Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Амилолитические ферменты зерна риса и их регуляция

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Амилолитические ферменты зерна риса и их регуляция"

АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. М. А. Айтхожинй

На правах рукописи

Хакимжанов Айдар Атымтаевич

УДК 57?. :151. 04.2+581.19

АШЛОЛИГИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ЗЕРНА РИСА И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ 03.00. 04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени .кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1990

АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. 11 А. Айтхожина

На правах рукописи

Хакимканов Айдар Агымтаевич

УДК 577.151. 042+581.19

АШЛОЛИТИЧЕСКйЕ ФЕРМЕНТЫ ЗЕРНА РИСА И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ 0.3.00. 04\д биологическая химия

'• АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук ' д.» -г

Алма-Ата - 1990

Работа выполнена в лаборатории биохимии зерновых культур Института молекулярной биологии и биохимии им. Ы. А. Айтхожина Академии наук Казахской ССР.

Научные руководители: академик АН КазССР, доктор

биологических наук, профессор Г. Б. Дзрканбаев кандидат биологических наук О. В. Фурсов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. Т. Иваненко

кандидат биологических наук а А. Аликулов

Ведущая организация - Всесоюзный институт растениеводства БАСХНИЛ

Защита состоится " 2. " kOJ&JiJ* 1990 г. в Щ часов на заседании специализированного совета К 008.22.01 по защите диссертаций на соискние ученой степени кандидата биологических наук при Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина АН КазССР по адресу: 480012, Алма-Ата, ул. Мичурина, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АН КазССР ( г. Алма-Ата, ул. Шэвченко, 28 ).

Автореферат разослан

• Zt' UAiiXSj(¿1990 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,.

доктор биологических наук р. М. Кунаева

I

'ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологические и технологические показатели качества зерна в первую очередь определяются содержанием и соотношением а нем основных компонентов - запасных белков и углеводов, метаболизм которых в созревающем и прорастающем семени находится под контролем соответствующих . ферментных систем. В рисе содержание основного запасного полисахарида - крахмала достигает 802 от общей массы зерна (наивысший показатель среди злаковых). Степень активности ферментов амилолиза в процессе прорастания семени во многом определяет их биологическое качество, т. е. жизнеспособность. Без активной Л- амилазы зерно злаковых теряет способность к прорастанию ( ВНа^асИагуа, МапсН, 1985). Велика: роль амилаз в технологической переработке верна при хлебопечении, произвостве пива, спирта и т. д. Если для амилаз пшеницы и ячменя ' в литературе имеется большое количество сведений относительно их свойств, локализации, регуляции и, др., то рисовые амилазы в этом . плане изучены 'сравнительно мало. Б последние годы в серии работ японских авторов (Акагата, М1уаЬа, 1982; Акагаиа, Нага-ШЕМтигг, 1985; ШуаЬа, Акагауга, 1982; Шуз1а, Акагачга, 1983) показана регуляция синтеза ¿.-амилазы, некоторые аспекты постсштетической модификации и секреций. Практически отсутствуют данные по физико-химическим свойствам амилаз этой культуры, изоферментному составу, .- надмолекулярной регуляции, а также практическим вспрсеац тестирования определенных признаков семени с помощью этих фер-, ментов.

Даль и задачи исследования. Целмо иастояшэР работы яеилось очистка, разделение, изучение некоторых физнко- химических сьсйатй (к -амилазы зерна риса, исследование ее полиморфиама иа различных этапах онтогенеза семени, .-•гидролитические'- воздействие на гранулы крахмала, а таюе «¿ноторгю ы.-пекты надмолекулярной ре-

гулации <& и £ -амилаз. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить полиморфизм злектрофоретического спектра ферментов гидролиза крахмала зерна риса.

2. Получить высокоочищэнный препарат -амилазы и изучить свойства групп компонентов. '

3. Исследовать гидролитическую способность групп компонентов (I -амилазы по отношению к гранулам крахмала и растворимому субстрату, изучить регуляцию "связывания" фермента с гранулами.

4. Выявить латентные формы амилаз и определить возможные кути их шстивации.

5. Разработать биохимические способы диагностики посевного и технологического качества семени риса.

Научная новизна и практическая ценность. В работе установлена множественность форм <£-амилаз, показано формирование компонентного состава уже в период созревания семени. Выявлена и охарактеризована группа ферментов, по свойствам занимающая промежуточное положение между <А и £ -амилазами и, относящаяся к негликозилированной ¿¿-амилазе. Изучены некоторые свойства зрелых (гликозилированных) форм фермента, показаны особенности их гидролитического воздействия на гранулы.крахмала. Впервые для ¿'-амилазы, из данного источника установлена регуляция связывания с гранулами крахмала при взаимодействии с веществами углеводной природы. Показано, . что во взаимодействии этих, регуляторов и фермента принимают участие водородные связи и молекулы води Выявлена роль протеолитических ферментов в активации процесса гидролиза , крахмала па начальных этапах прорастания ес-меии. Разработана биохимические методы диагностики посев

ного и технологического качества зерна. Изучение уровня активности и . степени гетерогенности состава амилаз различных образцов зерна риса позволило разработать совместно с учеными почвоведами "Способ подготовки щелочных почв под посев риса". Для определения семенных кондиций - жизнеспособности зерна предложен быстрый й надежный тест-метод. На сделанные разработот получено 1 авторское свидетельство на изобретение и 1 полоииель-ное решение на выдачу авторского свидетельства

Апробация работы. Результаты.исследований представлены на 4 конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), на 10 конференции стран СЭ1Р "Минеральное питание зерновых культур, урожай и качество продукции" (Ташкент, 1987), на 4 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Вильнюс, 1988).

Публикации. Основные материалы диссертационной работы опубликованы в б статьях и 4 тезисах докладов, 1 статья находится в печати. Получено 1 авторское свидетельство й 1 положительное решение на предполагаемое изобретение. .

Обьем работы. Диссертация изложена на ílO страницах машинописного текста И состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка использованной литература Текст содержитZТрисунков и 3 таблицы. Список цитированной литературы включает публикаций, из ниx/-fi0m иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В экспериментах использовали покоящееся, созревающее и прорастающее вешо риса сорта Кубань 3 ( Oryza Sativa L.). Гекоти-пическую зависимость компонентного состава «{-амилазы изучали на семенах следующих сортов: Краснодарский 424, Прикубаисгай,

Дубовский 1R9, Родина, Авангард, Узбек 5, УзРос 59, Приманкч-ский, Казахстанский 3, а также разновидности глюгенозного риса.

<к -Амилазу из зерна риса выделяли 20 мМ раствором СаС1г и очищали осаддением гликогеном с последующей аффинной хромато- ,

V '

графией на Л-циклодекстрине, ковалентно связанным с зпокси-се-фарозой (Wagenaar, Lugtenborg, 1974).

Препаративное разделение фермента на группы изоферментсв осуществляли методом ионообменной хроматографии на , DEAE-ceфа-розе.

Протеолитические ферменты очищали разработанным наш методом аффинной хроматографии на оризенин-сефарозе.

Выделение и обнаружение гликопротеинов осуществляли аффинной хроматографией на конканквалин А-сефарозе и Шифф-йодным методом (Хефгман, 1986; Гааль и др. ,1982)

Электрофорез белков в ПААГ проводили в нативных условиях с использованием трис-глициновой буферной системы, рН-8,3 (Фурсов, Дарканбаев, 1979), а также в присутствии ДДС-Na по методу ЛЛэм-шш (Laemnüi, 1971).

Аналитическое изоэлектрофокусирование амилаз проводили в диапазоне pH 3,5-5 п использованием амфолинов фирмы LKB (Ригетти, 1986). ■ , '

; л ' ч v*

Крахмальные гранулн, получали методом тодуольной депротеи-низации (Boyer et al.",i976) 'и фракционировали в градиенте плотности глицерина (Channon, 1974).

Выделение и фракционирование эндоспермальных белковых тел осуществляли методом градиентного ультрацентрифугирования (Mitsuda et al., 1969).

Амилозу, амилопектин и "синие Числа" определяли общепринятыми методами (Рихтер и др., i960).

Амилааную и протеазную активность определяли стандартными и модифицированными методами (Гильманов' и др., 1981; Shannon, Wallace, 1979).

Концентрацию белка в растворе определяли по О. Лоури (Lowry et al. , 1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Я ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Компонентный состав амилаз зерна риса

Амилазы зерна риса в значительно меньшей степени изучены по сравнению с таковыми из других важнейших злаковых. В связи с этим первостепенной задачей явилось исследование гетерогенности электрофоретического спектра амилаз на различных этапах формирования и прорастания семени этой культуры. С целью идентификации ск- и fi -амилаз использовались следующие дифференцирующее факторы: 5М мочевина в ПААГ и 15 мин. прогрев препарата при- 70° С, подавляющие активность jfj-амилазы, а также ЭДТА-Na,, ннгибирую-щий oi-амилазу и спеифический субстрат для <к-амилазы -^-ограниченный декстрин. С помощью различных экстрагентоа и дифференцирующих факторов показано наличие в покоящемся зерне риса ферментов, отличающихся термо и мочевиностабильностью, т. е. обладающих свойствами d -амилазы и ЗИА-стайильных, что характерно для J-амилазы. Близкие исследования, но без качественной.характеристики природы компонентов проводилгсь в свое время на зерне риса и ячменя Р. Шинке с. соавторами (Shinke et al. , 1971,1972,1973,1978).

Установлено, что максимум активности и злектрофсреткческоа гетерогенности амилаз приходится на 5-е сутки прорапивания семян. В электрофоретическом спектре амилаз зерна риса,как и для ами-

- б -

лав пшеницы и кукурузы (курсов и др., 1987), четко идентифицируются три группы компонентов, условно обозначенных буквами А, В и С. В группах А и В содержится 5-6 компонентов с типичными свойствами ^-амилазы. Ферменты группы С обладали термо и ЭДТА-ста-бильностью, т. е. характеризовались свойствами как так- и £ -амилаз.

Проведено исследование компонентного состава амилаз созревающего зерна риса. Максимальная активность и степень электрофо-ретическсй гетерогенности наблюдалась в семенах молочно-восковой спелости. Установлено, что уже на стадии формирования происходит образование ферментов Есех трех групп (рис.1). Эта особенность отличает данную культуру от пшеницы и ячменя (Дарканбаев, Фурсов, 1082), у которых выявлены специфические для созревания и щюрасталия группы компонентов «4-амилазы.

Рис.1 Электрофоретичеекие спектры амилаз -сореващгго и прорастающего зерна риса. 1,2,3,4 - молочная, мо-

лочно-воскорая, воскоьая спелости и ирораежшщзе герло. А,Б, С - группы компонентов.

- 7 "

Сеойствэ рисовых амилаз

Основная масса исследований в этом направлении проводится на пшенице и ячмене. По амилазам зерна риса имеются лишь единичные сообщения. Для проведения исследований в этом плане наш прежде всего была отработана двухстадийная процедура очистки амилазы, включавшая прямое осаждение фермента гликогеном и аф-

Л -

финную хроматографию на ¿-циклодекстрин-сефарозе. По данным на-тивпого электрофореза(рис. 2) пик активности фермента, элюируемого

12

1 {Н!]а

Р

№1

16 го г« Номера реакции

Гнс. 2 Профиль элоции ¿-амилазы и белка с аффинного сорбента £А -циклодекстрин-сефарозы и электрофореграмма пика активности. _' Активность ¿(-амилазы, —'— белок фракций; а - инкубация гелей в растворимом крахмале, б - в $ -ограниченном декстрине.

с колонки избытком лиганда состоял из 9 компонентов, локалиэо-ванных в трех группах: А, В и С. Обработка гелей растворимым крахмалом и субстратом, спедафичным только для ¿-амилазы -^-ограниченным декстрином показали полную идентичности электрофоре-тических спектров.

Согласно данным, имеющимся в литературе синтезируемые молекулы (к-амилазы подвергаются постсинтетической модификации - гли-козилированию (Okyta et al, 1979; Akazawa, Miyata, 1982). В этой связи определенный интерес представляло выявление гликопротеинов среди различных компонентов <к-амилазы. На рис. 3,1 приведена картина аффинной хроматографии препарата cf-амилаЕЫ на конканавалин А -сефарозе. Ш данным нативного электрофореза с лектином 'связывались только изоферменты групп А и В. oi-Амилаза группы С не сорбировалась на колонке и давала отрицательную реакцию при обработке гелей после электрофореза с Шифф-реагентом. Следовательно изоферменты групп А и В являются зрелыми, гликозилированными формами «¿-амилазы, ферменты же группы С - их негликозилирован-ными предшественниками. Молекулярная масса гликозилированной формы <L -амилазы была равна 44 кД, а изоэлектрические точки ее компонентов распределялись в диапазоне pH 4,0-4,4 (рис.3,2). Негликозили-рованный фермент обладал молекулярной массой около 41 кД и изоточ-ками в интервале значений pH 4,6-4,8.

Иавестно, что Местом гормон- индуцируемого синтеза «¿-амилазы являются ткани вдгека и алейронового слоя ( Gibbons, 1979; Okainoto, Akazawa, 1980; McGregor et al., 1984; Mitsui, Akazawa. 1986), откуда фермент секретируется в эндоспермальную часть зерновки при прорастании. Методом электрофореза -амилазы, выделенной из различных частей прорастающего семени нами установлено наличие в эндосперме только изо$ерментов групп А и В. Фэрменты группы С обнаруживаются лишь в щитке и алейроновом слое, т.е. является несекреторными (внутриклеточными) формами <L-амилазы.

В работах японских авторов (Matsui et al., 1975, 1977) отмечалось наличие в зерне риса каких-то промежуточных по свойствам ферментов, являющихся по нашим данным негликозилированиой формой Л -амилагы. '

— и о

— 610

*<т ш

—• зо.о

щ и.о

Я

[ 5.0

В

13-5

а»

Л'- Фракций

Рис. 3 I. Профиль элюции (¿-амилазы на Соп-А-сефароэе и электрофоре граммы пиков активности. _Активность 4 -амилазы,

----содержание, белка; 1,2,3 - электрофорез фермента пиков активности, 4 - электрофорез тотального препарата •• амилазы (окраска геля Шфф-иодным методом). II. ДДС-На электрофорез и изоэдектрафокусирование ¿-амилазы, связываемой аффинным сорбентом.

Особенности гидролиза гранул крахмала -амилазой

Известно, что гранулы крахмала зерновых гетерогенны как по составу, так и по своим размерам (Козьмина, 1976). Отличительная особенность рисового крахмала - чрезвычайно малый размер гранул (от 2 до 10 мкм). В ступенчатом градиенте плотности глицерина они были рааделены на 3 фракции: размером от 2 до 4, от 4 до 8 и от 8 до 10 мкм. Процентное соотношение трех выделенных фракций по весу составило соответственно 9, 70 и 21%. . , : .

Установлено, что рисовый крахмал весьма: активно сорбирует

<А -амилазу. Связывание фермента в 4-5 раз эффективнее по сравнению с другими изученными злаковыми (Фурсов и др., 1990). Дня зерна данной культуры выявлена специфичность взаимодействия между А и В группами компонентов с£-амилазы и гранулами. Наиболее прочно связывались компоненты группы В и практически не экстрагировались буферным раствором из комплекса с субстратом. ¿-Амилаза группы С не связывалась с гранулами, что по-видимому обьясняется структурными особенностями молекулы фермента. Нами установлено, что, фракция мелких гранул гидролизовалась препаратом ¿.-амилазы вдвое эффективнее, чем фракция наиболее крупных (рис.4). Столь высокая аффинность при взаимодействии с субстратом и, как следствие , скорость гидролизуемости очевидно обьясняется малыми размерами гранул. При их небольшом размере увеличивается обшая доступная ферменту поверхность взаимодействия.

В ряде работ на зерне пшеницы отмечалось присутствие на поверхности гранул крахмала прочносвязанного белка, удаление которого папаином повышало их гидролизуемость ¿-амилазой ( Аникеева и др., 1982;.. БециоЫ, УатаЗа, 1989). Зти данные подтверждаются результатами, полученными на семени риса. Обработка гранул эндоген-ыи протеиназами приводила к 1,5-2- кратному увеличению скорости их гидролизуемости с{-амилазой.

Некоторые аспекты регуляции амилаа в зерне риса

Регуляция процэссов синтеза, постсинтетмэскэй модификации и секреции ¿-амилазы к настоящему времени.довольно хорошо изучена, надмолекулярная ж регуляция амилаз остается мало'исследованной. В понятие надмолекулярного уровня регуляции вкладываются процессы ЕзалыодеПстгия ашлаз с мембранными структурами разданных анато-

(рем) имкукцын (vac)

Рис. 4 Гидролизуемость различных фракций гранул крахмала из зерна риса препаратом <к-амилазы. 1-мелкие гранулы (2-4 мкм), 2-средние (4-8 мкм), крупные (8-Ю мкм), 4-обший препарат гранул.

мических частей зерновки (мембранные структуры щитка, алейронового слоя и эндосперма), а таю® их взаимодействие с ингибиторами белковой и небелковой природы. Дж. Кругер (Kruger, 1976) первым высказал мысль о том, что увеличение активности ферментов амило-лиза при прорастании семян происходит двумя путями. Первый заключается в простом реактивировании зимогенных форм, синтезированных при созревании. Второй путь - синтез амилаз de novo.

Активация латентных форм амыаз fi -типа возможна в присутствии папаина,детергента тритона X-1Q0 и SH-агеитов (Daussant et al.. 1969). В дальнейшем был выполнен цикл работ Р. Шинке с соавторами (Sbinke et al., 1971-1973), в котором показано существование в верне злаковых, в том числе и риса, специфической формы _0 -амилазы, активируемой палашом. Авторы предположили участие эндогенна s-s- редуктаз в процессе трансформации зимограшнщ нзо-форм в активный тип.

Конкретными местамч локализации латентных форм амилаз в эндосперме являются белковые тела и поверхность гранул крахмала

(Gry, Bennigsen, 1969; Okamoto, Akazawa. 1979; La Berge, Marchy-lo, 1986; Nichimura et al., 1987).

Эндоспермальные белковые тела представляют собой плотно упакованные запасным белком образования, тесно контактирующие с гранулами крахмала и, по-видимому, включают в себя комплекс ^латентных форм гидролитических ферментов.

По данным световой микроскопии размеры белковых тел, выделенных нами из зрелого верна риса не превышали 1-2 мкм. Методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы от 1,15 до 1,35 г/см3получены три фракции белковых тел. По данным рефрактометрии они локализовались в зонах с градиентом плотности сахарозы 1,19; 1.23 и 1,27 г/см? .

' В качестве активаторов латентных форм амилаз были использованы тритон Х-100, ультразвук, папайн, а также протеазц из прорастающего зерна риса Протеолитические ферменты экстрагировали 50 мМ ацетатным буфером, pH 5,0, содержащим 5 мЫ 2-ШТ и 5 мЫ ЭДГА-Naj. Белок осаждали сульфатом аммония в диапазоне 30-70% насыщения. Очистку осуществляли разработанным нами методом аффинной * ■ ■ ■

хроматографии с использованием запасного белка семени риса (ори-аинина) в качестве лиганда. Полученный препарат протеаз по данным ДДС-Na электрофореза давал две белковые полосы с молекулярны-ш массаш, близкими к 35 и 92 кД и не содержал ашлазной активности (рис. 5).

Протеодиз белковых тел эндогенными : протеиназами приводил к значительной активации амилаз, высвобождаемых из комплекса с. этики структурами. По мере увеличения продолжительности инкубации белковых тел с препаратом протеолитчческих ферментов ( от 2 до 1S час.) "свободная" ашзшаая. активность возрастала более чем' в 7 раз (рис.6) пи сравнению с коятгюдем . (инкубация белковых тел в

5 20 35 50 ' <5 80

Одьем, ил

Рис.5 Аффинная хроматография протеаз зерна риса на оризенин-сефарозе (А) и . ДЦС-На - электрофорез пика активности фермента (Б). __ активность протеазы, -----содержание белка.

2 Ь 8 16

Время инкубации, ч.

Рис. 6 Действие эндогенной протеиназы на препарат белковых тел. I - диаграмма изменения активности высвобождаемой амилазы. II - электрофореграммы реактивированных амилаз. . а - Эле&рсфоретический спектр амилаз прорастающего зерна.

Зуферном растворе). Использование дифференцирующих факторов при электрофорезе реактивированных амилаз С 5М мочевина и В -ограни-

чениый декстрин) позволило выявить ь группе компонентов А - <к и ß -амилазу, в группе В - ¿-амилазу.

Процесс активирования латентных форм амилаз наблюдался и при инкубации препарата белковых тел с папаином, тритоном Х-100, а также в результате ультразвугавой обработки. Эффективность воздействия протеиназы оказалась в 1,5-2 раза выше по сравнению с действием детергента и ультразвука.

Данные проведенного исследования позволяют предположить существование в семени специфического, не изученного ранее пути активации гидролиза запасного полисахарида Посредством реакций ограниченного протеолиза происходит образование (реактивирование) активных форм ашлаз из неактивных. Вероятно этот механизм активирования имеет определенное физиологическое значение на самых ранних этапах прорастания семени (от 6 до 24 час.), когда de novo синтез ¿-амилазы, контролируемый гормонами еще довольно слаб.

В последнее время для ¿-амилаз пшеницы и тритикале установлено существование в структуре фермента центра регуляции, отличного от активного центра (Weselake, Hill, 1982, 1984). Испрль-зуя циклодекстрины и олигосахариды, авторы пришли к выводу, что ингибирование этого центра приводит к подавлению связывания фермента с гранулами крахмала. На основании сказанного они назвали этот регуляторный центр - центром "связывания", или дополни-тельнительным центром. Отличие центра "связывания" от каталитического определяется тем, что при заингибированном регуляторном центре активность фермента по отношению к субстрату - . растворимому крахмалу остается на уровне контроля. Для ¿-амилазы семени риса нами впервые показана возможность регуляции через этот центр. При атом установлено, что если для ¿-амилазы зерна пшеницы возможно достилекие практически полного подавления (на 100%) связывания

ферь.ента с гранулами крахмала, то для -амилазы Берна риса эта величина достигает лишь 60%. Мы объясняем это присутствием в общем препарате амилаз риса группы негликозилированных ферментов. Сдельные ингибиторы связывания - циклодекстрины не влияли на взаимодействие этих ферментов с гранулами крахмала. Кроме того установлено, что & и ^ -циклодекстрины в разной степени ингибировали связывание «^-амилаз с гранулами. ¿¿-Циклодекстрин обладал большей ингибирукщей способностью и взаимодействовал с.ферментом прочнее, чем ^ -циклодекстрин (рис. 7). По-видимому, это объясняется

Рис. 7 Ингибирующее действие циклодекстринов на сС-амилазный гидролиз. — -•- Циклодекстрин, ^ - циклодекстрин.

тем, что молекула ^?-цшслодекетрина в своем составе имеет на один глюкозный остаток больше, чем о£-циклодекстрин. Следовательно размер центра "свяшвания" наибольшим образом стерически соответствует взаимодействию с ^-циклодекстркном. Методом электрофореза изучено влияние циклодекстринов на связывание с гранулами крахмала различных групп компонентов с{-амилазы. Показано, что паиболее прочно взаимодействующей с гранулами является с£-амилаза группы Е

Зга компоненты не удавалось извлечь даже после 24-часовой инкубации в буфере при 30°С. Прединкубация d -амилазы с циклодекстрином способствовала полному извлечению фермента при простом размешивании гранул в буферном растворе в течении 5 мин. на холоду. Этот факт указывает на потерю специфичности взаимодействия между ферментом с заингибированным центром "связывания"' и субстратом.

Изучено влияние разобщителей водородных связей (мочевины, гуанидинхлорида, хаотропного агента роданида калия и дегидратирующего соединения сульфата аммония) на взаимодействие циклодекстри-нов с cí-амилазой. Показано, что для комплекса ¿¿-амилаза- Л -цшыодекстрин максимальным эффектом разобщения обладал роданид калия (78Z), сульфат аммония разобщал на 72Х, а мочевина и гуанидинхлорид - на 50%. Таким образом в организации комплекса eí-амилаза-ингибитор "связывания" принимают участие водородные связи и молекулы воды. Можно предположить, что либо продукты Гидролиза, либо какие-то вещества углеводной природы, имеющиеся в зерне способны участвовать в регуляции взаимодействия -амилазы с гранулами крахмала. Следует отметить, что такого рода регуляция выявлена не только для зерновой cí-амилазы. Имеются глубокие кинетические исследования регуляции бактериальной глюкоаммлазы через дополнительный центр(Сергеев, Фирсов, .1385; Савельев и др., 1987; Бегпро-звааннй и др. ,1987). Эт..,ел авторами установлено, чао, как и для с£-амнлаз, для глюкоамилаз из одного источника характерно-различная чувствительность к действию циклодекстринов. Эти ингибиторы не влияли на активный центр фермента.

.¿»-Амилаза, как маркер генотипа и показатель качества зерна

Ib литературных ксточнююв известно, что компоненты cÉ-atis-

лазы зерна злаковых имеет изоферментную природу ( Nagayoshi, 1978, Molntoch, 1985). Исследованием электрофоретических спектров амилазы образцов зерна пшеницы различной плоидности выявлено до 17 изоферментов (Зурсов и др., 1978). Имеются также сведения по обнаружению изоэнзимов ¿-амилаза из зерна кукурузы, являющихся маркера!® генотипа (Chao, Scandal ios, 1971). Нами изучалась сортовая специфичность ¿-амилазы прорастающего зерна риса. Методом электрофореза показано, что анодные компоненты (группа А) были общими для всех исследованных образцов и состояли из 2-3 изоферментов. Различия главным' образом обнаруживались среди компонентов группы В (от 1 до4) И группы С (от 0 доП). как было отмечено выше, компоненты группы С являются негликозилировачной формой .¿-амилазы (предшественник), в .связи .с че'м использование их в изоферментном анализе проблематично.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о зависимости электрофоретического спектра ¿-амилазы от генотипа. Это позволяет использовать отдельные группы изоферментов ¿-амилазы из зерна риса в качестве маркеров определенных признаков.

Ранее з литературе имелось сообщение (Прудникова и др., 1987) о связи активности и множественности форм амилаз в зерновках риса с жизнеспособностью. В наших исследованиях, проведенных на рисе, выращенном на различных типах почв с внесением мелиоративных добавок показано наличие связи между биологическим качество!-; семян (жизнеспособность), степенью электрофоретической гетерогенности амилаз, их активностью и условиями выра'дивания. Выявлено отрицательное воздействие отдельно взятых солей цинка на активность и компонентный состав амилаз. В то жо время показано положительное влияние на эти показатели совместного внесения в почву под рис солей цинка и органических добавок. Установлена взаимосвязь между

вносимыми добавками и показателями технологического качества полу-ченниого 8ерна - содержание крахмала и амилозы (таблица). •

Данные, приведенные в таблице иллюстрируют взаимосвязь уровня амилазной активности с технологическими характеристиками семени риса. Следует отметить негативное воздействие солей цинка на оба

. IV

показателя. На основании полученных экспериментальных данных нами совместно с учеными-почвоведами предложены практические разработки: "Способ подготовки щелочных почь под посев риса" и "Способ определения жизнеспособности семян злаковых".

Содержание крахмала, амилозы и «¿-амилазная активность верна при выращивании риса на мелиорируемой такыровидяой почве

Таблица

Опыт I Крахмал,% к1 Амилоза, I "Синие I Ж-Амилазная актив-1 I масйе сух.-1 % I числа"! ность на Б-е сутки!

I вещ-ва

I проращивания I

I Солома + ЫКБ 12п(ЮД Юолома^пОЮд^ ! Компост

I Контроль I Солома

83 79

84 84

82

81

27 0,65

24 0,62

27 0,70

21 0,50

26 0,63

27 0,65

123 76 103 129

90

100

- 1а -

ВЫВОДЫ

1. Изучена электрофоретическая гетерогенность амилаз созревающего, покоящегося и прорастающего зерна риса. Показано,, что в семени риса полное качественное формирование изоферментного спектра ¿-амилазы происходит в процессе созревания. Эдектрофоре-тический спектр этого фермента представлен тремя группами компонентов, условно обозначенных А, В и С.

2. Установлено, что группы компонентов А и В относятся к ис-тиньой ¿{-амилазе. Компоненты группы С обладают свойствами, промежуточными между характерными для истинных и ^-амилаз и являются негликозилированными предшественниками зрелой, формы ^-амилазы. Шлекулярные массы гликозилированной и негликозилированной форм фермента составляют 44 и 41 кЛ,. а изоэлектрические точки - от 4,0 до 4,4 и от 4,6 до 4,8 соответственно.

3. Изучена гидролитическая способность различных групп шгилазы по отношению к гранулам .крахмала. Показано, что только компоненты групп А и В связывались с гранулами крахмала и гидроди-зовали их. Компоненты группы С обладали нормальной гидродизущей способностью лишь по отношению к растворимому крахмалу.

4. Установлена локализация латентных, форм амилаз на белковых телах зерновки риса. Выявлена специфичность действия эндогенных протеиназ, что указывает на преимущественно данный путь активирования связаных форм амилаз в семени. .

5. Впервые для ^-амилазы' из зерна риса установлена регуляция через центр "связывания". Образование комплекса фермента с веществами углеводной природы типа циклодекстринов блокирует его связывание с гранулами и их гидролиз, но не препятствует гидролизу

растворимого крахмала. В образовании комплекса of-амилаза-цикло-декстрин принимают участие водородные связи и молекулы воды.

6. Показана зависимость активное" ¡' и электрофоретической гетерогенности амилаз, содержания крахмала и амилазы в зерне от типов почвы и, вносимых в нее добавок при посеве риса. На основании этого разработан биохимический метод определения посевного качества семян и способ подготовки щелочных дочв под посев риса

СПИСОК ПУБЛИКАДШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зурсов 0. В., Хакимжанов A.A., Дарканбаев Т. Б. Амилолиги-ческие ферменты зерна риса // Физиол. и бяохим. культура, рас т. -|385. -Т. 17. -N5. -С. 486-492.

2. Хакямжанов A.A., Каракеева Р. К., КузовлевйА. Крахмалги-дралазц белковых тел верна злаковых // Тез.г докл. 4 Конф. биохкы. ресд. Ср. Азии и Казахстана - Ашхабад.-1986.-С. 312.

3 . Фурсов О. Е , Хзйдарова Ж. С., Аникеева Л. А., Хакимжз-нов А. А.. Дарканбаев Т. Б. Свойства и особенности индивидуальных изоферментов d -амилазы зерна злаковых // 5 Всес. биохим. сьезд: Тез. докл. - М. : Наука, 1986.-Т. 2.-0.67.

4. Хакикоанса А. А. Крахмаядеградирующие ферменты зерна риса // Ферменты и качес тво зерна: Сб. науч. тр. - Алма-Ата: Наука, 1937.-С. 80-97.

5. курсов О. В., Нелидов С. Н., Хагамжанов A. A. Минеральное питание и качество зерна риса на мелиорируемых щелочних почвах // •Минеральное, питание эериомг:. культур, урожай и качество продукции: Теь. докл. Ю конф. стран C3R - Ташкент, 1987, -С. 16-17.

6.. Хакимжанов А, А.,' $урсов O. S. .Ингибирование öl-амилазы вер-m р;гц эдклрдекотрином // ' Физиол." ' и биохим." ■ кудьтурн. ' раст. -

1988. -Т. 20. -М2. -С. 157-162.

7. Фурсов О. В., . Аникеева Л А., Кузовлев В. А., Хакимжа- , нов А. А.," Каракесва Р. К. Механизмы регуляции гидролиза гранул крахмала зерна злаковых // Инженерная энзимология: Матер, б Всес. симп. Ч. П.-Вильнюс, 1988.-С. 146.

8. Фурсов О. В, Нелидов С. 11, Хакюстэнов А. А. Продуктивность риса-и качество зерна на мелиорируемых щелочных почвах // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1989.-N3.-0.380-394.

9. Фурсов О. В., Аникеева Л. А., Кузовлев В. А., Хакимжанов А. А., Хайдарова К. С. Особенности ферментативного гидролиза крахмальных гранул верна злаковых // Лрикл. бШхим. и микробгал. - 1990. - Т. 26. Вып. 5 -С. 371-378.

10. Фурсов 0. Е , Хакимжанов Л. А. Протеолитическая активация гидролиза гранул крахмала в зерне риса // Фмэиол. раст.(в печати).

11. Способ подготовки щелочных почв под посев риса: А. с. 1293192 СССР, МКИ С 09 К 17/00 / С. Н. Нелидов. О. Е Зурсов, Л. Л. Ха-кимтанов, Т.Б.Дарканбаев /СССР/.- 2С.

12. Способ определения качества семян злаковых: Полок, решение на выдачу а. с. N 4409921/3018 // О. Е фурсов, ■ С. Н. Нелидов, А. Л. Хакимжанов, Е А. Кузовлев, ЕЕ Валов.