Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие дофамин-бета-монооксигеназы с липидами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие дофамин-бета-монооксигеназы с липидами"

РТБ О Л

ьч Яфвлър-зил,

иги Чгй.^и.оаопъР-впъ^ ъ-рь-щ'ьъ «чьвилил, ди1пиии,ги."ь

аЪгииснф ^ршфиОЕт! Пьво. 531.3/541.128/547.915/577.1?.

•чпапивил и.пгь'ъь п-ьчппч-ь т-пааи-ьъ-р-гпъпо-риь'ььъааь ФШ»и.ат-ъзпмэ-зпкьс

Х.МЪ'КЬЪГМЪЗ Ч-.00.02 -

ЦиСишрш(!ш1|шС сф1пп1итДИц1}1 рЪЦИшбпф ^[илш^шВ шиш|1Йш(![1 Ницд 11шВ штЬйш^пширцлй

иьпдгичФР

ЬРЬ'Ш1. -1996

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 531.3/541.128/547.915/577.17. ПОГОСЯН АРМИНЭ ГЕВОРКОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДОФАМИН-р-МОНООКСИГЕНАЗЫ С ЛИПИДАМИ

Т-. 00.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван 1996

U,2|uuuniuGgp ^lumuipi^bit: ¿,iu¡iuuuiiuG}i ¿.luGpun^hinnipiuiG (l-fiuinip¡m_í¡Ghpfi l),qqui U.l|iurjhiJfiiu¡}i U>qül)m]iui}iG l|hGuiupuiGrupiuiG l'Guui)iinniinniiT

4-Jiuivul|iuG цЫрифирйЬр' IjbGuuipiuGiu^uiG qfimnipiruGGbpJi ph^Gui

U..U.Pn¡uí¡>¡

¿,¿. Я-UU, uiljiunbtffiljnu, l|t¡GuuipuiGuil) q|iimup¡m.GGhp|i t).nl)Uinp, iqpn^bi 4 A.1.mpmq¡nqi

Hu^uinGuiliiuG pGr^rjJiiIuilunuGhp' IjbGuiupmGiul^uiG qJiuinipiruGGhpti t)nl)u

црпфЪипр t-U.4-Unpq] ljhGuuipiuGiul|uiG qJiimup¡m.GGUp}i phl|Gui

q..u..q.unpq]

Ц,п.ш2шшшр IjiuqiIuiljtipiqnipini.G* bplnuGJi ¿¡jjiqfiljuiiti ЬСшгфтпшф mu^firngfinG ljhGuiu;}>|iq|il|Uii|i U IjhGuuiuhGunpGhpfi )шрпршшпр}1ш

f)iU2U|uiGmpimG|i ^luiuiGiuinL t "M " /О 1996 р., d ¡4 bpUuiGJi и)Ьшш1| fiunliuiuuipiuGJiG Ijfig 051 U'uiuGujq|iuiiuljuiG tunpfipr>}i Gfiuinrml (375049, bpliuiG, U, LTuíttniljjmGJi ijinri. 1, b^R, ^шОишршйш^шВ $uil|niiuihui): U,mt¡Gml\inumpimGp l|iupbi(i t öuiGnpiuGiui fiuiiIiuiuuipuiGfi qpiur>iupiuGmiJ

Uhriiluiqjipn шпшЕ4Ш5 t "¿'5 " С л 1996p.

ITiuuGuiqtiinuiljUiG |ипрпргф qJiuml|uiG piupuiniquip, -

IjhGuuipuiGiu^iuG q]unnipitiiGGhp|i phljGuiöm Clfoui* U.U..1nDjuiG

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии Национальной академии наук Республики Армения

Научные руководители: кандидат биологических н<

A.C. Боядя доктор биологических н: академик HAH РА, профеа К. Г. Караге:

Официальные оппоненты: доктор биологических на)

профессор Э.С. Гевор! кандидат биологических на Г.А. Гевор!

Ведущая организация: Лаборатория радиационной биофизики и б сенсоров Ереванского физического института.

Защита состоится "Ш " РГТ 1996 г. в Н часов на заседа! Специализированного Совета . 051 при Ереванском государствен! универсетете (375049, Ереван, ул.Алека Манукяна, 1, Ереване! госуниверситет, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке универсетета. Автореферат разослан " чУ " 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, /" ^___

кандидат биологических наук (ЗЛр-"€-< С.А.Гонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли липидов, в частности фосфолипидов (ФЛ), в функционировании биологических мембран путем воздействия на мембраносвяэанные ферменты. Возможность осуществления подобных функций обусловлена тем, что липидное микроокружение является активным фактором, определяющим структурные, каталитические, динамические и, соответственно, функциональные особенности мембранных белков, как интегральных, так и периферических. Оно достаточно мобильно и динамично, чувствительно к изменениям окружающей среды, что, в определенной степени, достигается благодаря процессам флип-флоп, латеральной диффузии и возможностям метаболических взаимопревращений компонентов липидного микроокружения белка, переходом одних форм липидов в другие и, соответственно, изменением конформации этого микроокружения. Модификация структурных и динамических свойств липидов способствует модификации структурных, динамических и каталитических свойств находящихся в их окружении белков (Бурлакова, 1977, Newton, 1993).

Объектом наших исследований является медьсодержащий фермент дофамин-р-монооксигеназа (ДБМ; КФ 1.14.17.1), локализованный в хромаф-финных гранулах (ХГ) и катализирующий один из ключевых этапов биосинтеза норадреналина. В гранулах существует две формы фермента -мембранная и растворимая. Мембранная форма фермента является одним из периферических белков мембраны ХГ. В экспериментах in vitro показано, что в гидрофильной среде, электрофоретически гомогенные препараты обеих форм практически идентичны по структуре, каталитической активности и иммунологическим характеристикам. Однако, две из четырех субъединиц мембранной дофамин-р-монооксигеназы (мДБМ) содержат дополнительный гидрофобный пептид, отсутствующий у растворимой ДБМ (рДБМ), что обуславливает определенные различия их свойств в амфифильном окружении (Scotland, Ljoines, 1979, Stewart, Klinman, 1988).

Несмотря на то, что исследованиями ДБМ занимаются уже много лет, на сегодняшний день все еще имеются неразрешенные вопросы

г

касающиеся отмеченного фермента. Так не ясен функциональный смысл локализации фермента в обеих (мембранной и растворимой) фракциях ХГ. Кроме того не ясно, что составляет основу мембранного якоря мембранной формы фермента. Совершенно не изучена функциональная роль липидного окружения мембранной формы фермента и возможное влияние мембранных липидов на его структуру и каталитические свойства.

Цель и залачи исследования. Основная цель настоящего исследования состояла в изучении молекулярных механизмов взаимодействия мДБМ с липидами. • В рамках отмеченной задачи планировалось изучить воздействие различных индивидуальных липидов, в частности, ФЛ на каталитическую активность фермента, а также исследовать процесс ассоциации фермента с ФЛ и влияние на этот процесс ряда факторов окружающей среды. В процессе всех экспериментов, параллельно с мДБМ, исследовалось также взаимодействие с липидами рДБМ. Сравнительный анализ полученных результатов в значительной степени облегчил интерпретацию экспериментальных данных и способствовал выявлению специфических для мДБМ особенностей во взаимодействии с ФЛ.

Научная новизна результатов, полученных в работе. Выявлено специфическое модулирующее воздействие ряда индивидуальных ФЛ на реакции, катализируемые ДБМ: фосфатидилхолин (ФХ) и лизофосфа-тидилхолин (лФХ) повышают, а фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидил-серин (ФС) и фосфатидная кислота (ФК) понижают эффективность катализируемой ферментом реакции. Показано, что воздействие ФЛ на каталитическую активность мДБМ обусловлено модуляцией кинетических параметров, катализируемой ферментом реакции. На основании полученных данных, с учетом того, что некоторые из отмеченных ФЛ-модуля-тров входят в состав непосредственного липидного микроокружения мДБМ, выдвинуто предположение о возможной регулятораой роли ФЛ т vivo в отношении отмеченных реакций и, соответственно биосинтез норадре-налина.

Установлено, что мДБМ образует обратимый комплекс с везикулами, сформированными как из индивидуальных цвиттерионных ФЛ-активаторов

фермента, так и из суммарной фракции ФА мембран ХГ. Процесс ассоциации фермента с фосфолипидными везикулами (ФЛВ), специфичен и зависит как от его третичной, так и от четвертичной структуры.

Показано, что. в стабилизации комплекса фермент - ФЛВ принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия. Сравнительный анализ эффективности комплексообразования мДБМ и рДБМ с ФЛВ позволяет сделать вывод об участии гидрофобного пептида мДБМ в стабилизации комплекса фермент-ФЛ на мембране гранул.

Научно-практическое значение работы. Данные о молекулярных механизмах воздействия липидов на каталитические свойства ДБМ, а также комплексообразования фермента с ФЛВ могут быть использованы в исследованиях по изучению общих принципов, лежащих в основе липид-белковых взаимодействий.

Впервые представлены данные, свидетельствующие о возможной роли фосфолипидного микроокружения на реакции гидроксилирования дофамина. Эти данные открывают возможности целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на процесс биосинтеза гормонов и нейромедиаторов катехоламиновой природы.

По ходу проведения настоящего исследования найдены новые методические подходы к постановке экспериментов в модельных системах белок-ФЛВ, которые могут быть применены в области экспериментальной биологии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Всемирном Конгрессе по Теоретической Органической Химии (Торонто, 1991), на VIII Международном Симпозиуме по Биологии Хромаффинных Клеток (Эдинбург,- 1995) и на двух республиканских конференциях. Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Института Молекулярной Биологии HAH РА (1996).

Публикации По теме диссертации опубликованы 6 научных статей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, общих выводов и библиографического указателя. Первая глава посвящена обзору литературы по теме диссертации, в первой

части которого представлены современные представления о взаимодействии периферических ферментов с липидами. Во второй части обзора рассмотрены основные данные о структурных, каталитических и функциональных характеристиках ДБМ. Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования, использованных в работе. В третьей главе представлены результаты собственных исследований и их обсуждение.

Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, содержит 13 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 105 названий источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Спектрофотометрические и флуориметрические измерения проводили на спектрофотометрах "СФ-46", "Specord М-40" фирмы "Zeiss" (Германия), и спектрофлуориметрах "MPF-44A" фирмы "Perkin-Elmer" (Швеция) и "Applied Photophisics SP-3" (США), снабженном поляризационной приставкой, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,5 и 1,0 см. В ходе экспериментов была использована ультрацентрифуга "Spinco L-2" фирмы "Beckman" (США). Ультразвуковую обработку проводили на приборе "УЗДН-2Т".

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью специальной компьютерной программы "En2fitter"; статистическую обработку проводили по t-кротерию Стьюдента с помощью компьютерной программы " t-EASE".

ХГ выделяли из мозгового слоя свежих надпочечников крупного рогатого скота модификацией метода Hoffman и др. (1976).

Мембранную фракцию ХГ получали следующим образом: суспензию ХГ в 1,5 мМ К,Na-фосфатном буфере, рН 6,0-6,5, содержащем каталазу (2000 ед/мл), подвергали лизису. Лизис проводили трехкратным замораживанием (в жидком азоте) и последующим размораживанием. Лизат центрифугировали при 15000 д, 60 минут. Надосадочный раствор, представляющий собой водорастворимую фракцию ХГ, далее сразу же использовали

как источник для получения рДБМ. Осадок, представляющий собой мембраны ХГ, использовали как источник для получения либо мДБМ и кислого медьсодержащего белка (КМБ), либо суммарного экстракта ФА.

Получение элвктрофоретически гомогенных препаратов мДБМ, рДБМ и КМБ основано на' ранее описанных методах (Foldes и др., 1972, Ljones и др., 1976, Григроян, 1983, Бояджян, 1985). Удельная активность полученных препаратов ДБМ составляла 17-25 мкмолей х мин 'х мг

Препараты КМБ восстанавливали десятикратным молярным избытком аскорбата, окисляли десятикратным молярным избытком феррицианида, инкубацией в течении 10 мин. Апобелок ДБМ получали диализом против ЭДТА (Skotland, Ljones, 1979). Все процедуры проводили при 23°С.

Концентрацию ДБМ определяли спектрофотометрически, исходя из значения коэффициента поглощения фермента при 280 нм (А280(1%) 12.4) (Scotland, Ljoines, 1979 ). Расчет молярных концентраций ДБМ и КМБ проводили с учетом их молекулярных масс, 280 и ЮкДа, соответственно.

Общее содержание белка определяли по методу Lowry (1951), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Содержание меди в препаратах белков и липосом определяли двумя методами: методом Matsuba и Takahashi (1970), позволяющим определять концентрацию как одно-, так и двухвалентной меди и методом Poilon и Dawson (1963), позволяющим определять концентрацию одновалентной меди.

Концентрации липидов определяли исходя из веса сухого вещества. Расчет молярных концентраций индивидуальных природных ФЛ проводили, принимая за среднюю молекулярную массу 0,7 кДа.

Определение удельной активности ДБМ и регистрацию кинетик образования продуктов реакции гидроксилирования проводили методом Kuzuya и Nagatsu (1969) при 37°С, используя в качестве субстрата тирамшг ("Sigma", США). Метод основан на спектрофотометрической регистрации интенсивности оптического поглощения оксибензальдегида (>. = 330нм), образующегося при химической модификации продукта реакции - окси-

тирамина.. В качестве стандарта использовали раствор окситирамина ("Sigma", США).

Кинетику окисления аскорбата ("Fluka", Швеция) в процессе реакций гидроксилирования тирамина или дофамина, катализируемых ДБМ, регистрировали при 23 С по методу Skotland и Ljones (1979), по уменьшению характерного для аскорбата поглощения при 300 нм (£300 = 420 М 'см ').

При регистрации кинетик в присутствии липидов ДБМ предварительно инкубировали с препаратами липосом или мицелл 10 мин при 23°С.

Экстракцию суммарных ФЛ из мембран ХГ проводили по методу Bligh и Dyer (1959).

Липосомы и мицеллы из индивидуальных ФЛ и суммарной фракции ФЛ мембран ХГ получали двумя следующими методами. 1. Суспензию ли-пида в 20 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0 (20 мг липида в 1мл буфера) подвергали ультразвуковой обработке в течении 20 мин при частоте 22 кГц и 10°С, в трубчатом концентраторе под током азота. В этих условиях моно-и дифосфатидилинозиды, а также лизо формы липидов образуют мицеллы, в то время как остальные липиды - биламеллярные липосомы со стоксовым радиусом от 80 до 115 А° (Марголис и Бергельсон, 1986). 2. Раствор липида в хлороформе высушивали под током азота в круглодонной колбе до получения тонкой пленки, после чего суспендировали в 20 мМ К-фосфатном буфере встряхиванием 20 мин при 25°С- Высокомолекулярные агрегаты отделяли центрифугированием 30 мин при 15000 д. В этих условиях большинство липидов образует большие мультиламеллярные липосомы .

Получение меченных флуоресцеин изотиоционатом Целит (ФИТЦ; "Sigma", США) препаратов ДБМ проводили в 20 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,5, по ранее описанной процедуре (Тогара и др., 1986). Концентрация включившейся метки, рассчитанная исходя из значения коэффициента молярной экстинкции характерной для ФИТЦ полосы при 490 нм (Е490 =

66000 М"'см ' ), составляла 0,35 ± 0,05 молей на тетрамер ДБМ. Титрование меченной ФИТЦ ДБМ ФЛВ проводили при постоянной концентрации

фермента, добавляя различные концентрации везикул до достижения их существенного избытка. При каждой данной концентрации липида по достижению равновесия измеряли относительную интенсивность флуоресценции (ОИФ) и интенсивности флуоресценции (ИФ) вертикально и горизонтально поляризованных компонент излучения при горизонтально и вертикально поляризованном возбуждении. На основании последних . рассчитывали анизотропию флуоресценции (АФ). Все вышеотмеченные измерения проводили при длинах волн возбуждения и испускания 470нм и 520 нм, соответственно. Собственную ОИФ немеченной ДБМ измеряли при длинах волн возбуждения и испускания 280нм и ЗЗОнм, соответственно. АФ рассчитывали как описано ранее (Лакович, 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возлействие фосфолипилов на каталитическую активность мДБМ. Нами было изучено воздействие ряда фосфолипидных аналогов мембран ХГ (используемых в виде моноламеллярных липосом и мицелл) - лФХ, ФХ, ФЭ, лФЭ, ФК, ФС, моно- и дифосфатидилинозитидов, а также сфингомиелина на реакции, катализируемые мДБМ. Эксперименты проводили при использовании трех доноров электронов фермента - кислого медьсодержащего белка (КМБ), аскорбата и ферроцианида и двух субстратов - дофамина и тирамина.

Согласно полученным результатам, лФХ и ФХ активировали, а ФС, ФК и ФЭ ингибировали реакции катализируемые мДБМ. Остальные липиды не оказывали существенного воздействия на отмеченные реакции. На рис.1 показаны кинетики образования окситирамина в процессе реакции гидроксилирования тирамина под действием мДБМ, при использовании в качестве донора электронов КМБ, в присутствии лФХ, ФХ, ФС, ФК, ФЭ и без липида. Как следует из представленных данных, лФХ и ФХ повышают, а ФС, ФК и ФЭ понижают эффективность катализируемой ферментом реакции. Аналогичные результаты были получены при регистрации кинетик образования окситирамина при использовании ди\\ч других доноров электронов - лскорбата и ферроцианида и кинетик окисления аскорбата в процессе гидроксилирования двух субстратов мДБМ

- тирамина и дофамина, а также в случае всех трех доноров электронов мДБМ, при регистрации кинетик поглощения 02 в процессе гидрокси-лирования двух субстратов мДБМ - тирмина и дофамина.

Рис. 1. Образование окситирамина при гидроксилировании тирамина в присутствии лФХ (1), ФХ (2), без липида (3), ФС (4), ФЭ (5) и ФК (6). I- (± ст), п = 15.

Таким образом, рядом независимых методов регистрации кинетик реакций, при использовании двух субстратов и трех доноров электронов ДБМ показано, что некоторые из ФА, входящие in vivo в состав мембран ХГ, способны модулировать реакции, катализируемые мДБМ.

В таблице 1 представлены кинетические параметры реакции гидроксилирования тирамина под действием мДБМ при использовании в качестве доноров электронов КМБ, определенные с использованием преобразований Лайнуивера-Берка при регистрации начальной скорости поглощения кислорода от концентрации субстрата и донора электронов.

Таблица. 1

липид Км КМБ, мМ (М ± м; п = 2) 02| мМ/мин (М± м; п=2) Км тирамина, мМ (М ± м; п = 2)

4.09 ± 0,43 5.09 ± 0,54 1,28 ± 0,13

лФХ 1.57 ± 0,17 5.05 ± 0,51 0.49 ± 0,06

ФХ 2.40 ± 0,25 5.10 ± 0,54 0.75 ± 0,08

ФС 4.10 ± 0,40 3.60 ± 0,36 1.28 ± 0,15

ФК 4.10 ± 0,42 2.80 ±0,13 1.30 ±0,10

ФЭ 2.70 ± 0,30 3.09 ± 0,54 0.86 ± 0,20

Кинетические параметры реакции гиАРоксилирования тирамина под действием мДБМ в присутствии лФХ, ФХ, ФС, ФК, ФЭ и без липида.

Как свидетельствуют-полученные данные, в присутствии ФХ и лФХ возрастало сродство мДБМ к субстрату и к донору электронов (приблизительно в 1,7 раз и 2,6 раз соответственно), максимальная скорость (Утах) катализируемой ферментом реакции при этом не изменялась.

В присутствии ФК и ФС наблюдалось понижение Ут.,х, катализируемой мДБМ реакции (приблизительно в 1,8 раз и 1,4 раза соответственно). Отметим, что сродство мДБМ к субстрату или к донору электронов в присутствии отмеченных кислых ФЛ не менялось.

Довольно интересные, на наш взгляд, данные были получены в случае ФЭ, обладающего, как было ранее отмечено, ингибирующим воздействием на фермент. В присутствии этого ФЛ сродство мДБМ к субстрату и к донору электронов повышалось, однако, \гтвх катализируемой ферментом реакции при этом понижалась. Аналогичный эффект - понижение Угаах реакции одновременно с возрастанием сродства фермента к субстрату, наблюдался для других ферментов (Агаджанян., 1986). Как предполагают, подобное явление связано с тем, что под действием ингибитора фермент

1 о

приобретает такую конформацию, при которой его связывание с субстратом (или образующимся из последнего продуктом) носит частично необратимый характер.

Нам удалось в определенной степени прояснить механизм понижения Vmax катализируемых ферментом реакций под действием кислых ФЛ (ФС и ФК). При гель-фильтрации на колонке с сефарозой 6В смеси, содержащей мДБМ и липосомы, сформированные из ФК или ФС, медь, входящая в состав активного центра этого белка, обнаруживалась во фракции липосом. С другой стороны, при наличии в инкубационной смеси экзогенной меди, ингибирующего воздействия ФК и ФС не обнаруживалось. По всей видимости, медь связывается с отрицательно заряженными головками отмеченных кислых ФЛ. На первый взгляд, можно заключить, что воздействие кислых ФЛ на мДБМ, сходное с воздействием многих хелаторов меди (Skotland и Ljones, 1979), не является специфичным и, с физиологической точки зрения, достойным обсуждения. Однако, следует обратить внимание, что, как показали эксперименты Saxena и Fleming (1981), часть молекул мДБМ в своем исходном липидном микроокружении представлена в виде апобелка, причем, медь при этом находится в комплексе с отрицательно заряженными головками ФС - основного липида в микроокружении фермента in vivo . Таким образом, не исключено, что результаты, полученные нами при исследовании воздействия кислых ФЛ на мДБМ in vitro отражают процесс, имеющий место in vivo.

При изучении степени активации или ингибирования мДБМ от концентрации соответствующих ФЛ- модуляторов было установлено, что в обоих случаях, максимальные эффекты наблюдаются, когда молярная концентрация липида в смеси приблизительно на три порядка превосходит соответствующую концентрацию фермента. Отмеченные рассчеты проводили при учете общей концентрации липида в инкубационной смеси, однако, не следует забывать, что используемые нами липиды находились не в виде отдельных индивидуальных молекул, а в виде липидных везикул. С учетом размеров везикул и допустимых расстояний между полярными головками входящих в их состав ФЛ (150 А° и 30 А° соответственно) (Левчук

и Воловик, 1983; Марголис и Бергельсон, 1986), мы рассчитали, что в среднем, в случае моноламеллярных липосом, формируемых ФХ, ФЭ, ФК и ФС, максимальные эффекты активации или ингибирования наблюдаются при соотношении между ФЛВ и мДБМ 10:1; очевидно, что в случае мицеллярных везикул, формируемых лФХ, это соотношение приблизительно в 2 раза выше. Представленные рассчеты, безусловно, весьма приблизительны и справедливы лишь в пределах порядка.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что модулирующее воздействие индивидуальных ФЛ на реакции, катализируемые мДБМ, отражается на кинетические параметры реакции. Различие в молекулярных механизмах влияния нейтральных ФЛ на фермент является еще одним хорошим доказательством специфичности взаимодействия мДБМ- нейтральный ФЛ. Отмеченные различия могут быть объяснены различием в конформации нейтральных ФЛВ, образуемых ФХ и лФХ, с одной стороны и ФЭ, р другой: области полярных головок этих цвитерион-ных липидов в структурном отношении отличаются весьма сильно.

Как было отмечено ранее, параллельно с изучением воздействия фЛ на мДБМ исследовалось также их воздействие на реакции, катализируемые рДБМ. Поскольку наблюдаемые эффекты ФЛ и степень активации или ингибирования ими рДБМ соответствовали обнаруженным в случае мДБМ, был сделан вывод, что во взаимодействие мДБМ с ФЛ, приводящее к модуляции ее каталитических свойств, не вовлечен входящий в состав молекулы этой формы фермента гидрофобный пептид.

Изучение процессов комплексообразоваяия межлу мДБМ и фосфо-липидами. Следующий этап изучения молекулярных механизмов взаимодействия мДБМ с ФЛ состоял в исследовании процессов комплексо-образования фермента с ФЛВ, сформированными из нейтральных ФЛ -активаторов фермента (ФХ и лФХ; мультиламеллярные липосомы и мицеллы соответственно), а также из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ (мультиламеллярные липосомы). Исследования были проведены при использовании техники флуоресцентной спектроскопии, и высокоскоростного центрифугирования.

Ассоциация мДБМ с нейтральными фосфолипидными везикулами На рис.2 показаны зависимости АФ меченных ФИТЦ мДБМ и рДБМ от концентрации лФХ. По мере повышения концентрации лФХ АФ возрастает, что является свидетельством образования комплекса между ферментом и ФЛВ (Лакович, 1986). Поскольку ОИФ меченной ФИТЦ ДБМ не изменялась, мы исключили возможность воздействия ФИТЦ на процесс комплексообразования.

Экспериментальные точки, полученные при регистрации АФ меченных ФИТЦ м- и рДБМ в зависимости от концентрации лФХ и ФХ, описывались теоретическими кривыми титрования со стехиометрией связывания 1:1 (везикула.фермент) (Тотра и др. 1986)

Рис.2. Равновесное титрование меченных ФИТЦ м- и рДБМ (Зх10"7М) везикулами лФХ. Измерения проводили в К-фосфатном буфере, рН 5,7. су <5%; п = 3.

Значения М, рассчитанные на основании соответствующих кривых составляли: для рДБМ - 3,9 (±0,3) цМ и 4,3 (±0,4) |лМ в случае лФХ и ФХ соответственно; для мДБМ - 0,58 (±0,4) цМ и 0,60 (±0,5) цМ в случае лФХ и ФХ соответственно; (М±м; п = 2). Таким образом, сродство мДБМ к нейтральным ФЛВ приблизительно на порядок выше, чем сродство рДБМ.

В соответствии с этим заключением находятся результаты (рис.3), демонстрирующие возможность вытеснения рДБМ из комплекса с везикулами ФХ добавлением мДБМ (аналогичные данные получены и в

13 .

случае лФХ). В отмеченных экспериментах меченную ФИТЦ рДБМ

титровали соответствующими ФЛВ и при насыщающих концентрациях липида добавляли немеченную мДБМ. При этом с увеличением концентрации мДБМ наблюдалось понижение АФ. Вытеснить мДБМ из комплекса с рДБМ оказалось невозможным.

С возрастанием. в смеси концентрации ФЛ, в процессе титрования ими немеченной мДБМ, наблюдается возрастание собственной ИФ фермента сопровождаемое небольшим коротковолновым сдвигом максимума спектра флуоресценции, в то время как в случае рДБМ эти параметры не меняются.' Эти результаты могут быть объяснены либо непосредственным взаимодействием флуорофора мДБМ с гидрофобной частью ФЛВ, либо конформационными изменениями в структуре фермента, приводящими к уменьшению доступности флуорофора к воде.

Рис. 3. Вытеснение меченной ФИТЦ рДБМ (Зх10"7М) из комплекса с везиулами- ФХ добавлением немеченной мДБМ. Измерения проводили в К-фосфатном буфере, рН 5,7; су <2%, п = 3

Поскольку в случае мДБМ и рДБМ разбавление комплекса фермент-ФЛВ приводило к понижению АФ не сопровождающемуся какими либо изменениями в специфической ИФ (отношение ОИФ к концентрации белка), был сделан вывод, что ассоциация обеих форм фермента с ФЛВ

имеет обратимый характер. В случае апобелков, д\я обеих форм ДБМ, процесс комплексообразования между ферментом и ФЛВ не наблюдался.

На рис.4 (А, Б, В) показано влияние рН (в пределах от .5,0 до 7,2) на АФ меченной ФИТЦ мДБМ как в присутствии (Б), так и в отсутствии [А) везикул лФХ, а также разностная кривая (В), характерезующая зависимость эффективности комплексообразования от значений рН. Наиболее эффективно процесс комплексообразования происходит при рН 5,0-6,0, достигая максимума при рН 5,7; дальнейшее повышение рН приводит к понижению- эффективности комплексообразования до минимальной - при рН 7,2. Сравнение Кс1 комплексов мДБМ-ФЛВ при различных рН подтверждает данные, представленные на рис.4 (таблица 2).

10-1 2.40

А<Р 2.20

2.00 ■ А ^

1.80

1.60 н\

1.40 ,п

1.20- Б • В

1.00 • 0.80 0.60 В___ о —В

" О АО •

0.20

0.00 4

4 &С 5.20 5.60 6.00 6.40 Р» 6.80 7.20

Рис.4. Зависмость АФ меченной ФИТЦ мДБМ (Зх10"7М) от рН в присутствии (А) и в отсутствии (Б) везикул лФХ (10"5М) и разностная кривая (В), полученная при вычитании экспериментальных точек' кривой Б из соответствующих точек кривой А при каждом данном значении рН. Измерения проводили в К-фосфатном буфере с соответствующим значением рН;- су ¿5%, п = 2.

Таблица 2.

Кс), цМ, (М±м;п = 2)

ФОСФОЛИПИД рН 5,7 - рН 7,2

лФХ 0,58 ± 0,04 20,3 ± 1,7

ФХ 0,60 ± 0,05 22,8 ± 2,0

Константы диссоциации (Кс1) комплексов мДБМ-ФЛВ при рН 5,7 и 7,2.

На рис.5 показано влияние ионной силы (концентрация МаС1) на процесс комплексообразования между мДБМ и везикулами лФХ. Как следует из представленных данных, с возрастанием ионной силы наблюдается понижение АФ меченной ФИТЦ мДБМ в условиях насыщения липидом. Таким образом, повышение ионной силы приводит к дестабилизации комплекса фермент-ФЛВ.

Рис.5. Зависмость АФ меченной ФИТЦ мДБМ (ЗхЮ"7 М) в присутствии везикул лФХ (10"5М) от концентрации ЫаС1. Измерения проводили в К-фосфатном буфере, рН 5,7; су 22%, п = 3.

Ассоциация мДБМ с везикулами, сформированными из суммарной фракции фосфолипилов мембран ХГ. В этих экспериментах фермент инкубировали с ФЛВ при комнатной температуре, 60 мин, затем центрифугировали 60 мин при ЮООООд и определяли содержание белка в осадке, исходя из разницы между исходной концентрацией белка в инкубационной смеси и концентрацией его в надосадочной жидкости.

Как следует из результатов эксперимента, представленного на рис.6, по мере повышения концентрации ФЛ в инкубационной смеси доля мДБМ в осадке .возрастает. При насыщающей концентрации ФЛ везикулы адсорбируют .около 40% от общего содержания белка. Эффективность комплексообразования рДБМ с отмеченными везикулами приблизительно в 4 раза ниже, чем в случае мДБМ: при насыщающей концентрации ФЛ везикулы адсорбировали всего 10% рДБМ.

Рис.6 Зависимость ассоциации мДБМ с везикулами, сформированными из суммарной фракции фосфолипидов мембран ХГ, от концентрации ' фосфолшшда. Измерения проводили в К-фосфатном буфере, рН 5,7; су <20%, п = 3.

Как и в случае нейтральных ФЛВ, процесс комплексообразования мДБМ с везикулами из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ зависит от рН и ионной силы среды. Как следует из данных, представленных на рис.7, наиболее эффективно ассоциация фермента с ФЛВ наблюдается в узком интервале кислых рН 5,0-6,0, с максимумом адсорбции при рН 5,5. При рН 7,0 ассоциация фермента с ФЛВ практически не наблюдается. С повышением ионной силы эффективность комплексообразования между мДБМ и ФЛВ понижается. При ионной силе, соответствующей 100 мМ ЫаС1, ассоциация фермента с ФЛВ практически не наблюдается.

?ис.7 Зависимость ассоциации мДБМ с везикулами, сформированными 13 суммарной фракции фосфолипидов мембран ХГ, от рН. Измерения зроводили в К-'фосфатном буфере с соответствующим значением рН; су «20%, п=3.

Таким образом, результаты экспериментов по изучению процессов комплексообразования между мДБМ и ФЛ свидетельствуют о способности фермента к образованию обратимых комплексов с везикулами, сформированными' из индивидуальных нейтральных ФЛ-активаторов фермента, а также с везикулами, сформированными из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ.

Известно, что мультиэлектростатические взаимодействия играют немаловажную роль в процессах ассоциации мембранных белков, особенно периферических, с липидными везикулами и биологическими мембранами. Наблюдаемое нами понижение эффективности комплексообразования мДБМ с вышеотмеченными ФЛВ при повышении ионной силы в среде также свидетельствуют, что в процесс ассоциации фермента с ФЛВ вовлечены взаимодействия ионного типа.

С другой стороны, изучение воздействия рН на процесс комплексообразования между мДБМ и ФЛВ позволило нам установить, что помимо заряда, другие факторы также играют определенную роль в формировании комплекса между ФЛ и ферментом, так как в противном

1 8

случае наблюдалась бы монотонная зависимость эффективности комплексо-образования от значений рН.

Известно, что тетрамерная молекула ДБМ способна к обратимой диссоциации на димеры, и этот процесс зависит от рН среды. При этом, в интервале рН 5,0-5,7 основной формой, присутствующей в популяции фермента, является тетрамер, дальнейшее повышение рН приводит к уменьшению соотношения тетрамер гдимер (Saxena и др., 1983). Аналогичная зависимость степени ассоциации-диссоциации субъединиц мДБМ от рН среды наблюдалась и нами. Поскольку, и процесс диссоциации субъединиц мДБМ, и процесс ассоциации фермента с ФЛВ аналогичным образом зависят от рН среды мы пришли к выводу, что ФЛВ не влияют на степень диссоциации суб'¿единиц мДБМ, и что эффективность комплексообразо-вания зависит от четвертичной структуры фермента: тетрамер образует комплекс более эффективно, чем димер. Результаты наших экспериментов свидетельствуют, что условия рН внутри ХГ (5,5-5,7) крайне благоприятны не только для каталитической активности мДБМ, но и для ассоциации последней с ФЛ, входящими в состав мембранной структуры этих органелл.

Кроме того, полученные данные- свидетельствуют, что, помимо заряда, и четвертичной структуры, общие конформационные изменения молекулы фермента также могут воздействовать на процесс ассоциации мДБМ с ФЛВ. Этот вывод сделан на основании того, что адобелок мДБМ, в определенной степени отличающийся по своей конформации от голофермента (Skotland, Ljones, 1979), не оказался способным к ассоциации с ФЛВ.

С другой стороны, как следует из представленных данных, для мДБМ характерна более высокая степень комплексообразования с ФЛВ, чем для рДБМ. Это свидетельствует о том, что гидрофобные взаимодействия, также принимают участие в прцессе образования комплекса мДБМ-ФЛ. Основываясь на этом выводе, можно предположить, что ín vivo гидрофобный пептид мДБМ может принимать участие в процессе комплексообразования фермента с мембранными ФЛ, стабилизируя комплекс, и тем самым, способствуя более прочной ассоциациим мДБМ с мембраной гранул.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено специфическое модулирующее воздействие ряда индивидуальных ФЛ на реакции катализируемые ДБМ: ФХ и лФХ повышают, а ФЭ, ФС и ФК понижают эффективность катализируемой ферментом реакции.

2. Воздействие ФЛ на каталитическую активность мДБМ обусловлено модуляцией кинетических параметров катализируемой ферментом реакции.

3. На основании полученных данных, с учетом того, что некоторые из отмеченных ФЛ- модулятров входят в состав непосредственного липидного микроокружения мДБМ, выдвинуто предположение о возможной роли ФЛ in vivo в отношении отмеченных реакций и, соответственно, биосинтез норадреналина.

4. Мембранная форма ДБМ образует обратимый комплекс с везикулами, сформированными как из индивидуальных цвиттерионных ФЛ-активаторов ДБМ, так и из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ.

5. Процесс ассоциации фермента с ФЛВ специфичен и зависит как от третичной, так и от четверитчной структуры фермента.

6. Процесс ассоциации между ДБМ и ФЛВ наиболее эффективно протекает при рН, соответствующих физиологическим значниям рН внутри ХГ.

7. Показано, что в стабилизации комплекса фермент - ФЛВ принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия.

8. Сравнительный анализ эффективности комплексообразования мДБМ и рДБМ с ФЛВ позволяет сделать вывод об участии гидрофобного пептида мДБМ в стабилизации комплекса фермент-ФЛ мембране гранул.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Boyadzhyan A.S., Karagezyan K.G., Pogosyan A.G., Mkrtchyan M.Y., Aivazyan V.A. Possible mechanism of modulation the catalitic properties of dopamine-p-monooxygenase during the interaction with phospholipid vesicles// Abstracts of the 2-World Congress of theoretical organic chemists. Toronto, Canada, 1990, DP-04.

2. Оганесян Л.Л., Бояджян А. С., Погосян А,Г. Кислый медьсодержащий белок - промежуточное звено на стадии переноса электронов от цитохрома Ь-561 к дофамин-р-монооксигеназе// Тезисы докладов VI научно технической конференции молодых ученных и специалистов района 26 Коммисаров: Ереван, 1990, - С.79.

3. Pogosyan A.G., Boyajian A.S., Mkrtchyàn M.Y., Karagezyan K.G. Interaction of dopamine-p-monooxygenase with chromaffin granule membrane lipids // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1992. -V.188.- P.678-683.

4. Boyajian A.S., Petrûsyan S.H., Pogosyan A.G., Aivazyan V.A., Karagezyan K.G. Association of dopamine-p-monooxygenase with chromaffin granule phospholipids// Abstracts of the 8-th International Symposium on Chromaffin Cell Biology, Edinburg, Scotland. - 1995. - P.86.

5. Петросян C.A., Погосян А.Г., Айвазян B.A., Маилян К.Р. Цепь переноса электронов и липид-белковые взаимодействия в мембранах хромаффинных гранул // Материалы научной конференции, посвященной 30-летию основания отделения Биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета. Ереван, 1996. -С.70.

6. Pogosyan A.G., Boyajian A.S., Maylian K.R., Aivazyan V.A., Petrosyan S.H. Fluorescence spectroscopy studies of the association of dopamine-p-monooxygenase with neitral phospholipid vesicles // Bioligical Membranes (in press).

илчгьъь q-ъчпраь «ппапивиъ

^П&ШГ^рЧГПЪЛ0ЧМ1М-ЪШаЬ ФПМЗЛ^ЬЗПМЬВПКЬС ^МЪТ-ЪЫЧ* Abs

ШГФПФЦ.«1ФР

^mgujjllû рШпЬр ijr^iuGJiD-ß-ifnGnogu|i€|bGuiti, фпифп^шфг^СЬр, ßpniTu^fiGtuj]iü îni_|Gbp, puirpuGp-, ljuiuiui[Jiin|il| uil¡in]n|n tp-jni.fi, IjJiGbuiJilj upupuiiTbmpbp, [>гц|ш][«}.-фЬр\Пз6\п ЦтГицЬри, Ijnifujjbjni vumu^uignuf, ф^пъпрЬидЬйтш^С jmpmil|nuj{iui> ^Ьрщрш<£ <jbütnp|^ni.<|nLif.

¿Auifuiáuijü duiifiuGuitjuil^c] \nbuni.p-j\iiG ll^lhT^kpji, \T\uuGuii|npumjbu ^njJiujJii}Gbpp» IpupUnpiucjni-jG i}bp bû |ишцпи? IjbGuiupuiGiulpuG p-uirjuiGpübp]i LÎbGinGbpji cjnp&ntGbni-p-juiG U IpupcjiuiJnpifuiG ujpntjbuGbpnuT: ЪЬр^ш^шд^шй vuuuuGpnuf nLunLifGmu{ipi[b^ fc l^inbJun|UiiTJiGGbp|i u|iGj>bqJiG ifuiuGuiljcjnn fu^JiGuijjiG (jp\uGni.]GbpJi p-tuï|ïufip}i VjtuqiTJi ifb¿ lîuiGni] фЬр1ГЬйиф ijr^iuGJiG-ß-nopu|ifjbGiuq|i ijmJuuinnbfjnLpjnt_G£ фпифп^и^|щСЬр|1 Rhin:

¿»wjinGuipbpi[b[ b ifji ¿uipg фпифп[|\и}(г^йЬр|г Gbp<jnpàru.pjni_Gp 1}пфшС|г6-р-nojmJitjbGuiqJi Цпт|гГJig ljiu\mu^qi[nr| itbuiljgJuujji [|1{|пфпифш1л|1^)ц}ип^Г]р U

фшш^г^^п^Ср JvpuiGnuf bG, Jiul| фпифшт^^ЬршСщииГ^Ср, фпифшифг^ц-JiGp b фпифшифцшj]iG p-pni-G Gi|iuqbgGni.if bß фЬр^ЬСиф IjnrpfJifj lpuuimjJiqi|nrj iljgjuuGbpJi uipryjni.Gw^binnujvjrn.Gji: 3n\.jg b inp\jui&, np ll^lh^kpji <jnpírm.pjni.G|i ujuijifiuGuii|npi|ui£r b фЬр1УЬ0ш}1 nrjiTJig ljuiimui|Hji|ni] nbuilj(j]iuiGbpji binjilj ujwpmiTbmpbpJi ijmifinjuifuiifp:

¿bmwfjnmi|bi fc Guili фЬр^Ьйиф uiun<j|iui<j|miG фпифп^ш}]»|йЬр|1 ßb\n: jmfiuipbp\|b| fc, np uiju ujpmjbup lpu|vi]ui2> fc ifji¿mijuijp¡i itpajifwßßbpJirj L uijf

ifrnGGbpJig (pH, JinGiuljwG фЬр^ЬСш^ bppnprçiuj|iG b ¿nppnprjuij|iß

mtgijwgg b uijG): öntjg fc uipijiu^, np флифпфщ^-фЬргГЬСт Ijmfu^fcgug jm_ßui<ji[ui& b JiG¿itjbu fc[bl|inpnuvnium{îl], lujGujbu b[ Й|и}рпфпр nLd"bpni[: Дш21}[» GbjniJ uijq. uiifbßQ рГ|йшр1р|пиГ fc [[iuj(iijGbp]i ljuip<juiilnp}i¿ qbpp in vivo 1}пфшй|10-^GnopuJiíjbGmfjJi filpuuiifuiifp:

'4-1/