Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм дезоксиниваленола (вомитоксина) у крыс

Обольский, Олег Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм дезоксиниваленола (вомитоксина) у крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм дезоксиниваленола (вомитоксина) у крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи

ОБОЛЬСКИЙ ОЛЕГ ЛЬВОВИЧ

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) У КРЫС

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2001

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте питания Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

академик РАМН, профессор В.А. ТУТЕЛЬЯН

доктор биологических наук, профессор А.В. КАРЯКИН,

доктор биологических наук, Л.Б. РЕБРОВ

Ведущее учреждение: Институт биомедицинской химии РАМН

Защита состоится «_»_2001 г. в «_» часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.002.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте питания Российской академии медицинских наук по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «_»_2001 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат медицинских наук В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

К приоритетным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих опасность для здоровья человека, относятся микотоксины — вторичные метаболиты микроскопических грибов. Исключительно широкая распространенность продуцентов микотоксинов и бесспорные доказательства их реальной опасности для здоровья человека и сельскохозяйственных животных обуславливает возросший интерес исследователей к изучению этих токсичных метаболитов. [Тутель-ян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Bhat R., 1999]. Наиболее часто встречаемыми в качестве загрязнителей продовольственного сырья, пищевых продуктов и кормов являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — трихотеценовые ми-котоксины и зеараленон [Саркисов А.Х., 1954; Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995; Bhat R., 1999]. Среди трихотеценовых микотоксинов наиболее распространенным в мире и обладающим высокой токсичностью является дезоксиниваленол (ДОН, воми-токсин) [Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995; Langseth W. et al., 1998; Hochsteiner W., Schuh M., 2001]. Исследования, проводимые с 1989 г., показали, что в некоторых регионах России, относящихся к основным производителям зерна, в отдельные годы частота контаминации ДОН заготавливаемого зерна пшеницы достигала 60-100% [Соболев В.С. и др., 1990; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Кроме того, показана возможность накопления в отдельные годы в зерне пшеницы наряду с ДОН другого фузарио-токсина — зеараленона [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998].

В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их мико-токсинами, основной мерой защиты организма от неблагоприятного воздействия этих токсинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье, пищевых продуктах. Однако, даже при наличии в достаточной степени налаженной системы контроля за безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов сохраняется вероятность поступления с пищей микотоксинов в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека. В связи с этим, важное значение приобретает поиск и изучение факторов, способных повышать устойчивость организма к неблагоприятному воздействию ДОН.

К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной циркуляции, биотрансформации и детоксикации [Тутельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях, для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Цель работы состояла в изучении влияния на основные пути биотрансформации и детоксикации ДОН у крыс алиментарных факторов — биологически активных компонентов пищи.

Задачи исследования:

- изучить распределение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН;

- изучить роль микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в детоксикации ДОН;

- изучить влияние различных уровней селена в рационе на метаболизм ДОН;

- изучить влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН;

- изучить влияние пробиотиков на метаболизм ДОН;

- изучить метаболизм ДОН при одновременном поступлении с кормом двух фузарио-токсинов — ДОН и зеараленона.

Научная новизна

Получены новые данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1.

Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1.

Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В.

Показано, что как дефицит селена в рационе, так и обогащение рациона селеном приводит к усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН, кото-

рое сопровождается возрастанием активности микросомальной UDP-глюкуронозил-трансферазы в печени крыс.

Показано, что обогащение рациона крыс пектином усиливает не только экскрецию ДОН, но и образование и выведение его глюкуроновых конъюгатов, что коррелирует с возрастанием в печени крыс активности UDP-глюкуронозилтрансферазы.

Впервые показано, что in vivo пробиотики могут влиять на токсикокинетику ксенобиотиков.

Установлено, что длительное поступление с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает какого-либо влияния на метаболизм ДОН.

Практическая значимость

Данные об отсутствии изменения метаболизма ДОН у крыс при длительном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и ДОН — в дозах, близких к недействующим для крыс, свидетельствуют, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов.

Получены новые данные по научному обоснованию использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: Теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994), 1-м съезде токсикологов России (Москва, 1998), Международной конференции «Региональные проблемы профилактической медицины» (Великий Новгород, 1999).

Публикации

По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 14 рисунков. Список литературы включает 294 источника, из которых 239 — иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Животные и их содержание. Исследования проводили на крысах линии Вис-тар — самцах и самках (в эксперименте по изучению комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН), выращенных в Питомнике лабораторных животных РАМН «Столбовая», с массой тела от 130 до 250 г в зависимости от эксперимента. В эксперименте по изучению влияния уровня селена в рационе на метаболизм ДОН использовали растущих крыс массой 50 г и крысят-отъемышей. Всего в работе было использовано 182 крысы. Животные получали соответствующие эксперименту рационы, а также воду без ограничений. Животных содержали в стандартных условиях вивария Института питания РАМН, в помещениях с температурой +20-24°С.

В экспериментах по изучению метаболизма ДОН крысы содержались в индивидуальных металлических обменных клетках с сетчатым дном. Каждая клетка оснащалась металлической воронкой для сбора экскрементов, под которой располагались стеклянная воронка и колба-приемник для мочи. Кал задерживался пластиковой сеточкой, размещенной в стеклянной воронке. Моча и кал собирались раздельно каждый час (за исключением ночного времени) в течение 48 часов. По окончании эксперимента клетка и металлическая воронка омывались 10-15 мл дистиллированной воды, смыв присоединялся к собранной моче. Мочу фильтровали и замеряли ее объем. Кал высушивали в термостате при температуре 63°С до постоянного веса и измельчали в фар-

форовой ступке. Образцы мочи и кала хранились до проведения анализа при температуре -18°С.

Препараты микотоксинов. Для введения крысам и приготовления стандартного раствора в эксперименте использовали коммерческий препарат ДОН фирмы "Sigma" (США), а также ДОН, полученный нами по методике Тутельян В.А. и др. (1991).

Структуру выделенного токсина подтверждали методом масс-спектрометрии с исполь-

зованием хроматомасс-спектрометра "Finnigan-3200F" (США) . Идентификацию и степень чистоты проводили методами ТСХ, а также нормально- и обращеннофазной ВЭЖХ. Содержание ДОН в полученном препарате составило не менее 96-98%.

ДОМ-1 был получен по методике Cote L.-M. et al. (1986) при инкубации ДОН с содержимым рубца бычка с последующим выделением метаболита методом хроматографии на колонке с силикагелем и препаративной обращеннофазной ВЭЖХ . Идентификацию и степень чистоты выделенного токсина проводили методами ТСХ и ВЭЖХ. Степень чистоты полученного препарата ДОМ-1 составляла 97%. Структуру

выделенного токсина была подтверждена масс-спектрометрически на хроматомасс-

спектрометре "Finnigan-3200F" (США) .

Метод определения ДОН и его метаболитов в кале и моче крыс. ДОН и его

метаболиты в моче и кале крыс определяли по методу, разработанному в Институте питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991], в нашей модификации.

В полиэтиленовую колонку диаметром 9 мм с пористым тефлоновым фильтром последовательно помещали смесь 0,1 г нейтрального активированного угля и 0,15 г це-лита, 0,1 г нейтрального оксида алюминия (для хроматографии по Брокману II). Сверху помещали кусочек ваты. Колонку последовательно промывали 3-5 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, 3-5 мл ацетонитрила, 5 мл воды в слабом вакууме водоструйного насоса.

1 мл мочи наносили на колонку, промывали 3 мл воды. ДОН и ДОМ-1 элюиро-вали 3 мл смеси ацетонитрил-вода (4:1). Из элюата удаляли основную массу ацетонитрила упариванием в токе азота на водяной бане, к остатку (до 1 мл) добавляли 4-5 мл

Масс-спектрометрические исследования проводились совместно с Ф.А. Медведевым (НИИ питания РАМН), за что автор выражает ему искреннюю признательность.

** Получение ДОМ-1 проводилось В.С. Соболевым и Л.П. Захаровой (НИИ питания РАМН), за что автор выражает им глубокую благодарность.

насыщенного водного раствора хлорида натрия, токсины четырежды экстрагировали этилацетатом порциями по 5 мл. Объединенные экстракты упаривали на ротационном испарителе досуха.

К образцу кала добавляли равную массу целита 545 и тщательно гомогенизировали в фарфоровой ступке; навеску гомогенной массы, соответствующую 3 г цельного кала, экстрагировали 20 мл смеси метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, затем добавляли равный объем ацетона и фильтровали через складчатый бумажный фильтр, отбирали аликвоту 15 мл, упаривали в вакууме до объема 3-3,5 мл, наносили на колонку и элюи-ровали, как это описано для мочи.

Глюкуроновые конъюгаты ДОН и ДОМ-1 определяли, используя ферментную реакцию с ß-глюкуронидазой. К 1 мл мочи добавляли 4 мл ацетатного буфера (рН 5,0) и 10 мг г ß-глюкуронидазы ("Serva", США) с активностью 51 ед/г (920000 ед. Фишма-на/г), инкубировали в течение 16-18 ч при 37°С, наносили на колонку и элюировали, как описано выше. Для определения глюкуронидов в кале навеску смеси кала с цели-том экстрагировали смесью метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, фильтровали. Аликвоту фильтрата, соответствующую 0,7 г, упаривали в вакууме досуха, перерастворяли в 4 мл ацетатного буфера. Ферментную реакцию и последующую очистку на колонке проводили как описано для мочи.

Сухие остатки растворяли в метаноле. Определение содержания ДОН и ДОМ-1 проводили методом обращеннофазной ВЭЖХ на хроматографе "Altex" модель 110 А (США) с УФ-детектором "Kratos-757" (США) при длине волны 224 нм. Хроматографи-ческая колонка "Силасорб SPH С18" 3 х 250 мм, размер частиц 6 мкм. В качестве подвижной фазы использовали 8% ацетонитрил. Расход подвижной фазы 0,7 мл/мин. Предел обнаружения метода для ДОН и ДОМ-1 в моче и кале крыс составил 50 нг/г, относительное стандартное отклонение — 0,05-0,1.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ "Statgraphics" (США) и "Excel" ("Microsoft", США). Достоверность отличия от контроля средних показателей опытных групп рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные экспериментальные показатели представляли в виде M±m. Различия считали достоверными при P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для изучения распределения экскретируемых метаболитов ДОН был использован метод, разработанный Тутельяном В. А. и др. (1991) в нашей модификации отдельных этапов пробоподготовки образцов биоматериала. В модифицированном методе была изменена форма нанесения экстракта образца на адсорбционную колонку, а также изменен состав элюирующей системы. В результате внесенных изменений общий выход метаболитов ДОН повысился на 20%. Предел обнаружения метода для ДОН и ДОМ-1 в моче и кале крыс составил 50 нг/г, относительное стандартное отклонение — 0,05-0,1. Исходный метод предполагал определение только глюкуроновых конъюгатов ДОН. Для изучения возможности образования наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконьюгатов использовали ферментную реакцию с арилсульфатазой ("Serva", Германия) Полученные результаты показали, что около 2% всех экскретируемых метаболитов ДОН выводятся в виде сульфоконъюгатов. Таким образом, впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъ-югатов ДОН и ДОМ-1.

Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН у крыс

Эксперимент проводили на 12 крысах-самцах Вистар. Животных помещали в индивидуальные обменные клетки на 24 часа, после чего вводили однократно внутри-желудочно водный раствор ДОН в количестве 10 мг/кг массы тела. Мочу и кал собирали раздельно в течение 48 часов. За период наблюдения животные получали общеви-варный рацион и воду без ограничения. Результаты исследования показали, что ДОН экскретировался как в неизмененном виде, так и в виде деэпоксида — ДОМ-1; кроме того, в кале и моче крыс определяли конъюгированные формы ДОН и ДОМ-1, причем с мочой преимущественно выделялся ДОН, а с калом — ДОМ-1 (рис. 1). Было обнаружено, что более половины всех экскретируемых метаболитов ДОН составляли конъю-гаты. Таким образом, получены новые экспериментальные данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпокси-да — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1.

I I I

ДОН ДОМ-1 ДОН ДОМ-1

□ Свободная форма ШКонъюгаты □ Общее количество

Рис. 1. Соотношение метаболитов ДОН в моче и кале крыс.

Изучение влияния индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков

на метаболизм ДОН

В качестве индукторов были выбраны фенобарбитал, 3-метилхолантрен и транс-стильбеноксид. Фенобарбитал является примущественным идуктором изоформ иБР-глюкуронозилтрансферазы семейства 2В, а 3-метилхолантрен преимущественно индуцирует изоформы семейства 1А. Транс-стильбеноксид индуцирует изоформы обоих семейств.

Эксперимент проводили на 5 группах крыс-самцов линии Вистар с массой тела 253±4 г, по 6 животных в каждой группе. Все животные получали общевиварный рацион и воду без ограничения.

При введении крысам фенобарбитала (75 мг/кг внутрибрюшинно, 5 доз) наблюдалось перераспределение соотношения экскретируемых свободных и конъюгирован-ных форм метаболитов ДОН: доля свободных форм снижалась с 61 до 43%, в то время как доля конъюгатов возрастала с 39 до 57% (рис. 2). Общая экскреция ДОН возрастала за счет увеличения в 1,5 раза образования и выведения конъюгатов ДОН. Общее количество экскретированного ДОМ-1 снижалось из-за подавления образования и выведения свободной формы ДОМ-1. Но при этом доля конъюгатов ДОМ-1 в общем количестве выводимого ДОМ-1 возрастала вдвое (табл. 1).

3-метилхолантрен (20 мг/кг внутрибрюшинно, 2 дозы) в меньшей степени влиял как на общую экскрецию, так и на соотношение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН (рис. 2). Общее количество выводимого ДОН несколько снижалось как за счет свободных форм, так и конъюгатов. Введение 3-метилхолантрена не оказывало влияния на общее количество экскретируемого ДОМ-1, однако приводило к достоверному возрастанию образования и выведения конъюгатов ДОМ-1 (табл. 1).

При использовании транс-стильбеноксида (400 мг/кг внутрибрюшинно, 3 дозы) наблюдалось резкое изменение соотношения экскретируемых свободных и конъюгированных форм метаболитов ДОН: снижение доли свободных форм с 60 до 20% и возрастание доли конъюгатов с 40 до 80% (рис. 2). Общее количество выводимого ДОН возрастало за счет значительного увеличения образования и выведения конъюгатов ДОН, при этом несколько снижалось выведение свободного ДОН. Общее количество экскретируемого ДОМ-1 снижалось более чем в 4 раза за счет резкого подавления образования и выведения свободной формы ДОМ-1 (табл. 1). Таким образом, основное количество ДОМ-1 выводилось в виде конъюгатов.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что образование глюкуроновых конъюгатов является одним из главных путей детоксикации ДОН в организме, и что в процессе образования глюкуронидов ДОН и ДОМ-1 принимают участие изоформы иБР-глюкуронозилтрансферазы, относящиеся к семействам 1А и 2В.

Таблица 1.

Влияние индукторов метаболизма ксенобиотиков на экскрецию ДОН и ДОМ-1 у крыс

Фенобарбитал 3-Метилхолантрен Транс-стильбеноксид

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

ДОН (мкг)

общее количество 232±25 295±13 297±23 208±7* 297±23 416±25*

свободная форма 124±17 139±13 138±9 105±5* 138±9 82±12*

конъюгаты 108±10 156±11* 159±19 104±3* 159±19 337±17*

ДОМ-1 (мкг)

общее количество 340±40 159±18* 374±28 381±25 374±28 87±12*

свободная форма 227±24 62±3* 261±29 210±19 261±29 24±1*

конъюгаты 113±17 97±17 113±13 170±21* 113±13 63 ±2*

Фенобарбитал

3-Метилхолантрен

Транс-стильбеноксид

ш о н

с о ю {2 60

X 2

3 50

га

ё 40

н ш о. а

X <и о ш н о

т о н

с о ю {2 60

— з 50

га

ё 40

I-

а и а п X ш о т н о

р30

— Я 20

т о н

о ю {2 60

3 50

га

ё 40

I-

а и а п X <и о т н о

р30

— Я 20

ТСО

□ Свободная форма

□ Конъюгаты

□ Свободная форма

□ Конъюгаты

□ Свободная форма

□ Конъюгаты

Рис. 2. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на соотношение свободных и конъюгированных форм метаболитов ДОН в моче и кале крыс.

Изучение влияния уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс

В первом эксперименте растущие крысы Вистар в течение 6 недель получали полноценный полусинтетический рацион с содержанием селена в концентрации 1 и 5 мг/кг рациона в виде селен-обогащенных дрожжей. После чего животным вводили внутрижелудочно водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг. Обогащение рациона крыс селеном в концентрации 1 мг/кг не влияло на уровень экскреции метаболитов ДОН как в свободной, так и в конъюгированной форме. Увеличение концентрации селена в рационе до 5 мг/кг вызывало достоверное возрастание экскреции ДОН и ДОМ-1 с мочой за счет усиления образования и выведения их конъюгированных форм (рис. 3А). Количество и соотношение метаболитов ДОН, выделяемых с калом, не изменялось (рис. 3Б).

Обнаруженное усиление образования и экскреции конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 при обогащении рациона селеном коррелировало с возрастанием в печени крыс активности УБР-глюкуронозилтрансфераз.

Таким образом, впервые показано, что обогащение крыс органической формой селена приводит к значительному усилению образования и выведения конъюгатов ДОН и его метаболита ДОМ-1.

§ 12

с!

га

ЕЕ 10

ш у

1 8

О |_

о 6

ш ш т н о

ДОН

ДОМ-1

□ Контроль

□ 1 мг/кг

□ 5 мг/кг

о а

п т н

о ф

с; о

т т н

ДОН

ДОМ-1

□ Контроль

□ 1 мг/кг 15 мг/кг

Рис. 3. Влияние обогащения рациона селеном на соотношение свободных и

конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых с мочой (А) и с калом (Б) у крыс.

а — общее количество, б — свободная форма, в — конъюгаты. *) Р<0,05.

Во втором эксперименте крысы-отъемыши Вистар получали в течение 6 недель специальный селендефицитный рацион с содержанием селена менее 0,02 мг/кг рациона. Селеновую недостаточность у животных оценивали по уровню селена в печени, а также по активности селензависимой глутатионпероксидазы, которая у селендефицитных крыс составляла около 6% от контроля. В конце эксперимента животным вводили однократно внутрижелудочно водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг. Результаты изучения метаболитов ДОН показали, что у крыс как опытной, так и контрольной групп единственным экс-кретируемым метаболитом ДОН наряду с неизмененным токсином является его глюкуро-нид. Полное подавление образование ДОМ-1, возможно, является результатом специфического влияния дрожжей, составляющих почти 30% рациона, на микрофлору кишечника.

У крыс, получавших дефицитный по селену рацион, двукратно возрастало количество выводимого с мочой общего ДОН как за счет повышения экскреции свободной формы, так и за счет усиления образования и выведения его конъюгатов (рис.4А). Дефицит селена в рационе не оказывал существенного влияния на уровень общей экскреции ДОН с калом, хотя доля конъюгатов превышала уровень контроля (рис. 4Б). Усиление образования и выведения глюкуронидов коррелировало со значительным возрастанием активности микросомальных иБР-глюкуронозилтрансфераз в печени крыс.

20 г

X 18

Об

о 14

ш у

6 -

ш Ч ш т т н о

£ 2 -

Рис. 4. Влияние дефицита селена в рационе на соотношение свободных и конъюгиро-ванных форм ДОН, экскретируемых с мочой (А) и с калом (Б) у крыс.

а — общее количество ДОН, б — свободная форма ДОН, в — конъюгаты ДОН. *) Р<0,05.

Таким образом, как обогащение, так и снижение уровня селена в рационе приводило к возрастанию суммарного количества экскретируемых метаболитов за счет усиления образования и экскреции конъюгированных форм, которое коррелировало со значительным возрастанием активности микросомальных иБР-глюкуронозилтранс-фераз.

Изучение влияния обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс

Известно, что некоторые типы пищевых волокон, в том числе пектин, являются субстратами для кишечной микрофлоры, в результате чего включение их в рацион может сопровождаться значительными изменениями характера кишечной микрофлоры и ее функциональной активности. Эксперимент проводили на 2 группах крыс-самцов Вистар, по 12 животных в каждой, массой 190-205 г. Крысы в течение 2 недель содержались на полусинтетическом рационе; в рацион опытной группы включали 5% пектина. После чего животным обеих групп вводили внутрижелудочно водный раствор ДОН в дозе 10 мг/кг.

Обогащение рациона крыс пектином не влияло на суммарную экскрецию ДОМ-1 и незначительно влияло на соотношение свободных и конъюгированных форм ДОМ-1. При этом наблюдался достоверный почти двукратный рост выведения нативного ДОН как с мочой, так и с калом главным образом за счет образования и экскреции конъюга-тов ДОН. Также отмечалось достоверное, хотя и не большое, увеличение экскреции свободной формы ДОН с мочой и с калом (рис. 5).

Увеличение количества выводимых конъюгатов ДОН коррелировало с почти двукратным возрастанием активности микросомальных иБР-глюкуронозилтрансфераз в печени крыс, получавших рацион с пектином.

Таким образом, обогащение рациона крыс пектином оказывало существенное влияние на различные этапы токсикокинетики ДОН, что проявлялось как в повышении скорости экскреции свободных форм ДОН и ДОМ-1, так и в усилении образования и выведения конъюгатов ДОН.

10-

Общее Свободная Конъюгаты Общее Свободная Конъюгаты количество форма количество форма

25-

15-

У д

ДОН

у—7

ДОМ-1

□ Контроль

□ Опыт

Общее Свободная Конъюгаты Общее Свободная Конъюгаты количество форма количество форма

Рис. 5. Влияние пектина на соотношение свободных и коньюгированных форм ДОН, экскретируемых с мочой (А) и калом (Б) у крыс. *) Р<0,05.

Изучение влияния пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс

Интерес к пробиотикам обусловлен, прежде всего, их способностью нормализовать состав кишечной микрофлоры и влиять на ее функциональную активность.

Крысам, получавшим в течение 8 дней суспензию живых культур молочнокислых бактерий (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus) в количестве 5-10 клеток, вводили ДОН однократно внутрь в дозе 8 мг/кг массы тела.

Введение молочнокислых бактерий приводило к возрастанию суммарной экскреции ДОН главным образом за счет достоверного усиления выведения нативного ДОН преимущественно в свободной форме как с мочой, так и с калом (рис. 6). Молочнокислые бактерии не оказывали существенного влияния на образование и экскрецию ДОМ-1, однако, отмечалось достоверное снижение выведения с калом конъюгатов ДОМ-1 при одновременном возрастании экскреции свободного ДОМ-1.

Таким образом, впервые показана способность пробиотиков in vivo влиять на токсикокинетику ксенобиотиков: усиливать выведение у крыс неизмененного ДОН как с калом, так и с мочой.

Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс

Крысы получали в течение 90 дней рационы с включением фузариозного зерна, содержащего только ДОН или ДОН вместе с зеараленоном. При этом концентрации ДОН — 5 мг/кг рациона и зеараленона — 3 мг/кг рациона, обеспечивали поступление микотоксинов в дозах, близких к недействующим для крыс и лежащих в основе установленных ПДК для ДОН и зеараленона. В конце эксперимента животным вводили однократно внутрь ДОН в количестве 8 мг/кг массы тела.

Суммарная экскреция ДОН, а также соотношение свободных и конъюгирован-ных форм ДОН и ДОМ-1 не менялись сколько-нибудь существенно как в группе животных, получавших с кормом только ДОН, так и у крыс на рационе, содержащем ДОН и зеараленон. Полученные результаты позволяют заключить, что совместное длительное поступление в организм крыс зеараленона наряду с ДОН в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает существенного влияния на метаболизм ДОН. Это согласуется с результатами параллельных исследований, которые показали, что низкие

л 7-

о 6-

О 5-

Ч Ф 4-

т 1- 3-

Общее Свободная Конъюгаты Общее Свободная Конъюгаты количество форма количество форма

.0 7

ч 6

О 5-

ч ф 4

т 1- 3

ДОН

□ Контроль

□ Молочнокислые бактерии

ДОМ-1

-С

Общее Свободная Конъюгаты Общее Свободная количество форма количество форма

Конъюгаты

Рис. 6. Влияние молочнокислых бактерий на соотношение свободных

и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых с мочой (А) и калом (Б) у крыс.

*) Р<0,05.

дозы ДОН и зеараленона при длительном совместном поступлении не влияют на токсичность ДОН для крыс.

Таким образом, результаты данного раздела исследований подтверждают, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые экспериментальные данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации дезоксиниваленола у крыс является образование его деэпок-сида — ДОМ-1 и конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1. Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1.

2. Впервые получены доказательства участия в образовании глюкуроновых конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В.

3. Установлено, что как избыток, так и дефицит селена в рационе крыс приводит к значительному усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 и сопровождается возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз.

4. Обогащение рациона крыс пищевыми волокнами (пектином) оказывает существенное влияние на различные этапы токсикокинетики дезоксиниваленола, что проявляется как в повышении скорости экскреции свободных форм дезоксиниваленола и ДОМ-1, так и в усилении образования и выведения глюкуроновых конъюгатов дезок-синиваленола.

5. Впервые показана способность пробиотиков (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus в количестве 5 х 10 клеток) in vivo влиять на токсикокинетику ксенобиотиков: введение per os культур молочнокислых бактерий достоверно усиливало выведение у крыс неизмененного дезоксиниваленола как с калом, так и с мочой.

6. Длительное совместное поступление с кормом двух фузариотоксинов — зеа-раленона и дезоксиниваленола — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает существенного влияния на метаболизм дезоксиниваленола, что подтверждает отсутствие необходимости изменения установленных регламентов содержания дезок-синиваленола и зеараленона в пищевых продуктах при их совместном обнаружении.

7. Полученные данные являются дополнительным научным обоснованием целесообразности использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Кузьмина Е.Э., Захарова Л.П., Соболев В.С., Обольский О.Л., Лашнева Н.В., Левицкий А.П., Тутельян В.А. О механизмах защитного эффекта некоторых пищевых веществ при воздействии вредных факторов окружающей среды / Материалы научной конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС". - Брянск, 1993. - С. 53.

2. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Обольский О.Л. Пищевые волокна и токсикокине-тика ксенобиотиков / Материалы Первого международного научного конгресса "Традиционная медицина и питание: Теоретические и практические аспекты". - М., 1994. - С. 467.

3. Обольский О.Л., Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Влияние уровня селена в рационе на активность иБР-глюкуронозилтрансфераз и метаболизм микотокси-на дезоксиниваленола у крыс // Вопросы питания. - 1998. - № 4. - С. 18-23.

4. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Обольский О.Л. Изучение роли иБР-глюкуро-нозилтрансфераз в метаболизме трихотеценового микотоксина дезоксиниваленола (ДОН) / Тезисы докладов 1-го съезда токсикологов России. - М., 1998. - С. 286.

5. Обольский О.Л., Авреньева Л.И., Кравченко Л.В., Тутельян В.А. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм микотоксина дезоксиниваленола (ДОН) у крыс / Тезисы докладов 1-го съезда токсикологов России. - М., 1998. - С. 303.

6. Кравченко Л.В., Обольский О.Л., Авреньева Л.И. Влияние пробиотиков на метаболизм трихотеценового микотоксина дезоксиниваленола (ДОН) у крыс / Материалы Международной конференции "Региональные проблемы профилактической медицины". - Великий Новгород, 1999. - С. 185-186.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Обольский, Олег Львович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Дезоксиниваленол и другие трихотеценовые микотоксины

1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов.

1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе.

1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов.

1.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков.

1.2.1. Общие сведения.

1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов.

1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола.

1.3. Влияние алиментарных факторов на метаболизм и токсичность ксенобиотиков.

1.3.1. Селен.

1.3.2. Пищевые волокна.

1.3.3. Пробиотики.

1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1. Животные и их содержание.

2.1.1.1. Экспериментальные рационы.

2.1.1.2 Условия эксперимента по изучению метаболизма ДОН.

2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе.

2.1.3. Физико-химические методы исследования.

2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия.

2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в моче крыс.

2.1.5. Статистическая обработка результатов.

2.2. Результаты исследования.

2.2.1. Модификация метода количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс.

2.2.1.1. Подбор системы для элюирования ДОН и ДОМс адсорбционной колонки.

2.2.1.2. Определение формы нанесения экстракта образца на колонку.

2.2.1.3. Определение сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1.

2.2.1.4. Модифицированный метод анализа ДОН и его метаболитов в экскретах крыс.

2.2.2. Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар.

2.2.3. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.4. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.4.1. Влияние обогащения рациона селеном на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.4.2. Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.5. Влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.6. Влияние пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс.

2.2.7. Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм дезоксиниваленола (вомитоксина) у крыс"

Актуальность проблемы

К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека, относятся микотоксины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них иммуноде-прессивных свойств и у многих — мутагенных, канцерогенных или коканцерогенных свойств [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. Микотоксины являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических (плесневых) грибов, способных поражать продовольствие на всех этапах его производства, переработки и хранения. Полагают, что не менее 25% всех продовольственных ресурсов подвержены загрязнению микотоксинами или повреждающему действию плесневых грибов [Pohland А.Е., 1998].

Исследования, проведенные как за рубежом, так и в нашей стране, показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — трихотеценовые микотоксины (ТТМТ), зеарале-нон и фумонизины [Саркисов А.Х., 1954; Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a; Bhat R., 1999]. В отличие от других микотоксинов, накопление которых в пищевых продуктах является, главным образом, результатом нарушений условий хранения или технологических условий производства продукта, фузариотоксины накапливаются в зерне в процессе его созревания, и интенсивность их синтеза в клетках мицелия зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Необходимо отметить, что проблема загрязнения продовольствия фузариотоксинами имеет выраженную тенденцию к нарастанию по степени риска для здоровья человека. Это определяется отсутствием устойчивости зерновых культур к поражению грибами рода Fusarium, отсутствием перспектив создания сортов, устойчивых к этим видам грибов и отсутствием в настоящее время достаточно эффективных в отношении грибов Fusarium фунгицидов [Львова Л.С. и др., 1992, 1994; Riley R.T., Norred W.R., 1999; Edwards S.G. et al., 2001].

Среди фузариотоксинов широкой распространенностью выделяются дезокси-ниваленол (вомитоксин) и зеараленон, а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993]. Дезоксинива-ленол (ДОН) в настоящее время, несомненно, является наиболее часто обнаруживаемым в мире микотоксином. ДОН выявляют в качестве контаминанта зерновых культур и, в первую очередь, пшеницы в большинстве регионов мира. Частота обнаружения ДОН в пшенице в разные годы в Канаде, США, в большинстве стран Европы и ряде стран Азии, Африки и Южной Америки достигает 50 100% [Ueno Y., Tanaka Т., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; TutelyanV.A. et al., 1990]. Результаты наших предыдущих исследований [Соболев B.C. и др., 1990; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995; Кравченко JI.B. и др., 1998; Tutelyan V.A., 1998] показали, что в период 1986-1999 гг. в некоторых регионах России, относящихся к основным производителям зерна, ежегодная частота контаминации ДОН заготавливаемого зерна пшеницы варьирует от 60 до 100%. Имеются сообщения о высокой частоте (до 41-50 случаев) обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в европейских странах — Польше, Германии, Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Muller H.M., Schwadore К., 1993; Muller H.M. et al., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. et al., 2001].

Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются доминирующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений в Индии [BhatR.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН. В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. Практически во всех странах Европы, в Северной и Южной Америке, в ряде стран Азии неоднократно выявляли ДОН вместе с зеараленоном в пшенице, ячмене, овсе [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; YoshizawaT., Jin Y.Z., 1995; Muller H.M. et al., 1998]. Результаты исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показали возможность накопления двух фузариотоксинов — ДОН и зеарале-нона — в зерне из ареала фузариоза (Краснодарский край) [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998].

В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксинами, основной мерой защиты организма от неблагоприятного воздействия этих токсинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Как показали результаты наших предыдущих исследований, даже при наличии в достаточной степени налаженной системы контроля за безопасностью продовольственного зерна и пищевых продуктов, сохраняется вероятность постоянного поступления с пищей микотоксинов (главным образом ДОН) в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека [Захарова JI.П., 1994, 1995; Кравченко JI.B. и др., 1998]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной циркуляции, биотрансформации и детоксикации [Ту-тельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях, для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Большинство ферментов, занимающих ключевое место в процессах биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков и в том числе ТТМТ, являются компонентами мембран, и их активность определяется в значительной степени функциональным состоянием мембран. Кроме того, в единичных исследованиях in vitro показана возможность восстановления эпоксидного кольца трихотеценовых микотоксинов ферментами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. В связи с этим особый интерес представляют компоненты пищи, способные оказывать стабилизирующее влияние на мембраны (антиоксиданты) и улучшающие микробиологический баланс кишечника (пробиотики, пищевые волокна).

Были поставлены следующие задачи:

- изучить распределение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН;

- изучить роль микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в детоксикации ДОН;

- изучить влияние различных уровней селена в рационе на метаболизм ДОН;

- изучить влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН;

- изучить влияние пробиотиков на метаболизм ДОН;

- изучить метаболизм ДОН при одновременном поступлении с кормом двух фуза-риотоксинов — ДОН и зеараленона.

Научная новизна

- Получены новые данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1.

- Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1.

- Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В.

- Показано, что как дефицит селена в рационе, так и обогащение рациона селеном приводит к усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН, которое сопровождается возрастанием активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс.

- Показано, что обогащение рациона крыс пектином усиливает не только экскрецию ДОН, но и образование и выведение его глюкуроновых конъюгатов, что коррелирует с возрастанием в печени крыс активности UDP-глюкуронозилтрансферазы.

- Впервые показано, что in vivo пробиотики могут влиять на токсикокинетику ксенобиотиков.

- Установлено, что длительное поступление с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает какого-л ибо влияния на метаболизм ДОН.

Практическая значимость

Апробация работы

Публикации

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Обольский, Олег Львович

4. ВЫВОДЫ

1. Получены новые экспериментальные данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации дезоксиниваленола у крыс является образование его де-эпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1. Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфо-конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1.

5. Впервые показана способность пробиотиков (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus в количестве 5 x 10 клеток) in vivo влиять на токсикокинетику ксенобиотиков: введение per os культур молочнокислых бактерий достоверно усиливало выведение у крыс неизмененного дезоксиниваленола как с калом, так и с мочой.

6. Длительное совместное поступление с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и дезоксиниваленола — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает существенного влияния на метаболизм дезоксиниваленола, что подтверждает отсутствие необходимости изменения установленных регламентов содержания дезоксиниваленола и зеараленона в пищевых продуктах при их совместном обнаружении.

2, 3 4

5, 6

7, 8 9

17,

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск путей снижения неблагоприятного воздействия на организм загрязнителей окружающей среды является особо актуальным для таких природных контаминан-тов продовольственного сырья как микотоксины.

Микотоксины — вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов — являются одними из приоритетных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов [Тутельян В. А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. В виду повсеместной распространенности грибов-продуцентов и высокой частоты контаминации микотоксинами продовольственного сырья основной мерой по защите организма от неблагоприятного действия микотоксинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Однако такая мера не может полностью предотвратить попадание в организм малых количеств микотоксинов, которые нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья [Захарова Л.П., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998, 2000]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, пече-ночно-кишечной рециркуляции, биотрансформации и детоксикации [Тутельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, такие как витамины, микроэлементы, пищевые волокна и пробиотики, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Настоящее исследование посвящено изучению влияния некоторых биологически активных компонентов пищи на метаболизм у крыс одного из наиболее распространенных в мире и обладающего достаточно высокой токсичностью трихотеценово-го микотоксина — дезоксиниваленола (ДОН, вомитоксина). ДОН продуцируется некоторыми видами микроскопических грибов Fusarium и является основным загрязнителем зерновых культур, главным образом пшеницы, во многих странах мира, в том числе и в России [Ueno Y., TanakaT., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; Tutelyan V.A. et al., 1990, 1998].

Для ДОН в настоящее время известно 2 пути детоксикации в организме: де-эпоксидирование и образование конъюгированных форм как исходного токсина, так и его деэпоксида (ДОМ-1). Выдвигаются предположения, что реакция деэпоксидирова-ния протекает под действием ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта [King R.R., et al., 1984; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Необходимо иметь в виду, что эпоксигруппа является основным фактором токсичности трихотеценовых микотоксинов, и ее разрушение приводит к практически полной утрате токсических свойств [Grove M.D. et al., 1984; Swanson S.P. et al., 1988]. Глюкуроновая конъюгация катализируется ферментом UDP-глюкуронозилтрансферазой, представляющим собой группу изоформ, локализованным главным образом в печени [Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg С.Р. etal., 1999].

Важным аспектом в изучении количества и соотношения метаболитов ДОН у крыс является эффективность методов определения ДОН и его метаболитов в моче и кале. В настоящем исследовании мы использовали метод, разработанный в Институте питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991], однако с целью увеличения степени извлечения анализируемых соединений представилось необходимым провести модификацию метода. В результате внесенных изменений в некоторые стадии очистки образцов общий выход метаболитов ДОН повысился на 20%. Исходный метод предполагал определение только глюкуроновых конъюгатов ДОН как преобладающего вида образующихся в организме конъюгатов. Однако конъюгация ДОН с другим субстратом в организме также может происходить в существенной степени, в частности сульфатная конъюгация. Мы сделали попытку изучить возможность образования наряду с глюку-роновыми конъюгатами сульфоконьюгатов. Полученные результаты показывают, что около 2% всех метаболитов ДОН выводятся из организма в виде сульфоконъюгатов.

Проведенный эксперимент по изучению распределения экскретируемых метаболитов ДОН у крыс Вистар показал, что ДОН выводится как в неизмененном виде, так и в виде деэпоксида — ДОМ-1; кроме того, в кале и моче крыс определяли конъю-гированные формы ДОН и ДОМ-1, причем с мочой преимущественно выделялся ДОН, а с калом — ДОМ-1. Было обнаружено, что более половины всех экскретируемых метаболитов ДОН составляют конъюгаты. Таким образом, проведенные исследования подтверждают данные, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его конъюгатов и деэпоксида.

С целью более детального выяснения роли UDP-глюкуронозилтрансферазы в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 было изучено влияние не которых индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков — фенобарбитала, 3-метилхолантрена и транс-стильбеноксида — на метаболизм ДОН. Проведенные исследования подтвердили, что образование глюкуроновых конъюгатов является одним из главных путей детоксикации ДОН в организме. Установлена прямая зависимость между усилением образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН и возрастанием активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы. Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В.

Одной из главных задач настоящей работы явилось изучение влияния биологически активных компонентов пищи на оба известных пути метаболизма ДОН: образование конъюгатов и деэпоксидирование. В качестве изучаемых алиментарных факторов были выбраны селен, пектин, а также пробиотики (молочнокислые бактерии).

Выбор селена был обусловлен его доказанным протекторным действием против повреждающего влияния на организм ряда токсических агентов — загрязнителей окружающей среды [Гореликова Г. А. и др., 1997], в том числе трихотеценовых микотоксинов [Борисов В. А., 1988 а, 1988 б; Rizzo A.F. et al., 1994; Yazdanpanah H. et al., 1997; Atroshi F. et al., 2000], а также его способностью влиять на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков, в том числе UDP-глюкуронозилтрансферазы [Reiter R., Wendel А., 1983; Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991; 1р С., LiskD.J., 1997]. Наши предположения основывались на том, что селен, благодаря способности модулировать активность UDP-глюкуронозилтрансферазы, может влиять на метаболизм ДОН, в первую очередь на образование его конъюгированных метаболитов.

Было проведено изучение влияния на метаболизм ДОН как обогащения рациона крыс селеном, так и дефицита его в рационе. В обоих случаях наблюдали одинаковый эффект: возрастание суммарного количества экскретируемых метаболитов ДОН за счет усиления образования и выведения с мочой конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, что коррелировало со значительным возрастанием активности UDP-глюкуро-нозилтрансферазы в печени крыс.

Принимая во внимание предположение, что за реакцию деэпоксидирования ДОН в организме ответственны ферментные системы микрофлоры желудочно-кишечного тракта, мы предположили, что введение в рацион биологически активных веществ, способных влиять на состав и тем самым на функциональную активность микрофлоры кишечника, может повлиять на деэпоксидирование ДОН. Одним из таких алиментарных факторов являются пищевые волокна, в частности пектин. Результаты эксперимента по изучению влияния обогащения рациона крыс пектином на метаболизм ДОН показал, что против наших ожиданий пектин не оказывал существенного влияния на образование и выведение ДОМ-1 у крыс. В то же время наблюдался достоверный почти двукратный рост выведения нативного ДОН как с мочой, так и с калом, главным образом за счет образования и экскреции конъюгированных форм. Увеличение количества выводимых конъюгатов коррелировало с возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в печени крыс. Пектин, таким образом, выступал как модулятор пути детоксикации ДОН, связанный с образованием его конъюгатов. Кроме того, усиление выведения свободной формы ДОН может указывать на адсорбционные свойства пектина.

Другим фактором, влияющим на состав кишечной микрофлоры и активность микробных ферментов являются пробиотики. В настоящем исследовании введение молочнокислых бактерий крысам per os не оказывало существенного влияния на образование и выведение ДОМ-1, но усиливали выведение, главным образом, свободной формы неизмененного токсина, как с мочой, так и с калом. Обнаруженное усиление экскреции свободного ДОН позволяет предположить, что молочнокислые бактерии могут проявлять свойства адсорбента и влиять тем самым на токсикокинетику ДОН.

Одной из актуальных задач современной концепции безопасного питания является изучение комбинированного влияния различных контаминантов продуктов питания при их совместном поступлении в организм. В виду того, что грибы-продуценты микотоксинов способны одновременно продуцировать несколько токсичных метаболитов, для прояснения вопроса о возможном синергическом токсическом эффекте этих соединений было проведено исследование комбинированного действия зеараленона и ДОН на метаболизм ДОН в дозах, близких к недействующим для крыс и лежащих в основе установленных ПДК для ДОН и зеараленона. Не было обнаружено существенного влияния на метаболизм ДОН введения в рацион крыс как ДОН, так и ДОН совместно с зеараленоном. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов.

Таким образом, обсуждая результаты проведенных исследований, необходимо еще раз подчеркнуть, что с позиций современной науки о питании роль пищи не ограничивается обеспечением организма нутриентами и энергией в соответствии с физиологическими потребностями. Несомненно, пищу следует рассматривать и как важнейший фактор, регулирующий и модулирующий различные функции организма и, тем самым, участвующий в обеспечении оптимального состояния здоровья и снижения риска многих заболеваний. Такой подход стимулирует интенсивное изучение физиологических эффектов и влияния на здоровье различных, в том числе и минорных биологически активных компонентов пищи, к которым относятся и изученные в настоящей работе селен, пищевые волокна, пробиотики. Позитивное влияние этих соединений на здоровье обусловлено в первую очередь возрастанием защитно-адаптационного потенциала организма.

Несмотря на то, что многие биологически активные соединения находят в настоящее время широкое применение в составе биологически активных добавок к пище или в качестве ингредиентов функциональной пищи, научное обоснование и доказательства их применения в большинстве случаев остаются недостаточными.

В связи с этим результаты настоящей работы, раскрывающие некоторые из механизмов влияния изученных алиментарных факторов на процессы детоксикации ксенобиотиков (на примере микотоксина дезоксиниваленола), представляют определенный вклад в научное обоснование их использования для повышения резистентности организма к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Обольский, Олег Львович, Москва

1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975 - 327 с.

2. Билай В.И., Пидопличко Н.М. Токсинообразующие микроскопические грибы. К.: Наук, думка, 1970. 287 с.

3. Билай В.И. Фузарии. К.: Наук, думка, 1977. 442 с.

4. Билай В.И., Тутельян В. А., Эланская И. А., Эллер К.И., Соболев B.C. Компонентный состав трихотеценов, продуцируемых Fusarium sporotrichiella Bilai // Микробиол. ж. 1983. - Т.45. - № 5 - С.45^19.

5. Борисов В. А. Влияние селена на течение фузарио- и Т-2 токсикоза у свиней / Факторы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Сб. науч. тр. Омск, 1988 а. С.60 67.

6. Борисов В. А. Формирование противосальмонеллезного иммунитета у больных фузарио- и Т-2 токсикозом свиней и возможность его повышения при помощи селена / Профилактика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. Сб. науч. тр. Омск, 1988 б.

7. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 6. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. ВОЗ, Женева, 1981. - 312 с.

8. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 58. Селен. ВОЗ, Женева, 1989. 270 с.

9. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности. Экология моря. 2000. Вып. 54. С.5-19.

10. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов J1.A. Общие механизмы токсического действия. — JI.: Медицина, 1986 280 с.

11. Головенко Н.Я., Карасева Т.Д. Сравнительная биохимия чужеродных соединений. К.: Наук, думка, 1983. - 200 с.

12. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. -М.: Изд. АТН РФ. 1995. 388 с.

13. Гореликова Г.А., Маюрникова J1.A., Позняковский В.М. Нутрицевтик селен: недостаточность в питании, меры профилактики // Вопр. питания. 1997. - № 5. -С. 18-21.

14. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Пищевые волокна и новые продукты питания // Вопр. питания. 1998 а. № 5. С.35^11.

15. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Пищевые волокна — новый раздел химии и технологии пищи // Вопр. питания. 1998 б. - № 3. - С.36-38.

16. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Новые продукты питания. М.: МАИК Наука, 1998 в.-304с.

17. Захарова Л.П., Обольский О.Л., Львова Л.С., Кравченко Л.В. Проблема контаминации зерновых культур дезоксиниваленолом в России // Вопр. питания. -1994. -№ 3. -С.40^14.

18. Захарова Л.П., Обольский О.Л., Львова Л.С., Быстрякова З.К., Кравченко Л.В., Тутельян В. А. Фузариотоксины в зерновых культурах в России. Ситуация в 1993 и 1994 годах // Вопр. питания. 1995. № 2. - С.26-29.

19. Збаровская И.А., Банникова М.В. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме. Клинические аспекты // Вести. РАМН. 1995. -№ 6. - С.53-60.

20. Златкина А.Р. Лечение хронических болезней органов пищеварения. М.: Медицина, 1994. 336 с.

21. Коршунова В.М., Киссина Е.В., Иконникова Т.Е. Влияние препаратов из лактобацилл и бифидобактерий на микрофлору кишечника мышей, облученных гамма-квантами // Ж. микробиол. 1980. - № 6. - С.47-54.

22. Кравченко Л.В., Кузьмина Е.Э., Авреньева Л.И., Тутельян В. А. Защитное действие селена при остром Т-2 микотоксикозе // Вопр. мед. химии. 1990. - № 5. - С.36-38.

23. Кравченко Л.В., Кузьмина Е.Э., Авреньева Л.И., Поздняков АЛ. Влияние селена на ферменты метаболизма ксенобиотиков печени крыс //Вопр. питания. 1991. № 5. С.73-75.

24. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Обольский О.Л. Пищевые волокна и токсикология ксенобиотиков / Материалы Первого международного научного конгресса «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты». М., 1994. - С.467.

25. Кравченко Л.В., Захарова Л.П., Обольский О.Л. Фузариотоксины в зерне: результаты мониторинга // Гигиена и санитария. 1998. - № 1. — С.3-5.

26. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В. А. Оценка комбинированного действия микотоксинов дезоксиниваленола (вомитоксина) и Т-2 токсина на крыс // Токсикологический вестник. 2000. - № 1. — С.2-8.

27. Кулакова С.Н., Карагодина З.В., Левачев М.М., Волгарев М.Н. Влияние обогащения рациона крыс селеном на эффективность метаболизма эссенциальной линолевой кислоты // Бюлл. эксп. биол. мед. 1994. - № 10. - С. 136-138.

28. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ. М.: Медицина, 1981. 344 с.

29. Левитин М.М. Микотоксины // Защита растений. 1994. - № 2. - С. 12-13.

30. Львова Л.С. Влияние технологических приемов переработки пищевых продуктов на содержание в них микотоксинов / Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т. 2. -М., 1985. С. 186 206.

31. Львова Л.С., Быстрякова З.К., Ремеле В.В., Орлова Н.Ю., Шатилова Т.И., Шульгина А.П. Распространение микотоксинов и токсигенных грибов в зерне разных культур / Защита от вредителей и санитарная охрана зернопродуктов. М., 1992.-С.74-87.

32. Мальцев В.Н., Коршунова В.М., Стрельников В.А. Бактериотерапия острой лучевой болезни // Радиобиология. 1978. - № 5. - С.757-760.

33. Мухина Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей // Русский медицинский журнал. 1999. - Т. 7. - № 11. - С. 487-494.36.

Информация о работе

Обольский, Олег Львович
кандидата биологических наук
Москва, 2001
ВАК 03.00.04

Диссертация

Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм дезоксиниваленола (вомитоксина) у крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы