Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белков, ассоциированных с микротрубочками, в хромафинных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование белков, ассоциированных с микротрубочками, в хромафинных клетках"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.321

Северин Федор Федорович

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С МИКРОТРУБОЧКАМИ. В ХРОМАФФИННЫХ КЛЕТКАХ

Специальность 03.00.03 -'Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководители: доктор биологических наук В.И.Гельфавд.

кандидат биологических наук В.И.Родионов.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор О.М.Васильев

доктор биологических наук.профессор Н.Б.Гусев

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится: ^ Р. (с¿^¡лЛ^_1992 г.

в ХР. час. на заседании специализированного совета Д 053.05.70 в Институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (П9899, г. Москва. Лен. Горы, МГУ, корп. "А")

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического ф-та Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

1992 Г. / ,

Ученый секретарь специализиррбашюгорсовета кандидат химических наук В.Н.Кэграманов.

Введение.

Актуальность проблемы■ В последние годы широко изучается роль микротрубочек в транспорте органалл и в определении их пространственного расположения в цитоплазме. Один из наиболее ярких примеров опосредуемого микротрубочками внутриклеточного транспорта -быстрый аксональшй транспорт. В нейроне вещества, синтезированные в теле клетки, перемещаются в мембранных везикулах вдоль аксонов на значительные расстояния ( десятки сантиметров). Установлено, что такой транспорт осуществляется по микротрубочхам с помощью так называемых белков-транслокаторов. Аналогичным образом перемещаются, например, лизосомы в макрофагах (ноПепЬеск, эмапзоп, 1990) и меланосомы в меланофорах (НскНопоу et а1.,1991).

В го же время, роль микротрубочек в таких транспортних процессах, как экзоцитоз и секреция намного менее понятна. Известно, что разрушение микротрубочек, как правило, мало влияет на уровень секреции. В то же рремя, сеть микротрубочек, по-видимому, определяет направленность доставки материалов к плазматической мембране. Так, после деполимеризации микротрубочек в клетках поляризованного эпителия, экзоцитоз некоторых белков осуществляется на "неправильной" стороне плазматической мембраны, а в фйроОластах разрушение микротрубочек препятствует направленной доставке секреторных везикул к активному краю ( кепу, 1990).

Эти данные указавают, по-видимому, на то, что зависимый от микротрубочек транспорт вряд ли принимает прямое участие в секреции. Роль микротрубочек состоит, вероятно, в организации

пространственного распределения органелл* и в юс сортинге. Действительно, полученные недавно биохимические данные указывают на возможное участие микротруОочек в сортинге, а результаты электронной микроскопии свидетельствуют о взаимодействии секреторных везикул с микротруСочками { Goits et ai, 1992). Однако непонятными остаются биохимические механизмы взаимодействия микротрубочек с секреторными везикулами.

Важным фактором, определяющим внутриклеточное распределение секреторных везикул может являться пространственная организация самих микротрубочек, которая, как известно, опосредуется взаимодействием микротруОочек с различными цитоскелетными структурами. Если взаимодействие микротрубочек с акпшовыми шпсрофшгзментами и с промежуточными филаментами описано и охарактеризовано, то о биохимических механизмах взаимодействия микротруОочек друг с другом известно значительно меньше.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP) в хромафЕинных клетках, а именно идентификация таких MAP, которые опосредуют взаимодействие микротрубочек с секреторными гранулами и друг с

ч

другом. Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем: (I) охарактеризовать взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками; (2) выяснить, какие белки ответственны за взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками; (3) идентифицировать белок, участвующий во взаимодействии микротруОочек друг с другом, ответственный за

формирование пучков микротрубочек.

Научная новизна работы В результате настадей работы впервые охарактеризовано взаимодействие хромаффишш гранул с микротрубочками in vitro. Показано, что взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками опосредуется белком MAP 2. Мдентифициирован и очищен неизвестный ранее белок с молекулярой массой 170 кД из хромаффинных клеток, вызывающий образование пучков микротрубочек.

Научно-практическая ценность работы Разработанные в нашей работе экспериментальные подхода могут быть использованы для дальнейшего изучения взаимодействия мембранных органелл с цитоскелетннми структурами. Разработанный метод выделения 170 кД-белка может быть использован для очистки MAP из различных источников.

. Апробация работы Материалы диссертации докладывались на школе-конференции "Механизмы клеточной подвижности^ транспорта органелл и структура мембранного цигоскелета" (Шладминг, Австрия, 1991); на Втором Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); на школе-конференции "Метода клеточной биологии" (Орхус, Дания, 1992) и на семинаре "Клеточная биология" (Вудс Хол, США, 1992).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания результатов, выводов и списка

литературы. Работа изложена нам" страницах машинописного текста, включая 16 рисунков и список литературы из / названий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы Материалы. Фосфоцеллюлоза (P-II) была получены от фирма Whatman. Субтилизин (бактериальная протеаза, тип vin) - от фирмы sigma. Таксол был любезно предоставлен доктором Н.Р.ЛомаКС (Drug Synthesis and Chemistry Branch, Developmental Therapeutics Programs, Division of Cancer Treatment, National cancer institute, Bethesda, MD, США). Остальные использованнке реактивы были получены ОТ фирм Sigma, Serva, Merck, Pharmacia и Bio-Rad. Антитела были любезно предоставлены доктором Т. Крейсом (Германия) и доктором X. Сакаи (Япония).

Получение микротрубочек и очищенного тубулина. Препараты микротрубочек из мозга крупного рогатого скота получали методом сборки-разборки (sheianski et ai., 1973) с небольшими модификациями (Kuznetsov et al., 1978). Основным этапом очистки являлась ионообменная хроматография на колонке с фосфоцеллмозой (Weingarten et al., 1975). О'ШЦеННЫЙ тубуЛИН В дальнейшем использовали для получения микротрубочек, свободных от MAP. Для этого к раствору тубулина (концентрации белка не менее 2 мг/мл) добавляли таксол до конечной концентрации 20 мкМ и инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Расщепление микротрубочек субтилизином. К препарату микротрубочек, полученных путем полимеризации

хроматоградаиески очищенного тубулина в присутствие 20 мкМ таксола, добавляли субтилизин и инкубировали как это описано в

работе (восиопоу а1, 1990). Контрольные микротрубочки инкубировали аналогичным образом без добавления субтшшзина. Протеолиз останавливали инкубацией смеси с 2 мМ фешлметилсульфонил фторидом в течение I часа при комнатной температуре. В контрольные образцы на этой стадии добавляли субтилизин, преинкубированный с фенилмегалсульфонил фторидом в течение I часа.

Электрофорез белков в поли а крил амидном геле. Электрофорез проводили в системе буферных растворов, описанной в работе Лзммли (ьаепгаи, 1970). В качестве разделяющих гелей использовали полиакриламидные гели с концентрацией акриламида 10% или градиентные гели с концентрацией акриламида 6-12%. Соотношение акриламида и ы,ы'-металенбисакриламида составляло 30:03. По окончании электрофореза гели фиксировали в 12,5% трихлоруксусной кислоте в течение ночи при комнатной температуре и окрашивали 0,1% раствором кумасси ярко-голубого £1-250 на 12,5% трихлоруксусной кислоте в течение часа при температуре 50-60°С. Для удаления^ несвязавшегося красителя гели промывали в 7% растворе уксусной кислоты. Иммуноблоттинг. Для переноса белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозу использовали систему "полусухого" электрофоретического переноса (КуЬзе-Апаегвеп 1984Далее иммуноблотинг проводили как описано в работе (искНопоу et а1., 1990).

Электронная микроскопия. Для исследования комплексов 170 кД-белка и микротрубочек исследуемый материал наносили на подложки и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата. Концентрация тубулина в суспензии микрогрубочек составляла

10 мкг/мл., концентрация 170 кД-белка - 10 мкг/мл. При анализе комплексов микротрубочек и хромаффинных гранул материал предварительно фиксировали 1% глутаровым альдегидом. Получение хромаффинных гранул. Хромаффинные гранулы получали методом дифференциального центрифугирования (Teriand, Fiatmark, 1980). Очищенные гранулы суспендировали в буферном растворе, содержавшем 1,5 М сахарозу.

Трипсинизация хромаффшшых гранул. Обработка трипсином проводилась при, комнатной температуре в течении 20 !.ин. Концентрация трипсина составляла I мкг/мл. протеолиз останавливали Соевым ингибитором трипсина (10 мг/мл). Аффинная хроматография на колонке с иммобилизованными микротрубочками. Колонку с. ковалентно привязанными микротрубочками готовили как описано в работе (Alberts et al.,i990). Ыатрикс, использованный для приготовления колонки, СОСТОЯЛ из смеси ÄffIgel 10 (Bio-Rad) И аКТИВИрОВЭННОЙ BrCN sepharose CL6B (Pharmacia), взятых в соотношении 1:1. Колонка была приготовлена в стерильном 10мл. пластиковом шприце. Объем колонки составлял 5 мл.

Контрольную колонку готовили тем же способом, что и опытную, но вместо микротрубочек использовали бычий сывороточный альбумин.

Осадок хромаффинных гранул суспендировали в буфере, содержавшем смесь ингибиторов протеаз и 0,5% Тритон Х-100. Экстракт осветляли при 150 ООО g в течении 40 мин. Связавшиеся белки последовательно элпировали буферами, содержавшими 2 мМ АТФ и 0,5 М KCl.

Соосавдение белков хромаффинных гранул с микротрубочками.

е

Связывание белков хромаффинных гранул с микротрубочками исследовали также методом соосаждения. Для этого экстракт хромаффинных гранул, полученный как описано выше, смешивали с суспензией полимеризованных таксолом микротрубочек. Смесь осаждали через слой буфера, содержавшего 4 M глицерин, и белковый состав осадков исследовали SDS-злектрофорезом. Микроскопия с видеоусилением. Для видеомикроскопии использовали световой микроскоп juiophot фирмы opton (ФРГ) с объективом 100x1,3 NA Plan-Neofluar И КОНДвНСОрОМ ICT, Микроскоп был оснащен видеокамерой Hamamatsu 2400-01 Chalnicon и процессором изображения Argus 100. Изображение записывали на видеомагнитофон Sony vo-763 0 и анализировали на телевизионном экране.

Измерение концентрации белка. Концентрацию белка измеряла по методу, описанному в работе (Bradford, 1976). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие хромаффинных гранул ç микротрубочками.

Для того, чтобы выяснить, взаимодействуют ли хромаффинные гранулы с микротрубочками был испльзован метод соосавдения. Нам удалось показать, что при центрифугировании через слой 1,6 M сахарозы в течение 10 мин. при 10 ООО g ни стабилизированные таксолом микротрубочки, ни хромаффкнные гранулы не осаждались, будучи взяты по отдельности. В то . же время, электрофоретический анализ осадков после

центрифугирования смеси суспензии микротрубочек и препарата хромаффинных гранул показал, что в осадках обнаруживались как белок микротрубочек тубулин, так и белки хромаффинных гранул

(в том числе и основной белок гранул - хромогранин), что указывало на образование комплексов хромаффинных гранул с микротрубочками.

Таким образом, очищенные хромайфинные гранулы взаимодействовали с микротрубочками и это взаимодействие обнаруживалось методом соосавдения.

Трипсинизация хромаффинных гранул. Судя по результатам электрофореза, хромаффинные гранулы теряли способность соосавдаться с микротрубочками в результате обработки трипсином. При этом выяснилось, что в результате протеолиза преимущественно расщеплялись высокомолекулярные белки гранул, а количество хромогранина, внутреннего белка гранул, оставалось неизменным.

Таким образом, трипсин, расщепляя наружные белки хромзфршных гранул, ингибировал взаимодействие гранул с микротрубочками. Следовательно, взаимодействие с микротрубочками определяется белковым компонентом гранул. АТФ и взаимодействие гранул с микротрубочками. Следующим шагом мы пытались выяснить относится ли белок, опосредующий взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками, к зависимым от микротрубочек белкам-транслокаторам. Хорошо известно, что зависимые от микротрубочек белки-транслокаторы элщруются с микротрубочек милимолярными концентрациями АТФ. Электрофоретический анализ осадков, полученных при соосавдении микротрубочек с хромаффшпшми гранулами в присутствии 2 мМ АТФ показал, что АТФ не влиял на количество материала в осадке. Следовательно, исследуемое взаимодействие опосредуется белком, не относящимся к транслокаторам.

Влияние обработки микротрубочек субтилизином на их взаимодействие с гранулами. Итак, белок, опосредующий взаимодействие гранул с микротрубочками не является транслокатором. Чтобы выяснить, не относится ли он к классу MAP, перманентно ассоциированных с михротрубочками, были поставлены эксперименты по соосаадению интакишх хромаффинных гранул с микротрубочками, обработанными субтилизином. Такая обработка позволяет отщепить С-концевые фрагменты субъедениц тубулина, с которыми взаимодействуют MAP, перманентно ассоциированные с микротрубочками. В то же время белки-транслокаторы, кинезин и динеин, сродства к обработанными субтилизином микротрубочками не теряют.

Эксперимент по соосаадению хромаффитшх гранул с микротрубочками, обработанными субтилизином, показал, что микротрубочки, состоящие из субъедениц тубулина, лишенных С-концевых фрагментов, с гранулами не связывались.

Для дополнительной демонстрации отсутствия взаимодействия мы использовали метод электронной микроскопии, в то время как в смеси интактных микротрубочек и гранул образовывались многокомпонентно комплексы, в случае обработанных субтилизином микротрубочек образования таких комплексов не наблюдалось.

Таким образом, взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками опосредует белок (или группа белков), относящийся к классу MAP, перманентно ассоциированных с микротрубочками.

Идентификация белка, опосредующего взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками. Для того, чтобы выяснить, какой именно MAP опосредует взаимодействие, была использована

аффинная хроматография тритонового экстракта гранул на колонке с иммобилизованными микротрубочками. Белки хоромаффинных гранул растворяли тритоном X-IOO, пропускали через колонку с микротрубочками и промывали, а затем последовательно элшровали буферами, содержавшими 2 мМ АТФ и 0,5 M kci. Такие условия элюции были выбраны потому, что АТФ, как указывалось выше, препятствует взаимодействию транслокаторов с микртрубочками, а высокая ионная сила подавляет взаимодействие с микротрубочками горманетно ассоциированных КАР (vaiiee,

Bloom, 1984).

В контрольном эксперименте была использована колонка с ковалентно привязанным бычьим сывороточным альбумином вместо микротрубочек. Оказалось, что в АТФ-элюатах с опытной и контрольной колонок присутствовал одинаковый набор белков.

Таким образом, ни один из белков экстракта гранул не обнаруживает связывания с микротрубочками, ингибируемого АТФ. В то же время имелся по крайней мере один белок, специфически элшфувдийся kci с колонки с иммобилизованными микротрубочками. Все остальные белки присутствовали как в контроле, так и в опыте и, по-видимому, связывались с колонками неспецифично. Молекулярный вес белка, специфически связывающегося с колонкой с иммобилизованными микротрубочками, близок к молекулярному весу МАР2. Более того, антитела к МАР2 окрашивали этот белок в иммуноблотинге. Таким образом, судя по аффинной хроматографии, взаимодействие гранул.с миротрубочками опосредуется МАР2.

Аналогичный результат был получен при исследовании соосаждения белков тритонового экстракта хромаффинных гранул

со стабилизированными таксолом микротрубочками. Единственным компонентом, оказавшимся в осадке помимо тубулина, оказался белок с мол. массой, близкой к мол. массе МАР2 , и окрашивавшийся антителами к МАР2.

Видеомикроскопическое исследование комплексов хромаффинны гранул с микротрубочками в присутствии кинезина. Таким образом, взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками осуществляется, по-видимому, посредством белка МАР2. Тем не менее мы решили проверить, не будет ли вызывать очищенный кинезин движения гранул по микротрубочкам. Для этого хромаффинные гранулы смешивали с суспензией микротрубочек, добавляли хроматографически очищенный кинезин, АТФ, и исследовали полученную смесь с помощью микроскопии с видеоусилением. Как и предполагалось, АТФ не препятствовал образованию комплексов гранул с микротрубочками. В то же время, хромаффинные гранулы не двигались по микротрубочкам, а микротрубочки перемещались по стеклу движимые адсорбированным на стекле кинезином. Таким образом, кинезин в наших опытах был активен, но взаимодействие гранул с микротрубочками опосредовалось, очевидно, не кинезином. Соосавдение микротрубочек с везикулярной фракцией хромаффинных клеток. Итак в наших условиях белки-транслокаторы не вносили никакого вклада во взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками. Можно предположить, однако, что в процессе подготовки препарата белки-транслокаторы по каким-то причинам теряли сродство к хрома|финным гранулам. Чтобы исследовать это предположение, мы исследовали взаимодействие с микротрубочками компонентов везикулярной фракции хромаффинных клеток. Хотя

основную массу этой фракции составляют хромаффинные гранулы, в ней содержатся и отличные от них везикулы. Для получения такой фракции финальный этап очистки хромаффинных гранул был исключен.

Взаимодействие компонентов везикулярной фракции с микрогрубочками изучали описанным выше методом соосаждения. Для осавдения образовавшихся комплексов были использованы более высокие скорости центрифугирования чем те, которые использовались в аналогичных экспериментах с очищенными хромаффинныш гранулами. Осадки анализировались с помощью электронной микроскопии. На электронной микрофотографии осадка полученного при центрифугировании смеси везикулярной фракции с интактными микротрубочками были видны хромаффинные гранулы и мембранные везикулы неизвестной природы, морфологически отличные от хромаффинных "гранул.

Таким образом, хромаффинные гранулы - не единственный компонент везикулярной фракции, взаимодействухщий с микротрубочками.

Одинаково ли взаимодействуют с микротрубочками хромаффинные гранулы и отличные от них везикулы? Ответом на этот вопрос служат результаты экспериментов, в которых мы сравнили соосавдение компонентов везикулярной фракции с интактными микротрубочками и с микротрубочками, обработанными субтилизином. Судя по результатам электрофореза, оказалось, что, в отличие от препарата очищенных хромаффинных гранул, в препарате везикулярной фракции имелись компоненты, соосакдавшиеся с обработанными субтилизином микротрубочками. Этот результат указывал на то, что в везикулярной фракции

имелись компоненты, взаимодействовавшие с микротрубочками посредством белков-транслокаторов. Действительно, в присутствии АТФ, взятого в концентрации 2 мМ, взаимодействие этих компонетов везикулярной фракции с обработанными субтилизином микротрубочками подавлялось. Результаты измерений количества белка в осадках подтвердили результаты электорофореза.

Итак, везикулярная фракция содержала небольшое количество мембранных везикул, взаимодействовавших с микротрубочками, обработанными субтилизином, и это взаимодействие было АТФ-чувствительным. Наиболее вероятно, что этот компонент - не хромаффинные гранулы, так как гранулы составляют основную массу везикулярной фракции.

Таким образом, опыты с везикулярной фракцией южно рассматривать как еще одно подтверждение того, что белки-транслокаторы не принимают участия во взаимодействии хромаффинных гранул с микротрубочками.

Хромаффинные гранулы содержат в своей мембране белок MAP 2. Наиболее вероятно, что именно MAP 2 опосредует взаимодействие гранул с микротрубочками. Этот вывод следует из нескольких независимых наблюдений. Во-первых, некоторые свойства связывания гранул с микротрубочками идентичны свойствам взаимодействия MAP 2 с микротрубочками. Такими свойствами являются нечувствительность связывания к АТФ и неспособность взаимодействовать с молекулами тубулина, лишенными С-концевых фрагментов. Во-вторых, MAP 2 является единственным' белком тритонового экстракта хромаффинных гранул, связывавшимся с микротрубочками. Это следует из . результатов афинной

хроматографии тритоновогб экстракта белкоз гранул на колонке с иммобилизованными микротрубочками, а также из результатов опытов по соосавденшо белков тритонового экстракта гранул с микротрубочками. . Какую физиологическую роль играет опосредованное MAP 2 взаимодействие хромаффинных гранул и микротрубочек? Возможно, хромаффинные гранулы, заякоренные на микротрубочках вблизи районов экзоцитоза, "дожидаются" сигнала к началу секреции. Исследование нового 170 кД-белка, вызывающего образование пучков микротрубочек.

Во второй части работы мы идентифицировали новый ассоциированный с микротрубочками белок из хромаффинных клеток, вызывающий образование пучков микротрубочек. Частичная очистка 170 кД белка.

Разработанный нами метод выделения 170 кД бежа ( см. схему выделения) заключался ' в. следующем. Мозговое вещество надпочечников (20 г) гомогенизировали на льду в буфере,

содержавшем 0,3 М сахарозу. Гомогенат центрифугировали 15 мин.

\

при 800 д. К супернатанту добавляли ингибиторы протеаз и центрифугировали 15 мин. при 27 ООО д.

Полученный супернатант смешивали с 20 мл суспензии стабилизированных таксолом микротрубочек и добавляли триполифосфат до концентрации 2,5 мм. Смесь инкубировали 5 мин. при 37° и микротрубочки осаждали черкз слой буфера, содержащего глицерин (4M), триполифосфат (2,5 мм) и таксол-(5 мкМ). Следующим этапом было центрифугирование при 22°, при 120 ООО д, в течение 60 мин. Осадок суспендировали в 1,5 мл. буфера с 20 мкм таксола и 0,2 М kci. В некоторых случаях буфер

Схема выделения 170 кД-белка гомогенизация надпочечников, центрифугирование гомогената

I

добавление к супернатанту суспензии микрогрубочек и триполифосфата

4

осавдение микротрубочек через слой 4 Ы глицерина для удаления несвязавшихся с 1шми белков

1

элюция связавшихся белков 0,2 М kci и, иногда, АТФ.

I

осавдение микротрубочек центрифугированием i

разделение белков супернатанта на колонке sup6

I

хроматография фракций, содержащих 170 кД-белок, на monoQ

для суспендирования также содержал 2 мм АТФ. После этого материал центрифугировали при 20° в течение 40 мин. при 150 ООО д. Супернатант собирали и вновь центрифугировали в. течении 20 мин. в том же режиме. Белки,' содержавшиеся в супернатанте, разделяли с помощью fplc. Для этого на колонку sup б наносили 0,5 мл. материала и собирали фракции по 0,5 мл. Результаты анализировали с помощью электрофореза. Злектрофоретический анализ показал, что основными белками, содержавшимися в полученных фракциях были белки с молекулярными массами 120 кД, 170 кД и 270 кД. С помощью

окрашивания Слотов специфическими антителами, белки с молекулярными массами 120 кД и 270 кД били идентифицированы как тяжелая цепь кинезина и MAP 2 соответственно. В то же время 170 кД-белок не реагировал с антителами к известным MAP: с антителами к MAP 2, к 200 кД МАР4, к белку с массой 170 кД из Heia и с антителами к кинезину.

Хорошо известно, что многие MAP, перманентно ассциированные с микротрубочками, выдерживают нагревание до 100°С. Так, MAP 2, тау и MAP 4 не преципигируют при нагревании и сохраняют способность связываться с микротрубочками. Чтобы проверить, обладает ли 170 кД-белок такой способностью, частично очищенный препарат бежа прогревали при 100°С в течении 5 мин. Выяснилось, что содержащийся в препарате 170 кД-белок полностью преципитировал в результате такой обработки. Таким образом, 170-кД белок не принадлежит к числу термостабильных MAP.

Итак, можно было предположить, что мы обнаружили неизвестный ранее белок, ассоциированный с микротрубочками.

Для окончательной очистки 170 кД-белка была использована ионообменная хроматография на колонке monoQ. Для этого фракции, содержащие 170 кД-белок, полученные при хроматографии на колонке sup6 объеденили, нанесли на колонку monoQ объемом 2 мл и связавшиеся белки элюировали градиентом kci ( см схему). Присутствие 170 кД-белка обнаруживали электрофорезом. Содержавшие 170 кД белок фракции объединяли, удаляли kci диализом и использовали полученный препарат для изучения свойств 170 кД-бежа. При нагрузке I мкг на доржку в окрашенных гелях обнаруживалась единственная полоса,

соответствовавшая 170 кД белку.

170 кД-белок вызывает образование пучков микротрубочек. Необычным свойством 170 кД-белка оказалась способность стимулировать образование пучков микротрубочек. Такие пучки можно было обнаружить с помощью видеомикроскопии после добавления препарата очищенного 170 кД-белка (концентрация белка 10 мкг/мл) к суспензии стабилизированных таксолом микротрубочек (конечная концентрация тубулина - 10 мкг/мл). Пучки образовывались после инкубации смеси в течение нескольких минут при комнатной температуре.

Электронная микроскопия негативно окрашенных образцов подтвердила образование пучков микротрубочек. Число микротрубочек в каждом пучке варьировало от 2-3 до нескольких десятков. На электронных микрофотографиях можно было видеть также частицы диаметром около 100 нм, соответсвующие, вероятно, индивидуальным молекулам 170 кД-белка.

Поскольку микротрубочки - полярные структуры, концы каждой микротрубочки различаются между собой. Было интересно выяснить, хаотична полярность микротрубочек в пучках, образованных в присутствии 170 кД-белка, или все микротрубочки в пучке имеют одинаковую полярность. Для выяснения этого вопроса к пучкам микротрубочек были добавлен белок-транслокатор кинезин. Кинезин вызывает скольжение микротрубочек по стеклу, причем это движение отличается полярностью: передний конец кандой микротрубочки соответствует ее так называемому минус-концу, а задний - так называемому плюс-концу. После добавления кинезина к пучкам составлявшие их микротрубочки приходили в движение, причем они "выползали" из

каадого пучка в обе стороны, что говорит о том, что полярность цикротрубочек в пучках была хаотичной.

Ыы охарактеризовали затем взаимодействие 170 кД-белка с иикротрубочками. Для этого мы сравнили связывание с микротрубочками 170 кД-белка, белков-транслокаторов и MAP, пермаанентно ассоциированных с микротрубочками. Хорошо известно, что взаимодейтвие белков-транслокаторов,кинвзина и динеина, подавляется АТФ, взятом в миллимолярных концентрациях. Ыы проверили, образуются ли пучки микротрубочек в присутствии АТФ и показали, что ни АТФ, ни другие нуклеозидтрифосфаты, взятые в концентрации 1-2 мМ, образования пучков не подавляли. Это наблюдение, а также то обстоятельство, что наши многочисленные попытки вызвать' движение микротрубочек добавлением 170 кД-белка кончились неудачей, позволяют заключить, что этот белок не является транслокатором.

MAP, перманентно ассоциированные с микротрубочками, (MAP I, -MAP 2, тау, МАР4 и др.) связываются с С-концевыми фрагментами субъедениц тубулина. Чтобы выяснить, связывается ли 170 кД-белок с теми же сайтами, что и MAP, перманентно ассоциированные с микротрубочками, мы использовали обработанные субтилизином микротрубочки. В таких микротрубочках субъеденицы тубулина лишены С-концевых фрагментов. Поскольку 170 кД-белок вызывал образование пучков микротрубочек, обработанных субтилизином, мы заключили, что он взаимодействует с микротрубочками отлично от перманентно ассоциированных MAP.

Таким образом, обнаруженный нами 170 кД-белок из мозгшового

вещества надпочечников обладает необычным набором свойств: он образует пучки микротрубочек, и его связывание с полимерным тубулином отличается как от связывания белков-транслокаторов, так и от MAP, перманентно ассоциированных с микротрубочками.

Выводы

1. Показано, что хромафЗЕшпше гранулы взаимодействуют с микротрубочками m vitro, и это взаимодействие опосредуется белковым компонентом хромаффинных гранул.

2. Взаимодействие не ингибируется АТФ, гранулы не связываются с микротрубочками, состоящими из субъедениц тубулина, лишенных С-концевых фрагментов. Следовательно, взаимодействие обеспечивается белками, отличными от белков-транслокаторов.

3. Тритоновый экстракт хромаффинных гранул содержит единственный белок, имещий сродстю к микротрубочкам. Этот белок был идентифицирован как МАР2.

4. Из мозгового вещества ~надпочечников выделен неизвестный ранее белок с мол. массой 170 кД, способный соосавдаться с микротрубочками.

5. Показано, что 170 кД-белок вызывает образование пучков стабилизированных таксолом микротрубочек.

6. Образование пучков микротрубочек под действием 170 кД-белка не ингибируется АТФ; обработанные субтилизином микротрубочки образуют пучки в присутствии 170 кД-белка. Следовательно, свойства 170 кД белка из мозгового вещества надпочечников отличаются от свойств описанных ранее MAP.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Ф.Ф. Северин. Белки, ассоциированные с микротрубочками //

Биохимия -1991, -т. 56, -стр. 963-976.

2. ф.ф. Северин. H.A. Шанина, С.А. Кузнецов, в.И. Гельфанц. Взаимодействие хромафЗинных гранул с мшсротрубочками in vitro //-Второй Всесоюзный Симпозиум по торвгическим и пракладнш аспектам молекулярной биологии.-1991, -Самарканд, -Абстракты, -стр 170.

3. F.F. Severin, H.A. Shanina, S.A Kuznetsov, V.l. Gelfand. MAP2-mediated binding of chromaffin granules to microtubules // PEBS Letters -1991, -v.282, -pp 65-68.

4. F.F. Severin, H.A. Shanina, S.A Kuznetsov, V.l. Gelfand. MAP2-mediated binding of chromaffin granules to microtubules // FEBS-EMBO Winter School -1991, Schladming, Abstracts, p. Tu7.