Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль D-триптофана и малонилтриптофана в биосинтезе ИУК при прорастании семян

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль D-триптофана и малонилтриптофана в биосинтезе ИУК при прорастании семян"

#

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

РОЛЬ О-ТРИПТОФАНА И МАЛОНИЛТРИПТОФАНА В БИОСИНТЕЗЕ ИУК ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 501.142:581.197.7

Юрьева Ольга Викторовна

Иркутск,1997

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растении СО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

H.H.Рекославская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.К.Войников

кандидат биологических наук A.A.Батраева

Ведущее учереждение: Пензенский государственный педагогический университет им. В.П.Белинского, г.Пенза

Защита состоится 29 апреля 1997 г в //'¿V часов на заседании специализированного совета К 003.25.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г.Иркутск, ул.Лермонтова 132.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан J^f^l'b'r____iggy г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прорастание является важным процессом в жизни растения, определяющим его дальнейший рост и развитие. Физиологические и биохимичесние события, сопровождающие прорастание семян, могут заметно влиять на жизнеспособность и продуктивность культурных растений. В связи с этим, сведения, позволяющие понять закономерности гетеротрофной стади развития, имеют не только фундаментальное, но и большое прикладное значение. Известно, что фитогормоны регулируют прорастание. Вместе с тем, гормональные аспекты прорастания изучены недостаточно. Особенно мало известно об образовании и роли ауксина в этом процессе. Обработка семян экзогенным ауксином нарушает гормональный статус зародышей и приводит к аномальному росту проростков. Поэтому большое значение приобретают исследования, посвященные биосинтезу эндогенной ИУК и метаболизму её предшественников при прорастании.

Последние годы большое внимание уделяют изучению стереохимии вторичного метаболизма аминокислот, накоплено достаточно много данных о природных Б-аминокислотах, процессах, в которых они участвуют, а также об энантиоселекгивности ферментов. Неиоторке авторы рассматривают О-трлптофан(П-Три) в качестве предшественника ИУК(ИсОиееп-Макоп еЬ. а1.,1989; Ткиги-заЫ е1:.а1.;1990;Гамбург,Рекославская,1991). Выявлен эффект 0-Три в стимуляции роста культуры клеток и в стимуляции кор-необразования у интактных растений. Некоторые авторы полагают, что природным дериватом 0-Три является Я-малонилтриптофан (МГри)(К1арМ,1960;Гамбург,Рекославская,1991),который после гидролиза тоже может превращаться в ИУК. Эндогенный (Яри обнаружен в тканях многих растений в том числе и в семенах. Экзогенный МГри также, как С-Три, стимулирует рост культур клеток и образование корневых бугорков на черешках срезанных листьев. Существуют некоторые данные об образовании, превращениях и биологическом действии Б-Три и МТри в тканях растений, однако, вопрос о роли В-Три и МТри в биосинтезе ИУК при прорастании специально не изучали.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение роли образования Б-Три и (¿Три при прорастании

семян. Для достижения згой цели необходимо било изучить:

распространённость явления образования МТри в семенах и проростках растений разных таксономических групп; динамику содержания МТри и Три и влияние света на образования МТри и процессе роста проростков; распределение эндогенных МТри, ПУК и Три по органам и зонам роста этиолированных проростков; образование Б-Три в проростках при участии триптофанрацемазы и превращение его в ИУК с участием О-триптофантрансаминазы: эффективность использования Б-Три и Ь-Три в качестве предшественников ИУК в культуре изолированных зародышей пшеницы.

Научная новизна работы. В работе впервые проведены исследования ферментов образования и превращения Б-Три, а также образования и роли МТри при прорастании семян, в результате которых обнаружено их существенное значение для гормональной регуляции прорастания;

в проростках пшеницы и томата обнаружена активность триптофанрацемазы, катализирующей превращение как 0-Три в Ь-Тр так и Ь-Три в В-Три и О-триптофантрансаминазы, которая катализировала дезаминирование 0-Три в биосинтезе ИУК;

выявлено ингибирующее действие света на накопление МТри в проростках, коррелирующее с торможением роста в длину осевых частей этиолированных проростков;

показана пространственная корреляция между содержанием МТри и ИУК в этиолированных проростках;

выявлена стимуляция корнеобразования и удлинения первого настоящего листа у изолированных зародышей, при внесении й-Тря в среду для их культивирования.

Обнаруженная в работе взаимосвязь между образованием О-Тр МТри и ИУК в проростках позволяет ло-новому рассматривать роль МТри и 0-Три в биосинтезе ИУК при прорастании семян и гетеротрофной стадии роста проростка, а также, дополняет сведения об образовании, метаболизме и роли О-триптофана у растений.

Практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе сведения о биосинтезе, метаболизме и роли И-Три и МТри в биосинтезе ИУК при прорастании вносят существенный вклад в развитие концепции эндогенной гормональной регуляции прорастз! семян и гетеротрофной стадии роста проростков, и могут быть использованы в программах спецкурсов по физиологии растений.

Сведения о роли триптофаирацемази и D-триптофантрансаминазы в регуляции скорости биосинтеза ИУК при прорастании семян ч дальнейшем могут послужить основой для работа по выделению и клонированию целевых генов высокой хозяйственной ценности.

Публикации и апробация работ». Но материалам работы опубликовано 15 работ. Результаты исследований были доложены и обсувдена: на 2 Всесоюзной конференции"Регудяторы роста и разв5ггия растений(Киев,1988), на Всесоюзном симпозиуме "Регуляторы роста,устойчивость и продуктивность"(Минск,1988), на Всесоюзной конференции "Физиология семян"(Душанбе,1988), на Всесоюзной научной конференции "Онтогенетика высших растений" (Кишинев,1989), на Всесоюзной конференции но карпологии растений(Кишинёв,1989), на Международном симпозиуме регуляторов ррста растений(Болгария,1986), на 11 Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению растений (Ленинград,1990),на рабочем семинаре Института физиологии растений (Иосква,1991), на ежегодной конференции Американского общества физиологов растений(Питтсбург, (ЛИЛ,1992), на ежегодном симпозиуме Всероссийского общества физиологов рас-тений(Пенза,199б), на 10 Конгрессе Федерации Европейского Общества физиологов растений(Флоренция,Италия,1996), па научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Структура и обьём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 наименований, из них 120 иностранных источников. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 7 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Содержание МТри определяли в семенах 13 видов и проростках 18 видов растений. Семена проращивали в темноте на влажной фильтровальной бумаге при 25°С. В ряде опытов часть проростков помещали на круглосуточное освещение (на 3 сут.) люминесцентными лампами(5 Вт на м~").

МТри, Три и ИУК экстрагировали из проростков 80% этанолом, экстракты фракционировали на щелочную и кислую фракции

7 дней

и анализировали при помощи колоночной или тонкослойной хроматографии. Для анализа МТри и ИУК использовали кислую эфирную фракцию, для анализа Три - водный остаток. Количественное определение Жри проводили с помощью реактива Эрлиха колориметрическим методом или с помощью ВЭЖХ, при использовании триптофана в качестве внутреннего стандарта. Три анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе Т-ЗЗЭ(ЧССР). Количество ИУК определяли, используя жидкостной хроматограф

детектором.

При оценке характера распределения МТри, Три и ИУК, проростки томата были разделены на семядоли,3 зоны гипонотиля, соответствующие трём зонам роста(определённым при помощи меток из смеси угля и ланолина) (рис.1) и корни. Проростки пшеницы разделяли на колеоп-тиль, первый настоящий лист, переходную зону и корни. Ко-леоптили разделяли на сегменты ,соответствующие участкам, традиционно признанным как: зона биосинтеза ИУКСапекс 2мм), зона, обладающая наивысшей чувствительностью к ауксину(средняя, 5 км) и зона, мало чувствительная к ауксину (нижняя).

Для изучения биологического действия ИУК и её предоест-

Рис.1.3оны этиолированного проростка томата:семядоли(I),под-семядольное колено(П) ,57. длины гипонотиля),средняя часть(III, 35%),нижняя часть(IV,60Х)и корни (V).

веиников использовали культуру изолированных зародышей пшеницы ТгШсит аезНуит I.. Зародыш культивировали на среде Норс-тога (Мог^;1о£Д973) без аминокислот. Активность триптофанраце-мазы определяли во франции гомогената проростков(буфер КНуРОд/ НаоНГО.;,рН 8,3), обогащенную этиопластами. Инкубационная среда содержала 5 мкмоль Ь-Три или Б-Три, 100 мкМ пиридоксальфосфата, 0,1% Р!<БР(фенилметилсульфанилфторид),0,1Х дитиотрейтол,

- б -

1 мМ ЭДТА 71 ферментный препарат. Количество белка я ферментном препарате определяли по методу Лоури(1.омгу а1. , 1951). После инкубации в течение 12 час при 37°С в смеси определяли количество энантиомеров Три по методу Каца1а (Шй) с

помощью оксидаз 0- и Ь-аминокислот и цветном реакции с 2,4-ди-иитрофенилгидразином.

Активность Ь-трштофангрансаминазы(Ь-ТАТ) и В-трипто-фантрансаминазы(О-ТАТ) определяли во фракции гомогената проростков пшеницы и томата, обогащенную этиопластами по методу, описанному Мс*}иееп-Ма50п е1. а1. (1989). Опыты проводили в 4-5 биологических повторностях и 6-8 аналитических повтор-ностях. Варьирование результатов оценивали по средней квадратичной ошибке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Содержание И-малонилтриптофана(МТри) в семенах и проростках растений разных таксономических групп.

Содержание эндогенного МТри определяли в сухих семенах 13 видов и в проростках 18 видов растений(табл.1,2).

Таблица 1.

Содержание МТри в сухих семенах

Видовое название

МТри, нмоль на 100 семян

1. Lycopersicon esculentum Mill.

2. Capsicum annuum L.

3. Melilotus albus Medik.

4. Medicago sativa L.

5. Vicia faba L.

6. Pisum sativum L.

7. Helianthus annuus L.

8. Zea mays L.

9. Avena sativa L.

10. Oryza sativa L.

11. Secale cereale L.

12. Hordeum distichon L.

13. Triticura aestivum L.

32 ± 17 0

40 t 10 11+3

0 0 0 0 0 0 0 0 0

Таблица 2.

Содержание МТри в проростках

Видовое название 1 Сорт ■ i ........ |МТри,нмоль/100 ¡проростков 1

1. Lycopersicon esculentum Mill. "Московский 1 | 809 i 180

осенний" I

2. Lycopersicon peruvianum Mill. 3769(Чили) I 8 + 1

3. Lycopersicon peruvianum Mill. 3954(Перу) 1 29 t 3

4. Lycopersicon peruvianum Mill. 3955(Перу) 1 31 + 3

5. Lycopersicon peruvianum Mill. 3952(Перу) | следы

6. Capsicum annuum L. "Виннипух" 1 0

7. Melilotus.albus Medik. - J1708 ± 13

8. Medicago sativa L. - 1 75 + 6

9. Vicia faba L. - 1 о

10.Glycine max L. - 1 о

ll.Pisum sativum L. "Тулунский 1 следы

зимний" 1

12.Helianthus annuus L. - | следы

13.Elimus síbirícus L. - 1 0

14.Zea mays L. - 1 0

15.Avena sativa L. - 1 0

16.0ryza sativa L. - I о

17.Secale cereale L. "Саратовская" | 476 + 28

lS.Hordeum dístichon L. "Рассвет" | 160 + 8

19. "Темп" 1 0

20. - " - " - "Витим" i 0

21. "Циклон" 1 0

22. "Новоси- 1 0

бирский-80" 1

23. -•'-»- "Краснояр- 1 0

ский" !

24. "Новатор" 1 о

25. - » - » _ "Радикал" i о

26. - " - " - "Метеор" 1 о

27.Triticum roonococcum L. 13032 1 о

28.Triticum dicoccum L. 14035 I 142 t 10

Продолжение таблицы 2.

29.Triticum aestivum L. 1"Ангара" 1 589 4- 18 J

30.Triticum aestivum L. j"Тулунекая" 1 558 £ о !

31. -••-»- ¡ "Зритроспер- 1 501 + 30 1

1 мум-172" 1

32. - " - " - ¡"Альбидум" 1 470 ¥ 31 Í

33. !"Скала" 1 454 + 2 !

34. Г'Келм- 1 385 + 25 !

¡тинум-158" 1

35. - " - " - !"Лютес- ! 354 + 24 1

¡цене-198" 1

36. 1"Ранняя-12" I 323 29 1

37. - " - " - 1"Скороспелая" i 1 297 i 35 I 1

МТри обнаружили в семенах Lycopersicon esculentum Mill.,Meli-lotus albus Medik. и Medicago sativa L. В семенах остальных 10 видов МТри не обнаружили. При прорастании семян всех видов содержание МТри резко увеличивалось. Интересно, что некоторые растения, не содержащие МТри в семенах, в значительном количестве образовывали его при прорастании. Например, МТри обнаружили в проростках Seeale cereale L.,Hordeum distichon L. , Triticum aestivum L., тогда как в сухих семенах этих растений МТри обнаружить не удалось (табл.2). Из всех изученных представителей трибы пшеницевых способность к образованию МТри проявилась наиболее устойчиво у Triticum aestivum L. ß дальнейшем эти данные обусловили выбор объека для изучения физиологической роли МТри и D-Три. Из однодольных с этой целью был использован Triticum aestivum L., из двудольных -Lycopersicon esculentum Mill.

Установлено, что образование МГри в семенах томата начиналось ещё при их созревании(табл.3). В сухих семенах содержание МГри оставалось постоянным в течение долгого времени. При прорастании МГри не исчезал, а продолжал накапливаться (табл. 2).

Таблица 3

Накопление МПГри в семенах томата при созревании.

Сутки после Вес 100 1 | 1 сухого ; |ИТри.нмоль 1 МТри, |

завязывания семян/г ! вещества |на 1 семя нмоль/1 г|

15 0,29 1 11 1 0 о 1

20 0,72 1 13 1 0 о 1

30 1,48 1 18 1 0,22 14,6 |

40 1,15 I 34 1 0,56 48,5 |

50 0,75 | 38 1 1,Ю 146,6 | . -1

По-видимому, в период созревания МТри резервировался в семенах томата, а. при прорастании он участвовал в процессах, сбеспечиваюгцих рост проростка также, как и другие запасные соединения.

2. Динамику содержания МТри и Три изучали в колеоптилях и корнях проростков пшеницы и в проростках томата(рис.2,3,4).

Интенсивное накопление МТри в проростках пшеищи и томата по времени совпадало с периодом наиболее активного роста в длину их осевых частей. Освещение подавляло рост осевых органов проростков в длину и накопление МТри как у пшеницы, так и у томата. Вместе с тем, свет не влиял или незначительно влиял на накопление свободного Три в проростках. Полагают. что реакция колеоптиля на освещение сопряжена с уменьшением продумрот ауксина в апексе(Бойсен-Иенсен,1938). Исходя из полученных данных можно полагать, что накопление МТри в этиолированных проростках связано с ростом в длину их осевых частей, вероятно, вследствие участия этого соединения в регуляции биосинтеза ИУК. Образование МТри в проростках происходит только в короткий период гетеротрофного роста. В тургесцентных фотосинтезирувщнх молодых растениях пшеницы и томата (Яри не обнаруживали. Мнгибирущее действие света на содержание МТри в проростках выявлено у представителей разных классов растений, различающихся по типу прорастания семян и эмбриогенезу. Это свидетельствует о закономерном характере образования МТри и

важном значении этого процесса для регуляции роста проростков в гетеротрофный период.

Дни проращивания

Рис.2. Динамика роста(А), содержания МТри(В) и Три(В) в колеоптилях пшеницы Т.аез<л\тт Ь., Сорт "Скала", 1 - в темноте, 2 - на свету.

Дни проращивания

Рис.3. Динамика роста(А), содержания МТри(В) и Три(В) в корнях проростков пшеницы Т.аез1л\ллп Ь., сорт "Скала", 1 - в темноте, 2 - на свету.

Рис.4. Динамика роста(А), содержания МТри(Б) и Три(В) в проростках томата Lycopersicon esculentum Mill., сорт "Московский осенний", 1 - в темноте, 2 - на свету.

3. Распределение МТри, ИУК и Три по органам и зонам этиолированных проростков пшеницы и томата.

Из таблицы 5 следует, что у пшеницы на 3 и 5 сутки роста в темноте самое высокое содержание МТри было обнаружено в ко-леоптилях. В корнях также происходило накопление МТри, но в меньшем количестве, чем в колеоптилях. В зерновке МТри обнаружить не удалось. В настоящих листьях следовые количества МТри появлялись на 5 сутки. Ь-Три был обнаружен во всех частях проростка пшеницы в значительном количестве(табл.4).

Таблица 4

Распределение Ш"ри, ИУК и Три по проростку паеницы на 3 и 5 сутки проращивания в темноте,нмоль на 1 г

Части проростка)

МТри

3 сут

ИУК | Три

5 сут МТри 1 ИУК

-н

+■

Три

Колеоптиль 1247+22 |154+16|165+33| 99+10| 94+6

Переходная зона| 9+1 | 7+4 | 90+15i 5+0 | 11+2

Первый лист | 0+0 | 0+0 |309+70| следы| 1+0

Корни | 9+3 | 15+5 |283+68| 20+7 ) 17+7

417+24i 104+181 366+531 336+60|

В первые сутки роста колеоптиль является наиболее активно растущим органом проростков у злаков. Вероятно, в первые сутки он наиболее эффективно по отношению к другим органам продуцирует и использует ауксин. Для оценки вероятности участия МТри в биосинтезе МУК изучали распределение МТри и ИУК по колеопгилю этиолированного проростка пшеницы. Для анализа использовали апекс,известный как зона биосинтеза ИУК в колеоптиле, зону, обладающую максимальной чувствительностьв к экзогенному ауксину(5мм под апексом) и нижнюю зону, не реагирующую на экзогенный ауксин в биотестах. На рисунке 5 видно, что самое высокое содержание МТри на 3 сутки прорастания

1 2 3 3 сут

12 3 12 3 3 сут 5 сут

зоны колеоптиля

зоны колеоптиля

Рис.5. Распределение МТри(А) и ИУК(Б) по зонам этиолированного колеоптиля пшеницы ТгШсит ас^и уши I..

1 - апикальная часть колеоптиля(2мм),

2 - средняя часть(5мм),

3 - нижняя часть(около Омм на 3 сут,около 65мм на 5 сут роста в темноте).

обнаружено в апексе колеоптиля. На 5 сутки это соотношение изменилось. В более зрелом, закончившем рост колеоптиле, не было выявлено различий по содержанию МТри между частями про-

ростка(рис.5). ПУК также в основном была локализована в двух верхних зонах колеоптиля. В проростке томата максимальное количество И.У К и МТри было обнаружено в зоне подсемядольного колена, которая, как известно, также как и верхние зоны колеоптиля, активно продуцирует ауксин(рис.6). Ь-Три обнаружен во всех частях проростка в значительном количестве. Очевидно, что процесс образования МТри имеет общий характер у растений, представляющих разные семейства, морфологические отличия которых проявляются ещё в период эмбриогенеза. Получение данные свидетельствуют о том, что уникальной способностью к образованию и накоплению МТри обладают лишь активно продуцирующие ауксин ткани проростков. В отношении свободного Ь-Три такой закономерности не было выявлено.

2000 г Т

Л

2 3 4

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

части проростка

части проростка

части проростка

Рис.б. Распределение ИУК(Л), МТри(Б) и Три(В) по этиолированному проростку томата(7 сут) Lycopersicoti esculentum Hill. 1 - семядоли, 2 -подсемядольное колено, 3 - средняя часть, 4 - нижняя часть гипокотиля, 5 -корни.

4.Образование и превращения D-Три в проростках.

В настоящей работе прежде всего необходимо било оценить вероятность образования D-Три при прорастании семян пшеницы и томата. Для определения активности трипгофанрацемазы использовали 3,5 и 7 суточные проростки T.aestivum L. и 5-суточные проростки L.esculentum Mill, copra "Ранний 83", из которых получали фракцию,содержащуи этиопласты. При инкубации ферментных препаратов из проростков пшеницы и томата с L- или D-Три происходила рацемизация обоих энантиомеров(табл.5,6).

Таблица 5.

Динамика активности триптофанрацемазы во франции этиопластов растущих проростков пшеницы, внесено 5 мкмоль Б-Три или Ь-Три в инкубационную среду

сутки|

L—"D

D—>-L

3 5 7

-г

|нмоль в реак-|нмоль/мг| нмоль в реак-|нмоль/мг |ционной среде(белка [ ционной среде¡белка

|-

12630 ± 110 i 481 ± О | 257 t 80

Ч-h

1223 ± 9 | I 46 ± О 1 I 18 t 6 |

J_l_

398 ± 50 128 t О 155 t 23

I 34 i 4 I 12 ± О ! 11 ± 2

Таблица 6.

.Активность триптофанрацемазы во фракции зтиопластов этиолированная проростков томата на 5 сут роста в темноте, в инкубационную среду внесено 5 мкмоль Б-Три или Ь-Три

Определено Три, нмоль на мг белка --,-

L —v D j D —>- L

I

194,8 + 31,0 | 250,0 + 0,3

Активность триптофанрацемазы зависела от присутствия тшри-доксальфосфата в среде. Кроме того, не обнаружили активность триптофанрацемазы при использовании прокипячённого препарата. Это подтверждает предположение о том, что реакция имеет ферментативную природу. Во фракции этиопластов, полученных из проростков паеницы, происходила рацемизация L-Три и D-Три. На 3 сутки прорастания активность триптофанрацемазы в направлении образования D-Три была в 10 раз вше, чем в направлении образования L-Три. К 7 суткам активность образования D-Три в инкубационной смеси снижалась относительно активности образования L-Три и превышала последним в 3 раза. В инкубационной смеси, содержащей фракцию этиопластов из проростков томата (7 сут) также происходила рацемизация энантиомеров триптофана, но в этом случае не было обнаружено значительных различий между L-Три и D-Три по активности рацемизации. Важно отметить, что у пшеницы максимальная активность рацемизации триптофана в D-направлении совпадала по времени с периодом, предшествующим максимальной скорости роста проростка в длину и накопления МТри.

D-Три как предшественник ИУК в проростнах. Ранее L-стереонзомеру Три отводили исключительную роль в биосинтезе ИУК, поскольку имели мало сведений о метаболизме и физиологической роли D-Три. Последнее время появляются доказательства того, что биосинтез ИУК может происходить при участки D-Три в качестве предшественника. Было установлено, что в проростках пшеницы и томата образование ИУК может происходить как при участии L-Три, так и при участии D-Три в качестве предшественника. В проростках пшеницы и томата наряду с активностью L-триптофантрансамин аз ы(L-TAT), обнаружена активность О-триптофантрансаминазы(О-ТАТ), катализирующая деза-минирование D-Три до индолилпировиноградной кислоты(ИПВК) в биосинтезе ИУК(табл.7 А и Б). У пшеницы высокая активность D-TAT определена в иолеоптилях, переходной зоне и корнях (табл.7 А).

Таблица 7.

Удельная активность Ю-триптофантрансаминазы(О-ТАТ) и Ь-триптофантрансамииазы(Ь-ТАТ) из проростков Triticum aestivum L.(А) и Lycopersicon esculentum Mill, в биосинтезе КУК, пмоль на мг белка. Инкубационная смесь содержала кофакторы пиридоксальфосфат(ЮОмкМ), НАД+(100мкМ) На-пируват(ЮмМ) и L- или D-ТриСЮмМ).

А.

■ " ------------ 1 Инкубационная | + L-Три - - — - .....- - " 1 | + D-Три |

смесь содержала |

1 Колеоптили ; | 1123 + 30 | 510 £ 44 |

Корни | 1307 ± 5 i 603 + 59 |

переходная зона | ■ 18400 ± 320 | 13316 + 200 | i i

Б. + L-Три | + D-Три i................:.. —

234500 ± 1300 | 12300 t 1100

Но в пересчёте на 1 мг белка она была самой высокой в переходной зоне, на порядок выше, чем в нолеоптилях и на 2 порядна выше, чем в корнях. Переходная зона у проростков злаков представляет образование, включающее все элементы, характерные для узла, в том числе и меристематические ткани. Эта часть проростка, несомненно, обладает большим морфогенным потенциалом, и, по-видимому, активно продуцирует ауксин из пред-шествештков Ь- и Ю-Три, особенно в период, когда рост колеоптиля замедляется и начинает интенсивно расти первый настоящий лист.

Полученные данные свидетельствуют о том, что 0-Три образуется и используется в биосинтезе ИУК при прорастании семян. Вероятно, благодаря В-конфигурации и малонилированию, О-Три не включается в биосинтез белка, а резервируется и может быть использован в реакциях, связанных с биосинтезом ИУК. Возможно, роль образования Б-Три состоит исключительно в обес-

печении стабильного поступления предшественника для биосинтеза ИУК в короткий период прорастания.

С целью оценки потенциальной способности проростков пшеницы использовать D- или L-Три в качестве предшественников МТри, было проведено сопоставление эффективности образования МТри в присутствии энантиомеров триптофана в культуре изолированных зародышей.

Таблица 8

Содержание N-малонилтриптофана и триптофана в проростках, выращенных из изолированных зародышей пшеницы Triticum aestivum L., сорт "Скала" в культуре, 14 сут культивирования

i i Внесено в среду| Определено |

для кульгивиро-¡МТри,нмоль/ МТри,нмоль Три,нмоль/ Три нмоль| вания |1 проросток]на 1 г 11проросток1 на 1 г |

-¡-1-1-¡-1

+Ь-Три,50мкМ | 0,9+0,1 | 52,0+6,0 | 95,0+12.0! 2930+360| +0-Три,50мкМ | 13,7+3,0 ¡402,2+57,01 | - | Контроль | 0 ± 0,0 | О + 0,0 | 4,lt0,l | 134+ 8 | Интактные про- | 5,3+0,6 I 38,5+5,0 | 69,9+9,0 | 480+58 | ростки | J J | | _i_i_i_i_i

В результате удаления эндосперма зародыши были лишены основного источника предшественников для биосинтеза Три, поэтому проростки, выращенные на среде без внесения аминокислот, содержали незначительное количество Три и не содержали МТри (табл.8). В проростках, выращенных в присутствии как L-.так и D-Три обнаружили МТри, но в присутствии D-энантиомера его образование происходило в 10 раз эффективнее (табл.8). По-видимому, эндогенный D-Три, который появляется при прорастании, тоже активно образует комплекс с малоновой кислотой. Эти данные позволяют предположить, что у пшеницы образование и накопление эндогенного МТри при прорастании связано с образованием D-Три.

В связи с ранее обнаруженным эффектом МГри и D-Три в стимуляции роста культуры клеток(Рекославская,Гамбург,1984). интересно было сравнить эффективность использования D-Три и

Ь-Три в качестве предшественников ИУК в культуре изолированных зародышей пшеницы.

5. Влияние 0-Три, Ь-Три и ИУК на рост изолированных зародышей пшеницы в культуре.

Зародыши ТгШсда аезичшт [.. культивировали в присутствии ИУК и её возможных предшественников Ь-Три и В-Три с цель» изучения их биологического действия(табл.9).В присутствии ИУК и её предшественников обнаружен большой процент колеоптилей с аномальной формой и признаками нефизиологического распределения ростового вещества(табл.9).

Таблица 9. Влияние В-Три, Ь-Три и ИУК на рост колеоптиля у изолированных проростков пшеницы Т.аезичгит , сорт "Скала", 7 и 14 сутки культивирования

1" ■ "......... ■""1 ( Варианты Длина колеоптиля 1 см |

7 сутки 1 > | 14 сутки • | | 1

! Контроль 3,2 + 0,3 ! 1 1,6 £ 0.7 1

| +Ь-Три(50мкН) 2,8 + 0,3 1 1.4 1 0.4 |

| +0-Три(50мкМ) 3,3 £ 0,5 ! 1.9 £ 0.7 |

| +ИУК(0,5мкМ) > 1 2,2 ± 0,6 1 0.8 ■ £ 0.8 | |

Выязлено отчётливое стимулирующее действие обоих энаптио-меров Три на корнеобразование(рис.7), причём В-Три оказался более эффективным в стимуляции кориеобразования, чем Ь-Три. К 14 суткам культивирования удалось обнаружить стимулирующее дез1ствие В-Три на рост первого настоящего листа (рис.7). В присутствии ИУК и Ь-Три такой стимуляции не происходило, и даже было обнаружено их ингибирукяцее действие. В отличие от ИУК и Ь-Три, вносимый в культуру В-Три быстро подвергается инактивации и резервированию, превращаясь в МТри (табл.8), вследствие чего концентрация В-Три в зародышах поддерживалась на оптимальном уровне и его действие было более продолжительным, тан как проростки могли длительное время использовать 0-Три для

биосинтеза ЛУК и эффективнее, чем экзогенные МУК и Ц-Три, стимулировать корнеобразовакие и рост первого настоящего листа.

"г

[ . *

8

а

с

тН

2 а

о

- 4

о

г £

01-

а

|ЗН*

12 3 4 12 3 4 ? сут 14 сух

и «

& • с

т з

|Ъ

12 3 4

7 сут

12 3 4

14 сут

Культивирование

Культивирование

Рис.7. А - влияние 0,5 мкМ НУК(2), 50 мкМ Ь-Три(З) и 50 мкМ Ю-Три(4) на корнеобразование, В - влияние 0,5 мкМ ИУК(2), 25 мкМ Ь-Три(З) и 25 мкМ Б-Три(4) на рост первого настоящего листа у изолированных зародышей пшеницы Т.аезУуш Ь. в культуре. 1 - контроль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые рассмотрены процессы образования V-Три и МТри в связи с биосинтезом ИУК при прорастании семян. Установлено, что эндогенный МТри образуется в семенах и проростках представителей различных семейств двудольных и однодольных, вместе с тем почти в каждом семействе обнаружены растения способные и не способные к образованию МТри(табл. 1,2).

Накопление МТри в проростках пшеницы и томата по времени совпадает с периодом наиболее интенсивного удлинения их осевых частей(колеоптпя пшеницы и гипоиотиля томата) (рис. 2,

3,4). Свет ингибирует как рост осевых органов проростков, так и накопление в них МГри. Поскольку реакция этиолированных проростков на освещение сопряжена с уменьшением продукции ауксина в их осевых органах(Бойсен-Иенсен,1938), можно полагать, что накопление МГри в проростках пшеницы и томата связано с биосинтезом ЛУК.

Более полное представление о роли природного коньюгата Три в биосинтезе ПУК при прорастании было получено при изучении распределения МГри по зонам и органам проростков. У растений, представляющих разные семейства, морфологические отличия которых проявляются ещё в период эмбриогенеза, обнаружены общие закономерности в распределении НГри по проростку(табл.4,рис.5,6). По-видимому, это соединение принимает участие в биосинтезе КУК, поскольку установлено, что МГри в основном накапливается в тканях проростков, активно продуцирующих ауксин(апексе колеоп-тиля пшеницы и подсемядольном колене томата).

Получены данные, свидетельствующие о существовании систем биосинтеза и превращения D-Три в проростках. В этиолированных проростках пшеницы и томата обнаружена триптофанрацемаза, катализирующая превращение L-Три в D-Три, выделена активность О-триптофантрансаминазы(О-ТАТ), катализирующей дезаминнрование D-Три в биосинтезе ИУК(табл.5,6,7). По-видимому эндогенный D-Три не накапливается в проростках, поскольку быстро кетаболкзируется с образованием ИУК или МГри. В культуре изолированных зародышей экзогенный D-Трк быстро превращается в МГри(табл.8). Возможно, и эндогенный МТри в проростках является продуктом малонилиро-вания D-Три.

Вопрос о взаимосвязи процессов образования D-Три и МГри в проростках томата в настоящее время является дискуссионным, поскольку, наряду с данными, подтверждающими такую возможность, существуют работы, в которых L-энанигомер триптофана рассматривают в качестве единственного предкествешшка эндогенного МТри у томата и в качестве основного предшественника МТри у пшеницы. (Маркова,Гамбург,1995). Исходя из совокупности данных, полученных в настоящей работе, можно заключить, что образование эндогенного Ы-малонил-О-триптофана в проростках как пшеницы, так и томата является вполне вероятным и закономерным процессом. В пользу этого предположения свидетельствуют следующие данные:

1. В проростках томата, также, как и пшеницы, функционирует триптофанрацемаза, которая может быть активна как в направлен« образования L-Три, так и в направлении образования D-Три, что обосновывает предположение об образовании эндогенного D-Три

у пшеницы и томата. Во фракции этиопластов из проростков пшеницы активность образования D-Tpn на порядок превышает активность образования L-Три, причём активность трмлтофанрацемазы в D-направлении наиболее высока, в период, непосредственно предшествующий периоду максимальной скорости образования эндогенного МТри. Экзогенный D-Три в культуре изолированных зародышей пшеницы используется для биосинтеза МТри в 10 раз эффективнее, чем L-Три. Эти данные позволяют предположить, что образование эндогенного МГрн в проростках пшеницы происходит при активном участии D-Три в качестве предшественника.

2. В проростках как пшеницы, так и томата активно функционирует D-триптофантрансаминаза, для работы которой важным и закономерным условием является присутствие субстрата D-Три. Накопление свободного D-Три в проростках маловероятно,поскольк; очевидно, что в клетках растений он быстро подвергается мало-нилированию. Следовательно, единственным источником субстрата для D-TAT у пшеницы и томата может бить эндогенный N-малонил-D-триптофан.

При изучении биологического действия ПУК и её предшественников на рост изолированных зародышей пшеницы удалось выявить стимулирующий эффект D-Три на норнеобразование и рост в длину первого настоящего листа(рис.V). D-Три оказался более эффективным в стимуляции, чем L-Три и ИУК, вероятно, вследствие использования для биосинтеза ИУК не только D-Три, но и его деривата МТри, который, по нашим данным, активно образуется и накапливается в проростках при внесении в культуру экзогенного D-Три(табл.8). Влияние ИУК и её предшественников на рост зародышей в культуре, безусловно, нельзя полностью идентифицировать с их физиологической ролью, поскольку ясно, что распределение экзогенных веществ не воспроизводит их природное распределение. Тем не менее, полученные данные подтверждают предположение об участии D-Три в биосинтезе ИУК в проростках в качестве предшественника. Особый интерес вызывает стимулирующее действие D-Три на рост первого

настоящего листа, поскольку этот эффект обнаружен впервые. Экзогенные ИУК и L-Три такого действия не оказывают, и, даже, ингибируют рост листа, по-видимому, вследствие того, что они, в отличие от D-Три, не подвергаются быстрой инактивации и резервированию, а разрушаются с образованием токсичных продуктов. В, листе эндогенный МТри накапливается в очень небольших количествах, но достаточно большое его количество образуется в переходной зоне (табл.4), меристематические клетки которой участвуют в образовании листьев. В переходной зоне была обнаружена самая высокая активность D-TAT, катализирующей переаминирование D-Три в биосинтезе ИУК. По всей видимости эта часть проростка пшеницы продуцирует ауксин, также, как и верхняя зона колеоптиля. Хотя пики активности этих зон в продукции ауксина, по-видимому, не совпадают но времени, каждая из них в определённый период прорастания является функционально важным центром, обеспечивающим рост и морфогенез, благодаря активному биосинтезу ИУК.

Пути превращений L-Три, D-Три, которые связаны с биосинтезом ИУК при прорастании можно выразить следующей схемой:

ипвк

D-Три МТри

Возмояшо, благодаря активации систем, катализирующих эти реакции, регуляция биосинтеза ИУК в проростках осуществляется более эффективно. В активно растущих проростках, по-видишму, функционирует несколько различных систем биосинтеза ИУК, локализованных в различных зонах проростка и ком-партментах клетки, и действующих сопряжённо во времени и пространстве с ферментами, которые обеспечивают стабильное присутствие субстрата. Функциональное соотношение этих систем не остаётся постоянным, а быстро изменяется в процессе морфогенеза.

ВЫВОДЫ

1. В семенах многих растений при созревании образуется

МТри.

2. При прорастании семян образование Н-малонилтриптофа-на возобновляется.

3. Освещение резко замедляет рост проростков в длину

и накопление в них МТри, и незначительно влияет на содержание свободного Три.

4. МТри накашивается в зонах этиолированных проростков, активно продуцирующих ауксин ( апикальной части колеоп-гиля и подсемядольном колене томата). В то же время,не существует значительных различий между органами и зонами роста проростков по содержанию свободного Три.

5. В проростках пшеницы и томата обнаружена активность триптофанрацемазы, катализирующей превращение Ь-Три в О-Три и Б-Три в Ь-Три.

6. В проростках активно функционирует Б-триптофантранс-аминаза, катализирующая дезаминирование 0-Три в биосинтезе ИУК.

7. Потенциальная способность проростков пшеницы к использованию Б-Три в качестве предшественника МТри на порядок превышает таковую в отношении Ь-Три, который незначительно использовался для биосинтеза МТри в культуре изолированных зародышей пшеницы.

8. Экзогенный Й-Три эффективнее, чем ИУК и Ь-Три стимули-

рует корнеобразование и рост первого листа у изолированных зародышей в культуре.

Э. В проростках пшеницы и томата функционирует система биосинтеза ИУК из D-Три в которой триптофанрацемаза играет ключевую роль. Благодаря образованию эндогенного МТри, биосинтез ИУК может быть обеспечен стабильно поступающим субстратом. Изученные превращения тритофана существенно углубляют представление о гормональной регуляции гетеротрофного роста проростка.

Публикации по материалам диссертации

1. Глуздо О.В.(Юрьева),Рекославская Н.И. Содержание Н-малоннл-О-триптофана в семенах при их созревании и прорастании у растений томата и донника// Физиология развития и роста растений в условиях Сибири. Оперативные информационные материалы.-Иркутск.-1987.-с.27-29.

2. Глуздо О.В..Рекославская Н.И., Гамбург К.З. Соотношение роста и содержания Н-малонил-О-триптофана, L-триптофана и индолилуксусной кислоты в гипокотиле проростка томата// Физиология сеиян. Формирование, прорастание, прикладные аспекты. Труда Всесоюзной конференции.-Душанбе.-1988.-с.168-171.

3. Рекославская H.H..Глуздо О.В..Гамбург К.З. Содержание Н-малонил-О-триптофана, L-триптофана и индолилуксусной кислоты в семенах и проростках томата//Регуляторы роста и развития растений. Материалы II Всесоюзной конференции.- Киев. -1988. -с.283.

4. Рекославская Н.И..Глуздо О.В..Гамбург К.З. Содержание К-малонил-О-триптофана при прорастании и созревании семян томата//Физиология Растений.-1989.-т.36.N 4.-С.762-767.

5. Рекославская Н.И..Глуздо О.В..Гамбург К.З. К-мало-нмл-О-триптофан при созреванда и прорастании семян тома-та//Теоретическая и прикладная карпология.Тезисы докладов Всесоюзной конференции.-Кишинёв.-1989.-с.149.

6. Рекославская Н.И..Гамбург К.З..Маркова Т.А..Глуздо О.В. Изучение индукции синтеза D-триптофана в завядающих растениях// Теоретическая и прикладная карпология. Тезисы докладов Всесоюзной конференции,- Кишинёв.- 1989.- с.342.

7. Гамбург К.З..Глуздо 0.В..Рекославская Н.И. Изменение

содержания L-триптофана и Н-малонил-Б-триптофана при прорастании сеянцев пшеницы//Физиология Растений.- 1993,- Т.40, H 3 С.426-430.

8.. Rekoslavskaya N. I. .Ganiburg K.Z. .Markova T. A. .Glusdo О.V. The physiological role of W-ralonyl-D-tryptophan formation in pîants//Abstr. 4th Intern. Plant Growth Regulators.-Bulgaria.-1986.

9. Rekoslavskaya N. I..Gamburg K.2..Markova T.A..Glusdo O.V.// The formation and pbysiolological function of H-malo-ny1-D-tryptophan in piants/ZAhstr. 6th Congress of FESPP.-Split,Yugoslavia.- 1988.- P.750.

10. Gamburg K.Z..Glusdo O.V..Rekoslavskaya N.I. The content of N-malonyl-D-tryptophan in seeds and seedlings of plants// Plant Sci.-1991.-V.77.-P.149-153.

11. Glisdo O.V..Rekoslavskaya M.I,.Gamburg K.Z. N-malo-nyl-D-tryptophan content during seed germination/ZProc.XI Intern.symp. Embryology and seed reproduction.- Leningrad.-1992,- P.180-182.

12. Gamburg K.Z..Rekoslavakaya N. I.,Markova Т.Д. .Gluzdo O.V. Drought-induced formation of N-malonyl-D-tryptophan, a

precursor of IAA biosynthesis//Plant Physiol.Supplement.-1992. V.9.N 1.- P.64.

13. Gamburg K.Z.,Gluzdo O.V..Rekoslavskaya N.I. The content of N-malonyl-D-tryptophan in wheat seedlings// Plant Sci.- 1992 .- V.88.-P.121-124.

14. Yurjeva 0..Rekoslavskaya N..Salyaev R. The formation of N-malonyltryptophan and appearance of D-tryptophan during germination and its physiological role// Physical-chemical Basis of Plant Physiology. Annual symp.of RSPP.Penza.-1996,- P. 75.

15. Rekoslavskaya N.I..Yurjeva O.V..Salyaev R.K. Appearance of D-tryptophan and its conversion to IAA in plants// Plant Physiol, and Biochem.Special issue.10th FESPP Congress. -1996. -P.200.

16. Рекославская H.И..Юрьева 0.В..Шибанова Л.А..Саляев Р. Образование и физиологическая роль D-триптофана при прорастани у пшеницы// Физиология Растений.- 1997.- T.44.N 2.-С.262-267(в печати).