Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация методов IN VITRO с целью повышения их эффективности в получении растений картофеля, устойчивых к патогенам

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Модификация методов IN VITRO с целью повышения их эффективности в получении растений картофеля, устойчивых к патогенам"

т б о л

* пН i

На правах рукописи

ШАРОВА Анна Петровна

ШЖШЯ МЕТОДОВ IN VITRO С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ В ПОЛУЧЕНИИ РАСТЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ, УСТОЙЧИВЫХ К ПАТОГЕНАМ

(03.00.23 - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории безвирусных культур Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель

кандидат биологических наук В.А.Аветисов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор 3. Б.Мамина кандидат биологических наук, доцент Т. А. Ежова

Ведущая организация

Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства

Защита диссертации состоится __..^у^ 1998 г.

в_ час. на заседании диссертационного совета Д.020.40.01 при

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42}

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " ' " ^ мл яяй г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук , си^ с.А.Меликова

- 3 -

0Б1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Картофель - первая из основных продовольственных культур, на которой с успехом были применены биотехнологические методы CKarp et al., 1988: Бутенко, 1990), так как, в отличие от многих других растений, полученные in vitro ценные Формы картофеля могут быть быстро размножены вегетативным путем.

Одной из важнейших задач, стоящих перед биотехнологами. работающими с картофелем, является создание сортов, устойчивых к патогенам, так как болезни наносят огромный ущерб производству картофеля, с помощью традиционных методов селекции постоянно выводятся и обновляются сорта, характеризующиеся повышенной устойчивостью к патогенам и другими ценными для человека качестваш.

В настоящее время, однако, в селекционный процесс, в той или иной степени, вовлечены многие дикорастущие виды картофеля, служащие обычно донорами генов устойчивости (Камераз. 1973), что значительно осложняет дальнейшую работу по выведению новых устойчивых к болезням сортов картофеля традиционными методами.

Поэтому требуются другие подходы, которые бы, в сочетании с классическими методами, позволили добиться дальнейших успехов в этом направлении. Одним из таких подходов для повышения устойчивости к патогенам этой ценной сельскохозяйственной культуры является использование индуцированного мутагенеза и сомаклональной изменчивости в культуре клеток и тканей.

Для успешного применения этих методов необходимо иметь эффективную систему регенерации побегов в культуре in vitro, которая у картофеля часто не отвечает требованиям эксперимента. Кроме того, почти все ныне существуквде схемы клеточной селекции рассчитаны на создание устойчивости к определенному патогену и, чаше всего, связаны с использованием патотоксинов, которые, в ряде случаев отсутствуют у возбудителя или не играют ключевой роли в заболевании. Поэтому чрезвычайно актуален поиск новых оригинальных способов получения устойчивых к патогенам растений картофеля, особенно с групповой устойчивостью к нескольким патогенам.

Известно, что под действием пектиназ и целлюлаз из клеточных стенок растений высвобождаются регуляторные молекулы особого типа - олигосахарины, которые способны индуцировать в растениях защитные реакции CDarviil et al., 1992: Павлова, 1995). Поэтому можно предположить, что выращивание и регенерация растений in vitro на средах, содержащих гидролазы, может привести к повышению их устойчивости к патогенам.

ilpjib и задачи иггпрппйаныя. Целью данной работы было на материале с высоким морфогенным потенциалом в культуре in vitro изучить эффективность сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза для повышения устойчивости к .^патогенам растений картофеля, а также изучить возможность создания.принципиально новой системы получения устойчивый к инфекционному стрессу растений картофеля на основе использования различный гидролаз микроорганизмов.

Для осуществления этой цели были поставлены следующие.задачи:

1. Изучить морфогенетическую активность различных сортов , и типов эксплантов картофеля и отобрать для дальнейшей работы,материал с высоким морфогенным потенциалом in vitro.

2. Получить различные сомаклонапьные варианта и индуцированные мутанты картофеля и изучить их устойчивость к патогенам.

3. Исследовать биологическую активность пектиназ и целлюлаз микроорганизмов на изолированных протопластах и асептически выращиваемых растениях картофеля.

4. Изучить устойчивость к патогенам растений картофеля, выращенных на средах с пектиназами и целлшазами.

5. Получить на. средах- с гидролазами микроорганизмов регенерант» картофеля и проанализировать их на устойчивость к патогенам.

Научная.новизна габпты. Показана важная роль гормонального состава среды, на которой предварительно пассировали каллус перед помещением его на морфогенную среду, в последующей реализации его регенерационного потенциала. Впервые изучено действие неполитических и целлюлолитических Ферментов микроорганизмов на растущие в условиях in vitro растения картофеля и показана определенная специфичность их действия. Выявлено влияние генотипа и уровня плоидности на устойчивость растений картофеля к гидролазам микро-роорганизмов, показано, что дикие сородичи картофеля не всегда более устойчивы к стрессам, чем сорта культурного картофеля. Впервые показано стимулирующее действие пектиназ на накопление растениями картофеля стеблевой биомассы. Показано, что пектиназы микроорганизмов, примененные in vitro, способны повышать устойчивость растений картофеля к Фитопатогенным грибам, но не повышают устойчивость растений к бактериальным болезням. ..

Практическая ценность рабпты. На основе использования пектиназ микроорганизмов предложен эффективный способ повышения устойчивости растений картофеля к Фитопатогенным грибам, при этом возможно повышение устойчивости одновременно к нескольким патогенам.

чего практически невозможно достичь обычными методами клеточной селекции, показанную в работе стимуляцию пектиназами делений протопластов и образования клеточный колоний предложено использовать для увеличения эффективности высева изолированный протопластов, что имеет важное значение в экспериментах по клеточной инженерии картофеля.

Апрпбаиия oafin-гы. Материалы диссертации докладывались на Международном Симпозиуме "Биотехнология растений и генетическая инженерия", 1994 г., Киев, Украина; III Российском Симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", 1995 г., Пушино; Ежегодном симпозиуме ОФР "Физико-химические основы Физиологии растений", 1996 г., Пенза.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

структура и объём работа. Диссертация состоит из следущих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков и 23 таблицы, список литературы включает 160 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования, в экспериментах были использованы дикий вид картофеля Solarium veraei Bitt. et Wittn. и культурные сорта 5. tuberosum. Растения выращивали на агаризованной среде Мурасиге и Скуга CMC) с 0,1 мг/л имк при 16-часовом Фотопериоде и освещенности 6-3 клк, создаваемой лампами ЛФР-150.

Индукиия калдусообразования и морфогенеза. Получение и культивирование каллуса на листовых и стеблевых зксплантах проводили на агаризованной среде МС, содержащей 2 или 7 мг/л 2,4-Д, в темноте при 25-26° с. побеги в каллусах индуцировали на среде МС, содержащей, если не указано иначе, 0,1 мг/л ПУК и различные цито-кинины, при культивировании в тех же температурных и световых условиях, что и растения. В каждом варианте опыта использовали не менее 15-20 каллусов.

Корневые экспланты выращивали на агаризованой среде МС, содержащей Смг/л)- тиамина 0,4, инозита 100, ГК 10, сахарозы 30000 и ИУК и цитокинины в различных концентрациях, в тех же температурных и световых условиях, что и растения. В каждом варианте использовали не менее 20-30 эксплантов. Полученные в опытах регенераты укореняли на агаризованной среде МС с 0,1 мг/л ИМК.

Изолирование и культивирование протопластов. Для получения протопластов использовали мезофилл асептически выращиваемых растений и каллусы картофеля различных сортов. Процессы изолирования и культивирования протопластов, а также регенерацию из ник растений проводили по методике САветисов и др., 1987).

Получение индуцировавши мутаций-. Непророщенные клубни облучали гамма-квантами е°Со в дозах 30 и 50 Гр или замачивали в течение 1 часа при температуре 25" С в 8 мМ растворах НММ и НЭМ в диметилФормамиде. После этого клубни проращивали во' влажном песке, появившиеся ростки стерилизовали в 0,1%-ном растворе диоцида и высаживали на среду MC для получения каллуса, в котором затем на среде с 0,5 мг/л зеатина получали регенеранты. Нормальные по Фенотипу регенеранты заражали расой 1.2.3.4. Ph.infestans и отбирали клоны с повышенной устойчивостью к ФитоФгорозу.

Изучение биологической активности гидролитических Ферментов. Растворы мацеразы (пектиназа, продуцируемая Rhizopus sp.."Serva", ФРГ) и Целлюлизина Сиеллшаза, продуцируемая Trichoderisa vlride, "Calbiochem", Швейцария) стерилизовали через мембранные фильтры и вносили в соответствующих концентрациях в питательные среды. Влияние препаратов на. растения оценивали по частоте- укоренения черенков, длине корней и побегов на 12 сутки выращивания и по биомассе растений на 26 сутки выращивания. В каждом варианте опыта использовали не менее 15 черенков.

Влияние гидролаз на изолированные протопласты оценивали по их жизнеспособности, способности образовывать клеточную стенку, делиться и образовывать колонии. В каждом варианте просчитывали не менее 1000 протопластов и колоний.

оценка устойчивости регенератов к болезням. Устойчивость регенерантов к ризоктониозу С Rhizoctonia solani Kuhn), ФитоФгорозу CPhytophthora infestans СMont.) De Вагу). черной ножке (Pecto-bacterium phytophthorum (App.) Waldee) и кольцевой гнили ССогупе-bacterium sepedonicum Skapt. et Burkh) проводили по методикам НМИКХ сМетодические указания НИИКХ, 1880). Полевую устойчивость к ФитоФгорозу испытывали также в условиях инфекционного Фона на сахалинском опорном пункте Института Фитопатологии.

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. данные проведенных исследований обработаны статистическими методами по Плохинскому С1967). В таблицах и на графиках приведены средние величины, полученные в 3-х экспериментах, и отложены ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Некоторые особенности морфогенеза в культуре in vitro картофеля.

l.l. Регенерацдонные процессы в листовых и стеблевых каллусах картофеля.

Каллусы различньш сортов картофеля различались по своим мор-Фогенетическим потенциям. У сортов янтарный. Изобилие, Домодедовский, Гатчинский 90-100% каллусов листового происхождения образовывали побеги. У сортов Повировец, Львовянка, Бирюза регенерировали побеги 50-60% каллусов С рис. 13. Каллусы же сортов Фаленский и Приекульский ранний практически не давали регенерантов.

% каллусов с побегами 100|-

Янтарный 1СА)

, ЗСБ) & 2СБ)

Домодедовский / т ЗСА) V/ А 2СА)

Д'А

недели культивирования

Повировец

1С А)

2СА) 1С Б)

Рис. 1. Регенерация побегов в листовых каллусах картофеля, каллус получали на среде с 2 мг/л С А) или 7 мг/л 2,4-Д СБ). Кон-вдя штокининов в морфогенной среде Смг/л): 1- 2 БАП+0,4 зеа.: 2-0,4 зеа.; 3-0,3 зеа.; 4-2 БАП + 5 зеа.; 5 - 2 БАП + 2 зеа.

too

Проведенные эксперименты показали важное значение для последующих регенерационных процессов не только гормонального состава морфогенной среды, но и гормонального статуса самих каллусных клеток, который связан, по-видимому, не только с генотипическими особенностями клеток, но. в значительной степени, определяется и гормональными условиями среды, на которой пассировались клетки перед помещением их. на морфогенную среду, У большинства сортов регенерация лучше шла в каллусах., полученных., на средах, содержащих 2 мг/л 2,4-Д, тогда как у сорта.Домодедовский морфогенетичес-кий потенциал оказался выше в каллусах, предварительно пассировавшихся на среде, содержащей 7 мг/л 2,4-Д. Эти данные логично согласуются с результатами, полученными при изучении изолированных протопластов сорта домодедовский, пролиферативная активность которых была ниже в случае, когда они были изолированы из клеток, росших на среде, содержащей 7 мг/л 2.4-д (Аветисов и др., 1987).

Влияние продолжительности пассирования каллусов на активность морфогенетических процессов в них также зависело от генотипа. Например, у сортов Повировец и Изобилие уже в 5-м пассаже не удалось вызвать морфогенеза, тогда как у сорта Янтарный даже в 11 пассаже наблюдали образование побегов в 73% каллусов.

Однако среди регенерантов. получаемых из длительно культивируемых каллусов, резко возрастает число форм с сильно измененной морфологией, плохо укореняпаихся и с другими нарушениями, что в значительной степени снижает их практическую ценность.

Побегообразование в каллусах, полученных на стеблевых эк~ сплантах, проходило несколько более активно, но основные закономерности этих процессов, выявленные в каллусах листового происхождения, сохранялись.

1.2. Регенерационные процессы на корневых эксплантах картофеля.

Гораздо быстрее шли регенерационные процессы на корневых эксплантах, довольно редко используемых в экспериментах. Если на листовых и стеблевых каллусах первые регенеранты появлялись лишь через 5-7 недель, то на корнях, помещенных на агаризованную среду, содержащую ГК, ИУК и цитокинины, уже через 7 суток закладывались компактные локальные образования плотной'зеленой змбриоген-ной каплусной ткани, в которой вскоре начинали появляться регенеранты. В результате, сроки регенерации, по сравнению с использованием листовых и стеблевых зксплантов, значительно сокращались.

Изученные сорта различались по количеству корневых зксплан-

тов, способных к регенерации побегов С табл. 1) и по числу побегов, образующихся на одном экспланте. По этим показателям выделялся сорт Янтарный, у которого все экслданты, практически независимо от состава среды, были способны регенерировать побеги, а число побегов на 1 эксплант составляло не менее, а часто даже более 10.

Таблица 1.

Влияние гормонального состава среды на образование побегов корневыми зксплантами картофеля.

т-1

I Экспланты, образовавшие побеги, %

Сорт

-!-1-г

I I II I III

|Домодедов-|82±5 | 40±3 | 80±7

1ский i i i

I зарево 185*7 I 8й±7 | 60±5

(Гатчинский120+3 I 40+4 I 33±3

I Янтарный I 100 I loo J loo

IV

40±4

25±5 О 100

86±7

100

20±3

85±7

Примечание. Составы сред:

I- 0,1 мг/л ИУК + 1,0 мг/л зеатина + 10 мг/л ГК;

II- 1,0 мг/л зеатина + 10 мг/л ГК;

III- 1,0 мг/л ИУК + 1,0 мг/л зеатина + 10 мг/л ГК;

IV- 1,0 мг/л ИУК + 1,0 мг/л БАП + 10 мг/л ГК:

V - 0,1 мг/л ИУК + 3,0 мг/л зеатина + 10 мг/л ГК.

Характерной особенностью системы адвентивного побегообразования на корнях картофеля является её довольно высокая стабильность. Эффективность регенерации была достаточно высокой и мало изменялась в различных экспериментах. Высокая морфогенная способность корневых зксплантов картофеля позволяет эффективно использовать их в качестве альтернативной системы регенерации растений картофеля в различных биоинженернык экспериментах, в том числе при образовании корней на каллусе и трансгенных корней, полученных при использования штаммов АйгоЬаЛеПит гМгс^епеэ.

Оценка общей продуктивности, т.е. числа сформировавшихся ре-генерантов. показала, что данная система регенерации побегов высоко эффективна. Из кошевой системы одного растения сорта Янтар-

ный можно было получить за 1,5-2 месяца в среднем до 140 регенерантов. У сортов повировец, Изобилие и Бирюза это число, котя и было ниже, однако также составляло значительную величину.

Корневые регенераты морфологически были достаточно стабильны, из чего следует, что система регенерации на кошевых эксплан-тах может быть использована, кроме экспериментов по клеточной инженерии. также для клонального микроразмножения картофеля.

Расчеты показали, что если применять комбинированный способ размножения, сочетающий черенкование побегов и адвентивное побегообразование на корнях, из одного растения, например, сорта Янтарный за полгода можно будет получить около 5 млн. растений, что приблизительно в 20 раз выше, чем при обычном черенковании.

Таким образом, адвентивное побегообразование на корнях, примененное одновременно с обычным черенкованием, значительно повышает коэффициент размножения картофеля in.vitro.

2. Устойчивость к патогенам полученных сошслонов и индуцированных мутантов картофеля.

Мы попытались сравнить эффективность использования сомакло-нальной- вариабельности и индуцированного мутагенеза для получения устойчивых к патогенам регенерантов картофеля, для этого была изучена устойчивость к одному из наиболее опасных заболеваний картофеля, фитофгорозу. полученных из протопластов и каплусных культур сомаклонов. а также индуцированных мутантов различных сортов картофеля.

Лабораторное изучение и полевые испытания регенерантов сортов Домодедовский и Янтарный показали, что они отличались большим разнообразием. В среднем, около 20-25% регенерантов имели те или иные морфологические отклонения, значительное их число характеризовалось пониженной жизнеспособностью в полевых условиях и задержкой в прохождении ФеноФаз. Все это может осложнять вовлечение регенерантов картофеля в дальнейшую селекционную работу даже при наличии у них таких полезных признаков, как повышенная устойчивость к заболеваниям, стрессам и т.д.

лабораторный:анализ устойчивости регенерантов сортов Домодедовский и Янтарный К расам 1.2.3.4.10.11 и 1.2.3.4 Ph. infestans выявил наличие более длительного инкубационного периода на листьях некоторых образцов, по сравнению с остальными регенерантами и контрольными образцами, можно было предположить, что образцы с более длительным инкубационным периодом окажутся более устойчивы-

ми к ФитоФторозу.

Однако полевая устойчивость к ФитоФторозу в условиям Московской области (ОПХ "Горки Ленинские") у проанализированных ре-генерантов была довольно низкой. Устойчивость более чем 70% регенератов сорта Домодедовский оказалась ниже, чем у контрольных растений, а с повышенной устойчивостью к ФитоФторозу в этом случае не было найдено ни одного С табл. 2). Лишь в случае сорта Янтарный небольшая часть регенерантов по устойчивости превышала контроль.

Таблица 2.

Уровень устойчивости к ФитоФторозу сомаклональных вариантов

картофеля.

Полевая оценка

Янтарный 162,5+12,1125,0±10,8112,5-ьЗ, 3 Домодедовский I72,7+11,7I23,1±11,7I О Домодедовский« 150,0+11,2135,0±10,7115,0±8,0

Лабораторная оценка Сраса 1.2.3.4. РЬЛпГей1ап5)

Домодедовский* 125,0±9,7 135,0±10,7140,0±11,0

_1_I_I_

Примечание. Уровень устойчивости по отношению к исходному сорту С контролю): пониженныйС-), повышенныйО), на уровне контроляСЮ.

В лабораторных условиях была искусственно инфицирована слабовирулентной и слабоагрессивной расой 1.2.3.4 фитофторы другая партия регенерантов сорта Домодедовский С*). Анализ показал, что 40% регенератов имели повышенную, по сравнению с контролем, устойчивость к этой расе ФитоФторы С табл. 2). В полевых же условиях большинство регенератов характеризовалось более низкой устойчи-

востью к ФитоФторозу и лишь 15% превшали контроль по устойчивости. Только два выделенных при лабораторных испытаниях высокоустойчивых регенеранта (264.6.92л и 272.3.93с), на которых не было обнаружено спор, при полевых испытаниях показали также довольно высокую устойчивость С 7 баллов) и представляли определенный интерес. Однако высокая устойчивость образцов к ФитоФторозу, как правило, не коррелировала с высокой урожайностью с табл.3).

Таблица 3.

Основные показатели урожайности микроклональных вариантов сорта Домодедовский.

г IN регенерантов Кол-во клубней с одного куста, шт Масса клубней с одного куста, г 1 Средний вес 1 одного клуб-1 ня, г 1

1 Контроль 10±2 750±45 75,0±21,3 1

1 257.2.92с 14±2 183±11 13,0±3,8 I

1 261.2.93с 8±2 204±16 ■ 25.5±7,9 1

1 262.4.93л 20±4 231±18 11,5±3,6 I

1 264.6.92л 16±3 155±10 9,5±3,0 I

1 267.2.93C 14+3 229±13 16,3+5,0 I

1 270.1.93С 14±2 208±16 14,1±4.5 1

1 272.3.93С 7+1 52±3 7,4±1,8 I

В других экспериментах для получения клонов с повышенной устойчивостью к ФитоФторозу применяли химический и радиационный мутагенез. Полученные регенеранты с нормальным Фенотипом, число которых составляло около 30% от общего числа регенерантов, испытывали в лабораторных условиях на устойчивость к расе 1.2.3.4. Ph. infestans. Отобранные наиболее устойчивые регенеранты проверяли на естественном инфекционном фоне на Сахалинском опорном пункте ВНИИ Фитопатологии в течение 2 лет. Оказалось, что их устойчивость к ФитоФторозу в условиях инфекционного фона часто была на уровне исходного сорта или даже ниже.

Хотя некоторые образцы слегка превышали по устойчивости к ФитоФторозу исходный сорт, но всё же значительно уступали стандарту - сорту Олев. Лишь два регенеранта - 518.2.92 и 517.2.92

показали на естественном инфекционном Фоне высокую устойчивость ботвы к ФитоФгорозу С рис.2). Первый из них значительно превышал по этому показателю родительский сорт и лишь незначительно уступал стандарту. Второй на некоторых стадиях своего развития даже превышал по устойчивости стандартный устойчивый сорт Олев. Однако, при повторных испытаниях в следующем году они, как и остальные номера, оказались пораженными фитофторозом, что можно объяснить, вероятно, изменением состава природной популяции гриба, к которой они оказались неустойчивыми.

Урожайность испытывавшихся регенерантов была, как правило, значительно ниже, чем в контроле с табл. 4), особенно у тех образцов, которые характеризовались определенной ФитоФтороустойчи-востью. Таким образом, как и в случае с сомаклонами, наблюдалась

Устойчивость 10 ботвы, баллы 9 8

Дата наблюдения

3.8 10.8 17.8 24.8 N515 EZ3 N51S

31.8 7.9 14.9 21.9

сорт cm Олев С СТ. ')

Рис. 2.

ае 10Ü 17В 24.8 31.8 Е5Э N512 ¡5383 N516 I-1 N517 ,-- _ , .

сорт Олев Сет.) Устойчивость к фитофторозу регенерантов картофеля.

Урожайность экспериментально полученный клонов картофеля.

1 - ........... 1 Сорт, Мутагенная 1 - 1 (Средний урожай1

INN регенерантов обработка 1 с куста, г 1

1 Домодедовский _ 1 0 I

1 510.2.92 НЭМ 0.02% 1 400±16 1

1 513.2.92 ЗОГр еосо 1 0 1

1 514.2.92 дам 0.02% 1 156±7 1

1 Изобилие - 1 553±20 I

1 512.2.92 ЗОГр еосо 1 368±16 I

1 516.2.92 дам 0.02% 1 280±13 1

1 517.2.92 50Гр еосо 1 96+5 I

1 Истринский - 1 364±16 1

1 515.2.92 50ГР биСо ! 0 1

1 518.2.92 ЗОГР 60Со 1 150±8 I

1 Гибрид 474 - 1 606+28 1

1 508.2.92 50Гр ШС0 ( 67±6 I

1 519.2.92 1 ЗОГР е"С0 1 82*6 1 1 1

определенная отрицательная корреляция между ФитоФтороустойчи-востью и урожайностью.

Анализируя все полученные в экспериментах результаты по более чем 300 сомаклонапьным вариантам и индуцированным мутациям картофеля, надо сказать, "что в офих случаях можно, по-видимому, эффективно отбирать в лабораторных условиях Формы с повышенной устойчивостью лишь к простым расам РЬ. 1пГез1ап5. Гораздо труднее получать Формы, устойчивые к сложным и высокоагрессивным расам, а также к ФитоФторозу в полевых условиях и не потерявшие, к тому же, основных сортовых качеств, в первую очередь, высокую урожайность, для чего требуется анализ большого числа регенерантов.

Индуцированный мутагенез чаще всего вызывает значительные изменениям в геноме, что приводит к сцеплению отдельных полученных ценных признаков с рядом отрицательных характеристик и потере основных сортовых признаков. Поэтому индуцированный мутагенез предпочтительнее, на наш взгляд, использовать для создания различных маркерных мутаций, чаще всего применяемых в фундаменталь-

ных исследованиях, когда сцепление их с другими признаками и сохранение сортовых свойств не имеет большого значения.

Для получения же методами клеточной биотехнологии исходного для селекции устойчивого к патогенам материала картофеля следует использовать, в первую очередь, сомаклональную изменчивость с применением различных селективных Факторов для отбора сомаклонов с направленной изменчивостью, причем в ранних пассажах, когда еще довольно высок морфогенный потенциал культуры и мала вероятность потери основных сортовых признаков.

3. исследование биологической активности некоторый гидгшаз ш-кюорганизмов.

Выбор гидролитических Ферментов микроорганизмов в качестве инструмента для повышения устойчивости картофеля к инфекционному стрессу был обусловлен, прежде всего, их способностью действовать как эндогенные злиситоры и активировать защитаке реакции растений (Hahn et al., 1989). Эти свойства гидролаз микроорганизмов связаны с высвобождением под их действием из клеточных стенок растений специальных регуляторных молекул, олигосахаринов, которые И"индуцируют защитные реакции СDarvill et al., 1892; Озе-рецковская и др., 1993). При этом, эта реакции не связаны с определенным конкретным видом патогена, что предполагает потенциальную возможность использования гидролаз для придания растениям групповой устойчивости к нескольким патогенам.

В опытах с пектиназами и целлюлазами микроорганизмов использовали сорта с высоким и, как правило, длительно сохранящимся морфогенетическим потенциалом - Янтарный. Гатчинский, Изобилие. Причем, Гатчинский и Янтарный - сорта довольно устойчивые к заболеваниям. в том числе и к ФитоФгорозу. что представляет интерес для оценки эффективности используемых для повышения устойчивости методов, так как у таких сортов обычно гораздо сложнее получать более устойчивые Формы.

Исходя из возможное™ использования пектиназ и целлкшаз для индукции в растениях защитных реакций и зависимости эффективности этих реакций от силы воздействия ферментов на растения (Branca et al.. 1988), представлялось необходимым изучить чувствительность асептически выращиваемых растений картофеля различных сортов и видов, а также изолированных протопластов к действию этих Ферментов in vitro. Это должно позволить более ясно представить себе специфику действия этих соединений в условиях in vitro и облег-

чить выбор оптимальных концентраций этих Ферментов для индукции защитных реакций у растений картофеля различных сортов и видов.

3.1. влияние пектиназ и целлшаз микроорганизмов на развитие асептически выращиваемых растения картофеля.

Эксперименты с гидролазами микроорганизмов показали, что их действие in vitro на растения картофеля зависело не только от их концентрации, но и от генотипа растения.

Присутствие в питательной среде обеих гидролаз ингибировало развитие новых побегов изолированными черенками картофеля S.verrieb тетраплоидного и дигаплоидного картофеля сорта гатчинский. Причём устойчивость к действию пектиназы повышалась в ряду S. Verne i < гатчинский 24х < Гатчинский 48х. Целлямаза же угнетала рост побегов картофеля гораздо сильнее и практически одинаково у всех генотипов.

таблица 5.

Влияние гидролаз на рост корней у черенков картофеля.

I г

I Гидролазы, ед.актив-f ности/мл

Длина корней, % к контролю

S. vernei

Гатчинский 24х

Гатчинский 48х

Пектиназа з

15 30 60

Целлюлаза з

15 60

41,0+4,7 31,2*4,1 18,8+3,0 12.5+2,5

66,3±5,2 49,7±4,7 9,8±2,5

52,2+5,1 40,6±4,7 13,0.±2,7 13,0±2,7

77.7±5,9 50,3±5,1 10.1±2,5

52,9±5,2 41,2±4,2 17,6±2,9 11.8±2,4

94,3±7,0

46,0+5,5

Процесс укоренения черенков, наоборот, ингибировался сильнее пектиназами, чем целлюлазами. Довольно сильно влияли Ферменты на рост корней, который угнетался уже при низких концентрациях ферментов, особенно при действии пектиназы С табл.5). При высокой концентрации целлюлазы четко проявилась более высокая устойчивость тетраплоидного картофеля сорта Гатчинский.

Анализ общей биомассы растений картофеля, выращенных на сре-

дах с пектиназой, показал, что низкая концентрация Фермента практически не влияла на этот показатель С рис. 33, тогда как целлюла-за даже в небольшой концентрации уже резко снижала биомассу у веек трек изученных Форм картофеля С рис. 4). Наиболее устойчивыми к действию целлюлазы и пектиназы по этому признаку также оказались тетраплоидные растения сорта Гатчинский.

Интересно отметить, что все'использованные концентрации пектиназы, кроме наиболее высокой, стимулировали прирост стеблевой биомассы у обоих Форм сорта Гатчинский С табл. 6), чего никогда не наблюдали при действии целлюлазы. Лишь в концентрации 60 ед. активности/мл пектиназа ингибировала прирост стеблевой биомассы у растений Гатчинского, причем сильнее у дигаплоида (^¿=2, 7;В>0,95).

Общая биомасса, % к контролю

во

Пектиназа, ед. акт./мл

Рис. з. Влияние пектиназы на биомассу растений картофеля.

Э 15 эо

1=3 З.уегп™ Гэтч.Еа Общая биомасса, 24х. % к контролю

Гатч. 48Х.

сю

Рис. 4. Влияние целлюлазы на биомассу растений картофеля.

еэ кет ей

5. v. Г. 24х Г. 48х

Целлюлаза, ед. акт./мл

Влияние пектиназ на прирост стеблевой и корневой биомассы растениями картофеля.

1 1 Пектиназа, Биомасса, % к контролю 1 1

1 ед.актив- 1

1 1 1

1 ности/мл Б.уегпе! 1 Гатчинский 24х1 Гатчинский 48x1 1 1 1

1 1 1 1 > 1 Стеблей1 Корней 1 Стеблей 1 Корней 1 Стеблей1 Корней1

1Пектиназа 1 1 1 1 1 1

1 3 113±10 73±8 1173*19 63±7 1150±18 64±8 1

1 15 69±8 21±5 I156±17 60±7 I172±20 62±8 1

1 30 35±6 4±3 1116*10 15±4 1131±15 27±4 1

1 60 1 16±4 | 7±4 1 41±6 | 3±2 1 69±8 г 3*2 1 )

Высокая устойчивость тетраплоидного картофеля сорта Гатчинский к пектиназам и целлюлазам, превышаадая устойчивость дикорастущего сородича картофеля Б. уегае1, показывает, что не всегда дикие сородичи культурного картофеля более устойчивы к различным стрессовым Факторам среды.

Различная чувствительность дигаплоидного и тетраплоидного картофеля к гидролазам указывает на определенный контроль над этим процессом со стороны ядерный генов и о влиянии дозы генов на устойчивость растений картофеля к этим Ферментам.

3.2. Влияние пекгганаз и даллшаз микроорганизмов на изолированные протопласты картофеля.

Пектиназа в концентрациям 0,075-0,75 ед. активности/мл практически не влияла на жизнеспособность изолированных каллусных протопластов сорта Гатчинский С24х) и на их способность образовывать клеточную стенку. В то же время был выявлен стимулирующий эффект пектиназы в концентрациях 0,075-0,3 на индукцию делений протопластов и на их способность образовывать клеточные колонии С рис. 5). это свойство пектиназ можно использовать в экспериментах с изолированными протопластами для повышения эффективности их высева, что очень важно в работах по клеточной инженерии. Из протопластов были получены каллусные микроколонии, способные расти на средах с пектиназой, но не способные регенерировать побеги.

Число КОЛОНИЙ, % 23

15

10

5

О

Пектиназа, ед. активности/мл

Рис. 5. Влияние пектиназы на образование мезофильными протопластами картофеля сорта Гатчинский 24х клеточных колоний.

Целлюлаза, в отличие от пектиназы, подавляла жизнеспособность изолированных протопластов. Кроме того, пролиферативная активность протопластов, вырациваемых на средах с целлшазами, была обычно гораздо ниже, чем в контроле, что, по-видимому, объясняется непрерывным разрушением вновь сформированной клеточной стенки. Можно полагать, что в этих условиях клеточная энергия используется, в основном, на синтез полисахаридов в ущерб синтезу метаболитов, необходимых для митоза и клеточного деления СБсЫЫе-Кеп^с-Ыег, 1977). Однако на средах с целляхпазой в концентрации 0,11 и 0,275 ед. активности/мл удалось получить клеточные колонии, образовавшие, в конце концов, микрокаллусы, но не способные к стеблевому морфогенезу.

3.3. Влияние пектиназ и целлхшаз микроорганизмов на устойчивость к патогенам растений картофеля.

Исходя из того, что пектиназы и целлюлазы микроорганизмов могут вьщеплять из клеточной оболочки растительных клеток регуля-торные молекулы, способные индуцировать защитные реакции в растениях (Оап/Ш еЬ а1., 1992), представляло интерес изучить устойчивость к патогенам растений картофеля, выращиваемых на средах с гидролазами микроорганизмов. Для этого были использованы небольшие концентрации пектиназ и целлюлаз, не угнетающие, как это было показано в предварительных экспериментах, рост растений картофеля 1п УЗ^ТО.

8,75

Устойчивость к патогенам растений картофеля, выращенных на средах, содержащих гидролитические Ферменты.

т

Сорт и

стандарты

Кон-ция Фермента в среде, ед. актив. / мл

Устойчивость, баллы

ФитоФто-роз*

Ризокто-ниоз

Кольцевая гниль

Янтарный

Домодедовский

Луговской

Любимец

Раменский

Резерв

Гатчинский

О

Пектиназа 0,03 0,3

Целлюлаза 0,1 1,0

5,7

8,1 6,3

5,0 3,0

4 неуст. 6 уст.

7 3

7 5

1 неуст. 7 уст.

5 3

5 3

1 неуст. 9 уст.

3 неуст О уст.

Примечание. * - раса 1.2.3.4.5.6.+ 0.8.9.10 хуг Р1ч. тГеБЪаш: ** - балл поражения.

7

5

2

Выращивание растений на средах с целлюлазами не привело к повышению их устойчивости, по сравнению с контрольными, хотя на картофеле была отмечена их способность активировать защитные реакции СОзерецковская и др., 1993). В то же время, пектиназы индуцировали более высокую, по сравнению с контролем, устойчивость к ФитоФгорозу Стабл.7). При этом, также, как и в случае с целлюла-зой, более низкая концентрация пектиназ оказалась гораздо эффективней в индукции устойчивости, которая превышала даже устойчивость стандарта. Таким образом, наблюдалась определенная концентрационная зависимость в индукции гидролазами устойчивости к патогенам.

Проведенный эксперимент показал возможность повышения устойчивости растений картофеля к одному из наиболее опасных заболеваний картофеля,. фитофгорозу, при выращивании растений на средах, содержащих пектиназы.

4. индукция морфогенеза на средах с пектаназаш мизсроорганизшв.

Исходя из изложенных выше результатов, мы попытались получить на средах с пектиназами регенеранты картофеля, обладающие, возможно, повышенной устойчивостью к патогенам.

Для этого была использована эффективная система регенерации на корневых эксплантах. Кроме того, пектиназы вносили в питательную среду на различных этапах культивирования эксплантов (1-й этап - от посадки корневых эксплантов на среду до образования на них плотного зеленого морфогенного каллуса и 2-й - Формирование на этом каллусе полностью развитых регенерантов) и в более низких концентрациях, оказываших меньшее токсическое действие, но, возможно, способных через образование олигогалактуронидов индуцировать защитные реакции и повышать устойчивость образующихся регенерантов к инфекционному стрессу.

Показано, что даже небольшие концентрации пектиназы, использованные на обоих этапах культивирования корневых эксплантов, ин-гибируюгг морфогенез, причём по-разному у разных сортов. У сорта Изобилие регенерация побегов была получена лишь при наименьшей из использованных концентраций пектиназы, а у сорта Янтарный - при наибольшей. В то же время, количество регенерантов на 1 зксплант у сорта Изобилие оказалось почти в 2 раза, а у сорта Янтарный, примерно, в 4 раза выше, чем в контроле (табл.8).

Таким образом, ингибирущее морфогенез действие пектиназ оказывается, в определенной степени, сортоспециФичным, что может, возможно, объясняться различиями в чувствительности сортов к пек-тиназал и, как следствие, образованием разных количеств олигогалактуронидов с различной биологической активностью.

Влиянием биологически активных олигогалактуронидов, образующихся при действии пектиназ на клеточные стенки растений и обладающих Фитогормональной активностью CDarvi.ll е1 а1.,1992), могут, по-видимому, объясняться и многие другие отмеченные нами на растениях и изолированных протопластах эффекты пектиназ.

Внесение пектиназы в культуральную среду лишь на одном из этапов культивирования практически не ингибировало морфогенети-ческие процессы,и во всех вариантах опыта у обоих сортов были по-

Влияние пектиназы на регенерационные процессы в корневых зксплантах картофеля.

г

Концентрация пектиназы, ед. активности/мл

т

1 этап

2 этап

Экспланты, образовавшие побеги. %

Янтарный I Изобилие

Количество побегов на 1 зксплант, % к К

Янтарный I Изобилие

о

0,03

0,075

0,3

69±12 57±16 80+17 100

100 122±29 154±43 8а±17

О

0,03

0,075

0,3

О

0,03

0,075

0,3

50± 9 О О

42+14

69+13 25+12 О О

100 О О 433

100 180±49 О О

0,03

0,075

0,3

О О О

71+ 9 53+12 55+10

85± 9 60±19 72±13

лучены регенеранты. Среди полученных на средах с пектиназами ре-генерантов были отобраны экземпляры с хорошо развитой листовой поверхностью и нормальным ризогенезом, у которых была затем проведена оценка их устойчивости к патогенам.

5. Устойчивость к патогенам регенерантов картофеля, полученных на средах с пектиназами.

Как показал анализ полученных данных (табл.9), пектиназы индуцировали устойчивость лишь к Фитопатогенным грибам, но не бактериям. Ни один из регенерантов по устойчивости к черной ножке и кольцевой гнили не превышал устойчивости растений исходных сортов, а значительная часть регенерантов оказалась даже менее устойчивой к этим бактериальным заболеваниям.

Принципиально иная картина наблюдалась по устойчивости реге-нерантов к ФитоФторозу и ризоктониозу. Большая часть регенеран-тов, полученных на средах с пектиназами, характеризовалась более высокой устойчивостью к этим заболеваниям, по сравнению с растениями исходного сорта и регенерантами, полученными на средах без Ферментов. Причем, у сорта изобилие, например, все регенеранты, независимо от примененной концентрации пектиназы, оказались более устойчивыми к ризоктониозу, чем растения исходного сорта.

Возможно, что эти различия как-то связаны с белком, ингиби-рущим полигалактуроназу, который присутствует в клеточных стенках всех двудольных растений. Этот белок способен ингибировать лишь грибную полигалактуроназу, ко не другие пектолитические Ферменты микробного или растительного происхождения С Сеп/опе е1 а1., 19903. Можно предположить, что используемые в опытах пектолитические Ферменты Шгориг зр. через посредство образуемых в ре-

таблица 9.

Влияние пектиназы на частоту изменения уровня устойчивости к патогенам регенерантов картофеля - с X).

"т

Концентрация пектиназы. на которой образовались регенеранты, ед. актив, /мл

ФитоФгороз*

—1-1—

- I к I + I I I I

Ризоктониоз! Черная I Кольцевая [ ножка I гниль т-1

—I-

- I К

"Т"

~г

"Г

~г

I - I К

К

Янтарный О

0,03 0,3

Изобилие 0,03 0,3

I I

167 133

125 |75

150 150

1001 - I -50 I - 150

- 11001 - 133 167

- 125 175 150 150 17 183 I - 167 133

1 1 1 I - 11001 I - 11001

1100 1100

I I ¡33 167 150 150 11001 -

133 167 11001 -

Примечание. Уровень устойчивости по отношению к контролю -пониженный(-), повышенным+), на уровне исходного сортасю: * - раса 1.2.3.4.5.6. + 0.8.9.10 ХУ2 Р1-1У1орШюга 1пГез1апз.

зультате их действия биологически активных олигогалактуронидов активируют этот белок, что и приводит к повышению устойчивости растений к Фитопатогенным грибам.

Необходимо отметить также, что ряд полученных регенерантов характеризовался более высокой устойчивостью одновременно к Фито-Фгорозу и ризоктониозу. Возможность получения растений, одновременно устойчивых к нескольким патогенам, чего практически невозможно достичь обычными методами клеточной селекции, является важной особенностью использованного нами метода повышения устойчивости растений картофеля к патогенам с помощью пектиназ микроорганизмов. Причем, повышение устойчивости к ШгосЛ.оп1а 5о1аш и высокоагрессивному и высоковирулентному штамму РЬ. 1пГез1ап5 у растений, изначально обладавших сравнительно высокой устойчивостью к ризоктониозу и фитофгорозу, говорит о высокой эффективности предложенного метода.

Индуцирующий устойчивость эффект пектиназ оказался также сортоспевдФичным. Для получения устойчивых к грибным заболеваниям регенерантов сорта Янтарный оптимальным было использование пектиназ в концентрации 0,03 ед. активности/мл, тогда как в случае сорта Изобилие, по-видимому, более-эффективной оказалась концентрация 0,3 ед. активности/мл. Это служит одним из косвенных доказательств участия олигогалактуронидов в повышении устойчивости растений картофеля к патогенам. Благодаря различной чувствительности генотипов картофеля к пектиназам молекулы с злиситор-ной активностью у растений разных сортов могут, по-видимому, вьь щепляться при действии пектиназ в различных концентрациях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В задачу настоящего исследования входило сравнить эффективность сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза для повышения устойчивости к патогенам растений картофеля, а также изучить возможность создания принципиально новой системы получения устойчивых к инфекционному стрессу растений картофеля на основе использования различных гидролаз микроорганизмов.

В результате изучения морфогенетических особенностей каллусов различных сортов картофеля и различных типов зксплантов для работы был отобран материал с высокой регенерационной способностью. Изучение особенностей регенерации на редко используемых в экспериментах корневых зксплантах картофеля показало высокую ста-

бильность и эффективность этой системы, которую можно с успехом использовать для размнояения картофеля in vitro и получения регенерантов в опытах по клеточной инженерии.

Использование методов сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза для создания растений с повышенной устойчивостью к патогенам требует анализа большого экспериментального материала. Индуцированный мутагенез, приводящий к значительным изменениям в геноме, предлагается использовать, в первую очередь, для получения маркерных мутаций, чаше всего применяемых в фундаментальных исследованиях. Для получения же ценного для селекции материала с высокой устойчивостью к патогенам следует использовать сомаклонапьную изменчивость в ранних пассажах одновременно с применением селективных Факторов для отбора устойчивого к патогенам материала, что должно значительно повысить эффективность этого метода.

Новым перспективным подходом к созданию с помощью клеточной биоинженерии устойчивого к инфекционному стрессу картофеля является использование для этого пектиназ микроорганизмов. Действие пектиназ на растительную ткань приводило к повышению устойчивости растений и- регенерантов картофеля, к. Фитопатогенным, грибам, вызывающим ризоктониоз и ФитоФтороз, даже в случае использования исходных растений, изначально обладавших сравнительно высокой устойчивостью к этим заболеваниям. Важным преимуществом предлагаемого метода перед обычными методами клеточной селекции является возможность получения растений с групповой устойчивостью к разным патогенам. Всё это говорит о возможности использования пектиназ для получения устойчивого к заболеваниям картофеля.

Выявленные в экспериментах способность пектиназ повышать устойчивость растений картофеля к патогенам и другие биологические эффекты этих Ферментов рассматриваются в связи с возможным действием особых регуляторнък молекул - олигогаяактуронидов, высвобождающихся из клеточных стенок высших растений при действии на них пектиназ и обладащих различной биологической активностью, в том числе и способностью индуцировать в растениях защитные реакции.

вывода

1. Изучены морфогенетические потенции каллусных культур различных сортов картофеля. Выделены сорта с высоким морфогенетичес-ким потенциалом in vitro, не теряющие регенерационной способности при длительном культивировании каллусов и поэтому удобные для ис-

пользования в экспериментах по клеточной инженерии картофеля.

2. Морфогенетические процессы в каллусах картофеля зависят не только от состава морфогенной среды, но и от гормонального состава среды, на которой они были получены, т.е. от гормонального статуса самих каллусньк клеток.

3. Цитокинины могут стимулировать процесс каллусообразования на зксплантах картофеля. Их присутствие в среде для каллусообразования в дальнейшем ускоряет регенерационные процессы на морфогенной среде, хотя и не влияет на конечную частоту регенерации.

4. Корневые экспланты картофеля являются высокоэффективной регенерационной системой в условиях in vitra. Они могут служить для размножения картофеля in vitra, получения регенерантов в опытах по клеточной инженерии, регенерации побегов из корней, образующихся на каллусах, а также для получения трансгенных растений картофеля при использовании системы Agrobacterium rhizogenes.

5. Для получения ценного для селекции материала картофеля с высокой устойчивостью к патогенам следует использовать сомакло-нальную изменчивость одновременно с применением соответствующих селективных факторов, что должно значительно повысить эффективность этого метода, особенно в ранних пассажах, когда еще высок морфогенный потенциал культуры и мала вероятность потери основных сортовых признаков.

6. Индуцированный мутагенез, приводящий к значительным изменениям в геноме на всех уровнях его организации, предлагается использовать, в первую очередь, для получения маркерных мутаций, чаще всего применяемых в Фундаментальных исследованиях, когда их сцепление с другими признаками и сохранение сортовых свойств не имеет большого значения.

7. Пектиназы и целлюлазы микроорганизмов влияют на рост и развитие растений картофеля in vitra, причем эффективность их действия зависит от генотипа и уровня плоидности растений. Целлюлазы сильнее ингибирукгг рост побегов, пектиназы - развитие корневой системы.

8. Пектиназы микроорганизмов убивают культивируемые клетки, но не действуют на изолированные протопласты картофеля, а в небольших концентрациях даже стимулируют их деления и образование клеточных колоний.

9. Пектиназы микроорганизмов, в отличие от целлюлаз, способны повышать устойчивость растений и регенерантов картофеля к фи-топатогенным грибам, при этом возможно повышение устойчивости од-

повременно к нескольким патогенам, что говорит о перспективности и высокой эффективности предложенного метода создания устойчивых к различным заболеваниям клонов картофеля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Avetisov V.A., Dawdova Yu. V., Sharova A. P., Melik-Sarkisov O.S. The microorganism hydrolitic enzymes in potato plant cell selection. In proceeding Internet. Svrap. "Plant Biotechnology and Genetic Engineering". October 3-6, 1994. Kiev. P. 7.

2. Шарова А. П., Давыдова Ю. В., Мелик-Саркисов о. С., Аветисов В. А. Морфогенетическая активность различных типов эксплантов картофеля в культуре in vitro. Биотехнология. 1995. N. 12. С. 15-18.

3. Шарова А. П., Давыдова Ю. В., Мелик-Саркисов 0. с., Аветисов В. А. Использование сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза в создании устойчивого к фитофторозу картофеля. Биотехнология. 1936. N. 6. С. 14-20.

4. Шарова А.П., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Новые подходы к конструированию устойчивого к инфекционному стрессу картофеля. Биотехнология. 1996. N. 7. С. 18-22.

5. Шарова А. П., Давыдова Ю. В., Мелик-Саркисов 0. С., Аветисов В. А. Влияние гидролаз микроорганизмов на развитие растений картофеля, выращиваемых in vitro. Онтогенез. 1996. Т. 27. N. 4. С. 266 -272.