Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика коллагенолитических ферментов из гепатопанкреасов крабов Paralithodes camtschatica и Chionoecetes opilio

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика коллагенолитических ферментов из гепатопанкреасов крабов Paralithodes camtschatica и Chionoecetes opilio"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

КЛИМОВА Ольга Анатольевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСОВ КРАБОВ РагаПсЬсккв сашсзсЬааса и СЫопоесесеэ орШо

(03.00.03 - Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени ■ кандидата биологических наук

Москва-199 2

Работа выполнена в лаборатории функциональной энзимоло-гик Всесоюзного научно-исследовательского института генетики п селекции промышленных микроорганизмов и завершена в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетик!, РАН.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор А.Я.Стронгин

Официальные оппоненты доктор биологических наук Н.Б.Гусев

кандидат химических наук И.А.Сурова

Ведущая организация - Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина, РАН

Защита диссертации состоится " " в

" ¡4 ' часов на заседании специализированного ученого совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгене-тика.

Автореферат разослан _& А«^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

■ ' • \..J i i

..i.¡i» i

loprs^v«!") (

~ ВВЕЯЕНКЕ

Актуальность теки.Трипсиноподобние ?ернента из беспозвоночных давно известны, но изучена гораздо менее подробно, чен гомологичные трипсину сериновые протеиназы из млекопнтавзих, и кх специфические свойства такпе ценза подробно определены. Скорее всего, трипсина из- беспозвоночных, пак и панкреатические сериновие протеинази млекопитающих, участвуят s пищеварении, а не «ортогенезе. Крабовые протеинази из камчатского краба Paralithodes caatschatica и краба-стригуна ChJonoecetes opilio - это ферменты с й.ы. от 23 до 36 кВа, протеазы, гидролизуЕг.ие тзнрокка спектр синтетических н природных белковых субстратов. К току се, Серьеяти из крабов обладаат каллагенолятической активностью, расцепляя иатизннА коллаген при физиологических условиях рН. t к конной силн, и явлаптса, по су7и. представителями нозой группы коллаге-наз.

Исследования структура, свойстс этих фериентов, являвшихся представителями малоизученной группа трипсинов беспозвоночных (по Н-конце-выа ггосяедователькостяа 9 ферментов кз Í3, исследованных нами, относятся it тркпсииоподобным) вазгш для поникания связи структура ферментов с ик уункцкяии, а такзе путеА приобретения рермеитаин новнх функций в процессе зволпци::. Наличие коллагенолнтичсских активностей у фериен-тоз из крабов Paralithodes cant.5chat.ica и Chionoecetes opilio и сравнительная простота методов их получения делапт возаовна« их внро-кое применение в практике - в аедицине, лицевой и фармацевтической промышленности, в биотехнологии.

Т.о., разработка истодов получения ферментов из промысловых крабов и изучение свойств зтих оераентов васин для ревеиия ряда как Фундаментальных, так и практических задач современной молекулярной биологии.

Цель работа. Цельв данной работн являлась разработка простого и xoposo воспроизводимого в проявленных ааснтабах нетода получения комплексов ¡(оллагсизлатических феркентов кз гепатопанкреасов крабов, разделение комплексов на индизядцальнке компонента и сравнительное изучение природы п свойств зтих контшеигон,.

Научная новизна. Проведеннке исследования позволили разработать метод зыделениа и очистки комплексов коллагенолитнческнх ферментов из гепатопанкреасов камчатского краба Paralithodes caatschatica и краба-стригуна Chionoecetes opilio, разделать их на индивидуальные кои-

поненти и охарактеризовать по ряда свойств: Н-концевыи последовательностям, молекулярным иассаы, к рН-зависииости и стабильности, активностяа по отновешш к ряду синтетических и природных субстратов, отношение к ингибиторам и т.д. В настоящей работе выделены, сличены и охарактеризована по ряду свойств 13 ферментов," 9 из которых по Н-кон-цевыа последовательностям относятся к мало изученной группе трилсило-подобных ферментов из беспозвоночных. 2 имеют уникальные К-концевые последовательности, а один -с й.и. 23 кОа - является вторыа представителем новой группы иеталлопротеиназ. Бее полученные ферменты гидроли-зувт аирокий спектр белковых и синтетических субстратов, в том числе, нативннй коллаген, причем 2 фермента из 13 иыевт коллагенолитические активности выне, чем "истинные" коллагеназн из С1.Ыз1о1уисив.

Практическая значимость. Разработан метод получения комплексов кол-лагенолитических ферментов из гепатопашреасов камчатского краба РагаШ.Ьос1ез сааЬзсЬаНса и краба-стригуна СЫопоесе1ег орШо, не со-дераацих токсических и пирогенних прикесей, на 90-952 состоящих из белков, применявшихся в медицине, пищевой и фармацевтической лромыи-ленности, в биотехнологии под фирменная названием "С1се51азе". Этот препарат охарактеризован по ряду свойств: составу индивидуальных компонентов, стабильности и т.д., что позволило дать практические реко-ыендацин по его применения.

Структура работы. Диссертация построена по стандартному плану и состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсугдение", "Заклвчение", "Выводы", "Список использованной литература".

Апробация работы. Результаты работы были долокены на Ежегодной научной конференции Института молекулярной биологии (ДО СССР (Москва, 1391г.), на заседании Ученого совета ИМГ АН СССР (Москва, 1991) и на семинаре лаборатории химии белка ВНйИгенетйка (Москва, 1391).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение и очистка коллагенолитических протеиназ.

Предварительная очистка.

Суикорннй препарат белков, экстрагированных из гепатопанкреаса камчатского краба, отделяли от нерастворимых в воде приыесей суспен-дированиеы в водном буферном растворе с последующий центрифугированием и гель-фильтрацией на 5ерЬабех £-75. Фракции тестировали на активность по гидролизу желатиновых пленок, объединяли, удаляли соли с помоцьв

- 3 -

системы "Pelicon" я лиофкльно высуживали.

Полцчешш индивидуальных протеиназ.

Злектрофоретически гомогенные препараты получали с помощью ионообменной FPLC на колонках Нопо Q к DEAE-Toyo Pearl и хроматографии гидрофобного взаимодействия на колонке Phe-S'jperose.

Определение молекулярного веса протеиназ.

Молекулярные кассы коллагенолитических протеиназ из гепато-панкреасов крабов определяли с помощье электрофореза по методу Laesmli (1970) и KPLC гель-фильтрацю на колонне Zorbax GF-250.

Визуализации протаолитической активности ферментов проводили с помощьп электрофореза образцов в PfiAG, содервацеа 0,1% Gelatin.

Определение концентрации белка.

Концентрации белка в препаратах определяли по методу Bradford К. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Определение иоллагенолитиче::кпй дктггег-гзсти.

Коллагенолктическуш активность определяли с использованием [ ^ С]-ацетилированного коллагена.

Определение общей прогеолитяческой активности проводили с использованием азоказеяна.

Определение активности индивидуальных ферментов по отношении к синтетическим субстрата».

Активности выделенных индивидуальных ферментов по отношении к синтегическик субстратам: PZ-пептиду С 4-фенилазобензил-оксикарбо-нил-Pro-Leu-Gly-Pro-D-flrg), ВТЕЕ Сэтиловокд эфиру И-бензоил-Ь-тирози-на), ВЙЕЕ (этиловому эфиру бензоил-Ь-аргинина). BflNrt (р-нитроанилиду бензоил-1-аргинина), N-ftc-iflJa )j-pNfi определяли по стандартным методика».

Анализ Н-концевых последовательностей.

Анализ N-концевих последовательностей выделенных индивидуальных протеиназ проводили деградацией по методу Эдмана на автоматическом сиквенаторе Весквап Hödel 890С с использование« 1 М квадролового буфера. РТН-производнне аминокислот разделяли и идентифицировали с по-мощьо HPLC на колонке Zorbax РТН (DuPont, 4,6x250 an).

Авипокисаотпай анализ.

Аминокислотный анализ протеиназ проводили на аминокислотной анализаторе Виггив В500 после полного кислотного гидролиза образцов 5,6 Н НС 1 под вакуумом при 110° С в течение 24 час. Для определения Суэ и Ней аминокислотных остатков для анализа были использованы образцы, окисленные перхлорной кислотой. Содервание Тгр определялось после гидролиза белков иетансульфоновой кислотой.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЕДЕНИЕ.

1. Биделение и очистка коллагенолитических протеиназ из гелатопанкреасов камчатского краба 1'ага1НЬо;1е5 сасйБсИаиса и краба-стригцна С1попоесе1е5 орШо.

В качестве исходных препаратов для выделения и очистки индивидуальных коллагенолитических ферментов использовали суммарные препараты белков из гелатопанкреасов камчатского краба РагаПЬЬойе$ сав1зсЬа11са и краба-стригуна СЬлопоесе1ез орШо.

Для освобокдения препарата от небелковых примесей наиболее подходящий методом, хорово воспроизводимым и даищи* возможность получать препараты с хоровим выходов, является гель-фильтрация. Препарат растворяли в водном буферной растворе и центрифугировали. Полученные при экстракции супернатанты наносили на колонку с $ерЬаёех Е-75. Использованный сефадекс Е-75 не позволял фракционировать целевые белки из-за. их близких молекулярных весов (23-36 кОа), но эффективно отделял их от прочих небелковых компонентов. Полученные активные фракции тестировали на активность по гидролизц желатиновых пленок, собирали, удаляли соли с помочь» систеиы РеПсоп и лиофильно высушивали. Полученный таким образом препарат содераал около 907. белка и незначительное количество пигментов. В соответствии с результатами электрофореза в поли-акриламидном геле в препарате "С1ве51азе", полученном в результате гель-фильтрации, содервался набор иамрных белков с молекулярными массами 23-36 кБа и минорные белки с молекулярными массами 37-65 Ма. По результатам НРЬС гель-фильтрации на колонке гогЬах ЕР-250 молекулярный вес активных по гидролизу аелатина протеиназ составлял 23-38 кВа. Соответственно, фракционирование, очистка и изучение свойств именно этой группы белков и стало навей задачей.

Рис.1. Схема разделения комплекса протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба на индивидуальные компонент«:

Суиыарный препарат белков из гепатопанкреаса _камчатского краба_

гель-фильтрация

на Sephadex G-75

¡препарат белков с П.и. 23-56 klJa ("Uigestase")

ионообкбнная FPLCvHa MonoJ3

Индивидуальные _¿_

протеикази:

Сракционирование сиеси протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба проводили с помо^ьи FPLC на ионообменной колонке Mono Q. Профиль элвции изобраден на Рис. 2.

10 30 SO tfO 50 во 70 SO 90 too

Зтот метод позволил лимь частично фракционировать смесь протеоли-тических ферментов, при этом 4 фермента были получены в гомогенном

состоянии: i - с молекулярной массой 28 кВа и 3 - 36 кВа (Рис. За).

[_

i г

i 2 з ч 5 i г з н 5 i г з ч ¡

Рис.З(а-в). 1 - суммарный препарат, 2 - "28 kDa", 3 - "36 kDa-fl", 4- "36 kDa-B", 5 - "36 kDa-C".

При этом ферменты с молекулярной массой 36 kDa различались по своим свойствам: по времени выхода с ионообменной колонки (в соответствии с этим препараты с молекулярной массой 36 kDa в дальнейвем будут называться "36; kDa-A", "36 kDa-B" и "36 kDa-C"), субстратной специфичности, удельной активности по различным субстратам, Н-концевым последовательностям. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле без обработки образцов TXU наблюдался автолиз всех гомогенных препаратов: протеиназа с молекулярной массой 28 kDa превращалась во фрагмент с М.и. 23 kDa, а протеиназы 36 kDa-fl, 36 kDa-B и 36 kDa-C - во фрагменты с К.ы. 19 kDa, 16 kDa и 11 kDa соответственно (Рис. 36), причем все эти фрагменты обладали высокой протеолитическиой и коллагенолитической активностьи. Это было потверждено электрофорезом протеиназ в PAflG, содержащем желатин (Рис.Зв), а также элицией фрагментов из геля с после-дувцим определением их активности по гидролизу азоказеина и нативного коллагена. Однако, обработка протеиназ i'¿ раствором SDS в течение 1 час перед проведением электрофореза с последующей инактивацией ТХ9 давала иной набор фрагментов. Очевидно, для образования активных в отношении белковых субстратов фрагментов с М.и. 23 kDa, 19 kDa, 16 kDa и И kDa принципиально важны не только время, температура обработки

протеиназ SDS, приводящая к их автолизу, но и высокая концентрация белка в полосе при электрофорезе.

Суммарный препарат белков из гепатопанкреаса краба-стригуна Chionoecetes opilio был получен при помоци усовершенствованной технологии с применением иикро- и ультрафильтрации и не содержал многих прииесей, затруднявних работд с препаратом из камчатского краба. Однако, прегде чей приступить к разделении снеси протеиназ на индивидуальна форкы, необходимо было такае избавиться от больного количества балластных белков, а тагае солей (преинущественно, На2С03). Для этого была такге использована гель-фильтрация на Sephadex G-75.

Дальнейшее фракционирование вклвчало в себя ионообменнуа хроиа-тографив на DEfiE-Toyo Pearl и хроматографии гидрофобного взаимодействия на Phe-Superose и ионаобиеннуп хронатогра(?иэ на ионообкенине Иопо Q.

Рис. 4. Схема разделения снеси протеиназ из гепатопанкреаса краба-стригуна на индивидуальные компоненты.

взаимодействиня на Phe-Superose на Mono Q

Индивиддалъные ___|_

протеииазя: 125 kDa-II 135 klfo-U 125 kDa-Iil

ШкРа! 12В kUal 136 küal

Десорбция белков при хрскагсграфии на колонке с DEOE-Toy'o Pearl 650М достигалась повыяекием ионной силы элпирувчего буфера. Профиль

элвции изображен на Рис.5.

визировали методом электрофореза в присутствии SDS (Рис.6.). Рис.6. Злектрофореграима фракций с DEflE-Toyo Pearl (2-19) и исходного препарата (1).

i 2 3^ 5 6 78 9i0iUZiii4 1516 17 18 19

911кщг Ь5кЩ

29 кЫ

20 Щ

На этой рисунке ковно сидеть, что исходный препарат содеряит несколько белков с одинаковой нолекулярней массой, но отличающихся по хроматог-рафичееккм н, как будет показано далее, энзинологическим свойстпам (2 белка с молекулярной ггассой 35 kDa и 3 - 25 kDa), эти белки были назван» в порядке элшревагшя с OEflE-Toyo Pearl и з дальнейшем будут именоваться 35 kDa-I, 35 kDa-II, 25 kDa-I, 25 kDa-II и 25 kDa-lII. При этой белки с молекулярными массами 32 kDa, 25 kDa-1, 28 kUa и 35 kDa-I, элвирупциеся при относительно пмзкой концентрации NaC] ( or 0,1 до 0,5 И), разделяется плохо (Рис. 5,0.), а белки, более прочно связанные с ионообкенником, - с нолекулзрннми иассани 23 kDa, 35 kDa-I, 25 kDa-I11 десорбируится с колонки практически в гоиогенном состоянии; фракции, содерзаеме белки 35 kDa и 25 kDa-II, нуздаптся в рехроаатографии (Рис.5,и).

Ораицни, полученные при хрокатографии на ЮЕ-Тоуо Pearl и со-дернацие протеинами с ц.м. 25 kDa-II и 36 kDa, рехроматографировали на ионообиеннике üono Q СРис.?а). При этом ферменты 36 kDa и 2b kDa-II были получена в гомогенном состоял:;:!.

/¡ля разделения менее сильно заряженных белков использование Mono 0 было неэффективно, для этого бил использован метод хроматографии гидрофобного взаимодействия. Профиль элпц;;м оптимизировали в соответствии с индпвиддасьпнки свойствами кзтг.ого б«згка. Так, элиции фракции, со-церпач^З напболеэ гидродолык:? из всего набора исследуемых белков 25 <1)а-1, начинали при концентраим:; едльфата аинония 1 и (Рис.76), ос-галыше бглкч злпроваяись с преде;;-:; концентрации сульфата аммония 5.1-0,3 Н (Рис.7в),

Аыо — [(m^soJ.M

4 Л fjO

ю го зо

но so so

rnt

10 2 0 50 40 50 SO- 70 80 SO

ml

s

Рис.7. Рехроматография фракций с DEfiE-Toyo Pearl на колонках Mono Q Ca) и Phe-Superose (б и в).

Злектрофореграмиа индивидуальных протеиназ, выделенных из гепатс-панкреаса краба-стригуна, в порядке их злвирования с ионообыенника ЗЕйЕ-Tovo Pearl приведена на Рис.8.

1 2 -3 4 S 5 7 с Ч !й

Рис.8. Злектрофореграмма индивидуальных протеиназ из краба-стригуиа в порядке их элвции с нонообменника: 1- исходный препарат, 2- 32 кОа, 3- 25 кВа-1, 4- 28 кБа. 5- 35 к0а-1. 6- 23 кПа, 7- 35 кОа-Н, 8- 25 кОа-П, 9- 36 кИа, 10- 25 кОа-Ш.

2. Активность выделенных ферментов по отноаениа к синтетическим сцбстратам.

Выделенные из гепатопанкреасов камчатского краба и краба-стригуна протеазы били изучены в отношении их активности и каталитических свойств с использованием синтетических коротких пептидов, а такае белковых (азоказеин и коллаген I и Ш типа) субстратов.

Данные по активности полученных из крабов протеиназ по отношению к низкомолекулярным синтетическим субстратам свидетельствуют, что больпинство этих ферментов родственны панкреатическим сериновым протеиназам млекопитающих и гидролизупт низкомолекулярные синтетические эфирные субстраты, используемые для тестирования трипсина, химо-трипсина и зластазн (Табл. 1.).

Табл. 1. Активность ферментов из краба-стригуна по гидролизу синтетических субстратов протеиназ.__

Тип Вктивнасть, мкмоль/мг фермента за мин

фермента ВТЕЕ ВАНА ВПЕЕ Ас-А1а-(Па-й1а-Нй Рг-пептид Смесь '

ферментов +- + + 0,08 +-

36-кВа +- 0,611 234,6 +- +-

35 кВа-1 +- +- 0,9 0,18 +-

35 к0а-1I +- 0,403 101,7 0,20 +

32 кОа +- +- + 0,15 +-

28 кВа +- +- +- 0,30 +-

25 кПа-1 +- + 0,12 +-

25 кВа-П 6,4 +- 5,2 +- +-

25 кВа-Ш 6.0 +-- 0,6 +-

23 кВа +- + 14,2 0,29 +■

трипсин _7500_

+ -слабо вцрааеннгя активность +- -очень слабая активность

Табл. 2. Активность ферментов из камчатского краба по отновенив к сиь

Тип • Активность, мкмоль/мг фермента за мин

фермента ВТЕЕ ВАКА ВАЕЕ Ас-й1а-й1а-А1а-Ий Рг-пептид

Смесь

ферментов 0,38 0.013 6,07 0,025 +-

26 кйа 0,20, 0,217 12,26 4- +-

36 кБа-С. 0.29 +- - +- 0.105 +-

-очень слабая активность

Кинетические параметры С Кс и Usax) протеиназ из гепато-папкреаса краба-стркгуна, полученные с использованием стандартных зс-теразкык и акидазявх субстратов, приведены в Табл.3.

Табл.3. Кинетические характеристики протеиназ кз краба Chionoecetes opilio.

Фермент Kb, М"1 Usax, коль/нин на иг фермента

ВТЕЕ BASE BMfiA^la)fpKfl ИТ ЕЕ DflEE ВАКА АсШа^-рНГ

2x10^ 2x1 С'5 1x10"! 2x10"3

36 kDa 8к102x10"1 _ь

35 kDa kDa-II 2xlo£lxl03 7x10 Я 1x10

32 kDa 3x1 Oli _2 2x10 r

28 kDa 1x10,1 5x10 * 3x10 I 3x10°

25 kDa-1 -ь 7x10_ь 1x10"?

25 kDa-II 2к 10_ь2x10,1, 8x104. 2x10",

25 kDa-III 2xlC ч4х10 и -ц 12з:10 4 lxiOi -у

22_kil?„_Lii£__bpi____________SxiiL......

i.e.. протеази sis крабов cnocoOiu реагировать со ыниГиии

сибстр?те::;1, катализируя рЪсцзпдеине апвдкик и зфкршх связей, вклачая и положительно згрянснгис, и ароматические ашшокислотнне остатка!. Ка-талкткческая эффективность протеаз »:з крабов, однако, значительно ниве, чек у кругах евр^иознх протеиназ по отношении к соответствуо;;':;: ии субстратам. Крана того, синтетический субстрат эластазн fsc-iП1 а>3 -рМЙ такае гидрог'-здетсв бсяьвинством протеиназ нз крабов, однако, с на 1-2 порядна иакьизй .а£г58К«Ж5носгьа, че^ гршениовве и ^иотрипегпгпвке субстраты. Значение К:., для больиииства феркеитов из крабов отлпчавт-ся от соответствуЕДИХ панкреатических сериновых протеиназ лнгъ нззна-чительно: в 4-6 раз. Sipa6oBKe феркеати предпочтительно гкдролизуш субстраты, ео^ериацие более длинные пзлвпептидные цепи. 3 г о хоропо согласуятст с результатами, полученными для протеиназь' мз ыапяцего краба Uca pugilator: Kcat. для этого фермента по огнояешш к Bz-flrg-Ha в 150 раз нкие, чек для Bz-Ual-Gly-flrg-Ш, это совпадает с предварительными наблиденияаи, что взаимодействия во вторичных сайтах связывания вносят значительный вклад в каталитическую эффективность серянових протеиназ. Похожий эффект наблвдается и для трипсина с тем пе наборов субстратов.

3. Каталитические свойства протеиназ из крабов по отнавении к белковый субстратам. Данные по расцепленка различных белковых субстратов С коллагенов I и IU типов, казеина, азоказеина и геноглобина) пратеиназаии кз краба-стригуна и камчатского краба приведена в Табл.4,5.

Табл.4. Удельная активность феркантов аз гепатопанкреаса краба-стригуна по отноасшш к белковин субстратам: натизксиу кол.пдгону ' тчпа и азо-казеину.

Тип Удельная активность с использованием

фермента Коллагена типа I, Пзоказгина

ккг субстрата/нг фермента за чес оптич.пд./иг фермента за час

30 кОа 1860 170

35 кБа-1 205 35

35 кПа-П 161 150

32 кПа 40 26

28 кБа 640 320

25 к0а-1 1403 180

25 кВа-П 230 370

25 кВа-Ш 659 141

23 кВа 2038 320

снесь протеиназ 650 450

из крабов

трипсин 25 420

С1оз1.г1с11ия Мз^уИсиа

коллагеназа 1 1416 0

коллагс,паза II 1854 0

Габл.5. Удельная активность ферментов из гепатопанкреаса кднчатского <раба по к отноиении к белковый субстратан: нативному коллагену I типа, ¡оллагену 1и типа, казеину и гемоглобину.

Гип Удельная активность с использованием

¡¡ераента Коллагена Казеина

I типа Ш типа

ш;г субстрата/иг фермента

Гемоглобина

,ыесь фотеиназ !8 кБа ¡6 кБа-А ¡6 кБа-В >6 кВа-С

660 264 208 299 386

516 384

486

63600 23280

25920

1000 0

1170

Полученные результаты свидетельствунт. что эффективность протео-лиза крабовыми ферментами полипептидных субстратов (за исключением коллагенов) близка к трипсину. Это отличается от результатов, полученных с низкоиолекулярниии синтетическиии субстратаыи, и предполагает, что взаимодействия "вытянутых" субстрат-связнваизих участков с

субстратами когут играть для крабовнх протеиназ вапнув роль.

Все форыы проявляли активность как по отнокенкш к азоказеину (общая протеолитическая активность), так и к коллагену (коллагенолктичес-кая активность), однако соотновение обцей протеолитической и коллаге-нолитической, а такие удельной активности по кавдому субстрату для всех форм было различным. Наиболее активными коллагеназаии являются протеиназы с К.в. 36 кВа. 25 кВа-1 и 23 кВа, по удельной активности превосходящие коллагеназы из С1озЬг1(Ииа Ьуз^^Мсш. Наиболее активными обеими протеиназаш является формы 28 кВа, 25 кБа-П и 23 кВа СТабл.4).

Крабовые протеазы - фериенты различной природы, главным образом, трипсиноподобные ферменты, имевшие лирокуе субстратную специфичность, и эффективно гидролизув1;ие вкрокий спектр белковых субстратов, исполь-зуемкх для тестирования трипсина, химотрипсина, эластазн и микробных коллагеназ.

Сравнительно вирокая субстратная специфичность, наблздаемая для крабовых протеиназ при Использовании полипептидных субстратов, такие характерна для них и при использовании низкомолекулярных синтетических субстратов. Однако, для всех синтетических субстратов (Табл.1,2.) скорость гидролиза гораздо ниве, чем для более селективных панкреатических протеиназ. Наоборот, для более длинных полипептидных субстратов скорость гидролиза крабовыми фериентаыи сопоставима, а в отдельных случаях и выие,, чек для трипсинов и микробных коллагеназ. Известно, что для больвинства сериновнх протеиназ из различных источников скорость гидролиза увеличивается с увеличением длина лептида за счет вторичных взаимодействий субстрат'-связывапщего участка с субстратом. Интерпретация точной природы такого взаимодействия и факторов, опреде-лявцих субстратнув специфичность и эффективность катализа на структурном •уровне, возмо!ны только на" основании сведений о первичной и пространственной структуре ферментов из крабов.

4. Действие ингибиторов на ферменты из крабов.

Специфические свойства протеиназ также изучались путем исследования эффекта различных сайт-специфичных ингибиторов протеиназ. Табл.6. Действие ингибиторов на ферменты из крабов (в реакции гидролиз азоказеина).

Тип фермента истаточная активность.^ Без ингибитора, U ингибиторами: EDTfl PMSF Iodoacetlc DTT pCMB TLCK TPCK add

I.Камчатский краб:

Смесь

протеиназ 100 80 42 70 70 100 58 66

28 kDa 100 80 35 35 65 70 90 85

36 kDa-fl 100 105 100 88 90 97 95 80

36 kDa-B 100 100 96 75 68 75 87 63

36 lcDa-C 100 84 56 87 65 70 77 66

11.Краб-стригун:

Сиесь

протеиназ: 100 80 38 75 68 108 _ _

36 kDa 100 110 100 100 92 100 11 56

35 kDa-I 100 65 50 55 50 110 54 77

35 kDa-II 100 87 65 87 82 84 59 78

32 kDa 100 00 42 60 46 70 30 61

28 kDa 100 78 13 79 70 85 92 80

25 kDa-I 100 11 100 83 39 145 107 25

25 kDa-II 100 100 2 81 90 96 90 90

25 kDa-III 100 98 3 65 87 89 97 33

23 kDa 100 85 66 97 70 82 84 86

По результатам, приведенным в Таблице 6, протеиназа с M.w. 28 кВа на 902, а протеиназы с Н.и. 25 kDa (II и III) - практически полностьи ингибирувтся PMSF, что позволяет их отнести к сериновым протеиназаы.

Протеиназа с И.ы. 25 kDa-I практически полностьи теряет активность в присутствии 1 мЫ EDTfl, что свидетельствует о ее принадлежности к классу металлопротеиназ (или металл-зависимых ферментов); однако, все остальные исследуемые протеинази такяе проявляли большую стабильность в присутствии ионов кальция.

Протеиназа с М.и. ЗВ kDa на 90У., а 32 кВа на Ж/, ингибировались TLCK, а 25 kDa-I и 25 kDa-II на 80Z и 70Z соответственно - ТРСК, что свидетельствует о наличии в их активном центре His.

В отнопении остальных протеиназ на основании их отнояения к тем или иным ингибиторам однозначные выводы относительно их природы сделать не удается.

Тот факт, что ни один из крабовых ферментов не ингибируется полностью хлорметилкетонани, очевидно, содергацики аминокислотные остатки, по которым протеиназы из крабов расцепляит полипептидные и синтетические субстраты, и могут алкилировать нуклеофильные группы в активных центрах тестируемых протейназ, наводит на ннсль, что нуклеофильные группы в активном центре не сбливены пространственно с метиленовой группой. Хотя система передачи заряда, существующая в активных центрах сериновых протеиназ, необходима для

проявления протеолитической активности, геометрия связывания хлорме-тилкетонов мокет быть такова, что алкилирование His в активном центре не происходит. Аналогичное отсутствие алкилировния откечено g протеи-назы из краба Ilea pugilator и субтилизина.

5.Зависимость активности ферментов из крабов от текперзгцры (в реакции гидролиза азокззеина). 8 качестве буфера использовали 50 uU Трис-HCl, рН 7.5, содержавший 3 вИ СаС1д.

Оптимальной температурой практически для всех ферментов являем температура 3?°С, однако ферменты из крабов проявляит аномально высокую активность (по сравнению с трипсинов) yse при 4°С, что mobbi играть важную роль в физиологии глубоководных камчатского краба i краба-стригуна.

Табл.7. Зависимость активности ферментов из крабов от температура в

реакции гидролиза азоказеина._

Фермент Активность при температуре, оптич. ед./мг фермента за час

1.11ротеазы из камчатского краба

Смесь протеиназ 127 346 470 357

протеиназы:

28 kDa 65 200 282 235

36 кПа-А 38 64 95 88

36 kDa-B 30 72 110 101

36 kDa-C 67 223 305 234

II.Протеиназы из краба-стригуна 346 450 375

Смесь протеиназ 118

протеиназы:

36 kDa 88 135 170 160

35 kDa—I 24 30 35 17

33 kDa—11 S5 137 150 188

32 kDa 20 22 26 15

28 kDa 79 210 320 202

25 kDa-I 56 115 180 170

25 kDa-II 150 350 370 335

25 kDa-I11 88 122 141 140

23 kDa 143 298 320 282

Трипсин 84 303 420 333

6.Зависимость активности ферментов из крабов от рН. (в реакции гидролиза азоказеина).

Для определения зависимости активности протеиназ из гепато панкреасов камчатского краба и краба-стригуна от рН использовалис следупщие буферные растворы : рН 3,0-рН 5,4: 50 жМ ацетатный буфер содержащий 3 аК СаС1-; рН 6,1-рН 9.1: 50 мН Трис-НС1, содержащий 3

e!Î CaC ; CaCÎ2.

pH 9.7-pH 12.1:

17 -

50 в И

монозтанолаыян. содержаний 3 шН

Габл.8. Зависимость активности протеиназ от рН.

)ерк8кта

рН 4

.Камчатский imai

Активность фермента по гидролизу азоказеина, У.

(за 100Z приняли активность при рИ /.5) 1 рН 5,0 рЯ 7.5 рН 9.7 рН 10.5 г>Н 11.0 рН 12J

!8 kDa 16 kDa-ft ¡6 kDa-B ¡6 kDa-C :уамарннй гоепарат

10,1

2,2

42.3 22,2

45.4 30,4

100 100 100 100

69,8

65.5

76.6 69,2

68,0

36.0 48,3

58.1

Î.Краб-стригун:

15,1 43,3 100 30,0 25,4

16 kDa 15 kDa-î >5 kDa-11 12 kDa 18 kDa !5 kDa-I :5 kDa-II !5 kDa-III 3 kDa уымарннй ;репарат II.Трипсин

1.8 17,1

19,7 6,1 67,0 2.1

5,3

15,6 15,0

33.5 31,4

55.0 42,3

53.1 17,3 81,1 30,3

15.6

42.2

33.3

100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100

67.6 57,1 80,0 92,3 73,8 77,8 37,8

68.7

50.0

31.1 88,1

55,3

70.0

71.2 66.7 29.7

50.2

43.3

24.4

80.1

Ь5.0 14,1

22.4

45.5

10,8

43.5 55,3

65.6 55,6 24,3 35,5 28,1

11.1

59.5

48.8 1.2

8,8 6,6

4,6

5,9

6.6

62.5

55.6 5,4 2,1

21.9

4.4

33.3

абл. 9. Зависимость активности фермента 25 kDa—II из гепатопанкреаса раба-стригуна от рН (по гидролизу азоказеина).

ермент

5 kUa-11 уммарный репарат

Активность фермента. 7. ИОО/i - активность при рН 7,5) рН 3.0 рН 3.2 рН 3.6 рН 3.7 рН 3.8 рН3.9 рН4.1 - 4,2 11,5 20,5 33,8 42,4 67,ТГ

1.1

1.8

2,2 3,9

_UL

16,6

- активность не наолпдалась

Максимум активности все ферментн проявляют при рН 7,5. Ферменты сохраняют активность в вироком диапазоне рН, например, фермент с молекулярной массой 25 к0а-П активен д«е при рН 3.68 (Табл.3), а ферменты с молекулярными массами 28 кОа и 25 к0а-1 сохраняет активность при рН 12,1. При рН ни«е 3,0 все фермента необратимо инактивирувтея.

- 18 -

?. К-концевае последовательности ферментов из крабов.

Табл.10, ti-концевыс последовательности ферментов из крабов Paralithodes caatschatica и Chicnoecetes opiHn (Я,10) и пищеварительных ферментов из других источников (1-8, 11)

Тип

фермента

M аминокислотного остатка

1.Бычий химотрипсин Й

2.Бычий трипсин

3.Трипсин свиньи

4.Трипсин лангуста

3.Трипсин личинки овода

6.Протеаза Б ($1герЬоЕусе5 бг1сеаз)

7.^.-литическая протеаза (М1хоЬас1ег 495) й И

8.Ферменты краба Оса ривПа1ог: "23 кВа-1"

"24 кСа-П"

9.Ферменты камчатского краба: 28 кРа

лаайа-Ш кОа

1

10

20

ju k.uc1-26 kflet -и. -В

10 Орпмвит стригуна:

35 kUa- -11

28 kDa

25 kPa- -II

25 kPa- -III

32 кРа 35 кРа-1 23 кРа

11.Протеаза из лангуста jflstacus.fluviali i1 g

1 U 11 G H t A U P G S U i' H « U s L U У

I U G G Y T С G A H T и P Y Q и s L H S

I и G G Y T С A A N s ï P Y Q и s L H s

I и £ G T D A T L G E F P Y Q L s F 3 H

I I H G Y E A Y T G L F P Y Q A G L D I

I S G £ D A I Y S S T G R С S L G F N Y

I и G G I E Y S I H К A S L С S U G F S

I и G G U E ¡1 y F L s H P H 9 Й fi L F I

I и G G a D Й t P ь a F P Y Q L S F Q U

I и G G Q E A S P G s W P X Ц U G L F F

I и G G T E U i V G E I P Y Cl L S L Q U

i i. и G G T E i; V T p G E J P Y Q L ¡5 F « U

i и G G s E A ï S G a F P Y Q X S F «É и

l и G G T E U ï p r, F I P Y Q 1. s L a il

s I и G G T E U г p ь £ 1 P Y 0 L i Y a и

r и G G Q E fi s p G S a P К Q U r u L с i'

i u G G 0 E A T p H T u U H a U A L К I

I и G G Q E A T p H T H U H Q и fl L F !

A M D X T A Y X D Y D E I Q A X L К G i.

A F D Л T N Y и T F E E I N S I L D G и

A А I L G D E Y L X С P G G U 0 p Y :Ï F «

A П I L G D E Y L H S G G U U P Y T F h

Аминокислотные последовательности первых 20-ти аминокислотных остатков (Табл.10.) свидетельствушт, что 9 протеиндз из 13, изучаемых в-данной работе, относятся к трипсиноподобпын и происходят от родственных генов. Хотя протеиназы из крабов гомологичны вссы "трипсинам", наибольвее сходство наблпдается с протеазами из канящего краба Uca pugilator. Однако, это сравнение проводилось для сегментов, составляющих менее 107. длины каядого полипептида, и различия между полными аминокислотными последовательностями могут быть более значительными. Так, Н.ы. этих протеиназ составляют от 23 kPa(Uta pugilator) до 36 kBa (крабы Paralithodes caetschatica и Chionoecetes opilio). 2 фермента - с К.«. 32 kDa и 35 kDa-I имеют уникальные Н-кон-цевые последовательности, а протеаза с К.к, 23 kDa - наиболее активная

оллагеназа - является вторым представителем новой группа неталло-ерментов, впервые обнарувенннх у лангуста Astacus fluviatilia. ернент из fistacus fluviátil is не исследовался на коллагенолитическу® ктивность, но сходство иеаду этими двумя фериентами предполагает, что н аозет проявлять такув активность, и эти ферменты из Decapotia аеат структурные особенности, позволяющие иы эффективно гидролизовать азличние типы нативного коллагена.

Протеиназа 20 kDa из камчатского краба, аминокислотннй состав ко-орой был нааи определен, характеризуется повывенним содержанием киг.-ых - fisp и Glu - и низким содерваниеи основных - Lj/s и Пгр - амино-ислотных остатков, что согласуется с низкой нзозлектричсской точкой pl низе 3) и характером злвции с иоиообнениика. Наличие 10 остатков ys предполагает у протеиназы 28 кПа из краба Paral it.hodes aatschatica образование дополиитсльнпх (по сравнению с больвинством ериновнх протеиназ из беспозвоночных) дисульфкднах связей.

вывода

1. Разработан иетод получения препаратов коллагенолитических фер-ентов из гепатопанкреасов камчатского краба и краба-стригуна и очист-н их от небелковых компонентов и балластных белков без потери биоло-ической активности.

2. !1з слокних многокомпонентных сиесей выделены девять (из краба-тригуна) и четыре (из камчатского краба) индивидуальных протеолити-;зских Фсраентов с молекулярными кассами в диапазоне 23-36 кПа с использованием комбинации хроаатографических методов: гель-фильтрации, онообненной хроматографии на колонках DEñE-Toyo Pearl и Mono-Ü и хро-атографии гидрофобного взаииодействня на колонке Phe-Superose.

Гомогенность выделенных препаратов подтверждена рехроиатографией ¡а колонке с Íiono-Q и электрофорезом в поляакриламидном геле в лрисут-твки SDS.

3. Определены !1-концевые последовательности 12 из 13 выделенных [ротсиназ. Судя по К-концевнм последовательностям, по крайней мере, I ферментов относятся к тркпсинсподобныи, 1 - является вторим предста-ттелеа новой группи иеталлопротеиназ, аналогом протеиназы, выделен-¡ой Titani и др. из лангуста fistacus fluwlatilis.

4. Изучены обцая протеолнтнческая и коллагенолитическая активнос-•н выделениях ферментов. Все формы проявляли активность как по отмове-|ип к азоказеину (общая протеолитическая активность), так и к кл,-.-.-,ге-iy (коллагенолитмческая активность), однако соотнопение ofs'ü п-г.тео-штической и коллагенолитической, а такие удельной активности пс кы ioay субстрату для всех фор« бнло различии«. Наиболее активными ког.лз

геиазаци является протсииазы с и.ц. 30 kLIa, 25 kl)a-I и 23 kUa. п удельной активности превосходящие коллпгенази из Clostridiu histolytica. Наиболее активними обшиыи протеиназаии являются форми 2 kDa, 25 kDa-II н 23 kDa. Изучена субстратная специфичность протеина на низкомолекулярних синтетических пептидах. Показано, что они прояв ляит различнув активность по отновении к синтетический субстратаи дл трипсина (аиидазнзя к эстеразная активность), хииотрипсина и эластазы Несколько фора так£е проявляет слабуп активность по отнозенип PZ-пептиду - субстрату для "истинных" коллагеназ (клостридиальнах).

Список работ, опубликованных по тека диссертации.

1. Клиаова О.й. (1991) "Выделение к характеристика коллагеаолит1 ческих протеиназ из крабов", Тезиг.ц Еесгодной научной конференции IU ститута молекулярной генетики ЛИ СССР. Косква, стр. 2?.

2. KlUova O.A., Dorukhov S.I., Solovyeva К.I., Balaevskaya T.0, Strongin A.Ya. (1530) "Isolation and properties of the coHagenolyt: enzyses fron crab hepatopancreas", Biochea. Biophys. Res. Cosaun 166, 3, 1411-1420.

3. Клиаова O.A., Ведицева B.B., Стронгин A.S. (1991) "Выделени; очистка и характеристика коллагснолитических ферментов из гепатопаш реаса краба-стригуна Chionoecetes opllio". Докл. Акад. Наук СССР, ЗГ 2, стр. 482-484.

4. Sova U.U., KliDOva O.A., Strengin A.Ya., Stadnikov U.I. "Ti eethod of production of the collagenolytic enzyEcs fron er. hepatopancreas using seabrane technology", European Pate Application, Publication fiuBber: 0402321, Application fiuab 90810420.1.

Огайо а набор 24.02.92 В начать 26.02.92

Формат 60x901/16 __Печать офсоталз

Усл. тач, л. 1,25 Усл. кр.-отт. 1,37 Уч.-ззд. л. 1,41

Тгр. 100 эаз. Заг. 1243

Проазаопстеевно-азцагепьсЕай Еомбгпат ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, MockoecsoE обл., ОктийрьсияЛ npocjicsr, -403