Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейрохимические характеристики дофамин- и гистаминергической системы стриатума у крыс линии крушинского-молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенной эпилепсии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Нейрохимические характеристики дофамин- и гистаминергической системы стриатума у крыс линии крушинского-молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенной эпилепсии"

На прав ахрукописи

СОРОКИН Александр Яковлевич

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДОФАМИН- И ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМ СТРИАТУМА У КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСЖОГО-МОЛОДКИНОЙ, ГЕНЕТИЧЕСКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННЫХ К АУДИОГЕННОЙ ЭПИЛЕПСИИ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова Российской Академии медицинских наук и на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор К.С. Раевский доктор биологических наук И.И. Полетаева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.А. Чепурнов доктор медицинских наук М.Е. Иоффе

Ведущая организация: Институт мозга РАМН

Защита диссертации состоится «24» мая 2004 г. в15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 на Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, 119992, Воробьевы горы, МГУ, Биологический ф-т, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологический наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Эпилепсия и другие судорожные расстройства относятся к числу наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы. Этим определяется большая социальная значимость проблемы эпилепсия и ее лечения. Одним из перспективных подходов к изучению патофизиологических механизмов эдилептиформных состояний является экспериментальное моделирование судорожных расстройств (Крыржановский, 1990). К числу известных экспериментальных моделей эпилептиформпых состояний относится так называемая аудиогенная эпилепсия.

Наиболее удобными для создания генетических моделей эпилепсии оказались грызуны. В природных как и во многих аутбредных лабораторных популяциях более 10% особей отвечают на громкий звук сильным двигательным возбуждением, которое часто переходит-в эпилептиформный судорожный припадок с клонической и иногда тонической фазами. Частота встречаемости данного признака в природных популяциях обусловлены, возможно, тем, что носители генов, определяющих данный признак, имеют селективное преимущество (Полетаева и соавт., 1996). Аудиогенная чувствительность у лабораторных крыс наследуется полигенно (Романова и Калмыкова, 1981). Возможно, что высокая чувствительность, грызунов к звуку, являющаяся важным адаптивным признаком, и предрасположенность к аудиогенным судорогам определяются одними и теми же генами, имеющими плейотропные эффекты. Можно предполагать, что аллели генов, определяющие повышенную чувствительность к звуку, важны для нормального развития организма. Линии крыс, полностью не чувствительные к звуку немногочисленны.

Путем селекции были получены лабораторные линии грызунов, имеющие высокую аудиогенную судорожную готовность. В настоящее время они широко используются в качестве экспериментальных моделей эпилепсии (крысы линий Крушинского-Молодкиной, ОЕРЯ - генерализованная судорожная эпилепсия; ШЕЯ- височная эпилепсия, а также мыши ряда линий, в частности, ББА/2, 101/ЫУ). Помимо этих линий, в физиологических исследованиях используют другие лабораторные модели, когда судорожная активность возникает в ответ на фармакологические воздействия, например, коразола, бикукулина, пикротоксина; на электростимуляцию, в том числе вызывающую явление «киндлинга».

Линия крыс, у которых в ответ на звуковое воздействие возникает выраженный эпилептиформный припадок клонико-тонического типа, была создана на биолого-почвенном факультете МГУ профессором Л.В. Крушинским и его сотрудниками Л.Н. Молодкиной и ДА. Флессом (Крушинский, 1960).

Известно, что ключевая роль в формировании судорожных, в том числе аудиогенной

природы, припадков принадлежит глутамату.

| БИБЛИОТЕКА I

Однако в последние годы появились данные о том, что сложный процесс вовлечения стволовых структур и переднего мозга в развитие генерализованного эпилептиформного припадка протекает при участии дофаминергических и гистаминергических систем разного уровня. В частности показано, что развитие или подавление судорожного припадка зависит от уровней дофамина и гистамина в базальных ганглиях (Derensart & Depaulis, 2002).

Следует отметить, что несмотря - на большое число работ, посвященных нейрофизиологическим аспектам развития судорожных припадков у крыс линии КМ, их нейрохимические механизмы изучены крайне недостаточно. В ряде работ сообщалось о нейрохимических особенностях, характерных для крыс линии - КМ. Так были описаны нарушения процессов перекисного окисления липидов (Копаладзе 1974; Бурлакова 1981), изменения в содержании нейромедиаторных аминокислот (Раевский и соавт., 1995; Вицкова и соавт., 1998), а также метаболизма моноаминов (Косачева и соавт.,. 1998), в структурах мозга этих животных.

Для оценки состояния нейромедиаторных систем мозга в условиях патологии могут быть использованы подходы и методы нейрохимическеской фармакологии. С этой целью применяются селективные фармакологические анализаторы,. оказывающие - влияние на отдельные звенья нейромедиаторной системы: биосинтез, резервирование, взаимодействие с рецепторами.

Существенным достижепием последнего времени явились разработка и внедрение метода внутримозгового микродиализа в сочетании, с техникой ВЭЖХ, позволяющие, проводить динамическую оценку внеклеточного содержание мозговых медиаторов - и продуктов их обмена у животных как в исходном, фоновом функциональном состоянии, так и в условиях фармакологических воздействий. Возможность поэтапного прослеживания эффектов фармакологических препаратов с известным механизмом действия на животных с генетическими различиями в предрасположенности к эпилептогенному действию сильного звука открывает принципиально новый подход к экспериментальному изучению эпилепсии. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение нейрохимических характеристик функционального состояния дофамин- и гистаминергической систем стриатума у крыс двух генотипов - инбредной линии КМ и аутбредной линии Вистар, различающихся по признаку "аудиогенная эпилепсия" с помощью методики внутримозгового микродиализа in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценить значения базального уровня дофамина, его метаболита ДОФУК (3,4 дифенил уксусной кислоты) и гистамина в условиях микродиализного эксперимента у крыс КМ и Вистар.

2. Изучить временные характеристики и динамику изменений нейрохимических показателей дофамин- и гистаминергической систем стриатума у крыс КМ и Вистар в норме и при действия фармакологических анализаторов (амфетамина, раклоприда, тиоперамида), модулирующих функциональную активность указанных нейромедиаторных систем в микродиализных опытах in vivo.

3. Оценить влияние тиоперамида (селективного антагониста НЗ-гистаминовых рецепторов) на функциональную активность дофаминергической системы стриатума по показателям динамики внеклеточного содержания дофамина у крыс КМ и Вистар в опытах in vivo.

4. Оценить влияние амфетамина (непрямого агониста дофаминовых рецпгоров) и раклоприда (Д2/ДЗ-рецепторного антагониста) на функциональную активность гистаминергической системы стриатума по показателям динамики внеклеточного уровня гистамина у крыс КМ и Вистар в опытах in vivo.

5. Оценить течение аудиогенного судорожного припадка у крыс линии КМ при воздействии фармакологических анализаторов, влияющих на различные звенья дофамин- и гистаминергической систем стриатума.

Научная новизна исследования. Впервые, с использованием метода внутримозгового микродиализа, получены данные о различиях в базальном уровне дофамина, его метаболита ДОФУК и гистамина между животными, различающимися по предрасположенности к аудиогенной эпилепсии (крысы линий КМ и Вистар). Впервые продемонстрированы различия во временам течении реакций моз га на введение препаратов с прямым (амфетамин, раклоприд) и опосредованным воздействием (тиоперамид) на механизмы дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс. Получены не описанные ранее данные о различиях во временнбм течении ответных реакций мозга крыс двух генотипов при прямой (тиоперамид) и опосредованной (амфетамин, раклоприд) модуляции гистаминергической нейропередачи в стриатуме крыс. Впервые описан отставленный характер фармакологического эффекта веществ, изменяющих функции дофамин- и гистаминергической систем мозга у животных с высоким уровнем чувствительности к звуку (крысы линии КМ).

Научно-практическое значение. Установленные в работе различия в базальном содержании дофамина, его метаболита ДОФУК, а также гистамина в микродиализатах стриатума крыс линий КМ и Вистар важны для понимания особенностей организации и функционирования указанных нейромедиаторных систем стриатума. Известные ранее факты об изменениях обмена катехоламинов и других нейромедиаторов у крыс линии КМ существенно дополнены демонстрацией отставленных эффектов веществ (амфетамина, раклоприда и тиоперамида), являющихся модуляторами дофамин- и гистаминергиеской нейропередачи, что свидетельствует об измененном характере регуляции и функционирования указанных систем

мозга у животных, генетически предрасположенных к ауциогенной эпилепсии. Полученные факты должны учитываться при изучении нейрохимических и нейрофизиологических механизмов и разработке новых подходов к лечению судорожных расстройств. Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на VIII Всероссийской школе молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии", Казань, 2001, на XXIII Congress of Neuropharmacology, Montreal, 2002, на VIII Международном симпозиуме "Базальные ганглии и поведение в норме и при патологии", Сапкт-Петербург, 2002, на 25 International Epilepsy Congress, Lisbon, 2003, на XI Международной Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Москва, 2004, на лабораторных и межлабораторных семинарах НИИ Фармакологии РАМН.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 335 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 27 рисунков.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 публикациях (6 тезисов и 2 статьи).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 95 самцов крыс линии Вистар, 90 самцов крыс линии КМ весом 220-260 г.

В исследовании использовали следующие веществаг амфетамин (Sigma), раклоприд (RBI), тиоперамид (Sigma) Для приготовления буферных растворов, перфузирующих растворов, подвижной фазы для хроматографического разделения веществ использовались реактивы фирм Биохром, ICN, Мегк. 1. Метод внутримозгового микродиализа

Крыс линии Вистар анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно) и фиксировали в стереотаксичсском приборе. Микродиализный зонд имплантировали в дорзальный стриатум по координатам: АР +0,5 мм; L -3,0 мм; DV -7,0 мм (Paxinos and Watson, 1986). Зонд фиксировали на черепе с помощью шурупа и заливали акрилоксидом. В работе использовали концентрические микродиализные зонды (Di Chiara et al., 1985; Gainetdinov et al., 1994) с диализной мембранной проницаемостью до 15000 дальтон ("Hospal AN-69", Italy).

Перфузию мозга проводили через 24-48 часов после операции, используя искусственную цереброспинальную жидкость следующего состава; 150 мМ Na+, 1,4 мМ Са , 30 мМ К+, 0,8 мМ Mg2+, 31,0 мМ РО4\ 155 мМ СГ, рН 7,4. Для подачи жидкости использовали шприцевый насос (Braun perfusor VI, TUV Rheinland, Германия), скорость протока обычно составляла 2 мкл/мин. Сбор диализатов начинали через 1-1,5 часа после начала перфузии. Диализаты собирали каждые 20 минут в течение 4-5 часов. Для определения базального уровня содержания исследуемых веществ до введения препаратов анализировали 3-4 образца.

Полученный диализат без дополнительной очистки анализировали на содержание дофамина и его метаболита ДОФУК с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД), на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США), снабженным инжектором Rheodyne 7125 с петлей на 20 мкл для нанесения образцов. Дофамин и диоксифенилуксусную кислоту (ДОФУК) разделяли на

колонке с обращенной фазой (3x150 мм, С18, 5 мкм, МНПП "Элсико", Москва). В качестве подвижной фазы использовали 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ октансульфата натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила (рН 3,6). Изучаемые вещества определяли электрохимически, используя амперометрический детектор LC-4B с ячейкой TL-5. Детекцию осуществляли на стеклоугольном рабочем электроде при +0.7В против Ag/AgCl электрода сравнения.

Для определения содержания гистамина диализат объемом 20 мкл смешивали с 50 мкл реагента, состоящего из смеси о-фталевого альдегида (54 мг), 1 мл абсолютного этанола, 1 мл 1М сульфита натрия и 18 мл боратпого буфера (рН 9.5) Реакция проводилась при комнатной температуре в течении 20 мин, затем 20 мкл продукта реакции наносили на храматографическую колонку.

Определение содержания гистамина в микродиализатах проводили на изократической ВЭЖХ-системе при температуре 50 С, используя колонку с обращенной фазой (100x4,6 мм, 3 мкм, Hypersil ODS) на электрохимическом детекторе LC-4B (BAS, USA) при скорости тока 0,25 мл/мин. Детекцию осуществляли на стеклоугольном рабочем электроде при +О,85В против Ag/AgCl электрода сравнения. Подвижная фаза состояла из 0,1М цитратно-фосфатного буфера, 1,1 мМ октан-сульфоновой кислоты, 0,1 мМ ЭДТА-№2 и 9% ацетонитрила, рН 3,7.

Среднее значение содержания дофамина, ДОФУК и гистамина в образцах диализата, полученных до введения препаратов, принимали за 100% (базальный уровень) и эффекты препаратов оценивали по отношению к базалыюму уровню. По окончании эксперимента животных декапитировали и проводили морфологический контроль для определения области локализации зонда.

2. Метод тестирования животных по их чувствительности к аудиогенной эпилепсии

Реакция крыс КМ на звук характеризуется стабильностью проявления, коротким латентным периодом и завершается, почти в 100% случаев, клонико-тоническим судорожным припадком. Интенсивность реакции на звук оценивают по 5 -балльной шкале (Крушинский, 1960). Животных подвергали 1.5 мин действию звука (100 дб) в звукоизолированной камере.

Развитие припадка начинается после латентного периода, во время которого животное сохраняет неподвижность. Его укорочение или удлинение отражает соответствующие изменения (увеличение или снижение) предрасположенности к аудиогенной эпилепсии. Именно модуляция длительности латентного периода припадка иногда оказывается единственным параметром, который изменяется при внешних воздействиях у крыс этой линии, ввиду ее чрезвычайно высокой чувствительности. Изменения интенсивности припадка происходят значительно реже (Алексеев и др., 2003).

3. Статистическую обработку данных проводили с U-критерия Манна-Уитни. Результаты представлены в виде M±SEM (среднее ± стандартная ошибка среднего) или M±SD (среднее ±стандартное отклонение).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ НЕЙРОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ СТИАТУМА КРЫС ЛИНИЙ ВИСТАР И КМ

Базальный уровень концентраций дофамина и ДОФУК в стриатуме крыс линий Вистар и КМ.

В условиях микродиализного эксперимента па свободноподвижных животных были определены базальные (фоновые) концентрации дофамина и основного метаболита ДОФУК в диализатах стриатума.

Средняя концентрация дофамина в дорзальном стриатуме крыс линии Вистар составляла 111,2 ± 5,6 fmol/20 мин/20 мкл, для ДОФУК эта величина была равна- 41,5 ± 3,7 pmol/20 мин/20 мкл. Базальный уровень концентрации дофамина в дорзалыгом стриатуме у крыс линии КМ был равен 139,03 ±6,1 fmol/20 мин/20 мкл, для ДОФУК эта величина составила - 53,9 ± 4,3 pmol/20 мин/20 мкл, что на 25 и 30% соответственно (р<0,05) выше значений, полученных у крыс линии Вистар (Рис 1).

Полученные в наших опытах межлинейные различия во внеклеточном содержании дофамина и ДОФУК в целом согласуются с соответствующими показателями, полученными для гомогеиатов мозга в условиях ex vivo (Косачева и соавт., 1998).

Влияние амфетамина на внеклеточный уровень дофамина и ДОФУК в стриатуме крыс линий Вистар и КМ.

Амфетамин в дозе 1 мг/кг вызывал у крыс линии Вистар достоверное (р<0.05) повышение внеклеточного уровня дофамина, которое наблюдалось уже через 20 мин после введения. Уровень дофамина достигал 254± 18% относительно исходного. В последующий период динамика изменения внеклеточной концентрации дофамина была следующей: к 4060 мин после введения амфетамина наблюдалось относительно быстрое снижение внеклеточного содержания нейротрансмиттера (приблизительно до 115% к 60-й мин), в последующий период снижение происходило более медленно, достигая значений базального уровня к 80 мин наблюдения (Рис 2а).

Внеклеточное содержание ДОФУК у крыс этой линии после введения амфетамина в указанной дозе претерпевало кратковременное повышение, которое наблюдалось через 40-60 мин после введения, к 80 мин уровень метаболита достоверно снижался до 37± 10% отностельно исходного, сохраняясь практически неизменным в последующий период наблюдения.

Обнаруженные нами изменения внеклеточного уровня дофамина и его метаболита ДОФУК у крыс линии Вистар на фоне однократного введения амфетамина хорошо согласуются с результатами, полученными другими исследователями (Zetteistrom et al., 1983; Cho & Segal, 1994; Kankaanpaa et al., 1997; Андяржанова и соавт., 1999; Afanas'ev et al., 2001). Небольшие отличия во временных характеристиках развития эффекта амфетамина могут объясняться неодинаковыми условиях проведения экспериментов.

У крыс линии КМ однократное введение амфетамина в той же дозе вызывало достоверное (р<0.05) повышение внеклеточного уровня дофамина до 260± 18%, сопоставимое по величине с наблюдаемым у животных линии Вистар (Рис 26). Однако, в отличие от последних, этот эффект наблюдался лишь через 120 мин после введения

Рис. 1. Базальный уровень концентраций дофамина (а), ДОФУК (б) и гистамина (в) в стриатуме свободноподвижных крыс линий Вистар и КМ. M±SEM (п=22-24). * - р < 0.05 - достоверность различий при сравнении показателей для крыс КМ с данными для крыс Вистар.

анализатора, т.е. оказался значительным отставленным по времени. Через 20 мин после введения, т.е. в период, когда у крыс Вистар наблюдался достоверный подъем этого показателя, уровень дофамина в стриатуме крыс КМ не отличался от базального.

У крыс линии КМ амфетамин вызывал достоверное снижение внеклеточного содержания ДОФУК (до 36± 10% от базального уровня). Это изменение наблюдалось на 120140 мин после введения, т.е. было отсроченным также как и описанный выше эффект повышения уровня дофамина у этих животных. Таким образом, эффекты амфетамина по своей величине и амплитуде были сходны у крыс обеих линий, однако у животных линии КМ оба эффекта оказались значительно отставленными по времени.

В качестве основы наблюдавшего амфетамин-зависимого повышения внеклеточного уровня дофамина принято рассматривать три возможных механизма.

1. Участие специфического дофаминового транспортера (ДАТ), локализованного в пресинаптической мембране нейрона. В "нормальных" условиях ДАТ обеспечивает поддержание нейротрансмиттерного баланса на синаптическом уровне, функционируя как активный переносчик дофамина из синаптической щели в пресинаптическую терминаль нейрона (Giros & Caron, 1993; Gainetdinov & Caron, 2002).

Амфетамин, как и дофамин, связывается с ДАТ и, подвергаясь трансмембранному переносу, поступает нервное окончание (Seiden et al., 1993; Jones et al., 1998). В этих условиях происходит «обращение» функции ДАТ, которое сопровождается активным переносом дофамина из нейрона во внеклеточное пространство (Gainetdinov et al., 2002).

2. Повышение внутриклеточной концентрации амфетамина, вследствие его транспорта через мембрану нейрона с помощью ДАТ и/или путем пассивной диффузии, вызывает переход дофамина из везикулярного пула в цитоплазматический (Jones et al., 1998). При этом происходит пополнение пула дофамина, доступного для высвобождения (Westeiink etal., 1989).

3. Введение амфетамина оказывает прямой ингибирующий эффект на активность моноаминоксидазы (МАО)- основного фермента метаболической деградации дофамина за счет его окислительного дезаминирования и превращения в ДОФУК (Cho & Segal, 1994). Следствием этого является наблюдаемое нами снижение внеклеточного уровня ДОФУК.

Таким образом, обусловленные амфетамином "обращение" ДАТ, перераспределение дофамина между везикулярным в цитоплазматическим пулами, а также ингибирование активности МАО определяют значительное увеличение внеклеточной концентрации дофамина и снижения уровня его основного метаболита - ДОФУК, описанные выше.

Можно предположить, что в основе наблюдаемых в наших опытах межлинейных различий реакции дофаминергической системы стриатума на введение амфетамина могут

лежать особенности регуляции одного или нескольких процессов, обеспечивающих поддержание нейротрансмиттерного баланса на синаптическом уровне. На такую возможность указывают данные об измененных ферментативных свойствах МАО-А у крыс линии KM (Medvedev Ы а!., 1992).

Рис. 2. Влияние амфетамина, в дозе 1 мг/кг (в/б) на внеклеточный уровень дофамина в стриатуме крыс линий Вистар (а) и КМ (б). М+8БМ (п=6-8). Стрелками показан момент инъекции. * - р < 0.05 - по сравнению с контролем (0,85% раствор ШС!).

Внеклеточный уровень дофамина и ДОФУК в стриатуме крыс Вистар и КМ в условиях блокады D2/D3-дофаминовых рецепторов.

Селективный антагонист 02Я)3-дофаминовых рецепторов- раклоприд при однократном введении в дозе 1,2 мг/кг (в/б), обеспечивает эффективную блокаду дофаминовых рецепторов этих подтипов (Ogгen Ы а1., 1986). В наших опытах раклоприд, использованный в указанной дозе вызывал градуальное повышение внеклеточного уровня дофамина, причем максимальный эффект наблюдался к концу первого часа и составлял 210±8,3% по отношению к базальному уровню. После этого отмечалось постепенное снижение содержания дофамина в диализатах до исходных значений.

Динамика изменения внеклеточного содержания ДОФУК была сходной: на протяжении первых 60 мин после введения рецепторного блокатора наблюдалось достоверное повышение диализатной концентрации ДОФУК, достигавшее 242±7,3% по отношению к исходному уровню, после чего происходило постепенное снижение внеклеточного содержания метаболита.

У крыс линии КМ сходный по амплитуде повышение уровня дофамина и ДОФУК (до 237±13,5% и 237±8,1% соответственно) было отставлено по времени и регистрировалось только через 100 мин после введения раклоприда (Рис. 3).

Повышение содержания дофамина в диализатах стиратума после введения раклоприда может рассматриваться как следствие функциональной блокады В2Л)3-подтшии пресинаптических рецепторов, локализованных на окончаниях дофаминергических нейронов и регулирующих процессы биосинтеза и высвобождения дофамина. В "нормальных" условиях эти процессы находятся под ингибиторным контролем внеклеточного "пула" нейротрансмиттера (¡шрегаЬ & Аще1исс1, 1989; Гайнетдинов и соавт., 1994). Блокада Б2/Б3 подтипа рецепторов раклопридом сопровождается увеличением интенсивности процессов синтеза, метаболизма и высвобождения дофамина (Раевский и соавт., 1996).

Полученные нами данные согласуются с результатами приведенных исследований и демонстрируют, что раклоприд вызывает повышение уровня внеклеточного дофамина в стириатуме крыс обеих линий, однако при этом выявляются значительные межлинейные различия, проявляющиеся в неодинаковой временной динамике процессов высвобождения дофамина в условиях Б2/Б3 -рецепторной блокады. Характер наблюдаемых изменений, как и межлинейные различия оказываются сходными с описанными выше для эффектов амфетамина. Межлинейные различия временной динамики возрастания внеклеточного уровня дофамина и ДОФУК при действии раклоприда могут быть обусловлены особенностями рецепторной чувствительности и неодинаковыми временными характеристиками регуляции функционирования этих рецепторов - у крыс линии КМ.

Измененная аффиность дофаминовых рецепторов D2/DЗ-подтипа в стриатуме крыс КМ может быть связана с обнаруженным нами более высоким внеклеточным содержанием дофамина у этих животных.

Рис 3. Влияние раклоприда, в дозе 1,2 мг/кг (в/б) на внеклеточный уровень дофамина в стриатуме крыс линий Вистар (а) и КМ (б). M±SEM (п=6-8). Стрелками показан момент инъекции. * - р < 0.05 - по сравнению с контролем (0,85% раствор ШО).

Влияние тиоперамида - селективного антагониста гистаминовьгх НЗ-рецепторов - на внеклеточное содержание дофамина и ДОФУК в стрнатуме крыс Вистар и КМ.

Как известно НЗ-рецепторы, впервые описанные около 20 лет назад (Аггащ и др., 1983), функционируют как ауторецепторы, регулирующие синтез и высвобождение гистамина. Впоследствии было показано, что НЗ-рецеиторы могут функционировать и как гетерорецепторы, ингибируя высвобождение других нейротрансмиттеров, в том числе дофамина (Аггащ е! а1., 1991; Мишаг е! а1, 2004).

Известно, что в дозе 2 мг/кг тиоперамид обеспечивает эффективную блокаду гистаминовых рецепторов НЗ-подтипа (ОЫ е! а1., 1998), локализованных на окончаниях дофамин- и гистаминергических нейронов (обзор хааса). В наших опытах однократное введение тиоперамида в указанной дозе вызывало достоверное градуальное повышение внеклеточного уровня дофамина в диализатах стриатума крыс линии Вистар. Максимальный эффект тиоперамида наблюдался к концу первого часа с момента инъекции НЗ-антагониста и составлял 212 ± 9,8% по отношению к базальному уровню. После достижения максимальных значений уровня дофамина отмечалось постепенное снижение его концентрации до величины базального уровня.

Введение тиоперамида не сопровождалось значимыми изменениями уровня ДОФУК в диализатах стриатума крыс Вистар

У крыс линии КМ введение тиоперамида в дозе 2 мг/кг вызывало эффект, сходный по-величине с наблюдаемым у крыс Вистар. Повышение уровня ДА достигало 210±9,7% по отношению к базальному. Однако, по сравнению наблюдаемым у животных линии Вистар, повышение уровня дофамина было значительно отставлено по времени. Содержание дофамина в диализатах стриатума достигало максимума через 100 мин после введения НЗ-антагониста, после наблюдалось постепенное снижение содержания ДА до базальных значений.

У крыс КМ тиоперамид в той же дозе, также как и у крыс Вистар, не оказывал значимого влияния на внеклеточный уровень ДОФУК.

Как указывалось выше, использование раклоприда позволило оценить вклад ауторепторной регуляции при участии Б2/Б3-подтипа дофаминовых рецепторов у животных двух сравниваемых линий. Применение тиоперамида, пресинаптического антагониста НЗ-гистаминовых рецепторов, дает возможность исследовать возможное участие гетерорецепторных механизмов регуляции синтеза и высвобождения дофамина. Полученные нами данные свидетельствуют о вовлечении этого звена регуляции при участии НЗ-гистаминовых рецепторов. Сравнение данных этой серии опытов с результатами предыдущей серии свидетельствуют о существенных различиях в нейромедиаторных

механизмах регуляции синтеза и высвобождения дофамина, при участии ауторецептров с одной стороны и гетерорецепторов с другой. Воздействие на ауторепторные механизмы регуляции (при участия D2/D3-подтипа дофаминовых рецепторов) позволяет оказывать регуляторное влияние на процессы как биосинтеза, так и высвобождения дофамина (эффект раклоприда). Это проявляется в изменениях внеклеточного уровня дофамина и его метаболита ДОФУК, отражающего интенсивность процессов биосинтеза нейромедиатора. Модуляция гетерецепторных механизмов, реализующихся при участии НЗ-подтипа пресинаптических рецепторов проявляется только в скорости высвобождения дофамина и не оказывает заметного влияния на скорость его биосинтеза (эффект тиоперамида). Интересно отметить, что в данной серии опытов временная динамика наблюдавшихся изменений обнаруживала те же межлинейные различия, которые наблюдались при исследовании процессов высвобождения дофамина при его модуляции амфетамином. У крыс линии КМ по сравнению с крысами Вистар временная динамика высвобождения и биосинтеза дофамина характеризуется отставленными по времени эффектами.

НЕЙРОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ СТИАТУМА КРЫС ЛИНИЙ ВИСТАР И КМ

Вязальный уровень гистамина в дорзалыгом стриатуме крыс линий Вистар и КМ.

Базальные (фоновые) внеклеточные концентрации гистамина в диализатах стриатума -крыс линий КМ и Вистар были определены в условиях микродиализного эксперимента на свободноподвижных животных.

Средняя внеклеточная концентрация гистамина в диализатах дорзального стриатума крыс линии Вистар составляла 66,5 ± 3,5 fmol/20 мкл /20 мин. Базальный уровень внеклеточной концентрации гистамина в диализатах дорзального стриатума у крыс линии КМ был равен 44,3 ± 4,6 finol/20 мкл /20 мин, что на 33,4% (р<0.05) ниже, чем у Вистар (Рис.

О-

Полученные в наших опытах межлинейные различия во внеклеточном содержании гистамина в целом согласуются с соответствующим показателем, полученными для гомогенатов мозга в условиях ex vivo (Tuomisto et al., 1996).

Влияние амфетамина на внеклеточное содержание гистамина в стриатуме крыс линий Вистар и КМ.

У крыс линии Вистар однократное введение амфетамина в дозе 1 мг/кг в/б вызывало достоверное (р<0,05) выраженное увеличение внеклеточного уровня гистамина, которое регистрировалось уже через 20 мин после введения и достигало 240±11% относительно базального уровня. В дальнейшем, динамика изменения внеклеточной концентрации

гистамнна имела двухфазный характер: первоначальное (на 40 мин с момента введения амфетамина) наблюдалось снижение уровня нейротрансмиттера (приблизительно до 140% к 40-й мин), а при последующих измерениях наблюдалось дальнейшее постепенное снижение этого показателя до базального уровня.

-♦-амфетамин -о- 0,85% раствор №С1

а 300 п

о"

m 50

0 "Т-1--1-1-1-1-1-1-1-!---1-1

-40 -20 . 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

время, мин

0 "I-1-1-1-1-1-1-1-1-1--1-1

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

время, мин

Рис. 4. Влияние амфетамина, в дозе 1 мг/кг (в/б) на внеклеточный уровень гистамина в стриатуме крыс линий Вистар (а) и КМ (б). M±SEM (n=6-8). Стрелками показан момент инъекции. * - р < 0.05 - по сравнению с контролем (0,85% раствор NaCl).

У крыс линии КМ однократное введение амфетамина в той же дозе вызывало достоверное (р<0,05) повышение внеклеточного уровня гистамина (до 244±9%), сравнимое по величине с наблюдаемым у животных линии Вистар, однако, в отличие от последних, этот эффект обнаруживался только через 120 мин после введения вещества (Рис. 4). В дальнейшем динамика изменения внеклеточной концентрации гистамина также как и у крыс Вистар имела двухфазный характер: первоначальное снижение содержания нейротрансмиттера сопровождалось в дальнейшем уменьшением этого показателя до исходных значений.

Известно, что на гистаминергических нейронах локализованы различные гетерорецепторы, в том и дофаминергические (РМИрри е! а1., 1992), что позволяет предполагать возможность взаимодействие гистаминергической и дофаминергической систем мозга, в частности стриатума. Эти данные послужили основанием для изучения возможных механизмов такого взаимодействия.

Влияние селективного аптагониста В2/Э3-рецепторов раклопрвда на внеклеточное • содержание гистамина в стриатуме крыс линий Вистар и КМ.

У крыс Вистар внеклеточное содержание гистамина определяли после однократного введения раклоприда в дозе 1,2 мг/кг (в/б), которая но данным литературы обеспечивает эффективную блокаду дофаминовых рецепторов В2/Б3-подтипа (Ogгen е! а1., 1986). К 40 мин после введения раклоприда содержание гистамина достоверно снижалось до 33+8% относительно базального уровня. Затем внеклеточное содержание нейротрансмитгера претерпевало кратковременное повышение наблюдавшееся на 60-100 мин после введения. Позднее - к 120 мин - содержание гистамина снижалось до значений базального уровня.

У крыс линии КМ однократное введение раклоприда в той же дозе вызывало сходное по амплитуде достоверное падение уровня гистамина (до 29±10% относительно базального уровня) которое было отставлено по времени и наблюдалось на 80 мин после введения, т.е. значительно позже, чем у крыс Вистар. Затем, как и у крыс Вистар, во внеклеточном уровне нейротрансмиттера наблюдалось его восстановление до значений базального уровня.

В регуляции высвобождения гистамина принимают участие дофаминовые рецепторы разных подтипов. Известно, что рецепторы В2/Б3-подтипов локализованы на гистамнергических нейронах. В опытах на гипоталамусе показано с использование пуш-пул каннюли, показано, что Б2-дофаминовые гетерорецепторы стимулируют высвобождение гистамина, в то время как рецепторы БЗ-подшпа - ингибировать этот процесс (Рж! е! а1., 1993). Если предполжить, что Б2 и Б3 дофаминовые гетерорецепторы гипоталамуса и стриатума функционально однородны, аблюдаемое нами снижение уровня гистамина при действии раклоприда может быть интерпретировано как результат подавления дофамин-

зависимого высвобождения гистамина, следствием которого может являться понижение внеклеточного уровня этого амина. Подобный эффект наблюдался в наших опытах с раклопридом.

Как и в предыдущих сериях опытов, межлинейные различия в динамике внеклеточной концентрации гистамина в ответ на блокаду Б2/Б3-подтипов дофаминовых рецепторов раклопридом проявлялись в оставленном по временя характере этих изменений у крыс линии КМ.

Влияние селективного антагониста НЗ-рецепторов тиоперамида на внеклеточное содержание гистамина в дорзальном стриатуме крыс Вистар и КМ.

Исследование было предпринято для изучения возможных механизмов регуляции высвобождения гистамина в условиях микродиализного эксперимента на свободноподвнжных крысах линии Вистар и КМ. С целью анализа использовали селективный антагонист пресинаптических НЗ-гистаминовых рецепторов тиоперамид в дозе 2 мг/кг, обеспечивающей эффективную блокаду указанных рецепторов (Ghi et al., 1998). Тиоперамид вызывал повышение внеклеточного уровня гистамина в диализатах стриатума крыс линии Вистар, наблюдавшееся уже через 20 мин после введения и достигавшее максимума к 40 мин (250± 11,4%). К этому времени кривая концентрации гистамина выходила на плато, сохранявшееся в течение 60 мин наблюдения, после чего наблюдалось градуальное снижение эффекта. Концентрация гистамина достигала исходного уровня к 160 мин эксперимента (рис 5).

Иная картина отмечалась при введении тиоперамида в той же дозе животным линии КМ: в течение первого часа уровня гистамина оставался неизмененным, повышаюсь до 217±37% лишь к SO мин наблюдения. Максимальный эффект имел место на 100 мин после введения, составляя 247±11,3%, после чего в течение последующих 40 мин регистрировалось интенсивное снижение уровня гистамина в диализатах стриатума, которое достигало базального уровня к 160 мин эксперимента (рис 56). Интересно отметить, платообразная форма концентрационной кривой гистамина в этом случае не наблюдалась.

Повышение содержания гистамина в диализатах стриатума. после введения тиоперамида можно рассматривать как следствие функциональной блокады НЗ-подтипа гистаминовых ауторецепторов. Локализованные на терминалях гистаминергичских нейронов, эти рецепторы регулируют процессы биосинтеза и высвобождения гистамина, обеспечивая тем самым нейрохимический гомеостаз на уровне синапса (Brown et al., 2001). Блокада этих рецепторов тиоперамидом устраняет ингибиторный контроль и вызывает активацию процессов биосинтеза и высвобождения гистамина, что сопровождается повышением концентрации нейромедиатора во внеклеточном пространстве, что и

наблюдается в наших экспериментах. Полученные результаты указывают на отчетливые межлинейные различия в механизмах пресинаптической регуляции процессов высвобождения гистамина у животных линий Вистар и КМ. Оставленное и кратковременное (менее 60 мин) повышение уровня гистамина у крыс КМ может указывать на нарушения механизмов пресинаптической регуляции высвобождения нейромедиатора у животных этой линии по сравнению с крысами Вистар.

Рис 5. Влияние тиоперамида, в дозе 2 мг/кг (в/б) на внеклеточный уровень гистамина в стриатуме крыс линий Вистар (а) и КМ (б). M±SEM (п=6-8). Стрелками показан момент инъекции. * - р < 0.05 - по сравнению с контролем (0,85% раствор N0).

ТЕСТИРОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЗВУКУ КРЫС ЛИНИИ КМ ПОСЛЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ.

Влияние амфетамина на чувствительность к звуку крыс линии КМ

Амфетамин в дозе 1 мг/кг в/б через 2 часа после однократного введения вызывал у крыс линии КМ незначительное увеличение латентного периода, предшествующего тонической фазе развития судорожного припадка, но не оказывало влияние на интенсивность судорог. Этот эффект коррелировал с максимальным подъемом уровня дофамина и гистамина в стриатуме крыс КМ.

Влияние раклоприда на чувствительность к звуку крыс линии КМ

Раклоприд, однократно введенный в дозе 1,2 мг/кг (в/б), обеспечивающей эффективную селективную блокаду дофаминовых рецепторов 02-подтипа (Ogren et al., 1986), через 100 мин приводил к незначительному увеличению латентного периода начала тонической фазы припадка. У тестируемых животных не наблюдалось полной тонической экстензии. Эти эффекты коррелировали с максимальным подъемом уровня дофамина и со снижением уровня гистамина в стриатуме крыс КМ.

Хотя введение раклоприда вызывало незначительное воздействие на чувствительность к звуку, его эффект на состояние двигательной системы крыс был, тем не менее, четко выражен. Через 100 мин после введения у животных обнаруживались нарушения координации движений и ослабление мышечного тонуса конечностей. Влияние SCH23390 начувствительность к звуку крыс линии КМ

Селективный антагонист Dl-подтипа SCII23390, однократно введенный в дозе 0,1 мг/кг (в/б), обеспечивающей эффективную блокаду дофаминовых рецепторов D1-подтипа (Zetterstrom et al., 1986), через 2 часа приводил к незначительному увеличению латентного периода, предшествующего тонической фазе развития припадка. У тестируемых животных не наблюдалось полной тонической экстензии. Таким образом, селективный антагонист рецепторов D1-mCTmm несколько ослаблял интенсивность аудиогенного припадка.

SCH23390 способен стимулировать высвобождение дофамина во внеклеточное пространство путем блокады Dl-подтипа рецепторов, локализованных в стриатуме, преимущественно пресинаптически, на проекционных ГАМК-ергических нейронах, участвующих в регуляции механизма "отрицательной11 обратной связи "стриатум/черная субстанция" и/или блокады рецепторов Dl-подтипа, опосредующих тормозпый контроль интернейронов, модулирующих выброс ДА через вовлечение длинных или локальных нейронных "петель" (Adercrombie, DeBoer, 1997; Shi et al., 2000).

Как и в случае введения раклоприда, эффект SCH23390 заключался в ослаблении мышечного тонуса конечностей и нарушении координации движений животных.

Влияние тиоперамида на чувствительность к звуку крыс линии КМ

Тиоперамид в дозе 2 мг/кг (в/б), обеспечивающей эффективную блокаду гистаминовых рецепторов НЗ-подтипа (Ghi et al., 1998), через 100 мин после однократного введения приводил к незначительному увеличению латентного периода, предшествующего тонической фазе развития припадка, но не оказывал влияния на его интенсивность. Этот эффект коррелировал с максимальным подъемом уровня дофамина в стриатуме крыс КМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование показало, что у инбредной линии крыс КМ, подверженной аудиогенной эпилепсии, базальные значения уровня внеклеточного дофамина и его основного метаболита ДОФУК в стриатуме оказались достоверно выше, а гистамина - достоверно ниже, по сравнению с аналогичными показателями у крыс Вистар, не у нечувствительных к звуку.

Обнаруженные различия могут определяться рядом друг друга не исключающих причин: разным фоновым уровнем активности ферментов синтеза дофамина и гистамина, различиями в плотности ДАТ на терминалах нейронов. Следует отметить, что характер двигательной активности и поведения крыс КМ не имеют выраженных специфических особенностей, что можно было бы предполагать при наличии: грубого дефекта дофаминергической системы мозга. Как известно, межлинейные различия поведенческих характеристик крыс Вистар и КМ можно выявить только в специально • поставленных экспериментах (Плескачева и соавт., 2002).

Имеющиеся различия в поведении между линией КМ и Вистар можно выявить только в специально поставленных экспериментах (Pleskacheva, 1996, Плескачева и соавт., 2002). Характер подобных вариаций при этом не выходит за рамки обычно обнаруживаемых межлинейных различий, что свидетельствует в пользу того, что в целом дофаминергическая система крыс КМ не имеет грубых дефектов.

Повышенный уровень содержания дофамина и пониженный уровень гистамина в состоянии спокойного бодрствования у крыс КМ может быть либо непосредственной причиной их повышенной чувствительности к звуку, либо является вторичным признаком, возникающим в индивидуальном развитии, который может служить - целям адаптации организма к необычно сильной реакции этих животных на звук. Подобные компенсаторные изменения описаны в норадренергической системе мозга мутантных. мышей. Неврологическая мутация мыши tottering связана с аномалией одного из генов кальциевого канала и проявляется в виде типичных эпилептических «абсансов». Для этой мутации характерны избыточное число глюкокортикоидных рецепторов в переднем мозге и, видимо, вторично развивающаяся гиперплазия адренергических волокон, поднимающихся в

передний мозг из locus coeruleus (Burgess, Noebels, 1999).

Второй обнаруженный в данном исследовании факт - это значительно отставленное во времени повышение уровня дофамина у крыс КМ (по сравнению с Вистар) при прямых фармакологических воздействиях. Подобные эффекты, обнаруженные нами при введении амфетамина и раклоприда (воздействие на дофаминергическую систему), а также тиоперамида (воздействие на НЗ-подтип гистаминовых рецепторов и опосредованно - на уровень дофамина), ранее никогда не описывались. Такие же временные особенности реакции на введение данных препаратов характерны и для внеклеточного уровня ДОФУК.

Объяснение этих фактов следует, видимо, искать также в механизмах генеза судорожного припадка у крыс КМ. У животных этой линии длительная строгая селекция на аудиогенную эпилепсию, а также, видимо, перевод линии в инбредное состояние имели результатом формирование «крайнего» значения признака - почти мгновенного развития интенсивных тонических судорог всего тела и конечностей. В настоящее время судорожный припадок в ответ на звук развивается у крыс КМ практически сразу после включения звука, а фаза двигательного возбуждения сменяется судорожным припадком уже через 5-6 с после включения звука. У крыс Вистар, точнее у той части популяции животных этой линии, которые обнаруживают аудиогенную эпилепсию, а также у крыс линии WAG/Rij, также частично чувствительных к звуку, и латентные периоды начала приступа, интенсивность судорог, и изменения этого признака при внешних воздействиях имеют иные характеристики, чем у крыс КМ. По всей видимости физиологические и нейрохимические особенности линии крыс КМ связаны не только с измененным уровнем активности тех или иных ферментных систем, отвечающих за синтез нейромедиаторов, а с более глубокими нарушениями, затрагивающими функциональную реактивность нейронов. Любая из возможных трактовок полученных нами результатов связана с особенностями организации дофаминергической и/или гистаминовой рецепции в мозге. Это означает, что предположение о пониженной активности того или иного фер'мента синтеза или деградации нейромедиатора (дофамина и гистамина) явно не может быть принято в качестве единственного объяснения феномена. Такое объяснение недостаточно еще и по той причине, что у крыс КМ описапы другие нейрофизиологические и нейрохимические особенности, которые могут быть связаны с обменом катехоламшюв и гистамина лишь косвенно. Было экспериментально продемонстрировано, что у этой линии изменен ряд показателей активности мембранных процессов, в частности связанных с нерекисным окислением липидов (Копаладзе и др., 1974 Раевский и др., 1995, Вицкова и др., 1998).

Резкое замедление в развитии реакции (повышения уровией внеклеточного дофамина и внеклеточного гистамина) на введение амфетамина, раклоприда и тиоперамида.

обнаруженное у крыс КМ на сегодня не имеет прямого нейрохимического объяснения. Возможно, что подобная особенность организации нейромедиаторных систем у крыс КМ есть одно из проявлений тех врожденных аномалий, которые свойственны данной линии. Можно предположить, что экспозиция животного действию сильного звука, требующая быстрой мобилизации защитных ресурсов ЦНС в виде быстрого изменения физиологических процессов, препятствующих распространению патологического возбуждения по восходящим проекционным путям мозга (например, активация ГЛМК-ергических нейронов ствола), происходит у животных этой линии неэффективно (Косачева и др., 1998). Отклонения нейрохимических и морфологических характеристик ГАМК-ергических нейронов нижнего двухолмия от «средней нормы» подробно описаны у крыс ОЕРЯ и, видимо, свойственны и крысам линии КМ (КисЫп Ы а1., 1982; Жулин, Плескачева, 1991). Однако, как недавно было показано в ряде работ на других моделях судорожных состояний, запуск судорожного припадка и его прекращение определяются состоянием дофаминергической регуляции стриатума (Вмешай & Бераи1к, 2002). Аномалии в функции этой системы описапы в настоящей работе у крыс с высоким уровнем судорожной готовности, В целом, процессы распространения (генерализации) судорожного разряда. в мозге, требующие не только определенного дисбаланса нейромедиаторов (возбуждающие аминокислоты /ГАМК/ катехоламины), но и формирования цепей положительной обратной связи в нейронах ствола и переднего мозга, еще мало изучены. Возможно, что мгновенный «запуск» тонических судорог у крыс КМ при действии звука определяется аномальной реакцией на сверх сильный стимул именно со стороны нейронов стриатума. Нейрохимическим выражением подобной аномалии может быть резко замедленное повышение уровня дофамина и гистамина в ответ на стимулирующее фармакологическое воздействие.

Можно предположить, что повышенная возбудимость стволовых отделов мозга и низкий судорожный порог у крыс КМ связаны с дефицитом тормозной функции хвостатого ядра вследствие избытка дофамина в этом отделе мозга. Более высокий фоновый уровень дофамина в стриатуме крыс КМ возможно является проявлением адаптивной реакции мозга к пониженной чувствительности дофаминовых рецепторов у этой линии. Возможно, что в предрасположенности к аудиогенным судорогам могут играть патогенетическую роль не только фоновый уровень дофамина, но и чувствительность соответствующих рецепторов.

Таким образом, имеющиеся данные указывают на то, что у крыс линии КМ по сравнению с крысами линии Вистар не только изменены базальные уровни дофамина и гистамина, но и существенно изменены функции дофаминергической и гистаминергической систем, проявляющиеся в виде аномальных временных характеристик реакций на введение веществ-анализаторов.

Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что уровни норадреналина, дофамина и ДОФУК в мозге на высоте аудиогенного судорожного припадка были существенно выше значений, полученных у крыс КМ без звуковой стимуляции (Косачева и соавт., 1998). Возможно, что такие изменения могут объясняться дисфункцией других нейромедиаторных систем мозга, например, ГАМК-ергической.

Генетические исследования показали (Романова и соавт., 1976), что предрасположенность к аудиогенной эпилепсии у крыс КМ детерминирована полигенно, и что в пределах вариации исследованных линий крыс, аллели, определяющие нечувствительность к звуку являются доминантными. В приложении к данным, полученным в настоящей работе, это может означать, что один из генетических факторов, определяющих аудиогенную эпилепсию в данной лабораторной модели, может быть вызывать дефект развития мембранной (как ауто-, так и гетеро-) рецепторной системы дофаминергических и гистаминергических нейронов. Поскольку аудиогенная эпилепсия определяется полигенно, это означает, что этот дефект не может быть единственным, определяющим эту патологию. Полное развитие признака «аудиогенная эпилепсия» в том виде, как он проявляется у крыс линии КМ с ее нынешнем высокочувствительным статусом, определяется не только генетически детерминированной «слабостью» ГАМК-ергической системы, аномальным развитием дофаминергической иннервации стриатума, но, возможно, и с рядом других аномалий (например, с описанной в 50-е годы дисфункцией щитовидной железы). Иными словами, для проявления данного патологического признака требуется «вклад» и других генов.

В настоящей работе впервые описаны не только количественные межлинейные различия в содержании дофамина и гистамина, но и сильно выраженные различия в динамике формирования реакции ЦПС на фармакологические воздействия. Эти факты заставляют предполагать аномалию не только в генах, связанных с кодированием белков-ферментов обмена (синтеза/деградации) пейромедиаторных систем и белков-рецепторов, но в генетических элементах, выполняющих регуляторную функцию (факторах транскрипции). Такое предположение подтверждается данными задержанной во времени экспрессии гена су крыс этой линии после развития аудиогенного приступа (Акуличев и др., 1989).

Наличие у крыс КМ столь глубоких генетически детерминированных аномалий подчеркивает высокую ценность данной линии как генетической модели для исследования физиологических и нейрохимических основ судорожных состояний.

23

ВЫВОДЫ

1. Методом внутримозгового микродиализа показано, что базальный уровень внеклеточного дофамина и его основного метаболита ДОФУК в стриатуме у крыс линии КМ' достоверно выше (на 25 и 30% соответственно) этих показателей у нечувствительных к звуку крыс Вистар.

2. В тех же условиях продемонстрировано, что базальный уровень гистамина в стриатуме крыс линии КМ достоверно ниже (на 33,4%) уровня этого нейромедиатора у крыс Вистар.

3. Максимальный эффект фармакологических анализаторов (амфетамина, D2/D3 антагониста раклоприда и Ю-антагониста тиоперамида), проявляющийся в повышении уровня дофамина в стриатуме, у крыс линии КМ отставлен по сравнению с этим показателем у крыс Вистар (р<0.05).

4. У крыс линии КМ амфетамина, раклоприд и тиоперамид вызывают изменение уровеня гистамина в стриатуме достоверно в более поздние сроки, чем у крыс Вистар (р<0.05).

5. В условиях блокады НЗ-пресинаптических рецепторов тиоперамидом повышение внеклеточного содержания гистамина у крыс КМ отставлено по времени и менее выражено. по интенсивности по сравнению с аналогичных эффектом у крыс Вистар. -

6. Крысы линии КМ, обладающие очень высоким уровнем чувствительности.к звуку,, обнаруживают тенденцию к увеличению латентного периода начала припадка через два часа -после введения веществ анализаторов, т.е. в период максимального подъема дофамина стриатуме.

7. В основе предрасположенности крыс инбредной линии КМ к аудиогенной эпилепсии могут лежать: 1. измененный базальный уровень дофамина, гистамина;. 2. аномальная: чувствительность нейронных структур, участвующих в формировании судорожного припадка.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДОФУК - 3,4-дифенилуксусная кислота, МАО - моноаминоксидаза, ДАТ - дофаминовый транспортер

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Сорокин АЛ., Новоселов ИА, Афанасьев И.И., Кудрин B.C., Раевский К.С. Исследование возможного участия D1-подтипа дофаминовых рецепторов в механизме психостимулирующего действия сиднокарба и D-амфетамина. //Акт. пробл. нейробиол. "VITI Всеросс. школа мол. уч. (Казань, 24-26 сент. 2001 г.). Тез. докл. Казань: КГМУ, 2001. - с. 54.

2. Сорокин АЛ., Новоселов И.А., Афанасьев И.И., Кудрин B.C., Раевский К.С. Нейрохимические аспекты участия Dl-подтипа дофаминовых рецепторов в механизме психостимулирующего действия D-амфетамина и сиднокарба. //Мат. П Российской конф. мол. ученых "Фунд. науки и прогресс клия. мед.". Москва: РАМН, 2001, -т.2, стр.268-269.

3. М. Dvorkina, I. Novosyolofif, A. Sorokin, I. Afanas'ev., К. Rayevsky. Dl-dopamine receptor antagonist SCH23390 attenuates stereotyped behavior but fails to modulate psychostimulant-induced increase in extracellular dopamine in rat neostriatum. // ХХШ Cong, of Neuropharm. Montreal, June 24-27,2002. Abstr.

4. Сорокин АЛ., Кузнецова Г.Д., Влияние амфетамина на выраженность "пик-волновой" активности у крыс линии WAG/Rij. /УБазальные ганглии и поведение в норме и при патологии: VIII Межд. симп. (С-Пб., 29-31 окт. 2002 г.). Тез. докл. С. 44-45.

5. Sorokin A.Ya., Salonin D.V. Effect of D-Amphetamine on Spike-wave Discharges in WAG/RIJ Rats // Abstracts from the 25InL Epilepsy Congr. Lisbon 12-16 0ct2003, Epilepsia v.44, suppl.8,p.l43,2003.

6. A.Y. Sorokin, D.V. Salonin. Effect of d-amphetamine on spike-wave discharges in WAG/Rj rats // The WAG/Rj Model ofAbsence Epilepsy, Ed. G. van Luijtelaar, NICL Nijmegen, 2003,p.l47-151.

7. Сорокин АЛ. Влияние амфетамина и раклоприда на обмен дофамина в стриатуме (микродиализное исследование in vivo) // Тез. докл. XI межд. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004". (М., 12-15 апреля 2004 г.). Секция Биология, с. 148-149

8. Сорокин АЛ., Кудрин B.C., Клодт ILM., Туомисто JL, Полетаева И.И., Раевский К.С.. Межлинейные различия в эффектах амфетамина и - раклоприда на активность дофаминергической системы в дорзальном стриатуме у крыс линии КМ и Вистар (микродиализное исследование) // Генетика, 2004, том 40, № 6, с. 1-3

- 74 20

Подписано в печать 22.04.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 110 экз. Заказ № 86 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102