Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигосахарины при фитофторозе картофеля

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Олигосахарины при фитофторозе картофеля"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н. БАХА

Р Р 5 О Д На правах рукописи

2 4 НОЯ кн?7

ПЕРЕХОД Елена Анатольевна ОЛИГОСАХАРИНЫ ПРИ ФИТОФТОРОЗЕ КАРТОФЕЛЯ 03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в лаборатории индуцированной устойчивости

растений Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

0.Л. Озерецковская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Е.П. Феофилова.

доктор биологических наук, профессор A.M. Носов

Ведущая организация: Главный Ботанический Сад РАН

Защита диссертации состоится nSn ^kMjiA 1997 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета (К. 002. 96. 01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук ё Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва. Ленинский пр., 33. корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва. Ленинский пр., 33, корпус 1).

Автореферат разослан "//" 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.И. Молчанов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Во второй половине 70-х годов был открыт новый тип регулятор-ных молекул, получивший название "олигосахаринов" (Ayers et al.. 1976; Albersheim, Valent, 1978; Albersheim, et al.. 1983). Олигоса-харины (ОС) образуются при частичном расщеплении углеводсодержаших биополимеров клеточных стенок грибов и растений. В крайне низких концентрациях, на 2-3 порядка ниже, чем для известных фитогормонов. ОС контролируют защитные функции растений, а также процессы их роста. морфогенеза и взаимодействия с грибами - симбионтами (Albersheim, Darvill, 1985).

Предполагается, что ОС являются сигнальными молекулами, участвующими в передаче и реализации информации у растений. Интерес к ОС связан не только с возможностью исследования с их помощью механизмов регуляции метаболизма растений, но и с перспективой практического использования регуляторов нового класса в сельскохозяйственном производстве и биотехнологии. Исследованию структуры и биологической функции ОС посвящены многие обзоры (Элберсгейм, Дарвилл. 1985; Aldington et al., 1991; Dixon, Lamb, 1991; Ryan, Farmer, 1991; Albersheim et al., 1992; Тарчевский, 1992; Aldington, Fry. 1993; Усов. 1993; Озерецковская, Роменская, 1996).

К настоящему времени известны четыре основные группы ОС. две из которых - фрагменты^-глюканов и хитина (хитозана), - образуются при расщеплении клеточных стенок грибов, тогда как две другие, -фрагменты пектинов и гемицеллюлоз, - являются продуктами деградации клеточных стенок растений.

В данной работе предполагалось исследовать иммунорегулирующие функции ОС на' патосистеме картофель - возбудитель фитофтороза (Phytophthora infestans Mont, de Вагу)-. Роль ^-1,3- 1.6 - глюканов во взаимоотношении этих партнеров к настоящему времени уже была достаточно хорошо исследована (Чалова и др.. 1976; Метлицкий и др., 1979; Doke et al., 1979; Garas et al.. 1979; Озерецковская и др.. 1982). Участие пектиновых ОС в регулировании устойчивости картофеля к P. infestans подвергаются сомнению (Озерецковская и др., 1993). Две остальные группы ОС остаются пока еще мало исследованными. Так, о роли хитинов (хитозанов) в контролировании устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза имеются лишь немногие сообщения (Максимов, 1995; Тютерев. 1995), тогда как о способности олигомеров ксилоглюкана, как основного представителя гемицеллюлоз. регулиро-

вать защитные реакции растений до самого последнего времени вооб ничего известно не было.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование иммунорегулируш способности олигосахаридов хитозана и ксилоглюкана в патосисте картофель - Phytophthora infestans.

Задачи исследования.

1. Провести поиск фрагмента хитозана, способного системно продолжительно защищать картофель от фитофтороза. Исследовать мех низда. определяющие защитные функции такого фрагмента.

Z. Исследовать возможность олигомеров ксилоглюкана регулир вать устойчивость картофеля к возбудителю фитофтороза. Оценить п раметры такого регулирования, а также связать- биологическое дей твие со структурными особенностями фрагментов.

Научная новизна работы.

Обнаружен водорастворимый хитозан с молекулярной массой (М.М 5 кД. способный системно и продолжительно защищать картофель возбудителя фитофтороза. Хитозан индуцирует у картофеля образован .фитоалексинов. PR - белков, ингибиторов сериновых протеиназ и суп роксидного радикала кислорода.

Впервые показано, что продукты глубокого гидролиза ксилоглюк на. так же как и некоторые его индивидуальные олигомеры. способны низких концентрациях системно и продолжительно подавлять устойч вость картофеля к возбудителю фитофтороза. Минимальным фрагмент ксилоглюкана, оказывающим иммуносупрессорное действие на картофел является трисахарид. Замещение ксилозы в молекуле трисахарида любой из испытанных фрагментов изменяло супрессорную активность элиситорную. Исключительно важную роль в регулировании иммунно статуса картофеля к P. infestans выполняет терминальный cL-L-фук зильный остаток. Олигосахариды. лишенные фукозы, становятся биол гически неактивными, теряя как элиситорные. так и супрессорн свойства.

Практическая ценность работы.

Обнаружен хитозан, с помощью которого возможно системно и пр должительно индуцировать фитофтороустойчивость клубней картофеля.

Установлена недопустимость присутствия ксилоглюкановых иммун супрессоров в рабочем растворе элиситоров, которыми предполагает индуцировать устойчивость картофеля. Находящийся в растворе супре

сор может доминировать над элиситором. в результате чего иммунный статус растений окажется подавленным.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на II конференции "Регуляторы роста и развития растений" (г. Москва. 1993); Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург. 1995): 18 International Carbohydrate Syropozlum (Milan. 1996).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 9 печатных работ и патент.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования служили клубни картофеля сорта "Истринский" с геном фитофтороустойчивости Rj и две расы P. lnfestans: несовместимая с сортом картофеля "Истринский" раса 3.4 и совместимая раса 1.3.

Гриб выращивали в течение И дней на овсяно-агаровой среде. Инфицирование картофеля осуществляли суспензией зооспор плотностью 5-10^ зооспор/мл.

В работе использовали:

- три хитозана с М.М. 200, 24 и 5 кД и степенью ацетилирования 15%. соответственно растворимых в 0,3 И; 0.1 М натрий ацетатном буфере. рН 5.6 и воде. Два последних хитозана получены д.х.н. В. П. Варламовым (центр "Биоинженерия" РАН) с помощью ферментативного гидролиза исходного хитозана с М.М. 200 кД комплексом хитиназ StreptomyceS Kurssanovii (Варламов, Стояченко. 1991).

- ксилоглюкан, выделенный и очищенный из культуральной жидкости суспензионной культуры клеток Dloscorea deltoidea, продукта его ферментативного гидролиза целлюлазой (Onozuka R-10). а также три индивидуальных ксилоглюкана. предоставленные проф. А. И. Усовым (ИОХ. РАН).

- ряд олигомеров. близких по структуре к фрагментам ксилоглюкана, полученные к.б.н. В.Е. Пискаревым (ИНЭОС РАН).

Биологическую активность вышеперечисленных веществ и фракций испытывали на двух моделях (рис.1). Для этого поверхность дисков и ' целых клубней картофеля обрабатывали различными концентрациями испытуемых веществ, а затем через определенные сроки

инфицировали суспензией зооспор патогена (пояснения см. на рисун 1 и далее в тексте). Использование этих моделей позволяет оцени способность веществ вызывать у клубней картофеля как локальную, т и системную продолжительную фитофтороустойчивость.

Обработка препаратом Время инку- Инфицирова- Модель

или водой (контроль) бации ние

Рис. I. Модели биотестов.

О распространении по тканям клубня несовместимой с испытуемь сортом картофеля расы 3.4 судили по числу некротизированных (инЗ» цированных) клеток. Степень поражения тканей совместимой расой пе тогена 1.3 оценивали по глубине его проникновения, подсчитывая ряд клеток, зараженных гифами гриба, считая от поверхности инфицировг ния.

Для каждого варианта отбирали по 10 дисков, из которых изгс тавливали срезы. В каждом срезе учитывали 600-800 клеток. Даннь обрабатывали статистически с вероятностью безошибочного прогноз 0.95. В работе приведены средняя арифметическая -М и абсолютна

максимальная погрешность д.

Фунгитоксичность диффузатов определяли, измеряя длину ростковой трубки проросших зооспор Р. infestaos с помощью окулярной линейки.

Фитоалексин картофеля - ришитин - определяли методом "инфекционных лунок" по реакции с концентрированной серной кислотой (Озе-рецковская и др. 1975), затем пересчитывали по калибровочной кривой, построенной по чистому ришитину, и выражали в мкг на мл диф-Фузата.

Активность 3 - глюканазы измеряли по количеству образовавшейся глюкозы в реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой при 582 нм. используя в качестве субстрата ламинарин (Sigma. США) (Elad et al.. 1982). Субстратом для измерения хитиназной активности служил коллоидный хитин. Количество' образовавшегося й-ацетилглюкозамина определяли по реакции с 3,5 - динитросалициловой кислотой (Miller, 1959).

Ингибиторы протеиназ определяли по способности подавлять., про -теолитическую активность трипсина ("Serva", ФРГ). Субстратом для действия трипсина служил азоказеин (Dod et al., 1978). Продукты гидролиза азоказеина измеряли при 440 нм.

Содержание супероксидного радикала кислорода определяли методом Доука (Doke, 1983) при окислении нитроголубого тетразолиума. ("Sigma") при 560 нм. В контрольные варианты опыта добавляли супероксид дисмутаз/ ("Sigma"), которая элиминирует супероксид радикал (СОЙ)..

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Иммунорегулирущая роль хитозана и его фрагментов.*

Хитозаны представляют собой гомополимеры ^-1, 4- связанных- Л-глюкозаминных остатков, небольшая часть которых ацетилирована. -Эти полимеры отсутствуют у высших растений, но входят в состав клеточных стенок многих фитопатогенных грибов (Феофилова. 1983). Хитозаны с единственным типом связи могут различаться только степенью полимеризации и ацетилирования, а также расположением ацетильных групп.

* Эта часть работы выполнена в совместных исследованиях с лабораторией инженерии ферментов центра "Биоинженерия" РАН, руководимой д. х.н. В. П. Варламовым.

В настоящем разделе приводятся данные по испытанию иммунорег лирущей активности трех хитозанов. различающихся по молекулярн массе: исходного хитозана 200 кД и его фрагментов с М.М. 24 и 5 к На первом этапе работы предстояло оценить, индуцируют ли ис ледуемые хитозаны фитофтороустойчивость клубней картофеля. Извес но, что индуцированная устойчивость растений может быть локальной системной (Ross, 1961: Озерецковская и др.. 1994). Локальная устс чивость развивается только в тех тканях, которые соприкасались индуцирующим патогеном'или элиситором. Системная устойчивость вс никает по всем тканям растения или его органа, независимо от мес нанесения индуцирующего агента. Соответствующие данные для йспыту мых хитозанов приведены на рис. 2. Наибольшей способностью индуи ровать локальную устойчивость дисков картофеля (Модель 1) обла,Е хитозан с М.М. 5 кД, (рис. 2, А), тогда как исходный хитозан совс не защищал диски, а хитозан с М.М. 24 кД обладал лишь небольи элиситорной активностью.

а б

80

60

40

20

8. К

£

^—

:----^ \ V \>да ей

.

—11-1---1-1—

5

а. £ 100

К

ИУ

<х

к

Щ ы 60

•

?

А «

1

го

0,01

0.1

I

и

100

looo

i и i;

Диск от поверхности обр«401

Хктазыы, икГ'Шк'

Рис. 2. Способность хитозанов вызывать локальную (А - Модель I) и системную продолжительную (Б - Модель 2. ) фитофтороустойчивость клубней картофеля (инфицирование несовместимой расой 3.4). 1 и 2 - Ю и 30 дней после обработки целых клубней хитозаном. соответственно.

Наиболее активный хитозан с М.И. 5 кД индуцировал не толы локальную, но и системную фитофтороустойчивость картофеля (рис. ; Б). После обработки целых клубней этим хитозаном (1000 мкг-мл"' (Модель 2) не только поверхностные, но и все ткани клубня оказывг лись защищенными от патогена. Индуцированная таким образом систе?

НЯЯ УС.ТП&т'ЛПГТК rnvridt/a югч. но чгипг-.

i

I

г

г

Известно, что устойчивость растений к Фитопатогенам основывается на мультикомпонентном защитном ответе (Метлицкий, Озерецковс-кая, 1985). Способность хитозанов индуцировать у картофеля некоторые из защитных реакций приводятся ниже.

Фитоалексины представляют собой низкомолекулярные антибиотические вещества, которые образуются в растениях в ответ на контакт с несовместимыми патогенами, несовместимыми расами патогенов или их злиситорами. Достигнув токсических концентраций, фитоалексины подавляют рост и развитие фитопатогенов (Метлицкий, Озерецковская, 1973; Бейли, Мансфилд. 1985).

Согласно проведенным испытаниям (Рис.3), наибольшей способ-

Хитозаны, мкг-мл 1

Рис.3. Способность различных хитозанов индуцировать выделение ришитина в диффузаты клубней картофеля.

с М.М. 5 кД, т.е. именно тот хитозан, который активнее остальных защищал картофель от фитофтороза. Исходный хитозан с М.М. 200 кД оказался неактивным, а хитозан с М.М. 24 кД слабо индуцировал риши-тин.

Белки, связанные с патогенезом (PR - белки), возникают в тканях растений, инфицированных грибами, бактериями, ' вирусами (Van Loon, 1988). Большинство PR - белков является полипептидами с относительно низкой молекулярной массой. Эти белки устойчивы к протео-

лизу и накапливаются как зкстрацеллюлярно, так и в вакуолях (Stermer. 1996). PR - балки условно подразделяют на 5 групп, из которых наиболее хорошо исследованы белки 2 и 3 группы - ^-глюканазь и хитиназы, соответственно (Llnthorst, 1991). Предполагается, что эти ферменты разрушают клеточные стенки фитопатогенов, а также участвуют в образовании ОС, деградируя соответствующие субстрата (Kombrink et al., 1988; Simmons. 1994).

В табл. 1 приводятся данные, демонстрирующие индукцию _р-глюка-наз и хитиназ для трех хитозанов (Модель 1). Оказалось, что ни исходный хитозан. ни хитозан с М.М. 24 кД не индуцировали в тканях дисков активацию _£-глюканазы и хитиназы. Индуцирующей активностью обладал лишь хитозан с М.М. 5 кД. Под его воздействием активность ^-глаканазы возрастала уже через 12 часов (данные не приводятся), тогда как хитиназа активировалась позднее - только спустя 48 часов.

Табл.1,

Активность j3-1,3- глюканазы и хитиназы в тканях дисков картофеля, обработанных хитозанами (500 мкг-мл-<) (48 часов после обработки).

Хитозан, кД Активность, мкмоль-мин""'- мг""' белка

р- глюканазная хитиназная

Контроль 0,077 0,110

5 0,125 0,200

24 0,078 0, 113

200 0,077 0,112

Ингибиторы протеиназ. представляют собой пептиды, или белки с относительно невысокой М.М.. одной из функций которых является подавление протеиназ фитопатогенов. В последнее время защитная функция ингибиторов протеиназ привлекает все большее внимание исследователей (Мосолов. Валуева. 1993; Ryan, 1995).

Способность хитозанов индуцировать ингибиторы протеиназ исследовали методом "инфекционных лунок". Определение показало, что способность индуцировать ингибитор трипсина (класс сериновых протеиназ) свойственна только хитозану с М.М. 5 кД (рис. 4). Два ос-

тальных хитозана оказались неактивными.

100

1000 2000 3000

-{

Хитозаны, мкг-мл

Рис.4. Ингибирование трипсина ди$фузатами клубней картофеля, содержащих различные хитозаны.

Активные формы кислорода. Одной из защитных реакций растений, активирующейся на самых первых этапах процесса патогенеза, является генерирование растительной тканью активных форм кислорода - супероксидного <0г) и гидроксильного (-ОН) свободных радикалов, перекиси водорода (Н^Ог). а также синглетного кислорода ('оА). Активные формы кислорода оказывают токсическое действие на патогены, разрушая их клеточные структуры, а также являются посредниками в транс-дукции сигнала, экспрессирующего защитные гены (Аверьянов, 1991; Тгег^, БеУау, 1993; Гг1йоу1с11. 1995).

В настоящем разделе определялась способность наиболее активного хитозана с М.М. 5 кД системно индуцировать образование

супероксидного радикала кислорода в ответ на механическое поранени< клубней картофеля.* Определение показало, что в дисках, вырезанны: из обработанных хитозаном клубней, содержатся вещества, восстанавливающие нитроголубой тетразолиум. Доказательством того, что восстановителем является именно супероксщшый радикал, служат контрольные опыты с супероксиддисмутазой, которая элиминирует 0^ (табл. 2).

На основании проведенного эксперимента можно полагать, чт( предобработка клубней картофеля Хитозаном с М.М. 5 кД в ответ ш механическое поранение системно индуцирует супероксидный радикал.

' Табл.2.

Содержание супероксидного радикала кислорода в дисках, изготовленных из клубней картофеля, предобработанных хитозаном'5 кД -1000 мкг-мл"' (неделя после обработки). (Модель 2).

Предобработка клубней Добавка к пробе Содержание супероксида. м ±д

Водой -п- сод 0,477 ¿0,103 0.511±0,103

Хитозаном -II- сод 0, 548 ± 0, 027 0,316 ±0,045

Таким образом, хитозан с М.М. 5 кД и степенью ацетилировани; 15% вызывает у картофеля системную и продолжительную фитофтороус-тойчивость, которая основывается на индуцировании фитоалексинов, Рй- белков, ингибиторов сериновых протеиназ и генерировании супероксидного радикала. Иммунорегулирующие свойства этого хитозана 1 сочетании с водорастворимостью делают его перспективным для контроля за болезнями растений.

* Эксперименты проведены совместно с д.б.н. A.A. Аверьяновы! (Всероссийский научно-исследовательский Институт фитопатологии).

- И -

3.2. Иммуиорегулирукицие свойства фрагментов ксилоглюкана.*

Ксилоглюкан (XG) - гемицеллюлозный компонент матрикса первичных клеточных стенок растений. Он связывает мицеллы целлюлозы и его разрыв является необходимым условием процесса растяжения клеточных стенок (Darvlll et al., 1992). Основу структуры XG составляют J3-1,4 - Д~ глюкопиранозиловые остатки с боковыми ответвлениями, состоящими из ксилозы (Xyl). галактозы (Gal) и фукозы (Fue) (рис. 5). Каждый четвертый ^-глюкопиранозиловый остаток скелета нераз-ветвлен. Именно в этом месте эндо -_р-1,4-глюканаза расщепляет' цепь ксилоглкжана. в результате чего образуются различные фрагменты, содержащие целлотетраозную основу.

Рис.5. Схема молекулы ксилоглюкана и его фрагментов.

* Эта часть работы проведена совместно с Институтом органической химии РАН (лаб. растительных полисахаридов проф. А.й. Усова) и Институтом элементоорганических соединений РАН. с к. х.н. В.Е. Писаревым (лаб. Физиологически активных биополимеров проф. И. А. Ямского) .

В 1984 году Йорк с сотрудниками (York et al.. 1984) показа, что XG 9 подавлял рост стеблевых сегментов гороха. индуцируем] аналогом ауксина 2.4 -Л. Оказалось, что активностью обладали толы олигомеры, в структуре которых присутствовала терминальная ¿-L- ф; коза. Впоследствии зависимость рост - ингибирующей активности i наличия фукозы была подтверждена на более широком наборе ксилопш кановых олигомеров (McDougall. Fry, 1988, 1989).

Относительно недавно удалось показать, что XG 9 и XG 5 облад; ют иммуностимулирующими свойствами, повышая устойчивость проростк! пшеницы к Fusarium culmorum и индуцируя фитоалексины у семядол! сои (Pavlova et al., 1992; Аш и др., 1994).

В настоящей работе препарат XG (1 мг-мл-*) подвергали гидрол зу целлюлазой (Onozuka R-10) в соотношении 10:1. Пробы, отбирали hi рез 0, 75, 150 и 240 мин, (соответственно фракции I, II, III и IV: Фракции кипятили. обессоливали на TSK-40, лиофильно высушивал! растворяли и наносили на диски клубней картофеля, которые затем т фицировали (рис. 6).

в; 140

4

о &

X

s I2Û

е-о

Vi.

5 100 5

t.

о

E-tn

a

о X a a.

Er4 CJ

о D, a о m Q-

80 --

60 1

40 -•

75

/

/

/

V /

/ с

/ / / Li.

/ /

/

A..

150 240

Продолжительность ферментов мин

□ - некротизированные кл( ки (инфицирование i совместимой расой 3.^ Ш - глубина проникнов. г (инфицир. совмести», расой 1.3).

рис. б. Влияние ксилоглюкана и продуктов его ферментативного гидролиза на результаты инфицирования дисков клубней картс<реля (Модель i).

О

На первых этапах ферментолиза (фракция II) образовывались фрагменты, обладающие элиситорным действием, тогда как на более поздних (фракции III и IV) - супрессорным. Нанесение последних на ткань картофеля подавляло иммунный ответ, в результате чего патоген сильнее распространялся по тканям.

Иммуносупрессорные фракции, образующиеся на поздних этапах ферментативного гидролиза XG, представляли особый интерес, поскольку до сих пор иммуноингибирующая активность ОС растительного происхождения обнаружена не была. Поэтому следующим этапом работы было исследование фрагментов XG. образующихся на конечных стадиях гидролиза.

Как следует из рис. 7, супрессорная активность фракции IV имеет широкий спектр действующих концентраций, от 10~6 до Ю мкг-мл"' т.е. в пределах 7 порядков. Максимальная активность соответствует концентрации от 1 до 100 нг-мл~'. минимальная - 1 пг-мл-'.

Рис. 7. Влияние различных разведений фракции IV на результаты инфицирования дисков из клубней картофеля расой 3.4 Р. lnfestans (Модель 1).

Представляло интерес определить, не оказывают ли ксилоглюкано-вые иммуносупрессоры системного действия? Ведь если индукция системной устойчивости уже хорошо исследована (Ross, 1961; Озерецковс-

кая и др., 1994), то существует ли системная иммуносупрессия,- пока неизвестно. С этой целью испытывали системность яммуносупрессорного действия IV фракции. Данные рис. 8 свидетельствуют, что супрессор-ное действие фракции на 8 день после обработки клубней обнаруживалось по всем тканям клубня, т.е. имело системный характер. Действие ксилоглюкановых иммуносупрессоров оказалось не только системным, но и продолжительным, поскольку сохранялось как минимум 24 дня.

•с Ч

О

о.

ЕЕ О

^ 160-

ж

2 140.

О)

а

п га о

О,

х п

б»

о

■£ а

120-

юа

I, II, III - N диска от поверхности обработки.

II

III

II

III

II

III

о . 8

Время после обработки, дни

24

Рис. 8. Системность и продолжительность иммуносупрессорного действия фракции IV (0.1 мкг-мл_<) (Модель 2).

На следующем этапе работы предстояло проверить, не препятствуют ли ксилоглюкановые иммуносупрессоры защитному действию элисито-ров. Для этого на диски клубней наносили IV фракцию, а спустя 2 часа эту же поверхность обрабатывали элиситором (рис. 9). В качестве элиситора использовали либо хитозан с М. М. 5 кД, либо арахидоновую кислоту - классический элиситор возбудителя фитофтороза (Воз1ок еь а!.. 1981: Чалова и др.. 1989).

о р. в г о и

О №

160

140-.

к «

в

<и

§ 120

<0 а з: к

СО «

о а я га я

о р-

к

О)

к

100

80-

60-

«

к а-к со а,

>е<

Рис. 9. Антиэлиситорное действие IV фракции (0.01 мкг-мл~') против хитозана 5 кД (1000 мкг-мл-') (А) и арахидо-новой кислоты - АК (5'10"гМ) (Б) (Модель 1).

Если IV фракция способствовала проникновению гриба в ткани картофеля, а хитозан и арахидоновая кислота ограничивали распространение гриба, то при совместном действии супрессора и элиситора всегда доминировал супрессор, препятствуя действию элиситора. Обнаруженный факт антиэлиситорного действия ксилоглюканового супрессора весьма важен: ведь если в препарате, которым предполагается иммунизировать растение, наряду с элиситором присутствует супрессор. то действие элиситора может быть подавлено и вместо индукции устойчивости возникает ее супрессия.

Далее в работе предполагалось исследовать биологическую активность уже не смесей Фрагментов ксилоглюкана, как это описывалось

ранее, а индивидуальных олигомеров. Параллельно ставилась задача установить, не связано ли обнаруженное иммуносупрессорное действие ксилоглюкановых ОС с наличием в их молекуле терминального Л-L - фу~ козильного остатка, как это имело место в вышеупомянутом антиаук-синовом эффекте ксилоглюкановых ОС (York et al., 1984; McDougall, Fry. 1988, 1989). С этой целью была испытана биологическая активность трех индивидуальных олигосахаридов: два из которых (XG 5 и XG 3) содержали концевую фукозу, тогда как третий (XG 4) был ее лишен (рис. 10). Оказалось, что оба фукозосодержащих олигосахарида обладал! иммуносупрессорным действием, тогда как тетрасахарид, не имевший в своем составе фукозу, активности не проявлял. Полученные данные позволяют предположить, что терминальный фукозильный остаток необходим не только для антиауксинового действия ксилоглюкановых ос. но и для их иммуносупрессорной активности. ' ■■

В таблице 3 приводится биологическая активность соединений, структурно близких к фрагментам ксилоглюкана. Чтобы не загружать таблицу, в ней не содержится абсолютных значений активности, а приводятся только символы.

Первое, что предстояло выяснить, какова минимальная структурная единица, определяющая иммуносупрессорную активность трисахарида (табл. 3, А). Оказалось, что наибольшую супрессорную активность имеет сам трисахарид, тогда как составляющие его моносахара, а также дисахарид, или совсем не обладали, или обладали лишь небольшой активностью.

В следующем разделе табл. 3, Б приводятся данные, определяющие роль ксилозы в составе трисахарида. Представлена активность ряда аналогов трисахарида, в которых ксилоза замёщена на другие структурные элементы. Оказалось, что любая замена ксилозы в трисахариде изменяла супрессорную активность на противоположную ей - элиситор-ную. Таким образом. олигомеры, содержащие в своем составе L-Fuc-i(-(i-i2)-D-Gal-J)-(l-»... в зависимости от природы третьего сахара могут обладать либо супрессорной, либо элиситорной активностью.

и наконец, в последнем разделе (табл. 3, В) выясняется роль фукозильного остатка двух соединений, обладающих наибольшей элиситорной активностью. Оказалось, что аналоги этих олигомеров, не имеющие концевого фукозильного остатка, лишают их элиситорной активности. Отсюда вытекает предположение, что терминальный Фукозильный

- а-

Пеитасахарид - ХС5

I 1

А-Ху1

Рис. 10. Развитие несовместимой 3.4 (I) и совместимой 1.3 (2) рас Р. ШГе.'Напз на дисках клубней картофеля, обра-пгтшшх олигомерамн ксилоглюкана (Модель 1).

Тай*. 3. Биологическая активность олигосвхаридов. — супрессорная активность 4- элиситорная активность О отсутствие активности

Соединение Активность

А. Структурные единица трисахарида

Кис«-2<Ыр1-2Ху1 Трисахарид (ЯЗЗ) ---

Гис Жукова 0

Ху1 Ксидоаа 0

ГиоЛ-гОа! ' «укоамгалактоаа (ГС; —

Б. Зависюость активности от заместителя ксшгавы в иэлекуле трисахарида.

Рио/1-гзв1^1-гху1 Трисахврях (мзз) ---

гиви-аза1{и-»«з1о {укоакиактова (Ю + + +

Фукэахшактогаыия (ПЛ) + +

1 ГисА1 Дийгковюиактоаа (СИ.) + + +

Лакго-11-фукопввтаоэа (ШТ>) + + +

Гиса-гОа1р1-аа1сИАс^1«Зва1]М-.43гс ГиоА1 Лакго-Н-дяфухогексаова (1~К0) 1 + +

В. Зависимость з!иоигорной активности от наличия в иомкум термияалвоя фукоэы.

ГиоЛ1-20а1|)1->4Я1о «уюэзилдактова (П.) +• + +

(5а1£1*4Шо Лактоза (и 0

Гис Д *4б1о Лаето-М-футопвитаоза (ШГР) + + +

Лакто-Н-тетраоаа (Ш1 О

остаток необходим не только для проявления супрессорного. но и эли-ситорного действия ксилоглюкановых олигосахаринов.

На последнем рисунке 11 представлены абсолютные значения активности всех исследованных веществ при концентрациях, вызывающих наибольший эффект. Видно» что иммунорегулирующей активностью, как элиситорной. так и супрессорной. обладают только олигомеры. содержащие в своем составе терминальный фукозильный остаток. Характер действия олигомера определяет его третий сахар. Если это ксилоза. -соединение обладает супрессорным действием, а если любой другой заместитель (из 'числа испытанных), - олигомер проявляет элиситорнув активность.

160--

§

о

О» &

X

* 120

* 100

80

60

40

10

-9

1П

о к

Неактивные ыоно- и одиго-

меры: Рас, Ху1, Х64,

5; -л Ц.

10

-8

10

,-7

ИГ

10"

Рис. 11. Биологическое действие олигосахаридов в концентрациях, обладэто'их м""-'г"ллы(ой активностью.

Зависимость биологической активности от структуры ксилоглюк; новых ОС. низкие действующие концентрации и широкий диапазон физис логической активности в сочетании с высокой растворимостью в во; дают основание предполагать наличие у растений специфических рецег торов, при взаимодействии с которыми олигосахаридный сигнал чере систему усиления преобразуется в защитные и ростовые эффекты. Ее; такие системы для элиситорных сигналов, индуцирующих защитные мехг низмы на уровне экспрессии генов, в настоящее время служат предме том интенсивного исследования, то вопрос о существовании сигнала системной иммуносупрессии даже не поднимается. Между тем трудно пе реоценить важность проблемы информационных сигналов системной имму носупрессии, которая наряду с сигнальной системой индукции состав ляет основу контроля иммунного статуса растительной ткани.

4. ВЫВОДЫ

1. Олигосахарины, обладающие иммуномодулирующей активностью системе картофель - Р. 1пГез1апз. обнаружены среди фрагментов хито зана и ксилоглюкана.

2. Водорастворимый хитозан с М.М. 5 кД и степенью ацетилирова ния 15% вызывает как локальную, так и системную продолжительную фи тофтороустойчивость клубней картофеля. Элиситорная активность хито зана основывается на его способности индуцировать в клубня: картофеля образование фитоалексинов, РИ - белков, ингибиторов про-теиназ и супероксидного радикала кислорода.

3. На начальных этапах ферментативного гидролиза ксилоглюканг эндоглюканазой образуются элиситорные фрагменты, тогда как на поздних - иммуносупрессорные.

4. Пента- и трисахарид (ХС 5 и Хй 3) усиливают распространение фитофтороза по тканям клубней картофеля в широком диапазоне концентраций с максимальной активностью при 10~5М. Ксилоглюкановые им-муносупрессоры обладают способностью индуцировать системную продолжительную восприимчивость картофеля к возбудителю фитофтороза, г также предотвращают индукцию устойчивости клубней картофеля элиси-торами.

5. Минимальным фрагментом, обладающим наибольшей иммуносупрес-сорной активностью, является трисахарид - ГисА1^2Са1]М-'2Ху1. Замена ксилозы на любой из испытанных фрагментов полярно изменяет супрес-

сорную активность на элиситорную.

6. сС -L- фукозильный остаток в составе ксилоглюкановых олигоса-харинов играет исключительно важную роль во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза. Олигосахариды, лишенные фукозы, становятся биологически неактивными, теряя как элиситорные. так и супрессорные свойства.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Озерецкойская 0.Л.. Леонтьева Г.В.. Чаленко Г.И., Роменская И.Г.. Караваева К.А.. Клыков С.А., Мельник М.С., Гернер м.Л., Переход Е.А.. Рабинович М.Л. К вопросу о природе олигосахаринов картофеля // Прикладная биохимия И микробиология. 1993. Т.29. Вып. 5. С. 757-764.

2. Леонтьева Г.В.. Роменская И.Г.. Чаленко Г.И.. Караваева К. А.. Гернер М.Л., Переход Е.А.. Мельник М.С.. Рабинович М. Л., Озе-рецковская О.Л. Природа олигосахаринов картофеля // Тезисы докл. Второй конференции "Регуляторы роста и развития растений", Москва. 1993. С. 43.

3. Озерецковская 0.Л., Рабинович М.Л.. Леонтьева.Г.В.. Чаленко Г.И., Ильинская Л.И., Караваева К.А.. Роменская И.Г.. Мельник М. С., Гернер М.Л., Переход Е.А. Индуктор устойчивости картофеля к фи-топатогенам //'Патент РФ N2013037. Бюллетень изобретений N10. 1994.

4. Переход Е.А., Герасимова Н.Г., Татаринова Н.Ю.. Варламов В. П. Способность водорастворимого хитозана индуцировать фитофтороус-тойчивость картофеля // Всероссийский съезд по защите растений, Те-.зисы докл. Санкт-Петербург. 1995. С.445.

5. Переход Е.А., Леонтьева Г.В.. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Иммунорегулирующая роль олигосахаринов // Всероссийский съезд по защите растений. Тезисы докл. Санкт-Петербург, 1995. С.446.

6. Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Роменская И.Г.. Чаленко Г.И.. Переход Е.А., Мельникова Т.М., Усов А.И. Фрагменты ксилоглю-кана - регуляторы иммунных эффектов в картофеле // Физиология растений. 1995. Т.42. К 5. С. 773-779.

7. Ozeretskovskaya O.L.. Perekhod Е.А., Chalenko G. I.. II'lnskaya L.I.. Pavlova Z.N.. BabakovA. V.. Borovskaya A. A.. Yamskov I.A.. Piskarev V.E. Biological activity of mammalian H -oligosaccharides In higher plants // Materials of 18 International

Carbohydrate Sympozium. 1996.. Milan. P. 592.

8. Ильинская Л.И., Переход E.А.. Чаленко Г.И., Герасимов Н.Г.. Озерецковская О.Л., Пискарев В. Е.. Боровская А.А., Ямсков \ к. . Бабаков А.В. Фукозилсодержащие олигосахариды и фитофтороусто? чивость картофеля // Физиология растений. 1997. Т.44. N 6.

9. Переход Е.А., Чаленко Г.И., Ильинская Л.И.. Васюкова Н.И. Герасимова Н.Г., Бабаков А.В., Усов А.И., Мельникова Т.М., 0зере1. ковская 0.Л. Модулирование устойчивости картофеля с помощью фраг ментов ксилоглюкана // Прикладная биохимия и микробиология.. 199' Т. 33. N $.

10. Переход £.А., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Озерецковскг 0. Л., Ильина А.В.. Татаринова Н.Ю.. Варламов В. П. Хитозан регулятс фитофтороустойчивости картофеля // 1997. ДАН, Т.355. N1.