Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эндогенных олигосахаридов из проростков гороха на процессы роста и корнеобразования

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние эндогенных олигосахаридов из проростков гороха на процессы роста и корнеобразования"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 581.192:547. 454

Гурьянов Олег Петрович

ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ИЗ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА НА ПРОЦЕССЫ РОСТА И КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ

03.00.12. - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1997

Работа выполнена в институте биологии Казанского научного центра

РАН

Научный руководитель - кандидат биологических наук

О. А. Заботина

Официальные оппоненты

- член-корреспондент РАН А. Н. Гречкин

- кандидат биологических наук С. Ф. Племенкова

Ведущая организация - Институт биохимии им. А. Н. Баха

РАН (Москва)

Защита состоится 1997 года в И часов на заседании

Специализированного совета К 002. 16. 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу 420503 Казань ул. Лобачевского 2/31, а/я - 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан сук^лА^ 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Лосева Н. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Углеводы также как белки и жиры играют полифункциональную роль в жизни растения. Хорошо изучена их роль в качестве источника энергии и структурного материала клеточной стенки. Глюкоза служит источником энергии для жизнедеятельности растений. Синтез сахарозы из глюкозы позволяет растению транспортировать энергию от зеленого листа к другим частям растения, а образование крахмала позволяет растению запасать энергию и регулировать её потребление.

Клеточная стенка растения преимущественно состоит из полисахаридов. Полисахариды связываются между собой и образуют жесткий каркас клеточной стенки. Тем самым обеспечивается определенная форма клетки и всего растения.

Углеводы в виде мономеров или небольших углеводных цепочек связываются со всеми классами химических соединений, которые находятся в растениях: белки, липиды, фенолы, терпены и др. химические соединения. Тем самым они расширяют спектр физических и биохимических свойств этих молекул и обеспечивают более разнообразное применение их растением.

Исследования последних двух десятилетий высветили ещё один существенный аспект роли углеводов в жизнедеятельности растений. Показано, что углеводы обладают регуляторными свойствами и вовлечены в регуляцию многих важных процессов растительной клетки. Они, как правило, имеют небольшой молекулярный вес и по степени полимеризации классифицируются как олигосахариды. Для проявления их биологической активности требуется определённая пространственная структура. Биологически активные олигосахариды были названы олигосахаринами [Albersheim and Darvill, 1985]. Они проявляют физиологическую активность при очень низких концентрациях, соизмеримых с концентрацией природных фитогормонов.

Основным источником олигосахаринов являются полисахариды клеточной стенки растений и грибов. После их частичного гидролиза кислотой или ферментами получают смесь олигосахаридов, из которой выделяют олигосахарины. Выделяемые таким образом активные олигосахариды образуются искусственным способом, и не ясно, действительно ли они

являются естественными углеводными регуляторами. Следовательно, вопрос о присутствии олигосахаринов в активной форме in vivo и их функционирования в растении оставался открытым.

Цель и задачи исследования. Цель нашей работы заключалась в выделении углеводов из водного экстракта тканей растения и выявлении среди них олигосахаридов с биоактивной функцией. Под водным экстрактом тканей растения мы понимаем водный раствор, который получают после экстракции фосфатным буфером содержимого гомогената тканей растения и отделения клеточной стенки и другого нерастворимого материала. Следовательно, в его состав входят все химические соединения из тканей растения, которые растворяются в фосфатном буфере независимо от их локализации в клетке (содержимое вакуоли, цитоплазмы и межклеточного пространства).

В литературе не описаны методы выделения олигосахаридов из подобных экстрактов. Более того, для корректного выявления биологически активных фрагментов необходима технология получения олигосахаридов с высокой степенью чистоты. В связи с этим, данная работа посвящена решению трех основных задач:

1. Разработка метода выделения чистых фракций олигосахаридов из водного экстракта тканей растения.

2. Тестирование выделенных фракций на биологических тест системах с целью поиска среди них биоактивных олигосахаридов, влияющих на процессы роста и корнеобразования.

3) Анализ состава выявленных активных олигосахаридов.

Научная новизна работы. В результате проделанной работы были достигнуты следующие результаты:

1) Разработан оригинальный метод выделения высокоочищенных нейтральных олигосахаридов из водного экстракта тканей растения.

2) Впервые выявлены три высокоочищенные биологически-активные фракции нейтральных олигосахаридов, образующихся в растительной ткани in vivo: стимулятор и ингибитор корнеобразования у тонкослойных эксплантов гречихи и ингибитор роста, стимулируемого 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), сегментов стеблей гороха.

3) Установлен моносахаридный состав и тип связей гликозидных остатков активных фракций.

Практическая значимость работы. Доказано существование олигосахаринов в растущих тканях in vivo. Выявленные фрагменты являются активными молекулами, влияющими на процессы ризогенеза и роста удлинением. Результаты проведенной работы вносят вклад в развитие представлений об участии углеводов в регуляции роста и органогенеза растений.

Применение олигосахаринов в биотехнологии позволит повысить эффективность искусственного культивирования растений. Естественное происхождение и углеводная природа олигосахаринов позволяют использовать их в биотехнологии без вредных последствий для окружающей среды.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на 3 съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); на 7 и 8 Международном симпозиуме по олигосахаридам (Словакия, 1994 и 1997); на 7 Международном конгрессе по клеточной стенке (Испания, 1995); на Международном симпозиуме "Пектины и Пектиназы" (Нидерланды, 1995); на 10 Международном конгрессе FESPP (Италия, 1996); на итоговых конференциях Казанского Научного Центра РАН 1994 и 1997)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, основных выводов работы, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, 23 таблицы и 1 фотографию. Список литературы состоит из 226 наименований. Приложение содержит 30 таблиц и 7 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ На схеме 1 представлены основные этапы выделения олигосахаридов из водного экстракта тканей гороха. В качестве источника олигосахаридов использовали побеги 10-12 дневных проростков гороха (Pisum sativum L.) сорта «Татарстан», выращенных на водопроводной воде при температуре 23-25°С на свету (12-ти часовой световой день, 20ВТ/м2). Проростки фиксировали при 100°С в течение 30 минут в сушильном шкафу и затем досушивали при 60°С до постоянного веса. Данный метод фиксации оказался наиболее приемлемым из

РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Многоступенчатая

экстракция(этанол+

хлороформ;50мМ фосфатный

буфер

ВОДНЫЙ ЭКСТРАКТ ТКАНЕЙ ГОРОХА

ДАУЕКС - 50 рН 6.0

(50 мМ КН2Р04)

ДАУЕКС - 50 (1.5 №С1)

ДАУЕКС - 50 рН 2.2, 2°С (10 мМ НС1)

ДЭАЭ - целлюлоза

(10 мМ МН4С1)

ОЛИГОСАХАРИДНЫЕ

ФРАКЦИИ

Гель-проникающая хроматография ТБК Н\М-40 (100 мМ №С1)

Гель-проникающая хроматография Р-4 (диет, вода, 60°С

Препаративная ВЭАОХ на СагЬо Рас РА-100 (фадиент 1М ацетат N8 в 0.1М МаОН)

ТЕСТИРОВАНИЕ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

Схема 1.

широко используемых способов (фиксация жидким азотом с последующей лиофильной сушкой, фиксация кипящим спиртом или трихлоруксусной кислотой) для выполнения наших задач. Высушенный растительный материал размалывали на механической мельнице до порошкообразного состояния и очищали экстракцией смесью хлороформ - этанол (1:2v/v) и 70% водным этанолом. Олигосахариды экстрагировали 50 мМ фосфатным буфером рН 7.0 из очищенного растительного материала. Экстракт доводили соляной кислотой до рН 6.0 и добавляли в раствор КМ-целлюлозу, уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером рН 6.0. КМ-целлюлозу отделяли на центрифуге, а надосадочную жидкость последовательно пропускали через Dowex 50 х 2 200400 меш, уравновешенный 50 мМ фосфатным буфером рН 6.0, концентрировали, добавляли NaCI до концентрации 1.5 М и пропускали через Dowex 50 х 2 200-400 меш, уравновешенный 1.5 М раствором NaCI.

Обессоленный на Sephadex G-10 раствор доводили соляной кислотой до рН 2.2 и пропускали через Dowex 50 х 2 200-400 меш, уравновешенный раствором соляной кислоты рН 2.2. Все операции при рН 2.2 делали на холоду при температуре 0-2°С и не более одного часа. На выходе из колонки с катионообменником раствор немедленно нейтрализовывапи аммиаком до рН 67. Затем полученный раствор доводили аммиаком до рН 8.0 и пропускали последовательно через ДЭАЭ-целлюлозу и Dowex 1 х 2 200-400 меш, уравновешенные 10 мМ раствором NH4CI, рН 8.0.

Выделенные нейтральные сахара делили гель-проникающей хроматографией на Биогеле TSK HW-40. (Toyo Soda",Япония), элюировали 100 мМ хлоридом натрия со скоростью 0.1 мл/мин. Содержание Сахаров в каждой фракции определяли антронным методом. Далее нейтральные олигосахариды делили гель-проникающей хроматографией на Биогеле Р-4 в воде при температуре 60°С и со скоростью 20 мл/час. Общее содержание нейтральных Сахаров (гексозы и пентозы) определяли орсинол-сернокислотным методом, а уроновые кислоты - мета-гидроксидифенильным методом.

Нейтральные олигосахариды делили препаративной

высокоэффективной анионообменной хроматографией (ВЭАОХ) на системе Dionex (Sunnyvale, СА, USA). Колонка CarboPac РА-100 20 мм х 250 мм,

снабжённая CarboPac РА пред-колонкой 3 мм x 25 мм. Скорость элюирования 25 мл/мин. Элюировали линейным градиентом: элюент А (100 мМ NaOH) и злюент В (1 М ацетата натрия в 100 мМ NaOH). После каждого анализа колонку промывали в течение 5 мин с 1 М NaOAc в 0.1 М NaOH и уравновешивали с 0.1 М NaOH в течение 15 мин. Выход углеводов контролировали пульс -амперометрическим детектором с золотыми электродами.

Название фракций образовывалось следующим образом. Например, для фракции 5(6)/1-1, первая цифра (5) обозначает номер фракции, полученной после деления на Биогеле TSK HW-40. Нумерация определяет порядок выхода фракции из хроматографической колонки. Вторая в скобках цифра (6) соответствует номеру новой фракции, полученной после деления на Биогеле Р-4 предыдущей фракции 5. Две последние цифры соответствуют номеру новой фракции, полученной после деления фракции 5(6) с помощью препаративной ВЭАОХ. Аналогичным способом образовывали названия для остальных двух активных фракций.

В случае фракции 5(6)/3-3, на первых двух этапах деления порядковый номер выявленных активных фракций были 4 (после TSK HW-40) и 4(6) или 4(7) (после Биогеля Р-4). Однако, при делении препаративной ВЭАОХ наибольшая активность (ингибирование) была выявлена при делении фракции 5(6) и это вызвало изменение порядка нумерации для ингибирующей фракции.

Определение моносахаридного состава и типов связей моносахаридных остатков проводили согласно следующей процедуре. Образцы олигосахаридов метилировали модифицированным методом Хакомори (Hakomori) [Sandford and Conrad, 1966], последовательно диализовали и высушивали в потоке воздуха. Чтобы получить ацетаты альдитолов, метилированные олигосахариды гидролизовали 2 М TFA (121°С 1 час). Гидролизат высушивали, восстанавливали боргидридом натрия (NaBH4) и ацетилировали уксусным ангидридом [Englyst and Cummings, 1984]. Частично метилированные ацетаты альдитолов анализировали на капиллярной колонке (30 мх0.32 мм; стенка покрыта с DB 1701; 0.25 мкм) в Carlo Erba FractoVap 4160 газовом хроматографе (ГХ), оборудованном FID. Состав образцов вычисляли, используя эффективные множители отклика углерода ECR [Sweet et al., 1975]. Идентификацию состава выпопняли на газовом хроматографе - масс-

спектрометре (ГХ-МС) (Hewlett Packard, MSD 5970-B связанный с HP 5890, снабжённый колонкой (CPSIL 19СВ, 26 мх0.22 мм; 0.18 мкм)). 3,4- и 2,3-0-металированные, а также 2- и З-О-метилированные ацетаты ксилитолов элюировались совместно и их относительные количества вычисляли из отношения количества ионов при м/з 117 и м/з 118, и м/з 118 и м/з 129+130 соответственно (м/з-отношение массы к заряду). Масс-спектры исследуемых фракций анализировали, используя масс-спектры стандартных моносахаридов. Средняя квадратичная ошибка при метилировании не превышала 3%.

Влияние выделенных олигосахаридов на процесс корнеобразования изучали на тест-системе с тонкослойными эксплантами из гипокотилей гречихи. Получение и культивирование эксплантов из гипокотилей гречихи (сорт "Крупнозерная") проводили согласно методике (Lozovaya et а)., 1993). Экспланты (0.5 см) вырезали из середины стерильных гипокотилей (1.5-2.5 см) и культивировали их стерильно по одному экспланту в чашке Петри (диаметр 40 мм) на среде В5 в термостате при температуре 25°С. Первые корни появлялись на 5 день, и с этого момента в течение двух недель подсчитывали число корней у каждого экспланта. На 30 день культивирования определяли массу корней.

Ингибирующий эффект олигосахаридов на рост, стимулируемый 2,4-Д, изучали на тест-системе с сегментами стеблей гороха [McDougall and Fry, 1988]. У этиолированных проростков гороха (сорт "Татарстан") с длиной третьего междоузлия 3.5-4.5 см отрезали сегмент длиной 6.0 мм от вершины третьего междоузлия, отступая от апикального крючка 2 мм. Сегменты вымачивали в воде (30 мин), в свежеприготовленной среде, которая содержала 1% сахарозы; 5 мМ КН2Р04; 0.02% натриевой соли бензил пенициллина, рН 6.1( 90 мин) и культивировали на этой среде в термостате (25°С, 18 час). В эксперименте использовали два контроля: среда без добавок; среда с 2,4-Д (1.0 мкМ). Опыт - среда с 2,4-Д (1.0 мкМ) + тестируемая фракция.

Все опыты по тестированию на биологическую активность проводили 5-6 раз; каждый опыт был выполнен в 30 биологических повторностях. Статистический анализ разницы между контролем и опытом проводили по методу сравнения выборок с попарно связанными вариантами [Лакин, 1980]. Разница между контролем и опытом статистически достоверна (Р>0.95).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности выделения олигосахаридов Олигосахариды экстрагировали фосфатным буфером из растительного материала, очищенного от фенолов, терпенов, липидов, фитогормонов и др. соединений смесью хлороформ - этанол и водным этанолом.

На катионообменнике йо\л/ех 50 при рН 6.0 олигосахариды очищали от соединений с основными свойствами (белки, амины, алкалоиды и другие соединения). На катионообменнике йо\л/ех 50 в 1.5 М растворе №С1 олигосахариды очищали от примесей, которые склонны к гидрофобной сорбции. Олигосахариды очищали от слабых оснований на колонке с Оо\«ех 50 при рН 2.2. На анионообменниках освобождались от отрицательно заряженных соединений (кислоты, белки и другие соединения). На этой стадии очистки отделялись кислые сахара от нейтральных. Все последующие исследования мы проводили только с нейтральными олигосахаридами.

Нейтральные олигосахариды делили гель-проникающей хроматографией на Биогеле ТбК Н\ЛМ0. Далее фракции, содержащие активные олигосахариды, последовательно делили гель-проникающей хроматографией на Биогеле Р-4 и препаративной высокоэффективной анионообменной хроматографией (ВЭАОХ, ОЮМЕХ).

Предлагаемая нами методика выделения позволила впервые получить высокоочищенные фракции нейтральных олигосахаридов из тканей растения. Выбор химических реагентов и условий очистки подобраны таким образом, чтобы сохранить целостность выделяемых олигосахаридов.

На каждом этапе хроматографического деления получаемые фракции олигосахаридов тестировали на биологическую активность. Тестирование проводили на тонкослойных эксплантах из гипокотиля гречихи и сегментах стеблей гороха.

Результаты тестирования олигосахаридов на биологических тест-системах Тонкослойные экспланты из гипокотиля гречихи способны на безгормональной среде образовывать корневую систему. Эта тест-система была разработана ранее в нашей лаборатории и активно используется для

исследования влияния олигосахаринов из клеточной стенки гороха на ризогенез у эксплантов. Результаты опытов анализировали по трём параметрам: число корней на один эксплант; процент эксплантов, которые дали корни; средняя масса сухих корней, которые приходятся на один эксплант (масса корней).

На первом этапе хроматографирования нейтральных олигосахаридов были выявлены две биоактивные фракции, оказывающие стимулирующий и ингибирующий эффект на процесс корнеобразования. Далее эти две активные фракции делили на Биогеле Р-4 и препаративной ВЭАОХ. Скрининг полученных фракций на аналогичной тест-системе позволил выявить две активные фракции 5(6)/1-1 и 5(6)/3-3. Фракция 5(6)/1-1 стимулировала корнеобразование (таблица 1), что выражалось увеличением числа корней на один эксплант и массы корней в среднем на 50%.

Фракция 5(6)/3-3 ингибировала корнеобразование (таблица 2 и 3), уменьшая число корней на один эксплант, процент эксплантов, давших корни и массу корней в среднем на 40%.

Таблица 1. Среднее значение увеличения числа корней на 1 эксплант

(в процентах).

Этапы тестирования фракция (концентрация) Среднее значение стимулирования числа корней на 1 эксплант по дням в %

7-8 9-10 11 -12

после ТБК Н\Л/-40 фракция 5 (1 мкг/мл) 71.0 + 9.5 26.5 + 2.5 47.3 ±21.7

после Биогель Р-4 фракция 5(6) (0.1 мкг/мл) 50.8 ± 15.7 56.0 ±10.1 46.4 ± 7.0

после ВЭАОХ фракция 5(6)/1-1 (0.01 мкг/мл) фракция 5(6)/1-1 (0.001 мкг/мл) 22.5 ±14.5 83.0 ± 30.6 40.5 ± 1.5 27.0 ± 5.0 20.0 ± 6.4

На каждом этапе очистки тестируемые концентрации олигосахаридов уменьшали в 10 раз. При этом, как показывают данные таблицы 1, 2 и 3, уровень активности не менялся, что отражает значительное повышение

удельной активности, т.е. высокую эффективность очистки (активные концентрации понизили в 1000 раз).

Таблица 2. Среднее значение снижения числа корней на 1 эксплант (в процентах).__

Этапы тестирования фракция (концентрация) Среднее значение ингибирования числа корней на 1 эксплант по дням в %

7-8 9-10 11 - 12

после ТЭК Н\Л/-40 фракция 4 (1 мкг/мл) 18.3 ±8.2 33.3 ±3.4 28 ± 6.6

после Биогель Р-4 фракция 4(6) (0.1 мкг/мл) фракция 4(7) (0.1 мкг/мл) 21.3+12.6 62.5 ± 53.0 24.0 ± 25.5 58.0 ± 59.4 29.5 ± 13.4 53.5 ±29.0

после ВЭАОХ фракция 5(6)/3-3 (0.001 мкг/мл) 25.5 ± 12.5 26.5 ± 13.5 35.0 ±0.6

Примечание. На заключительной стадии деления (ВЭАОХ) ингибитор выделяли из стимулирующей фракции 5(6), что отражается в изменении нумерации ингибирующей фракции.

Таблица 3. Среднее значение снижения процента эксплантов, давших корни (в

Этапы тестирования фракция (концентрация) Среднее значение ингибирования процента эксплант, давших корни по дням в %

7-8 9-10 11-12

после ТБК Н\Л/-40 фракция 4 (1 мкг/мл) 56.3+12.7 54.5 ±13.3 48.5 ± 11.4

после Биогель Р-4 фракция 4(6) (0.1 мкг/мл) 51.5 ±33.2 35.5 ± 28.8 23.5 ±2.1

после ВЭАОХ фракция 5(6)/3-3 (0.001 мкг/мл) 39.0 ±15.3 35.3 ±13.4 12.0 ±2.0

Степень полимеризации активных фракций 5(6)/1-1 и 5(6)/3-3 определяли аналитической ВЭАОХ с использованием стандартных гидролизатов галактана и составляет 5 и 4, соответственно.

Мы выделяли олигосахариды из растений, которые находились на стадии интенсивного роста, предполагая, что на этой стадии эндогенные регуляторы роста, в том числе и углеводной природы, присутствуют в большем количестве. Поэтому, мы считали обоснованным тестирование фракции олигосахаридов на ростовую активность. При исследовании регуляторов роста общепризнанной тест-системой для их выявления являются сегменты стеблей растений, в нашем случае сегменты гороха [McDougall and Fry, 1988].

Тестирование олигосахаридных фракций, полученных в результате деления на Биогеле TSK HW-40, показало наличие ингибитора роста сегментов во фракции 4. Затем фракцию 4 хроматографировали на Биогеле Р-4 и с помощью препаративной ВЭАОХ. Тестирование вновь полученных фракций на аналогичном тесте выявило активную фракцию 4(4)/4-5, которая ингибировала рост, индуцируемый 2,4-Д, сегментов стеблей гороха при концентрации 0.01 мкг/мл и 0.1 мкг/мл (таблица 4). Степень полимеризации фракции 4(4)/4-5, определяемая аналитической ВЭАОХ с использованием стандартных гидролизатов галактана, составляет примерно 8-10.

Таблица 4. Ингибирование роста проростков (в процентах).

Этапы тестирования фракция (концентрация) Среднее значение ингибирования в %

после TSK 4 (10 мкг/мл) 2.16

HW-40 4 (1 мкг/мл) . 5.0

После 4(4) (0.1 мкг/мл) 12.4 + 3.7

Биогель Р-4 4(4) (0.01 мкг/мл) 16.7 ±4.9

после 4(4)/4-5 (0.1 мкг/мл) 11.5±3.1

ВЭАОХ 4(4)/4-5 (0.01 мкг/мл) 17.7 ±8.7

Состав и предполагаемый механизм участия олигосахаринов в регуляции корнеобразования 1. Стимулятор корнеобразования В таблице 5 представлены данные по моносахаридному составу активных фракций и типам связей гликозидных остатков в мольных процентах от суммы нейтральных моносахаридов.

Основными компонентами стимулятора корнеобразования (фракция 5(6)/1-1) являются галактоза и глюкоза (таблица 5). Дополнительно в состав фракции входят ксилоза и манноза. Анализ состава стимулятора корнеобразования с помощью аналитической ВЭАОХ (рис.1) показал, что

Таблица 5. Моносахаридный состав и типы связей гликозидных остатков фракций 5(6)/1-1, 5(6)/1-1 и 4(4)/4-5 (в мольных процентах от суммы нейтральных Сахаров). __.__

Фракция 5(6)/1-1 Фракция 5(6)/3-3 фракция 4(4)/4-5

Тип мол % Тип мол % Тип мол %

моносахарида моносахарида моносахарида

4-Ксил. 7.2 т-Ара. 4.7 2-Рам. 3.5

т-Гл. 25.1 т-Гл. 35.8 т-Гл. 12.1

4-Гл. 15.9 З-Гл. 12.4 З-Гл. 8.9

4,6-Гл. 6.3 4-Гл. 17.7 4-Гл. 34.1

4-Ман. 4.3 4,6-Гл. 1.9 т-Гал. 13.0

6-Ман. 6.0 т-Гал. 3.3 4-Гал. 14.0

т-Гал. 11.2 4-Гал. 17.1 6-Гал. 14.5

6-Гал. 2.5 6-Гал. 5.7

4,6-Гал. 6.3 4,6-Гал. 1.6

3,6-Гап. 12.6

фракция 5(6)/1-1 представлена одним основным пиком, на долю которого приходится 50-60% олигосахаридов и несколькими пиками, которые относятся по времени выхода на препаративной ВЭАОХ к соседним неактивным фракциям 5(6)/1-2, 5(6)/1-3 и 5(6)/3-5 и содержатся в качестве примеси во фракции 5(6)/1-1.

В составе фракций 5(6)/1-2 и 5(6)/1-3 (таблица 6) отсутствует 3,6-Гал, 4-Ман, и в два раза падает содержание т-Гл. В составе фракции 5(6)/3-5 (таблица 6) отсутствует 3,6-Гал, 4-Ман и 6-Ман. Исходя из сравнительного анализа данных аналитической ВЭАОХ и состава соседних фракций, возможно, что 3,6-Гал. и 4-Ман. входят только в состав активной фракции, и следовательно, можно предполагать, что в состав олигосахарина, который стимулирует корнеобразование, входит 3,6-Гал. и 4-Ман. и т-Гл. В литературе не известны

олигосахариды с таким составом моносахаридов и типом их связей, которые стимулируют корнеобразование. До сих пор были описаны только два фрагмента, обладающих стимулирующим эффектом на корнеобразование. Это пентаксилоглюкановый фрагмент, состоящий из глюкозы, ксилозы, галактозы и фукозы (Аш и др. 1995) и арабиногалактановый фрагмент не установленной

Время удерживания (мин.)

Рис 1. Профиль элюирования при аналитической ВЭАОХ (DIONEX) фракции 5(6)/1-1, полученной после последовательного деления олигосахаридов из водного экстракта тканей гороха гель-проникающей хроматографией на Биогеле TSK HW-40 (фракция 5), гель-проникающей хроматографией на Биогеле Р-4 (фракция 5(6)) и препаративной высокоэффективной анионообменной хроматографией (фракция 5(6)/1-1). Колонка СагЬо Рас РА 100 (4x250 мм). Скорость элюирования 1мл/мин. Линейный градиент: элюент А -100 мМ NaOH; элюент В - 1М ацетат натрия в 100 мМ NaOH. Выход углеводов контролировали пульс - амперометрическим детектором (ПАД).

структуры (Zabotina et al., 1996), который стимулировал все стадии корнеобразования, в отличие от полученного в нашей работе активного олигосахарида. Всё это даёт основание утверждать, что нами получена стимулирующая корнеобразование оригинальная олигосахаридная фракция.

Выделенный нами стимулятор корнеобразования характеризуется следующими свойствами:

1. Увеличивает число корней на один эксплант и массу образующихся корней.

2. Не изменяет процент эксплантов, дающих корни.

Изменение во времени процента эксплантов, дающих корни, характеризует скорость увеличения количества эксплантов, у которых начинают визуализироваться корни. Чем интенсивнее развитие корней, тем раньше они появятся на поверхности экспланта и будут зафиксированы при подсчёте.

Таблица 6. Моносахаридный состав и типы связей гликозидных остатков фракций 5(6)/1-2, 5(6)/1-3 и 5(6)/3-5 (в мольных процентах от суммы нейтральных Сахаров). __•

Фракция 5(6)/1-2 Фракция 5(6)/1-3 Фракция 5(6)/3-5

Тип моносахарида мол % Тип моносахарида мол % Тип моносахарида мол %

4-Ксил. 2.8 т-Гл. 10.0 т-Ксил. 2.5

т-Гл. 12.7 З-Гл. 2.6 4-Ара. 7,4

З-Гл. 4.2 4-Гл. 38.8 2-Рам. 7.7

4-Гл. 50.1 4,6-Гл. 10.5 т-Гл. 21.7

6-Гал. 5.4 т-Гал. 5.5 З-Гл. 6.3

4-Гал. 21.9 4-Гал. 15.4 4-Гл. 23.0

4,6-Гап. 11.2 6-Гал. 7.7 т-Гал. 7.3

6-Ман. 5.4 6-Ман. 4.3 4-Гал. 13.0

6-Гал. 6.0

4,6-Гал. 3.8

Чем выше скорость роста корней, тем быстрее будет расти количество новых эксплантов с корнями и выше параметр процента эксплантов, дающих корни. Поскольку не наблюдалась разница между контролем и опытом (стимулятор) по параметру процент эксплантов, давших корни, мы пришли к заключению, что стимулятор не влияет на скорость роста корней на ранних стадиях развития.

Количество корней на каждом экспланте может определяться двумя факторами:

1. Количеством закладываемых корней у экспланта. Чем больше будет заложено корневых зародышей, тем больше будет корней на экспланте.

2. Скоростью роста корней на ранней стадии развития (от закладки корневых примордиев до визуального обнаружения корней).

Поскольку выше отмечалось, что олигосахарид, вероятнее всего, не действует на скорость роста корней на ранних этапах развития, можно предполагать, что он увеличивает количество закладываемых корневых зародышей на каждом экспланте. В закладывании корневых зародышей на фазе инициации корнеобразования основную регуляторную роль играет ИУК [Eriksen arid Mohammed, 1974]. Поэтому, можно предположить, что выделенный нами олигосахарид либо проявляет ауксин подобный эффект, либо вовлечён в ауксин зависимую регуляторную цепочку биохимических событий, которые приводят к инициации образования корней.

2. Ингибитор корнеобразования

Выделенный нами ингибитор корнеобразования у эксплантов гречихи (фракция 5(6)/3-3) снижает все три анализируемых параметра: число корней на 1 эксплант, процент эксплантов, давших корни и массу корней. Такое многоплановое действие затрудняет даже предварительный анализ способа действия ингибитора. Ингибирование может проходить на всех стадиях развития корней, и это можно объяснить как анти-гормональными эффектами (например как в случае ингибирования роста корней у эксплантов олигогалактуронидами [Eberhard et al., 1989]), так и прямым действием олигосахарина, не затрагивая гормональную регуляцию.

На промежуточном этапе хроматографирования (Биогеле Р-4) выявили две фракции, которые ингибировали корнеобразование. Фракция 4(6) снижала число корней на 1 эксплант, процент эксплантов, дающих корни и массу корней (таблицы 2 и 3). Фракция 4(7) только снижала число корней на 1 эксплант, но не изменяла два других параметра (таблица 2). Мы предполагаем, что разные характеристики ингибирования можно объяснить присутствием стимулятора и ингибитора в разном соотношении. Стимулятор и ингибитор элюируются очень близко друг к другу, и следовательно, стимулирующая и ингибирующая фракции содержат в своём составе как ингибитор, так и стимулятор, но в разных пропорциях. Высокое соотношение стимулятор/ингибитор стимулирует

корнеобразование, а высокое соотношение ингибитор/стимулятор ингибирует корнеобразование. Фракция 4(7) характеризуется промежуточным соотношением концентраций ингибитора и стимулятора. В связи с данными наблюдениями встаёт вопрос о роли отношений концентраций стимулятора и ингибитора на корнеобразование. Можно предположить, что отношение концентраций ингибитора и стимулятора, подобно фитогормонам, играет роль в процессе корнеобразования.

На аналитической ВЭАОХ фракция 5(6)/3-3 представлена двумя основными пиками (рис. 2), на долю которых приходится 90% олигосахаридов фракции. Состав фракции представлен двумя основными моносахаридами

Время удерживания (мин.)

Рис 2. Профиль элюирования при аналитической ВЭАОХ (DIONEX) фракции 5(6)/3-3, полученной после последовательного деления олигосахаридов из водного экстракта тканей гороха гель-проникающей хроматографией на Биогеле TSK HW-40 (фракция 4), гель-проникающей хроматографией на Биогеле Р-4 (фракция 4(6)) и препаративной высокоэффективной анионообменной хроматографией (фракция 5(6)/3-3). Колонка Carbo Рас РА 100 (4x250 мм). Скорость элюирования 1мл/мин. Линейный градиент: элюент А -100 мМ NaOH; элюент В - 1М ацетат натрия в 100 мМ NaOH. Выход углеводов контролировали пульс - амперометрическим детектором (ПАД). На заключительной стадии деления препаративной ВЭАОХ ингибитор выделяли из фракции 5(6), что отображено в изменение нумерации.

(таблица 5) - галактоза и глюкоза (в небольшом количестве присутствует терминальная арабиноза). Содержание глюкозы и галактозы примерно одинаково. Не известны полисахариды клеточной стенки, где в равном количестве содержатся оба моносахарида, и при этом отсутствуют другие моносахариды. Поэтому можно предположить, что один из двух пиков на рис. 2 относится к глюкану, а другой к галактану.

Как известно из литературных данных, ингибиторами корнеобразования являются фрагменты олигогалактуронидов [Eberhard et al., 1989] и галактоглюкоманнана [Liskova et al., 1995]. В составе фракции 5(6)/3-3 отсутствуют галактуроновая кислота и манноза. Поэтому упомянутые фрагменты не могут входить в состав фракции 5(6)/3-3. Следовательно, обнаруженный нами олигосахарид, ингибирующий корнеобразование, не принадлежит ни к одному из известных активных олигосахаридов с аналогичным эффектом.

Одновременное присутствие в ткани эндогенных олигосахаринов с противоположным действием, возможно, может свидетельствовать о том, что для регуляции процесса корнеобразования важно их количественное соотношение. Смещение этого соотношения в ту или иную сторону приводит к различным ответным реакциям. Так как выделение олигосахаридов проводили из всей растительной ткани, то нельзя исключить, по аналогии с фитогормонами, возможность различной локализации олигосахаринов с противоположной активностью в разных тканях. Например, накопление ауксина' и абсцизовой кислоты на противоположных сторонах стеблей растений в случае тропического изгиба [Barlow Р, 1982].

Важно подчеркнуть, что полученные нами олигосахаридные фрагменты с противоположным эффектом на процесс корнеобразования присутствуют in vivo в активной форме. Структура этих фрагментов отлична от известных олигосахаринов, полученных из клеточных стенок, что может свидетельствовать о многообразии форм активных олигосахаридов и, вероятно, об их специфичности для различных видов растений. Либо можно предположить, что структура фрагментов, образующихся in vivo, отлична от структуры олигомеров, получаемых несколько искусственным путем из гидролизата полисахаридов клеточной стенки.

3. Ингибитор роста сегментов стеблей гороха

Фракция 4(4)/4-5 представлена двумя основными моносахаридами -галактоза и глюкоза (таблица 5). В небольшом количестве имеется рамноза.

В настоящее время известно только три нейтральных олигосахарида, которые ингибируют рост сегментов стеблей гороха: ксилоглюкановый фрагмент Хв-Э, фрагменты галактоглюкоманнана со степенью полимеризации 4-8 и фрагменты целлюлозы. В состав Хв-Э, помимо глюкозы и галактозы, входят фукоза и ксилоза, которые отсутствуют в составе фракции 4(4)/4-5 (таблица 5). Во фракции также отсутствует манноза - характерный признак фрагментов галактоглюкоманнана. Можно предположить присутствие фрагментов целлюлозы в составе фракции, но известно, что гидролиз целлюлозы отсутствует в растительной клетке. Следовательно, обнаруженный нами активный олигосахарид является новым, и не принадлежит ни к одному из известных активных нейтральных олигосахаридов с аналогичным действием. В пользу данного утверждения также говорит тот факт, что в моносахаридном составе активной фракции 4(4)/4-5 (таблица 5) отсутствуют разветвлённые моносахариды, и, следовательно, активная олигосахаридная молекула, присутствующая во фракции 4(4)/4-5, имеет линейную-структуру. Известно, что ксилоглюкановый фрагмент Хв-Э, фрагменты галактоглюкоманнана относятся к разветвлённым олигосахаридам.

Таким образом, мы можем утверждать, что выделенный нами новый ингибитор роста сегментов проростков имеет линейную структуру и его состав отличается от известных из литературы олигосахаринов с аналогичной активностью.

Пока сложно говорить о пути образования активных олигосахаридов. Наиболее вероятно, что их источником являются полисахариды клеточных стенок, которые расщепляются с помощью гликозидаз, присутствующих в тех же стенках и активизирующихся в тех или иных условиях. При нашем способе фиксации мы допускаем активизацию гликозидаз в первый момент повышения температуры, что может привести к увеличению доли выщипляемых олигосахаридных фрагментов. Однако, время такой активизации составляет всего несколько минут и доля образующихся в результате олигосахаридов весьма незначительна по сравнению с уже существующей до этого момента. Следовательно, пока можно утверждать только то, что выделенные нами

олигосахарины образуются в растительной ткани in vivo. Возможно, их содержание повышается в результате краткосрочной термостимуляции гликозидаз. Мы не исключаем также возможности их термоиндуцированного возникновения. В последнем случае их можно рассматривать как стресс -олигосахарины, что также является весьма интересным фактом, до сих пор не описанным в литературе и требующим дальнейших исследований.

Механизм действия олигосахаринов на рост неизвестен. Существующие сейчас данные указывают, что их действие зависит от структуры олигосахаридного фрагмента, от его концентрации и от времени воздействия. Например, фрагменты ксилоглюкана, которые не содержат фукозу, стимулируют рост, а содержащие фукозу, ингибируют рост проростков гороха [McDougall and Fry, 1989]. Отмечают разную чувствительность клеток сегментов гороха к разным концентрациям фрагментов галактоглюкоманнана в зависимости от стадии роста. В первые 4 часа наибольший ингибирующий эффект наблюдали при концентрации фрагментов галактоглюкоманнана Ю"10 М, после чего наиболее активно ингибирование проходило при концентрации фрагментов галактоглюкоманнана 10"3 М [Auxtova-Samajova et al., 1996]. Существуют предположения об участии олигосахаринов в гормональной регуляции. Одним из способов их участия в механизме действия фитогормонов обсуждается роль олигосахаринов в качестве "вторичного посредника". Небольшое количество фитогормонов оказывает влияние на широкий спектр жизненных процессов у растений. Предполагают, что олигосахарины в качестве вторичных посредников обладают более высокой специфичностью и сужают спектр действия фитогормонов до конкретного физиологического отклика [Albersheim and Darvill, 1985]. Также обсуждается возможность напрямую регуляции олигосахаринами активности ферментов [Fry et al., 1993].

ВЫВОДЫ

1) Разработан метод выделения высокоочищенных фракций нейтральных олигосахаридов из водного экстракта тканей растения. Получены фракции олигосахаридов, которые по уровню чистоты удовлетворяют высоким требованиям, предъявляемым к исследованиям физиологически активных соединений.

2) Впервые получена олигосахаридная фракция, которая стимулирует образование корней (увеличивает число образующихся корней на один

эксплант и массу корней) у тонкослойных эксплантов из гипокотиля гречихи. Полумаксимапьный эффект наблюдали при концентрации 5х10"9 М.

3) Предварительный анализ состава активной фракции показал, что стимулятор корнеобразования представляет собой разветвлённый фрагмент со степенью полимеризации 5. Обнаружена корреляция активности фракции с наличием в ней 3,6-Гап. и 4-Ман. в своём составе.

4) Выявлена новая олигосахаридная фракция, которая ингибирует процесс корнеобразования (снижает число образующихся корней на один эксплант, число эксплантов, давших корни и массу корней) у тонкослойных эксплантов из гипокотиля гречихи. Фракция содержит два олигосахаридных фрагмнета со степенью полимеризации 4, являющиеся фрагментами галактана и глюкана. Полумаксимальный эффект наблюдали при концентрации 5x10"9 М.

5) Выделена новая олигосахаридная фракция, которая ингибирует рост, стимулируемый 2,4-Д, сегментов стеблей гороха. Полумаксимальный эффект наблюдали при концентрации 5х10'8М. В отличие от известных ранее олигосахаридов с аналогичной активностью данная фракция содержит фрагменты линейной структуры и иного моносахаридного состава.

6) Анализ литературных данных показал, что полученные в работе результаты являются первым прямым доказательством образования олигосахаринов, влияющих на процессы роста и органогенеза, в растительной ткани in vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Заботина О., Маликов Р., Гурьянов О., Жихарева М., Лозовая В., Белдман Г. Стимуляция корнеобразования олигосахаридными фрагментами // Тезисы докладов третьего съезда всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург 1993, 24-29 июня, т. 3, стр. 302.

2. Zabotina О., Gurjanov О., Ayupova D., Larskaya I., Beldman G., Lozovaya V. Separation of oligosaccharins occurred naturally in plant tissues II Programme and Abstracts 7th Bratislava symposium on saccharides. Smolenice, Slovakia 1994, August 29 - September 2, p. 95.

3. Заботина О., Гурьянов О., Маликов Р., Аюпова Д., Белдман Г., Вораген А., Лозовая В. Выделение олигосахаринов из побегов гороха и их физиологическая активность // Физиология Растений. 1995. т.42. № 3. с. 416-422.

4. Zabotina О., Gurjanov О., Ayupova D., Beldman G., Voragen A., Lozovaya V. Bioactive oligosaccharides from pea shoots II Abstracts and Programme 7th Cell Wall Meeting (eds: Zarra I. and Revilia G.) Santiago, Spain 1995, p. 62.

5. Zabotina O., Ibragimova N., Ayupova D., Gurjanov O., Lozovaya V., Beldman G., Voragen A. Bioactive fragments from pea pectin II Programme and Abstracts Pectins and Pectinases. International symposium. Wageningen, The Netherlands, 1995, December 3-7, P 30.

6. Zabotina O., Gurjanov O., Ayupova D., Beldman G., Voragen A., Lozovaya V. Biologically - active soluble oligosaccharides from pea stem tissues. // Plant Cell Reports. 1996, vol. 15, pp. 954-957.

7. Zabotina 0., Ibragimova N., Ayupova D., Gurjanov O., Lozovaya V., Beldman G., Voragen A. Bioactive fragments from pea pectin. In: Pectins and Pectinases (Ed. Visser J. and Voragen A.) Elsevier Science В. V. 1996, p. 693-701.

8. Zabotina O., Gurjanov O., Ayupova D., Ibragimova N., Beldman G., Voragen A., Lozovaya V. Participation of oligosaccharines in the process of root development. In: From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach // 10th FESPP (Federation of European Societies of Plant Physiology) Congress. Florence, Italy. September 9-13, 1996, p. 46.

9. Заботина О., Гурьянов О., Аюпова Д., Лозовая В., Белдман Г., Вораген А. Д. Г. Выделение и анализ растворимых олигосахаридов из побегов гороха, стимулирующих процесс корнеобразования II Биохимия. 1997, т. 62, вып. 8, стр. 988-992.

10. Zabotina О., Gurjanov О., Ibragimova N., Ayupova D., Larskaja I., Nikolaeva O., Lozovaya V., Zabotin A., Beldman G„ Voragen A. Effect of oligosaccharines an morphogenesis and adaptation // Programme and Abstracts 8th Bratislava symposium on saccharides. Smolenice, Slovakia 1997, September 1-5, p. 38-39.