Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях флуктуации температуры

ВАК РФ 03.02.10, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях флуктуации температуры"

На правах рукописи

БЕЛОЦИЦЕНКО Елена Сергеевна

Устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях флуктуации температуры

03.02.10 - гидробиология 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Я ш 2015

Владивосток 2015

005570600

005570600

Работа выполнена в Лаборатории физиологии автотрофных организмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Титлянов Эдуард Антонинович

кандидат биологических наук Яковлева Ирина Михайловна

Официальные оппоненты:

Раков Владимир Александрович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник,

ФГБУН Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, главный научный сотрудник Лаборатории морской экотоксикологии

Пронина Наталия Александровна, доктор биологических наук, профессор,

ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, ведущий научный сотрудник Лаборатории управляемого фотобиосинтеза

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Мурманский морской биологический институт Кольского научного центра РАН

Защита состоится «25» сентября 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17, факс (4232)2310900. Электронный адрес: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук: http://wwwimb.dvo.ru/misc/dissertations/index.Dhp/sovet-d-005-008-01/21-belotsitsenko-elena-sergeevna

Автореферат разослан « » июля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Костина Елена Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На мелководных участках шельфа морей умеренных широт водоросли-макрофиты занимают обширные площади морского дна и являются основными продуцентами первичного органического вещества и кислорода. В силу своего прикрепленного образа жизни эти автотрофные организмы особенно часто подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, которые могут провоцировать у растений дисбаланс между процессами поглощения и утилизации световой энергии (обзор, Aguilera, Rautenberger, 2012). В этих условиях усиление генерации активных форм кислорода (АФК) в тканях водорослей приводит к развитию фотоокислителыюго стресса, ФОС (Asada, 1999; Reddy, Raghavendra, 2006), который в свою очередь может вызывать серьезные окислительные повреждения вплоть до гибели организма (обзор, Alscher et al., 1997). Проведенные к настоящему времени многочисленные исследования (обзоры Cosse et al., 2008; Lesser, 2012; Bischof, Rautenberger, 2012) показывают, что устойчивость макроводорослей к ФОС во многом определяется состоянием их антиоксидантных систем (AOC), на эффективность и направленность работы которых часто влияют факторы внешней среды в месте обитания вида.

В умеренных широтах одним из основных факторов, определяющих распространение, выживание и продуктивность морских макроводорослей, является температура (Liining, 1990). В литературе показано (обзор, Hanelt et al., 2003), что устойчивость макроводорослей к изменениям температурного режима обеспечивается адаптивными перестройками на уровне репродукции, роста, фотосинтетических и других метаболических процессов. Сведения о влиянии температурного режима на продукцию АФК и антиоксидантный ответ морских автотрофных организмов ограничены небольшим количеством работ, выполненных, главным образом, на макрофитах Атлантики (Collen, Davison, 1999а, b, с; Choo et al., 2004; Lolirmann et al., 2004) и симбиотических микроводорослях тропиков (обзор, Lesser, 2012). Кроме того, вопрос о том, как изменения в антиоксидантном статусе водорослей, вызванные флуктуаций температуры воды, участвуют в формировании устойчивости растений к ФОС при дополнительной нагрузке других факторов среды (например, высоких интенсивноетей света) до сих пор остается мало изученным. Учитывая тот факт, что в природе влияние абиотических факторов среды взаимосвязано, отсутствие таких сведений препятствует полному пониманию механизмов, вовлеченных в процесс биохимической адаптации морских водорослей в условиях интенсификации окислительных процессов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование влияния температуры на устойчивость к фотоокислительному стрессу морских макроводорослей с точки зрения регуляции их систем антиоксидантной защиты. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Оценить состояние антиоксидантных систем морских макроводорослей Японского моря в период их активного вегетативного роста.

2. Изучить характер дневных и сезонных изменений уровня перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных систем водорослей; оценить вклад температуры в регуляцию этих процессов.

3. Изучить антиоксидантный статус водорослей, акклимированных к различным температурам, и сравнить их устойчивость к фотоокислительному стрессу.

Научная новнзна. В настоящей работе впервые приводятся количественные данные об активности и содержании компонентов АОС у макроводорослей Японского моря. Показано, что виды, принадлежащие к тропическо-низкобореальной биогеографической группе, характеризуются более высоким антиоксидантным потенциалом по сравнению с бореальными видами. Впервые исследована дневная динамика активности антиоксидантных процессов у морских макроводорослей. Обнаружено, что источником окислительных процессов в тканях растений в середине дня летних месяцев являются высокие концентрации перекиси водорода. Установлено также, что кратковременное повышение температуры в середине дня приводит к активации процессов ресинтеза низкомолекулярных антиоксидантов у видов, принадлежащих к тропическо-низкобореальной группе, и вызывает инактивацию суперок-сиддисмутазы, а также нарушение процессов регенерации аскорбата и глутатиона у видов бореальной группы. Выявлены механизмы долговременной акклимации ферментативной антиоксидантной системы макрофитов субтропического и бореального генезиса к понижению и повышению температуры воды, а также впервые продемонстрирована их связь с устойчивостью водорослей к фотоокислительному стрессу.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят существенный вклад в расширение фундаментальных знаний о механизмах устойчивости и стратегиях биохимической адаптации морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной и долговременной флуктуации температуры, а также о роли компонентов аскорбат-глутатионового цикла в этих процессах.

Проведенные нами исследования диапазона вариабельности компонентов антиоксидантной системы массовых видов макроводорослей Японского моря представляют несомненный практический интерес. Полученные данные могут оказаться полезными для оценки функционального состояния растительных гидробионтов в биоиндикации и экологическом мониторинге прибрежных водных экосистем умеренных широт. Сведения об условиях инициации, накопления и функционирования компонентов АОС в тканях морских макроводорослей могут быть также востребованы при разработке медицинских препаратов и пищевых добавок, связанных с природными антиоксидантами.

Полученные в процессе выполнения этой работы экспериментальные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов.

Методология и методы диссертационного исследования. В представленной работе для исследования устойчивости водорослей к окислительному стрессу использован комплексный подход, т.е. сочетание методов оценки антиоксидантного потенциала организмов, метаболизма АФК и функциональной активности фотосинтетического аппарата макрофитов. Работа проведена на современном методологическом уровне с применением методов оксиметрии и спектрофотометрии. Кроме того, использованы классические методические подходы к эколого-физиологическому изучению фотосинтеза морских прикрепленных водорослей (Титлянов, 1978) и общепринятые методы химического анализа в гидробиологических исследованиях (Методы, 1979).

Основные сокращения: ФОС - фогоокнслитеяьный стресс; АОС - антиоксидангная система; АФК -активные формы кислорода; СОД - супероксиддисмутаза; КАТ - каталаза; АПО - аскорбатпероксидаза; ГР - глутатионредуктаза; АсК - аскорбат, ГЛ - глутатион; МДА - малоновый деальдегид; ПОЛ -перекисное окисление липидов; Ртх - скорость потенциального фотосинтеза; Кар - каротиноиды.

Положения, выносимые на защиту.

1. Активность и содержание основных компонентов АОС защиты массовых видов макроводорослей Японского моря определяются их таксономической и биогеографической принадлежностью.

2. Устойчивость морских макроводорослей к ФОС в середине солнечного дня летних месяцев связана с их широтным распространением и определяется динамикой активности и содержания антиоксидантных компонентов аскорбат-глутатионового цикла в тканях макрофитов. В этот период реакция на кратковременное повышение температуры воды процессов рециклирования и регенерации низкомолекулярных антиоксидантов у макроводорослей субтропического и бореального генезиса различна.

3. Накопление каротиноидов-ангиоксидантов и повышение активности антиоксидантных ферментов является одним из механизмов акклиматизации макроводорослей умеренных широт к понижению температуры воды до 5-10°С. Такие перестройки способствуют устойчивости макрофитов к ФОС в холодное время года в условиях умеренной освещенности и не влияют на стресс-устойчивость видов при дополнительной нагрузке света высокой интенсивности.

4. Снижение содержания каротиноидов и инактивация пероксид-детоксицирующих ферментов в тканях морских макрофитов в условиях длительного воздействия высоких температур (выше 20°С для бореальных видов и выше 25'С для тропическо-низкобореальных видов) повышают чувствительность водорослей к ФОС при дополнительной нагрузке высокой освещенности.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов обеспечена применением стандартных методик сбора водорослей, объемом фактического материала (2499 образцов для оценки физиологического состояния водорослей и 2347 образцов для биохимического анализа), собранного в ходе многолетних (2009-2011 гг.) исследований. Особое внимание уделено также выбору наиболее однородного материала, многократности в повторах экспериментов и статистической обработке оригинальных данных. Результаты исследований подтверждены табличными данными и графическими изображениями.

Апробация работы. Результаты исследований и материалы диссертационной работы были представлены на: XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2009); IX Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций ДВ России (Владивосток, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010); II Asia Pacific Coral Reef Symposium «Collaboration for Coral Reef Conservation in a changing climate» (Phuket, 2010); Международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптации гидробионтов» (Борок, 2012); ежегодных научных конференциях Института биологии моря им. A.B. Жирмунского (2010-2013 гг.; 2015 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов работы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы,

включающего 420 источников, из которых 381 на иностранном языке, а также приложения. Работа изложена на 205 страницах, иллюстрирована 1 схемой, 24 рисунками и 19 таблицами.

Личный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории физиологии автотрофных организмов Института биологии моря имени A.B. Жирмунского ДВО РАН и является продолжением многолетних исследований лаборатории по изучению процессов устойчивости и адаптаций морских макрофитов (Титлянов и др., 1975, 1987; Ли, Титлянов, 1978; Ядыкин, Титлянов, 1980;Titlyanov et al., 1992а, Ъ; Yakovleva, Titlyanov, 2001 и др.) и симбиотических кораллов (Титлянов и др., 1988, 2002; Titlyanov et al., 2002, 2004; Yakovleva et al., 2009 и др.) к колебанию факторов окружающей среды (главным образом освещенности и температуры). В основу настоящей работы положены результаты экспериментальных исследований, проведенных автором на акваториях залива Петра Великого Японского моря в течение 2009-2011 гг. Экспериментальная работа, анализ полученных данных и их обобщение и сопоставление с литературными источниками проведены лично автором.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность проф., д.б.н. Э.А. Титлянову и К.6.Н. И.М. Яковлевой за помощь на всех этапах планирования, выполнения и написания работы. Особую благодарность выражаю И.М. Яковлевой за практическую помощь в освоении методик, ценные методологически консультации, а также к.б.н. Ю.В. Набивайло за действенную помощь в проведении экспериментов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре диссертации, дано понятие «фотоокислительный стресс», охарактеризованы функциональные особенности АФК и компонентов АОС водорослей. Приведены данные о развитии ФОС и повреждении фотосинтетического аппарата у водных растений в условиях прямого и опосредованного действия субоптимальных и пессимальных температур. Обращается внимание на недостаток информации о роли метаболизма реактивного кислорода в формировании устойчивости водорослей к термострессу. Остается также открытым вопрос о вкладе температуры в регуляцию АОС макроводорослей в условиях комбинированного стресса. В главе также приводятся опубликованные результаты исследований зависимости антиоксидантного статуса и эффективности работы АОС макрофитов от их таксономической принадлежности, вертикального распределения, а также от интенсивности сезонных флуктуаций факторов среды в месте обитания водорослей. Отмечается отсутствие информации о динамике окислительных и антиоксидантных процессов у морских макроводорослей в течение дня.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования выбраны бентосные морские макроводоросли залива Петра Великого Японского моря (умеренные широты), принадлежащие к трем систематическим отделам: (1) Chlorophyta - Monosiroma grevillei, Ulva lactuca; (2) Ochrophyta (класс Phaeophyceae) - Costaria costata, Stephanocystis crassipes, Undaria pinnatiflda\ (3) Rhodophyta - Ahnfclliopsis ßabelliformis, Chondrtis pinnulatus, Grateloupia divaricata, Laurencia nipponica, Palmaria stenogona и Tichocarpus crinitus. Данные виды широко

представлены в акваториях Японского моря и являются потенциальными источниками экономически важных полисахаридов.

В главе дана краткая физико-географическая характеристика районов исследования. Схема станций отбора проб приведена на рис. 1. Исследования, послужившие основой для написания настоящей работы, были проведены автором в 2009 - 2011 гг.

132° в.д. ■

Рис. 1 Карта-схема района работ. 1-6. Соболь (Уссурийский залив); 2-6. Прибойная (зал. Восток), 3-м. Красный (Амурский залив).

Сбор водорослей осуществляли при помощи легководолазного снаряжения в первую половину дня из естественных незатененных мест обитания на глубине 1-2 м. Водоросли, очищенные от эпифитов, либо фиксировали в жидком азоте для дальнейших анализов, либо использовали в экспериментах, описанных ниже. Количество проб каждого вида - от 3 до 15.

Мониторинговые исследования антиоксидантного потенциала верхне-сублиторальных макроводорослей Японского моря в период их активного вегетативного роста проводили в полевых условиях. Изучение устойчивости морских макрофитов к ФОС в условиях кратковременной флуктуации температуры проводили как в полевых, так и лабораторных экспериментах, максимально приближенных по температурному и световому режиму к естественным условиям обитания. Сезонные изменения фотоокислительных и антиоксидантных процессов макроводорослей исследовали в природных условиях. Для оценки влияния долговременной температурной акклимации ферментативной АОС водорослей на их устойчивость к действию высокой освещенности в постакклимационный период был проведён ряд экспериментов в контролируемых лабораторных условиях.

Фотосинтетическую активность водорослей оценивали стандартными методами оксимет-рии (Granbom et al., 2001) с использованием электрода С1агк-типа (CellOx 325, WTW, Weilheim, Германия) соединенного с оксиметром (OXI 197S, WTW, Weilheim, Германия). В ряде случаев скорость нетто-фотосинтеза водорослей определяли в замкнутой системе при постоянном перемешивании методом Винклера (Методы, 1979).

Фотосинтетические пигменты зеленых и красных водорослей экстрагировали по методу Д.И. Сапожникова и сотр. (1964), бурых водорослей - по методу Сиили с сотр. (Seely et al., 1972). Фикобилиновые пигменты экстрагировали по методу, предложенному Эвансом (Evans, 1988).

Для анализа антиоксидантных ферментов и малонового диальдегида фиксированный в жидком азоте водорослевой материал гомогенизировали в охлажденном 50 мМ фосфатном

- 43° с.ш.

Залив Петра Великого

буфере (pH 7.4), содержащем 1% поливинилпирролидон-10 (ПВП-10), 0.1 мМ ЭДТА, 0.25% Triton Х-100 и 1.3мМ L-аскорбат в 1 ш раствора. Для анализа содержания аскорбата и глутатиона образцы экстрагировали соответственно в охлажденной 6% H2S04 или охлажденной 5% сульфосалициловой кислоте. Для анализа содержания перекиси водорода (Н2О2) в тканях водорослей образцы гомогенизировали в 0.1% трихлоруксусной кислоте. Полученные гомогенаты центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 15 мин при 4°С. Супернатанты собирали и хранили на льду до начала анализа. Все измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-2101 PC (Япония).

Содержание белка определяли методом, основанным на связывании белками красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bradford, 1976). Содержание H202 в тканях водорослей определяли по методу Беликовой с соавт. (Velikova et al., 2000). Об интенсивности перекисного окисления липидов судили по уровню в тканях одного из конечных продуктов реакции - малонового диальдегида (МДА). Содержание МДА определяли в соответствие с методикой Камала с сотр. (Kamal et al. 1989), основанной на образовании окрашенного триметинового комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при нагревании. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли методом Бичемпа и Фридовича (Beauchamp, Fridovich, 1971), основанном на ингибировании фотохимического восстановления красителя нитро-голубого тетразолия (NBT) радикалами 02* до формазана. Активность каталазы (КАТ) определяли методом прямого измерения распада Н202 при 240 нм, как описано Бииром и Сайзером (Beers, Sizer 1952). Активность глутатионредуктазы (ГР) оценивали по уменьшению поглощения света образцом при 340 нм вследствие окисления НАДФ-Н+ в реакции: GSSG + р-НАДФ-Н+ + Н+ -> 2GSH + Р-НАДФ+ (Goldberg and Spooner, 1983). Активность аскорбатпероксидазы (АПО) оценивали по уменьшению поглощения света образцом при 290 нм вследствие окисления аскорбата по методике, предложенной Накано и Асада (Nakano and Asada, 1981). Содержание аскорбата (АсК) измеряли согласно методике, предложенной Фоером с соавт. (Foyer et al., 1983) по увеличению содержания дегидроаскорбата в присутствии аскорбатоксидазы, катализирующей прямое окисление аскорбата до дегидроформы. Содержание глутатиона (ГЛ) определяли по методу ферментативной рециклизации (Anderson, 1985).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft). Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стыодента для независимых переменных (/-test) при равных объемах выборок и дисперсий. В ряде случаев полученные данные подвергали дисперсионному анализу (ANOVA) с последующим использованием многорангового Тьюки HSD-теста (Tukey HSD-test). Представленные значения соответствуют средним и их стандартным отклонениям (SD); различия считали значимыми при Р<0.05. Для выявления взаимосвязи между физиолого-биохимическими показателями макроводорослей и факторами среды в месте их обитания в течение года использовали множественный регрессионный анализ (Multiple regression). Статистически значимыми коэффициентами детерминации, т.е. отклоняющимися от нуль гипотезы о несопряженности изменений физиолого-биохимических показателей и параметров внешней среды, считалиR2 > 0.3 приР < 0.05.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ и Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика антиоксидантного статуса макроводорослей Японского моря

Выявленный нами диапазон вариабельности активности и содержания основных компонентов AOC макроводорослей, обитающих на открытых участках верхней сублиторали б. Соболь Японского моря, сопоставим с ранее опубликованными данными для зелёных макроводорослей Балтийского моря (Choo et al., 2004), красных водорослей Чёрного моря (Ткаченко и др., 2004), а также бурых и красных водорослей Атлантики (Collen, Davison, 1999 b, с, 2001; Lohrmann et al., 2004).

Максимальная активность антиоксидантных ферментов и наибольшее содержание глутатиона и каротшюидов характерны для представителей зеленых водорослей (отдел Chlorophyta) (табл. 1). Минимальная активность супероксиддисмутазы (СОД), аскорбатпероксидазы (АЛО) и глутатионредуктазы (ГР) зарегистрирована у бурых водорослей (отдел Ochrophyta, Phaeophyceae), красные водоросли (отдел Rhodophyta) по этому показателю занимают промежуточное положение. Минимальный уровень каротиноидов отмечен в тканях представителей отдела Rhodophyta. Полученные тенденции соответствуют результатам мониторинговых исследований водорослей Арктики (Aguilera et al., 2002а; Dummermuth et al., 2003), а также согласуются с данными ряда работ, проведенных на макроводорослях Жёлтого (Park et al., 2011), Северного (Malea et al., 2006; Zakeri, 2010; Zacharias, 2012), Чёрного (Ткаченко и др., 2004) морей и северо-восточного побережья Индийского океана (Chakraborty et al., 2010), которые демонстрируют, что у красных и бурых водорослей потенциал ферментативной и низкомолекулярной AOC ниже, чем у представителей зеленых водорослей.

Таблица 1

Активность СОД, КАТ, АПО, ГР и содержание АсК, ГЛ, Кар в тканях макроводорослей с открытых участков верхней сублиторали б. Соболь Японского моря._

Вид Биогео- сод КАТ, АПО, ГР, АсК, ГЛ, Кар,

графия Огн. едУг Огн. едУг ЕдУг ЕдУг ,мкмоль/г мкмоль/г мг/г

Chlorcmhvta

U. lactuca К 180±7 119±5 6.25±0.31 0.83±0.03 1.32±0.11 0.41±0.04 0.64±0.05

М. grevilki аБ, шБ 169±8 62±3 4.61±0.14 - 1.55±0.19 0.64±0.04 0.51±0.05

Ochroohvta

С. costata т шБ 38±1 48±1 1.56±0.11 0.13±0.01 1,08±0.10 0.33±0.03 0.24±0.03

S. crassipes п шБ 32±1 - O.lliO.OO 0.17±0.01 0.7Ü0.05 - 0.21±0.02

U. pinnatifida п СТ-нБ 57±5 64±5 1.88±0.17 0.26±0.02 - 0.21±0.02 0.4б±0.04

Rhodoohvta

Л. flabelliformis тТ-нБ 122±15 71±9 3.74±0.22 0.38±0.05 1.48±0.13 0.36±0.04 0.08±0.01

С. pirumlatxis п нБ 73±7 48±4 2.25±0.18 0.27±0.02 0.75±0.05 0.27±0.02 0.06±0.00

С. divaricata т нБ 68±5 31±2 1.92±0.13 0.22±0.02 0.98±0.08 0.12±0.01 0.08±0.00

L nipponica п СГ-нБ 132±11 81±6 2.97±0.27 0.52±0.04 1.22±0.05 0.41±0.05 0.12±0.00

P. stenogona п шБ 65±3 51±2 2.64±0.08 0.23±0.01 0.37±0.04 0.29±0.03 0.04±0.00

T. crirtiftis п шБ 82±8 33±3 2.30±0.18 0.21±0.05 0.83±0.10 O.lliO.Ol 0.i3±0.01

Примечание. В таблице представлены среднеарифметаческие значения ±5Д п=10-15. Показания рассчитывали огноаггельно сырого веса образцов. «-» измерения не проводили. Сокращен™ биогеографии: К - комоподиг, аБ - амфибореапьный; нБ - низкобореальный; шБ - широкобореальный; Т -тропичесюш; СТ -субтропический; п-приазиагский (западнстихоокеанский); т-тихоокеанский (согласно Пересгенко, 1980).

Сравнительно низкий уровень активности антиоксидантных ферментов и содержания глутатиона, обнаруженные нами у бурых и красных водорослей б. Соболь предполагает наличие у

них альтернативных антиоксидангных механизмов защиты, в частности накопление соединений, потенциально способных участвовать в перехвате АФК. Такими соединениями являются, например, флоротаннины бурых водорослей (Connan et al., 2006; Cruces et al., 2012a), микоспорин-подобные аминокислоты красных водорослей (обзор, Sinha et al., 2007) и сульфати-рованные полисахариды у представителей обоих отделов (обзоры, MacArtain et al, 2007; Jiao et al, 2011).

Кроме того, обнаружены различия в конститутивном уровне активности антиоксидантной системы защиты между видами макроводорослей в пределах отделов Ohrophyta и Rhodophyta (табл. 1). Максимальные значения активности ключевых антиоксидангных ферментов характерны для видов, принадлежащих к тропическо-низкобореальной группе (Undaria, Ahnfeltiopsis, Laurencia), а минимальные значения - для бореальных видов (табл. 1). Подобную закономерность ранее неоднократно отмечали у высших растений (обзор, Wahid et al., 2007) и беспозвоночных (обзор, Abele, Puntarulo, 2004), по у морских макроводорослей показано нами впервые. По нашему мнению, высокий антиоксидантный потенциал у видов красных и бурых водорослей, широко распространённых в субтропических и бореальных водах, косвенно указывает на их большую устойчивость к окислительному стрессу по сравнению с видами бореального группы. По данным ряда исследователей (Padilla-Gamino et al, 2007; Liu, Pang, 2010b), стресс-устойчивость тропических макроводорослей значительно превышает таковую их близкородственных видов из холодноводных районов умеренных широт. Аналогичные данные были получены также и для фитопланктона (Helbling, 2003; Wong et al, 2007).

Таким образом, результаты исследования антиоксидантного статуса макроводорослей мелководных участков шельфа умеренных широт показывают широкую таксономическую вариабельность их антиоксидантного потенциала. Не исключено, что межвидовые различия в активности АОС водорослей могут быть связаны с их географическим происхождением и филогенетически закрепленной способностью к активации и синтезу её компонентов, что определяет адаптивные возможности водных растений противостоять ФОС в условиях как кратко-, так и долговременных флукгуаций факторов окружающей среды.

Регуляция устойчивости водных растений к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременного повышения температуры воды

Сравнительные исследования устойчивости красных водорослей мелководья (субтропическо-низкобореальной Laurencia nipponica и низкобореальной Grateloapia divaricata) к ФОС в яркие солнечные дни летних месяцев в зал. Восток Японского моря показывают, что у L. nipponica дневные изменения скорости потенциального фотосинтеза выражаются одновершинной кривой с максимумом в полуденное время (рис. 2А) и уровень маркёров окислительного стресса (МДА и Н202) в течение дня не меняется (рис. 2Б, В), тогда как у G. divaricata имеет место полуденная депрессия фотосинтеза с 12 до 15 ч (рис. 2А). Подобная тенденция сопровождается существенным (в 2-2.5 раза) увеличением содержания МДА и Н202 в тканях грателюпии в период, когда интенсивность фотосинтетнчески активной радиации, падающей на поверхность воды, ФАРп, достигает 1800-2000 мкЕ/(м2 сек), а температура воды повышается до 25-27 °С. В пасмурные дни при освещенности 400-500 мкЕ/(м2 сек) и незначительном колебании температуры воды (20-22°С) у обоих видов водорослей статистически значимых (Р>0.05) изменений в содержании МДА и Н202 не зарегистрировано.

• Laurencla nipponica--— Grateloupta divaricate

О

3 0,5

МДА

а г®

Î--Î--

6 g 12 15 1S 21 Среднее местное время, (ч)

6 9 12 15 18 21 Среднее местное время, (ч)

Б 9 12 15 18 21 Среднее местное время, (ч)

Рис. 2 Дневная динамика скорости потенциального фотосинтеза, Pmlx, (А) и содержания маркеров окислительного стресса: МДА (Б) и Н202 (В) в тканях L. nipponica и G. divaricaia в условиях мелководья в типичный летний солнечный день. На рисунке приведены среднеарифметические значения ± SD, п = 6.

Таким образом, нами впервые показано, что вид субтропического/тропического генезиса более устойчив к ФОС в условиях ярко освещенного мелководья по сравнению с видом бореального происхождения. Снижение функциональной активности фотосгаггетического аппарата водорослей в середине дня в летние месяцы обусловлено повышением концентрации Н202 и накоплением продуктов ПОЛ в тканях растений.

Из литературы известно, что стресс-устойчивость морских макрофитов приливно-отливной зоны океана может быть обусловлена накоплением в их тканях фотопротекторов (Karsten et al., 1998; Andersson et al., 2006), способностью фотосинтетического аппарата к эффективной диссипации избыточной энергии поглощенного света (Hader et al., 2002; Gevaert et al., 2003), а также транзитной активацией систем антиоксидантной защиты (Collen, Pedersen 1996; Collen, Davison, 1999b). Согласно нашим данным для стресс-устойчивого вида L. nipponica действительно характерно повышение (в 2-2.5 раза) активности СОД, КАТ, АПО и ГР к середине дня; поддержание их стабильно высокой активности в период действия сильной инсоляции и субоптимальных температур, и уменьшение к вечеру (рис. ЗА-Г), когда поток падающей на воду радиации и температура воды снижаются. Аналогичная тенденция прослеживается в отношении содержания восстановленных форм глутатиона, GSH, (рис. 4А) и аскорбата, АА, (рис. 4В). Учитывая тот факт, что в условиях ФОС идет их активное окисление (Shiu, Lee, 2005), существегаюе повышение GSH (рис. 4А) и АА (рис. 4В) в середине солнечного дня летних месяцев, указывает не только на активное рециклирование данных антиоксидантов (Asada, 1999), обусловленное высокой активностью ферментов аскорбат-глутатионового цикла - АПО и ГР (рис. ЗВ, Г), но и на адаптивную активацию биосинтеза молекул этих соединений de novo (Wonisch et al., 2001; Tausz et al, 2004). Подобную динамику активности компонентов АОС в течение яркого солнечного дня ранее наблюдали у стресс-устойчивых видов морского фитопланктона (Butow et al, 1997; Dupont et al, 2004), кораллов мелководья (Levy et al, 2006) и высших наземных растений (Schupp, Rennenberg, 1988; Yang et al, 2001), но у морских макрофитов показано нами впервые.

Низкая стресс-устойчивость G. divaricaia в середине дня может быть связана с ингиби-рованием активности СОД (рис. ЗА), участвующей в дисмутации супероксидного радикала, 02" (Alscher et al, 2002) и снижением активности КАТ (рис. ЗБ), утилизирующей Н202

If íl

60 so

40

30 20 10

- Laurencia nipponica

Супероксиддисмутаза

1,5 1

0,5 O

9 "12 16 18 21 Аскорбатлвроксидаза

— — — Gratatoupla divaricata Каталаз a

AOQ ' ЗОО 200 100 O

0,08 0,07 0,06 0,05 O.Ot О.ОЗ 0,02 0,01

9 12 16 16 21 Глутатионрвдукгаэа

. r

i 9 12 15 18 21 Среднее местное время, (ч)

8 9 12 15 Среднее местное ■

18 21 [ремя, (ч)

Рис. 3 Дневная динамика активности СОД (А), КАТ (Б,), АПО (В) и ГР (Г) в тканях L. nipponica и G. divaricata в условиях мелководья в типичные летние солнечный дни. На рисунке приведены среднеарифметические значения ± SD, п = 6. Примечание: Содержание общего растворимого бежа в тканях исследуемых видов в течение как яркого солнечного, так и пасмурного дней статистически значимо (Р>0.05) не изменялось и составляло в среднем д ля L nipponica 170-190 мг/г сух. веса и для G, divaricata - 190-200 мг/г сух. веса

(Willekens et al, 1997) с 12 до 18 ч дня, а также задержкой в активации АПО (рис. ЗВ). Кроме того, в послеобеденное время у G. divaricata зарегистрировано нарушение работы аскорбат-глутатионового цикла, активно участвующего в детоксикации Н202 (Asada, 1999): резкое уменьшение содержания восстановленной формы глутатиона (рис. 4Б) на фоне пониженной активности ГР (рис. ЗГ), ответственной за его рециклирование (Noctor, Foyer, 1998). Это свидетельствует об ингибировании процессов ресинтеза низкомолекулярных антиоксидантов у стресс-чувствительных водорослей в середине солнечного дня летних месяцев.

Рис. 4 Дневная динамика содержания восстановленной и окисленной форм ГЛ (А, Б) и АсК (В, Г) в тканях Ь. трротса и & divaricata в условиях мелководья в типичный летний солнечный день. На рисунке приведены среднеарифметические значения ± ЙИ, п = 4.

Необходимо отметить, что ритмические изменения в активности и содержании компонентов АОС исследованных водорослей, найденные нами в солнечный день, отсутствуют в пасмурную погоду при незначительных колебаниях факторов окружающей среды (не показано), что может свидетельствовать об отсутствии эндогенной ритмики и регуляции этих процессов изменением в течение дня интенсивности солнечной радиации и температуры воды. Большинство исследователей склонны придерживаться аналогичной точки зрения (обзор, Barros et al, 2005), что, однако, не исключает наличие внутренней циркадной ритмики антиоксидантных процессов, отмеченной, например, у некоторых морских микроводорослей (обзор, Carvalho et al, 2004).

Таким образом, можно заключить, что способность к поддержанию стабильно-высоких активностей ключевых антиоксидантных ферментов и содержания антиоксидантов аскорбат-глутатионового цикла в середине летнего солнечного дня является важным защитным механизмом против фотоокислительного стресса при адаптации водорослей умеренных широт к условиям литорали.

Для оценки вклада кратковременного повышения температуры воды в регуляцию окислительных и антиоксидантных процессов водорослей в условиях ФОС, испытываемого растениями на мелководных участках литоральной и верхнесублиторальной зоны в яркие солнечные дни летних месяцев нами проведена серия лабораторных экспериментов. Сравнительный анализ антиоксидантного статуса и маркеров окислительного стресса у верхне-сублиторальных водорослей Амурского залива Японского моря: тропическо-низкобореального Ahnfelíiopsis flabelüformis и низкобореального Chondrus pinnulatus, показывает, что активность СОД, КАТ и содержание низкомолекулярных антиоксидантов выше (Р<0.05) в тканях тропическо-низкобореального вида (табл. 2). В активности АПО и содержании МДА и Н202 значимых с позиции статистики различий (Р>0.05) между видами не обнаружено (табл. 2).

Таблица 2

Содержание маркёров окислительного стресса (МДА и Н202), активность СОД, КАТ, АПО и содержание АсК, ГЛ в тканях контрольных образцов А. АаЪе11\(огпт и С. ртпиЬшя._

Вид МДА Н2О2 сод КАТ АПО АсК ГЛ

нмоль/г нмоль/г Отн. едУг Огн. едУг ЕдУг мкмоль/г мкмоль/г

A.j!abellifcrmis 7.14a 56a 73.8a 77.2a 3.4a 1.36a 0.62a

С. рттйсЛич 6.54a 61a 54.2й 39.16 3.2a 0.86е 0.23®

Примечание. В таблице представлены среднеарифметические значения. Одинаковые буквенные индексы, расположенные справа от значений, показывают отсутствие статистически значимых различий между значениями параметра у исследованных видов, при Р<0.05. Стандартное отклонение не превышало 15%, при п = 4-5. Показания рассчитывали относительно сырого веса образцов.

В условиях светового стресса при комфортной температуре (20°С для Л. /1аЬеШ/опт$ и 15°С для С. ртпиЫш) оба исследованных вида проявляют высокую устойчивость к ФОС. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных изменений в уровне МДА и Н202, (не показано) в тканях А. АаЬсШ^огпт и С. ртпиШш после кратковременного (4ч) воздействия высоких интенсивностей видимого света, соответствующих освещению в природе в середине летнего солнечного дня на мелководье Амурского залива. Подобный

A. flabellíformis

щ

I экспозиция I восстановление

термостресс комб. стресс термосгресс комб. стресс Вариант опыта Вариант опыта

Рис. 5 Скорость потенциального фотосинтеза, Рпт (А), содержание МДА (Б) и Н202 (В) у А. АаЪеШ/огт15 и С. ртпиклиь после З-ч термосгресса (26°С) или З-ч комбинированного стресса (действие высоких интенсивностей солнечной радиации при 26°С) с последующим восстановлением на слабом свету при 22°С. Данные представлены в единицах относительно контроля. Контрольные растения в ходе всего эксперимента находились при температуре 22°С и 190 мкЕ/(м2 сек) ФАР. На рисунке приведены среднеарифметические значения ± ББ, п = 4. * - отличие статистически значимо по отношению к контролю приР<0.05.

феномен может быть обусловлен тем, что при совместном произрастании на небольших глубинах (1, 5 - 2 м) эти виды в процессе своего онтогенетического развития адаптировались к высоким интенсивностям падающего света благодаря способности к эффективной диссипации излишней световой энергии (Demmig-Adams, 2003; Adams et al., 2006), накоплению соединений-фотопротекгоров (Hoyer et al., 2002; Karsten et al., 2009a), а также адаптивной активации АОС (Davison et al., 2000; Aguilera et al., 20026; Bischof et al., 2003). Последнее хорошо продемонстрировано в нашей работе: для обоих исследованных видов водорослей отмечено повышение в их тканях активности ключевых антиоксидантных ферментов в ответ на кратковременный световой стресс (не показано).

В условиях комбинированного стресса (кратковременное действие высоких интенсивностей солнечной радиации при температуре 26°С) для анфельтиопсиса и хондруса характерно снижение PMWi (рис. 5А) и накопление в тканях маркёров окислительного стресса (рис. 5Б-В). Следует отметить, что у тропическо-низкобореального А.

flabelliformis после периода

МДА и Н202 соответствуют контрольным С. pinnulatus данные процессы носят период у облученных образцов

восстановления на слабом свету уровни Р, значениям (рис. 5А-В). У низкобореального необратимый характер, так как в постстрессовый восстановления этих показателей до уровня контроля не происходит (рис. 5А-В). Низкая устойчивость С. рттймт к комбинированному стрессу может быть обусловлена 2-х кратным падением (Р<0.05) активности СОД (рис. 6А), а также снижением (Р<0.05) содержания АсК (рис. 7А) по сравнению с уровнем, зарегистрированным в контрольных образцах. Обращает внимание дальнейшее снижение (Р<0.05) содержания АсК у С. ртпиШиэ после периода восстановления на слабом свету (рис. 7А), что может указывать на истощение пула АсК вследствие нарушения процессов его ресинтеза на фоне инактивации АПО в этот период (рис. 6В). У стресс-устойчивого А. /1аЬе1И/огт1$ комбинированный стресс, напротив, вызывает 2-3-х кратное повышение (Р<0.05) активности всех исследованных ферментов (рис. 6А-В) и

увеличение содержания АсК и ГЛ соответственно в 1.8 и 1.5 раза по отношению к контролю (рис. 7 А, Б).

О §

!! *

1 I ^ 2

< г!

А. паьсииогтп

Д

ш

Щ

С. ртпи/зил

н восстановление

г?

; о. 1.5

1

о *

"0,5

А. НаьеННогти

Р] ЭКСПОЗИЦИЯ К] восстановление

гермостресс комб. стресс термостресс комб. стресс Вариант опыта Вариант опыта

Рис. 6 Активность СОД (А), КАТ (Б) и АПО (В) в тканях А. АаЬеШ/огт!$ и С. ртгш1аШ после З-ч термостресса (26°С) или З-ч комбинированного стресса (действие высоких интенсивностей солнечной радиации при 26°С) с последующим восстановлением на слабом свету при 22°С. Обозначения как на рис. 5.

термостресс комб. стресс термостресс стресс

Ваоиант опыта Вариант опыта

Рис. 7 Содержание низкомолекулярных антиоксидантов: АсК (А) и ГЛ (Б) в тканях А. АаЬеШ/огт1$ и С. ртпи1а/и$ после З-ч термостресса (26°С) или З-ч комбинированного стресса (действие высоких интенсивностей солнечной радиации при 26°С) с последующим восстановлением на слабом свету при 22°С. Обозначения как на рис. 5.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о разной степени устойчивости фотосинтетического аппарата и прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза клеток низкобореального и тропическо-низкобореального видов верхне-сублиторальных водорослей Японского моря к совместному воздействию кратковременного повышения температуры воды и высокой инсоляции. Принимая во внимание отсутствие негативной реакции физиологических процессов исследованных водорослей на световой стресс, мы предполагаем, что разная устойчивость А. АаЬе\Щогтх$ и С. рттйаШ к комбинированному стрессу обусловлена различием в реакции их АОС на повышение температуры воды.

Действительно, в условиях термостресса (26°С) при интенсивности света, насыщающей, но не ингибирующей фотосинтетические процессы А. /1аЬеШ/огт1$ и С. р 'тпиЫиз, активация антиоксидантных ферментов отмечена только в тканях бореального хондруса (рис. 6А-В), что свидетельствует о развитии ФОС у этой водоросли (СЬоо е! а1, 2004) и ее повышенной чувствительности к тепловому воздействию. Не исключено, что подобный феномен связан с изначально низким конститутивным уровнем активности АОС у С. ртпи/апи,

принадлежащего к бореальной зонально-географической группе (табл. 2). На макрофитах Желтого моря также показано, что активность антиоксидантных ферментов тропическо-бореальной водоросли Graleloupia luruturu превышает таковые у широкобореального вида Palmaria palmala, что в дальнейшем обуславливает низкую устойчивость последнего в условиях теплового стресса (Liu, Pang, 2010b). Непосредственная взаимосвязь между конститутивным уровнем активности антиоксидантных ферментов и устойчивостью к окислительному стрессу отмечена также у бурых и красных макроводорослей северной Атлантики (Collen, Davison, 1999b, с), зеленых макроводорослей Балтийского моря (Choo et al., 2004), а также макрофитов субэкваториального пояса (Rout, Shaw, 2001).

Таким образом, температура вносит существенный вклад в регуляцию активности АОС тропическо-низкобореальных и бореальных видов как литоральных, так и верхнесублиторальных макроводорослей Японского моря. Кратковременное повышение температуры воды вызывает инактивацию СОД и ферментов аскорбат-глутатионового цикла, АПО и ГР, и нарушение процессов регенерации АсК и ГЛ у видов бореальной биогеографической группы и ускоряет рециклирование низкомолекулярных антиоксидантов у видов, принадлежащих к тропическо-низкобореальной группе. Выявленные нами различия в функционировании антиоксидантной системы бореальных и тропическо-низкобореальных макрофитов зал. Петра Великого Японского моря в условиях высокой инсоляции и кратковременного повышения температуры воды могут свидетельствовать о том, что способность к реализации антиоксидантного потенциала водорослей одной глубины обитания, но различного широтного распространения, определяется их генетически закрепленным диапазоном толерантности к температуре.

Регуляция антиоксидантной системы морских макроводорослей в условиях долговременного температурного воздействия.

Принимая во внимание, что в естественных условиях обитания водоросли умеренных широт испытывают не только кратковременные, но и долговременные колебания температуры воды сезонная динамика функциональной активности их АОС может являться важнейшим звеном в формировании устойчивости морских макрофитов к ФОС в течение года. Этот постулат находит свое отражение в результатах, полученных нами при анализе активности СОД, ГР и АПО в тканях пяти макроводорослей б. Соболь (Японское море) и двух красных водорослей из Амурского залива (Японское море) в течение их вегетационного цикла. Общей закономерностью для большинства исследованных видов, несмотря на их различную таксономическую и биогеографическую принадлежность, является повышение активности исследованных ферментов в холодные месяцы (январь-март для водорослей б. Соболь (рис. 8); февраль-апрель для водорослей Амурского залива) в условиях низких положительных температур (до +7°С) и снижение ферментативной активности в теплый период года (июнь-август для водорослей б. Соболь (рис. 8); июнь-сентябрь для водорослей Амурского залива) в условиях максимальных инсоляции и температуре воды выше +1ГС. Стоит отметить, что снижение активности ГР и АПО до минимальных годовых значений у большинства исследованных водорослей (рис. 8) происходит в июле после окончания периода пасмурной погоды или в августе при максимальном прогреве воды до 24.0 - 25.0°С и максимальном уровне инсоляции (суточная доза ФАР ~ 29-38 моль

м"2 сут"1). Аналогичная тенденция отмечена также в отношении каротиноидов, Кар (табл. 3, 4), известных своей способностью проявлять антиоксидантную функцию (ВпПоп, 1995; В18Ьо£ Rautenberger, 2012).

Нояб Дех Фее Июн Июл Авг Йяв Фее Нар Июм Июл OS OS 06 06 06 06 10 10 10 10 10

Вреин (месяц, год]

Об 0S 06 06 06

Вромя (месяц. ГОД)

Время (месяц, год)

Рис. 8 Активность СОД, ГР и АПО у макроводорослей б. Соболь Японского моря в течение их вегетационного цикла в холодные (ноябрь-март) и теплые (июнь-август) месяцы 2005/2006 и 2010 гг. На рисунке приведены среднеарифметические значения ±80, п=4.

В целом, по мнению ряда исследователей (Collen, Davison, 2001; Dummermuth, 2003; Lohrmann et al., 2004), повышение антиоксидантного потенциала макроводорослей в холодное время года является частью их зимней акклиматизации, направленной на минимизацию окислительных повреждений при возрастании уровня АФК в тканях водных растений в условиях низких температур. Действительно, адаптивная активация антиоксидантных ферментов, наблюдаемая нами у большинства исследованных видов в холодное время года (рис 8), по-видимому, способствует повышению их устойчивости к ФОС, о чем свидетельствует отсутствие достоверных изменений в содержании МДА в их тканях и стабильно высокий уровень Ртах в этот период (табл. 3, 4). Следует отметить, что в условиях низких положительных температур существенный вклад в обеспечение устойчивости макроводорослей к стрессу могут также вносить низкомолекулярньте антиоксиданты (Collen, Davison, 2001; Lohrmann et al., 2004). Инактивация антиоксидантных ферментов (рис. 8) и истощение пула каротиноидов-антиоксидантов (табл. 3, 4) у большинства исследованных видов при повышении температуры воды в

теплые месяцы (особенно на фоне высокой инсоляции) сопровождается интенсификацией окислительных процессов в тканях водорослей и подавлением их фотосинтетической активности в этот период года (табл. 3, 4). Так, например, в июле-августе у водорослей б. Соболь (за исключением Ulva lactuca) содержание МДА существенно (в 2-3 раза) возрастает (Р<0.05) (табл. 3), а уровень Лми значительно (на 20-80% в зависимости от вида водоросли) снижается (Р<0.05) (табл. 3).

Таблица 3

Содержание Кар, МДА и скорость потенциального фотосинтеза (Рмах), у макроводорослей б. Соболь, Японского моря в течение их вегетационного цикла в холодные (ноябрь-февраль) и теплые (июнь-август) месяцы 2005/2006 гг._

Вдд параметр _Время, месяц_

_Холодные месяцы_Теплые месяцы

ноябрь декабрь февраль июнь п.п. июль август

Ulva lactuca Кар 0.87" 0.68" 0.78* 0.48' 0.64 0.50 "

МДА 1.60" 1.58" 1.61" 1.82 " 2.03" 2.12"

Рт» 2.26" 2.86" 3.07" 2.91" 3.15" 3.5"

Costaría costata Кар 0.49" 0.80 6 0.49" 0.37" 0.36" 0.27"

МДА 9.75" 9.35" 9.33 " 9.92" 21.83 6 30.53 '

0.86" 1.39 6 2.64 " 1.38 6 0.33 г 0.32'

Undaria pinnatifida Кар 0.47" 0.58" 0.51 1 0.56" 0.09 6 н.д.

МДА 7.20" 7.49" 6.53" 7.72" 14.56 6 н.д.

/>„„ 1.30" 1.31" 0.96" 1.44" 1.00" н.д.

Palmaria stenogona Кар Н.Д. 0.06" 0.06" 0.05 ' 0.05 6 0.10"

МДА Н.Д. 6.00" 5.07" 5.92" 15.99 6 12.74 6

Н.Д. 0.83" 0.89" 0.67" 0.41 6 0.516

Tichocarpus crinitus Кар 0.14" 0.16" 0.17" 0.14" 0.09 6 0.17"

МДА 4.71" 4.57" 4.98" 3.80" 8.41 ® 4.66"

Рты 0.68" 0.65" 0.64 " 0.52" 0.42 6 0.56"

Примечание. В таблице представлены среднеарифметические значения (п = 5-6). Одинаковые буквенные индексы, расположенные справа от значений, показывают отсутствие статистически значимых различий между значениями параметра в разные месяцы, при Р0.05. Рт% выражена в мг 02/г сыр. веса ч; содержание Кар выражено в мг/г сыр. веса; содержание МДА выражено в нмоль/г сыр. веса. Сокращение п.п. - период пасмурной погоды; н.д. - нет данных.

Таблица 4

Содержание Кар, МДА и скорость потенциального фотосинтеза (Рмах) у макроводорослей Амурского залива, м. Красный Японского моря в течение их вегетационного цикла в холодные (февраль-апрель) и теплые (июнь-сентябрь) месяцы 2009 г.._

Вид Параметр Время, месяц

февраль л. п. март л. п. апрель июнь п.п. июль август сентябрь

Ahnfeltiopsis Jlabelliformis Кар 0.17" 0.13" 0.09 6 0.07 6 0.08 6 0.05" 0.07"

МДА 10.03 " 10.63 " 20.04 6 12.15" 8.40" 12.86 "6 9.40"

Рты 0.96" 0.81" 0.87" 1.08" 0.98" 0.89" 0.89"

Chondrus pinnulatus Кар 0.07" 0.06" 0.05" 0.06" 0.02 6 0.01 6 0.02 6

МДА 14.05" 11.12" 16.30® 11.07" 11.61" 14.01" 9.90"

1.06" 1.05" 0.616 0.87' 0.40' 0.71" 0.72'

Примечание. В таблице представлены среднеарифметические значения (п = 4). Обозначения как в табл. 3. Сокращение л.п. - ледовый покров; п.п. - период пасмурной погоды.

Следует отметить, что снижение активности антиоксидантных ферментов в период повышения уровня инсоляции и температуры воды у таких водорослей как Costaría costata и Undaria pinnatifida может быть связано с угасанием метаболической активности водорослей

вследствие окончания периода их вегетации и увеличением чувствительности к фотоокислительным повреждениям на данном этапе развития.

В целом, для круглогодично вегетирующих япономорских видов водорослей адаптивная реакция на низкие положительные температуры воды в зимний и ранневесенний период времени проявляется в повышении активности антиоксидантных ферментов и накоплении каротиноидов-антиоксидантов. Совместное действие повышения температуры воды и высоких интенсивностей солнечной радиации в летний период времени вызывает падение активности ферментов, ответственных за детоксикацию перекиси водорода в тканях водорослей, и истощение у них пула каротиноидов, что сопровождается интенсификацией окислительных процессов и подавлением фотосинтетической активности макрофитов. Однако мы не исключаем существование и других факторов (например, наличие внутренних эволюционно сформированных физиологических ритмов или влияние скорости ростовых процессов), определяющих характер антиоксидантных механизмов защиты морских макроводорослей в течение их вегетационного цикла.

Лабораторные исследования активности антиоксидантных ферментов морских макроводорослей в условиях долговременной температурной акклимации, проведенные нами на тропическо-низкобореальном А. /1аЬеШ/огт1.ч и низкобореальном С. рттЛашз, показывают существенные различия в реакции их ферментативной АОС на пониженные и повышенные температуры воды. Так, при акклимации водорослей к температурам в диапазоне 5-15°С для тропическо-низкобореального А. /1аЬеШ/огт1х отмечено изменение активности ферментов, ответственных за удаление перекиси водорода: снижение (Р<0.05) активности КАТ и АПО, и повышение (Р<0.05) активности ГР, а для низкобореального С. ртпиШия характерно поддержание стабильно высокой активности всех исследованных антиоксидантных ферментов, за исключением ГР в варианте 15°С (табл. 5). При акклимации водорослей в диапазоне температур 20-25°С у А. /1аЬеШ/огт15 зарегистрировано повышение (Р<0.05) активности КАТ и АПО и снижение (Р<0.05) активности ГР, тогда как у С. ртпи1аш$ выявлено уменьшение (Л<0.05) активности всех исследованных ферментов, за исключением АПО и ГР в варианте 20°С, активность которых не изменялась (табл. 5). Длительное нахождение водорослей при субоптимально высокой температуре (30СС) вызывает 2-3-х кратное падение активности КАТ и АПО у тропическо-низкобореального А. /1аЬеШ/огт!з (табл. 5) и обесцвечивание, фрагментацию и гибель талломов на 7-10 сутки экспозиции у низкобореального С. ртпи1аШз.

Изменения скорости потенциального фотосинтеза (Ртах) и темнового дыхания (Ял) у обоих исследовшшых видов при их длительном культивировании в широком диапазоне температур носят адаптивный характер - низкие значения и Нд при 5-10'С и увеличение этих параметров с повышением температуры воды в диапазоне 15-30' (табл. 6). Максимальные уровни Ртах и у А. АаЪеНфгтгз зарегистрированы соответственно при температуре воды 20-25°С и 30°С, а у С. ртпиШиз - соответственно при 15-20°С и при 25°С (табл. 6). У А. АаЬе/П/огпи.^ акклимация к температуре воды 30°С вызывает 1.7-кратное снижение (Р<0.05) показателя Рт1Х. Аналогичные результаты получены при акклимации С. рттйаШЕ к температуре воды 25°С. Уровни маркеров окислительного стресса, МДА и Н2О2, у исследованных видов значимо (Р>0.05) не различаются между

температурными вариантами опыта (табл. 6), что свидетельствует об успешной акклимации водорослей к предложенным температурным условиям.

Таблица 5

Активность антиоксидантных ферментов: СОД, КАТ, АПО и ГР в тканях А. /\abeHiformis и

Параме тр Температура акклимации, °С

5 10 15 20 25 30

А. ¡1аЬе1Нргт!$ СОД 140.70" 134.25" 144.07" 134.39" 147.67" 138.87"

КАТ 40.08" 56.23е 49.67® 73.34" 73.24° 17.24г

АПО 1.81" 2.18" 2.34е 4.75* 5.21" 2.506

ГР 0.33" 0.31' 0.36" 0.25*6 0.16е 0.20е

С. ртгткиш сод 119.17" 120.00" 131.76* 96.46б 64.97° -

КАТ 61.63" 63.71" 51.78" 14.88® 11.65® -

АПО 1.84" 1.98" 2.20" 1.94" 1.30е -

ГР 0.25" 0.29" 0.17е 0.18е 0.13' -

Примечание. В таблице представлены среднеарифметические значения, при п=4-6. Одинаковые буквенные индексы, расположенные справа от значений, показывают отсутствие статистически достоверных различий в значениях параметра между температурными вариантами опыта, при Р<0.05 Активность ферментов выражена в Отн. Ед./г сыр. веса. 1 единица = мкмоль субстрата, израсходованного за 1 мин.

Таблица 6

Максимальная скорость потенциального фотосинтеза (Ртах), скорость темпового дыхания (Ла) и уровень маркеров окислительного стресса: МДА и Н202 в талломах А. ]1аЬеШ/огт15 и

Вид водоросли Парамс Температура акклимации. ° С

тр 5 10 15 20 25 30

А./1аЬеШ/огт1! 0.78" 0.94" 0.98" 1.24 е 1.18 6 0.72"

д, 0.12" 0.13* 0.196 0.21е 0.36° 0.69г

МДА 17.32" 22.16" 19.61" 23.69" 18.58" 23.11"

н202 0.013" 0.016" 0.013" 0.012* 0.015" 0.015*

С. рШикИш Ртп 0.88" 0.90" 1.316 1.15 е 0.72° _

Я, 0.05" 0.06" 0.29 е 0.31е 0.43 е

МДА 5.98" 7.86" 6.46" 6.34" 4.84" -

Н202 0.013" 0.018" 0.020 * 0.019" 0.020" -

Примечание. В таблице представлены среднеарифметические значения, при п=8. Обозначения как в табл. 5. Ртах и Д| выражены в мг 02г сыр. веса ч; содержание МДА выражено в нмоль/г сыр. веса; содержание Н202 выражено в мкмоль'г сыр. веса.

В целом, данные лабораторных экспериментов, как и результаты наших полевых исследований, свидетельствуют о том, что долговременная акклимация как к пониженной, так и к повышенной температуре воды играет значительную роль в регуляции уровня активности антиоксидантных ферментов в тканях макроводорослей умеренных широт. Обнаруженные нами различия в реакции ферментативной АОС тропическо-низкобореальных и низкобореальных видов на длительное пребывание при пониженных и повышенных температурах воды позволяют предположить их опосредованное влияние на регуляцию устойчивости к ФОС водорослей разного широтного распространения при дополнительной нагрузке других типов стресса, в частности при действии яркого света.

Ahnfeltlopsls flabelliformis

Chondrus pinnulatus

i s

a6

i

iTíШШ

Однако, результаты, полученные нами после кратковременного облучения водорослей высокими интенсивностями видимого света не подтверждают выдвинутой гипотезы.

При экспонировании

тропическо-низкобореапьного А. АаЬеШ/огти и низкобореального С. рттйаш на ярком свету установлено, что водоросли, акклимиро-ванные к температурам 5-20°С, отличаются высокой устойчивостью к ФОС. Об этом свидетельствует поддержание показателей Ртах на уровне контроля в постстрессовый период (рис. 9А, Б) и отсутствие значимых (Р>0.05) изменений в содержании МДА (рис. 9В, Г) и Н202 (рис. 9Д, Е) в тканях обоих видов после световой экспозиции.

Фотоустойчивость исследованных водорослей при пониженных температурах воды (5-15°С для А. АаЬе1И/огт1$ и 5-10°С для С. ртпиЫш), по-видимому, не связана с постакклимационными перестройками в уровне активностей КАТ, АПО и Г? у А. /\abelliformi.ч и СОД, КАТ АПО и ГР у С. ртгшЫш (табл. 5). Об этом свидетельствует отсутствие существенных изменений в активности АПО у обоих видов после световой экспозиции, а также необратимая инактивация КАТ и ГР у А. АаЬеЩогт\$ в конце

LlLi

I

imm

Температура, { С)

Температура, ('С)

Рис. 9 Скорость потенциального фотосинтеза, Ртак (А, Б), содержание МДА (В, Г) и Н202 (Д, Е) в тканях A. flabelliformis и С. pinnulatus, акклиматизированных к различным температурам, после 4-ч воздействия высоких интенсивностей видимого света с последующим восстановлением на слабом свету. Данные представлены в единицах относительно контроля. На рисунке приведены средне-арифметические значения ±SD, п=4. * -отличие статистически значимо по отношению к контролю, при Р<0.05.

эксперимента (рис. 10В, Ж), и значительное (50% от контроля) постэкспозиционное снижение активности СОД, КАТ, ГР у С. pinnulatus (рис. 10Б, Г, 3). Принимая во внимание стабильность в показателях маркеров окислительного стресса у исследованных видов в этих условиях (рис. 9В-Е), мы не исключаем наличия у обоих водорослей альтернативных механизмов защиты, включающих в себя процессы диссипации избыточной энергии света, а также накопления в тканях низкомолекулярных антиоксидантов и вторичных метаболитов с антиоксидантной функцией (обзор, Aguilera, Rautenberger, 2012). Следует также отметить, что в обеспечении устойчивости тропическо-низкобореального A. flabelliformis к яркому свету в диапазоне температур 5-15°С, по-видимому, участвует и термостабильный фермент СОД (табл. 5), активность которого в конце световой экспозиции в этих температурных условиях составляла в среднем 150-190% по отношению к контролю (рис. 10А).

Ahnfeltiopsis flabelliformis

Chondrus pinnulatus

| Q экспозиция

i восстановлен«

Ш

Ahnfeltiopsis flabelliformis

Chondrus pinnulatus

5 10 15 20 25 30 Твипературв, (*С)

15 20 25 Такпзрагурэ, (®С)

Температура, (С|

Температура, (°C¡

Рис. 10 Активность СОД (А-Б), КАТ (В-Г), АПО (Д-Е) и ГР (Ж-3) в тканях А. УЪЬеШ/огт18 и С. ртпи1а1т, акклиматизированных к различным температурам после 4 ч воздействия высоких интенсивностей видимого света с последующим восстановлением на слабом свету. Обозначения как на рисунке 9.

Обращает на себя внимание, что несмотря на постакклимационное снижение активностей СОД, КАТ при 20°С и ГР при 15-20°С у С. pinnulatus (табл. 5), эти ферменты принимают активное участие в регуляции устойчивости вида к высокой инсоляции в диапазоне температур 15-20°С. На это указывает двукратное повышение их активностей после световой экспозиции и восстановление показателей до уровня контроля в постэкспозиционный период (рис. 10Б, Г, Е, 3). Аналогичные результаты получены в отношении ГР у A. flabelliformis в температурном варианте 20°С (тал. 5, рис. 10Ж).

В условиях повышенной температуры воды (25-30°С для A. flabelliformis и 25°С для С. pinnulatus) в талломах водорослей, экспонированных на ярком свету, отмечена интенсификация процессов ПОЛ (рис. 9В, Г) и накопление Н202 (рис. 9Д). Это согласуется с необратимым ингибированием Ршах у обоих исследованных видов (рис. 9А, Б).

Общей закономерностью для A. flabelliformis и С. pinnulatus в условиях субоптимально высоких для видов температур (30°С для A. flabelliformis и 25°С для С. pinnulatus) является сопряженность низкой фотоустойчивости водорослей с:

(1) повышением в их тканях активности СОД (обратимым у тропическо-низкобореального A. flabelliformis и необратимым у низкобореального С. pinnulatus) (рис. 10А-Б), способствующей продукции Н202 в реакции дисмутации 02~ (обзор Бараненко, 2006)

(2) инактивацией ферментов, участвующих прямо или косвенно в элиминации Н202 (КАТ, АПО у A. flabelliformis (рис. 10В, Д) и АПО, ГР, у С. pinnulatus (рис. 10Е, 3)). Последнее может быть обусловлено угнетением активности ферментов еще на этапе долговременной акклимации водорослей к этим температурным условиям (табл. 5). Кроме того, необратимая потеря активности АПО у обоих видов в вариантах 25-30°С для A. flabelliformis и 25°С для С. pinnulatus при действии комбинированного стресса (рис. 10Д-Е) также может косвенно свидетельствовать об истощении пула аскорбата в процессе нейтрализации в хлороготастах водорослей высоких концентраций Н202 (Asada, 1999; Noctor, Foyer, 1998). В этой связи

обращает на себя внимание повышение (в 1.5-2 раза) активности ГР в тканях A. flabelliformis под действием светового пресса в вариантах 25°С и 30СС (рис.ЮЖ). Из литературы известно, что при истощении пула аскорбата в условиях окислительного стресса высокая активность ГР может свидетельствовать об участии этого фермента в дополнительной генерации супероксидного радикала (Asada, 1992), а значит, приводить к снижению устойчивости тропическо-низкобореального вида при субоптимально высокой температуре воды.

В целом, полученные данные согласуются с результатами наших полевых исследований динамики антиоксидантного потенциала и фотоустойчивости морских макрофитов Японского моря в теплое время года и свидетельствуют о том, что угаетише компонентов ферментативной АОС водорослей умеренных широт в условиях длительного воздействия высоких температур повышает чувствительность видов к ФОС и тем самым понижает их устойчивость к воздействию высокой освещенности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования убедительно показывают, что при адаптации макроводорослей к условиям мелководья важным защитным механизмом против ФОС, вызванного высокой инсоляцией и кратковременным повышением температуры воды в течение дня, является способность макрофитов поддерживать стабильно высокие активности СОД и ключевых компонентов аскорбат-глутатионового цикла (АГЦ), ответственных за удаление Н2Ог в тканях водорослей. Конститутивная емкость АОС и способность к реализации своего антиоксидантного потенциала в этих условиях у водорослей, принадлежащих к разным биогеографическим группам, существенно отличаются. При этом для бореальных видов водорослей характерна высокая чувствительность к ФОС, сопровождаемая снижением Ртак и накоплением в тканях Н2О2 и продуктов ПОЛ. Установлено, что данный феномен является следствием инактивации СОД и ферментов АГЦ - АПО и ГР, а также нарушения процессов регенерации АсК и ГЛ.

Нами впервые изучена динамика ферментативных антиоксидантных процессов при долговременной акклимации к пониженным и повышенным температурам воды. Гипотеза об участии температурной приакклимация ферментативной АОС в формировании устойчивости морских макрофитов к ФОС, нашла подтверждение только в отношении реакции водорослей на субоптимально высокие температуры. Экспериментально показано, что длительное воздействие температур выше 25°С для бореальных видов и выше 30°С для тропическо-бореальных видов вызывает у них инактивацию ферментов, ответственных за элиминацию Н2О2, и тем самым повышает чувствительность водорослей к ФОС при дополнительной нагрузке других стрессовых факторов среды (в частности, высокой освещенности).

Полученные данные представляют значительный интерес для прогнозирования видового разнообразия морских фитоценозов умеренных широт (в частности Японского моря) и вероятностных изменений границ ареалов макроводорослей вследствие циклических изменений климата (повышение солнечной активности и средней температуры поверхностных вод). Регулярно наблюдаемая в последние годы тенденция к повышетгию температуры воды (mvw.climate.nasa.gov: www.whoi.edu/oceans/featiire) может способствовать быстрому распространению термоустойчивых инвазийных водорослей, сдвигу южных границ ареалов бореальных видов, обитающих на пределе своей температурной толерантности, и замещению бореальной флоры представителями тропическо-бореального макрофитобентоса.

ВЫВОДЫ

1. Определен диапазон вариабельности антиоксидантной системы (АОС) защиты массовых видов макроводорослей Японского моря в период их активного вегетативного роста. Установлено, что максимальная активность АОС характерна для представителей зеленых водорослей (отдел СЫогорЬ^а), а минимальная - для бурых водорослей (отдел ОсЬгорЬу^а). В пределах отделов К1ю(1орЬу1а и ОЬгорЬ^а виды, принадлежащие к тропическо-низкобореальной биогеографической группе, характеризуются более высоким антиоксидантным потенциалом по сравнению с бореальными видами.

2. Впервые показано, что субтропическо-бореальные виды макроводорослей отличаются большей устойчивостью к фотоокислительному стрессу в яркие солнечные дни летних месяцев по сравнению с видами бореальной биогеографической группы.

3. Установлено, что снижение функциональной активности фотосинтетического аппарата макроводорослей умеренных широт при повышении температуры воды и уровня освещенности в середине солнечного дня летних месяцев связано с увеличением концентрации Н2О2 и накоплением продуктов перекисного окисления липидов в тканях растений.

4. Впервые показано, что устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях повышения температуры воды до максимальных значений в середине солнечного дня обеспечивается высоким уровнем активности антиоксидантных ферментов и накоплением низкомолекулярных антиоксидантов аскорбат-глутатионового цикла. Кратковременное повышение температуры воды ускоряет рециклирование низкомолекулярных антиоксидантов у тропическо-низкобореальных видов, и вызывает инактивацию супероксиддисмутазы и нарушение процессов регенерации аскорбата и глутатиона у видов бореальной группы.

5. Обнаружено, что одним из механизмов акклиматизации макроводорослей умеренных широт к понижению температуры воды до 5-10°С является накопление каротиноидов-антиоксидантов и повышение активности антиоксидантных ферментов в тканях макрофитов, что способствует устойчивости водорослей к окислительному стрессу и поддержанию ими стабильного уровня фотосинтетической продукции в холодное время года в условиях умеренной освещенности.

6. Экспериментально показано, что перестройки на уровне ферментативной АОС у водорослей при низких положительных температурах (5-10°С) не играют значительной роли в регуляции устойчивости видов к ФОС при дополнительной нагрузке света высокой интенсивности.

7. Установлено, что существенное снижение содержания каротиноидов и инактивация ключевых пероксид-детоксицирующих ферментов при длительном пребывании морских макрофитов умеренных широт в условиях высоких температур (выше 20°С для бореальных видов и выше 25°С для тропическо-низкобореальных видов) в летний период года повышают чувствительность водорослей к ФОС и тем самым понижают их устойчивость к последующему воздействию высокой освещенности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах:

1. Кравченко А.О, Белоциценко Е.С, Яковлева И.М, Барабанова А.О, Ермак И.М. Сезонные изменения содержания фотосинтетических пигментов у красной водоросли Ahnfeltiopsisflabelliformis Японского моря//Известия ТИНРО. 2011. Т. 166. С. 123-133.

2. Белоциценко Е.С, Яковлева И.М. Устойчивость к фотоокислительному стрессу морской красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis: влияние долговременной температурной акклимации // Естественные и технические науки. 2011. №4 (54). С. 191-196.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских и международных конференций:

3. Белоциценко Е.С, Набивайло Ю.В, Яковлева И.М. Дневная динамика окислительных процессов и активности антиоксидантных ферментов у морских красных водорослей Японского моря // Материалы ХП Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток: Изд-во ДВО РАН. 2009. С.7

4. Белоциценко Е.С, Акимова Л.А. Влияние температуры и высоких интенсивностей света на содержание фикобилинов у морских красных водорослей Ahnfeltiopsis flabeliformis и Chondrits pinnulatus II Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии. Материалы IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций ДВ России. Владивосток: Изд-во Дальневосточного ун-та. 2010. С. 11-13.

5. Белоциценко Е.С, Яковлева И.М. Устойчивость к фотоокислительному стрессу морских красных водорослей в течение дня // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва. 2010. С. 61-62.

6. Belotsitsenko E.S, Skriptsova A.V, Yakovleva I.M. Response of antioxidant system in tropical marine alga Ahnfeltiopsis flabelliformis to thermal stress // Proceedings of the 2nd Asia Pacific Coral Reef Symposium «Collaboration for Coral Reef Conservation in a Changing Climate». Phuket, Thailand. June 20-24,2010. P. 23.

7. Белоциценко Е.С, Яковлева И.М. Устойчивость к фотоокислительному стрессу морской красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis: влияние долговременной температурной предакклимации // Материалы международной конференции «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Н. Новгород. 2011. Ч. I. С.90-91.

8. Белоциценко Е.С. Влияние кратковременного термостресса на антиоксидантную систему стерильной и фертильной форм красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis II Материалы Всероссийской конференции «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптации гидробионгов». Изд-во ФГБУН ИБВВ. Борок. 2012. с. 43 -47.

Белоциценко Елена Сергеевна

Устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях флуктуации температуры

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 02.07.2015 г. Формат 60 х 84/16. Усл. печ. л. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0. Тираж 120 экз. Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: ntera_v@mail.ru