Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОСТАВ ЗЕРНА ОЗИМОЙ РЖИ И ЯЧМЕНЯ И АКТИВНОСТЬ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СОСТАВ ЗЕРНА ОЗИМОЙ РЖИ И ЯЧМЕНЯ И АКТИВНОСТЬ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А, ТИМИРЯЗЕВА

^^ — ^ На правах рукописи

Лидия Васильевна ЛАЗАРЕВА

СОСТАВ ЗЕРНА ОЗИМОЙ РЖИ И ЯЧМЕНЯ

И АКТИВНОСТЬ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

(Специальность № 03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1973

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологической химии Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор Б. П. Плешков.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки доктор биологических наук профессор 3. И. Журбицкий, доктор биологических наук В. Ф. Голенков.

Ведущее учреждение — Всесоюзный институт удобрений и агропочвоведения им. Д. Н. Поянпшникова.

Автореферат разослан «'. » ^^^^^^ . . 1975 г.

Защита состоится в « час. «

1975 г. на заседании Ученого совета факультета агрохимии и почвоведения ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА (10-й корпус).

Просим Вас принять личное участие в работе указанного Совета или прислать письменный отзыв по данному автореферату по адресу: 125008, Москва А-8, Тимирязевская ул., 49, Ученый совет ТСХА,

Замечания и отзывы по данной работе, подписанные и заверенные печатью, просьба направлять в двух экземплярах.

Ученый секретарь Совета академии

доцент Ф. А. Девочкин

ВВЕДЕНИЕ

Проблема белка — одна из основных, проблем современной биологической науки. Увеличение производства белка и повышение-его качества будет способствовать дальнейшемуулуч-шеиию питания населения и повышению продуктивности животноводства, поэтому необходимость более глубокой экспериментальной и теоретической разработки этой проблемы очевидна.

Основные источники растительных белков —зерновые злаковые культуры, поэтому в последнее время большое внимание уделяется изучению белков именно этих культур. Известно, что белки выполняют роль не только запасных веществ, но и обладают различными: функциональными свойствами. К функциональным свойствам белков относится их фермента; тнвная активность. Ферментативно активные белки в зерне злаков сосредоточены в. основном в водо- и солерастворимой белковых фракциях. Одной из основных групп ферментов, на-ходящихсяв семени, являются гидролитические ферменты. Среди них важное значение имеют ферменты, обладающие амилолитической активностью:.

Амилазы очень широко распространены врастениях, и как ферменты зерна злаков, представляют интерес в связи с широким использованием их свойств в хлебопечении, при изготовлении пива и кондитерских изделий, а также в оценке качества зерна и муки, ¿'настоящее время установлено, что хлебопекарные свойства муки определяются двумя главнейшими показателями: ее газоудерживающей и_ газообразующей способностями. Последняя как раз и определяется активностью ферментов амилазного комплекса и участием крахмала (Шлавицкая 3. И„ 1959). Исключительно важно значение амилаз для самого зерна как семени.(Известно, что одним из условий для поддержания жизнедеятельности клеток и их роста является наличие источников энергии. В начальный период прорастания семян важнейшим источником энергии для протекания реакций служит окислительный распад углеводов, и основным путем снабжения растительных клеток низкомолекулярными сахарами является гидролиз крахмала амилазами. Крупные советские и зарубежные биохимики уде; I.

с/Г- ¿$о?ь

ляли много внимания исследованию амилаз, в результате чего динамика изменения активности амилолитических ферментов при созревании и прорастании зерна изучена сравнительно полно. В многочисленных работах показано, что прорастание зерна характеризуется прежде всего увеличением актнвностн всего ферментативного аппарата зерновки, при созревании же все ферментативные процессы постепенно затухают (Бах. А. Н., Опарин А. И,, Венер Р. А., 1926; Опарин А. И. с сотр., 1928, 1945; Проскуряков-Н. И. с сотр., 1933, 1941, 1948, 1955, 1962; Дарканбаев'Т. Б. с сотр., 1955; 1967; Rohrlich М„ Hitze W„ i969; Bilderback D„ 1971 и др.).

Активность ферментов может существенно изменяться^ зависимости от многих факторов. Одним из основных, факторов являются условия, питания, растений. Однако вопрос о влиянии удобрений на активность амилолитических ферментов очень, слабо изучен, а . имеющиеся сведения противоречивы.

Учитывая важнейшую роль, ферментов амилазного комплекса и недостаточную изученность влияния удобрений на активность амилаз, целью нашей работы было изучение'влияния.условий питания на химический состав зерна ржи и-ячменя .и .активность амилолитических ферментов при созревании и .прорастании зерна." В задачу исследований входило; изучение водорастворимых белков.зерна.ржи и ячменя.как наиболее сложных с точки зрения их. свойств и биологических особенностей, их поведение в процессе, гель-фильтрации, изучение компонентного состава белков данной фракции, их ами-лолитической.активности, а также молекулярного веса- ферме нтови их изофермеитного состава, _

Объекты » методы исследований

В качестве объекта исследований были взяты семена озимой ржи сорта Гибридная 2 и ячменя сорта Московский 121. Изучение процессов, происходящих в зерне ржи при созревании, проводилось на базе старейшего в стране длительного опыта, заложенного по схеме Д. Н. Прянишникова в 1912 г. на территории Полевой опытной станции ТСХА. Пробы зерна отбирались в течение всего периода созревания со следую* щих вариантов; I — Nioo, 2 — Piso, 3 — Kiso. 4—NiooPiso, 5 — NiooKtío: 6 — Pi5oKiio, 7 — NjooPi5oKj2o, 8 — без удобрений. Опыт с ячменем был заложен в учхозе «Михаил овское» (Московская обл., Подольский р-он). Схемой данного опыта было предусмотрено изучение влияние азотного питания растении на активность .-амилолитических ферментов. Схема опыта включала три варианта: I—Р«оКео, 2 — N60PeaKeo, 3 — NiaoPeoKeo. Для изучения-процессов, происходящих при. про-2

растании зерна, семена ржи и ячменя проращивали в течение 1, 3, 5, 7 и 9 суток в чашках Петри на питательной смеси Гель-ригеля в следующих вариантах: 1—вода, 2— смесь Гельри-геля, 3 — смесь без азота; 4 — смесь с внесением двойной дозы азота, 5 —смесь без фосфора,,6.— смесь с внесением двойной дозы фосфора,

В основу определения активности амилаз был положен метод Смита и Роя (Smith В; W.~, Roe J. Н., 1949) с некоторы-, ми изменениями применительно к растительным белкам (Сокольская Т. И.,.1970), Активность а-амилазы определяли после выдерживания.ферментного раствора в присутствии уксуснокислого кальция при 70° в течение 15 мин. (Frydenberg О., Nielsen G., 1965). Для гель-фильтрации белков применяли колонки размером: 1,8X90 см; В исследованиях использовали сефадекс марки G—150„ элюирующим раствором служил 0.5М NaCl в 0,005М фосфатном буфере (pH — 7,4). Скорость . злюции составляла 35 мл/час. Для изучения состава водорастворимых белков применяли метод дискового вертикального электрофореза в поликриламидном геле (Raymond S., Wein-traub L,., 1959; Davis В. J.. 1962). При работе использовали методику, несколько измененную другими авторами . (Сафонов В. И., Сафонова М. П., 1969). Разделение проводилось как в щелочных, так и-в кислых буферных системах (Reis-4 feld, 1962), Для анализа использовали стеклянные трубки* размером 0,5Х7,0:см. Гели фиксировали в течение 30 мин. в 7%-ном растворе трихлоруксусной ■ кислоты. Окрашивание-производили 1%-ным раствором амидо черного: Обнаружение зон белков, обладающих амилазной активностью, проводили с помощью йод-крахмальной пробы (Лукашевич И. В., 1974). Содержание белкового азота* определяли по методу Барн-штейна (Петербургский А, В;,* 1968), крахмала — по Починку (Починок X. И., 1959) сахара — по Бертрану (Петербургский А. В;, 1968)-. • ■

. Изменение биохимических свойств зерна ржи и ячменя в процессе созревания при различных условиях питания растений

Изучение4 активности амилаз в процессе созревания зерна показало, что активность ферментов заметно уменьшается-(табл.. 1). Уменьшение суммарной активности амилаз в зерне ржи различных вариантов в процессе созревания произошло в 4—5 раз. Снижение активности а-амилазы от молоч-' ной до полной спелости носит более резкий характер. При" выращивании растений на фоне калия активность а-амилазы снизилась в 27 раз, на фоне азота; фосфора и без удобрений— в 10 раз, а в варианте с фосфорно-калийными удобрениями к

г

* Та блица. I

Влияние удобренийна амилазную активность-семян ржи при созревании , ,'■) .(мг гидролизуемого крахмала из I мг белка)

,'.,! И Суммарная активность амилаз ЛКТИВИОСТЬ Г1-аМ!].133Ы

Варианты ..... ; • .] 1 ;1; I 16/У11 & 25/VI • > £ 3 23,'VII

к" -•:.; 50,0 34,3' '25,4 15,2 9,0. 20,0. 6.8 ■3,7 1,9 2.1

47,0: > 27,7 .21,5 15,2 ■ 8,5 17,0 5^9 1,8 1,1 1.7

к' » "46,7' 25,3 '21,2 11.0 83 16,3 5,3 2,2 1,0 0.6

-•"Р.. . 55,Э 42,2 , 23,0 24,6, 11.9 ,17,8 6,1 2.1- 1.5 3,1

59.2 36,4 23.0: 17.8 ■ 9,6 13,7 6,2 1,5 1,0 1Д'

45,3 29,3 22.9' 15.1 9.7 1Й.2 5.6 1,7 0 0

____ :62,3 • 36.7 22,9 16,6 14,7. 18,6 5,9 2.0 1,5* 2,9'

Без' удобре-ийй- " 44,5 28.2 '21,1 8.6' 11,0" 18.3 5,е 1.6 0 1,9

моментууборки урожая а-амилаза практически не проявляла свою -активность. Следует отметить, что в вариантах с внесение^' азотных удобрений активность ферментов была - несколько выше, чем без их внесения; Независимо от вносимых удобрений;' максимум' амилазиой активности наблюдался в фазу ранней молочной спелости.

1В'о(все фазы созревания зерна ячменя активность амилаз также была выше в вариантах с азотными удобрениями (рис.' :1)..*, Максимальные величины как суммарной, так и а-а'милазной активности, наблюдались в зерне растений, выращенных в варианте с внесением 120 кг/га азота.Таким образом, азотные удобрения -способствовали получению зерна с повышенной активностью амилолитических ферментов.

Сопоставляя активность ферментов с содержанием белка в зерне, можно отметить," что в тех вариантах опытов, в которых наблюдаётся повышенное содержание белка, отмечается и более высокая активность амилолитических ферментов (табл. 2 и 3).

, Очевидно," между содержанием белка в зерне и активностью 'амилаз имеется положительная коррелятивная связь. Проявление такой связи более резко выражено в вариантах с внесением азотных удобрений..

,*, По'мере созревания зерна ржи и ячменя происходило значительное увеличение количества крахмала (более чем в 2 раза в относительном выражении и более чем в 6 раз в абсолют-"4 ' ' '

Табдииа 2

Содержание Сел косого азота & зерне ржи в процессе созревания

Варианты 25,'VI ЗА'И 9А'И 16/УП 23/УИ

N...... . 1.61 1.70 1.79 1,82 1.95

170 ЗМ 471 КЗ 627

Р......' . . . . 1.50 1.ГЛ 1.£в 1.83

юэ 260 476 £35 620

к.......... 1.5* 1.Г.1 1.70 1.75 1.83

271 4СЗ 545 618

N1» .......... 1,С8 1.7«* 1.РО 1.97 2.03

113 283 435 581 . 654

кк...... . 1.75 1.77 1.92 1.99 2.06

К5 276 Ф15 582 баз

РК......... 1.23 1.62 1.77 1.82 1.85

181 3(3 4Ъ9 №4 619

ХРК........ 1.72 1.83 1.95 2.07 2,16

¡68 ¿эг 318 667 733

Без улобрений , . . . 1.55 1,64 1.76 1 ЯЗ 1.89

295 433 5С0 60в

Числитель — азот в % «а с\'хог вещество. Знаменатель — в мг на 1000 семян

ТаблицаЗ

Содержание белкового азота в зерне пчменя в процессе созревания

Варнзсты 18ЛЧ1 £5 .'VII 1/У1П 9ЛПН 16/УНГ

1,66 1.75 1,82 1.85 1.83-

41: ■ «51 747 «И 637

1.70 1,78 1.90 1,92 1,89

378 647 769 733 649

■ 1.74 1.Б2 1.94 '1.96 1.92'

343 &42 73& 678 667

Чкслитсль — азот в ГЛ на сухое вещество. Знаменатель — в мг на 1000 семян.

ном). Начиная от фазы ранней молочной и до конца восковой спелости, наблюдалось наиболее интенсивное накопление крахмала, а в дальнейшем накопление происходило

Медленнее (табл. 4, 5), Содержание крахмала в зерне ржи достигло максимума к моменту уборки урожая, а в зерне ячменя несколько снизилось. Удобрения оказали незначительное влияние на содержание крахмала: в зерне ржи макси-

Таблица 4 Содержание крахмала в зерне ржи лри созревании

Варианты 25/У1 З/УИ 9/УН ш/уп 23ЛШ

N . 25.3 40.7 53.1 ВД.2 62,1

27 84 144 184 199

Р . 2Э.& 43,4 57,3 60,3 63,8

30 80 162 194 216

К . 30,7 42.6 56.8 60.0 64,3

26 72 153 187 200

КР 26.8 41,5 66.1 59,8 62.5

20 70 176 201

ык 27.0 41,9 56,7 60,4 62.3

26 65 122 11-76 197

РК 29.7 ' 42.3 57,3 62.7 64,7

35 90 158 208 216

МРК 28,1 41.& 57,8 62,0 63.5

23 91 153 199 215

Без удобрений . . . . 31.7 42.7 57.0 64,5 66,4

28' 79 146 197 213

Числитель — крахмал в % на сухое вещество. Знаменатель — в г на 100 семян.

Таблица 5 Содержание крахмала в зерне ячменя лри созревании

Варианты 18/VII 25/УН | 1/УШ 9/УШ 16^111

21,7 37,4 45.2 55.6 54.1'

54 139 186 210 188

Г^воРвсКва...... 20.0 36,1 43.8 54.9 53.2

45 131 ГО '¿\ 1' да

М Г> 1* 18.4 32,1 42.7 53.3 52.6

37 96 102 185 183

Числитель — крахмал в % на сухое вещество. Знаменатель — в*г на 100 семян,

мальное количество наблюдалось на контрольном варианте (66,4%), минимальное — на фоне азота и его парных комбинаций с фосфорными и калийными удобрениями.

В опыте с ячменем получена примерно такая же закономерность: на фоне фосфорно-калнйных удобрений наблюдалось наибольшее содержание крахмала (54,1%), азотные удобрения вызывали некоторое снижение содержаний крахмала в зерне.

В процессе созревания зерна ржи и ячменя происходило снижение как суммы Сахаров, так н их редуцирующих форм. В зерне ржи суммарное количество Сахаров к моменту уборки урожая уменьшилось почти в 2 раза, в зерне ячменя — более чем в 3 раза. Наибольшее содержание Сахаров' было отмечено на неудобренном фоне.

Изменение биохимических свойств зерна ржи и ячменя в процессе прорастания при-различных условиях.питания1 проростков

Изучение активности амилолитических ферментов в процессе прорастания показало, что их активность резко возрастает. Так уже через одни сутки после начала прорастания зерна ржи суммарная активность амилаз возросла в 3—4 раза по сравнению с активностью в сухом зерне, а у ячменя — в 3 раза (табл. и). На третьи сутки прорастания увеличение амилазиой активности происходило более интенсивно: в зерне ржи в 7—12 раз, в зерне ячменя — в 10—15 раз по сравнению с сухим зерном. По мере дальнейшего прорастания активность ферментов возрастала в еще большей степени н достигала максимума на 7-е сутки. После трех суток про-растання начинало проявляться действие условий питания на активность амилолитических ферментов. При внесении удобрений в период прорастания ферменты проявляли более высокую активность по сравнению с контролем, за исключением варианта с внесением двойной дозы фосфора в Некоторые сроки прорастания зерна ржи, где активность ферментов была примерно одинаковой с активностью на контроле, а иногда даже несколько ниже (через 7 суток после начала прорастания).

В зерне ячменя по всем удобренным фонам наблюдались более высокие величины активности по сравнению с активностью амилаз в зерне, прорастающем на воде. Необходимо отметить-также влияние ззотного питания на активность амилолитических ферментов. Нами показано, что во всех вариантах с внесением азота (смесь Гельригеля, смесь с 2М, смесь без Р) активность ферментов была выше по сравнению с другими вариантами,

* Таблица 6

Влияние условий литания наамидазную активность семян ржи и ячменя при прорастаниимг гидролиз у е «ого крахмала на 1 иг белка)

Суммарная активность амилаз Активность п-амнлаэы

Варианты - £ о & о £ ч 7 сут. ь-' О) V 3 сут. 5 сут. & к о>

• Вода 125" 281 327 488 234 19 160 272 335 С69

100 392 049 944 216 ■12 13? 297 754 174

Смеси Гельригеля 163= 340 408 578 459 30 255 371 550 370

ПО 518- 786 азе 21 192 380 91й 308

Смесь без N [38 325 340 КЗ 39 176 289 320 215

>110 532 702 1024 293 12 172 474 аа} 216

Смесь с 2 N 180 •428 45Г, гт 498 6+ 245 403 5,12 490

М8 ■601 830 1697 19 209 011} 1260 346

Смесь без Р 101 372 404 Ш 451 Зй 224 381 423 406

105 580 ТОО 13« ЗУб 18 193 417 1032 292

Смесь с 2 Р 120 Э17 342 433 315 21 216 303 398 291

107 476 №3 935 235 14 171 390 да 219

Числитель — рожь. Знаменатель — ячмень.

Аналогичная закономерность изменения активности наблюдалась и при изучении а-амилазы. В период достижения максимальных значений активность а-амилазы была в десятки раз выше, чем в сухом зерне. По-видимому, это отражает тот факт, что а-амилаза образуется в процессе прорастания зерна, составляя в период максимальной активности 80—90% всей активности амилолитических ферментов.

В течение вссго периода прорастания происходило снижение как абсолютного, так и относительного количества белкового азота в зерне (табл. 7). Условия питания проростков не оказали значительного влияния на содержание белкового азота; Однако следует отметить, что наименьшее его количество наблюдалось на смеси с внесением двойной дозы азота в зерне ржи и во всех вариантах с внесением азотных удобрений в зерне ячменя. Следовательно, азотные удобрения способствовали более быстрому использованию запасных белков семени,

Уже на ранних стадиях прорастания зерна большие изменения .претерпевает углеводный комплекс. При этом происходит гидролитическое расщепление различных полисахаридов

Таблица '7

Содержание белкового азота в зерне ржн'Н ячмгни при' прорастании '!

' Ячмень • Рйжь ... " -.. .

Варианты £ V н ^ и £ и " £ V ч . » £ * >.■ V V р <■ V»!'

ГО ' ю N • О! * ' Р1*' ■' и}

Вода 1.55 1,08 0.82 1.79 1.56 1,22 1.14' 0.8.1'

060 440 эа> 221 131 508 378 241 144 72

С«со> Гельрнгеля 1.7С 1Д? ' 1.22 1.12 0,77 1,85 1.52 1.27 1; •* 1.13 0.82.

559 433 гоо 217 115 519 353 245 137

Смесь без N 1.72 1.5* 1.23 1.06 й.86 1.74 1М 1.23 1.03 0.80

432 280 210 127 4В6 335 237 64*

Смесь с 2 N 1.ГД 1.30 1.10 0.83 1.89 1.58 1.3» 1.18 0.85

576 4Пг 282 201 118 &01 332 235 123 59

Смесь без Р 1.77 Г.ГО (.32 1.12 0.74 1.70* 1.52 1.21 Г.03 0.81

531 461 293 216 112 473 354 222 117 60

Смссъ с 2 Р 1.73 1.62 1,29 1.15 0.80 1.72 1.45 1.24 1.Ю 0.77 ■

5СУ 452. 29о 223 127 470 337 1 234 .. 1 125 61

. ■ ■ .1 . .

Числитель — азот в % на с>хое вещество. . .

Знаменатель —в мг на 1000 семян. , ( г/ .

до олиго- и моносахаридов, в результате'чего'бистро увеличивается содержание восстаиавливающихся Сахаров. Так, уже через одни сутки после начала прорастания количество крахмала в зерне ржи и ячменя уменьшилось на 4—5% (табл. 8). В зерне ржи особенно интенсивное уменьшение: крахмала наблюдалось после трех суток прорастания, в зерне ячменя— уже после первых суток. Более значительное-снижение крахмала происходило в вариантах с внесением азотных • удобрении, что связано с действием ферментов,амилазногокомплек-са, так как активность амилаз в вариантах.с вНесением'азоТа была выше по сравнению с остальными вариантами. •• , . г м .

Таким образом, имеется положительная корреляция, меж« ду снижением содержания крахмала и активностью амилоли-тических ферментов в зерне ржи и ячменя при прорастании; вследствие, чего азотные удобрения способствовали более быстрому гидролизу запасного крахмала семени. ..,,..».

Большой интерес, представляло,,изучение влияния последействия удобрений на амилолитлческую активность зерна. С этой целью семена ячменя; выращенного в полевом опыте с внесением РезКео. ^сРезКи и МиоРздКео проращивали на во-* де. Результаты исследований- показали, что последействие'

удобрений оказало заметное влияние на активность амилоли-тнчсских ферментов( рис. 2). Срок достижения максимума амилазной активности не зависел от-количества и соотношений применявшихся удобрений. Наибольшие величины активности амилаз наблюдалисъ'в зерне варианта, где под ячмень вносили 120 кг/га азотных удобрений. Суммарная активность амилаз в зерне растений этого варианта составила 1181 ед., что на 265 ед. больше, чем в варианте без азота; активность а-а мил азы соответственно составляла 1007 ед., или на 335 ед. больше активности фермента на фоне фосфорно-калийных удобрений. Самый низкий уровень активности был от.мече;1 в зерне растений, выращенных без внесения азотных удобрений:

Таблица 8

Содержание крахмала в зерне ржи и ячменя при прорастании [в процентах)

Ячмень Рожь

Варианты £ - El н £ - и! и £ и

V V • с <j С <J о

— ■ fa ю t-- о —■ м 1Л о

Вода 49.6 33,8 30,2 24,2 19,3 59,2 52,4 40,9 80.9 20.8

Смесь

Гель?» геля 49,0 36,2 28,4 22.3 16.5 53.0 51,7 39.С 26.3 16,2

Смесь без N 43,4 35.8 28,8 21.6 17,3 53.7 51,6 39,6 27,5 1в.4

Смесь с 2 N 49,2 36£ 30,7 20,8 14.2 57,8 50.0 36.1 25.5 15,9

Смесь без Р 49.3 36,0 27,2 21.4 17.0 58,2 51,2 37,4 24.2 16,0

Смесь с 2Р 49,0 36.0 33.1 22,8 18.0 59.1 52,3 39,3 28,7 19.4

Таким образом, при внесении азотных удобрении растения образуют зерно, которое в период прорастания обладает повышенной активностью амилолитических ферментов. Учитывая этот факт, следует осторожно подходить к вопросу о применении высоких доз азотных удобрений под озимую рожь, так как повышенная активность амилаз способствует ухудшению технологических свойств ржаной муки. По мнению Деесбаха (Deesbach J., WeipertD., 1967), активность а-амилазы возрастает при внесении азотных удобрений в начале вегетационного периода. При более поздних сроках внесения азотных удобрений происходит повышение содержания белка, но не наблюдается возрастания активности амилаз.

Электрофоретическое изучение- водорастворимых белков н их амилолнтическая активность

Результаты наших исследований водорастворимых белков ржи и ячменя методом электрофореза в нолиакр ил амид-ном геле показали большую гетерогенность белков данной

влияние нотных удоы>еиин на

АМИЮДИТИЧеСКУЮ АКТИВНОСТЬ

¿ернл «чменя при содошии

в*11цнве последейсиия аэдого

ПИТАНИЯ ЙА; АМИАОАИШбСКЧЮ

шмосп ¿еРНА женя при

ПРОРАСТМШИ

гизэлектрофорегрлммы ьолорастьоримых ьелков рши инчмем при прорастании зерил

РОЖЬ

3 5 7

/С V .г л и / '

5

/ с

5

* г

7

ЛИ./

ачмень

3 ■ 5 / с у т

7

ли/

м ЭлешофорегрАММы ьоаораст&оримы 1 велкоь ржи и ячменя при соьревднии зерил

РОЖЬ .

ЩГ Ум и]т

5Ш 7/« ;и/г»

ячмень -Ч

1В/*11 43/У11 , |/чш

«¡УВД

пщ

3|»П

рис.5. Элешофорегршы ююрастьоркмых

ЬеЛКО&,ОЬЛЦАЮЩИХ АНШНШ ШШОСТЬЮ ПРИ ПРОРХСТШН 56РНИ РОЖЬ

' 1

I ЧГ'

/ с у т к н /

''ЯЧМЕНЬ

•ч

/СУ л * И /

-у- -5-/сутки /

4.

фракции (рис. 3 и 4). По мере созревания и прорастания зерна в составе белковых компонентов происходили количественные и качественные изменения. Общее число компонентов при прорастании уменьшалось, распадались один компоненты и синтезировались другие, качественно новые белки. Поя в л е-. нне новых белковых компонентов при прорастании зерна можно объяснить новообразованием ряда ферментов, о чем сообщают н другие авторы (Проскуряков Н. И., Баблнцева М. Б., 1962; Хавкин Э. Е„ 1969; Bri^s D. Е., 1968). Распад водорастворимых белков при прорастании происходит постепенно, так как он осуществляется в силу смены ферментных систем, катализирующих биохимические процессы, изменением свойств ферментов при прорастании, их постепенного синтеза и распада.

Удобрения не изменяли состав белкового комплекса, характерного для данного растения, а лишь в некоторых опытах наблюдались изменения абсолютного количества отдельных белковых компонентов. Электрофорез водорастворимых белков прорастающих семян позволил выделить ряд компонентов, обладающих амилолитической активностью (рис, 5). После первого дня проращивания зерна ржи было обнаружено три белковых компонента, проявляющих амилазную активность в щелочном геле (0,14, 0,49 и 0,57) и два компонента в кислом геле (0,29 и 0,51), Компонент с подвижностью 0,49 имел довольно высокую активность. Через 7 суток после начала прорастания отмечено появление активных компонентов, отсутствующих на первых фазах прорастания зерна. В этот срок амнлазнои активностью обладали 6 компонентов (0,14, 0,40, 0,46, 0,51, 0,57 0,66) при электрофорезе в щелочном геле и 3 компонента (0,26, 0,40, 0,51) в кислом геле.

Белковые компоненты с подвижностью 0,14, 0,51 и 0,57 обладали активностью с первых до семи суток прорастания, причем активность компонентов с подвижностью 0,14 и 0,51 не изменялась, а с подвижностью 0,57 значительно возросла. Компонент с подвижностью 0,26 обладал а милолити чсской активностью на 7-е и 9-е сутки прорастания, однако активность его по мере прорастания зерна значительно уменьшалась. На девятые сутки после начала прорастания число амилазиоактивных компонентов уменьшилось в 3 раза по сравнению с предыдущим сроком.

При прорастании зерна ячменя несколько большее число компонентов, проявляющих амилазную активность, выявлено при электрофорезе в кислом геле. Компоненты с подвижностью 0,31 в кислом геле и 0,48 в щелочном геле ' обладали активностью в течение всего исследуемого срока прорастания. По-видимому, это отражает тот факт, что увеличение актив-

ностн амилаз связано как с активацией неактивных форм ферментов, так. и в большей степени. синтезом их de- novo. Поскольку эти множественный формы обнаружены методом электрофореза, очевидно, мы имеем дело с разновидностями молекул, отличающихся значением суммарного электрическо--го заряда и молекулярными весами, т; е. амилазы, гидроли-зуюшие крахмал, имеют-довольно сложный изоферментный состав.

Оценка молекулярных весов белков с амилазной активностью > при помощи гель-фильтрации

Гетерогенность водорастворимых белков ржи и ячменя была показана при гель-фильтрации их на сефадексе G—и0, В период ранней молочной спелости зерна ячменя, выращенного иа фоне NtioPtoKeo. были обнаружены 5 ферментов, обладающих амилолнтической активностью (табл. 9). По мере созревания зерна, к концу восковой спелости активностью обладали 3, а при уборке урожая только 2 амилолитических фермента. Ферменты имели различный молекулярный вес (or 35000 до 160000) и отличались друг от друга своей активностью и оптимумамн рН. Ферменты с молекулярным весом 45000 и 1С0 000 проявляли свою активность на протяжении всего периода созревания; фермент с молекулярным весом 00000 не проявлял активность в момент уборки урожая* а ферменты с молекулярными весами 35000 и -88 000-обладал и активностью'только в первый период созревания зерна. По-видимому, по мере созревания произошла инактивация этих ферментов, т. е. они перешли в знмогенную форму в результате связывания их с запасными белками эндосперма. Самым активным в первый период созревания был фермент с молекулярным весом 1СОООО. К фазе восковой спелости его активность снизилась на 66%, а к моменту уборки урожая — на 76%. Активность фермента с молекулярным весом 45000 в ранний период созревания зерна была на 35% ниже, чем в фазу восковой спелости. Самой низкой активностью обладал фермент с молекулярным весом 35000. В зерне ячменя, выращенного в варианте с внесением РеоК« были обнаружены те же ферменты, за исключением фермента с молекулярным весом StíOOO. Вероятно, это связано с тем, что в момент взятия образца растений данный ферментлибо еще не образовался, либо уже перешел в знмогенную форму. Активность ферментов с молекулярными весами 160000 н 45ООО уменьшилась к концу восковой спелостп зерна ячменя соответственно на 58 и 40%, но к моменту уборки урожая несколько возросла по сравнению с активностью в предыдущую фазу; активность же фермента с молекулярным: весом 60 ООО состав

Таблица 9

Молекулярный вес белков с амнлоднтнчесюй активностью в процессе созревания зерна ржи и ячменя

Ячмень Рожь

Варианты молекулярный оптимум активность амилаз в мг гидролизуемого крахмала па I мг белка Взрианш молекулярный оптимум активность амилаз в мг гидролнзусмого крахмала на 1 иг белка

вес рН 18.'УП 1/УШ вес РН 7Д'П ИЛ'Н

1000« 5,5 45«) 1120 210030 5,0 — 290 —

ваооо . 5,0 040 — — 145000 5.5 1480 045 180

МиоРбоКм СОООО 45000 6,0 5,5 470 680 490 10С0 700 К|яР|нК)г1 9X00 70000 6,5 55 410 275 ззэ

35(ХО 5,5 215 — — 4,>003 5,5 — — 200

100000 5,5 2300 970 1100 2150С0 5.0 — 350 —

Р«Км о:ооо 45000 6,0 5,5 125Э 715 025 430 630 Ьеэ удобрений 143000 00000 5.5 6,5 043 4000 270 305 110

35000 5.5 420 — — 70000 4300-1 ■ 55 5,5 400 780 70

вила лишь 50% активности, которая была отмечена в фазу молочной спелости.

Ферменты разных вариантов имели один и тот же оптимум рН, но отличались своей активностью. Так, активность фермента с молекулярным весом 160000 в зерне растений, выращенных на фоне М^сРеоКбо, в фазу молочной спелости была в 2 раза выше, чем в варианте с внесением РвоКео, в фазу восковой спелости— на 40%, а в момент уборки урожая активность фермента не зависела от соотношений применявшихся удобрений. Примерно такая же закономерность наблюдалась и в отношении фермента с молекулярным весом 45000. .С другой стороны, активность-фермента с молекулярным весом 35000 была почти в 2 раза выше на фоне фосфорно-калийных удобрений, а с молекулярным весом 60000 более чем в 2,5 раза выше в фазу молочной и на 22% выше в фазу восковой спелости зерна.

Аналогичные исследования были проведены по изучению свойств ферментов в зерне ржи. В фазу молочной спелости было обнаружено два фермента, обладающих амилолитнче-ской активностью, по мере созревания появлялся еще один высокомолекулярный фермент, а к моменту уборки урожая этот фермент и фермент с молекулярным весом 70000 перешли в зимогенную форму, но появились два новых фермента с молекулярными весами 90 000 и 45000.

Удобрения также, как и в опыте с ячменем, оказали влияние на активность ферментов. Так, фермент с молекулярным весом 145000 в первый период созревания зерна на удобренном фоне обладал в 2 раза большей активностью, а фермент с молекулярным весом 70000 проявлял одинаковую активность в обоих вариантах. В фазу восковой спелости зерна активность ферментов с молекулярными весами 240000 и 70000 была выше в варианте без удобрений, а активность фермента с молекулярным весом 145000 в этот же срок созревания была почти в 2,5 раза выше на удобренном фоне. В момент уборки урожая этот же фермент обладал, большей активностью на контроле. Возможно, что удобрения в какой-то степени оказывали влияние на соотношение активных н зимогеиных форм ферментов, в результате чего активность одних ферментов возрастала по мере созревания зерна, других — не изменялась, а у третьих — изменялась скачкообразно.

При прорастании зерна ячменя (через 7 суток) было обнаружено 3, а в зерне ржи 4 фермента с различными молекулярными весами. Фермент с молекулярным весом 45000 обладал активностью и при созревании зерна этих культур (табл. 10). В процессе гель-фильтрации объем выхода фермента с молекулярным весом 10000 не вполне соответствует

его молекулярному весу из-за сродства к фазе геля. Активность ферментов изменялась в зависимости от условий питания проростков. Так, фермент с молекулярным весом 70000 обладал большей активностью при проращивании зерна на воде, ферменты с молекулярными весами 37000 н

Таблица 10

Молекулярный вес белков с амнлолнтической активностью -в зерне ржи и ячменя при прорастании

+ . Культуры Молекулярный вес Оптимум рН Активность амилаз в мг гидролизу« мог о крахмала на I мг велка

вода смесь Гельригеля смесь с внесением 2N

Ячмень 70000 45000 <16000) 5.5 5.5 5.0 10800 4400 2100 83SO 56TÜ 3330 8000 6670 TOCO

Рожь 45000 370С0 30000 (16000) 5.5 6,5 &0 5.0 11200 ISS60 ' 10350 15S0 14400 24550 18000 1290 24560 21970 15920 4600

ЗОООО — на питательной смеси Гельригеля, а остальные ферменты— при проращивании зерна на смеси с двойной дозой азота.

Таким образом, молекулярные веса ферментов колебались в довольно широких пределах, т. е. в зерне ржи и ячменя присутствовали как высоко- так и низкомолекулярные ферменты. По-видимому, такая множественность молекулярных форм ферментов, обладающих амилолитической активностью, также свидетельствует об их сложном изоферментном составе.

Выводы

1. В процессе созревания зерна ржи. и. ячменя происходило интенсивное накопление крахмала и снижение содержания Сахаров, особенно нх редуцирующих форм. Различные условия, питания растений фосфором и калием не оказывали значительного влияния на содержание и состав углеводов в зерне, однако при повышенном уровне: азотного питания количество углеводов понижалось.

2. Процентное содержание общего азота в зерне при: созревании заметно понижалось, но относительное и абсолют-

ное количество белков возрастало. Фосфорные и калийный удобрения не вызывали изменения содержания азотистых веществ в зерне, а азотные удобрения способствовали большему накоплению белков,

3. Уменьшение веса зерна при прорастании сопровождалось снижением содержания белков и крахмала. Абсолютное количество белкового азота уменьшилось за период прорастания в 7—8 раз в зерне ржи и в 4—5 раз в зерне ячменя. Содержание крахмала за этот период уменьшилось в 3—4 раза. В условиях азотного питания происходило более интенсивное снижение содержания белков и крахмала в зерне. Таким образом, азотные удобрения способствовали более быстрому гидролизу запасных питательных веществ зерновки.

4. В результате исследований состава водорастворимых белков ржи и ячменя в процессе созревания и прорастэния установлена их большая гетерогенность. Условия питания не изменяли состав белкового комплекса, характерного для данного растения, а.лишь в некоторых опытах наблюдались изменения абсолютного количества отдельных белковых компонентов.

5. Активность амилолитическнх ферментов в зерне ржи и ячменя уменьшалась в процессе созревания, причем она оставалась на более высоком уровне в зерне ячменя по сравнению с активностью амилаз ржи. Азотные удобрения вызывали повышение амнлолитической активности во все фазы созревания зерна; а фосфорные и калийные удобрения не изменяли активность амилаз.

6. При прорастании зерна активность амилолитическнх ферментов возрастала в основном за счет а-амилззы. Особенно резкое увеличение амнлолитической активности происходило на фоне азотного питания проростков.

7. Под влиянием азотного питания ячменя формируется зерно, которое при прорастании обладает повышенной амнлолитической активностью. Увеличение суммарной активности амилаз прорастающего зерна ячменя, выращенного при внесении азотных удобрений, может достигать 50%. •

8. Электрофоретическими исследованиями установлено, что в прорастающем зерне образуются новые белковые компоненты, обладающие амнлолитической активностью, что свидетельствует о новообразовании амилаз при прорастании зерна,

9. Методом электрофореза в полнакрнламидном геле и гель-фильтрацией на сефадексе установлено, что в зерне присутствуют несколько амилолитическнх ферментов, отличающихся но своей: активности, молекулярным весам и оптиму-мамн рН. Молекулярный вес белков с амилазиой активностью колебался в пределах 30 ООО—240 ООО.

10. (Обнаруженная нами множественность молекулярных форм ферментов свидетельствует о большой потенциальной возможности прорастающего н созревающего зерна в изменении ферментативных процессов, а также быстрой приспособляемости растений к постоянно меняющимся условиям внешней среды.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Влияние условий питания на активность амилаз при прорастании озимой ржи, ячменя и озимой пшеницы. Доклады ТСХА, вып. 193, 1973 (в соавторстве с Плешковым Б. П. и Сокольской Т. И.).

2. Химический состав и амилазная активность семян озимой ржи в процессе их созревания и прорастания при различных условиях минерального питания.. Известия ТСХА, вып. 1, 1975 (в соавторстве с Плешковым Б. П.).

Объем 1V* п. л.

Заказ 517,

Тираж 150

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 125008, Москва А-8, Тнмнряэеаская ул.. 44