Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие микротрубочек с ассоциированными белками

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие микротрубочек с ассоциированными белками"

• МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи УДК 576. 321

Кашина Анна Сергеевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРОТРУБОЧЕК С АССОЦИИРОВАННЫМИ БЕЛКАМИ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук В. И. Гельфанд, кандидат биологических наук В. И. Родионов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Д. И. Левицкий

доктор биологических наук Т. М. Свиткина

Ведущая организация: НИИ Канцерогенеза ВОНЦ РАМН Защита состоится: "<У" 1992 г.

С^О г

в /О час. на заседании специализированного совета Д 053.05.7С в Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ (119899, г. Москва, Яен. горы, МГУ, корп. "А").

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического ф~та Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 'ф " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук у В. Н. Каграманов

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Микротрубочки - одна из трех систем цитоскелета эукариотической клетки - играет ключевую роль в важнейших процессах функционирования и жизнедеятельности. Окн участвуют в поддержании формы клетки, ее ориентации па субстрате и способности клетки к направленному перемещение. Микротрубочки составляют структурную основу ресничек и жгутиков, обеспечивающих передвижение отдельных типов клеток. Наконец, микротрубочки формируют внутриклеточные "рельсы" для перемещения органелл и крупных частиц из одной части клетки в другую. Выполняя эти функции, микротрубочки принимают непосредственное участие в таких важнейших процессах, как транспорт материалов к вновь формирующимся участкам клеток, в частности, к нервным окончаниям, митотические движения хромосом, и определяют положение органелл в нормально функционирующей цитоплазме.

Установлено, что выполнение ликротрубочками этих функций обусловлено наличием в их составе двух типов белков - структурных MAP и белков-транслокаторов. Структурные НАР участвуют в стационарных взаимодействиях микротрубочек с другими элементами цитоскелета и мембранными органеллами. Среди них наиболее характерными представителями являются MAP 1, MAP 2, и тау. Белки-транслокаторы - это зависимые от микротрубочек механохимические АТФ-азы, способные преобразовывать энергию гидролиза АТФ в механическую энергию, обеспечивающую перемещение частиц по микротрубочкам. Основные известные до сих пор

транслокаторы - кинезин и цитоплазиатический "динеин - опосредует движение по микротрубочкам в противоположных направлениях - от центра и к центру соответственно.

Одна из существенных задач в этой области состоит в изучении взаимодействия этих двух групп белков с микротрубочками, что может пролить свет на понимание процессов функционирования этих белков в составе микротрубочек. Взаимодействие структурных MAP с микротрубочками изучено достаточно хорошо. В то же время взаимодействие с микротрубочками белков-транслокаторов практически не изучено.

Цель и задачи исследования Целью данной работы является морфологическое и количественное исследование взаимодействия с микротрубочками белков из группы транслокаторов на примере кинезина, сравнение участков связывания белков-транслокаторов и структурных КАР на молекуле тубулина, и применение полученных данных и разработанных методов для поиска и исследования новых белков, ассоциированных с микротрубочками.

Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем: 1) определить, какова стехиометрия связывания кинезина с микротрубочками в насыщении; 2) исследовать морфологию комплекса кинезина с микротрубочками и установить, какие участки молекулы кинезина взаимодействуют с мнкротрубочками; 3) выяснить, различаются ли участки связывания структурных MAP и белков-гранслокаторов на молекуле тубулина; 4) применить методы соосаждения белков с микротрубочками для поиска и характеристики новых MAP.

Научная новизна работы В результате данной работы впервые установлено, что связывание кинезина с микротрубочкаыи происходит с насыщением. Показано, что в насыщении кинезин связывается с микротрубочками в соотношении 1 молекула кинезина на 7 димеров тубулина и что кинезин связывается с микротрубочками глобулярными головками, содержащими активный центр. Методом ограниченного протеолиза субтилизином получены микротрубочки, не содержащие участков тубулина, необходимых для связывания структурных MAP. С помощью таких микротрубочек впервые показано, что участки связывания белков- транслокаторов и структурных MAP на молекуле тубулина различаются. Наконец, методом соосаждения обнаружен новый белок, связывающийся с микротрубочками и предположительно являющийся одним из транспортных белков клостеровируса желтухи сахарной свеклы. По отсутствию связывания с микротрубочками, обработанными субтилизином, этот белок причислен к группе структурных MAP.

Научно-практическая ценность работы Проведенные в данной работе исследования связывания кинезина с микротрубочками могут быть использованы для характеризации кинезиноподобных белков из различных объектов. Разработаный метод получения микрогрубочек, не содержащих С-концевых участков и выявление их способности взаимодействовать с белками-транслокаторами, но не со структурными MAP. Э1от метод может быть использован как для выделения белков-транслокаторов из различных объектов путем одностадийной очистки от примесей структурных MAP, так и для классификации и характеристики новых белков

микротрубочек по принадлежности к одной из двух указанных групп. Второе использование метода наглядно продемонстрировано в данной работе на примере белка р65 клостеровируса желтухи сахарной свеклы, обладающего характеристиками белка из группы структурных MAP. Такие свойства впервые обнаружены у белка, кодируемого растительным вирусом и возможно установление наличия такого белка в составе растительных вирусов может пролить свет на понимание механизмов транспорта вируса из клетки в клетку.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на ежегодной конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Дания, 1990 год) и на зимней школе "Структурные и движущие белки ядра и цитоплазмы", проводимой совместно Федерацией Европейских Биохимических Обществ и Европейской Молекулярно-Биологичекой Организацией (Австрия, 1991 год). Материалы диссертации были апробированы на заседании комиссии по переаттестации аспирантов и сотрудников Института белка РАН 23 июня 1992 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, вклочая 15 рисунков и список литературы из 163 названий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы Материалы. ДЕАЕ-целлюлоза (DE-52) и фосфоцеллюлоза (Р-11) были получены от фирмы Whatman (США), сефадекс С-25 и сефакрил S-300 были получены от фирмы Pharmacia (Швеция). Субтилизин (бактериальная протеаза, тип VIII) - от фирмы Sigma (США). Гаксол был любезно предоставлен доктором Н.Р. Ломаке (Drug Synthesis and Chemistry Branch, Developmental Therapeutics Programs, Division of Cancer Treatment, National Cancer Institute, Bethesda, MD, США). Остальные использованные реактивы были получены от фирм Sigma (США), Serva (Германия), и Merck (Германия). Бесклеточная система трансляции из лизатов ретикулоцитов кролика и белок hsc70 из лизатов ретикулоцитов кролика были любезно предоставлены

0.Н.Денисенко (ИБ РАН, Пущино). L-^S-метионин был получен от фирмы Радиопрепарат (Ташкент). РНК-полимераза фага Т7 была получена от фирмы Биопол (Москва).

Методы. В работе использованы следующие методики:

1. Получение микротрубочек, очищенного тубулина и тотальных MAP методом сборки-разборки (Shelanski et al., 1973, Kuznetsov et al., 1978) и ионообменной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой (Weingarten et al., 1978).

2. Расщепление микротрубочек субтилизином.

3. Получение кинезина и цитоплазматического динеина. Кинезин получали по методу Кузнецова и Гельфанда (Kuznetsov, Gelfand, 1986). Цитоплазматический динеин получали по методу Паскаля с соавторами (Paschal et al, 1987) с небольшими модификациями.

4. Получение р65 в бесклеточной системе трансляции. Белок р65

клостеровируса желтухи сахарной свеклы был получен А. А. Карасевым (Институт вирусологии РАН) и В. В. Доля (Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ). Транскрипция плазмиды pBY65, линеаризованной EcoRI или Salí проводилась с помощью РНК-полимеразы фага Т7\. как описано в работе (Morozov et al., 1990). Трансляция некэпированных транскриптов проводилась в бесклеточной системе из лизатов ретикулоцитов кролика. Стандартная трансляционная смесь (75 мкл) содержала 80-100 мкг/мл транскрипта и 60 мкКи L-35S-MeTHOHHHa. Через 60 мин инкубации при 30°С. Трансляцию останавливали добавлением пуромицина до конечной концентрации 0,3 мМ, инкубировали еще 10 мин при 30°С и добавляли к смеси РНКазу А для высвобождения синтезированных пептидов в раствор.

5. Соосаждение белков с микротрубочками.

6. Определение АТФ-азной активности кинезина. Проводили в буфере А с добавлением 3 мМ MgClj. Инкубационная смесь содержала также 2 мМ АТФ. АТФ-азную активность определяли по количеству неорганического ортофосфата, который высвобождался в течение 30-минутной инкубации при 37°С. Концентрацию ортофосфата определяли методом Дельсаля с некоторыми модификациями (Panusz et al., 1970).

7. Исследование транслокаторной активности кинезина. Исследования проводились как описано в работе (Vale et al., 1985а).

8. Конкуренция различных MAP за связывание с микротрубочками.

9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в системе буферных растворов, описанной в работе Лэммли (Laemmli, 1970).

10. Денситометрическое сканирование гелей.

И. Электронная микроскопия. Для исследования комплексов кинезина с микротрубочками осадки, полученные в результате соосаждения суспендировали в буфере А с 20 мкМ таксолом, наносили на подложки и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата. Микроскопию проводили на электронном микроскопе "Philips ЕМ 400" при ускорявшем напряжении 80 кВ и увеличении 50 000. Для исследования морфологии микротрубочек на поперечных срезах осадки микротрубочек фиксировали раствором 1% таннина и 1% глутарового альдегида, приготовленного на 10 мМ Na-фосфэтном буфере (рН 7,0). Затем осадки постфнксировали 1% OsO^ на фосфатном буфере и, после обезвоживания в спиртах восходящей концентрации заключали в эпон 812. Ультратонкие срезы были любезно приготовлены 0. А. Соловьяновой (Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ). Срезы просматривались и фотографировались на электронном микроскопе Hitachi HU12.

12. Измерение концентрации белка. Концентрацию белка измеряли по методу, описанному в работе (Loury et al., 1951). В качестве

■s

стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие кинезина с микротрубочками Связывание структурных MAP с микротрубочками изучено достаточно хорошо. В то же время связывание транслокаторов с микротрубочками практически не изучено. Одним из важных вопросов для понимания функционирования микротрубочек в клетке является вопрос о соотношении участков связывания этих двух групп белков на молекуле тубулина. Чтобы приступить к исследованию этого вопроса,

9

необходимо сначала более подробно изучить " связывание белков-транслокаторов с микротрубочками. Поэтому в первой части нашей работы мы поставили перед собой цель подробно исследовать взаимодействие с микротрубочками кинезина - наиболее изученного белка из группы транслокаторов.

Для определения стехиометрии взаимодействия кинезина с микротрубочками мы поставили несколько опытов по соосаждению возрастающих количеств кинезина с постоянным количеством полимеризованного тубулина. Для такого соосаждения брали суспензию микротрубочек, содержащую 10 мкг тубулина, смешивали с раствором кинезина, содержащим от 0 до 30 мкг белка и инкубировали 20 мин. при комнатной температуре в присутствие 20 мкМ таксола для предотвращения разборки микротрубочек и 2,5 мМ триполифосфата для усиления связывания кинезина с тубулином. Затем смесь осаждали центрифугированием через слой 4 М глицерина на буфере А с 20 мкМ таксолом и 2,5 мМ триполифосфатом, при 120000xg в бакетном роторе. Полученные осадки микротрубочек с кинезином полностью растворяли в буфере для образцов для поледующего анализа их белкового состава методом электрофореза. Ранее было показано, что в присутствие 2,5 мМ трилолифосфага связывание кинезина с микротрубочками усиливается (Kuznetsov, Gelfand, 1986). Таким образом, выбранные нами условия являлись оптимальными для связывания кинезина с микротрубочками и полученные результаты могли использоваться для определения количественных параметров связывания.

Осадок из каждой пробы наносили полностью на дорожку геля и, по окончании электрофореза, гели окрашивали кумасси ярко-голубым R-250 и сканировали при длине волны 550 нм. Параметры

взаимодействия определялись из графика зависимости отношения площади пика кинезина к площади пика тубулина от концентрации кинезина, добавленного к смеси. Площадь пика тубулина определялась как сумма площадей пиков а- и (З-субьединиц тубулина. В контрольном опыте сканирование калибровочного геля с нанесенными на него параллельными сериями стандартных количеств тубулина и бычьего сывороточного альбумина показало, что в исследуемом диапазоне концентраций белка (0-11 мкг) зависимость площади соответствующего пика от количества белка в полосе линейна. Таким образом площади пиков, определяемые при сканировании, являются однозначными показателями количеств белка в соответствующих полосах геля, а соотношение площадей пиков кинезина и тубулина однозначно свидетельствуют о весовом соотношении этих белков в осадке.

Среднее значение отношения площадей пиков кинезина и тубулина в насыщении составляло 0,49+0,05. Если учесть, что молекулярная масса иолекулы кинезина приблизительно равна 380 кД, а молекулярная масса димера тубулина - около 110 кД, то получается, что при насыщении микротрубочек кинезином на одну молекулу кинезина приходится в среднем 7 димеров тубулина.

Нашей следующей задачей было исследование морфологии комплексов кинезина с микротрубочками. Для этого осадки микротрубочек с кинеэином суспендировали в буфере А с 20 мкМ таксолом, наносили на подложки, контрастировали уранилацетатом и проводили микроскопию на электронном микроскопе "Philips ЕМ 400" при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 50000.

Молекулы кинезина имеют сильно вытянутую форму, их длина

составляет 70-90 нм, а ширина 3-5 нм. На одном из концов молекулы отчетливо видны два глобулярных образования (головки) диаметром 8-11 нм, а на другом конце, как правило, заметен глобулярный домен шириной 10-14 нм. Часть молекул имеет изогнутую форму, что позволяет предположить наличие "шарнира" примерно в середине стержня. Такая форма молекулы хорошо согласуется с изображениями кинезина, полученными ранее при изучении методом электронной микроскопии препаратов, оттененных круговым напылением платиной (Scholey et al., 1989; Hirokawa et al.,1989). На полученных изображениях хорошо видно, что кииезин прикреплен к микротрубочкам глобулярными головками, чаще двумя, но иногда только одной. В отдельных случаях, когда две микротрубочки находятся близко друг от друга, молекула кинезина может быть ассоциирована одновременно с двумя микротрубочками. При этом с одной из микротрубочек кинезин связан головками, а с другой - глобулярным доменом, находящимся в хвостовой части молекулы.

Соотношение мест связывания структурных MAP и транслокаторов на молекуле тубулина

Следующий вопрос, на который мы попытались ответить - как соотносятся места посадки структурных MAP и транслокаторов на молекулах тубулина, составляющих стенку микротрубочки. Как известно из литературы, структурные MAP взаимодействуют с С-концевыми участками молекул тубулина. Мы попытались выяснить, перекрываются ли участки связывания транслокаторов на молекуле тубулина с участками связывания структурных MAP.

Первой нашей задачей явилось получение микротрубочек с

нормальной морфологией, состоящих из тубулина с отщепленными С-концами а- и р-субъединиц (S-микротрубочек). Как известно из литературы, при обработке субтилизином неполимеризованкого тубулина С-концы а- и 0- субьединиц легко отщепляются, и модифицированный тубулин хорошо полимеризуется, хотя полностью теряет способность связывать MAP. Образовавшиеся полимеры, однако, морфологически отличаются от нормальных микротрубочек. С другой стороны, данные иммунофлуоресцентного анализа свидетельствует о том, что С-концевые участки молекул тубулина в составе микротрубочек экспонированы на поверхности полимера. Поэтому мы обрабатывали субтилизином не димерный тубулин, а стабилизированные таксолом микротрубочки. К препарату микротрубочек добавляли субтилизин до концентрации 20 мкг/мл и инкубировали 12-16 часов при 37°С. Протеолиз останавливали инкубацией смеси с 2 мМ фенилметилсульфонил фторидом в течение часа при комнатной температуре. В качестве контроля служили микротрубочки, которые иихубировали 12-16 часгв при 37°С без глицерина. На стадии остановки протеолиза к ним добавляли субтилизин, преинкубированный с фенилметилсульфонил фторидом 1 час. Затем контрольные и S-микротрубочки осаждали при 120000xg в бакетном роторе через подушку, содержащую 4 М глицерин, 5 мкМ таксол и 2 мМ фенилметилсульфонил фторидом. Осадки суспендировали в буфере А с 20 мкМ таксола и 2 мМ фенилметилсульфонил фторидом, измеряли концентрацию белка и уравнивали по концентрации растворы контрольных и S-микротрубочек.

Чтобы выяснить, сохраняют ли микротрубочки после протеолиза нормальную морфологию, мы исследовали ультратонкие срезы осадков

микротрубочек методом электронной микроскопии. На полученных

микрофотографиях морфология интактных и обработанных протеазой

микротрубочек не различается. Таким образом, микротрубочки после

обработки субтилизином сохраняют нормальную морфологию. С другой

стороны, при злектрофоретическом анализе таких микротрубочек в

полиакриламидном геле хорошо видно, что полоса тубулина,

составляющего S-микротрубочки, смещается вниз примерно на 4 кД по t

сравнению с интактным тубулином.

Итак, полученные нами S-микротрубочки имеют нормальную морфологию и состоят из тубулина, не содержащего С-концевых участков а- и /3-субьединиц.

В дальнейших экспериментах мы попытались выяснить, взаимодействует ли кинезин с S-микротрубочками. Критериями такого взаимодействия служили характерные свойства белков-транслокаторов:

(1) способность белков-транслокаторов соосаждаться с микротрубочками в отсутствие и. не соосаждаться в присутствие АТФ;

(2) стимуляция АТФ-азнцй активности белков-транслокаторов при добавлении микротрубочек; (3) способность белков-транслокаторов опосредовать АТФ-зависимое движение иикротрубочек по субстрату.

Для экспериментов по соосаждению к суспензиям контрольных и S-микротрубочек добавляли равные количества препарата кинезина. В контрольном опыте к обоим типам микротрубочек добавляли препарат тотальных MAP. Высокомолекулярные MAP 1 и MAP 2 соосаждались с контрольными и не соосаждались с обработанными субтилизином микротрубочками. С другой стороны, кинезин соосаждался обоими типами микротрубочек. Более того, количество кинезина в осадках с контрольными и обработанными субтилизином микротрубочками было

одинаково. Следовательно, кинезин соосаждается с Б-микротрубочками не хуке, чем с контрольными. Чтобы выяснить, является ли такое связывание специфичным, мы проводили опыт по соосаждешш микротрубочек с кинезином в присутствие 5 мМ > Ь^-АТФ. Как было сказано выше, 1^-АТФ препятствует связыванию белков-транслокаторов с микротрубочками, что является одним из специфических свойств белков-транслокаторов. Кинезин в присутствие 5 мМ Ь^-АТФ не соосаждался ни с контрольными, ни с обработанными субтилизином микротрубочками. Таким образом, связывание кинезина с 5-микротрубочками, как и с контрольными, являлось АТФ-чувствительным и, следовательно, специфичным.

Для дальнейшей функциональной характеристики связывания кинезина с Б-микротрубсчками было проведено сравнение стимуляции АТФ-азной активности кинезина контрольными и обработанными субтилизином микротрубочками. Кинезин в буфере А без микротрубочек имел собственную АТФ-азную активность при 37°С менее 0,05 мкМ Р|/мин/мг. При добавлении контрольных микротрубочек с концентрацией тубулина 1,0 - 1,5 мг/мл АТФ-азная активность кинегина стимулировалась примерно в 20 раз, достигая значения 1,12+0,31 мкМ/мин/мг (среднее значение восьми независимых измерений). Добавление сходного количества микротрубочек, обработанных субтилизином, стимулировало АТФ-азную активность кинезина примерно в 8 раз, до значения 0,4+0,12 мкМ/мин/мг (по восьми измерениям). Хотя Б-микротрубочки стимулируют АТФ-азную активность кинезина слабее, чем контрольные, очевидно, что после обработки субтилизином это свойство микротрубочек сохраняется.

Значения К для микротрубочек, рассчитанные на димер

15

полимеризованного тубулина,' составляли 2, Н+0,7 мкИ/нин/мг для контрольных и 2,5+0,9 мкМ/мин/мг для обработанных субтилизином мнкротрубочек. Эти значения были рассчитаны по результатам четырех независимых измерений. Статистических отличий между значениями К&рр для двух типов микротрубочек не наблюдалось.

Значения Карр, рассчитанные в нашей работе были занижены по сравнению с аналогичными величинами, определенными ранее

(Kuznetsov and Gelfand, 1986; Kuznetsov, et al., 1989). Это может объясняться использованием в нашей работе микротрубочек, переосажденных через 4 М глицерин и ресуспендированных в буфере А, а не суспензии свежеполимеризованных микротрубочек. Возможно, микротрубочки после переосаждения слипаются в пучки и агрегаты, которые невозможно полностью разрушить гомогенизацией.

Итак, S-микротрубочки стимулируют АТФ-азную активность кинезина и аффинность кинезина к таким микротрубочкам не отличается от его аффинности к контрольным микротрубочкам.

Основное свойство кинезина, как белка из группы транслокаторов - способность индуцировать АТФ-зависимое перемещение микротрубочек по субстрату и частиц по микротрубочкам в тестах in vitro. В этой связи возник вопрос, способны ли микротрубочки, обработанные субтилизином, к движению по субстрату, покрытому кинезином. Для ответа на этот вопрос мы сравнили способность контрольных и S-микротрубочек к АТФ-зависимому движению по поверхности стекла, обработанного кинезином. Все микротрубочки, наблюдаемые в обоих препаратах, двигались. Средняя скорость движения контрольных микротрубочек составляла 0,22+0,09 икм/с (п=69). Средняя скорость

16

движения S-микротрубочек составляла 0,20i0,05 мкм/с (п=46). Таким образом, обработка микротрубочек субтилизииом не влияла на их способность к кинезин-зависимому движению.

Из приведенных выше результатов видно, что кинезин способен взаимодействовать с S-микротрубочками. Таким образом, наиболее вероятно, участки связывания кинезина и структурных MAP на молекуле тубулина различаются. Для прямой проверки такого предположения, мы провели опыт по конкуренции между кинезином и смесью тотальных MAP за связывание с микротрубочками. Тубулин в концентрации 1,0 мг/мл, полимериэованный в присутствии таксола, смешивали с кинезином в насыщающей концентрации, с добавлением 20 мкМ таксола и 2,5 мМ триполифосфата, и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Конечные концентрации кинезина и тубулина в такой смеси составляли 0,9 и 0,125 мг/мл соответственно. Затем смесь наносили в центрифужную пробирку, предварительно заполненную последовательными слоями (сверху вниз) 1 М, 2 М и 4 М растворов глицерина на буфере А с добавлением 5 мкИ таксола и 2,5 мМ триполифосфата. Слой 2 М глицерина содержал насыщающее количество структурных MAP (концентрация 0,9 мг/мл). Полученную смесь центрифугировали 20 мин при низкой скорости для связывания максимального количества MAP с микротрубочками в слое 2 М глицерина, и 20 мин при высокой скорости для осаждения микротрубочек. Осадки после окончания центрифугирования полностью растворяли в буфере для образцов и анализировали методом электрофореза. В контрольном опыте слои глицерина в подушке не содержали структурных MAP. Такая постановка Опыта позволяла сочетать достижение максимального связывания микротрубочек сначала

с кннезином, при предварительной инкубации, а затем со структурными MAP, при низкоскоростном центрифугировании. Таким образом, если бы эти белки конкурировали за связывание с микротрубочками, в окончательном осадке обнаруживалось бы меньше кинезина, чем в контрольной пробе, не содержащей структурных MAP.

Количество кинезина, связанного с микротрубочками в отсутствие и в присутствие структурных MAP не различается. В то же время наблюдается сильное связывание MAP с микротрубочками. В дополнительных контрольных экспериментах было показано, что количество структурных MAP, связанных с микротрубочками, также не зависит от наличия кинезина. Таким образом, кинезин не конкурирует со структурными MAP за связывание с микротрубочками и, следовательно, участки связывания на микротрубочках для кинезина и структурных MAP различаются.

Следующий вопрос - является ли вывод о различии мест связывания структурных MAP и кинезина верным и для других белков-транслокаторов. Для ответа на этот вопрос мы исследовали, связывается ли цитоплазматический динеин с микротрубочками, обработанными субтилизином в опытах по соосаждению. Препарат цитоплазматическог? динеина смешивали с контрольными и обработанными субтИлйзином микротрубочками в присутствие 20 мкМ таксола, но, в отличие от кинезина, без добавления триполифосфата. Смеси инкубировали 20 мин при комнатной температуре и осаждали центрифугированием при 120000xg в бакетном роторе через слой 4 М глицерина. Осадки суспендировали в буфере для образцов и анализировали методом электрофореза.

В этой эксперименте цитоплазматический динеин соосаждался

одинаково о контрольными и обработанными субтилизином микротрубочками. Мы считали такое связывание специфичным, так как в присутствие 5 мМ АТФ цитоплазматический динеин не соосаждался ни с контрольными, ни с S-микротрубочками. Таким образом, цитоплазматический динеин, как и кинезин, соосаждается с обработанными субтилизином микротрубочками и его связывание с микротрубочками зависит от АТФ.

Из приведенной выше серии экспериментов следует, что структурные MAP и белки-транслокаторы имеют различные места связывания на молекуле тубулина, входящей в состав стенки кикротрубочки. Таким образом, существует два класса белков, различающихся по участкам связывания на молекуле тубулина. Вероятно, этот факт отражает ситуацию в живой клетке, где микротрубочки скорее всего насыщены MAP (см., например, Drubin et al., 1985). В таких условиях необходимо существование обособленных участков связывания белков-транслокаторов на молекулах тубулина, позволяющих обеспечивать транспорт органелл по микротрубочкам, покрытым MAP.

Взаимодействие белка р65 с микротрубочками

В предыдущм разделе было выяснено, что два типа ассоциированных с микрогрубочками белков - структурные MAP и транслокаторы - различаются по одной из существенных характеристик - участкам связывания с микротрубочками. Это свойство может служить основой для классификации вновь открываемых белков микротрубочек, как принадлежащих к одному из двух указанных типов. Наша дальнейшая работа проводилась в направлении' поиска и классификации новых белков, ассоциированных с микротрубочками.

19

В геноме некоторых ' РНК-содержащих . вирусов растений закодированы белки, мутации по которым ингибируст транспорт вируса из клетки в клетку. Эти белки были названы транспортными. Транспортные белки различных вирусов различаются по аминокислотной последовательности и молекулярному весу, но всегда сходны по положению в геноме. Существуют косвенные данные, что в транспорте вирусов по растению играют роль микротрубочки. Мы решили проверить, связываются ли с микротрубочками траснпортные белки растительных вирусов. Для исследования был взят белок с молекулярным весом 65 кД (р65), закодированный в геноме РНК-содержащего вируса желтухи сахарной свеклы. Этот белок был недавно секвенирован группой Аграновского с соавт. ^гапоувку е1 а1., 1990). Было обнаружено, что этот белок имеет высокий процент гомологии с белками теплового шока из семейства ЬБр70.

Белок р65 был синтезирован в бесклеточной системе из лизата

ретикулоцитов кролика. Продукт трансляции, меченный по 35

Б-метионину, при электрофорезе в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией имел ожидаемый молекулярный вес -около 65 кД. Для ответа на вопрос, связывается ли р65 с микротрубочками, мы смешивали трансляционную смесь, обработанную для удаления нуклеиновых кислот и неспецифических агрегатов, с микротрубочками, полимеризованными из очищенного тубулина и осаждали при 120000хя через слой 4М глицерина. В этоих опытах р65 выявляется в осадке при осаждении в присутствие микротрубочек и не выявляется в отсутствие микротрубочек. В контрольных экспериментах показано, что капсидный белок Х-вируса картофеля (РУХ СР), синтезированный аналогичным образом в 'бесклеточной системе из

20

лизата ретикулоцитов кролика, и очищенный белок теплового шока hsc70 из ретикулоцитов кролика, любезно предоставленный О.В.Денисенко (Институт белка РАН), не соосаждаются с микротрубочками в сходных условиях. Следовательно, р65 соосаждается с микротрубочками и это соосаждение специфично.

Следующий возникающий вопрос - взаимодействует ли р65 с С-концами субьедиииц тубулина, как белок из группы структурных MAP, или участок его связывания находится вне С-концов как в случае кинезина и цитоплазматического динеина. Для ответа на этот вопрос мы проводили соосаждение меченного р65 с контрольными и S-микротрубочками. В результате таких опытов было выявлено, что р65 соосаждается с нормальными и практически не соосаждается с обработанными субтилизином микротрубочками. Остаточное связывание р65 с S-микротрубочками можно объяснить наличием в препарате S-микротрубочек небольшого количества нерасщепленных микротрубочек, неразличимого при окрашивании геля Кумасси, но достаточного для связывания небольшого количества меченого р65. Таким образом, связывание р65 с микротрубочками происходит по С-концам молекул тубулина, как у структурных MAP.

Итак, связывание р65 с микротрубочками происходит по типу структурных MAP. В то же время существует ряд соображений,, по которым такое связывание может регулироваться АТФ. С одной стороны, так как р65 является белком теплового шока, он имеет АТФ-связывающий участок. Следовательно, представляется возможным, что его взаимодействие с микротрубочками регулируется АТФ. •С другой стороны, все MAP, отвечающие за внутриклеточный ' транспорт, связываются с микротрубочками АТФ-чувствительно. Поэтому мы решили

проверить, зависит ли связывание р65 с микротрубочками от АТФ. Так как смесь для трансляции содержала 1 мМ АТФ, мы проверили, влияет ли удаление АТФ из смеси апиразой на связывание р65 с микротрубочками. Выяснилось, что предварительная обработка апиразой смеси, содержащей меченный р65, существенно усиливала связывание р65 с микротрубочками. Следовательно, хотя АТФ и не препятствует связыванию р65 с микротрубочками, его присутствие в смеси мохет существенно ослаблять такое связывание.

Существуют косвенные свидетельства того, что транслокаторов самих по себе не достаточно для опосредования движения частиц по микротрубочкам. Вероятными кандидатами на роль "помощников", заякоривающих частицы на микротрубочках, являются структурные MAP (Severin et al., 1991). Участие в движении частиц по микротрубочкам было также предсказано для ß-интернексина, еще одного представителя семейства hsp70, имеющего свойства структурных MAP (Green, Li em, - 1989). Подобную роль в движении можно предложить и для р65, который может участвовать в заякоривании вирус-специфических рибонуклеопротеинов на микротрубочках с их последующей транслокацией плазмодесмам или через плазмодесмы в соседние растительные клетки. Другие вирусы, не" кодирующие подобных белков, возможно, используют для этой цели собственные транспортные белки или клеточные белки теплового шока. Необходимость клостеровируса желтухи сахарной свеклы в кодировании собственного белка для этих нужд может объясняться сравнительно большими размерами генома этого . вируса, представляющего существенные механические проблемы для перемещения в соседние

клетки через плазмодесмы.

ВЫВОДИ

1. Показано, что связывание кинезина с микротрубочками происходит с насыщением. Построена кривая насыщения, вычислено, что стехиометрия связывания кинезина с тубулином в насыщении составляет 7 димеров тубулина на 1 молекулу кинезина.

2. Методами электронной микроскопии получено изображение комплекса кинезина с микротрубочками. Установлено, что кинезин связывается с микротрубочками глобулярными головками, содержащими активный центр.

3. Разработана методика ограниченного протеолиза тубулина субтилизином, позволяющая получить микротрубочки с нормальной морфологией, состоящие из субъединиц тубулина с отщепленными С-концами (S-микротрубочки).

4. Установлено, что S-микротрубочки, при полной потере способности связывать структурные MAP, сохраняют способность к АТФ-зависимому соосаждению с кинезином, стимуляции его АТФ-аэной активности и АТФ-зависимому движению по субстрату, покрытому кинезином.

5. Установлено, что цитоплазматический динеин, как и кинезин, соосаждается с S-микротрубочками АТФ-зависимо.

6. Установлено, что в прямых опытах по соосаждению кинезин не конкурирует со структурными MAP за связывание с микротрубочками.

7. Сделан вывод о том, что структурные MAP и белки-транслокаторы связываются с разными участками молекулы тубулина.

8. Установлено, что белок клостеровируса желтухи сахарной свеклы, р65, специфически связывается с микротрубочками. Это

23

связывание АТФ-зависимо и" происходит по. С-концевым участкам молекул тубулина, что позволяет причислить р65 к группе структурных НАР.

Основные результаты диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Цупрун В. Л., Кашина А. С., Гельфанд В. И. Исследование комплекса кинезина с микротрубочками методом электронной микроскопии. // ДАН СССР - 1991 - т. 320 - стр. 1270-1272.

2. Rodionov V. I., Gyoeva F.K., Kashina A.S., Kuznetsov S.A., Gelfand V.I. Microtubule-associated proteins and microtubule-based translocators have different binding sites on tubulin molecule. // J. Biol. Chen. - 1990 - v. 265 - pp. 5702-5707.

3. Karasev A.V., Kashina A.S.. Gelfand V.I.. Dolja V. V'. HSP70-related 65 kDa protein of beet yellows closterovirus is a microtubule-binding protein." // FEBS Lett. - 1992 - v. 304 - pp. 12-14.

Бак.

Тирах//¿>

Опытно-полиграфическое предприятие ЦНИИТЭИлегпроыа Москва, уд. Вавилова, 69.

24