Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ из растений и их влияние на пищеварительные протеиназы позвоночных животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ из растений и их влияние на пищеварительные протеиназы позвоночных животных"

оо

СП СП

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Ольга Викторовна О 70щ-

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИНГ ИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ РАСТЕНИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Краснодар 1998 г.

Работа выполнена в Кубанском государственном университете

- доктор биологических наук, профессор Проскуряков М.Т

Заслуженный деятель науки и техники РФ, доктор технических наук, профессор В.Г. Щербаков Старший научный сотрудник Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур, кандидат биологических наук В.С.Питибская

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства

Защита состоится "28" апреля 1998г. в ! 0-00 часов на заседании диссертационного совета К063.40.03. Кубанского государственного технологического университета по адресу: 350072, г.Краснодар, ул.Московская, 2, кор.А, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КубГТУ.

Автореферат разослан "

/и-Сф^Ш^ ¡998г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета -

к. т. н., доцент ____^ Л.Д.Минакова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты и их ингибиторы играют важную роль в жизнедеятельности организмов.

Протеолитические ферменты широко применяются в пищевой промышленности, медицине, для скармливания в виде добавок к к< мбикормам животным (Мосолов, 197); Вагонис, Тимука„, Трюкас, 1973; Веремеен-ко, 1971). Необходимость поисков протеиназ и ингибиторов протеиназ растительного происхождения, очечидна.

Особое внимание обращает на себя роль протеолитических ферментов и нх ингибиторов в процессе пищеварения у человека и животных. Растительный и елок является важнейшей составной частью рационов полноценного питания. Однако, высокое содержание ингибиторов в некоторых растениях приводит к значительному снижению пищевой ценности продуктов. Присутствие таких продуктов в рационе питания приводит, в ряде случаев, к отрицательным физиологическим явлениям (Ge, Morgan, 1993).

Ингибиторы протеиназ обладают высокой термостабильностью и не разрушаются даже после кипячения (Chen, Mitchell, 1971). В некоторых случаях в результате термической обработки пищи ингибиторная активность резко повышается (Doell, Ebden, Smith, 1981). В результате ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять пищеварение белков. С другой стороны, находящиеся в растениях протеолитические ферменты стимулируют jtot процесс.

В связи с этим изучение содержания протеиназ и их ингибиторов в пищевых продуктах, а также исследование влияния этих веществ на пищеварительные протеиназы животных приобретает особое значение при разработке вопросов питания человека и животных.

Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях, обна-

руженные нами в литературных источниках, являются неполными и касаются, в основном, представителей семейств бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже - зонтичных и крестоцветных. Еще меньше литературных сообщений об активности протеаз и их ингибиторов в представителях семейств, объединяющих фруктовые растения. Известно ( Онивоги, 1986), что многие фрукты содержат значительное количество белка. Логично • предположить, что эти растения обладают существенной активностью протеиназ и их ингибиторов. Так, по данным B.H.Doell, C.J.Ebden и C.A.Smith (1981), яблоки содержат до 67,7 мг ингибитора трипсина на грамм белка.

В литературе имеются данные о влиянии растительных ингибиторов бобовых, злаковых культур и картофеля на панкреатические птотеиназы животных и человека (Belitz, Zynen, Weder, 1982; Rakowska et al., 1991). Все эти растения употребляются в пищу после термической обработки, что, как правило, снижает уровень активности ингибиторов.

В большинстве работ, посвященных исследованию влияния растительных ингибиторов на панкреатические протеиНазы животных и человека, сравнивается ингибигорный эффект на активность протеиназ двух различных животных: карпа и быка (Хаблюк, 1983), толстолобика и быка (Зозуля, 1996), курицы и быка (Нечепуренко, 1997), человека и быка (Doell, Eb-den, Smith, 1981), человека и крысы (Krogdahl, Holm, 1983). Только в некоторых исследованиях изучалось влияние ингибиторов из растений на про-теиназы представителей сразу всех классов позвоночных животных (Проскуряков, 1969, Krogdahl, Holm, 1981). Результаты этих работ часто противоречивы.

Влияние протеиназных ингибиторов из растений на активность желудочных протеиназ человека и животных исследовалась очень слабо (Sakato, Та-naka, Misawa, 1975). Очевидно, эти исследования нуждаются в уточнении и расширении как в отношении растительных источников ингибиторов, так и источников панкреатических и желудочных протеиназ.

Результаты этой работы могут быть полезными при составлении рационов питания здоровых людей и больных с нарушениями пищеварения, а

также в кормопроизводстве. Неполная изученность содержания протеоли-ткческих ферментов и их ингибиторов в растениях, а также влияния ингибиторов протеиназ из растений на пищеварительные протеиназы человека и животных побудили нас к проведению этой работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование количественного содержания протеолитических ферментов и их ингибиторов в растениях, традиционно употребляемых в пищу в Краснодарском крае, а также определение влияния ингибиторов из этих растений на активность пзнкреатических и желудочных протеиназ различных позвоночных животных в целях поиска источников протеолитических ферментов, производства кормов, а также создания рационов питания для человека и животных.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать количество белка, активность трипсиноподобных, хи-мОтрипсиноподобных, кислых и щелочных протеиназ, а также содержание ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина в растениях, традиционно употребляемых в пищу в Краснодарском крае.

2) Определить динамику количества белка и активность вышеперечисленных биологически активных веществ исследуемых растений в процессе их онтогенеза;

3) Исследовать динамику содержания белка и активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в яблоках различных сортов при их хранении;

4) Определить термостабильность протеиназ и их ингибиторов, содержащихся в исследуемых растениях;

5) Исследовать влилние растительных ингибиторов на панкреатические протеиназы различных позвоночных животных;

6) Определить влияние растительных ингибиторов на пепсины различных позвоночных животных.

Научная новизна. Впервые систематически изучен большой спектр растений, употребляемых в пищу сыром виде и после термической обработки на содержание протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ.

Спорный вопрос об ингибиторах кислых протеиназ в растениях (пепсина) в наших исследованиях нашел подтверждение: значительная часть изученных нами растений содержала ингибиторы пепсина. По спектру биологически активных веществ растения определены в 9 групп. Большинство растений находится в первых группах. Это свидетельствует о том, что, вероятно, все растения содержат все протеиназы и ингибиторы протеиназ, однако, количество их варьирует в представителях разных групп.

Исследовано влияние растительных экстрактов на общую казеиноли-тическую активность протеиназ, активность трипсинов и химотрипсинов различных позвоночных животных. Впервые определено влияние растительных экстрактов на активность пепсинов позвоночных животных всех классов.

Установлено, что при формировании зерен, бобов и орехов в них происходит увеличение содержания белка, количество белка в плодах, побегах и листьях, а также в плодовых телах грибов в процессе онтогенеза уменьшалось.

В процессе онтогенеза и хранения плодов, побегов и листьев исследованных растений происходит снижение количества бежа, активности трип-синоподобных, химотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ и увеличение количества ингибиторов трипсина, химотрипсина я пепсина..

Теоретическая и практическая значимость работы. Все изученные растения разделены на группы по спектру обнаруженных в них биологически активных веществ. Предполагается, что все растения содержат исследованные биологически активные вещества, однако, количественное содержание их в растениях отличается. Проведено сравнительное изучение влияния растительных ингибиторов на протеиназы позвоночных животных всех классов: рыб, птиц и млекопитающих. Пищеварительные протеиназы позвоночных животных всех классов по-разному угнетаются ингибиторами из растений. Выявлены различия в действии ингибиторов протеиназ на ферменты жвачных и моногастричных животных позвоночных. Так, по степени влияния ингибиторов из сои на активность трипсинов животные распола-

гаются в следующем порядке: карп > толстолобик > судак > акула > курица > утка > свинья > крупный рогатый скот > овца > человек.

Полученные данные могут быть использованы при составлении рационов питания для людей с нормальным пищеварением и при лечении больных с нарушениями этого процесса.

Результаты работы могут быть также полезными при производстве искусственых кормов для сельскохозяйственных животных.

Кислые протеиназы и химотрипсиноподобные ферменты растении в перспективе могут быть использованы в молочной промышленности.

Высокое содержание протеиназ у бобовых культур (приблизительно на порядох ниже, чем в поджелудочной железе крупного рогатого скота) делает их потенциально пригодными для получения ферментов.

Ингибиторы протеиназ из исследованных растений могут быть использованы в качестве биоспецифических носителей при аффинной хроматографии.

Материалы диссертации могут быть полезными при чтении спецкурсов по специальности "Биохимия".

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Растительные продукты, входящие в рацион питания жителей Краснодарского края, содержат белок, трипсиноподобные, химотрипсиноподобные, щелочные и кислые протеиназы, а также ингибиторы трипсина, химо-трипсина и пепсина.

2. В различных сортах одного и того же вида растения находится разное количество белка, ферментов и ингибиторов.

3. В процессе онтогенеза плодов фруктов, побегов и листьев овощей, а также плодовых тел грибов наблюдается снижение количества белка. В процессе формирования бобов, зерен, орехов и плодов овощей, наоборот, происходит накопление белка. Уровень активности трипсиноподоб-ных, химотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ по мере развития всех исследованных анатомических частей растений понижается, а активность ингибиторов трипсина, хиыотрипсина и пепсина возрастает.

4. Динамика содержания белка, ферментов и ингибиторов в процессе онтогенеза отличается в зернах, бобах, орехах, листьях, плодовых тепах и плодах.

4. При хранении плодов исследуемых растений в них происходит снижение количества белка и протеолитических ферментов и возрастание активности ингиСиторов протеин аз.

5. Ингибиторы протеиназ из исследованных растений в существенной степени угнетают активность панкреатических протеиназ позвоночных животных.

6. Экстракты изученных растений угнетают активность пепсинов позвоночных животных.

7. Степень угнетения активности протеиназ зависит как от источника растительных ингиоиторов, так и от животного, используемого в эксперименте.

8. Ингибиторы протеиназ исследуемых растений обладают значительной термостабильностью, а протеиназы теряют свою активность при повышении температуры до 55-60°С.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы докладывали на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы водных экосистем и сопредельных территорий" (Краснодар, 1995), на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1996), на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных и центральных регионов России" (Краснодар, 1996), на межреспубликанской конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий" (Краснодар, 1997), на 4-том симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997), на международном координационном совещании "Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных" (Воронеж, 1997).

Публикация материалов исследования. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и возможностей практического приложения полученных результатов. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 13 таблицами. Список использованной литературы включает 288 источник, из них 142 на иностранных языках. Диссертация содержит 4 приложения.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили съедобные части 82-' растений, принадлежащих к 25 семействам: бобы представителей семейства бобовых; зерна злаковых культур; орехи представителей семейств ореховых, березовых, сосновых, розовых; листья капустных, зонтичных, маревых и гречишных растений; побеги луковых и зонтичных; клубни пасленовых и сложноцветных; корнеплоды капустных, зонтичных и маревых; плодовые тела ага-риковых. сыроежковых, болетовых и трихоломовых; плоды пасленовых, тыквенных, розовых, рутовых, виноградных, крыжовниковых, жимолост-. ных, эбеновых, банановых и буковых, а также луковицы растений - представителей семейства луковых.

Динамику количества белка, протеиназ и их ингибиторов в процессе онтогенеза растений выявляли, определяя содержание этих веществ на трех стадиях развития растений: незрелой (I), недозрелой (II) и зрелой (III) (Валентинова, 1992).

Для определения содержания белка, активности трипсина, химотрип-сина, щелочных и кислых протеиназ, ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина, использовали водные экстракты из исследуемых частей растений.

Количество белка определяли методом Лоури, содержание трипсина,

трипсиноподобных ферментов и ингибитора трипсина определяли методом Тирру, активность химотрипсика, химотрипсиноподобных протеиназ и ингибитора химотрипсина измеряли методом Пятницкого. Количество щелочных протеиназ исследовали методом Кунигца, а количество кислых протеиназ и ингибитора пепсина - методом Ансона . Все анализы в каждом образце проводили минимум в трехкратной повторности.

Полученные данные были обработаны статистически (Лакии, 1990).

. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Содержание протеиназ и их ингибиторов в растительных' пищевых продуктах Краснодарского края

Из 82 изученных растений в автореферате (таблица 1) представлены 30 растений, которые являются наиболее часто употребляемыми в пищу. Таблица 1. Содержание протеиназ и их ингибиторов в растительных пищевых продуктах (верхняя строка - протеин азы, нижняя - ингибй-торы)

Представители Трипсино-подобные ферменты Ингибитор трипсина (мг/г) Химотрипси-ноподобные ферменты Ингибитор химотрйпеина (мг/г) Щелочные протеазы (мг/г) Кислые протеазы Ингибитор пепсина (ед) Белок общий Белок растворимый (мг/г)

1 2 3 4 5 6

Соя Фора 0,453+0,0531 33,152+3,3910 0,293+0,0331 15,102+1,4320 0,605+0,0671 0,244+0,0275 9,123+0,8791 395,000 .57,123+5,6902

Соя Юг-30 0,734+0,0751 12,160+1,1323 0,503+0,0302 0,134+0,4613 0,974+0,0853 0,425+0,0381 4,317+0,4108 395,000 52,873+2,7801

Горох свежий 0,537+0,6381 0,093+0,0082 0,204+0,0332 0,000 0,785+0,0714 0,000 0,531+0,0446 48,800 15,772+1,8933

Картофель 0,043+0,0052 0,514±0,0587 0,069+0,0053 0,334+0,0480 0,075+0,0081 0,067+0,0069 1,765+0,1408 14,000 9,374+0,9521

Продолжение таблицы 1

1 2 1 3 1 4 I 5 6

Поми- 0,019+0,0289 0,007+0,0008 0,019+0,0047 0,000 8,000

дор 0,150+0,0172 0,000 0,000 3,014+0,3540

Бакла- 0,017+0,0022 0,006+0,0007 0,013+0,0041 0,016+0,0027 9,600

жан 0,092+0,0983 0,029+0,0035 0,010+0,0011 2,276+0,9831

Пше- 0,089+0,0092 0,048+0,0037 0,063+0,0077 0,042+0,0048 147,000

ница 0,075+0,0084 0,252+0,0420 1,043+0,1207 11,378+1,7834

Капуста 0,295+0,0342 0,034+0,0039 0,329+0,0490 0,033+0,0024 14,400

белоко- 0,073+0.0081 0,008+0,0009 0,014±0,0031 5,027+0,5150

чанная

Редька 0,033+0,0026 0,019+0,0021 0,035+0,0025 0,028+0,0017 15,200

0,093+0,0084 0,025+0,0034 0,042+0,0047 4,769+0,4113

Репа 0,039+0,0032 0,022+0,0028 0,023+0,0037 0,012+0.0019 9,600

0,197+0,0114 0,078+0,0064 0,067+0,0054 0,194+0,0278

Тыква 0,018+0,0029 0,022+0,0037 0,019±0,0023 0,000 8,000

0,324+0,0241 0,097+0,0082 0,000 0.457+0,0379

Мор- 0,036+0,0034 0,008+0,0009 0,026+0,0029 0,007+0,0082 10,400

ковь 0,164+0,0183 0,052+0,0058 0,019+0,0013 3,765+0,3212

Свекла 0,019+0,0022 0,004+0,0004 0,018+0,0019 0,036+0,0039. 12,000

0,188+0,0152 0,060+0,0057 0,711+0,0074 3,820+0,3814

Лук реп- 0,017+0,0023 0,007±0,0008 0,013+0,0017 0,008+0,0008 20,000

чатый 0,232+0,0278 0,093+0,0089 0,177+0,0132 7,685+0,8170

Лук 0,135+0,0156 0,023+0,0021 0,134+0,0211 0,050+0,0050 10,400

перо 0,019+0,0012 0,000 0,000 3,314±0,3281

Яблоко 0,085+0,0086 0,065+0,0062 0,074+0,0065 0,014+0,0017 7,800

Ред <0,01 0,000 <0,01 3,738+0,2812

Депишес

Яблоко 0,091+0,0092 0,059+0,0055 0,083+0,0085 0,000 8,500

Годден <0,01 0,000 0,000 4,413±0,3741

Делишес

Яблоко 0,042+0,0047 0,018+0,0017 0,043+0,0047 0,027+0,0021 6,800

Ренет Си- <0,01 0,002+0,0003 <0,01 3,941+0,3202

миренхо

Яблоко 0,054+0,0053 0,034+0,0031 0,048+0,0046 0,034+0,0039 5,400

Айдо- <0,01 0,001+0,0002 <0,01 3,363+0,2811

ред

Яблоко ' 0,068+0,0062 0,000 0,032+0,0036 0,000 3,200

Мелба 0,000 0,000 0,000 2,146+0,2527

Яблоко 0,072+0,0073 0,017+0,0017 0,070+0,0071 0,037+0,0032 ' 4,200

Мекин- 0,000 0,000 0,000 3,029+0,2921

тош

1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

Саша 0,052+0,0051 0,000 0,032+0)0034 0,022+0,0015 6,000

0,000 0,000 0,000 3,107+0,4421

Грушж 0,014+0,0019 0,007+0,0007 0,019+0,0022 0,000 3,100

<0,01 <0,01 -- 0,007+0,0008 1,909+0,2231

Вино- 0,029+0,0024 0,009+0,0009 0,021±0,0024 0,035+0,0034 6,000

град Иза- 0 032+0,0037 0,004+0,0005 <0,01 2,947+0,2532

белла

Вино- 0,013+0,0018 0,011+0,0017 0,024+0,0027 0,017+0,0026 6,000

град 0,054+0,0050 0,000 ^ — 0,000 3,348+0,2200

Мускат

Хурма 0,024+0,0038 0,084+0,0081 0,074+0,0079 0,000 4,300

кавказс- 0,013+0,0018 0,006+0,0007 о,о:7±о,ооп 3,443+0,3424

кая Хурма 0,013+0,0019 0,042+0,0045 0,048+0,0043 0,023+0,0029 4,300

восточ- 0,020+0,0024 0,000 0,000 4,135+0,3875

ная Шам- 0,013+0,0077 0,032+0,0017 0,082+0,0088 0,031+0,0033 29,500

пиньон 0,214+0,0024 0,149+0,0181 <0,01 6,741+0,6228

Подоси- 0,061+0,0067 0,045+0,0044 0,028+0,0031 0,043+0,0041 24,600

новик 0,028+0,0035 0,006±0,0006 0,000 5,170+0,5805

Опенок 0,023+0,0025 0,001+0,0091 0,018+0,0024 0,020+0,0018 13,800

0,000 0,015+0,0021 <0,01 3,217±0,3890

Анализ содержания протеиназ и их ингибиторов в исследованных растениях позволил разделить их на 9 групп в зависимости от состава протеиназ и ингибиторов.

Наиболее представительной оказалась 1 группа, содержащая большинство исследованных растений. Представители этой группы содержали все изученные биологически активные вещества. Максимальное содержание трипсиноподобных протеиназ бьшо определено в сое Юг-30: 0,734 мг/г, а максимальное количество ингибиторов трипсина - в сое Фора: 33,152 мг/г (табл.1).

. Во вторую группу вошшг растения, которые содержали все исследуемые биологически активные вещества, за исключением ингибитора пепсина. Наибольшее количество ппотеш:.ггических ферментов сред-: этих растений было опред- к:: 1с в с^г синовике и тыкве, а наибольшее количееяю ингибиторов - вио' \v-e.5x телах шампиньона. Плодовые тела подосинови-

ка содержали 0,061 мг/г трипсиноподобных протеииаз, а содержание ингибитора трипсина в шампиньоне составляло 0,149 мг/г (табл.1).

Растения третьей группы не содержали ингибитор химотрипсина и ингибитор пепсина. Больше всего протеииаз и ингибиторов среди представителей этой группы находилось в зеленых побегах лука и бобах зеленого . гороха. Количество химотрипсиноподобных протеииаз в горохе составляло 0,204 мг/г (табл.1).

Представители, вошедшие в остальные группы, составляли меньшинство всех исследованных растений и обладали более узким спектром про-теолитических ферментов и ингибиторов протеииаз: в растениях четвертой группы отсутствовали химотрипсиноподобные лротеиназы и ингибитор . пепсина, растения пятой группы не содержали кислые протеиназы и ингибитор пепсина, представители шестой, седьмой, восьмой и девятой групп не обладали активностью ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина. В растениях седьмой группы содержались щелочные протеиназы, включая трипсин и химотрипсин, в растениях восьмой группы - трипсиноподобные и щелочные протеиназы, а в представителях девятой группы - только трипсиноподобные ферменты.

*

Таким образом, водные экстракты плодов, семян и листьев растений, традиционно принимаемых в пищу в Краснодарском крае, содержат белок, трипсиноподобные,'химотрипсиноподобные, кислые и щелочные протеиназы, а также ингибиторы трипсина, химотрипсина и пепсина. При этом одни растения содержат больше протеолитнчеехпх ферментов, другие - ингибиторов протеииаз.

Разные сорта одного вида растения отличаются по содержанию протеииаз и ингибиторов и находятся в разных группах по спектру этих биологически активных веществ.

По-видимому, все растения содержат то или иное количество исследованных протеолитических ферментов и их ингибиторов, но активность этих биологически активных веществ в некоторых случаях оказывается ниже чувствительности методов исследования.

Между содержанием ферменте» и белка, ингибиторов и белка, а также ферментов и ингибиторов была обнаружена положительная корреляционная зависимость (Р<0,05).

3.1. Динамика содержания белка, активности протеиназ и их ингибиторов в процессе онтогенеза растений - •

В таблице 2 представлен характер изменения количества белка, ферментов и ингибиторов в процессе онтогенеза в % по отношению к незрелой стадии (I), которая принята за 100%. Все исследованные части растений объединены в 3 группы: 1. Зерна, бобы и орехи; 2. Листья и плоды овощей, плодовые тела грибов; 3. Плоды фруктов.

Таблица 2. Динамика количества белка, протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе онтогенеза некоторых растений (в % относительно I стадии)

Трипсинопо- Химотрипси-

Стадии онтогенеза добные ноподобкые Щелочные Кислые Раствори-

и группы растений ферменты ферменты протеиназы протеиназы мый белок

Ингибиторы Ингибиторы Ингибитор

трипсина химотрипсина пепсина

Ц 72-60 75-80 45-60 75-85 ■ 175-195

Зерна, бобы 200-300 150-220 130-170

и орехи

Листья и плоды 55-75 65-75 50-68 70-80 40-50

овощей, плодовые 160-330 180-250 175-200 •

тепа грибов

Плоды 65-90 80-90 55-80 85-95 90-95

фруктов 130-165, 130-135 137-145

III 25-50 55-70 10-30 60-75 185-195

Зерна, бобы 450-700 300-500 250-400

и орехи

Листья и плоды 45-60 60-65 15-50 55-70 25-40

овощей, плодовые 270-550 250-290 195-225

тела грибов

Плоды• 65-75 65-85 45-60 35-45 80-92

фруктов 175-280 155-170 145-150

Результаты исследований показали, что при формировании зерен, бобов и орехов в них происходило накопление белка, количество белка в исследованных частях остальных растений уменьшалось.

В процессе онтогенеза было отмечено снижение активности трипсино-подобных, химотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ и возрастание активности ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина. Динамика всея показателей была наиболее интенсивной при переходе от I стадии онтогенеза ко II.

Во всех исследованных частях растений с наибольшей интенсивностью снижалась активность щелочных и трипсиноподобных протеиназ (до. 50-25%), количество химотрипсиноподобных и кислых протеиназ уменьшалось в меньшей степени (до 55*35%). i

Максимальные различия в уровнях активности протеиназ на разных этапах онтогенеза были отмечены у растений 1 группы, а наименьшие изменения происходили в плодах представителей 3 группы. Так, активность щелочных протеиназ, отмеченная а сое сорта Фора, снижалась в периоды от

I ко II и от I к III стадии онтогенеза на 41 и 74% соответственно. Эти значена

ния для листьев капусты белокочанной составляли 43 и 62%, а для плодов крыжовника - 28 и 44% соответственно.

Максимальное увеличение активности ингибиторов наблюдалось в бобах, зернах и орехах, а минимальное - в плодах фруктов. Так, активность ингибитора трипсина в бобах фасоли увеличивалась в течение двух этапов онтогенеза на 255 и 560%, для плодов репы эти показатели составляли 167 и 51.7%, а для плодов груши -130 и 280% соответственно.

Таким образом, в процессе онтогенеза в исследуемых анатомических частях растений происходит снижение ферментативной активности и заметное увеличение активности ингибиторов протеиназ.

Наши исследования подтверждают данные других авторов о динамике количества белка, протеолитических ферментов и ингибиторов в процессе онтогенеза растений (Ambe, Sohonie, 148; Реагсе et al, 239). В бобах, зернах и орехах это связано с процессом накопления белка по мере созревания растения. В остальных исследованных частях растений увеличение ингибиторной активности происходило, вероятно, вследствие незавершения процесса формирования семян и предотвращения преждевременного

рассредоточения их животными, а также для защиты от повреждающего действия насекомых и микроорганизмов. Возможно и другое объяснение увеличение содержания ингибиторов по мере развития плодов овощей и фруктов: активность ингибиторов могла повышаться на фоне снижения активности протеиназ в процессе онтогенеза.

3.2. Динамика содержания белка, активности протеиназ и их ингибиторов в некоторых сортах яблок при хранении

В процессе хранения яблок происходило снижение количества белка, протеолитических ферментов и возрастание количества ингибиторов протеиназ. Исследованные сорта отличались друг от друга по динамике этих показателей. Основная доля снижения количества белка, протеиназ и возрастания количества белка приходилась на первые три месяца хранения (табл.3). После 6 месяцев хранения содержание расворимого белка в яблоках снижалось, в среднем, в 1,4 раза, содержание общего белка - в 1,2 раза.

Вероятно, в процессе хранения в расход идет, в основном, лабильный белок, а структурный белок используется в меньшей степени.

По истечении 6 месяцев наибольшее количество трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов было отмечено в яблоках сортов Гол-ден Делишес и Ред Делишес и составило 57,2 • Ю-3 и 55,2 ■ 10-3 мг/г трипсиноподобных и 3,4 10 3и 2,7 Ю-3 мг/г химотрипсиноподобных ферментов соответственно (табл.3).

В сортах Ренет Симиренко и Ред Делишес наблюдалось наиболее интенсивное увеличение содержания ингибиторов протеиназ. В конце периода хранения данные сорта содержали 68,2 103 и 59,4 • 10'3 мг/г ингибитора трипсина. Наименьшее увеличение содержания трипсиновых ингибиторов было зарегистрировано в яблоках сорта Джонатан.

В большинстве исследованных сортов активность ингибиторов химо-трипсина увеличивалась менее интенсивно, чем активность ингибиторов трипсина. После 3-х месяцев хранения содержание ингибиторов химотрип-

Таблица 3. Количество белка, трипсиноподобных, хииотрипсиноподобных ферментов и ингибиторов трипсина и химотрппсниа з некоторых сортах яблок при хранении

Сорт яблок Балок общий, мг/г Бьлок растзсримый, мг/г Трипсинсподобные ферменты, мг/г • 10-3 Ингибяторг трипсина, иг/г 1<Н Химотрипсиноподобные ферменты, мг/г - 10~э Ингибитор химотрипсина мг/г • 10-3

О&'-хбрь | Январь | Апрель Октябрь ] Январь | Апрель Октябрь I Январь < Апрель

Рея Делишес 7,8 +0,61 3,7+0,28 7,5+0,71 3,2x0,27 7,1+0,64 2,8+0,22 85,4+6,23 <0,01 65,3+4,12 43,2+4,21 55,2+2,19 59,4+5,82 6,5+0,52 0,0 5,8+0,42 7,1+0,62 3,4+0,25 9,0+0,82

Гагагн Дет* ¡нес 8,5+0,68 4,4+0.37 8,1+0,72 3,9+0,33 7,8+0,69 3,1+0,25 91,7+7,56 <0,01 67,4+4,21 32,6+3,54 57,2+4,15 45,0+4,75 5,9+0,48 0,0 4,7+0,31 4,2+0,35 2,7+0,24 7,4+0,85

Джонатан 4,/г <",35 2,5+0,19 3,8+0.31 2,3+0,17 3,4+0,26 1,9+0,14 30,3+2,70 <0,01 24,4+1,37 11,2+1,17 Г 19,5+1,79 24,8+2,27 2,8+0,24 2,3+0,35 2,5+0,22 4,4+0,37 1,8+0,14 5,5+0,68

Ренет Спниренко 6,8+0,54 3,9+0,32 6,4+0,53 3,2+0,31 6,1+0,56 2,7+0,14 41,7+3,85 <0,01 29,2+2,08 52,3+5,35 25,4+1,84 68,2+6,57 1,8+0,22 3,8+0,44 1,6+0,13 6,3+0,54 1,2+0,16 9,4+0,82

Айдоред 5,4+0,43 3,4±0,27 5,1+0,42 2,9+0,22 4,8+0,31 2,5+0,19 54,2+4,39 <0,01 45,1+3,24 24,1±2,)4 37,2+2,74 29,5+2,47 3,4+0,25 1,3+0,19 2,9+0,21 9,1±0,95 1,9+0,12 13,4+1,15

сива в плодах повышало», в среднем, в 1,3 раза, а в течение второго срока эти значения сохранялись, приблизительно, на одном и том же уровне.

Одной из основных функций ингибиторов является защита растений от повреждающего действия насекомых и микроорганизмов (Мосолов, Валуева, 1993). Повышение ингибиторной активности необходимо для нейтрализации протеиназ фитопатогенных микроорганизмов, вызывающих пшль яблок при хранении. Это предположение подтвеждается тем, что сорта, рекомендованные к длительному хранению (Причко, 1990), содержат максимальное количество ингибиторов. Однако, может быть и другое объяснение повышения содержания ингибиторов в плодах яблок: ингиби-торная активность увеличивается в результате снижения активности протеиназ в процессе хранения.

3.4. Влияние растительных ингибиторов на пищеварительные протеи-назы позвоночных

Сравнивали in vitro влияние ингибиторов 14 растений на щелочные протеиназы крупного рогатого скота, овцы, свиньи, курицы, утки, судака, карпа, толстолобика и акулы (табл.4).

Протеиназы всех исследованных позвоночных животных проявляли различную чувствительность к ингибиторам каждого отдельно взятого растения. Наиболее отчетливо эти различия проявлялись при взаимодействии протеолитических ферментов с протеиназнымн ингибиторами соевых бобов (табл.4). Максимально угнетались протеиназы карпа, толстолобика и судака. Ферменты курицы, акулы и утки подвергались влиянию соевых ингибиторов в меньшей степени. Затем следовали протеиназы свиньи и жвачных животных. Слабее других угнетались ферменты человека.

При использовании экстрактов других растений мы наблюдали некоторые отличия в действии ингибиторов на ферменты позвоночных. Так, общая казеинолитическая активность протеиназ акулы угнеталась ингибиторами из картофеля и моркови слабее, чем общая казеинолитическая ак-

Таблица 4. Угнетение щелочных протеиназ, трипсиноподобных и химо-трипсиноподобных ферментов различных позвоночных ингибиторами некоторых растений, %

Фер- Карп Толс- Су- Аку- Кури- Утка Сви- Крупный Ов- Чело-

Растение менты толобик дак ла ца нья рогатый скот ца век

П 73 62 55 24 38 34 30 23 16 8

Соя Т 100 97 88 55 77 74 64 54 43 24

- X 71 62 53 23 37 35 30 22 15 10

п 65 51 40 19 37 31 22 17 16 10

Фасоль т 100 73 67 50 54 52 43 37 33 16

X 100 66 57 22 40 38 32 24 18 6

и 61 44 33 9 25 18 19 13 16 6

Горох т 100 71 65 16 46 36 29 21 26 10

X 100 53 47 13 27 23 20 10 14 8

п 82 62 51 30 43 34 22 15 9 13

Пшеница т 100 92 85 57 59 53 43 35 24 21

X 100 68 53 36 39 33 19' 17 14 9

п 62 51 40 30 16 14 9 6 5 4

Кукуруза т 100 77 72 52 29 V. 32 22 13 11 6

х> 100 3& 34 19 11 7 8 5 4 3

п 77 51 44 35 26 20 19 14 9 6

Ячмень т 100- 87 78 62 46 32 34 23 16 9

X 100 89 51 27 22 16 14 11 10 4

п 74 57 51 35 23 ' 16 13 9 5 4

Рожь т 100 83 75 64 41 36 27 19 15 9

X 100 52 46 42 25 23 18 12 6 5

Карто- п 73 62 52 15 30 21 27 16 13 7

фель т 100 90 86 31 48 47 53 43 39 19

X 100 80 73 22 39 26 48 38 30 12

Цветная п 29 24 18 14 12 10 9 8 4 6

капуста т 54 50 45 35 33 27 25 23 14 16

X 32 27 24 20 14 И 16 13 7 9

Белоко- п 21 19 16 15 11 9 7 8 4 6

чанная т 49 42 38 29 26 24 20 17 12 13

капуста X 27 21 20 16 11 9 14 8 5 7

п 26 24 19 16 8 6 13 10 4 4

Репа т 43 38 37 28 23 14 19 12 7 9

X 24 20 18 12 7 3 12 9 5 6

п 20 19 14 12 7 3 8 5 4 4

Редька т 39 36 30 18 19 5 14 9 7 7

X 21 14 13 10 7 2 9 5 4 3

п 21 19 16 8 14 10 11 7 5 6

Свекла т 36 30 27 19 23 20 17 15 . 12 9

X 22 21 18 9 15 11 14 11 9 4

п 17 16 12 5 10 6 7 5 4 3

Морковь т 29 26 23 13 19 18 12 9 8 6

X 18 ¡8 15 6 13 10 9 7 . 7 5

Примечание: П - щелочные протеиназы, Т - трипсины, X - химотрипсины

тивносгь протенназ свиньи, утки и крупного рогатого скота. Интенсивность взаимодейс.вия трипсина человека с ингибиторами из редьки и хи-мотрипсина человека с ингибиторами из репы была ниже интенсивности взаимодействия аналогичных ферментов овцы и свиньи с ингибиторами данных растений.

Сравнивали in vitro влияние ингибиторов тех же растений на активность пепсинов человека, крупного рогатого скота, овцы, свиньи, курицы, утки, судака и акулы (табл.5).

Таблица 5. Угнетение активности пепсинов различных позвоночных ингибиторами из растений, %

Растения Судак Акула Свинья Крупный рогатый скот Овца Курица Утка ieno-век

Соя 64 56 49 44 40 35 31 24

Фасоль 56 48 41 37 32 26 24 20

Горох 42 38 33 24 23 20 19 14

Картофель 52 45 36 32 28 23 21 22

Пшеница 37 28 32 23 17- 21 19 16

Ячкень 34 13 27 20 17 24 18 12

Рожь 21 12 12 17 11 14 13 9

Кукуруза 19 12 15 11 9 14 15 8

Капуста цветная 26 12 22 19 15 И 10 16

Капуста белокочанная 23 10 18 16 11 9 9 12

Репа 21 16 13 12 10 8 6 13

Редька 20 14 11 10 8 7 6 11

.Морковь 18 14 10 8 8 7 4 12

Свекла 14 11 8 7 5 5 4 10

Наибольшую восприимчивость к соевым ингибиторам проявили ферменты судака и акулы, протеиназы свиньи, жвачных животных и птиц угнетались в меньшей степени. В минимальной степени ингибировались ферменты человека.

При использовании в качестве источника ингибиторов экстрактов других растений наблюдались некоторые отличия в ряду животных, расположенных по степени угнетения их пепсинов. Так, птицы занимали второе, после рыб, место по степени угнетения их пепсинов ингибиторами протеи-наз из пшеницы, кукурузы, ячменя, цветной и белокочанной капусты и чет-

вертое место по степени угнетения их пепсинов ингибиторами из моркови после судака, акулы и человека. Пепсин свиньи угнетался ингибиторами репы, редьки, моркови' и свеклы заметно интенсивнее, чем пепсины птиц и человека. По степени угнетения пепсина ингибиторами из картофеля, цветной и белокочанной капусты, репы, моркови и свеклы овца находилась на последнем месте среди всех исследованных животных. Пепсин человека взаимодействовал с ингибиторами протеиназ из редьки, цветной и белокочанной капусты слабее, чем пепсины рыб н птиц, а по интенсивности взаимодействия с ингибиторами моркови и свеклы занимал третье место после судака и акулы (табл.5).

Проведенные исследования показали, что протеиназные ингибиторы растений оказывают существенное влияние на активность пищеварительных протеиназ позвоночных животных, зависящее от источника ферментов и ингибиторов.

ВЫВОДЫ

1. Систематическое исследование растений, принимаемых в пищу в Краснодарском крае, показало, что их водные экстракты содержат белок, трипсиноподобные, химотрипсиноподобные, кислые и щелочные протеи-назы, а также ингибиторы трипсина, химотрнпсина и пепсина.

2. Между содержанием ферментов и белка, ингибиторов и белка, а также ферментов и ингибиторов была обнаружена положительная корреляционная зависимость (Р<0,05).

3. Высокое содержание протеиназ у бобовых растений делает их потенциально пригодными для получения протеолитических ферментов.

4. Установлено, что разные сорта одного и того же растения могут в существенной степени отличаться друг от друга по содержанию белка, протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ. ■4

5. В процессе онтогенеза плодов фруктов, побегов и листьев овощей, а также плодовых тел грибов наблюдается снижение количества белка. В процессе формирования бобов, зерен, орехов и плодов овощей, наоборот, происходит накопление белка. Уровень активности трипсиноподобных, хи-мотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ по мере развития всех исследованных анатомических частей растений понижается, а активность ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина возрастает. Наиболее интенсивной динамика этих показателей была в зернах, бобах и орехах, наименее интенсивной - в плодах фруктов.

6. Установлено, что в процессе хранения плодов в них происходит понижение количества белка и протеолитических ферментов и увеличение содержания ингибиторов протеиназ.

7. Протеиназы исследованных позвоночных по-разному угнетались ингибиторами каждого отдельно взятого растения. В наибольшей степени

угнетались ферменты карпа, а в минимальной степени - ферменты человека. Так, ингибиторы из сои угнетали трипсины карпа и человека на 100 и 24%, а ингибиторы из моркови - на 29 и 6% соответственно.

8. Химотрипсины во всех случаях угнетались слабее, чем трипсины исследованных животных. Так, ингибиторы протеиназ из сон угнетали активность трипсина и химотрипсина быка на 54 и 22% соответственно. ' 9. Пепсины исследованных позвоночных по-разному угнетались ингибиторами каждого отдельно взятого растения. Максимальную чувствительность к действию ингибиторов проявляли протеиназы судака, а минимальную - пепсины человека и утки. Так, ингибиторы из сои угнетали пепсины судака и человека на 64 и 24%, а ингибиторы из свеклы угнетали пепсины судака и утки на 14 и 4% соответственно.

10. Исследуемые растения находились в следующей последовательности по ингибирующей панкреатические протеиназы позвоночных способности: соя > фасоль >горох> пшеница > кукуруза > ячмень > рожь > картофель > цветная капуста > белокочанная капуста > репа > редька > свекла > морковь. При угнетении пепсинов морковь находилась на предпоследнем, а свекла - на последнем месте по интенсивности взаимодействия с протеина-зами; остальная последовательность растений сохранялась.

11. Установлено, что ингибиторы протеиназ исследуемых растений обладают высокой устойчивостью к температурным воздействиям. Ингиои-торы имеют различную степень устойчивости при кипячении в кислой, нейтральной и щелочной среде.

13. Активность ингибиторов протеиназ в некоторых растениях в значительной степени повышается в результате термической обработки. Гак, активность ингибитора трипсина в бобах сои сорта Фора повышалась на 490% в результате кипячения соевого экстракта в течение 5 минут при рН 9. Это происходит, вероятно, вследствие разрушения протеиназ при повышении температуры.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т. Содержание протеиназ и их ингибиторов в некоторых пищевых продуктах Краснодарского края. -В сб. : Материалы межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологи и охраны природы водных экосистем и сопредельных территорий". -4.2. -Краснодар. -1995. -с. 24-28.

2. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т., Причко Т.Г. Динамика содержания белка, активности протеаз и ингибиторов в яблоках при хранении. -В сб.: Тез. докл. межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий". -Краснодар. -1997. -с. 248-250.

3. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т. Содержание протеаз и их ингибиторов в некоторых сортах яблок. -В сб.: Тез. докл. межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных и центральных регионов России". -Краснодар. -1996. -с. 177-178.

4. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т.Влияние растительных ингибиторов на панкреатические протеиназы позвоночных. -В сб.: Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии". -Ставрополь. -1996. -с. 303.

5. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т. Влияние растительных ингибиторов на активность пепсинов позвоночных. -В сб.: Тез. докл. IV-ro симпозиума "Химия протеолитических ферментов". -Москва. -1997. -с. 93.

6. Ковалева О.В., Плотников Г.К., Проскуряков М.Т. Влияние термической обработки на ингибиторы растительных компонентов кормов. -В сб.: Тез. докл. международного координационного совещания "Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных". - Воронеж. -1997. -с. 80-81.