 47, №2. P.255-259.

49. Kamiya H., Ogata K., Hori K. Isolation and characterization of a new agglutinin in the red alga Palmaria palmata (L.) O.Kuntze // Bot. Mar. 1982. Vol. 25, №11. P.537-540.

50. Kamiya H., Ogata K. Hemagglutinins in the Acorn Barnacle Balanus (Megabalanus) roseus: purification and partial characterization // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1982. Vol. 48, №10. P.1421-1425.

51. Kamiya H., Muramoto K., Hoshino T., Raj U. Isolation and characterization of hemagglutinins from the sponge Dysidea herbacea // Experiantia. 1985. Vol. 41, №9. P. 1201-1202.

52. Kashiwagi M., Mynderse J.S., Moore R.E., Norton T.R. Evaluation of pacific basin marine-algae // J/ Pharm. Sci. 1980. Vol. 69, №6. P.735-738.

53. Kisugi J., Kamiya H., Yamazaki M. Purification of dolabellanin-C an antineoplastic glycoprotein in the body fluid of a sea hare, Dolabella auricularia // Dev. Comp. Im. 1989. Vol. 13, №5. P.3-8.

54. Kobayashi A., Shimizu Y. Marine biopolymers with cell specificity. I. Purification of agglutinins from Codium fragile // Lloydia. 1976. Vol. 39, №6. P.474.

55. Kocourek J., Horejsi V. A note on the recent discussion on definition of the term "lectin" // Lectins: Biology, biochemistry and clinical biochemistry. 1983. Vol. 3. P.3-6.199

56. Li C P., Prescott B., Eddy B.E., Caldes G., Green W.R., Martino E.C., Young A.M. Antiviral activity of paolins from clams // Ann. N-Y. Acad. Sci. 1965. Vol. 130. №1. P.374-382.

57. Li C.P., Prescott B., Martino E.C., Liu O.C. Antineoplastic activity of clam liver extract // Nature. 1968. Vol. 219, №5159. P.l 163-1164.

58. Li C.P., Tauraso N.H., Prescott B., Eddy B.E., Maye R.C., Martino E.C., Caldes G., Gorschbo C. Intratumor therapy in rodents with aqueous clam extracts // Cancer Res. 1972.

59. Vol. 32, №6. P. 1201-1205.

60. Li C.P., Goldin A., Hartwell J.L. Antineoplastic substances from sea: A review // Cancer Chemotherapy Reports. 1974. part 2. Vol. 4. P.97-129.

61. Lidgren G., Andersson L., Bohlin L. Studies of swedish marine organisms. 4. Screening of biological activity // Acta Pharm. Suec. 1985. Vol. 22, №6. P.351-356.

62. Liu O.C., Cipolla R.J. Study of antiviral factor from shellfish (Abstr.) // Bact. Proc. 1967. Vol. 164, №1. P. 162.

63. Liu O.C., Li C.P., Cipolla R.J. The antiviral and antineoplastic activity of shellfish extracts // In: Drugs from the sea (Freudenthal H.D. ed.). Washington.: DC. Marine Technology Society. 1968. P.141-150.

64. Llovo J., Muñoz A., Fabregas J. Agglutination of red seaweeds against guinea pig erythrocytes // Acta Cient. Compostelana. 1986. Vol. 23, № 1-2. P.85-88.

65. Lyamkin G.P., Artyukov A.A., Loyenko Yu.N. The application of marine natural polysaccharides to remove lead ions from organisms // Proceedings of the Sixth international symposium on marine natural products. Dakar, Senegal, 1989 (addendumO. P. 12.

66. Marchalonis J.J., Edelman G.M. Isolation and characterization of haemagglutinin from Limuluspolyphemus II J. Mol. Biol. 1968. Vol. 32, №3. P.453-465.

67. Mikheyskaya L.V., Evtushenko E.V., Ovodova R.G., Belogortseva N.I., Ovodov Yu.S. Isolation and characterization of a new P-galactose-specific lectin from the sea worm Chaetopterusvariopedatus II Carbohyd. Res. 1995. Vol. 275. P. 193-200.

68. Minamiguchi, K., Nagase, H., Kitazato, K. Interaction of a new depolymerized holothurian glycosaminoglycan with proteins in human plasma // Thrombosis Research. 1996. Vol. 83, №3. P.253-264.

69. Moore E.G., Temin H.M. Lack of correlation between conversion by RNA tumour viruses and increased agglutinability of cells by concanavalin A and wheat germ agglutinin // Nature, 1971, Vol. 231, №5298. P. 117-118.

70. Munoz A., Llovo J., Fabregas J. Hemagglutinins in green algae // Acta Cient. Compostelana.1985. Vol. 22.№2-4. P.873-878.

71. Murofushi M., Mizuguchi J., Aibara K, Matuhasi T. Immunopotentiative efect of polysaccharide from kefir grain, KGF-C, adminstered orally in mice // Immunopharmacology.1986. №12. P.29-35.

72. Nagase H., Enjyoji K., Shima M., Kitazato K., Yoshioka A., Saito H. Effect of depolymerized holothurian glycosaminoglycan (DHG) on the activation of factor VIII and factor V by thrombin//J. Biochem. 1996. Vol. 119. №1. P.63-69.

73. Nakashima H., Kido Y., Kobayashi N. et al. Antiretroviral activity in a marine red alga: reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract of Schizymenia pacifica И J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 1987. Vol. 113, №5. P.413-416.

74. Nisizawa К. Специфические особенности компонентов морских водорослей и их применение в косметических и парфюмерных товарах // Fragrance J. 1985. Vol. 13, №4. P. 100-105. (японск.яз.).

75. Noda H., Amano H., Arashima К. et al. Antitumour activity of polysaccharides and lipids from marine algae //Nippon suisan gakkaishi, 1989. Vol. 55, №7. P.1265-1271.

76. Noguchi H. On the multiplicity of the serum haemagglutinins of cold-blooded animals // Zentbl. Bakt. Parasitenkd. infect. Hyd. Abt. 1903. 10 rig. 34. P.286-288.

77. Ogata K., Muramoto K., Yamazaki M. Isolation and characterization of Balanus balonoides agglutinin//Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1983. Vol. 49, №9. P.1371-1375.

78. Park J., Kim H. Isolation and characterization of lectin from the mussel Mytilus edulis (I) // Han'guk Saenghwa Hakhoechi. 1987. Vol. 20. №3. P.208-214.

79. Paskins-Hurlburt A.J., Skoryna S.C., Tanaka Y. et al. Fucoidan: its binding of lead and others metals // Bot. Mar. 1978. Vol. 21, №1. P.13-22.

80. Paskins-Hurlburt A.J., Tanaka Y., Skoryna S.C. Fucoidan: isolation and metal binding properties // Bot. Mar. 1976. Vol. 19, №5. P.327-328.

81. Pettit G.R. Biosynthetic products for cancer chemotherapy // Plenum Press, N.-Y., Lnd., 1977. Vol. 1. P.165-175.

82. Prescott В., Caldes G. Chemical studies of an antitumor substances from clams // Fed. Proc. 1967. Vol. 26. Abstr.336. P.314.

83. Ragan M.A. Brown algal polyphenols synthesis of fucophlorethol-A octemethyl ether (2,2',4,6,6'-pentamethoxy-4'-(2,4,6-tri-methoxyphenoxy) biphenyl // Can. J. Chem. 1985. Vol. 63, №2. P.291-293.

84. Ravindranath M.H., Higa H.H., Cooper E.L., Paulson J. Purification and characterization of an o-acetyl-sialic acid specific lectin from a marine crab Cancer antennarius II J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, №15. P.8850-8856.

85. Robey F.A., Liu T.Y., Limulin: a C-reactive protein from Limulus polyphemus II J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256, №2. P.969-975.

86. Roche A.C., Monsigny M. Limulin {Limuluspolyphemus lectin). Isolation, physicochemical properties, sugar specificity and mitogenic activity // Biomedical Applications of the Horseshoe crab (Limulidae): E.Cohen ed. 1979. P.603-616.202

87. Rogers D.J., Blunden G., Evans P.K. Ptilota plumosa, a new source of a blood group В specific lectin // Med. Lab. Sci. 1977. Vol. 34, №3. P. 193-200.

88. Rogers D.J., Blunden G., Topliss J.A., Guiry M.D. A survey of some marine organisms for haemagglutinins // Bot. Mar. 1980. Vol. 23, №9. P.569-577.

89. Rogers D.J., Blunden G. Structural properties of the anti-B-lectin from the red alga Ptilota plumosa (Huds.) C. Ag. // Bot. Mar. 1980. Vol. 23, № 7. P.459-462.

90. Rogers D.J., Blunden G., Guiry M.D., Northcott M.J. Evaluation of Ptilota plumosa from Ireland as a source of haemagglutinin // Bot. Mar. 1982. Vol. 25, №8. P.399-400.

91. Rogers D.J., Topliss J.A. Purification and characterization of an atisialic acid agglutinin from the red alga Solieria chordalis (C.Ag.) J. Ag. // Bot. Mar. 1983. Vol. 26, №6. P.301-306.

92. Rogers D.J., Loveless R.W., Northcott M.J. Specificity studies on lectin-type haemagglutinins from Codium fragile II J. Pharm. Pharmacol. 1984. Vol. 36. P.71.

93. Rogers D.J., Loveles R.W. Hemagglutinins of the, phaeophyceae and non-specific aggregation phenomena by polyphenols // Bot. Mar. 1985a. Vol. 28, №4. P. 133-137.

94. Rogers D.J., Loveless R.W., Recetor-specificity diferences in the lectins from subspecies of Codium fragite // Br. Phycol. L. 1985b. Vol. 20, №2. P. 190-191.

95. Rogers D.J., Loveless R.W., Balding P. Isolation and characterization of the lectins from subspecies of Codium fragite // Lectins. Berlin; New York, 1986. Vol. 5. P. 155-160.

96. Rogers D.J., Fish В., Barwell C.J. Isolation and properties of lectins from some red marine algae // Book of abstracts interlec 10: Tenth International lectin conference (Prague, 1988). Prague, 1988. Supplement vol. P.67.

97. Rothman U.S.E. Polypeptide fractions from mussel for madical use. PCT №81/03124. (1981) // Изобр. в СССР и за рубежом. 1982. Вып. 13, №12. С.57.

98. Rothschild A.M., Gascon L-A. Sulfuric esters of polysaccharides as activators of a bradykinin-forming system in plasma // Nature. 1966. Vol. 212, №5068. P.1364.

99. Sasaki Т., Takasuka N., Abiko N. Antitumor activity of a boiled Scallop extract: Brief Communication // J. Nat. Cancer Inst., 1978. Vol. 60, №6. P.1499-1500.

100. Sasaki Т., Nakamichi K., Tachibana Y. et al. Novel antitumor glycoprotein substance and its preparation: Патент США №4436 656.

101. Sasaki Т., Nakamichi К., Tachibana Y. et al. Antitumour glycoprotein substance and preparation there of: Патент США №4436 657.

102. Sasaki Т., Uchida H., UchidaN.A. et al. Antitumour activity and immunomodulatory effect of glycoprotein fraction from scallop Patinopecten yessoensis // Nippon Suisan gakkaishi. 1987. Vol. 53, №2. P.267-272.203

103. Schauer R., Veh R.W., Sander M., Corfield A.P.,Wiegandt H. // Structure and functions of gangliosides. V. 125/Eds Svennerholm L. et al. N.Y.: Plenum press, 1980. P.283.

104. Schimpf K., Lenhard J.„ Schaaf G. Influence of polysaccharide carrageenin on clotting mechanism of blood in rabbit in vitro and in vivo // Thromb. Diath. Haemorrh. 1969. Vol. 21, №3. P.524-533.

105. Schmeer M.R. Growth inhibiting agents from Mercenaria extracts: chemical and biological properties//Science. 1964. №144. P.413-414.

106. Schmeer M.R., Huala C.V. Mercenene: in vivo effects of mollusk extracts on the sarcoma 180 // Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1965. №118. P.605-610.

107. Schmeer A.C. Chemical characterization and biological activity of an anti-cancer agent of marine origin//Physiol. Chem. Physics. 1979. Vol. 11, №5. P.415-424.

108. Shiomi K., Kamiya H., Shimizu Y. Purification and characterization of an agglutinin in the red alga Agardhiella tenera//Biochem. Biophys. Acta. 1979. Vol. 576, №1. P. 118-127.

109. Siegel M.I., Mc Connel R.T., Bonser R.W. Cuatrecasas P. The production of 5-HETE and leukotriene B in rat neutrophils from carrageenan oleural exudates // Prostaglandins. 1981. Vol. 21, №. P. 123-132.

110. Sigel M.M., Walham L.L., Licher W. Anticellular and antitumor activity of extracts from tropical marine invertebrates. In: "Food Drugs from the Sea". Washington, DC, Marine Technology Society, 1970. P.281-294.

111. Splawinski J.A., Wojtaszek B., Gryglewski R.J. Endogeneous factors affecting arachidonic acid metabolism. I. Biosynthesis of prostacyclin and prostaglandins by carrageenan of rats // Prostaglandins. 1978. Vol. 16, №5. P.683-697.

112. Sugawara I., Itoh W., Kimura S. et al. Further characterization of sulfated homopolysaccharides as anti-HIV agents//Experientia. 1989. Vol. 45, №10. P.996-998.

113. Suh-Chae Y.A., Jeune-Chung K.H., Chung S.R. Lectins from marine shells: (VIII) characterization of the NIC lectin isolated and purified from Neptunea intersculpta // Korean. Biochem. J. 1988. Vol. 21, №1. P.46-52.

114. Suzuki Y., Yamamoto I., Umezawa I. Antitumor effect of seaweed: partial purification and the antitumor effect of polysaccharides from Laminaria angustata Kjellman var. longissima Miyabe // Chemotherapy (Tokyo), 1980. Vol. 28. P.165-170.

115. Suzuki K., Tokoro A., Okawa Y., Suzuki S., Suzuki M. Effect of N-acetylchito-oligosaccharides on activation of phagocytes // Microbiol. Immunol. 1986. Vol. 30, №8. P.777-787.204

116. Suzuki Т., Mori К. A galactose-specific lectin from the hemolymph of the pearl oyster Pinctada fucata martensis // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 92B, №3. P.455-462.

117. Takahashi M. Studies on the mechanisms of host-mediated antitumor action of crude fucoidan from a brown marine alga Elsenia bicyclis II J. Jpm. Soc. Reticuloendothel. Sys. 1983. Vol. 22. P.269-283.

118. Takashi N., Terukazu N. Сахарные компоненты и антикоагулянтная активность фукозосодержащих сульфатированных полисахаридов в девяти бурых морских водорослях // Ниппон ногэй кагаку кайси, J. Agr. Chem. Soc. Jap. 1987. Vol. 61, №3. P.361-363.

119. Takahashi Y., Katagiri S. Seasonal variation of the hemagglutinating activities in the red alga Gracilaria verrucisa//Nippon Suisan Gakkaishi. 1987. Vol. 53, №12. P.2133-2137.

120. Thomson A.W. Carrageenan and immune-response // Biomedicine. 1978. Vol. 28, №3. P.148-152.

121. Tokoro A., Tatewaki N., Suzuki K., Mikami Т., Suzuki S., Suzuki M. Growth-inhibitory effect of hexa-N-acetylchitohexaose and chitohexaose against Meth-A solid tumor // Chem. Pharm. Bull. 1988. Vol. 36, №2. P.784-790.

122. Tokura S., Itoyama K., Nishi N., Nishimura S., Azuma I., Saiki I. Selective sulfation of chitin derivates for biomedical functions // Pure Appl. Chem. 1994. Vol. 31, №11. P.1701-1718.

123. Tveter-Gallagher E., Wight T.N., Mathieson A.C. Effects of various types of carrageenans on human fibroblasts in vitro // Marine algae in pharmaceutical science. Berlin; New York, 1982. Vol. 2. P.51-64.

124. Uhlenbruck G., Steinhansen G. Tridacnins: symbiosis-profit or defense-purpose? // Devel. Сотр. Immunol. 1977. Vol. 1, №3. P. 183-192.

125. Usui Т., Asari K., Mizuno T. Isolation of highly purified "fucoidan" from Eisenia bicyclis and its anticoagulant and antitumor activities // Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44, №8. P. 19651966.

126. Van Furth R. Current view on the Mononuclear Phagocytes sysytem // Immunobiol., 1982. Vol. 161. P.178-185.

127. Venkateswaran P.S., Millman I., Blumberg B.S. Interaction of fucoidan from Pelvetia fastigiata with surface antigens of hepatitis В and woodchuck hepatitis viruses // Planta med. 1989. Vol. 55, №3. P.265-270.

128. Venkata Rao E., Ramana K. Structure and in vitro anti-coagulant activity of a new sulphated polysaccharide from a green seaweed Cladophora socialis II 17 IUPAC, I symposium on the chemistry of natiral products. India, 1990. P.226.205

129. Wakabayashi K., Inagaki T., Fujimoto Y., Fukuda Y. Induction by degraded carrageenan of colorectal tumors in rats // Cancer Lett. 1978. Vol. 4, №3. P. 171-176.

130. Weijian X., Weng Y., Qionghua C. Prevention and treatment of alloxan-induced diabetes in mice by the polysaccharides from Laminaria japónica and Hericium erinaceus II Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao, 1989. Vol. 20, №6. P.378-380.

131. Wight T.N., Ross R. Proteoglycans in primate arteries. 2. Synthesis and secretion of glucosaminoglycans by arterial smooth-muscle cells in culture // J. Cell. Biol. 1975. Vol. 67, №3. P.675-686.

132. Willmer E.N. Cell and tissue culture. London, 1965. 170 p.

133. Yamamoto I., Maruyama H. Effect of dietary seaweed preparations on 1,2-dimethylhydrazine-induced intestinal carcinogenesis in rats // Cancer. Lett. 1985. Vol. 26, №3. P.241-251.

134. Yamamoto I., Naguno T., Fujihara M. et al. Antitumor effect of seaweeds. II. Fractionation and partial characterization of the polysaccharide with antitumor activity from Sargassum fulvellum // Japan J. Exp. Med. 1977. Vol. 47, №3. P. 13-144.

135. Yamamoto I., Naguno T., Takahashi M. et al. Antitumor effect of seaweeds. III. Antitumor effect of an extract from Sargassum Kjellmanianum II Japan J. Exp. Med. 1981. Vol. 51, №3. P. 187-189.

136. Yamamoto I., Naguno T., Yagi K. et al. Antitumor effect of seaweeds. I. Antitumor effect of extracts from Sargassum and Laminaria II Japan J. Exp. Med. 1974. Vol. 44, №6. P.543-546.

137. Yamamoto I., Takahashi M., Suzuki T. et al. Antitumor effect of seaweeds. IV. Enhancement of antitumor activity by sulfation of a crude fucoidan fraction from Sargassum Kjellmanianum //Japan J. Exp. Med. 1984a. Vol. 54, №4. P.143-151.

138. Yamamoto I., Takahashi M., Tamura E. et al. Antitumor activity of edible marine algae: Effect of crude fucoidan fractions prepared from edible brown seaweeds against L-1210 leukemia//Hydrobiol. 1984b. Vol. 116 (SEP). P.145-148.

139. Yamamoto I., Takahashi M., Tamura E., Maruyama H. Antitumor activity of crude extracts from edible marine algae agains L-1210 leukemia // Bot. Mar. 1982. Vol. 25, №9. P.455-457.

140. Yamazaki M., Esumi-Kurisu M., Mizuno D., Ogata K., Kamiya H. Marine animal lectin-dependent tumor recognition by macrophages // Gann. 1983. Vol. 74, №3. P.405-411.

141. Ажгихин И.С., Шпаков Ю.Н., Мехтиханов С.Д., Гандель В.Г. Применение метаболитов морских организмов в народном хозяйстве и медицине. Кишинев, 1980.

142. Ажгихин И.С., Шпаков Ю.Н. Перспективы использования непромысловых морских гидробионтов. Б., Азерняшр. 1983.

143. Ажгихин И.С., Аразашвили А.И., Аракелова Н.Н. и др. Особенности действия и перспективы применения в медицине деградированных альгинатов // Фармация. 1988. № 1. С.77-85.

144. Александер С.К., Ляшенко В.А., Якушкина И.В. Сравнение противоопухолевых, иммунодепрессивных и токсических комплексов карминомицина с альбумином, различающихся по содержанию карминомицина// Антибиотики, 1981, № 4. С.298-302.

145. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.

146. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М., 1972.

147. Берман В.М., Славская Е.М. Завершенный фагоцитоз. Сообщение I. Новый методический принцип изучения завершенности фагоцитарной реакции // Журн. микробиол., 1958. № 3, С.8-13.

148. Богданов В.Д. Структурообразователи в технологии рыбных продуктов. Владивосток, 1990.

149. Богословская Е.П., Катан В.Е., Глущенко Н.Н., Ерохин В.Н., Козлов Ю.П. Сравнительное изучение противоопухолевого действия полиненасыщенной жирной кислоты (линоленовой) и продуктов ее автоокисления // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1976. №5. С.734-741.

150. Ванчугова Н.Н. Современное состояние вопроса о применении краткосрочных тестов для выявления потенциальной онкогенности промышленных минеральных пылей // Гиг. труда, 1989. №1. С.34-38.207

151. Волегов А.И. Устойчивость организма к злокачественным опухолям. М., 1987.

152. Воронцов И.М. Опыт применения морской капусты ламинарии в онкологической практике // Тр. Запорожского гос.ин-та усовершенствования врачей им. М.Горького. Запорожье, 1957. Т.1. С.27-31.

153. Галактионов В.Г. Анфалова Т.В. Сингенные и аллогенные отношения при макрофагальной индукции иммунного ответа у мышей разных генотипов // Ж. общ. биол., 1974. Т.35, №3. С.365-375.

154. Гаркави JI.X., Уколова М.А., Квакина Е.В., Гелыптейн В.И. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов-на-Дону, 1979.

155. Голынская E.JI., Макаренко М.Н., Осауло Л.К., Помилуйко В.П., Юрчишина Т.В. Кукурузные рыльца ценное сырье для получения биологически активного препарата фитогемагглютинина // Охрана, изучение и обогащение растит, мира. 1980. Вып.7. С.100-105.

156. Ермольева З.В., Вайсберг Г.Е. Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. М., 1976.

157. Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Елякова JI.A. Ламинарины бурых водорослей // 8-я Всесоюзная конференция по химии и биохимии углеводов; Тез. докл. Пущино, 1987а. С.102-103.

158. Игнатенко Л.А., Елякова Л.А., Оводова Р.Г. Влияние биогликанов природного происхождения на популяцию клеток стволовой фракции кроветворения // Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988. С.46-47.

159. Каледин В.И., Матиенко H.A., Волкова А.И. Каммера для учета антителообразующих клеток в реакции Ерне-Нордина // Лабор. дело, 1975. №2. С. 112.

160. Каулен Д.Р., Терятников В.П., Фаворская Ю.Н., Хасман Э.Л. Изменение функциональной активности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы под влиянием стимуляторов иммуногенеза//Иммунология, 1980, №6,.С.46-49.

161. Кизеветтер И.В., СховееваМ.В., Шмелькова Л.П. Промысловые морские водоросли и травы дальневосточных морей. М., 1981.

162. Купер Э. Сравнительная иммунология. М., 1980.

163. Лабораторные методы исследования в клинике. М., 1987.

164. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов // Итоги науки и техники. Сер. биотехнология. Т.2 / Под ред. А.А.Клесова.: М.: ВИНИТИ. 1987.

165. Лебедев К.А., Хоробрых В.В., Боглазова Е.К., Пригода О.С., Каулен Д.Р. Рост карциномы Эрлиха у облученных животных // Радиобиология, 1979. Т. 19, №6. С.858-862.

166. Линевич Л.И. Лектины и углевод-белковое узнавание на разных уровнях организации живого // Усп. биол. химии. 1979. Т. 20. С.71-94.

167. Лоенко Ю.Н., Оводова Р.Г., Молчанова В.И., Оводов Ю.С., Прокофьева Н.Г. Новый противоопухолевый углеводсодержащий биополимер из тридакны // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. Вып. 37 С.26-29.

168. Лоенко Ю.Н., Оводова Р.Г., Артюков A.A., Ковалев В.В. Влияние полисахарида зостерина на иммунобиологическую реактивность интактного организма // Научная конференция по актуальным проблемам иммунологии: Тез. докл. Владивосток, 1987. С. 129.

169. Лоенко Ю.Н., Артюков A.A., Лямкин Г.П., Руцкова Т.А. // Раст ресусры. 1990. Т.26. №2. С.263-274.

170. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д Лектины. Львов, 1981. '

171. Маслаков Д.А., Эйсмонт К.А. Биологическая активность некоторых полисахаридов и их клиническое применение. Минск, 1977.

172. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск. Наука, 1983.209

173. Михайлов В.В., Кочкин A.B., Иванова Е.П. Сравнительное изучение микроорганизмов мидии и среды ее обитания // Микробиология. 1988. Т.57, вып. 1. С.158-159.

174. Михайлов В.В. Морские гетеротрофные микроорганизмы продуценты физиологически активных веществ // Автореф. докт. дисс., Владивосток. 1995.

175. Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Лоенко Ю.Н. Биогликаны иммуномодуляторы // Химия природ, соедин., 1983. №6. С.675-694.

176. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М., 1987.

177. Писарев В.М., Пивницкий Л.А. Усиление феномена специфической супрессии иммунного ответа в системе адоптивного переноса //Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1977. №5. С.571-573.

178. Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов B.C., Усов А.И. Сравнительное исследование антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов бурых морских водорослей // Фармакология и токсикология. 1988. Т. 5, №4. С.63-67.

179. Сакандалидзе О.Г., Кипиани P.E. Биологически активные вещества гидробионтов -новый иссточник лекарств. Кишинев. 1979.

180. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы. М.: Медицина, 1987.

181. Система создания противоопухолевых препаратов в СССР и США. М., 1977.210

182. Тан Цзянзюнь. Особенности культивирования каррагинана и его использование // Шенгу Хуасюе Юй Дзиньчжань. 1986. №4. С.42-45.

183. Тен Хак Мун, Кондратьева JIM., Гаретова JI.A. Штормовые выбросы морских водорослей и трав как сырье для биоконверсии // Биотехнология. 1989. Т. 5, №1. С. 7880.

184. Туманян М.А., Кирилличева Г.Б. Методические рекомендации по первичному сбору иммуномодуляторов по уровню активности 5'-нуклеотидазы макрофагов перитонеального экссудата мышей. М., 1987.

185. Турова А.Д., Гладких A.C. Биологическая активность полисахаридов растительного происхождения// Фармакология и токсикология. 1965. Т.28, №4. С.498-504.

186. Усов А.И. Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов. М., 1985. С.77-96.

187. Усов А.И. Полисахариды морских водорослей: проблемы изучения и использования // Биологически активные вещества морских организмов. М., 1990. Вып. 1. С.97-117.

188. Учитель И Я. Макрофаги в иммунитете. М., 1978.

189. Фомина И.П., Навашин С.М., Преображенская М.Е., Розенфельд E.JI. Сравнительное изучение биологического действия полисахаридов глюкана и ламинарина // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1966. Т. 31, №5. С.79-83.

190. Франц X. Лектины: свойства, функции и возможности применения // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1980, №1. С.3-10.

191. ФролькисВ.В., Мурадян Х.К. Экспериментальные пути продления жизни. Ленинград, 1988.

192. Хаитов P.M. Воздействие на отдельные этапы становления и взаимодействия Т- и В-клеток// Общие вопросы патологии, М., 1976. Т. 4. С. 101-123.

193. Харацеюс Д. А., Монцевичюте-Эринтене Е.В. Удельная скорость роста и макрофагальная инфильтрация экспериментальных опухолей // Эксперим. онкология, 1985. Т. 7, №5. С.45-47.

194. Чернух A.M. Воспаление. М., 1979.