Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксина зеараленона

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксина зеараленона"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ Институт Молекулярной Биологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ Научно-Исследовательский Институт Курортологии и Физической

Медицины

На правах рукописи

УДК 616.127. 616-001. +577.12:577.151.63+611.36+543.87 + 771.74+576.8.097.29 Карагезян Мария Константиновна

Изучение молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксина зеараленона

Ч.00.03 - Молекулярная биология и генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1997

чизиизиъь ттгчьзпиэзиъ чьБпназппл.ьгь иааизьъ шты/ьи ит.Ь^пцш^й ^Ь0ишршйп1р]ш0 Ьйиифтпил

чизиизиъь тР1ГОЬ8ПИЭ311Ъ иПЛааЦТШПКЭЗиЪ ЪШи11ПиРМ03П1-Ъ Мгирпртшршбгир^й 1д 3)|1ц[1^ш1)шй Ч|тлшЬЬ1Лшчпи1ш1|шО _Ьйиш[илгпщ___

РОшярЬ ^рш^тОрт!

ЛНЗО 616.127. 616-001. + 577.12:577.151.63 + 611.36 + 543.87 + 771.74+576.8.097.29 МшршщпфшО 1Гшр[1Ш ^пС1Ллшйг|[10|1

п1ипи30ши11рп1р)п10[]

Ч.ОО.ОЗ-йп^пцш^й ^ЬбишршОгир^й и с^ЬОЬш^^ш

ЦЬйишршОшЦшй рЬЦОшйтЬ ч|ипщ1|шй штгфбшй

Ьш]дЬ1П1 штЬйш|ипипф1шО

иь чииаьр

ЬрЬшО-1997

Работа выполнена В Институте Молекулярной Биологии Национальной Академии Наук Республики Армения и Научно-исследовательском Институте Курортологии и Физической Медицины Министерства Здравоохранения Республики Армения.

Научные руководители

академик HAH РА Л.Л. ОСИПЯН, доктор биологических наук A.C. БОЯДЖЯН

Официальные оппоненты:

академик HAH РА М А ДАВТЯН доктор биологических наук Е.Б. БУРЛАКОВА

1 Ведущая организация - Кафедра Общей и Биоорганической Химии Ереванского Государственного Медицинского Университета им.М.Гераци. ■ Защита состоится $ июля 199? г. в 14ч. на заседании Специализированного Совета 042 при Институте биохимии им. акад. ГХБунятяна HAH РА (375014, Ереван, ул.Паруйра Севака 5/1J.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии им. ахад. ГХБунятяна HAH РА. -

JT ■■

Автореферат диссертации разослав июня 1997 г,

Уиюй секретарь Специализированного Совета ~ , дрхгор биологических наук, процессор / ' ААСЙМрНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 1'АЬОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее злободневных проблем ^одремешшй токсикологии является нешученность молекулярных механизмов патогенеза отравлений грибными ядами. С отмеченной точки зренш; особы!; интерес представляют пищевые отравления. ядами мшфоа;агл1Чйаа;х г;,;-;;.;:, рода Фузарпум, в частности, так называемым микотохешш;! зеараленопа.ч, ¡шляющимся крайне токсическим соединением, загрязняющим главным образом злаковые культуры. Природа патологических проявлений, формирующихся на фона поражений пищевыми контаминантамн, в том числе и микотокешшми различного профиля дейепшя, характеризуется мутагенными, тератогенными, гллергогешшмн. канцерогенными, нейротрогшыми и многими другими эффекташз, и том числе и различными расстройствами деятельности отдельных органов, систем и пнутрешюй среды организма (Осишад Л„ 1997).

Согласно статистическим указаниям многих американских, европейских,; африканских и азиатских стран (С1шБ1еп5еп С., 1979) большинство массовых, алиментарных токсикозов имеет в своей основе поражение пищевых продуктов пнкотоксино.м зеаралеионом (МиосЬа С. е1 а1., 1984).

Отдаленные результаты последствий тяяселых отравлений грибными едади не могут не коснуться пркчшшо-следстБешшх негативных сторон многих демографических отхланешш (Оащян Л.,' 1997) и ьспросов

устойчивости фактора человеческого разкгпа {Дзишельи К., 35££}.

Поскольку зсараленон, предстай^кшры се>Сгй лс^хтсл резарциловой глгелоты, является производным гормонов-эетрогеиоз, то было бы логичным предположить сходство в эффектах указанных соединений на организм Человека и животных, б частности, в плаце иитеисификаци процессов анаболизма катехоламииов (Рапек е1 а!., 1986). При этом уместна попытка 1штерпретиросап> проявляющийся эффект в свете современных представлений по принципиально позым закономерностям взаимодействия биологических объектов со саеихмалыми дозами биологически активных соединений {Бурлакова Е., 1994). 1С соячплошао, по сей декь остаются мало освещенными молекулярные !;.-\анилш шюгоиеза токсических поражений зеараленоиом п отиотсиин <. !н ¡и'.есксло аппарат, ^ частности процессов экспрессии

тггрсзнпгидроксплази и дофадекарооксила-ш {Фетисов С., 1994), а также отклонений метаболизма липоидов lui уровне хроматина и ядерной мембраны чимоцптсг» (Кулагина Т., 1904). В связи с этим отсутствие сведений об эффективности иншбиругощего действия соответствующих антител как высокоспецифнческих, полуфункцнональных блокаторов значительно затрудняет поиск эффективных мер борьбы с этим недугом. В подобной постановке вопроса назревает необходимость изучения особенностей расстройств метаболизма тех важнейших биологических систем клетки, которые ответственны за бесперебойность функционирования механизмов транспорта веществ внутрь клетки н из нее во внеклеточное пространство. Находясь в постоянной зависимости от функционального состояния нейроэндокринного аппарата, в частности от настроя катехолашшобразовательных процессов (Winkler H. et al., 1986; Schwarzenbrunner U. et al., 1990), конечные эффекты зеараленоновых отравлений характеризуются, подчас, необратимостью нейропаралитических проявлений и гибелью организма, во многом обусловленной концентрацией поступившего в него яда. Последней придается важное значение в изменениях активности ферментных систем и индивидуальных белков типа медьсодержащего белка кислой природы (Helle К., et al., 1978),. участвующих в биосинтезе катехоламинов, главным образом видоспецифичкской дофамин-ß-монооксигеназы (Bon S. et al., 1991), катализирующей, как известно, процесс гидрокислирования дофамина с трансформацией его в норадреналин (Scotland T. et al., 1979; Winkler H. et al., 1986; Stewart L. et al., 1988; Schwarzenbrunner U. et al., 1990). Глмкопротеидная природа фермента (Scotland T. et al., 1979) не подкреплена до сих пор дополнительной научной информацией относительно характера комплексования входящих в его строение маннозы, галактозы, N-глюкозамина и сиаловых кислот с молекулой белка, помимо известной глюкозидной связи между этими углеводами и амидными группами (Wang N.. et al., 1990; Wong D., et al., 1990).

Из существующих двух разновидностей дофамин-р-монооксигеназы -растворимой (цитозольной) и мембраносвяэашюй, особый интерес возбуждает последняя (Бояджян А., 1996; Петросян С. Ам„ 1996; Погосян А.. 1996), отличающаяся известным урош. ,-м гидрофобности, обусловленной присуствием

о ее строении гидрофобного белка, состоящго из 22 аминокислотных остатков способствующего его трошюсти к мембране хромаффннных гранул (Fukada ' et al., 1994). С другой стороны, отмеченное сродство фермента к мембран {Gibson К. et al., 1993), по всей вероятности, обусловлено также обнаруженным в структуре фермента кислыми и нейтральными фосфолшшИдами ( Saxena А. < et, 1983; Stewart L. et al., 1988) среди которых фосфотиднлсаршшм придает« Езрпостеяе;п;ог аначение (Taylor С. et al, 1989} как наиболее активные реализации ассоциативной связи между ферментом п мембран: хромаффннных гранул. Следовательно, делипиднзация мембран, достигаем, хлороформ-метаноловой экстракций фосфолилидов мембран, сопровождает инактвацией фермента (Saxeaa А. et а!., 1983), лкпидзавнсимость которо потдверждается развивающимся при этом нарушением фнлогеиеткчгс стабилизированного постоянства качественного набора и количественно содржания фосфолипидов в данной биологической системе. В. ахкумулнрозак а. трансформации энергии в биологических мембранах (Скулачеа В.,. 5969, 197 реализации высоких уровней энергии взаимодействия природных (Храпоаг 108!) и синтетических аптиоксидаатов с перекиспыми радикалами .(Гаркшзг Т., 1979; Храпова Н., 1931; Бурлакова Е., 1694; Салганик P., 1S94; Донченко Г др., 1982, 1983, 1985 а, б) и, наконец, в обеспечении физиолошчео активности клетки в целом (Крапе Е.,1967, 1981; Бурлакова Е. и др., 1981, 198' б) исключительно важна бесперебойность процессов трансмембранн переноса веществ и синхронность в функционировании мембранносвизанн Л1' идзависнмых протеинов - ферментов и рацепторних белков.

Вышеизложенное акцентирует неизбежность изучения • особенное вредоносного действия мнкотоксина зеаралепопа на функциональное состоя важнейших субклеточных образований головного мозга, печени - митохонд; микросом, их наружных и внутренних мембран, а также мембран эритрощ к лимфоцитов как важнейших показателей состояния функции хроветворе: иммунологической, антиоксидантной реакции и гипоксического состоя организма (Донченко Г. и др., 1982, 1983, 1985 а, б; Капралов А. и др., 1994). всей вероятности, расстройства в отмеченных сферах жизиедеятелыгосп различных уровнях организации клетки, молниеносно' разыгрывающие»

е

фоне зеараленоновых отравлний, выступают и роли главного патогенетическою фактора в быстром назревании необратимых нарушений с летальным исходом.

Цель п основные задачи исследопания Принимая во внимание -паралитическое действие токсикозов различной природы, в частности отравлений грибными ядами, на структурно-функциональное состояние живой клеткй, интенсивность течения в них жизненно важных биохимических и молекулярно-биологическнх процессов, обуславливающих бесперебойность функционирования систем трансмембранного переноса веществ, транедукцин внешнего сигнала внутрь клетки (Ре1есЬ Б. е1 а1,, 1989; Асатрян Л„ 1993; Тадевосяк Ю., 1996) и аффинности рецепторов к своим лигандам, мы' задались целью проведения специальных исследований. Они в основном развивалсь в

■ ■ ^ I

направлении изучения особенностей нарушения качественно-количественных показателей метаболизма фосфолипидов в мозговой, печеночной тканях, эритроцитах и лимфоцитах белых крыс в различные сроки отравления микотохсипом зеараленоном. Вместе с тем преследовалась также цель по, изысканию наиболее эффективных мер борьбы с последствиями метаболических нарушений в направлении интенсификации свободрорадикальных реакций, развивающихся на фоне интоксикации (Салганик Р. и др., 1994), и обеспечению нормализации расстроенных сторон метаболизма фосфолипидов. Особое внимание будет уделено .некоторым аспектам молекулярно-клеточной регуляции дыхательной функции митохондрий (Корнеев А. и др., 1994; Элбахидзе Г, и др., 1994).

Для осуществлния отмеченных целей были запланированы следующие, 'задачи настоящего исследования по изучению;

-эффектов зеараленона на активность дофамин-р-моиооксигеназы, ее физико-химических свойств, количественных изменений катехоламинов в мозговом слое надпочечников;

-динамики активности дофамин-р:монооксигеназы в хромаффинных . гранулах мозгового слоя надпечечников при действии зеаралено.на;

-сдвигов структурно-кинетических параметров электрофоретически гомогенных препаратов цитозольной и мембраносвязанной форм дофамии-р-монооксигеназы при зеаралоиоьоных отравлениях;

-методов получения полинеспецифичесхих аНгител к зоараленоиу и использования их с целью нейтрализации признаков отравления;

-особенностей нарушения обмена фосфолипидов, приводйщего к их качественным и количественным изменениям, расстройств сдвигов интенсивности течения реакций свободнорадикального окисления липидов в митохондриальной и микросомальной фракциях мозговой и печеночной тканей, в наружных, и внутренних мембранах этих образований, равно как и в мембранах эритроцитов и лимфоцитов при зеараленоновом токсикозе;

-природы токсических эффектов зеараленона в формировали срывов резистентности этитроцитов к перекисному гемолизу, .

-роли зеараленона в патогенезе нарушений процессов окислительного фосфорилирования а митохондриальной фракции головного мозга и печени;

-специфики нивелирующего действия тиосульфата натрия на метаболические нарушения фосфолипидов в отмеченных образованиях клетки и роли этого антиоксиданта в нормализации фосфолияд-фосфолипидных взаимоотношений и лимитировании интенсивности .течения процессов свободнорадикального окисления липидов в различные периоды зеараленонового отравления; -

-токсического действия зеараленона на процесс фиксации кислорода, реакцию этерификации неорганического фосфата и изменения величины коэффициента Р/О в митохоцдриях исследованных тканей и нормализующих ■ эффектов свободного этанолашша, этаноламиифосфата й фосфатидилэтаноламина. V

Научная новизна работы. На основании результатов впервые предпринятых фундаментальных исследований по изучению молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксина зеараленона в эксперименте на белых крысах представилась возможность выявить и ..интерпретировать следующие феномены, касающиеся конкретных вопросов фосфолипидного метаболизма на уровне субклеточных образований, их наружных и внутренних мембран мозговой и печеночной тканей, а также мембранных образований эритроцитов крови и лимфоцитов" селезенки. Установлены :'

■ -стимулирующее действие зеараленона на активность фосфолипазы Аз с интенсифик. дней процессов деацилирования мем^ тносвязанных'

фосфолипндоп, сопровождающихся выходом значительных концентрами лизофосфатидилхолинов, неэстерифицированных жирных кислот полиеноиог-ряда, интенсивно вовлекающихся в реакции свободнорадикальцого окисление как в неферментативной (аскорбат-зависимой), так и ферментативной (ЫЛОР.Н-зависимой) системах окисления;

-стимулирующее действие зеаралекона в дозе 1-15 мкг/мл на реакции катехоЛаминобразования и, наоборот, ингибирующее влияние его более высоких концентраций на отмеченный процесс, реализуемые через молекулярные изменения активности дофамин-р-монооксигеназы, катализирующей реакцию гидроксилироватш дофамина с образованием норадреналина, метилирующегося в адреналин;

-взаимосвязь и взаимообусловленность между активированием процессов биосинтеза катехоламииов, высокие уровни которых способствуют активации реакций деацилирования фосфолипидов при участии фосфолипазы Аг с развитием мембранотоксических и мембранолитических эффектов, обусловливающих гибель данной биологической системы и организма в целом;

-метаболическая связь между нормализующим действием свободного этаноламина, этаноламинсодержащих эфиров и фосфатидилэтаноламинов в упорядочении реакций окислительного фосфорилирования в митохондриях мозговой и печеночной тканей в развитии зеараленонового токсикоза;

-патогенетическая роль срывов в резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу как одному из решающих тревожных факторов, ведущих к необратимому наступлению летального исхода.

Практическое значение работы. Факт чрезмерного развития интенсивности течения реакций свободнорадикального окисления липидов на уровне исследованных биологических систем клетки под действием микотоксина зеараленона послужил основанием к испытанию эффектов тиосульфата натрия на фоне отравлений зеаралеп 'ном различной продолжительности. Полученные результаты по степени своей выраженности и эффективности убеждают в необходимости неотлагательной рекомендации использования тиосульфата натрия как мощного ангиоксиданта при данной паюлогшг. Согласно проведенным наблюдениям тиосульфат натрия оКашвает наибтее демонстративно проявляющее-! Гпагмгнорпое лейемше при

■ Использовании его в первые 2 часа зеараленонового отравления. Более того, 'введения зеараленона экспериментальным животным, предварительно .инъецированным тисульфатом натрия, характеризуются полнейшим

; нивелирбванием признаков зеараленонового токсикоза, что проливает

! .

существенный свет на понимание молекулярных механизмов нормализующего Действия тиосульфата натрия на биологические системы клетки, ответственные 'Ц/физиологичиосгь его функционирования.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать тиосульфат натрия к (широкому исйользованию в качестве весьма эффективного и перспектйь.юго лечебного фармакопейно принятого препарата при токсикозах различного происхождения вообще и зеарал°ноновых отравлениях в частности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: -формирование молекулярных механизмов токсического действия зеараленона на физико-химические п функциональные свойства дофамин-р-монооксигеназы и в связи с этим, особенностей хатехоламинобраэовательной функции организма;

-эффекты .зеараленона в изменениях качественного спектра и количественной) содержания индивидуальных фракций фосфолипидов, суммы их нейтральных и кислых представителей, фосфолипид-.фосфолипидных взаимоотношений в различных клеточных образованиях мозговой и печеночной тканей, а также в эритроцитах и лимфоцитах селезенки;

-стимулирующая роль зеараленона в интенсификации реакций своб.\днорадикалыюго окисления липидов и понижении резистентности эритроцитов к перекисиому гемолизу;

-значение тиосульфата натрия как мощного соединения антиоксидантного действия в нивелировании зеараленонового отравления, упорядочении и поддержании филогенетически стабилизированного постоянства фосфрлипид-фосф'олипидных взаимоотношений на различных уровнях организации клетки;

/¿•(Юль свободного этпноламина, этаноламинфосфата и фосфагилилуганоламина ' в -.нормализации процессов окислительного фосфорилироваиия в митохондриалытой фракции исследованных тканей -в условиях зеараленоновых отравлений. ■ •

Структура диссертации. Диссертация представленна на 123 страницах русского текста, состоит из оглавления, введения, 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка цитированной литературы (159 русских и 131 иностранных источников), 34 рисунков и списка использованных сокращений.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Иследования проводили на 260 белых крысах-самцах, массой 180-200 г., содержавшихся на стандартном пищевом рационе. Животных, предварительно ' голодавших в течение 12 ' ч. , умерщвляли декашггированием под легким ' эфирным" наркозом. Изоляцию исследованных тканей, их субцеллюлярных образований и мембран производили в максимально сжатые сроки на холоду.

Отделение лейкоцитов селезенки производили центрифугированием клеточной суспензии в градиенте плотности фикол-400 - верографин (Воунш А., 1968).

Фракционирование MX, МС, ММХ и ММС осуществляли методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Арчаков А. и др., 1968).

По. .учение, очистку и идентификацию МЭ реализовали использованием метода осмотического шока (Limber G. et al., 1970). Выделение ХГ (Hoffman P. et al., 1976) из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота производили в холодных условиях, а их хранение обеспечивали при -20°С

Активность ДБМ определяли (Kuzuya Н. et al., 1969) в инкубационной смеси, содержавшей.20 мМ ТА (субстрат), 10 мМ аскорбата или ферроцианида (доноры электронов), 20 мМ фумарата, 5-100 мкг фермента в 10 мМ Na-; ацетатного буфера при 37°С, рН 6,0 в течение-30 мин. Реакцию останавливали с помощью 4 N раствора гидрата окиси аммония, добавление которого в контрольную пробу производили перед внесением в среду соответствующих субстратов. По завершении центрифугирования к надссадочной жидкости прибавляли 2% расгвор периодата натрия с целью окисления образующегося в . надосадочной жидкости Окси-ТА в ОБА, а, остаток его нейгралтопали

введением в среду 10% раствора метабисульфата натрия и приступали к регистрации удельной активности ОБА в мкМ при 330 нм.

Изучение кинетики реакции образования продуктов гндроксилирования, катализируемой ДБМ, строилось на регистрации в каждые 5 мин оптического поглощения при 230 нм в присутствии фермента и донора электронов. Применение прямого метода регистрации кинетических характеристик в виде спектрального определения понижения характерного для аскорбата уровня оптического поглощения при 330 им (Scotland Т. el а!., 1980) основывалось на использованных двух субстратах - ДА и ТА.

В экспериментах по изучению токсических эффектов ЗН на активность ДБМ производили инкубацию фермента с ядом, предварительно растворенным в течение 10 мин. при комнатной температуре в 40% растворе этанола.

Изолирование рДБМ и мДБМ осуществляли согласно методике, предложенной Бояджян А. (1996).

Определение содержания меди в препаратах белка и ЗН проводили спектрофотометрически (Matsuba Y." et al., S970), количества белка - по Lowry О., et а!. (1951), уровня КА - флюорометрически в сочетании-с использованием метода колоночной хромотографии на окиси алюминия (Матлина Э. и др., 1967).

О гомогенности AT к ЗН судили по идентификации единой белковой полосы на электрофореграмме с использования 7,5 % ПААГ (Davis В., 1964). ТСХ синтезированных производных ЗН производили методом двумерной хроматографии на силуфоновых пластинах (5 х 15 см) в следующих системах растворителей: 1) пс-тролешшй эфир - диэтиловый эфир (90:4), 2) петролейный эфир - диэтиловый эфир - муравьиншя кислота (80:20:2) с проявлением пятен в насыщеньтх парах йода.

Наличие реакции антиген - AT констатировали ' по изменению относительной интенсиновчости рассеянного света, согласно уравнению Р0'С,М.С. (Кантор Ч. и др., 1984), где Р„ - относительная интенсивность рассеянного света. К - коэффициент преломления, М - молокуляршмя масса, С концентрация реагирующих веществ, а определение содержания образующггося комплекса проводили снсктрофотомстричоскп с учетч КМЭ |Л'•,,„, 13.5).

Количественное определение эндогенного а-Т производил;! снектрофлгоорометрически (Duggan D., 1959), перекисей липидов - с помощью тиобарбитуратспсцнфической реакции (Владимиров Ю. и др., 1972).

Экстракцию фосфолипидов из исследуемого материала проводили трехкратно с помощью хлороформ-метаноловой смеси в объемных соотношениях 1:2, 1:1 и 2:1 (Folch J. et al., 1957) в модификации (Карагезян К., 1972),

Фракционирование ФЛ достигалось методом одномерной восходящей хроматографии в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-метгнол-копцентрнрованный аммиак (65:35:5). Разделение МФИ, ДФИ и ТФИ проводили в системе растворителей хлороформ-метанол-концентрированная серная кислота (200:100:1) с использованием в качестве свидетелей чистых стандартов, производства " SIGMA" (США).

Определение уровня поглощенного кислорода производили манометрически в аппарате Варбурга, а степени этерификации НФ - по убыли его количества из инкубационной среды.

Введение свободного Э, ЭФ и ФЭ в инкубационную среду.осуществляли в концентрациях, колебавшихся в пределах 0.04-0.05 мкМ/проба.

Раствор ЗН (1 мл) в концентрации 1-15 мкг/мл, приготовленный на 40% растворе этанола, вводили внутривенно в место слияния верхней полой и подключичной вен (Angulus venosus), а ТСН в том же объеме 10% водного раствора вводили однократно в виде внутриперитоиеальных инъекций.

Обработку фактического цифрового материала производили с использованием критерия вариационной статистики в системе Стыодента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали проведенные исследования, активность ДБМ в гомогенатах мозгового слоя надпочечников в присутствии ЗН значительно возрастает, при этом синхронно понижается содержание ДА и возрастает количество НА и А. На рис.1 показана зависимость удельной активности ДБМ от концентрации ЗН, а на рис.2 сравнены уровни отмеченных КА в контрольных и

подвергнутых воздействию ЗН образцах. Как г, иди о из представленных данных, ЗН эффективен как активатор ДБМ в концент рации 2-7 Мкг/мл.

Рис.1 Зависимость активности ДБМ (мкмоль/мин/мг) опт концентрации ^Н (1-11 мкг/мл)

По всей видимости, ЗН воздействует на интенсификацию процессов анаболизма КА за счет активации ДБМ на стадии биосинтеза НА.

93 !

:В2

Рис.2 Эффект ЗН (2) на уровень ДА, НА и А

в мозговом слое надпочечников и в контроле (1).

Следовательно, результаты наших экспериментов на примере ЗН в определенной степени проливают свет на современное понимание возможных механизмов активирующего воздействия эстрогена на отдельные папы метаболизма КА.

Как видно из данных рис.3, активирующий эффект ЗН особенно отчетмгоо наблюдается при концентрации этого токсина а 2,5 мкг в 1 мл.

ь ис.З Воздействие ЗН { 0,5-2,5 мкг/ил) на удельную активность ДБМ (мкмоль/мин/мг) в ХГ.

Таким образом, можно утверждать, что стимуляция ЗН процессов анаболизма КА в определенной степени обусловлена его активирующим воздействием на лимитирующую стадию этого процесса, катализируемую ДБМ.

На рис.4 представлены значения удельной активности мДБМ и рДБМ.

44

40

35 ....

30

25 V

20 пвде. 1-

15

10

5

0

ш

Щ-

мДБМ

г'.<

о

.

ак

П1

□ 2

рДВМ

Рис.4 Воздействие ЗН на удельную активность мДБМ и рДБМ в мкМ/мнн/мг. Примечание: К - контроль, 1,2 - ЗН в дозе 5 и 20 мкг/мл, соответственно.

Изучение молекулярных механизмов участия ФЛ и регуляции систем респираторной функции митохондрий заслуживает особого внимания. Важность филогенетически стабилизированного постоянства качественного набора и количественного содержания ФЛ, специфичных для конкретной биологической системы (Крене Е., 1981), возбуждает живой интерес к выявлению на фоне отравления ЗН особенностей изменений ФЛ-ФЛ соотношений в ММХ и МЭ, сдвигов интенсивности течения в них процессов СРО липидов, состоять. РЭПГ, динамики количественных изменений в плазме крови а-Т и проявлений аптиоксидантного действия ТСН на этом фоне.

Как явствует из рис.5 А, Б и В эффект ЗН сопровох<дается чувствительными отклонениями в ММХ головного мозга СФЛ за счет уменьшения как СНСГА, так и СКФЛ, приводящего к пропорциональной убыли их процентного содержания в СФЛ, которое никак не отражается на величине-К СНФЛ/СКФЛ. Отмеченный факт подчеркивает важность имеющей место максимальной мобилизации компенсаторно-приспособительной функции организма, направленной на обеспечение в экстремальных условиях его существования не абсолютных уровней этих соединений, а существующего в норме статуса ФЛ-ФЛ соотношений. Как выясняется, в последнее время отмеченному фактору придается особое значение в регуляции функциональной активности мембраносвязанных ферментов и рецепторных белков.

Отмеченное нами многократное увеличение в ММХ головного мозга уровня ЛФХ под действием ЗН указывает на механизм. его возникновения, обусловленный, по всей вероятности, повышением активности фосфолипазы А2, что заслуживает специального исследования. Достойно особой отметки также количественное уменьшение в ММХ головного мозга ДФИ, ТФИ и ФХ как инициаторов функционирования фосфошгозитидного и фосфатидилхолинового циь1\ов (Ре1есЬ Б. е1 а1., 1989), известных высоким уровнем чувствительности к

V

веществам токсического денствия, возможно, и к ЗН.

Рис.5 Качественный спектр я количественное содержание ФА (мкг липидного фосфора/г влажного остатка ММХ) в ММХ головного мозга в контроле (1<>, при действии ЗН (15 мкг/мл) - 1 н ТСН (1 мл !0% р-ра) - 2 па этом фоне. А-Н.ФЛ. Б-КФЛ, В-СНФЛ, СКФЛ, СФЛ. Примечание: " - степень достоверности по .¡пюшеншо к контролю; п - по отношению к дгйсгвшо ЗН;

' (0,001 <р<0,01).

Для МЭ, как это продемонстрировано на рис.6 А, Б и В наиболее демонстративным является резко выраженное увеличение уровня ЛФХ и, в отличие от ММХ, возрастание содержания ФК и КЛ, что, по-видимому, свидетельствует о необходимости специального изучения указанных КФА в условиях отравлений ЗН, как факторов, наделенных функцией активаторов трансмембршного переноса веществ, возможно, и кислорода. Интенсификация процессов деацилнрования ФЛ приводит к повышенному выходу нь только ЛФХ, но и НЭЖК, преимущественно полиеновых, вовлекающихся в реакции перехисеобразования в качестве субстратов окисления. Это обычно происходит при развивающемся дисбалансе между про- и антиоксидантными системами в пользу первых при отчетливо проявляющемся ослаблении систем антирадикал!,кой згщиты клетки, в которых роль а-Т вряд ли можно переоценить.

Таким образом, становится очевидной вредоносная роль отмеченной тройки - ЛФХ, НЭЖК и липидных перекисей, характеризующейся выраженными детергентными свойствами в виде мебранотоксического и мембранолитического действия. В связи с отмеченным интерес представляют результаты по токсическому действию ЗН на изученные стороны мшидного метаболизма и эффектам ТСН при этом.

Полученные результаты свидетельствуют о значительном падении РЭПГ в ' •"ловиях действия ЗН, проявляющемся в виде существенного повышения процентного выхода гемоглобина из Э, что развивается параллельно отмечающемуся понижению содержания эндогенного а-Т в плазме крови. Предпринятое т фоне действия ЗН изучение эффектов ТСН позволило проследить следующие закономерности. Однократное внутрибрюшинное введение 1мл 10% р-ра ТСН (100 мг) после 2 ч экспозиции ЗН приводило » бь^тро развивающемуся упорядочению ФЛ-ФЛ соотношений в ММХ и М' (рис.5, 6), нормализации качественного набора и количественного содержание ФЛ в них, - лимитированию интенсивности течения реакций СРО липидов ; пределах физиологических показателей, установлению уровня эндогенного а-' в нлазме кррви и существующего в норме статуса РЭПГ (рис.7 А. Б, В), что и

Рис.6 Качественный спектр и количественное содержание НФЛ (А), КФ (Б), С НФЛ, СКФЛ И СФЛ (В) (мкг лшшдиого фосфора/г влажных МЭ) п М: контроле (К), при действии ЗН (15 мкг/мл) - I и ТСИ (1 м\ 10% р-ра) - 2 п.: • фоне. Примечание: см. рис. 5.

целом демонстрирует ярко выраженное антиоксидантное, нормализующее действие ТСН.

Рис.7 Интенсивность течения процессов СРО липидов (по выходу МДА, нмоль/мг белка) во фракциях MX мозговой ткани в аскорбатзавнсимой (I) и НАД.Н-зависимой (И) системах переокисления (А); динамика содержания эндогенного а-Т (мг %) в плазме хрови (Б); РЭПГ {%) (В) в контроле (К), действии ЗН (15 мкг/мл) - !, и ТСН (1 мл 10% р-ра) - 2 на этом фоне. Примечание: см. рис.5.

Выявление молекулярных механизмов токсических эффектов микотоксннов на иммунологический статус организма и изыскание результативных путей по нивелированию и коррекции этгос нарушений представляет существенный академический интерес, имея также важное прикладное значение.

Недостаточность научной информации относительно специфики взаимосвязи и взаимообусловленности между метаболическими отклонениями ФЛ п МЛ и '."х рсцегггорной функцией называет жирой интерес к этой

проблеме, современное понимание которой немыслимо без учета главенствующей роли системы вторичных мессепджеров, ■ проявляющейся при инициации и дальнейшем активировании фосфоинозитидного я фосфатидилхолипопого циклов (Ре1есЬ Б. е1 а1„ 1989). Мгновенно совершающиеся пертурбации в сложных перепитиях метаболизма мембранных образований, например, а катализе реакций дгацилирования-реацнлированпя мембранных ФА (Каратезяи К и др., 1986; Тадевосян Ю. и др., 1937} Батакян Т., 1989; Асатрян Д., 1993), являются лидирующими в реализащга постоянно совершающейся трзнедукция внешнего сигнала внутрь клетки, обеспечения ¡голноцепности ее функционирования и жизнедеятельности в целом.

Как вытекает из данных, отраженных па рис.б,: эффекты ЗН сарактернзукугся чузстаятелышм уменьшение!! содержания СФЛ в МЛ, •лагныи образом за счет убыли количества основных НФЛ - ФХ, ФЭ, СФМ и фопкопологшо направленных едзигоз уровней КФЛ • МФИ, ФС, ФК и КЛ,. абсолютное содержание которых значительно уступает таковок/ НФЛ. Весьма геезидио, что столь демонстративные изменения ФЛ-ФЛ соотношений, шзнвающнеся под действием ЗН, характеризуют новый, неестественный тип Е>Л окружения протеинов МЛ и создают таким образом услозпя, вызывающие геобратштй дксонанс в их функциональной активности.

Ркс.8 Динамнха количественных изменений СНФЛ, С КФЛ СФЛ (в ихг шндного фосфора/г сухого остатка МЛ) в МЛ селезенки белых крыс в иггроле (К) через 1, 2, 3, 4, 5 ч после однократного внутривенной введения ЗН 5 мкг/мл).

Мц надеемся, что предпринятое нами исследование в направлении •изучения молекулярных механизмов развития интоксикаций различного происхождения, в частности при отравлениях грибными ядами (Карагезян М. И _др„ 1990; Кагадеигуап М. е! а1., 1991) послужит делу дальнейшего ,совершенствования поисков новых, более эффективных путей по предотвращению, нивелированию и нормализации последствий изученных токсикозов, разыгрывающихся в результате отравлений различными : мшсотоксннами.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Молекулярные механизмы токсических эффектов микотокснна зеараленона обусловлены его дозозвисимым воэдествием на процессы анаболизма катехоламннов, реализуемые через дофамин-р-монооксигеназу, преимущественно ее мембраносвяза1шую форму, катализирующую реакцию трансформаци дофамина в норадреналин.

2. Патогенетические прояпленя Jpeдoнocнoгo действия зеараленона на уровне мембранных образований различных органов и систем организма характеризуются глубиной развивающихся в них нарушений филогенетически стабилизированного постоянства фосфолипид-фосфолипидных взаимоотношений.

3. Отравления зеараленоном сопровождаются интенсификацией реакций деацилирования мембраносвязанных фосфолипидов с выходам высоких концентраций лизофосфатидилхолинов н неэстерифицированных жирных кислот полиенового ряда, как результат возрастания активности фосфолипазы Аг.

4. Зеараленоновая интоксикация сопровождается чувствительным активированием свободнорадкальных процессов в исследованных клеточных образованиях как в неферментативной, так и в ферментативной системах окисления липидов.

Интенсификация процессов перекисеобразовакия при изученной патологии наиболее отчетливо проявляется в виде чувствительного понижения резистеш :ости эритроцитов к перехисному гемолизу как наиболее

тревожного патогенетнчекого фактора в реализации летального исхода, а' также глубокими растрэйствами дыхательной функции митохондрий и течения в них процессов окислительного фосфоршшровапия. 5. Применение тиосульфата натрия как in vitro, так и in vivo, оказывает мощное" нивелирующее действие ш развивающиеся при изученном токсикозе расстройства метаболизма фосфолшидов, дыхания, реакций окислительного фосфорнлировакия. Это приводит к быстро развивающемуся восстановлению качественного набора и количественного содержания фесфолзшпдов в исследованных биологических системах. и упорядочению в ппж отиччеттх окислительных процессов. 3. Благстаорныв эффекты тиосульфата патрил оказываются наиболее

дсясистратипними в первые два часа зеараленопового отравления, ■7. Токсический эффект зеараденона полностью предотвращается па фоне

предварительно введенного тиосульфата натрия, 0. Результаты экспериментальных исследований по нормализующему действию тиосульфата натрия позволяют рекомендовать его з качестве эффективного антитоксического средства вообще и зитнэеараленогозого отравления в частности.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

(Х-Т альфа-токоферол

А адреналин

М дофамин

ДБМ дофамнн-р-монооксигеиаза

ДФИ дифосфоинозитиды

жк жирные кислоты

зн зеараленон

КА хатехоламипы

КА кардиолнпипы

ш кислые ФЛ

л лейкоциты

ЛФХ лизофосфатмднлхол1пгь5

\\А - малононый диальдегнд

■ДЬМ - мембранная ДБМ

НА - мембраны лейкоцитов

ММС - мембраны микросом

ММХ - мембраны митохондрий

МС - микросомы

МФИ - монофосфоинозитиды

ДФИ - дифосфоинозитиды

ТФИ - трифосфоинозитиды

МХ - митохондрии

МЭ - мембраны эритроцитов

НА - норадреналин

НФЛ - нейтральные ФЛ ■

НЭЖК - неэстерифицированные жирные кислоты

рДБМ - растворимая ДБМ

РЭПГ - резистентность эритроцитов к перекисному гемолизу

СКФЛ - сумма .С.ФЛ

СНФА - сумма НФЛ

СРО - свободнорадикалыюе окисление

СФЛ - сумма ФЛ

СФМ . • сфингомиелины

ТА - тирамин

ТГ - тирозингидроксилаза

ТСН - тиосульфат натрия

ФК т фосфатидные кислоты

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерины

ФХ - фосфатидилхолини

ФЭ - фосфатидилэтаноламины

ХГ - хромаффинные гранулы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТОМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Î. Карагезян М.К., Осипяи Л.Л., Еопджян АС., Карагезян К.Г. Зеараленон как ингибитор активности дофамцп-р-монооксигеназы // Тез. докл. МШ научно-тех ко1гф. молод, уч-ых и спец. - Ереван - 1930. - С.65

2. Karageuzyan М.К., Boyajyan AS., Hovsepyan L.L, Karageuzyan K.G. Interactions oi Zearalenon with, dopamine-ß-monooxygenase // Abstract fer EUROTOX Congress. - Maastricht, The Netherlands. - 1991. - P.172.

3. Karageuzyan M.K., Boyajyan A.S., Osipyan L.L., Karageuzyan K.G. DcpnuntBö-p-monooxygenaso as a target ior mycotoxin zeare'er.on nction // Abs tract for fe 10-the Meeting cf Europ. Soci. for Neurocherairtry. - JerataÎDa; Irrcel - 1P3Î. -P.S 57-С.

4. Эффекпд микотоксина зсараленона из фссфолнт^-фссфсл^идшге соотношения и интенсивность течегшя процессов c::c,eo,\':o^.\-yrri.v..r.cro 'окисления липидое в мембранах эритрэцптоз беспородных белзг* хрнс // Тез, докл. V-oro съезда Армянского физиологического общества. - Ey îss.'ï, РА - 1994. - С.44.

5. Карагезян М.К., Боядезт A.C., Осипяи Л.Л., Карагезян К.Г. Зе«?а*'гтоя активатор дофамнн-р-моноокснгеназы // Докл. РАН. - 1995. - 7.2 îî. N J. -С.113-П4.

5. Карагезян М.К., Овсепян Л.М., Овакнмяи С.С., Бояджян A.C., Осипяи Л.Л., Карагезян К.Г, Мпкэтоксшг зеараленон как инициатор процессов свободтгорадикалыгого окисления липидав в митохондривльпои и мпхросомалыгой фракциях нечепн белых крыс // Докл. РАН. - 1995, • Т.341, N 2. - С.259-262.

7. Карагезян М.К., Овакимяп С.С., Овсепян Л.М., Бояджян A.C., Осипян Л.Л., Карагезян К.Г. Молекулярные механизмы токсического действия мнкотоксина зеаралг-иотп на метаболизм фосфолипидов, процессы перехис^обрагопаппя п м'.т.бранах i ипохондрий головного мозга и эгптрсцчтоя, pc-t:CTi:-îiT"0CTb "•ослсдиях к 1тер-?кнспому гемолизу у баи г: крмс и эффекты т^пгуль'Ь .та натрия на этом фея«? // Докл. РАН. • 1095. -Т.341, N 3. - С.40Я-4И.

8. Karageuzyan K.G., Pogosyan A.Yu., Sekoyan E.S., Zakharyan A.R., Karageuzyan M.K., Osipyan I,.L, Boyajyan A.S. Molecular mechanisms of oxidative stress in pathogenesis of raycotoxin zearalenon-induced toxic effect in rat brain tissue // Abstract of the I-st Conference for Armenian Association of IBRO. - Yerevan, RA.

- 1896. - P.38.

9. Karageuzyan M.K., Boyajyan A.S., Osipyan L.L, Karageuzyan K.G., Hovsepyan L.M., Zakharyan N.A., Zakharyan A.A., Zakharyan A.R. Molecular mechanisms of phospholipid biosynthesis disorders in rat brain mitochondria and microsomes under raycotoxin zearalenon action // J. of Neurochem. (Abstract of the Ill-d Meeting of the Asian-Pacific Soci. for neurochem. - Beijing, China. - 1996. - V.67.

- P.S 42-D.

10. Kerageuzyan M.K., Boyajyan A.S., Osipyan LL, Karageuzyan K.G. Toxin zearalenon on reactions catalysed by dopamlne-p-monooxygenase // J. of Neurochem. (Abstract of the L.-d Meeting of the Asian-Pacific Soci. for neurochem. - Beijing, China. - 1996. - V.67. - P.S 41-A.

ШФПФЦЧЬР

1фЦптпЕ1фб qbmpu!¡.hünD[i tr.ngu(ilj l$bljunGbp}i i5n|bljruiLujfiD 6fcjüiiJÜfiq6ühpD ujUj¡áiuGujt[npilmó hC Ерш £шйшцш1)ш(г1)ш1 uiqqt¡gm.p)ui>5p l¡muihfuniU!i3}íQ0bp{j шбшргцВД u|fingbuDbp[i tlpiu, ujpngbußbp|i. npnCiß tiniAJC.npóilniú hG qn$wi5fiö-ß-iinGrjosu|iqbGuiqJi ü|i?ngni{, hfiúGuJIjiüGniú Gpuj рш^шЗ^шЦшицфиб £1ф ^Onpíifiii, np}i üujuGujlignipjuiúp U Циллш^цфпЛ t rjn^wsïJtGfig Gnpujqphfiujifiû utnuigtSuiß nbuit|g|iuiQ:

CpqujGtiqúfr qiuöiuqujG opquuíiGbph U huiûiu^mpqbph йшЦшрцш^пф qfewpuJihGnG|i 'jGiuuiupuip uiqqbgtupjuiG щшрпцЬйЬифЦ qpulinpniiSGbpc рОлрл^фшЗ bG СршйдлкЗ флифп^ифо-^пифп^цфг^шфй ЬшршрЬршЦдшр^ш^р ■ íhinqbDbin¡il|npbG Ьишш^Ьдфий l|iujni.Gni.pjUjQ funp fuujGqiupnidGnpml:

Sthuipuii.bQr,Gni4 рглйш^пргиййЬрр qniqnpqilm.ii bG ри^шйршЦш1цф.и6 5nii'j;niJiU[firjGbpfi rjbuigfutugtfujG nbiu^gfiuiGbp|i hbin, npnGg pbpruú bG ¡jíqr^nu^niíiLqhqDbpfi L ¿hiuqbgL[iu6 п^ЬрЬр^ФЬ^^О'Дшб tfiupiuiiippniGbpfi puipàp îjnQghGirpuigtiiyubpfi iür.uigiugúuiGo, ú¡i ршй npß пршЦшфгрфий t прицЬи .'Jir;!j'ppiÍ!u¡Luqm l)2 iijl¡m¡ii{nipjujG puipûpiugiJiuG hbuiùaiGg: QbuipiuibQnDujj|iû priinuj^npniüGbpn рСгирищрфтЗ hü iuqujinnaiq|il{iuiuijfiü nbiutjgfmjGbpfi qqiu¡.(i L'jpuiPjHigt.'sijuijp ODuf\t\aig(ímG {iGjtqbu "phníihGinujmb.il, aiiüai'au t(.

фЬ ¡n l1 h S LntiiLnp4 hlliljUjljLUpqbpnLlí:

ЗЬти^пигДшб bhilLuOqiuafiG i[¡iíSujl|Ghp}i ujiuji3iuGGbpni.i3 ifuqfiqiujfiG qbpcgufiqübpp tunuijuigihuG uipngbuGbpfi ^GuibGupitLugniiÎQ umu!i|hi U!p ip.'ijh Luj ini[iuó i: u|bpo£u[iqiuj|iG hbúni|iqfi 1|ЬП1иРЬр]Ш|. tp(iinpng¡imfibpíi riju^ur^nqiuLjiufirupjuiCi wGl)dujG uiuin¡-¡SujGti pmpúpiugúiuúp: Uju фиштр pujga-uipriLÚ t niunLL¡Guju[ip^d pru(kui(npm.i3Gbp|i diuiKuGiul) гфшфчц lupiuq qiunqujgnq ОшЬфий йиэд, npfiû Ciqiuuuinul bG GiuU !5(iuingnGqp[iLuG''pnn3 2й;шти1|шй 3)ruûl|gfii.uûbpfi U opufiqujgtuiG :j5nu3>np|iiuigt5tuG nbujligtn'.íGbpjv ujpuiquigtfuiû bpLnijpGbpp:

Liumplintút1 рЬпипцфипгф in vitro U in vivo oqmuiqnpóúujG cfiuútuGiu^ qpmûgi(nit3 t фил ujpwuihujjmi{uid Uiqqbgnipjni.ü пштййидфрфиб

L|bGuu;qnjLugrupjmGíjbprud фгшфпфщргрифй ijintuiuûujtfnipjujû fuuuGqiupruúGbptí quipquigúujG к (unpuigiSiuG ||рш: MbpçfiGfiu ¿Gnphfiit Gljuiuulmú bG $nu$ni|iUjtir)Gbpti npurtjuit|UjG LjmqiSh U giuGuil{uil|LuG piuqiuqprupjLuG фзршЦшйс^йгиД fiG¿u¡t¡u GuiU |jiutfiqujjfiû qbpopufiqGbpfi luniuçiugiîiuG пЬшЦд[|шйЬр(1 lupiuquigCiujG ¿шфшфчршй Gnpäuit hjmt^uiôpGbp|i hiuúiup CGryuOt|uió uiuhiSuiGGbpruii:

liUJLnp|inii3ti р^пипцфштр lupqjniGtiJilbuiriipjuiG puipâp iuum|itfujG(} гфтфий t qbiupuit.hGnüm{ pniGuji(npruiiûbp|i n¿ гиг ßUjG luniugfiG bpljnt dujúbpti (¡Gpuiganiü, Jiutj шпшф|. iu¡¡p[i oG^ünq lupqjntüeúbpo qpuiGgitmú bö, bpp (¡¿фид hwL|Wopu|iqujGui[i Gbpúiu6i(nLÚ t opquiG|iqó pruGui4npiui5|ig t)bu chuií lunujo: Uinaigi[Luó mpqjntGpGbpi] pnij(_ bû muiifu Ьрш^(иш11прЬ1 Qiuinp|inu3|i р}типцфш1Л[1 прщЬи Ьшишф huiljiuopufiqujGm шшррЬр ôuiqnni

nifibgnq ртйшЦпртййЬр^, йшиСшЦпрши^Ьи, qbaipaiLbGnGfi innpu|iljnqGh|i(i