Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль кислого медьсодержащего белка в функционировании цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль кислого медьсодержащего белка в функционировании цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул"

министерство образования И науки республики АРМЕНИЯ ереванский государственный университет

РГ 6 од

,.,. на правах рукописи

' Т' ; ПГ и;,,: УДК577.112/115/036/15.042

гетросян сусанна амазасповна

роль кислого медьсодержащего белка в функционировании цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул

Ч..00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

ереван -1990

Работа выполнена о Институте молекулярной биологии Национальное академии наук Республики Армения

Научные руководители: кандидат биологических наук.

старший научный сотрудник.

л.с.бояджйн

академик НАН РА, доктор биологических наук, профессор К Г.КАРАГЕЗЯН

Официальные оппоненты. доктор биологических наук,

профессор А.А.ТРЧУНЯН

кандидат биологических наук С.Г.ШАРОЯН

Ведущая организация: кафедра биологической и медицинской физики Ереванского государственного медицинского университета им.М.Гераци.

Защита состоится '31 * ЦлОи / 1996 г. в/ часов на заседании Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университете (375049. Ереван. ул.Алека Манукяна. 1. ЕрГУ. биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного универстета.

Автореферат разослан * / * ОСи? а V 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологический наук

С.А.Гонпн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Синтез ряда ваяаейшгх биоактивных. соединений .ташой клетки протекает на ее мембранных стуктурах зря участия електронтранспортных цепей. Согласно современным представлениям одна из таких електронтранспортных цепей, принимавшая участие з конечном этапе биосинтеза норадреналина, функционирует на мембранах хромаффинных гранул (ХГ). ХГ, локализованные в основном в мозговом слое надпочечников, осуществляют хранение, накопление и секрецию гормонов катехоламиновой природы. Структурная организация ХГ а механизм их функционирования сходны с таковыми других секреторных гранул. Поскольку ХГ значительно крупное по размерам аналогичных структур в других тканях и, кроме того, их несравненно легче получать методически, эти органе -.ты рассматривают как вдеальую модель для изучения структурной организации и механизмов функционирования секреторных гранул в нолем.

Ряд экспериментальных данных свидетельствует, что на мембранах ХГ существует цепь переноса электронов, поставляющая необходимые для синтеза керодрэналява восстановительные эквиваленты мембранной форме дсфамин-0-моносксигеназы (мДЕШ и включающая в свой состав следующую функциональную последовательность компонентов:

НАИН:(акцептор)редуктаза 1 —>флавопротеид цитохрем

■Оа „ Оа

? —> мембранная форма дофамин-0-монооксигеназы -^>0о

Как следует из представленной схемы, состав компетентен электронтранспортной цепи идентифицирован не полностью. В частности, не установлен непосредственный природный донор электронов мДШ, т.е. электронный переносчик, функционирующий на участке цепа между цитохромом Ь^ (цит.Ь^) и данным ферментом.

С другой стороны, в составе мембран хромаффинных гранул обнаружен кислый медьсодержащий белок (КМБ), вопрос о физиологической роли которого до настоящего времени остается открыты?.!. По ряду своих физико-химических параметров этот' белок может быть сравним с так называемыми "синими", медьсодержащими белками, функционирующими в составе цепей переноса алектроног растений к бактерий и часто внетупакщиш в роли акцепторов электронов цпто-храмов и донерев электронов кенцевых сксидаз.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящего иссле-

д-jBQEna состояла б изучении возможности функционирования КМБ ь составе цепи переноса электронов мембран хрсазффиннкх гранул, как промежуточного звена на . стадии переноса электронов от ^-•fcbg-j к концевой оксидазе втой цехш - мДШ, а также участия росфолипидных компонентов мембран ХГ в реакциях переноса электронов Mss^y виши белками.

Научная новизна результатов, полученных в работе. Результаты по изучению донсрно-акцепторных отношений КМБ, цит.Ь-,-* и _„, , 5Ь1

как е двухкошонентнкх системах (цкт.Ь^1 - КМВ; КМБ -

так и в рекоструированной системе, включающей все три вцгеотмеченнных белка, полученные рядом независимых методов, лсеесляют сделать вывод о возможной физиологической роли КМБ как промежуточного звена на стадии переноса электронов от цит.Ь^ к .'¿НЕМ ;г с достаточной степенью вероятности предполагать, что один из участков цепи переноса электронов мембран ХГ включает в себя отмеченную функциональную последовательность этих трех компонентов.

Исследование влияния фосфолипидных аналогов мембран ХГ на отмеченные переноса влектронов мекцу отмеченными белками показало, что некоторые фосфолипиды способны оказывать модулирующее воздействие как на процесс переноса влектронов от дат. к

КМБ, так И от КЫБ к мДЕМ.

Результаты настоящего исследования вносят существенный вклад в исследования молекулярной организации биологических цепей переноса влектронов. Полученные данные могут также быть вф-фективно использованы для выявления общих закономерностей структурно-функциональной организации секреторных гранул.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации' опубликовано 5 научных,статей. Материалы диссертации были представлены на 6-ом Международном Симпозиуме по Биологии Хром аффинных Клеток (Эдинбург, 1995). Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Института молекулярной биологии HAH РА.

Структура и объем -работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, общих выводов и библиографического указателя. Первая глава посвящена обзору литературы по теме диссертации, в первой части которого представлены современные представления об электронных переносчиках мембран ХГ и рассмотрены различные гипотезы относительно их структурно-функциональной роли.

как компонент:® эдиной цепи переноса электронов. Во второй: части обзора рассмотрены низксмолекулярные медьсодержащие белковые переносчики электронов, их структура и роль в функционировании биологических цепей переноса электронов. В третьей части представлены данные о влиянии лилидов на процессы переноса электронов. Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования, использованных в работе. В третьей главе представлены результаты собственных исследования, и их обсуждение.

Диссертация изложена на,116 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков и две таблицы. Библиографии включает 155 названий источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3 ходе экспериментов были использованы рефрижераторные центрифуги "К-70" и "К-24" фирмы "Janetskl" (ГДР). Значение pH растворов измеряли на рН-ыетре фирмы "P.adelkis" (Венгрия)" ОР-205". Спектрсфотометрические измерения проводили нз спектрофотометрах "Specord 11-40" фирмы "Zeiss" (ГДР) и "СФ-46" отечественного производства в термсстатируемых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,5 и 1 см. Полярографические измерения проводили с помощью кислородного анализатора "Beckaan" (США), снабженного электродом Кларка в герметичных термостатируемых кюветах. Ультразвуковую обработку проводили на прЕборе • "УЗДН-2Т" (отечаст-венного производства).

Экспериментальные данные были обработаны с помощью специальных компьютерных программ "Enzfitter" и "Plot-40"; статистическую обработку проводили по t-критерию Стыодента с помощью компьютерной программы "t-EASE".

XT выделяли из мозгового слоя свежих надпочечников крупного рогатого скота модификацией метода Hoffman и др. (1976).

Мембранную фракцию ХГ получали следующим образом: суспезию ХГ в 1,5 мМ К,Ма-фосфатнсм буфере, ptt 6,0-6,5, содержащем катз-лазу (2000 ед/мл), подвергали лизису. Лизис проводили- трехкратным замораашЕанием (в жидком азоте, или з системе' сухой лед -ацетон) и последующим размораживанием суспензии, концентрация которой составляла 10® (вес на объем). Лизат центрифугировали

rr:r 1500:. g, йо ыпн., после чего осадок промывали: сусп«адгрова-ди б 1/4 части начального объема буфера в снова центрифугировали зи тех же условиях. Осадок, представлякшй собой мембранную фракцию ХГ, использовали для получения препаратов цдт.Ь^б1, КМБ л цЩ, основываясь на ранее списанных процедурах очистки (Polies et. al., 1972; Бояджян и др., 1981; Григорян, 19S3; Петро-сяк, 1992).

Содержание меда в препаратах белков и липосом определяли двумя методами: методом Matsuba и lakahasM (1970) и методом Pcilon и Dawson (1963). Перьый из них. позволяет определить концентрацию как одно—, так и двухвалентных ионов меди, второй -концентрации двухвалентных ионов меди.

Концентрацию Д9.1 определяли спектрофотометрически исходя из значения коэффициента поглощения фермента при 280 им (logo ~ 12,4) iSkotlana, Icônes, 197?.'.

Общее содержание белка определяли по методу Lowiy и др. ¡1951), используя бычий сывороточный: альбумин в качестве стандарта.

Концентрации лигшдов определяли исходя их веса. При расчете молярных концентраций индивидуальных природных фосфолипидов за молекулярную массу.принимали среднее из пяти значений молекулярных масс соответствующих индивидуальных фосфолипидов с известным амрнокислотнш составом.

Определение удельной активности мДЕМ и регистрацию ышетик образования продуктов реакции гидроксилирования проводили методом Kusuya. и Nagatsu (1969), .при 37°С, используя в качестве субстрата тирамин. Метод основан на. спектрофотоме трической регистрации интенсивности оптического поглощения пара-акаибензальдегида (при X = 330 нм), образущегося при химической модификации продукта реакции - окситирамина. При расчете удельной активности фермента в качестве стандарта использован раствор пара-оксибенззльдегида.

Кинетику окисления аскорбата в процессе реакций гидроксилирования тирамина или дофамина, катализируеыих мДВМ, регистрировали при 23°С по методу Scotland и Irenes (1980), по уменьшению характерного для аскорбата поглощения при ■ 3Û0 нм (£-,qq=420

¡-Сщатику поглощения кислорода в процессе реакций, катализируемых мИЕМ, регистрировали при 37°С. Реакционная смесь содерг;а-ла мДЕМ, субстрат (тирамин или дофамин) и донор электронов (ас-корбат, ферроцианид или КМБ) в 10 мМ Па-ацетатном буфере, рК ь ,0. При регистрации вышеотмеченных кинетик в качестве контроля нспользозали инкубационную смесь, содержащую предварительно ан-жтивироранный. 110 мин, Ю0°С) фермент.

2а кинетикой окисления или восстановления цит.Ь=^ следили спектрофотометрически по уменьшению или возрастанию интенсивности полосы поглощения с максимумом прг 561 нм, характерней для восстановленной формы ютохрома и отсутствующей у окисленной.

При регистрации кинетик в присутствии липядов, белки предварительно инкубировали 10 мин с препаратами лилосом или мицелл при комнатной температуре.

Липосомы и мицеллы из индивидуальных фосфолипидоз. получали следующим образом: суспензию лигшда в 20 мМ К-фосфатзсм буфере, рЕ 7,0 120 мг липида з 1 мл буфера) подвергали ультразвуковой обработке в течение 20 мин при частоте ¿2 кГц и 10° С, в трубчатом концентраторе под током азота (Левчук п Воловик, 1983; Мзр-голис я Бергельсон, 1986). Для удаления высокомолекулярных агрегатов смесь центрифугировали 2 часа при 15000 5. После центрифугирования надосадочннй ' раствор подвергали гель-фпльтрацпа на колонке с Сефарозой 63, уравновешенней 20 мМ К-фссфатным буфером и_элшровали липядные везикула тем же буфером. В дальнейших

экспериментах'были использованы фракции со Стоксовым радиусом о

115 А.

Окисление или восстановление белковых- препаратов проводили инкубацией (10 мин, при комнатной температуре) о Ю-кратным молярным избытком окислителя или восстановителя, излишек которых удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 0-25 -

.Медь из состава КМБ удаляли инкубацией с зкнимсл.-хным количеством ЭДТА в течении 30 мин," реконструкцию проводили в присутствии двукратного молярного избытка СиС1., в течении 1С ш. Избыток окислителя, восстановителя, ЭДТА и 0иС1о удаляли гель-фильтрацией на сефадексе 0-25. Бее отмеченные процедуры проредили 'при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. КМБ, как акцептор электронов цит.Ь^ . Инкубация восстановленных препаратов цит.Ь^ с окисленными препаратами КМБ приводила к восстановлению последнего и окислению цитохрома.

-........... . I и I. .....

5 J.0 Время, дан

Э

Концентрация Е.1Б, м5Л

Рис.1. Окисление восстанавлезнкх "препаратов цит.Ь^ " в присутствии окисленных препаратов КИВ. а - кинетика окисления цит.Ьс^1. Реакционная смеоь оодеряала: 4 2 Ю-ь М цит-Ь^, 2,4 х Ю-4 М КМБ в 10 мМ К,Ыа-фосфатнои буфере, рН 7,0. Регистрацию проводили во временном режиме работы прибора; проведено 9 подобных измерений (три отдельных эксперимента, каждый из • которых включал три параллельных измерения) в результате чего были нолучены практически совпадающие кривые, б - зависимость скорости окисления цит.beg., от концентрации МБ, Реакционная смесь содержала: 4 х 10~5 М цит-Ь^^ и отмеченные на графике концентрации КМБ в 10 мМ К,Ка-фосфатном буфере, рН 7,0;

На рис.1 (а) показана кинетика отмеченного процесса, а на рис.1 (б) - зависимость скоростии окисления цит.Ь^ от концентрации КМБ. Экспериментальные точки, представленные на ркс.1 (С) хорошо описывались уравнением Хилла:

7о = V х SH/ (kd + S2) с kd = 1,85(±0,02) мМ; V = 5,7(±0,15) мМ/тш; ïï = бС+0,2) -(М±м; n-Z)

где V - скорость окисления цитохрсма, S - концентрация КМБ, -константа диссоциации, а H - число активных центров в пределах одной молекулы цитохрома, способных к взаимодействию с КБ. Та-образом, процесс взаимодействия КМБ - цит-Ь^ имеет положительно кооперативный характер, а стехиометрия связывания составляет 1:6. Иными словами, одна октамерная молекула цит.Ь=^1 способна к взаимодействия с шестью молекулами КМБ, Последнее находится з хорскем соответствии с соотношением электронодонорных групп КМБ и цитохрсма - 1:6 и свидетельствует о том , что каждый из шести гемсв, входящих в состав цит.Ь^ способен к взаимодействию с медью активного центра КМБ (белок содержит 1 атом меди на молекулу массой 10 кДа). Окисления цит-Ь^., не наблюдалось ни в присутствии восстановленных препаратов КМБ, ни его' окисленной апо-формы.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что КМБ способен выполнять роль непосредственного акцептора электронов цит.Ьц^^ Добавление восстановленных препаратов цитохрома с либо Ь^ к окисленным препаратам КМБ не приводило к восстановление последнего и соответственно окислению отмеченных цитохромов, что определенным образом свидетельствует о специфичности процесса взаимодействия КМБ с inra.tw,.

5о 1

2. а® как донор электронов мДШ На следующем этапе исследований было изучено взаимодействие КМБ с мДБМ. Инкубация препаратов мДЕМ с тирэмином или дофамином в присутствии восстановленных препаратов КМБ приводила к образованию соответствующих продуктов гидроксилирования - оксн-тирамина и норадреналина. В присутствии окисленных препаратов ЯШ или его восстановленной апо-формы этого не наблюдалось. Таким образом, на основании полученных данных, с учетом того, чт';

{.шляясь гкдроксилазоа со смешанными функциями) не способна катализировать характерные для нее реакцда е- отсутствии внешнего донора рлектронов, мы припли к сднозна->шоыу Е-лзоду, что КМБ способен выполнять роль донора электронов ь реькциях катализируемых

Для того, чтобы оценить эффективность а специфичность Ю.З ■сак донора электронов ДБМ, мы сравнили его с наиболее эффективные: г.з функционирующих in vitro донорами ьлектрэнов фермента -чскорбатсм и ферроцианидо;.:. Нл pro.2 сравнены кинетики образова-ei:.i океитирамина и югнетикк поглощения кислорода в реакции п;д-роксилировакия тдрамкна, катализируемой х'ДЗМ, в присутствии КМБ, аскорбата и ферроцианида. Из представленных данных очевидно, что наиболее аффективно образование продукта к поглощение кислорода

отвии КМБ (1), аскорбата (2) и ферроцианида (3). Реакционна

смесь содержала: а - 2 х 10~^ М ыДЗМ, 2 х 10~' Ы пграшш и соот-

— ь —А

ветствуший донор электронов; б - 2 х 10 " М мДВУ, 2 х 10 Ы

тмрадан и соответствующий донор олектроноЕ. Кинетику регистрировали в 10 мМ Ла-ацетатном буфере, рК 6,0. Указанные на графике экспериментальные точки являются средними трех отдельных, экспериментов, каждый из которых включьл три параллельных измерения. Для каждой яз них отмечена величина стандартного отклонения (±ff)

Удельная активность мДЕМ в присутствии КГЛЗ в 1,5 и 2 рас; .а вше, чем в присутствии асксрбата и феррсцианида соответственно (тоблгца '}.

Таблица 1

Данее субстрат

электсоусз тнгамин дсс.амив

КМ5 =•5.1 ± 7,5 .15.1 ± 7.1

¿3.3 г 6,7 ЗД,.1 ± 5,п

Феррейнам: :д 28,9 ± 4,2 22,1 ± 3,7

/дельная аггг-зностъ (М ± и) в присутствии Ю.Б,

юкг.рзатз и •фзрроц^зкзда.

Регистрация завистилссти начальной скорости поглощения кислорода от концентрации субстрата и донора электроноз и применение преобразований Лайиуизера-Беркз позволил! нам определить ¿сп-геткческие ларамэтры исследуемой реакции з случае каждого ии грех нцпестмечэнныг доноров электронов. Согласно получении;.* данным максимальная скорость поглощения кислорода в процесса реакции тадрс:-:зплгровйния тирампнз в присутствии КМБ приблизительно в 1,5 '.I 2 раза сшз, чей з присутствии аскорбата и феррсцианида есот2*?етзеняэ Iтаблица 2). Креме того, как елгдг*? из значений з присутствии КМЕ сродство мЯБЫ к субстрату чем в присутствии феррсцианида и аскорбзта, и в то з:ч время сродство .чДЭЛ к ЫБ бсльсе, чем к другим зьпестмэченгпдл донорам электронов. Аналогичные данные были получены и при использовании в качестве субстрата дофамина. Следовательно является более эффективным декором электронен *.гЯЕМ, чем зск-;;:-ба? или (^еррсцяаяид, что свидетельствует о сдецифичнс^тд окислттелькс-вассттасзптельксй реакции между эт:"/. ".»¿-■•г.ч и ферментом.

Таким образом, исследования взаимодействия И.Е с ци?. а^. е одной сторона, и и НЕ!,! , с другой, позволяют сделать 'ни-зед о возможности фунгциенпреззния етего белка п релт ауц-птсга электроноз цптегрема и донора элзктрсысв ДЕМ.

Таблица 2

Донор электронов ■ к^ донора электронов, ю-4 и (М ± а) V поглощения -5°2 ' 10 М/ыин (Ы ± т) тирамина, "ю-4 м (М г Ы

КМБ 4,09 ± 0,22 ' 5,09 ± 0.12 1.29 ± 0,03

аскорбат 5,02 ± 0,52 3,33 ± 0,17 2,13 ± 0,02

ферроцканщх 6,25 ± 0,14 '| 2,27 ± 0,03 3,71 ± 0,11

п=2

Кинетические параметры реакции гидроксилирования тирамина в присутствии КМБ, аскорбата и ферроцнанида, определенные при изучении зависимости начальной скорости поглощения кислорода от концентрации донора электронов и субстрата (тирамина).

3. Реконструкция участка цепи переноса электронов, включавшего дат. Ь^ 1, КМБ и мДБМ

В следующих экспериментах изучение донорно-акцепторных отношений цит.Ь^1, КМБ и нДБМ проводили при использовании системы, включающей одновременно все три отмеченных белка.

Результаты экспериментов показали, что в присутствии восстановленной формы цит.Ь^^1 и окисленной формы КМБ мДЕЫ Способна катализировать характерные для нее реакции. При отсутствии, КМБ или при замене цитохрома его окиоЛеййой формой, этого не .наблюдалось.

На рис.3 (А) показана кинетика образования окситирамина в реакции гидроксилирования тирамина, канализируемой мДБМ, в присутствии различных соотношений восстановленной формы цит.Ь5б1 и окисленной фэрмы КМБ, при насыщающей КШЦбйтрации субстрата. В этих условиях эффективность реакции зазисйт только от концентрации цитохрома и не зависит от концентрации КМБ.

Так, если цитохроы взят в том ке молярном избытке (по числу* електрондонорных груш) по отношению к мДБМ, что и субстрат, независимо от того, находятся ли мДБМ и КМБ в вквимолярных со-

*ка одну лалекулу цуяюхрола приходится 6 лоаекул гела, КМБ - 1 атол леди, ДБН - Л стола леди; ■ „ м

для ггЮроксилирования одной лолещии суастрта необходил перенос ка ДБЫ двух электронов.

отношениях (•-•), или последний взят в избытке по отношению к ферменту (в-ш), эффективности реакций практически одинаковы.

А330 -

Время, мин

Рио.З Образование окситираминя в процессе гидроксилирования тирашша под действием мДБМ. А - в присутствии восстановленных препаратов цит.Ь^ и окисленных препаратов КМБ; Б - в присутствии восстановленных препаратов КМБ. Реакционная смесь содержит 3 х 10"

ции штохрома и КМБ: (»

М мДБМ, 3 х 10 ' М тирамин и еле душке концентра) - 10"7 М цит.Ь(-й1, б х Ю-7 М КМБ;

7 -р ~ -р

(•-•) - 10 ' М цит.Ь5б1>.1,2 X 10 ° М КМБ; (п-в) - 2 х 10 - М ,-8 и тли?. _ с х 10~9 М цкт.ЪС£ ^,

6 х 10"7 М КМБ; (*-») - 1,2 х Ю-8 М

л-7

561'

1,2 х 10~а М КМБ; (х-х)

Ь х

10'' М КМБ; (о-о) - 6 х 10"' М КМБ; (*-») - 1,2 х 10 ~ М КМБ. Кинетики регистрировали в 10мМ N8-346181110« буфере, рН 6,0. Указанные на графике экспериментальные точки являются средними трех отдельных экспериментов, кавдый из которых включал пять параллельных измерений. Для каждой из них отмечена величина среднего,квадратичного отклонения (±т).

Дальнейшее повышение концентрации цитохрома не приводит к возрастанию.эффективности реакции. По мере понижения его концентрации, независимо от концентрации КМБ, эффективность реакции также понижается. При эквимоляряых соотношениях цитохрома и ьДБМ, независимо от того, находятся ли мДШ и КМБ в еквимэляр-

üi3t ссотаадензя* (п-с), пет последний взят в избытке по отнсшэ-:г.го к фераенту (х-х), гвдроксидировавия тиракинэ кз наблюдалось. Для сравнения на рис.3 (Б) показаны тая® кинетические кривые , образования окситирзшна . в реакции гпдроксилпрозания тпрэмина, катализируемой-ДЕЛ. полученные в отсутствия • цпт.Ц-.,, при использовании восстановленных препаратов КМВ (дЕухксмпснент-гая система). Как видно из представленных дан- них, когда VU3 гоят б том же молярном избытке по отношению к мДЕЛ, что и субстрат- (с-о), эффективность реакции практически та аз, что и s случае использования трехксмдонентных систем с избытком ццтсхро-!л-д (,•-•; ■-■). Дальнейшее псг.иаекиэ какцеитрыдш КИЗ не приводило к возрастанию эффектавксата: реакция. По мари понижения концентрации ХМБ &$ф»кигаиоеть р*окцак понижается. Пси эквимслярных . ¿отношениях мету К?ЛБ и мДЕМ (а-*), гвдроксидирозаняя ЯЕрэмина еэ чаб-ссдалось.

Регистрация зависимости начальной скорости поглощения О, от концентрации цит.Ь--^ (восстановленная форма) в реакции- гидрок-сядарования тирзмиза при еквиыолярны* соотношениях меаду к.\е (отеленная форма) и мДЕМ и применение преобразований Лайнунзе-рз-Берка позволило определить значение k}J для иит.Од,:.,. SM сравнения подобным образом было также спэредел-зно значаще' к,, для KS в двухколонен гной системе (восстановленный - мДБ'Л). соотносив» KMS я пиг.'с--^ 6:1. 5тст факт, о одной стороны, япляетея дорогим подтверждением ранее установленной нами стехиометрии взаимодействия КМБ-шт.Ъа с другой - свидетельствует об идентичности насыдаащкх ксц-?нтраций этих декоров электронов для реакций, катализируемых мДЕМ.

На рис.а сравнены кинетики окисления восотанссленксй форма б реакциях гадрскекялровяния тиромнна и дефзыика, катализируемых мЛЕМ, в присутствии окисленной форма. K.S Ш и кинетика окисления ццтохреыа, подученная при использовании дзухкем-понеятной система (восстановленный ци.Ь-^ - окисленный EMS) при тех же соотношениях мвзду цдтогромом*и КЛЗ(б). Сопоетодлени* данных, представленных на ptc.4(a) и 4(5) наглядно дАкагстриру^т функциональную взаимосвязь компонентов реконотруирозагеюй системы и последовательность переноса элэктрснса от цпт.Се^ к K.G и цДЗ-i, сопряженного с ггдроксилир-сзанаем тирамана или дофамина: в "3PSCM случае va процессом восстановления К4Б под действием

терема следует окисление последнего под действием цДЕН; во втором перекос электронов ограничивается яшь отехкометрическ-им восстановлением КК'В. Поэтому, к тому времен::, когда процесс о'сисления питсхрома для двухкомпеяентноя системы достигает нас.ч-зения, в случэр трехкомпенентной енсте.а с;н езд продолжает нарз-

С'ТЗТХ .

Рис.4. Окисление восстановленных препаратов цит.Ь^.а - в процессе реакции гидроксилирсвакия тиражи а (1) и дофамина (2), под действием мДЕИ, в присутствии окисленных препаратов КМБ; б - при использовали двухкомпонентней системы: восстановленный Ш!Т.ЬС61-окисленный КМБ. Реакционная смесь содертмт: а - 4 х 10"й М ШТ.ЬС61, 4,8 X Ю-7 М.КМБ, 1,2 X 10~7 М мДБМ, 1,2 х 10М шрамин или дофамин; б - 4 х И'цит.Ъ-^^, 4,3 х 10 7 М К\5. Регистрацию проводили во временном режиме работы прибора в 10 мМ К,Ка-фосфатном буфере, рН 7,0.

4. ЗАКЛЮЧЕН!® К РАЗДЕЛАМ 1-3 Как рте было отмечено, до настоящего времени не был идентифицирован ел.е1;трэкякй переносчик, функционирующий в цепи перекоса электронов-мембран ХТ мезду цит.ь^ к мДВМ. О кзличта тпкего промежуточного переносчика свидетельствовал тот фзкт, что хотя восстановление цит.Ь-^1 в конечном итоге и приводило, к восстановлению мДБМ, однако, в силу высокой разности ыезду окислитель-но-восстаковительнкми потенциалами стм?пеглих оелгав, прямого

- U -

.:.vj.!-:!ijca электронов между ними не наблюдалось (TeirLand, Hat-, nark, 1ЧЯ0). В представленных выше экспериментах мы исследовали бормсжность функционирования КМБ (физиологическая роль которого до настоящего времени не была установлена).ранее обнаруженного в составе мембран ХГ (Helle et.al., 1978) как промежуточного звена на стадии переноса электронов от цат.Ьд^ к нЦБМ.

Результаты ■ по изучению донорно-акцепторных отношений цит.ь^, КМБ и мДБМ как в двух компонентных системах (цит.Ъ^., - КМВ; КУБ - мДБМ), так и в системе, включающей все три выщеот-меченнных белка, полученные рядом независимых методов (регистрация кинетик окисления идт.Ь^й1, кинетик образования продуктов реакции .гидроксилированю*, катализируемых мДШ, и поглощения кислорода в этих реакциях), позволяют сделать вывод о возможности Функционирования КМЕ как промежуточного звена на стадии переноса электронов от цит.Ь,^ к мДБМ и с достаточной степенью вероятности предполагать, что один из участков цепи переноса электронов мембран ХГ включает в себя отмеченную функциональную последовательность этих Tpei компонентов.

Поскольку апо-фэрма КМБ не оказалась способной ни принимать электроны от цит.Ь^, ни передавать их мДЕМ, мы пришли к выводу, что окислительно-восстановительные свойства КМБ обусловлены гдличием з его состазе переходного металла - меди.'Следует отметить, что реконструированный белок вновь восстанавливал способность к участию в окислительно-восстановительных реакциях. Низксмолекулярные медьсодержащие переносчики электронов широко рзспострак-яы в составе цепей переноса электронов растений и микроорганизмов. Многие из них, как было ранее отмечено, функционируют на этапах переноса электронов от цитохромов к концевым скпидазам (Adman, 1588; Nakamura, 1988). Однако, КМБ, во многом схожая с ними по своим физико-химическим параметрам, является лерчыы белком подобного типа, обнаруженным у животных (Григорян, 1983).

5. Влияние фосфолипидов на процесс переноса электронов

от цит.Ь=й1 к КМБ и от КМБ к мДБМ J

.шпиды, в частности фосфолишды, играют существенную роль ь функционировании цепей переноса электронов, входящих в состав

биологических мембран, обеспечивая наиболёе выгодное для работы электронных переносчиков окружение; модулируя их структурно-каталитические свойства (выполняя, таким образом, регуляторную функцию); воздействуя на стабильность и мобильность компонентов

цепи переноса электронов и т.д.

Учитывая вышеизложенное, нами была предпринята серия экспериментов по изучению участия фосфолипидных компонентов мембран ХГ (фэсфатидилэтаноламин (ФЭ), лизофосфатидилэтаноламин (лФЭ), фосфатидалхолин (ФХ), лизофоефатидилхолин (лФХ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидная кислота (ФК), моно- и дифосфатидилинозити-дов) в реакциях переноса электронов. В результате экспериментов было установлено, что ряд фосфолипидов способен оказывать- как активирующее, так и янгибирутощее воздействие на отмеченные реакции на стадиях переноса электронов от цит.Ьссч к КМЕ и от КМБ к

окисленной формы КМБ в присутствии в« (1), ФС (2), без липяда (3), ®Э (4) и лФЭ (5). Реакционная смесь содержит 1,5 х 10~ь м шга.Ь^.,, 2 х 10~5М КМБ и 10~3 М'соответствувдиЯ липид в 10 мМ К,Ка-фосфатном буфере, рН 7,0. Представленные на графиках экспериментальные точки' являюися средними трех независимых экспериментов, каждый из которых включал пять параллельных измерений; в среднем, для каждой из них коэффициент вариабельности не превышал 8%.

показали проведенные эксперименты, ФЭ и дЗЭ ак?ащзоаа~ ли, ч ФК и ас ивгибировали процесс переноса влектронов от ют.Ь-,-, к КМБ. Остальные из исследуемых фссфолипидов не оказы-вяли существенного воздействия на отмеченную реакцию. На рис. 5 показано воздействие ФО, лФЭ ФК и ФС на реакцию переноса электронов от цат.Ь^ (восстановленная форма) к КМБ (окисленная форма).

[Ь). Реакционная смесь содержит 5 х Ю"а М мДЕМ, Ю-6 М ШБ, 2 х Ю - М тирамин и 5 х Ю~" М соответствующий липид в 10 мМ ГГа-адатзтном буфере, рН 6,0. Кинетику регистрировал:! в 0,5 см кювете. Указанные на графиках экспериментальные точки являются средними трех отдельных экспериментов, каждый из которых включал -лть параллельных измерений. Для каждой из них отмечена величина стандартного отклонения (га).

Остальные йз Исследуемых фосфолипидсв.не оказывал! суце-STBfîmoTo воздействия на отмеченную реакцию. Аналогичные ое-зуль^аты вали получены при регистрации, в тех же условия?, кг-нетик тпжлицешя кислорода Б' процессе гидроксилирования двух субстратов мДВМ - тирамина и дофамина.

. Поскольку, как активирующее, так и ингибирухщее воздействие вшеотмеченных фосфоляшдов проявлялось и- в том случае, когда вместо КМБ в качестве донора электронов использовали ае-корбат или ферроцианид , ш праали к выведу, что отмечейш--эффекты обусловлены непос'редетвешым йзакмодействием фосфолшгг-дов с адЦБМ.

Таким образом, полученные нами данные Свидетельствуют о том, что некоторые фосфолипвды, входящие в состав мембран ХГ, способны модулировать реакции переноса электронов меяду КМБ и мДБМ. В целом, за исключением ФЗ, нейтральные фосфолипвды (ФХ, лФХ, лФЭ! проявляли активирующее бездействие на отмеченные реакции; ФЭ действовал как 'активатор на этапе переноса электронов от цит.Ь^ к КМБ и ингибаробали Процесс переноса электронов от КМБ к мДБМ. Кислые фосфолипиды (4x3 и ФК) ингибировали процесс переноса электронов на обоих этапах.

Нам удалось в определенной степени прояснить механизм инги-бирующего воздействия кислых фосфолипидсв На обоих этапах переноса электронов. При гель-фильтрации на колонке с сефарозой сВ смеси, содержащей мДБМ или КМБ и липосомы, сформированные из ФК йли ФС, медь, входящая в состав активных центров этих белков, обнаруживалась во фракции липосом. С другой стороны, при наличии в инкубационной смеси екзогенной меди, ингибируюдего воздействия ФК и ФС не обнаруживалось. По видимому, медь связывается с отрицательно заряженными головками кислых фосфолшидов. В этой свйай становится понятной более высокая степень йнгибирования реакций переноса электронов со стороны ФК, по сравнению с ФС, так как суммаршй отрицательный заряд первой больше, чем у последнего. Поскольку белковые глобулы мДБМ и КМБ в целом несут отрицательный 'заряд , можно предполояотть наличие на поверхности етих белков локальных положительно заряженных участков по которым и происходит взаимодействие с кислыми фоефолигшдами. Ряд экспериментальных данных свидетельствует о наличии подобных участков в составе молекулы мДШ (Scotland, Ljones, 1979)- Не исключено,

— 19 -

на небольшой размер его молекулы, КМБ также содержи подобные участки, как это, например, имеет место в случав сходных с ним по размерам "синих" медьсодержащих белков.

На первый взгляд можно заключить, что воздействие кислых фосфолипидов на КМБ и мДШ, сходное с воздействием многих хела-тсрав меди (Scotland, Ljones, 1979). не является специфичным и, с физиологической точки зрения, достойным обсуждения. Однако, следует обратить внимание на тот факт, что, как показали эксперименты Saxc-na и íleming (1981), часть молекул мДБМ в своем исходном липидном когкроокружении в составе мембран ХГ представлена з виде апобелка, причем, медь при этом находится в комплексе с отрицательно заряженными головками <5С - основного „■¡плица в микроокружении фермента in vivo. Таким образом, не исключено, что результата, полученные наш: при исследовании воздействия кислых фосфолипидов на мДБМ (а возможно и КМБ) in vitro, отражают процесс, имеющий'место in.vivo.

С другой стороны, специфичность воздействия нейтральных фосфолипидов на отмеченные реакции переноса электронов очевидна и проявляется как на уровне воспроизводимого аффекта (активирование или ингибирование), так и на уровне самих реакций.

Более высокая .степень активации реакций переноса электронов в присутствии лизо-форм липидов - лФЭ и лФХ, по сравнению с S3 и ФХ, соответственно, является, на наш взгляд, следствием того, что при одной и той же исходной концентрации фосфолипида в смеси, в случае мицеллярных везикул, образуемых .лизо-формами липидов, количество везикул, способных, к взаимодействию больше, чем в случае моноламеллярных липосом, образуемых ФЭ и ФХ.

Интересно отметить, что некоторые из вышеуказанных фасфа-лютндов - модуляторов тесно связаны с изучаемыми наш белками, составляя in vivo их непосредственное лишдное окружение. Так, К является составным компонентом липидного микроокружения ш:Т-Ь5ё1 <Ретросян, 1992), а ФХ и ФС - мДБМ (Saxena, Fleming, 19Э1). К сожалению, пока еще ничего не известно о липидном мик-рсокружешщ ЕМБ.

Таким образом, сопоставив приведенные факты с полученными яамя данными, можно допустить возможность участия липидного микроокружения unT.b5g1 и мДБМ в реакциях переноса электронов, осуществляемых: этими белками, при наличии ШБ в качестве проме-

- ГЭ -

;.утсчнсго звена. Выполняют ли фогролипиды регуляторну^ рс.г. , осуществление которой всзмоаяо как в случае их взаимтагг-е) rvf-

У^Я ---> ФЭ--> ОХ) (Мецлер, 1980), так и рзаитзгчй;»"::;;

(латеральная диффузия или механизм флип-флсп) (Марголис, или s:e липидное окружение отмеченных белков всегда постоянно и создает в комплексе ту микросреду, которая обеспечивает им наиболее эффективное функционирование - ети вопросы требуют dbi-í:; дальнейшего решения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

i. остановлена функциональная роль обнаруженного в состав0 меч-Сран хромаффиншга гранул кислого медьсодержаяего белка:

а. Показано, что кислый медьсодерясашй белок функционирует р составе цепи переноса электронов мембран хромаффинннх грянул "ч участке между цитохромом b-g1 и мембранной формой дофамин-f?-«/o-, нооксигеназы, как акцептор электронов цитохрома и донор электронов дофамиЕ-0-монооксигеназы. .

б. Проведена реконструкция участка цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул, включающего датохром кислый медьсодержащий белок и мембранную форму дофамин-0~мснооксигена-зы.

2. Выявлено специфическое модулирующее воздействие ряда индивидуальных фосфолипидов мембран хромаф$шлшх гранул, на реакции переноса электронов между цитохромом b4g ^, кислым медьсодержащим белком и мембранной формой дофамкн-р-монооксигена-зы.:

а. Установлено, что одни фосфолилиды способны активировать, а другие - ингибировать отмеченные реакции переноса электронов; 3. На основании полученных данных, с учетом того, что некоторые из отмеченных фосфолипидов - модуляторов входят в состав непосредственного микролипидаого окружения цитохрома.и мембранной формы дофамин-р-ыонооксигеназы, выдвинуто предположение о возможной рэгуляторной роли фосфолипидов in vivo в отношении отмеченных реакций переноса электронов.

- 20-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ огаавоян Л.Л., Боядаян A.C., Петросян С.А., Карагезян К.Г. Клслый медьсодержащий белок - промежуточное звено на стадии переноса электронов от цитохрома ЪС(;1 к дсфзмин-0-монсоксиге-4338. Молекулярная биология, 1991, т.25, вш.1, С.99-104. Петросян С.А., Бояджян A.C., Карагезян К.Г. Участие белковых :: липидных компонентов мембран хромаффинных гранул в реакциях катализируемых дсфамин-^-монооксигеназой. Нейрохимия, 1992, Т. 11, С.70-78.

3. Есяджян A.C., Петросян С.Ам., Петросян С.Аш. Карагезян К.Г. реконструкция участка цепи переноса электронов мембран ;:рсмз£флных гранул, включающая цитохром кислый

медьсодержащий белок и дофамин-ß-мснооксигеназу. Доклады Академии Наук (Российская Академия Наук, LAPS, NA\JKA), 1S95, Т.344, Н.6, С.

1. Bcyi.jian A.S., Petrosyan З.Н., Pogosyan A.G., Aivazyan Т.A., I-'arsgyuzyan K.G. Association of dopamine-0-monooxegenase with chromaffin granule membrane phospholipids. Abstracts of the 3th International Symposium on Chromaffin Cell Biology, Edin-burg, Scotland, 1995, P.86.

5 Петросян С.А., Погосян А.Г., Айвазян B.A., Маилян K.P. Цепь переноса электронов и ляпид-белок взаимодействия в мембранах л-рсмаэдинных гранул. Материалы научной конференции, посвященной 30-илетию основания отделения Биофизики биологического факультета Ереванского Государственного Университета. Ереван, 1996.

UniuuifiCui ¿milujqujumfi lltuipnuiuiG (&T»nimnfiGä u|UipniGuil)nii rnqfunuilpugft туЬрр ppinJuj^jiCiuiliG <H>tuGmjGbpfi ¡«ur|u<GpGbpfi tlblíutpnGGIrpJi мЬцшффйшВ 2Hpiují> qjipbCbmpimQniJ

асгФПФач.Г'Р

Цвппт! puinbp1 tí]bljuipnüGbpti iribr)iui|injUTiuI; ppmSiu^jiümifiü

qpiuGni|Gnp

uUpljuijnulu прпгЦшй t np BpmliufcbGuntiG qpiuanqGtpb («4) pirnimGpGUnui qjipônuî t tlU)uipnüübp}t uitriuujinJuduiO гпрш, np(i ilfijngmj Ipauiuipilni.' !; GnpiurjpbGiuifiGfi IjbGuujuJiGebqfi Яшйшр uiGßpiudhjm iJtrpuilpjuGqGb» ßujiJuipttbjiGlii (, Лишш1(1иршрп1\1п : UuiljWjQ G?i(uiô îqpuiifi n¿ ргцпр ршцшдошЛииЬрС ЬО npn^iu.v ЦшиСшЦпршцЬи muipqijuiô it gfunncptxl b$6¡-¡t (gjun.bjfei I U ;л(8иц|| '.(Lp. i-unU: ogujiqiiiqji - ршцшСршфй rçn4>imIfifl-p-iînGnjBu}iC(iïiiuiqti (pT-PLTl - iI|t«U цпрзпц if}i£iuElßii/[ orjuityp: ЪЫ(Ш|шд«)шй ui?|uiumuiG£f> (uGijftpG tp fibuituqnmtq pmrjiuGpCbpfig 1иС?ши4ш0 ppni ujrçfiGà ufu'pmfiiuljmi uujfiLnuiljmgf) (MU) qnpSGtnijbjuiG RGujpuiijTípnipimGp npu)bu J¡i2iuGlj¡uii oqiulj gfim.b5(,¡-¡is r).ua|¡i (ЛРУ tlhUinprGGtp}) ifmjuiuGoduiü фпцпц!:

LTfi ?шрр U1GI|UÍ¡U briwQml(Gbpml дпцд t шр^шб, np P-'W-fi opufityuigvluiS Jon t\tl(inpnGOtpli т^дЬцглпр t fhuGntmiuGniJ i{bpiut|UiQq.Giluiü 9t"n.b56i-|> fituiJuip: ITliUiduttfuiGuilj f¡t¡uiuiqnmmp¡niC!¡t¡pii 4№inul t¡ü, np ^Ьри^щСцй^шЛ

fiuiGqbu t qiui[iu npujtu p^RLT-ti шпшЦЬ] mprvimGmi)tm tlUlpnpnGGbp}) ryiGnn: МштшрЦЬ) t]bljuipnGGbph ifinJutuGgiIuiG 9hi"-bS6i, fa-'HU Ь pT-PU-frg

4uiqtfi[ui& uitr\ujiJujuJi iftpiulpunnigrutf U дпцд t mpi[ti GiJuiG фгршЦшптдфлй гцрШ1П>1 tlbl)inpnGGbph ifinfuuiripvIuiG fiGu¡piui|nr,~'l№1-G ^ typuiG fiiujnpqni\ p'î-РЦГ ni¡ ljujiniuifiqi{nq fifiripniiufiiiugiluiG ntnul|g)iuJ]f) fipmqnnônulp:

¿twwqnuii(t[ t dutU -fiQ pumiuGpGiíjifi L/wqüp Ob? JinUnq i!fi фпифп^чИСЬТф uiqri-tgmpiniGp Gji(i¡j5 iii^jiinmlímoGtrpf) wtrifi mGtgnr¡

títljmpnüGbpb i)m)uuiGgiJuiG »Jpur. ¿bmuiqninijuii 4>nu$ni)iujhn.Gtplig ¡3iuG¡<u¡i Ifuiinujpnu! UG GjiJuii nbuilígfiuiGbph tiGf¡(ip|iuinp|i, |iul) U¡niuGbpn' (иЦтИи^ппрЬ ¿uij4h umGtqni| ui]G BuiGqmdiuGjjp, rp G?i)uj& tínrpwjiumnp ^ru^n^mfirjGbpbg mtiuGp iIinGnuI UQ gfiw.bS61 U pT-PlT-ft шС^^ш^шС tf(il{pn2p?uii4muifi l^uiqil¡i iJtf, рБСшрЩпи! t DpiuGg in vivo рЬрр tlbl|tnpnGGUpt> тЬпшфп^Цшй tibuil(gtiuiGUp|i l)uipqiui|npnulnuï: