Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические и биохимические аспекты культивирования камчатского краба
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические и биохимические аспекты культивирования камчатского краба"
На правах рукописи
Загорская Дарья Сергеевна
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАМЧАТСКОГО КРАБА
03.00.23 - биотехнология, 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 О ДЕК 2009
Щелково - 2009
003488098
Работа выполнена в ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО)»
Научный руководитель:
доктор биологических наук Ковачева Николина Петкова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна
доктор сельскохозяйственных наук Жигин Алексей Васильевич
Ведущая организация:
Российский Государственный Аграрный Университет - МСХА им. К.А. Тимирязева
Защита состоится "25" декабря 2009 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, п. Биокомбината, ВНИТИБП, E-mail: vnitibp@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.
Автореферат разослан "24" ноября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Культивирование камчатского краба Рага1Шюс1е$ сат1$скаИсиз - это новое направление в марикультуре. Ввиду того, что ракообразные заметно отличаются от других объектов аквакультуры (рыб и моллюсков), их культивирование в искусственных условиях должно базироваться на оригинальных подходах, разработка которых требует детального изучения биохимических процессов, происходящих в их организме в ходе линоч-ного цикла. Разработка системы контроля физиологического состояния крабов, включающая в себя ряд биохимических показателей органов и тканей, а также оценки эффективности технологии культивирования ракообразных являются крайне актуальными.
Одной из важных проблем, возникающих при культивировании ракообразных, в частности камчатского краба, является преодоление линьки. Для ракообразных этот процесс является наиболее энергозатратным и часто сопряжен с фатальным исходом. Выжившие после линьки особи с ограниченной подвижностью и неокрепшим панцирем при совместном содержании подвержены каннибализму со стороны еще не линявших или уже окрепших особей.
В настоящее время весьма актуальна задача разработки рецептур специализированных кормов, включающих продукты переработки ракообразных: хитин-белковый комплекс, белковый гидролизат и хитозан, позволяющих адекватно заменить естественный рацион для личинок, мальков, и взрослых особей камчатского краба. Введение в рацион крабов кормов, содержащих низкомолекулярный хитозан, обладающий росто- и иммуностимулирующими свойствами, позволило бы повысить естественную резистентность культивируемых особей и выживаемость их после линьки, а также ослабить негативное влияние каннибализма.
Для получения низкомолекулярного хитозана лучше использовать собственные ферментные комплексы краба, обладающие субстратной специфичностью и хитинолитической активностью в отношении хитозана ракообразных, чтобы свойства получаемого вещества были наиболее близки к свойствам ана-
лога, образующегося в организме краба естественным путем. Известно, что ферментный комплекс, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба, проявляет гидролитическую активность в отношении крабового хитозана, которая обусловлена наличием карбогидраз и протеиназ (Ильина и др., 2009).
Существующая общепринятая на промысле беспозвоночных система оценки межлиночной стадии крабов в условиях культивирования оказывается несостоятельной, поскольку используемые в ней параметры, такие как исчер-ченность панциря и количество обрастателей неадекватны при бассейновом содержании. Это ставит задачу разработки системы объективных биохимических показателей для более точного определения межлиночной стадии крабов.
Важным аспектом наших исследований стала разработка экологически безопасного способа переработки панцирьсодержащих отходов (ПСО) камчатских крабов в местах культивирования, добычи и переработки. Гепатопанкреас крабов, также являющийся отходом переработки, может быть использован для проведения гидролиза белковой части хитин-белкового комплекса (ХБК) и хитозана, что направит в производство новые источники сырья для получения биологически активных препаратов различного назначения.
Целью настоящей работы является получение из гепатопанкреаса, гемолимфы и панциря камчатского краба биологически активных веществ и определение биохимических индикаторов физиологического состояния культивируемых ракообразных, а также разработка рецептур специализированных кормов для ракообразных, отвечающих их естественным рационам и содержащих хитозан в качестве ростостимулирующего агента.
Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:
- провести комплексное исследование биологически активных веществ, способных служить параметрами для оценки физиологического состояния камчатского краба в процессе культивирования: липидов и ферментов гепатопанкреаса, хитин-белкового комплекса панциря, белков гемолимфы;
- получить iii vitro низкомолекулярный хитозан с использованием ферментного комплекса из гепатопанкреаса камчатского краба;
- разработать рецептуры кормов для ракообразных;
- предложить способ безотходного использования культивируемых и промысловых ракообразных;
- разработать комплексную методику отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимических исследований.
Научная новизна. Впервые определены биохимические индикаторы в комплексе для контроля физиологического состояния культивируемого камчатского краба, а также для оценки эффективности технологии культивирования: общее содержание липидов и содержание соЗ и шб полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в гепатопанкреасе, протеиназная и хитобиазная активности в экстракте гепатопанкреаса, суммарное содержание белка в гемолимфе, температуры первого и второго стеклования ХБК панциря.
Впервые исследованы закономерности изменения липидного состава гепатопанкреаса, а также специфических и неспецифических хитинолитических активностей ферментов гепатопанкреаса камчатского краба на различных стадиях линочного цикла.
Впервые исследована зависимость степени кристалличности ХБК панциря камчатского краба от межлиночной стадии.
Впервые разработана рецептура специализированных кормов для ракообразных с использованием ХБК и низкомолекулярного хитозана.
Разработана методика комплексного отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимических исследований биологически активных веществ, способных служить индикаторами физиологического состояния культивируемых ракообразных, а также являющихся компонентами кормов.
Практическое значение. Разработанные биохимические индикаторы дают возможность оценки физиологического состояния камчатского краба в процессе культивирования и эффективности методов их культивирования. Получен-
ные результаты позволяют определять межлиночную стадию краба по биохимическим показателям.
Полученные результаты легли в основу рекомендаций по составлению рецептур специализированных кормов для ракообразных.
Введение в рацион культивируемых ракообразных разработанных нами кормов, содержащих низкомолекулярный хитозан в качестве ростостимули-рующего агента, позволит повысить их выживаемость после линьки, и рентабельность процесса культивирования камчатского краба в целом.
Предложен экологически безопасный способ переработки ПСО культивируемых и промысловых крабов. Показано, что гепатопанкреас крабов может быть использован для гидролиза белковой части ХЕК панциря и хитозана с целью получения компонентов специализированных кормов для ракообразных.
Основные положения. На основе биохимических исследований гепато-панкреаса, гемолимфы и панциря камчатского краба установлены параметры для оценки его физиологического состояния в процессе культивирования.
Обосновано введение в специализированные корма для ракообразных компонентов, свойственных их естественным рационам: ХБК, белкового гидроли-зата, хитозана, полученных из гепатопанкреаса и панциря ракообразных. Введение низкомолекулярного хитозана в корма для ракообразных оказывает рос-тостимулирующее действие.
Апробация. Основные положения диссертационной работы доложены на 2-й и 3-й Международных научно-практических конференциях: «Пищевая и морская биотехнология: реализация, проблемы, перспективы» (Калининград, 2006, 2008), на XIII & XIV Seminar and Workshop "New Aspects of the Chemistiy and Applications of Chitin and its Derivatives" (Wroclaw, 2007, Olshtyn, 2008), на международной конференции «Aquaculture Europe» (Стамбул, 2007), на 3 Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008), на 9-й международной конференции Европейского хитинового общества «Forthcoming Euchis - 2009» (Венеция, 2009), международной конференции
«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора: участие в планировании и постановке экспериментов, разработка методики отбора проб органов и тканей камчатского краба, пробоподготовка, исследование липидного состава гепатопанкреаса, оценка специфической и неспецифической хитинолитической активности в экстракте гепатопанкреаса, изучение белкового состава гемолимфы, изучение процесса гидролиза крабового хитозана ферментным комплексом из гепатопанкреаса краба, участие в разработке рецептур специализированных кормов, математическая обработка, анализ и интерпретация полученных результатов, написание научных статей, докладов и презентаций, участие в конференциях.
Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел результатов и их обсуждения, выводы, практические рекомендации, список литературы, приложение. Работа изложена на 129 страницах, содержит 36 таблиц и 33 рисунка, библиографию из 151 наименования, в том числе 58 на иностранном языке.
Благодарности. Автор выражает благодарность к.х.н. Ильиной A.B., к.х.н. Сидорову H.H., д.х.н. Урьяшу В.Ф., всем сотрудникам лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН, лаборатории термохимии Института химии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, а также сотрудникам лаборатории «Воспроизводства и культивирования ракообразных» ВНИРО за содействие в проведении данной работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, ее научная новизна, определены основные направления исследований, сформулированы цели и задачи исследования, положения, выносимые на защиту.
1. В разделе «Обзор литературы» обобщены и проанализированы сведения о физиологических и биохимических процессах в организме камчатского краба
на протяжении линочного цикла. Уделено внимание ферментному комплексу гепатопанкреаса камчатского краба. Приведена информация об использовании в комбикормах для сельскохозяйственных животных и объектов аквакультуры хитина, хитозана и его низкомолекулярных производных. Отмечено, что технология культивирования камчатского краба по-прежнему находится на стадии разработки и для ее совершенствования необходимо создание системы контроля физиологического состояния культивируемых крабов, а также методов оценки эффективности технологии культивирования.
2. Материалы и методы исследования. Исследованы образцы органов и тканей 311 особей камчатского краба, содержавшихся в условиях установок с проточным и замкнутым циклом водообеспечения, а также добытых в Баренцевом и Охотском морях в промысловые сезоны 2005-2009 г.
Экспериментальную часть работы проводили в лаборатории воспроизводства и культивирования ракообразных ВНИРО, на промысловых судах, бассейновом комплексе ООО «Северный проект» (Мурманск), на береговой базе компании Norway King Crab АС (Бюйгенес, Норвегия), лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН, лаборатории термохимии Института химии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.
Схема исследований представлена на рис.1.
Фракционный состав липидов гепатопанкреаса краба определяли методом ТСХ на аллюминевых пластинах Мерк и Силуфол (Кейтс, 1975). Жирнокис-лотный состав липидов гепатопанкреаса краба определяли методом ГЖХ. (Фрайфелдер, 1980).
Определение суммарного количества белка в гемолимфе проводили спек-трофотометрически по методу Брэдфорд (Spektor, 1978). Протеиназную активность определяли по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза, используя в качестве субстрата азоказеин (Шагинян, 1980). Хитобиазную активность определяли, используя в качестве субстрата 4-нитрофенил-М-ацетил-P-D-глюкозаминид (Kubicek-Planz, 1986).
Методом дифференциального термического анализа изучена динамика изменения минерализации панциря, физико-химические показатели ХБК, хитина и хитозана и температуры физических переходов (Урьяш, 1978).
Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка. Динамическую вязкость растворов хитозана определяли на ротационном вискозиметре Брукфильда с цилиндрическим ротором при 30°С (Ikeda, 1993).
Опытные партии гранулированных комбикормов изготавливали на лабораторной и пилотной установках ВНИИПРХ, моделирующих промышленную технологию кормопроизводства для рыб.
Полученные результаты исследований обрабатывали с применением методов математической статистики на уровне требований надежности с вероятностью Р=0,95. Для построения графических зависимостей использовали стандартные программы Windows 2003, Exel 2003.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Современные технологии культивирования ракообразных предусматривают регулирование всех жизненно важных процессов объекта разведения. Биологической особенностью в развитии ракообразных является линька. От успешности ее преодоления в искусственных условиях зависит эффективность той или иной техники культивирования.
Цикл линьки традиционно подразделяют на четыре периода: предлинь-ка, линька, послелинька и межлинька. Для увеличения точности опыта мы выделяли В межлиночных стадий, описание которых представлено в табл. 1.
Проведено комплексное исследование органов и тканей камчатского краба для обнаружения биологически активных веществ, способных служить индикаторами физиологического состояния краба, в частности для определения меж-линочной стадии, а также для оценки эффективности технологии культивирования.
Таблица 1
Признаки межлиночных стадий_
мс Период линьки Описание стадии
1 После-линька Крабы полиняли несколько дней назад, панцирь чистый, мягкий, светлый; при нажатии или сдавливании панцирь и ноги легко ломаются без хруста. До 5 дней после линьки.
2 После-линька Панцирь чистый, прочнее и заметно темнее, чем у крабов стадии 1. Мышечные ткани водянистые («Пустой краб»). При поднятии за ногу или надавливании на панцирь они ломаются с хрустом. От б дней до 3 недель после линьки.
3.0 Межлинька Панцирь чистый и твердый, при надавливании слегка прогибается, кок-соподиты белые, без царапин. Наполнение конечностей мышечной тканью не более 30%. При поднятии краба за второй членик ходильной конечности он слегка гнется, но не ломается. От 3-х недель после линьки.
3.1 Межлинька Панцирь достиг максимальной прочности, на коксоподитах желтые и светло-бурые царапины, отмечаются поселения обрастателей. Шипы на внутренней части клешней и на панцире белые и острые. Наполнение конечностей до 90-95%
3.2 Межлинька Иногда отмечаются значительные обрастания, коксоподиты темно-бурые, нижняя поверхность ног покрыта почерневшими царапинами. Наполнение максимальное - 90% и более. Крабы линяли около года назад.
4.0 Пред-линька Нижняя поверхность тела исчерчена, верхняя покрыта обрастателями. Панцирь вновь эластичен. Наполнение конечностей не более 40-50%, мышечные ткани обводнены.
4.1 Пред-линька Нижняя поверхность тела исчерчена, верхняя покрыта обрастателями. Панцирь эластичен. Наполнение конечностей не более 30-40%, мышечные ткани обводнены. Абдомен раздут, двигательная активность значительно снижена. До линьки осталось 10-15 дней.
4.2 Старый краб Очень старые крабы, имеющие изношенный панцирь, покрытый обрастателями. Такие крабы уже не линяют.
3.1. Биохимические исследования
3.1.1. Исследование лнпндиого состава гепатопанкреаса камчатского краба. Содержание крабов в течение 5-6 месяцев в одинаковых условиях позволяет сравнивать липидные показатели гепатопанкреаса. В жире гепатопанкреаса обнаружены фосфолипиды, 1,2 и 1,3 диглицериды, холестерин, жирные кислоты (ЖК), триглицериды, алкоксиглицериды и углеводороды. Общее содержание жира составило от 9% до 27% в зависимости от межлиночной стадии.
На рис. 2 представлено содержание некоторых ЖК в гепатопанкреасе краба на 3.2 и 4.1 межлиночных стадиях.
cft (Й V -P V -?> -P J» J» J¡> .3 Л
.SJ >0 „ ¿Л iO. cO . cO . tO . со , со . ív", со , cO
индивидуальные ЖК
1 2 3.0 3.2 4.0 4.1 межлиночнап стадия
Рис. 2. Содержание ЖК в образцах липи-дов гепатопанкреаса камчатского краба на 3.2 и 4.1 межлиночных стадиях
Рис. 3. Общее содержание юЗ и шб ПНЖК в липидах гепатопанкреаса камчатского краба в зависимости от межлиноч-ной стадии
Разница в содержании отдельных ЖК составляет от 11 до 43%. В жирно-кислотном составе гепатопанкреаса камчатского краба преобладают моно- и полиненасыщенные жирные кислоты (МНЖК и ПНЖК) - от 60% до 69% и от 13% до 29% соответственно, состав которых изменяется в зависимости от меж-линочной стадии. Содержание насыщенных ЖК колеблется в интервале 9 -12%. Общее количество юЗ и ®6 ПНЖК изменяется в интервале 20-28% на разных межлиночных стадиях, что показано на рис. 3.
Очевидно, что максимальное содержание юЗ и шб ПНЖК приходится на стадии 3.2 и 4.0 (28,2 и 28,3%, соответственно). Это связано с тем, что в период межлиньки краб накапливает энергетические ресурсы для успешного преодоления линьки и полного восстановления организма в послелиночный период. Основным объектом промысла в Баренцевом море являются особи камчатского краба со степенью наполненности конечностей от 70% до 100%, что соответствует третьей поздней и четвертой ранней межлиночным стадиям. Наши исследования подтверждают, что в этот период промышленная добыча гепатопанкреаса камчатского краба как источника биологически активных веществ наиболее экономически выгодна.
Совместно с ГУ «Медицинский радиологический научный центр» РАМН проведено лабораторное тестирование радиозащитной и гемостимулирующей активности препаратов липидов из гепатопанкреаса камчатского краба на мышах. Пероральное введение лабораторным животным препаратов жира гепатопанкреаса камчатского краба статистически достоверно увеличивает массу селезенки у-облученных мышей и содержание в них эндогенных селезеночных колоний. Последние формируются выживающими после облучения кроветворными стволовыми клетками. Этот факт свидетельствует о наличии у исследованных препаратов гемостимулирующей и радиозащитной активности.
3.1.2. Исследование ферментного комплекса гепатопанкреаса камчатского краба. В ферментном препарате - экстракте из гепатопанкреаса камчатского краба присутствует ряд гидролитических активностей представленных в табл. 2, которые обусловлены наличием карбогидраз и протеиназ, что позволяет использовать этот ферментный комплекс для деполимеризации р - глико-зидных связей в хитозане.
Ферментативная активность на разных межлиночных стадиях. Определены ферментативные активности, которые могут служить индикаторами физиологического состояния организма краба в процессе культивирования на различных межлиночных стадиях.
Наши исследования показали, что через неделю после линьки протеиназ-ная активность в экстракте гепатопанкреаса камчатского краба увеличивается на 58%. К этому времени у краба значительно возрастает двигательная активность и появляется интерес к пище. У крабов 4.0 стадии, собирающихся линять в текущем сезоне активность хитинолитических ферментов, ответственных за поставку мономеров полисахаридов для построения нового панциря, на 70% выше, чем у крабов 4.2 стадии, перенесших последнюю линьку. Наиболее перспективными для использования в качестве индикаторов оценки физиологического состояния краба являются протеиназная и хитобиазная активности, которые обнаружены в образцах гепатопанкреаса на всех межлиночных стадиях и
отражают течение физиологических процессов, таких, как синтез и разрушение хитиновых покровов, подготовка к линьке, пищеварение и т.д.
Таблица 2
Специфические и неспецифические хитинолитические активности, присутствующие в ферментном препарате из гепатопанкреаса камчатского краба
Наименование, единицы измерения Субстрат Активность измеренная в экстракте
Жидком Сухом
Хитиназная, мкмоль/мг х мин Коллоидный хитин 0,02-0,14 0,0-0,04
Хитобиазная мколь/мг х мин 4-нитрофенил-М-ацетил-р-0-глкжозаминид 0,40-2,29 0,20-1,10
[М—>4 глюконазная мкмоль/мг х мин КМ-целлюлоза 0,09 - 0,24 0,04-0,14
ßl->3;l-»6 глюконазная мкмоль/мг х мин Ламинарии 0,16 - 0,29 0,08-0,12
Гликозидазная, мкмоль/мг х мин 4-нитрофенил-а-Ь-фукопиранозид 35-37 16-18
4-нитрофенил-а-0-гапактопиранозид 8,4 -
4-нитрофенил-р-0-галактопиранозид 69 -135 -
4-иитрофенил-р-0-маннопиранозид 3,8-9,2 -
4-нитрофенил-Р-0-глюкопиранозид 14-30 -
Протеиназная, мг х мин -1 o.e. Азоказеин 98 - 286 100-300
Наличие специфических и неспецифических хитинолитических активностей в экстракте гепатопанкреаса свидетельствует о том, что камчатский краб усваивает компоненты панциря поедаемых им ракообразных своего и других видов. Таким образом, можно рекомендовать введение в рацион культивируемых ракообразных муки из отходов переработки промысловых ракообразных, содержащих ХБК.
3.1.3. Исследование суммарного содержания белка в гемолимфе камчатского краба. Определение биохимических параметров гемолимфы является доступным методом для оценки физиологического состояния краба в процессе культивирования, не требующим его убоя.
На рис. 4 представлено среднее содержание белка в сыворотке гемолимфы для промысловых крабов баренцевоморской популяции на 2, 3.1 и 3.2 межли-
ночных стадиях, которое составило 16,5; 14,8 и 18,8 мг/мл соответственно.
На рис. 5 представлена зависимость суммарного содержания белка в сыворотке гемолимфы камчатского краба от межлиночной стадии для культивируемых особей. Содержание белка в гемолимфе возрастает до 20,3 мг/мл на стадии предлиньки и снижается на 50-60% за послелиночный период, после чего вновь идет его повышение. Резкое снижение уровня белка в предлиночном периоде связано с почти двукратным разбавлением гемолимфы краба, происходящим за счет поглощения большого количества жидкости перед линькой.
2 3.1 3.2 межлиночная стадия
Рис. 4. Суммарное содержание белка в гемолимфе камчатского краба баренцево-морской популяции на разных межлиноч-ных стадиях
Рис. 5. Суммарное содержание белка в гемолимфе культивируемого камчатского краба на разных межлиночных стадиях
3.1.4. Исследование физико-химических свойств ХБК панциря акклиматизированного камчатского краба (АКК) в зависимости от межлиночной стадии. С целью определения зависимости изменения структуры ХБК панциря от межлиночной стадии, совместно с лабораторией термохимии НИИ ХНГУ им. Н.И. Лобачевского нами проведено термохимическое исследование степени его кристалличности. Установлено, что в процессе укрепления панциря после линьки увеличивается упорядоченность его структуры, расширяются кристаллические области полимера. На стадии предлиньки зафиксировано протекание обратных процессов. В табл. 3 представлены физико-химические свойства и средние температуры физических переходов в ХБК, выделенном из панциря АКК на разных межлиночных стадиях.
У изученных образцов проявились два температурных интервала стеклования. Такое поведение хитина связано с наличием в нем микрообластей раз-
личной степени кристалличности (высококристалличных и аморфных). У образцов стадии послелиньки (№2 и 3) и первого образца межлиночного периода (№4) температура второго стеклования Тс2=144°С одинаковая, затем она понижается у образцов №5 и 6 до 137°С, повышается у образца №7 до 154°С и вновь понижается до 137°С в момент линьки (обр.№1), что проиллюстрировано рис.
Таблица 3
Физико-химические свойства и средние температуры физических переходов в ХБК панциря _ камчатского краба __
Образец 1 2 1 3 4 1 5 1 6 7
Стадии линьки Экзувий Послелинька Межлинька Предлинька
Сод. воды, % 9,5 8,5 | 9,8 10,5 | 7,3 | 6,7 6,6
Температуры физических переходов
*исп.Н20,°С 123 121 125 121 125 128 126
to,°C 81 61 85 66 64 62 50
tel, С 113.5 113 118.5 111 117 117 123
tc2, С 137.5 144.5 143 144 137 136.5 145
224.5 227 214 215 215.5 224.5
tflccTp2, С 266 291.5 245 274 300 299 295
Потеря массы безв. образца, мас.% 13.6 16.1 22.2 25.4 30.6 38.3 23.9
После разложения образцы взвесили и определили убыль их массы по сравнению с безводными образцами (табл. 3). Наблюдалось закономерное изменение массы образцов (рис. 7).
s -9-
150
О 140
а 130
|l20 О)
5*110 100
межлииочная стадия
Рис. 6. Температуры первого (ТС1) и второго (Тй) стеклования образцов ХБК на разных межяиночных стадиях
Рис. 7. Потеря массы безводного образца ХБК после деструкции
Проведенные исследования показали существенные различия физико-химических характеристик ХБК, выделенного из панциря краба на различных
межлиночных стадиях. В дальнейшем их можно будет использовать для объективной оценки соответствующего этапа в развитии краба.
Сводные результаты по разработанным биохимическим параметрам, отражающим изменения в органах и тканях камчатского краба на протяжении линочного цикла, представлены в табл. 4.
Таблица 4
Биохимические индикаторы
Параметр Применение Значение
Гепатопанкреас
Общее содержание липидов, % Оценка физиологического состояния. Оценка эффективности технологии культивирования 9-27
Содержание шЗ и ш 6 ПНЖК, % Оценка эффективности технологии культивирования 18-25
Протеиназная активность, o.e. - мг белка Интенсивность физиологических процессов, в частности, деградации и образования хитиновых покровов 98-286
Хитобиазная активность, мколь/мг х мин Интенсивность процессов деградации хитиновых покровов 0,40-2,29
Панцирь
Температура стеклования, °С Оценка степени кристалличности ХБК, определение межлиночной стадии Тс1 :111-123 Тсг: 137-145
Гемолимфа
Суммарный белок, мг/мл Оценка физиологического состояния ракообразного в данный момент времени 8-20
3.2. Биотехнологические исследования
3.2.1. Гидролиз крабового хитозана ферментным комплексом гепато-пашсреаса камчатского краба. Подобраны оптимальные параметры для проведения гидролиза высокомолекулярного крабового хитозана ферментным комплексом гепатопанкреаса камчатского краба: рН, фермент-субстратное соотношение, температура, продолжительность процесса деполимеризации.
Гидролиз хитозана проводили при рН 5,6, когда его растворимость составляет 10 мг/мл. При более низком рН 4,6, при лучшей растворимости хитозана 15-20 мг/мл, одновременно протекает кислотный гидролиз.
Для выбора фермент-субстратного соотношения провели деполимеризацию хитозана при рН 5,6, 37°С, в течение 30 минут. Характеристическая вязкость гидролизатов составила 4,1, 5,1, 6,6 и 7,1 дл/г при соотношениях 1:50; 1:100; 1:200 и 1:400, что соответствовало снижению вязкости на 48; 35; 17 и 10% и содержанию ферментного комплекса в гидролизатах 2; 1; 0,5 и 0,25% соответственно. Гидролиз следует проводить при фермент-субстратном соотношении 1:200, при котором содержание ферментного комплекса менее 1% и снижение вязкости больше, чем при соотношении 1:400.
Исследована термостабильность протеиназ и карбогидраз в экстракте из гепатопанкреаса камчатского краба при 37 и 50 °С в течение 5 - 120 мин. Из полученных результатов следовало, что деполимеризацию целесообразно осуществлять при 37°С, тогда как более высокая температура способствует быстрой потере гидролитической активности в экстракте.
Таблица 5
Динамика падения вязкости в процессе гидролиза хитозана в зависимости от выбранно-
го экстракта*
Время, мин Падение вязкости, %
Жидкий экс- Сухой
тракт экстракт
0 100 100
30 48 46
60 69 68
180 83 80
1200 98 97
*Гидролиз проводили в Ш-ацетатном буфере рН 5,6; при 37°С; фермент-субстратном соотношении 1:200
Таблица 6
Влияние продолжительности процесса деполимеризации на динамическую и характеристическую вязкость_
Время, мин Вязкость
Хитозан
сР дл/г
0 83 (0)" 7.9 (0)
30 43 (48) 4.7(41)
60 26 (69) 3.1 (61)
90 — —
120 15(82) 1.8 (77)
240 14(83) 1.6 (80)
1200 3(96) 1.2 (85)
•деполимеризацию проводили жидким экстрактом из гепатопанкреаса **падение вязкости выраженное в %
Проведен гидролиз крабового хитозана экстрактом гепатопанкреаса камчатского краба. Исследование динамики изменения вязкости раствора хитозана
в процессе гидролиза сухим и жидким экстрактом свидетельствовало о снижении на 97 и 98%, с 67 до 2 сР за 20 ч, что показано в табл. 5-6.
Средневязкостная молекулярная масса (М.м.) полученных образцов составила 34-43 кДа, степень дезацетилирования - 82 ± 3%.
3.2,2. Специализированные корма для ракообразных. Технология культивирования камчатского краба находится на стадии разработки и усовершенствования. На данный момент не производилось сбалансированных кормов полностью отвечающих естественным рационам камчатских крабов.
Комбикорма для ракообразных как объектов аквакультуры должны не только обеспечивать прирост массы и длины тела, но и улучшать их физиологический статус. В качестве базового варианта был использован стандартный комбикорм форелево-осетрового типа, содержащий 45-50% протеина и 9-11% жира. В табл. 7 представлен компонентный состав разработанных кормов.
Таблица 7
Компонентный состав кормов, %_
Компоненты/Варианты кормов 1 2 3 4
Рыбная мука 50 50 50 50
Витазар (мука зародышей пшеницы) 16 15,5 15 14
Панцирь омара, краба 10 10 10 10
Гидролизат северной розовой креветки 6 6 6 6
Хитозан 0 0,5 1 2
Пшеничная мука 5 5 5 5
Белковая кормовая добавка (БКД) 7 7 7 7
Витаминный премикс 1 1 1 1
Рыбий жир 5 5 5 5
Белок 49,91 49,74 49,56 49,21
Жир 11,10 11,09 11,08 11,06
В состав кормов для ракообразных включена мука из панциря омара и краба, являющаяся источником минеральных веществ и хитин-белкового комплекса. В качестве аттрактанта в состав комбикормов введен белковый гидролизат из панциря северной розовой креветки, являющийся также источником белковых компонентов, в том числе и комплекса незаменимых аминокислот.
Введение в корм низкомолекулярного хитозана, благодаря его росто- и иммуностимулирующим свойствам, позволит повысить иммунный статус и сопротивляемость организма ракообразного различного рода внешним и внутренним факторам. Также известно, что все препараты хитозана и его производных обладают адгезионным действием, что весьма актуально в агрессивной водной среде.
Опытные образцы корма различались содержанием низкомолекулярного хитозана - 1 - 0%, 2 - 0,5%, 3 - 1%, 4 - 2% соответственно.
Апробация специализированных кормов для ракообразных на гигантских пресноводных креветках. Поскольку биохимические механизмы линоч-ного процесса у различных видов ракообразных весьма сходны, то их изучение лучше проводить на животных с коротким линочным циклом и быстрым ростом. В качестве модельного объекта для наших экспериментов с кормами для ракообразных были выбраны гигантские пресноводные креветки Масго-ЬгасМит гозепЬе^и, технология культивирования которых хорошо отработана.
Эксперименты проводили на постличинках со средним размером 1,5 см, по 16 шт. в группе. Прирост креветок, получавших корм с хитозаном, за 60 суток подопытного периода был выше, в среднем на 14%, чем в контрольном варианте корма без хитозана, что отражено на рис. 8.
«
3 ч»
— ¿4
200
5 150
4 5
6 О 100
5 СЬ
§ 50 а в
ё о
0,5 1
содержание хитозана, %
Рис. 8. Относительный прирост постличинок гигантской пресноводной креветки за 60 суток получения корма.
Средний привес постличинок сопоставим для всех вариантов корма, и составляет от 750% до 850%. Для креветок, получавших с кормом низкомолекулярный хитозан, отмечено сокращение межлиночных периодов, увеличение
количества линек. Выживаемость для всех вариантов корма составила более 94%.
Из полученных данных можно заключить, что новые корма с содержанием хитозана удовлетворяют потребностям организма ракообразного и обладают ростостимулирующим эффектом, что позволяет рекомендовать их дальнейшее применение в качестве компонента в рационах.
3.3. Определение показателей безопасности хитинсодерясащего сырья.
Значительный интерес, в качестве сырья для получения хитиновых веществ, представляют хитин содержащие отходы процесса культивирования, а также запасы панцирей и экзувиев акклиматизированного камчатского краба (АКК), законсервированные в естественных условиях на Российском и Норвежском побережье Баренцева моря в районе их промысла и переработки.
Для определения возможности использования данного источника сырья нами исследованы нормированные показатели безопасности, представленные в
табл. 8-9.
Таблица 8
Содержание токсичных элементов и радионуклидов в панцире АКК*
Токсические элементы, мг/кг, не более Радионуклиды, Бк/кг
Свинец Мышьяк Кадмий Ртуть Цезий-137 Стронций-90
п н п н п н п н п н п н
4,80 10,0 2,50 5,0 1,00 2,0 0,05 0,2 120 200 70 100
* п- показатель, н-норма
Таблица 9
Микробиологические показатели панциря АКК*
КМАФ АнМ**, КОЕ/г, не более Масса продукта (г), в которой не допускаются:
БГКП (коли формы) S. aureus Патогенные, в т.ч. сальмонеллы
п н п н п н п н
1х102 5х104 1х10"3 1х10"2 1x10 2 1x102 25 25
* п - показатель, н-норма
"""Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов Уровни содержания тяжелых металлов и радионуклидов, а также микро-
биологические показатели находятся в пределах нормы. Освоение новых ресурсов панцирьсодержащих отходов способствует расширению производства компонентов кормов для ракообразных.
ВЫВОДЫ
1. Биохимические параметры гепатопанкреаса гемолимфы и панциря культивируемого камчатского краба существенно изменяются в зависимости от межлиночной стадии. Общее содержание липидов в гепатопанкреасе колеблется от 9 до 27%, содержание соЗ и ®6 ПНЖК составляет 18 - 25% от общего содержания ЖК, протеиназная активность в экстракте гепатопанкреаса изменяется от 98 до 286 мг белка (o.e.), хитобиазная активность - от 0,40 до 2,29 мколь/мгхмин, суммарное содержание белка в сыворотке гемолимфы изменяется в интервале 8 - 20%, температуры первого и второго стеклования образцов хитин-белкового комплекса колеблются в интервалах от 111 до 123 и от 136,5 до 145 "С, соответственно.
2. В качестве параметров для оценки физиологического состояния культивируемых крабов, в частности межлиночной стадии, и эффективности технологии культивирования можно применять биохимические характеристики, такие как общее содержание ЖК и содержание соЗ и шб ПНЖК в гепатопанкреасе, протеолитическая и хитобиазная ферментативные активности в экстракте гепатопанкреаса, степень кристалличности ХБК панциря, суммарный белок в сыворотке гемолимфы.
3. Дано научное обоснование для введения в специализированные корма для ракообразных низкомолекулярного хитозанового компонента, полученного путем гидролиза хитозана ферментным комплексом, выделенным из гепатопанкреаса камчатского краба. Из крабового хитозана с М.м. 700 кДа и степенью дезацетилирования 0,85 получены низкомолекулярные образцы хитозана с выходом 85% при 37°С и фермент-субстратном соотношении 1:200 в течение 20ч.
4. Разработана рецептура кормов для ракообразных на основе рыбной (50%) и крабовой (10%) муки с добавлением белкового гидролизата из северной розовой креветки (6%) и низкомолекулярного хитозана. Изготовлены корма с различным содержанием низкомолекулярного хитозана: от 0,5 до 2 %. Корма применены при выращивании постличинок гигантской пресноводной креветки. Выживаемость составила более 94%.
5. Добавление низкомолекулярного хитозана в корма для культивируемых ракообразных оказывает ростостимулирующее действие. Прирост постличинок гигантской пресноводной креветки, которые получали корм с хитозаном, за 60 суток подопытного периода был выше, в среднем на 14%, чем в контрольном варианте корма без хитозана. Средний привес постличинок сопоставим для всех вариантов корма, и находится в пределах от 750 % до 850%. Для креветок, получавших с кормом низкомолекулярный хитозан, отмечено сокращение меж-линочных периодов на 11%.
6. Разработана комплексная методика отбора проб органов и тканей ракообразных на примере камчатского краба, таких как мышечная ткань, гепато-панкреас, гемолимфа и панцирь, позволяющая оценивать изменение биохимических показателей на протяжении линочного цикла.
7. Предложен способ переработки ПСО культивирования и промысла АКК с помощью ферментного комплекса из гепатопанкреаса краба, также являющегося отходом, с целью получения специализированных кормовых продуктов для ракообразных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
На основании полученных данных о липидах гепатопанкреаса, специфических и неспецифических хитинолитических активностях ферментов гепатопанкреаса, физико-химических свойств ХБК панциря, суммарного содержания белка в гемолимфе камчатского краба на разных межлиночных стадиях, рекомендуется подразделять четвертую линочную категорию на 3 стадии: 4.0, 4.1, 4.2.
Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать введение в корма для культивируемого камчатского краба на стадиях предлиньки и послелиньки муку из панцирей морских ракообразных с целью обогащения их рациона минеральными веществами и ХЕК. Для этих целей рекомендуется использовать панцири ракообразных 3.1 и 3.2 промысловых линочных категорий, когда минерализация панциря максимальна.
Результаты исследований позволили наметить пути решения проблемы переработки отходов культивирования крабов, путем комплексного использования панциря и гепатопанкреаса для изготовления компонентов кормов.
Разработана и утверждена «Методика комплексного отбора проб различных органов и тканей камчатского краба» для биохимических исследований.
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
1. Немцев C.B., Быкова В.М., Ежова Е.А., Сорокоумов И.М., Загорская Д.С., Ковачева Н.П. Панцирь акклиматизированного камчатского краба. Экологические проблемы и пути их решения // Экология и промышленность в России. Сентябрь, 2007. С. 43-45.
2. Uryash V., Nemtsev S., Kokurina N., Ezhova E., Zagorskaya D., Kovacheva N. Physicochemical properties of chitin-proteín complex from shell of red king crab (Paralithodes camtschaticus) at various stages of molting cycle // Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. Ed. by M.M. Jaworska, Monograph v.XIII, 2008. P. 17-24.
3. Загорская Д.С., Урьяш В.Ф., Немцев C.B., Кокурина Н.Ю., Ковачева Н.П. Влияние возраста акклиматизированного камчатского краба {Paralithodes camtschaticus) на физико-химические свойства его хитин-белкового комплекса // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2008. №4. С. 53-58.
4. Загорская Д.С., Сидоров H.H., Боева Н.П., Н.П. Ковачева Н.П., Немцев C.B. Биоконверсия липидов ракообразных на разных стадиях линочного цикла // Рыбпром, 2008. №3-4. С. 58-62.
5. Ильина А.В., Загорская Д.С., Левов А.Н., Албулов А.И., Ковачева Н.П., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного хитозана и его производных с использованием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба // Прикладная биохимия и микробиология, 2009. Т. 45. №4. С. 415421.
6. Немцев С.В., Ковачева Н.П., Загорская Д.С., Сорокоумов И.М., Панов К.Н. Панцирь акклиматизированного камчатского краба в разных линочных стадиях, как источник получения хитина и белковых продуктов. Рыбное хозяйство, 2009. №2. С. 7-14.
7. Кокурина Н.Ю., Урьяш В.Ф., Ларина В.Н., Фаминская Л.А., Новоселова Н.В., Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И., Загорская Д.С., Немцев С.В., Ильина А.В. Термодинамические характеристики хитина и хитозана в зависимости от источника получения и степени упорядоченности // Материалы XVII Международной конференции по химической термодинамике в России. Казань, 2009. С. 216-220.
8. Uryash V.F., Nemtsev S.V., Kokurina N.Yu., Zagorskaya D.S., Kovacheva N.P. Physicochemical properties of chitin from chitin-protein complex of acclimatization kamchatsky crab (Paralithodes camtschaticus) II Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. Ed. by M.M. Jaworska, Monograph v.XIV, 2009. P. 7-14.
9. Загорская Д.С. Использование продуктов переработки ракообразных в специализированных кормах для культивируемого камчатского краба // Материалы международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2009. С. 492-497.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АКК - акклиматизированный камчатский краб ГЖХ - газожидкостная хроматография ЖК - жирные кислоты
МНЖК - мононенасыщенные жирные кислоты
М.м. - молекулярная масса
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПСО - панцирьсодержащие отходы
ТСХ - тонкослойная хроматография
ФК - ферментный комплекс
ХБК - хитин-белковый комплекс
Подл, в печать 11 Я Объем/, Упл. Тираж/И экз. Заказ БНИРО. 107140, Москва В. Красносельская, 17
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Загорская, Дарья Сергеевна
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биологические и биохимические особенности ракообразных отряда Decapoda.
1.1. Линька ракообразных.
1.2. Химический состав организма камчатского краба.
1.3. Биохимические изменения в органах и тканях камчатского краба в ходе линочного цикла.
1.3.1. Гепатопанкреас.
1.3.2. Гемолимфа.
1.3.3. Экзоскелет.
1.4. Культивирование ракообразных и использование специализированных кормовых продуктов.
1.5. Экологический аспект.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Биохимические исследования.
2.3. Биологические исследования.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Биохимические исследования
3.1.1. Исследование липидного состава гепатопанкреаса.
3.1.2. Исследование комплекса ферментов гепатопанкреаса камчатского краба.
3.1.3. Исследование белка гемолимфы камчатского краба.
3.1.4. Исследование физико-химических свойств хитин-белкового комплекса панциря акклиматизированного камчатского краба в зависимости от межлиночной стадии.
3.2. Специализированные корма для ракообразных.
3.3. Исследование показателей безопасности хитин-содержащего сырья.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические и биохимические аспекты культивирования камчатского краба"
Камчатский краб Paralithodes camtschaticus (Tilesius, 1815) является одним из важнейших промысловых видов ракообразных. Кроме высокоценного в пищевом отношении мяса из камчатского краба можно получать ценные биологически активные вещества различного назначения: индивидуальные ферменты и ферментные комплексы, каротиноиды и непредельные жирные кислоты, биополимеры хитин и хитозан, гемоцианин. В связи с этим, а также с постоянно растущим спросом на живого краба в мире проявляется большой интерес к камчатскому крабу, как к объекту культивирования.
Актуальность исследования. Ввиду того, что ракообразные не имеют сходства с рыбами, культивирование их в искусственных условиях должно базироваться на оригинальных подходах, разработка которых требует детального изучения биохимических процессов, происходящих в их организме в ходе линочного цикла, что необходимо для разработки адекватной технологии их культивирования.
Разработка системы контроля физиологического состояния крабов, включающая в себя ряд биохимических показателей органов и тканей, а также оценка эффективности технологии культивирования ракообразных являются крайне актуальными.
Технология культивирования камчатского краба подразумевает три основных направления исследований:
- искусственное воспроизводство и выращивание мальков с целью выпуска в природную среду;
- доращивание некондиционных особей до товарного качества;
- передержка взрослых особей с целью продажи в живом виде.
Разработанные методы искусственного содержания ракообразных позволяют регулировать все жизненно важные процессы, протекающие у объектов разведения, и дают возможность проводить биохимические исследования их тканей, таких как панцирь, мышцы, гемолимфа и гепатопанкреас, в одной генерации животных, что существенно увеличивает достоверность результатов по сравнению с исследованием ракообразных, изъятых из природных условий.
Одной из важных проблем, возникающих при культивировании ракообразных, в частности камчатского краба, на разных стадиях жизненного цикла является преодоление им линьки. Для ракообразных этот процесс является наиболее энергозатратным и часто, в связи со слабостью организма, сопряжен с фатальным исходом. Выжившие после линьки особи с ограниченной подвижностью и неокрепшим панцирем при совместном содержании подвержены каннибализму со стороны еще не линявших или уже окрепших особей.
В настоящее время весьма актуальна задача разработки рецептур специализированных кормов, включающих продукты переработки крабов, позволяющих адекватно заменить естественный рацион как для личинок и мальков, так и для взрослых особей камчатского краба. Введение в рацион крабов кормов, содержащих иммуномодулирующие и иммуностимулирующие вещества, позволило бы повысить естественную резистентность культивируемых особей, повысить их выживаемость после линьки, а также ослабить негативное влияние каннибализма.
Известно, что хитозан обладает иммуномодулирующими свойствами по отношению ко многим организмам растительного, животного и микромира и можно предположить, что на организм ракообразных он будет действовать аналогичным образом. В гемолимфе ракообразных обнаружены N-ацетилглюкозамин и ацетат N-ацетилглюкозамина, содержание которых изменяется в зависимости от межлиночной стадии, попеременно то увеличиваясь в результате гидролиза хитина перед линькой, то уменьшаясь в результате синтеза хитин-белкового комплекса в период укрепления нового панциря после линьки.
Внесение в корма ракообразных низкомолекулярного хитозана повышает концентрацию глюкозаминов в гемолимфе, что может ускорять процесс укрепления панциря после линьки. Однако, для получения низкомолекулярного хитозана лучше использовать собственные ферментные комплексы краба, обладающие субстратной специфичностью и хитинолитической активностью в отношении хитозана ракообразных, чтобы свойства получаемого хитозана были наиболее близки к образующимся в организме краба естественным путем.
Известно, что ферментный комплекс, выделенный из гепатопанкреаса акклиматизированного камчатского краба (АКК) проявляет гидролитическую активность в отношении крабового хитозана, которая обусловлена наличием карбогидраз и протеиназ (Мухин, Новиков, 2002; Ильина и др., 2009).
При изучении влияния иммуномодулирующих веществ в составе специализированных кормов на взрослых особей камчатского краба трудно получить воспроизводимые результаты, так как в связи с несинхронностью и длительностью линочного цикла, а также медленным темпом роста невозможно подобрать группу опытных и контрольных особей. При достижении половозрелого состояния крабы линяют или 1 раз в год, или пропускают 1-2 линьки и сбрасывают панцирь раз в 2-3 года. Краб достигает половозрелого состояния за 10 лет, при этом средний прирост по ширине карапакса у пререкрутов в процессе линьки составляет 15-30 мм (Ковачева, 2008). Поскольку биохимические механизмы линочного процесса у различных видов ракообразных весьма сходны, то их изучение лучше проводить на животных с коротким линочным циклом и быстрым ростом. В качестве модельного объекта для наших экспериментов с кормами для ракообразных были выбраны гигантские пресноводные креветки МасгоЬгасЫит rosenbergii, технология культивирования которых хорошо отработана.
Существующая общепринятая в зоологии беспозвоночных система оценки межлиночной стадии крабов в условиях культивирования оказывается несостоятельной, поскольку используемые в ней параметры, такие как исчерченность панциря и количество обрастателей неадекватны при бассейновом содержании крабов. Это ставит задачу разработки системы объективных биохимических показателей для более точного определения межлиночной стадии крабов.
Важным аспектом наших исследований стала разработка экологически безопасного способа переработки многочисленных панцирьсодержащих отходов промысловых и культивируемых крабов в местах добычи и переработки. Гепатопанкреас крабов, также являющийся отходом их переработки, может быть использован для проведения гидролиза белковой части хитин-белкового комплекса или хитозана, что поможет направить в производство новые источники сырья для производства биологически активных препаратов различного назначения.
В области развития теории технологии культивирования ракообразных значительные успехи были достигнуты такими авторами, как Наканиши, Курата, Ковачева, Мортенсен, Дамсгорд, Эппельбаум.
Целью настоящей работы является получение биологически активных веществ и определение биохимических индикаторов физиологического состояния культивируемых ракообразных из гепатопанкреаса, гемолимфы и панциря камчатского краба, а также разработка рецептур специализированных кормовых продуктов для ракообразных, отвечающих их естественным рационам и содержащих хитозан в качестве иммуномодулирующего агента.
Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:
- провести комплексное исследование биологически активных веществ, способных служить параметрами для оценки физиологического состояния камчатского краба в процессе культивирования: липидов и ферментов гепатопанкреаса, хитин-белкового комплекса панциря, белков гемолимфы;
- получить in vitro низкомолекулярный хитозан с использованием ферментного комплекса из гепатопанкреаса камчатского краба;
- разработать рецептуры кормов для ракообразных как объектов аквакультуры;
- разработать метод безотходного использования промысловых и культивируемых ракообразных;
- разработать комплексную методику отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимических исследований.
Научная новизна. Определены биохимические индикаторы для контроля физиологического состояния камчатского краба, а также для оценки эффективности технологии культивирования: общее содержание липидов и содержание соЗ и соб полиненасыщенных жирных кислот в гепатопанкреасе, протеиназная и хитобиазная активности в экстракте гепатопанкреаса, суммарное содержание белка в гемолимфе, температуры первого и второго стеклования хитин-белкового комплекса панциря. Впервые исследованы закономерности изменения липидного состава гепатопанкреаса, а также специфических и неспецифических хитинолитических активностей ферментов гепатопанкреаса культивируемых ракообразных на различных стадиях линочного цикла. Впервые исследована зависимость степени кристалличности хитин-белкового комплекса панциря АКК от межлиночной стадии. Впервые разработана рецептура специализированных кормов для ракообразных как объектов аквакультуры с использованием хитин-белкового комплекса и низкомолекулярного хитозана. Разработана методика комплексного отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимического исследования биологически активных веществ, способных служить индикаторами физиологического состояния культивируемых ракообразных, а также являющихся компонентами кормов и их предшественниками.
Практическое значение. Разработанные биохимические индикаторы дают возможность оценки физиологического состояния камчатских крабов в процессе культивирования и эффективности методов культивирования этих ракообразных. Полученные результаты создают предпосылки для определения межлиночной стадии краба по биохимическим показателям.
Полученные результаты легли в основу рекомендаций по составлению рецептур специализированных кормов для ракообразных аквакультуры.
Введение в рацион культивируемых ракообразных разработанных нами кормовых продуктов, содержащих низкомолекулярный хитозан в качестве иммуномодулирующего агента, позволит повысить их выживаемость после линьки, и, как следствие, повысить рентабельность культивирования взрослых особей камчатского краба.
Предложен экологически безопасный способ переработки панцирьсодержащих отходов промысловых и культивируемых крабов. Показано, что гепатопанкреас крабов может быть использован для гидролиза белковой части хитин-белкового комплекса, предлагающий производству новые источники сырья для получения биологически активных препаратов различного назначения.
Основные положения, выносимые на защиту: совокупность новых научных результатов и положений обосновывающих выбор биохимических параметров для оценки физиологического состояния культивируемого камчатского краба: общее содержание липидов и содержание соЗ и со6 полиненасыщенных жирных кислот в гепатопанкреасе, протеиназная и хитобиазная активности в экстракте гепатопанкреаса, суммарное содержание белка в гемолимфе, температуры первого и второго стеклования хитин-белкового комплекса панциря;
- получение из гепатопанкреаса и панциря ракообразных биологически активных веществ, являющихся компонентами специализированных кормов для ракообразных и их предшественниками (ферменты гепатопанкреаса, хитин-белковый комплекс панциря, хитозан) обоснование введения в специализированные корма для культивируемых ракообразных компонентов, свойственных их естественным рационам, а также компонентов оказывающих ростостимулирующее и иммуномодулирующее действие (хитин-белковый комплекс, хитозан, белковый гидролизат)
Апробация. Основные положения диссертационной работы доложены на 2-й и 3-й Международных научно-практических конференциях: «Пищевая и морская биотехнология: реализация, проблемы, перспективы» (2006, 2008, Калининград), на XIII & XIV Seminar and Workshop "New Aspects of the Chemistry and Applications of Chitin and its Derivatives" (Poland, Wroclaw, 2007 & Olshtyn, 2008), на международной конференции «Aquaculture Europe» (Стамбул, Турция, 2007), на 3 Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008), на 9-й международной конференции Европейского хитинового общества «Forthcoming Euchis -2009» (Венеция, 2009), на 17-й Международной конференции по химической термодинамике в России (Казань, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора: участие в планировании и постановке экспериментов, разработка методики отбора проб органов и тканей, пробоподготовка, исследование липидного состава гепатопанкреаса камчатского краба, оценка специфической и неспецифической хитинолитической активности в экстракте гепатопанкреаса камчатского краба, изучение белкового состава гемолимфы, участие в разработке рецептур специализированных кормовых продуктов, математическая обработка, анализ и интерпретация полученных результатов, написание научных статей, докладов и презентаций.
Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел результатов и их обсуждения, выводы, практические рекомендации, список литературы, приложение. Работа изложена на 140 страницах, содержит 36 таблиц и 33 рисунка, библиографию из 144 наименований, в том числе 51 на иностранном языке.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Загорская, Дарья Сергеевна
ВЫВОДЫ
1. Впервые показано, что биохимические показатели гепатопанкреаса и гемолимфы и панциря культивируемого камчатского краба существенно изменяются в зависимости от межлиночной стадии. Общее содержание липидов в гепатопанкреасе колеблется от 9 до 27%, содержание соЗ и соб жирных кислот составляет 18 - 25% от общего содержания жирных кислот, протеиназная активность в экстракте гепатопанкреаса изменяется от 98 до 286 мг белка (о.е.), хитобиазная активность - от 0,40 до 2,29 ммоль/мгхмин, суммарное содержание белка в сыворотке гемолимфы изменяется в интервале 8 - 20%, температуры первого и второго стеклования образцов хитин-белкового комплекса колеблются в интервалах от 111 до 123 и от 136,5 до 145 °С, соответственно.
2. Впервые предложено использование биохимических характеристик, таких как общее содержание жирных кислот и содержание соЗ и соб полиненасыщенных жирных кислот в гепатопанкреасе, протеолитическая и хитобиазная ферментативные активности в экстракте гепатопанкреаса, степень кристалличности хитин-белкового комплекса панциря, суммарный белок в сыворотке гемолимфы, в качестве параметров для оценки физиологического состояния культивируемых крабов, в частности межлиночной стадии, и эффективности технологии культивирования.
3. Дано научное обоснование введения в специализированные корма для ракообразных низкомолекулярного хитозанового компонента, полученного путем гидролиза хитозана ферментным комплексом, выделенным из гепатопанкреаса камчатского краба. Из крабового хитозана с ММ 700 кДа и степенью дезацетилирования 0,85 получены низкомолекулярные образцы хитозана с выходом 85% при 37°С и фермент-субстратном соотношении 1:200 в течение 3 - 20 ч. Протеолитическая активность гепатопанкреаса может быть использована для получения кормового компонента хитин-белкового комплекса из панциря крабов и других ракообразных.
4. Разработана рецептура кормов для ракообразных на основе рыбной (50%) и крабовой (10%) муки с добавлением белкового гидролизата из северной розовой креветки (6%) и низкомолекулярного хитозана. Изготовлены корма с различным содержанием низкомолекулярного хитозана: от 0,05 до 2 %. Корма применены при выращивании постличинок гигантской пресноводной креветки, причем выживаемость составила более 94%.
5. Добавление низкомолекулярного хитозана в корма для культивируемых ракообразных оказывает ростостимулирующее действие. Прирост креветок, которые получали корм с хитозаном, за 2 месяца подопытного периода был выше, в среднем на 14%, чем в контрольном варианте корма без хитозана. Средний привес постличинок сопоставим для всех вариантов корма и, в среднем, составляет от 750 до 850%. Для креветок, получавших с кормом низкомолекулярный хитозан отмечено сокращение межлиночных периодов.
6. Разработана комплексная методика отбора проб органов и тканей ракообразных на примере камчатского краба, таких как мышечная ткань, гепатопанкреас, гемолимфа и панцирь, позволяющая оценивать изменение биохимических показателей на протяжении линочного цикла.
7. Предложен способ решения экологической проблемы загрязнения мест промысла и побережья панцирьсодержащими отходами промыслового и культивируемого краба путем их переработки с помощью протеолитического и хитинолитического ферментного комплекса из гепатопанкреаса, также являющегося отходом переработки краба.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Результаты исследований позволили разработать рекомендации по точному определению линочной стадии культивируемых ракообразных на основании биохимических показателей их органов и тканей.
Для оценки физиологического состояния культивируемых камчатских крабов на основании полученных данных о содержании липидов в гепатопанкреасе, специфических и неспецифических хитинолитических активностей ферментов гепатопанкреаса, физико-химических свойств хитин-белкового комплекса панциря, белков гемолимфы культивируемых ракообразных на разных межлиночной стадиях рекомендуется подразделять четвертую линочную категорию на 3 стадии: 4.0, 4.1; 4.2, описание которых представлено в таблице 1.
Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать введение в корма для культивируемых камчатских крабов на стадиях предлиньки и послелиньки муку из панцирей морских ракообразных с целью обогащения рациона минеральными веществами и хитин-белковым комплексом, необходимых для строительства нового экзоскелета. Для этих целей рекомендуется использовать панцири ракообразных 3.1 и 3.2 промысловых линочных категорий, когда минерализация панциря максимальна.
Результаты исследований позволили наметить пути решения экологической проблемы загрязнения мест обитания и добычи крабов отходами промысла и переработки путем комплексного использования панциря и гепатопанкреаса для изготовления компонентов специализированных кормов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Загорская, Дарья Сергеевна, Щёлково
1. Акулин В.Н., Касьянов С.П., Рыбин В.Г., Караулов А.Е., Юрьева М.И. Исследования липидов гидробионтов // Известия ТИНРО. 2005.- С.335-341
2. Албулов А.И., Комаров Б.А., Самуйленко А.Я. Разработка технологии получения натриевой соли сукцината хитозана // Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 1999. - С.7-8.
3. Албулов А.И., Симонова Л.В., Фролова Е.А. Перспективы применения хитозана в косметике II Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы Пятой конференции. М.: ВНИРО, 1999. — СЛ17-118.
4. Албулов А.И., Шмидт Е.В., Варламов В.Г., Останина Е.С., Голуб Ю.С., Голуб О.Ю., Крыжановская Е.В. Противотуберкулезная активность хитозана // Ветеринария и кормление. 2007. - №5. - С.10-12
5. Берг Л. Г. Введение в термографию. М.: Наука 1969. - 395с.
6. Богачев А.Г. Влияние хитозана на организм цыплят-бройлеров // Мат. VIII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2006. С. 169-170.
7. Богданов В. Д. Эмульсионные системы, содержащие хитозан // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. Материалы третьей Всесоюзной конференции. М: ВНИРО, 1992. -С.76-83.
8. Быков В.П. Перспективы организации в рыбной отрасли промышленного производства хитина и хитозана // Тезисы докладов четвертой Всероссийской конференции «Производство и применение хитина и хитозана.» М, 1995. - С.3-5
9. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производств хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы Пятой конференции. М.: ВНИРО. - 1999. - С.15-18.
10. Варламов В.П., Ильина А.В., Банникова Г.Е., Немцев С.В., Ильин Л.А., Чертков К.С., Андрианова И.Е., Платонов Ю.В., Скрябин К.Г. Способполучения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов // Патент РФ №2188829, 2000, Б.И. № 25.
11. Виноградов Л.Г. Годичный цикл жизни и миграции краба в северной части западнокамчатского шельфа // Известия ТИНРО. — 1945. Т.19. -С.3-54.
12. Гамыгин Е.А, Передня А. А, Шоль А. В Новые комбикорма для аквакультуры // Зооиндустрия. 2001. - №8. - С.
13. Дамсгорд Б. Поведение и рост искусственно выращенного в Норвегии камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) II Сб. научн. Тр. : Марикультура в прибрежной зоне северных морей. Мурманск: ПИНРО. -2000. С.19-26.
14. Девятов П.Н., Фролов А.В., Нифантьев Н.Э. Использование гидрохлорида хитозония для профилактики и лечения инфекция молодняка гусей // Мат. VIII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 2003. — С.25-428.
15. Зубкова Н.А. Опыт содержания камчатского краба в аквариуме // Тр. Мурм. морск. биол. Ин-та. 1964. Вып. 5. №9. С. 105-113.
16. Иванов А.В. Промысловые водные беспозвоночные // М.: Сов. Наука. -1955.-С.352.
17. Иванов П.Ю., Щербакова Н.В. Опыт и проблемы выращивания камчатского краба в контролируемых заводских условиях // Изв. ТИНРО. 2005. - Т. 143. - С.305-326.
18. Ильина А.В., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. -Т.37. - №2. - С.160-163.
19. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана //Биоорг. химия. 2007. - Т. 33. - С. 156-159.
20. Ильина А.В., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002.-Т.38.-№ 2.-С.132-135.
21. Исаев В.А., Руденская Т.Н., Купенко О.Г., Степанов В.М., Попова ИМ., Диденко Ю.Г. Способ получения препарата коллагеназы патент 2008353 от 5 августа. Бюлл. изобр. №4, 1994 г.
22. Камчатский краб в Баренцевом море. Изд. 2-е, перераб. И доп. — Мурманск: Изд-во ПИНРО, 2003.-С. 292-299.
23. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов // Пер. с англ. В.А. Вавера. 1975.
24. Кизеветтер И.В., Некрасов А.И. Материалы по биологии, промыслу и обработке камчатского краба. Производство крабовых консервов // Известия ТИНРО. 1945. - Т.19. - С.107-117.
25. Киселев А.Ю., Илясов А.Ю., Филатов В.И., Богданова JI.A. Технология выращивания гигантской пресноводной креветки Macrobrachicum rosenbergii в установке с замкнутым циклом водоснабжения // М.:ВНИЭРХ. 1995. - 12с.
26. Кислицын Ю.А, Ребриков Д.В, Дунаевский Я.Е, Руденская Т.Н. Выделение и первичная структура трипсина камчатского краба Paralithodes camtschaticus II Биоорганическая химия. — 2003. — Т. 29. -N3. — С.269-276.
27. Ковачева Н.П. Воспроизводство камчатского краба {Paralithodes camtschaticus) с использованием искусственной морской воды в аппаратах типа «Акватрон» // ЭИ ВНИЭРХ. Сев. Аквакультура. 2000. -Вып.1. - С. 14-27.
28. Ковачева Н.П. Способ воспроизводства ракообразных (камчатский краб) // 2003. Патент РФ №2200386 Россия. Бюлл. №8.
29. Ковачева Н.П. Камчатский краб как новый объект марикультуры // ЭИ ВНИЭРХ Сер. Марикультура М. 2005. - 40с.
30. Ковачева Н.П., Жигин А.В., Эпельбаум А.Б., Борисов P.P. Способ воспроизводства ракообразных (камчатский краб) // 2005. Патент № 2261594 Россия, МПКА01К61/00. Бюлл. №28.
31. Ковачева Н.П. Искусственное воспроизводство и культивирование морских и пресноводных ракообразных отряда Decapoda: Автореф. дисс. док. биол. наук. М.:ВНИРО, 2006а. 53с.
32. Ковачева Н.П. Камчатский краб новый объект культивирования на побережье Баренцева моря // Материалы 7-й Всероссийской конф. по промысловым беспозвоночным, М.: ВНИРО, 20066, 284-286.
33. Ковачева Н.П. Аквакультура ракообразных отряда Decapoda: камчатский краб Paralithodes camtschaticus и гигантская пресноводная креветка Macrobrachium rosenbergii. М.: Изд-во ВНИРО, 2008, 240 с.
34. Костецкий Э.Я. Фосфолипидный состав моллюсков и ракообразных // Биология моря, 1985. №2. - С. 52-61
35. Крапивина Е.В. Естественная резистентность, иммунный статус и методы их повышения у сельскохозяйственных животных в условиях различного загрязнения почв радиоцезием. Дисс. доктора биол. наук, Брянск: БГСхАк, 2003. с.
36. Кузнецов П.А., Албулов А.И., Юпокина В.И., Гринь С.А., Крапивина Е.Б., Иванов Д.В., Крыжановская Е.В. Изучение иммуномодулирующих свойств сукцината хитозана // Ветеринария и кормление 2007. - №5 - С. 12-13.
37. Культивирование тихоокеанских беспозвоночных и водорослей // Сб. научн. тр. / Ред. В.Г. Марковцев, Ю.Э. Брегман, В.П. Пржеменецкая и др. М.: Агропромиздат, 1987. - 192с.
38. Лебедев П.Т., Усович А.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных. М.: Россельхозиздат, 1976. — 359с.
39. Левин B.C., Камчатский краб Paralithodes camtschaticus. Биология, промысел, воспроизводство. СПб.: Ижица, 2001. - С.63-67.
40. Лопатин С.А. Хитозан в хроматографии // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение М.: Наука, 2002 - С.247 — 254.
41. Лопатин С.А., Папков В.А., Варламов В.П. Гидролиз хитозана иммобилизированными ферментными препаратами // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". -М.: ВНИРО, 2003. С.398-402.
42. Лютова Л.В., Карабасова М.А. Андреенко Г.В., Руденская Г.Н., Исаев В.А., Брусов А.Б. Действие протеолитического препарата мокриазы на состояние рубцовой ткани в условиях in vitro // Вопросы медицинской химии, 1999. т. 45 - №5.
43. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология, 1999. т. 35 - №6 - С.624-628.
44. Мортенсен А. Королевский краб наилучший объект для разведения // Рыбн. Хоз-во. Сер. Аквакультура: Информпакет «Аквакультура: проблемы и достижения» - ВНИЭРХ, 1996. - В.7 - С.22-24.
45. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидробионтов: получение, свойства и практическое использование. Мурманск: ПИНРО, 20016. - С.97.
46. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Белковые гидролизаты из отходов переработки морепродуктов // Птицеводство, 2002. №1 - С.21-23.
47. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных. Мурманск: Изд. ПИНРО, 2002а. - С.56.57,71-89.
48. Немцев С.В. Способы получения хитина и хитозана // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования.
49. Материалы Третьей всесоюзной конференции.- М.: ВНИРО, 1992. С.7-15
50. Немцев С.В., Али Салем Омер Технологические особенности хитиновых пластин головоногих моллюсков // Технология переработки гидробионтов. Международная конференция.- М.: ВНИРО, 1994.- С. 125127.
51. Немцев С.В., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г. ., Хисматуллин М.Р., Лариков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора — новый продукт пчеловодства// Пчеловодство 2001. - №5. - С.50-51.
52. Немцев С.В., Ильина А.В., Шинкарев С.М., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного хитозана // Биотехнология 2001 -№ 6 - С.37- 42.
53. Немцев С.В. Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных. М.: Изд. ВНИРО, 2006 - С.8-52
54. С.В. Немцев, В.М. Быкова, Е.А. Ежова, И.М. Сорокоумов, Д.С. Загорская, Н.П. Ковачева Панцирь акклиматизированного камчатского краба. Экологические проблемы и пути их решения // Экология и промышленность в России, сентябрь 2007, С. 43-45
55. Новейшие методы исследования полимеров / Под ред. Б. Ки. М.: Мир, 1966.-571 с.
56. Новиков В.Ю., Мухин В.А. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus И Прикладная биохимия и микробиология.-2003.-Т.39.-№5.-С.530-535.
57. Новиков В.Ю., Мухин В.А., Рысакова К.С. Свойства хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus // Прикл. биохимия и микробиология — 2007.— Т.43. №2. — С. 178-183.
58. Нудьга Л.А. Биоматериалы на основе хитина и хитозана. Совершенствование производства хитина и хитозана из панцырьсодержащих отходов криля и пути их использования // М., 1992. с. 40-44.
59. Останина Е. С., Лопатин С. А., Варламов В. П. Получение хитина и хитозана из восковой моли Galleria mellonella II Биотехнология. 2007. -N 3. - С.38-45.
60. Орлов Ю.И. К биологии камчатского краба и акклиматизации его в водах Баренцева моря // Рыб. Хоз-во. Сер. Аквакультура: Информпакет «Аквакультура: проблемы и достижения». ВНИЭРХ, 1996. В.1-2 - С.З-19.
61. Павлов В.Я., Жизнеописание краба камчатского, Paralithodes camtschaticus (Tilesius, 1815). -М.: ВНИРО, 2003. С.55-62.
62. Переход Е.А. Олигосахарины при фитофторозе картофеля // Дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. — М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха, 1997. -22с.
63. Пономарев С.В., Гамыгин Е.А., Пономарева Е.Н., Сергеева Ю.В. Продукты глубокой переработки крабов в комбикормах для объектов аквакультуры //Моногр., Астрахань: АГТУ, 2007. — 116с.
64. Проссер Л., Браун Ф., Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1967. - С 630-632.
65. Рысакова К.С. Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря. Автореферат дисс. канд. биол. наук. Петрозаводск, 2008. 38с.
66. Рысакова К.С., Новиков В.Ю., Мухин В.А., Овчинникова С.И. Обнаружение хитинолитической активности в пищеварительных органах гидробионтов Баренцева моря // Вестник МГТУ.— 2006.— Т. 9, №5.— С.786-791.
67. Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. Применение хитозана в качестве адаптогена для медоносной пчелы // Мат. IX Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2008. С.252-254.
68. Самородова И.М. Применение хитозана для лечения острых отравлений кроликов гетероциклическими соединениями // Мат. VI Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2001. С.225-227.
69. Семенова С.А., Руденская Г.Н., Лютова Л.В., Никитина О.А. Выделение и свойства изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба Paralithodes camtschatica II Биохимия — 2008. Т.73 -В.10 - С.1403-1413.
70. Скобелева В.Б., Руденская Г. Н., Руденская Ю. А. Изучение энзиматической активности иммобилизированной мокриазы // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. - Т.41 - №6 - С.395-398.
71. Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А., Дормидонтова О.В., Логинова Н.В. Биодеструкция хитозана под действием микроскопических грибов //
72. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы пятой конференции. -М.: ВНИРО, 1999. С. 282.
73. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих / Под ред. Быкова В.П. -М.: ВНИРО, 1999. С 132-135.
74. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. - 281с.
75. Топурия Л.Ю. Иммунологические показатели у телят под действием хитозана // Аграрная наука. 2005. - №7. — С.28-29.
76. Топурия Л.Ю. Применение хитозана для лечения эндометритов у коров // Молочное и мясное скотоводство. 2006. — №3. — С. 26-27.
77. Топурия Л.Ю., Топурия Г.М., Мерзляков С.В. Состояние иммунной системы коров при применении хитозана // Ветеринарный врач. — 2006. — №3.-С. 36-40.
78. Топурия Л.Ю. Структурно-функциональная и клиническая оценка влияния иммуномодуляторов природного происхождения на организм животных. Автореферат доктора биол. наук. Оренбург, 2008. 34с.
79. Урьяш В. Ф., Мочалов А. Н., Покровский В. А. Установка для дифференциального термического анализа // Термодинамика органич. соедин.: Межвуз. сб. / Горький: ГТУ. 1978. - В.7. - С.88-92.
80. Фомичев Ю.П., Шайдуллина Р.Г., Федоров Ю.Н., Стрекозова Е.Н., Заболотский В.А. Влияние хитозана на резистентность и рост телят // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". М.: ВНИРО, 2003 - С.210-214.
81. Шагинян К.А., Изотова Л.С., Йомантас Ю.В., Строгин А.Я., Степанов В.М. // Биохимия. 1980. - Т.45. - С 2083-2095. Название
82. Шевченко Д.Г. Эффективность продуктов глубокой перерабтки крабов в составе комбикормов для молоди радужой форели // автореферат к.б.н. — Москва, 2005. 28с.
83. Эпельбаум А.Б. Питание камчатского краба Paralithodes camtschaticus (Tilesius 1815) на ранних стадиях онтогенеза в искусственных условиях // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.:ВНИРО, 2004. 24с.
84. Эрнст JI.K., Злочевский Ф.И., Ерохин В.А., Клецко Н.Г. Энтомологический метод утилизации органических отходов животноводства, в частности, свиноводства // Аграрная Россия. 2000.-№5 С.51-57.
85. Chang E.S. Pysiological and biochemical changes during the molt cycle in decapod crustaceans: an overview // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. -1995. №193. -P.l-14.
86. Epelbaum A.B., Kovatcheva N.P. Daily food intakes and optimal food concentrations for red king crab {Paralithodes camtschaticus) larvae fed Artemia nauplii under laboratory conditions // Aquacult. Nutrition. 2005. -V.l 1. - №6 - P.455-461.
87. D'Abramo L.R., New M.B. Nutrition, feeds and feeding. // Freaswater Prawn culture: the farming of Macrobrachium rosenbergii. / New M.B., Valenti W.C. (Eds.) UK. 2000. - P.203-220.
88. Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., Goasdoue N. // Carbohydr.Res. 1999. - V.322. - P.291-297. Название
89. Folch J., Lees M. Sloan-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // Biol. Chem. 1957. V. 226 №1, p. 497-509.
90. Gamzazade AI., Slimak VM., Skljar AM., Stykova EV., Pavlova S-SA., Rogozin SV. // Acta.Polym. 1985. - V.36. - P.421-424. Название
91. Hagerman L. Haemocyanin concentration of juvenile lobsters (Homarus gammarus) in relation to moulting cycle and feeding conditions I I Mar. Biol. -1983,-V.77.-P.11-17.
92. Hood M.A. Ferst International Conference for Chitin/Chitosan. Abstr., Boston, 1977. P. 44-45. Название
93. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2003.-V.30.- №.11.-P.627-635.
94. Jeckel W.H., de Moreno J.E.A., Moreno V.J. Changes in biochemical composition and lipids of the digestive gland in females of the shimp Pleoticus muelleri (Bate) during the molting cycle // Сотр. Biochem. Physiol. 1990. - V.96B. P.521-525.
95. Ikeda I., Sugano M., Yoshida K., Swaki K., Iwaamoto Y., Hatano K. Effects of chitosan hydrolyzates on lipid absorption and on serum and liver lipid concentration in rats // J. Agric. Food Chem. 1993. - V.41. - № 3. - P.431-435.
96. Ilyina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of lowmolecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii II Process Biochemistry.-1999.- V.34.- №.9.-P.875-878.
97. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization // Carbohydrate Research.-2003.-V.338.-№ 12.-P.1283-1290.
98. Koga D. Biological functions and properties of chitinase isozymes from yam // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A.Domard, CJeuniaux, R.Muzzarelli. G.Roberts. France. 1995.-V.1. - P.70-77.
99. Kubicek-Pranz EM., Kammel WP., Streichsbier F., Toth J., Kubicek C.P. // Chitin in Nature and Technology / Ed. Muzzarelli RAA. N.Y.; L.: Plenum Press. 1986. -P.243-249.
100. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Eur. J. Biochem.-2004.-V.271 .-№4.-P.713-723.
101. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochimica et Biophysica Acta.-2004.-V. 1670.-Ж2.-P.137- 146.
102. Kurata H. Studies on the larva and postlarva of Paralithodes camtschatica. II Feeding habits of the zoea // Bui. Hokkaido Reg. Fish. Res. Lab. 1960. -V.21. - P.1-9.
103. Laufer H., Borst D., Baker F.C., Sinkus C., Reuter M., Tsai L.W., Schooley D.A. Identification of a juvenile hormone-like compound in a crustacean // Science. 1987a - V.235. - P.202-205.
104. Laufer H., Landau M., Homola E., Borst D. Metyl farnesoate: its site of synthesis and regulation of secretion in juvenile crustacean // Insect Biochem., 1987b.-V.17. P.1129-1131.
105. Maggie В., Covington M.D. Omega-3 Fatty Acids // Amer. Fam. Physician, 2004.-V.70.-N.1.- 133-140
106. Marukawa H. Biological and fishery research on Japanese king crab Paralithodes camtschaticus (Tilesius) // J. Imper. Fish. Exp. Stat. Tokyo. -1933.-V.37-№4. -P.l-152.
107. Meens J., Schreiber C., Hain M. Screening of marine fungi for new chitin deacetylase enzymes // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy.-2001.-P.533-539.
108. Miller GL. // Anal.Chem. 1959. - V.31. - P.426-428. Название
109. Mortensen A. King crab is the best crustacean prospect // Fish Farm. Intern. -1995.-V.22. №9.-P.50-51.
110. Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Depolymerization of chitosan and substituted chitosan with the aid of a wheat germ lipase preparation // Enzyme and microbial technology.- 1995.-V.17. №.6. P.541-545.
111. Nakanishi T. Rearing conditions of eggs, larvae and postlarvae of king crab Paralithodes camtschatica II Bull. Jpn. Sea. Nat. Fish. Res. Inst. 1987. -V.37. - P.57-161.
112. New M.B., Valenti W.C. Freshwater prawn culture. The farming of Macrobrachicum rosenbergii II Nottingham: Blackwell Sci. 2000. - P.443.
113. Paul A.J., Paul J.M., Coyle K.O. Energy sources for first-feeding zoeae of king crab Paralithodes camtschaticus (Tilesius)(Decapoda, Lithodidae) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1989. - V.130. - P.55-69.
114. Porfir'eva O.V., Yusupova D.V., Zotkina N.L., Sokolova R.B., Gabdrakhmanova L.A. Chitinolitic complex of Serratia marcescens and peculiarities of its biosynthesis // Microbiology. 1997. - V.66. - P.347-353.
115. Reetarani S. P., Ghormade V., Deshpande M. V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and Microbial Technology.-2000.-V.26.-№ 7. P.473-483.
116. Riddiford L.M. Cellular and molecular actions of juvenile hormone: general considerations and premetamorphic actions // Adv. Insect Physiol. 1994. -V.24. - P.213-274.
117. Rudenskaya G.N, Kislitsin Yu.A, Rebrikov D.V. Collagenolytic serine protease PC and trypsin PC from king crab Paralithodes camtschaticus: cDNA cloning and primary structure of the enzymes // BMC Structural Biology. 2004. - V.4, issue 2. - P. 1-9
118. Sato S., Takana S. Study on the larval stage of Paralithodes camtschatica (Tilesius) // Sci. Pap. Hokkaido Fish. Sci. Inst. 1949. V. 3. P. 18-27.
119. Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Rebrikov D.V., Isaev V.A. cDNA cloning, purification and properties of Paralithodes camtschatica metalloprotease // Protein and Peptide Letters. 2006. V.13 (6). P.571-575.
120. Stevens B.G. Observations on molting of red king crab // Crab 2001. Crabs in cold water regions: boil., manag., econ. Abstr. Allaska Sea Grant College Progr. Fairbanks: Univ. of Alaska. 2001. - P.3.
121. Schrempf H. The chitinolytic system of Streptomysetes // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A. Domard, C. Jeuniaux, R. Muzzarelli. G.Roberts. France. 1995.-V.l. - P.123 - 128.
122. Spector T. //Anal.Biochem. 1978. - V.86. - P. 141-146. Название
123. Tamone S.L., Chang E.S. Methyl farnesoate stimulates ecdisteroid secretion from crab Y-organs in vitro // Gen. Сотр. Endocrinol. 1993. - V.89 -P.425-432.
124. Van Wormhoudt A., Sellos D. Modification of synthesis and acetylation of hepatopancreas chromatin components in Palaemon serratus during the intermolt cycle // Сотр. Biochem. Physiol. 1981. - V.68B. - P.49-56.
125. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. -1991. V.13. - №5. - P.281-285.
126. Wang S-L., Chio S-H. Deproteinization of shrimp and crab shell with the protease of Pseudomonas aeruginosa K-187 // Enzyme and microbial technology. 1998. - V.22. - N.7. - P.629-633.
127. Yudin A.I., Diener R.A., Clark W.H., Chang E.S. Mandibular gland of the blue crab, Callinectes sapidus II Biol. Bull. Woods Hole Mass. 1980. -V.159 - P.760-772.
128. Zhang J., Rao G., Wang Z., Meng X., et al. Production effect of Erioheir sinensis larvae culture with micro-capsulated diets to replace living foods // J. Shanghai Fish. Univ. 1998. - V.7. - P.235-240.
129. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research. 1999. - V.320. - N.3/4. - P.257-260.1. ЪЪ
130. УТВЕРЖДАЮ ектор ВНИРО . Котенев 2007 г.1. Методика
131. Комплексного отбора проб различных органов и тканей камчатского краба
132. Цель работы: Препаративная заготовка образцов органов и тканей крабов для исследования биоконверсии различных биологически активных соединений в процессе линыси и межлиночный период.
133. Медицинские ножницы для препарирования
134. Блендер для измельчения тканей и органов
135. Пинцет для удаления посторонних органов
136. Спиртовые маркеры для нумерации пробирок
137. Сульфат аммония и этиловый спирт для фиксирования проб8. химическая воронка и мелкий газ (№70)
138. Целлофановые пакеты высокой прочности для хранения проб панциря
139. Стерильные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 5, 10, 15, 50 мл11. Медицинские перчатки1. Yi
140. Штангенциркуль, тетрадь для записей, канцелярские принадлежности1. Отбор проб:
141. Для электрофоретического анализа состава белков гемолимфу замораживают при -18°С.2. Отбор панциря
142. Образцы хранят в плотных полиэтиленовых пакетах снабженных этикетками при комнатной температуре (20-25°С). Сушка экзувия и панциря занимает 1,5-2 суток, второй панцирь до 5 суток при умеренной влажности помещения (50-60 %).3. Отбор гепатопанкреаса
143. Общее время комплексного отбора проб для одной особи краба составляет от 40 до 60 минут.
144. Зав. лабораторией воспроизводства ракообр1. Научный сотрудник1. Д.б.н.1. Научный сотрудникроссийская федерация
145. ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «биопрогресс»141142, Московская обл., Щелковскийр-он, п. Биокомбинат, ВНИТИБП, тел. 8 (256) 3-24 32; 7-34-991. ПАСПОРТ № 31
146. Препарат:^iWHOMjCl^ UltM-Л-Серия: Pi Q'jCp/'&dmx Масса: ^ Q КЛ'
147. Дата изготовления: С. О6, 05'г-Получатель: &МСОРО
148. Наименование показателей Характеристика и результаты испытания1. Внешний вид nvfWlU&k^1. Цвет
149. Запах С/Ш- Ц*СОС{9 IL/U-eJC-sCsCCJ
150. Массовая доля влаги, %,. . 1 -УХ, V
151. Массовая доля аминного азота, %, .1. Гл. технолог Контролер1. М.А. Фролова// Л.Н. Морозова/'российская федерация
152. ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВОбиопрогресс»141142, Московская обл., Щелковский р-он, п. Биокомбинат, ВНИТИБП, тел. 8 (256) 3- 24 32; 7- 34 - 99; 995-75-331. ПАСПОРТ №
153. Препарат: JCu,rrW3Я/И ItClЩЛ^Ш/ Количество: Qзлучатель: 9УУУ7 в'УЦ/У?1. Получатель Серия: J)J.
154. Дата изготовления: QJj. flj??.
155. Наименование показателей Характеристика и норма Методы контроля
156. Внешний вид Тонкодисперсн ый порошок смл> гпЛе
157. Цвет От белого до кремового или розового Кfitc
158. Вкус Свойственный данному виду продукта постороннего привкуса
159. Macci . доля воды,.% не более 10,0+ 1 а
160. Массовая доля хитозана, % не менее 99 Off, Г
161. Массовая доля золы, % не более 1,0рН, не более 7,5 i; 6'9
162. Вязкость I % водного раствора, ССт, не более 30 ol¥S /
163. Молекулярная масса, кДа Jtf>
164. Степень деацетиллирования, %
165. Заключение: Качество соответствует ТУ 9289-002-11418234-99. «ДХ» Рклгигёкл 200/ г.1. УТВЕРЖДАЮ Врио директора
166. ФГУП Всероссийского научно-исследовательстЕОюао^ института рыбного хозяи^ва! и.,-.(^^цографии (ВНИРО) Щ1. ГлубоковВЁйй1. Ы ^ ^30 »1. АКТоб испытании специализированных кормов для ракообразных
167. Опытные партии гранулированных комбикормов по разработанной нами рецептуре изготавливали на лабораторной и пилотной установках ВНИИПРХ, моделирующих промышленную технологию кормопроизводства для рыб.
168. Оценка рыбоводно-биологических характеристик позволяет заключить, что экспериментальные корма оказывают ростостимулирующий эффект имогут быть включены в рацион культивируемых ракообразных.j ■
169. Зав. лабораторией воспроизводства ре1. Научный сотрудник1. Научный сотрудник1. ФГУП «ВНИРО», д.б.н.1. Кряхова Н.В.1. Загорская Д.С.1. Ковачева Н.П.
-
Загорская, Дарья Сергеевна
-
кандидата биологических наук
-
Щёлково, 2009
-
ВАК 03.00.23
- Биология, распределение и динамика численности камчатского краба Paralithodes camtschaticus (Tilesius, 1815) в Баренцевом море
- Физиологические основы жизнедеятельности камчатского краба Paralithodes camtschaticus в условиях транспортировки
- Особенности динамики питания десятиногих ракообразных в раннем онтогенезе
- Воспроизводство и культивирование морских и пресноводных ракообразных отряда Decapoda
- Влияние молоди камчатского краба на прибрежные бентосные сообщества Баренцева моря
