Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белков, ассоциированных с микротрубочками, в хромаффинных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование белков, ассоциированных с микротрубочками, в хромаффинных клетках"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНША, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.321

Северин Федор Федорович

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С МИКРОТРУБОЧКАМИ. В ХРОМАФФИННЫХ МЕТКАХ

Специальность 03.00.03 --»Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992 г.

х

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководители: доктор биологических наук В.И.Гельфанд.

кандидат биологических наук В.И.Родионов.

Официальные оппонента: член-корреспондент РАН, профессор D.M.Васильев

доктор биологических наук,профессор И.Б.Гусев

|0

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН Защита состоится: Ч " 9/^AsüjvJ^__1992 г.

в __час. на заседании специализированного совета Д 053.05.70

в Институте Зизико-шшческой биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (I19899, г. Москва, Лен. Горн, МГУ, корп. "А")

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического ф-та Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "/" t-АолЭ-С.

.1992 г.

Ученый секретарь спешализиррванноГ^^совета кандидат химических наук у /^Г В.Н.Каграманов.

РОСЧИ1"? C j Г1'

if . - ■ ' ■ ' es:.;.- -— ■

Введение.

Актуальность проблемы-В последние годы широко изучается роль микротрубочек в транспорте органвлл и в определении их пространственного расположения в цитоплазме. Один из наиболее ярких примеров опосредуемого мякротрубочками внутриклеточного транспорта -быстрый аксональннй транспорт. В нейроне вещества, синтезированные в теле клетки, перемещаптся в мембранных везикулах вдоль аксонов на значительные расстояния ( десятки сантиметров), Установлено, что такой транспорт осуществляется по микротрубочкам с помощью так называемых белков-транслокаторов. Аналогичным образом перемещаются, например, ЛИЗОСОМЫ В макрофагах (Hollenbeck, Swanson,1990) и меланосомы в меланофорах (Roäionov et ai.,1991).

В то же время, роль микротрубочек в таких транспортных процессах, как экзоцитоэ и секреция намного менее понятна. Известно, что разрушение микротрубочек, как правило, мало влияет на уровень секреции. В то же рремя, сеть микротрубочек, по-видимому, определяет направленность доставки материалов к плазматической мембране. Так, после деполимеризации микротрубочек в клетках поляризованного эпителия, экзоцитоэ некоторых белков осуществляется на "неправильной" стороне плазматической мембраны, а в фибробластах разрушение микротрубочек препятствует направленной доставке секреторных везикул к активному краю ( Kelly, 1990).

Эти данные указавзют, по-видимому, на то, что зависимый от микротрубочек транспорт вряд ли принимает прямое участие в секреции. Роль иикротрубочек состоит, вероятно, в организации

пространственного распределения органелл* и в их сортинге. Действительно, полученные недавно биохимические данные указывают на возможное участие микротрубочек в сортинге, а результаты электронной микроскопии свидетельствуют о взаимодействии секреторных везикул с микротру.Оочкаш ( Goits et al, 1992). Однако непонятными остаются биохимические механизмы взаимодействия микротрубочек с секреторными везикулами.

Важным фактором, определяющим внутриклеточное распределение секреторных везикул может являться пространственная организация самих микротрубочек, которая, как известно, опосредуется взаимодействием микротрубочек с различными цитоскелетными структурами. Если взаимодействие микротрубочек с актиновыми михрофиламентами и с промежуточными филаментами описано и охарактеризовано, то о биохимических механизмах взаимодействия микротрубочек друг с другом известно значительно меньше,

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование белков, ассоциированных с микротрубочкэми (MAP) в хромаффинных клетках, а именно идентификация таких MAP, которые опосредуют взаимодействие микротрубочек с секреторными гранулами и друг с другом. Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем: (I) охарактеризовать взаимодействие хромаффинных гранул с микро грубо чками(2) выяснить, какие белки ответственны за взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубэчками,- (3) идентифицировать белок, участвующий во взаимодействии микротрубочек друг с другом, ответственный за

формирование пучков микротруОочек.

Научная новизна работа В результате настящей работы впервые охарактеризовано взаимодействие хромаф$инных гранул с микротрубочками in vitro. Показано, что взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками опосредуется белком MAP 2. Идентифициирован и очищен неизвестный ранее белок с молекулярой массой 170 кД из хромаффинных клеток, вызывающий образование пучков микротрубочек.

Научно-практическая ценность работа Разработанные в навей работе экспериментальные подходы могут быть использованы для дальнейшего изучения взаимодействия мембранных органелл с цитоскелетными структурами. Разработанный метод выделения 170 кД-белка может быть использован для очистки ИАР из различных источников.

. Апробация работы Материалы диссертации докладывались на школе-конференции "Механизмы клеточной подвижности,^ транспорта органелл и структура мембранного иитоскелета" (Шладдссг, Австрия, 1991); на Втором Всесоюзном симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); на школе-конференции "Метода клеточной биологии" (Орхус, Дания, 1992) и на семинаре "Клеточная биология" (Вудс Хол, СНА, 1992).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания результатов, выводов и списка

литературы. Работа изложена на ( I 0 страницах ма1 текста, включая 16 рисунков и список литературы из названий.

Ill

1ШИНОПИСНОГО

ЭКСПЕРШЕНТАЛШЯ ЧАСТЬ Материалы и методы

Материалы. Фосфоцеллкшоза (P-II) была получены от фирмы Whatman. Субтилизин (бактериальная протеаза, тип vin) - от фирмы sigma. Таксол был любезно предоставлен доктором Н.Р.Ломаке (Drug Synthesis and Chemistry Branch, Developmental Therapeutics Programs, Division of Cancer Treatment, National cancer institute, Bethesda, HD, США). Остальные использованнне реактивы были получены ОТ фирм Sigma, Serva, Merck, Pharmacia и Bio-Bad. Антитела были любезно предоставлены доктором Т. Крейсом (Германия) и доктором X. Сакай (Япония).

Получение микротрубочек и очищенного тубулина. Препараты микротрубочек из мозга крупного рогатого скота получали методом сборки-разборки (Sheians*i et ai., 1973) с небольшими модификациями (Kuznetsov et al., 1978). ОСНОВНЫМ ЭТаПОМ очистки являлась ионообменная хроматография на колонке с

фОСфОЦвЛЛЗОЛОЗОЙ (Weingarten et al., 1975). О'ШДвННЫЙ ГубулИН В

дальнейшем использовали для получения микротрубочек, свободных от MAP. Для этого к раствору тубулина (концентрации белка не менее 2 мг/мл) добавляли таксол до конечной концентрации 20 мкМ и инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Расщепление микротрубочек субтшшзином. К препарату микротрубочек, полученных путем полимеризации хроматографически очинённого тубулина в присутствие 20 мкМ таксола, добавляли субтилизин и инкубировали как это описано в

работе (ксхПопоу еь а1, 1990). Контрольные микротрубочки инкубировали аналогичным образом без добавления субтилизина. Протеолиз останавливали инкубацией смеси с 2 мМ фешшлетилсульфонил фторидом в течение I часа при комнатной температуре. В контрольные образцы на этой стадии добавляли субтшшзин, преинкубированныЯ с фенилмехилсульфонил фторидом в течение I часа.

Электрофорез белков в полиакриламщюм геле. Электрофорез проводили в системе буферных растворов, описанной в работе Лэммли (ьаетшИ, 1970). В качестве разделяющих гелей использовали полиакриламидаые гели с концентрацией акриламвда 10% или градиентные гели с концентрацией акриламвда 6-12%. Соотношение акряламида и н,и'-метиленбисакриламида составляло 30:03. По окончании электрофореза гели фиксировали в 12,5% трихлоруксусной кислоте в течение ночи при комнатной температуре и окрашивали 0,1!« раствором кумасси ярко-голубого й-250 на 12,5% трихлоруксусной кислоте в течение часа при температуре 50-60°С. Для удаления несвязавшегося красителя

3

гели промывали в 1% растворе уксусной кислоты. Иммуноблоттинг. Для переноса белков из полиакриламидашх гелей на нитроцеллюлозу использовали систему "полусухого" электрофоретического переноса (КуЬзе-АгШегзеп 1984). Далее иммуноблотинг проводили как описано в работе (йсхНопоу сь а1., 1990).

Электронная микроскопия. Для исследования кошлексов 170 кД-белка и микротрубочек исследуемый материал наносили на подложи и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата. Концентрация тубулина в суспензии микротрубочек составляла

10 мкг/мл., концентрация 170 кД-белка - 10 мкг/мл. При анализе комплексов микротрубочек и хромаффикных гранул материал предварительно фиксировали 1% глутаровым альдегидом. Получение хромаффшпшх гранул. Хромаффинные гранулы получали методом дифференциального центрифугирования (Teriand, Fiatmark, 1980). Очищенные гранулы суспендировали в буферном растворе, содержавшем 1,5 М сахарозу.

Трипсинизация хромаффинных гранул. Обработка трипсином проводилась при, комнатной температуре в течении 20 мин. Концентрация трипсина составляла I мкг/мл. протеолиз останавливали Соевым ингибитором трипсина (10 мг/мл). Аффинная хроматография на колонке с иммобилизованными микротрубочками. Колонку с. ковалентно привязанными микротрубочками готовили как описано в работе (Alberts et ai.,i990). Матрикс, использованный для приготовления колонки,

СОСТОЯЛ ИЗ смеси Affigel 10 (Bio-Kad) И аКТИВИрОВЭННОЙ BrCN Sepharose CL6B (Pharmacia), ВЗЯТЫХ В соотношении 1:1. Колонка была приготовлена в стерильном 10мл. пластиковом шприце. Объем колонки составлял 5 мл.

Контрольную колонку готовили тем не способом, что и опытную, но вместо микротрубочек использовали бычий сывороточный альбумин.

Осадок хромаффинных гранул суспендировали в буфере, содераавшем смесь ингибиторов протеаз и 0,5% Тритон Х-100. Экстракт осветляли при 150 ООО g а течении 40 мин. Связавшиеся белки последовательно элпировали буферами, содержавшими 2 мМ АТФ и 0,5 М КС1.

Соосавдение белков хромаффинных гранул с микротрубочками.

Связывание белков хромаф&шных гранул с микро трубочками исследовали также методом соосандения. Для этого экстракт хромаффинншс гранул, полученный как описано выше, смешивали с суспензией полимеризованных таксолом микротрубочек. Смесь осаидали через слой буфера, содержавшего 4 M глицерин, и белковый состав осадков исследовали SDS-электрофорезом. Микроскопия с видеоусилением. Для видеомикроскопии

использовали световой микроскоп Axiophot фирмы Opton (ФРГ) с объективом 100x1,3 nx Pian-Neofiuar и конденсором ICT. Микроскоп был оснащен видеокамерой Hamaraatsu 2400-01 Chalnicon и процессором изображения Argus 100. Изображение записывали на видеомагнитофон Sony vo-7630 и анализировали на телевизионном экране.

Измерение концентрации бежа. Концентрацию белка измеряли по методу, описанному в работе (Bradford, 1976). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие хромаффинных гранул с; микротрубочками.

Для того, чтобы выяснить, взаимодействуют ли хромаффшшые гранулы с микротрубочками был испльзован метод соосавдения. Нам удалось показать, что при центрифугировании через слой 1,6 M сахарозы в течение 10 мин, при 10 ООО g ни стабилизированные таксолом микротрубочки, ни хромаф$инные гранулы не осаждались, будучи взяты по отдельности. В то же время, электрофоретнческнй анализ осадков после

центрифугирования смеси суспензии михротрубочек и препарата хромаффинных гранул показал, что в осадках обнаруживались как белок микротрубочек тубулин, так и балки хромаффинных гранул

(в том числе и основной белок гранул - хромогракин), что указывало на образование комплексов хромаффинных гранул с микротрубочками.

Таким образом, очищенные хромаффияные гранулы взаимодействовали с микротрубочками и это взаимодействие обнаруживалось методом соосаждения.

Трипсинизация хромаффишшх гранул. Судя по результатам электрофореза, хромаффинные гранулы теряли способность соосавдаться с микротрубочками в результате обработки трипсином. При этом выяснилось, что в результате протеолиза преимущественно расщеплялись высокомолекулярные белки гранул, а количество хромогранина, внутреннего белка гранул, оставалось неизменным.

Таким образом, трипсин, расщепляя наружные белки хромаффинных гранул, ингибировал взаимодействие гранул с микротрубочками. Следовательно, взаимодействие с микротрубочками определяется белковым компонентом гранул. АТФ и взаимодействие гранул с микротрубочками. Следующим шагом мы пытались выяснить относится ли белок, опосредующий взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками, к зависимым от микротрубочек белкам-транслокаторам. Хорошо известно, что зависимые от микротрубочек белки-транслокаторы элщруются с микротрубочек милимолярными концентрациями АТФ. Электрофоретический анализ осадков, полученных при соосавдении микротрубочек с хромаффинными гранулами в присутствии 2 мМ АТФ показал, что АТФ не влиял на количество материала в осадке. Следовательно, исследуемое взаимодействие опосредуется белком, не относящимся к транслокаторам.

Влияние обработки микротрубочек субтилизином на их взаимодействие с гранулами. Итак, белок, опосредующий взаимодействие гранул с микротрубочками не является транслокатором. Чтобы выяснить, не относится ли он к классу MAP, перманентно ассоциированных с микротрубочками, были поставлены эксперименты по соосаждению интактных хромайинных гранул с микротрубочками, обработанными субтилизином. Такая обработка позволяет отщепить С-концевые фрагменты субъедеииц тубулина, с которыми взаимодействуют ПАР, перманентно ассоциированные с микротрубочками. В то же время белки-транслокаторы, кинезин и динеин, сродства к обработанными субтилизином микротрубочками не теряют.

Эксперимент по соосаждению хромаффинных гранул с микротрубочками, обработанными субтилизином, показал, что микротрубочкл, состоящие из субъедениц тубулина, лишенных С-концевых фрагментов, с гранулами не связывались.

Для дополнительной демонстрации отсутствия взаимодействия мы использовали метод электронной микроскопии. В то время как в смеси интактных микротрубочек и гранул образовывались многокомпонентна комплексы, в случае обработанных субтилизином микротрубочек образования таких комплексов не наблюдалось.

Таким образом, взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками опосредует белок (или группа белков), относящийся к классу MAP, перманентно ассоциированных с микротрубочками.

Идентификация белка, опосредующего взаимодействие хромаффинных гранул с микротрубочками. Для того, чтобы выяснить, какой именно MAP опосредует взаимодействие, была использована

аф&шная хроматография тритонового экстракта гранул на колонка с иммобилизованными микротрубочками. Белки хоромаффинных гранул растворяли тритоном X-IOO, пропускали через колонку с микротрубочками и промывали, а затем последовательно элшровали буферами, содержавшими 2 мМ АТФ и 0,5 M kci. Такие условия элгащи были выбраны потому, что АТФ, как указывалось выше, препятствует взаимодействии транслокаторов с микртрубочками, а высокая ионная сила подавляет взаимодействие с микротрубочками парманетно ассоциированных MAP (vaiiee, Bloom, 1984 ).

В контрольном эксперименте была использована колонка с ковалентно привязанным бычьим сывороточным альбумином вместо микротрубочек. Оказалось, что в АТС-эл»атах с опытной и контрольной колонок присутствовал одинаковый набор белков.

Таким образом, ни один из белков экстракта гранул не обнаруживает связывания с микротрубочками, ингибируеыого АТФ. В то же время имелся по крайней мере один белок, специфически элшруюцийся kci с колонки с иммобилизованными кшкротрубочками. Все остальные балки присутствовали как в контроле, так и в опыте и, по-видимому, связывались с колонками неспецифично. Молекулярный вес белка, специфически связывающегося с колонкой с иммобилизованными микротрубочками, близок к молекулярному весу МАР2. Более того, антитела к МАР2 окрашивали этот белок в иммуноблотинге. Таким образом, судя по аффинной хроматографии, взаимодействие гранул, с миротрубочками опосредуется МАР2.

Аналогичный результат был получен при исследовании соосавдения белков тритонового экстракта хромаффинных гранул

со стабилизированными таксолом микротрубочками. Единственным компонентом, оказавшимся в осадке помимо тубулина, оказался белок с мол. массой, близкой к мол. массе МАР2 , и окрашивавшийся антителами к МАР2.

Видеомикроскопическое исследование комплексов хромаффинны гранул с микротрубочками в присутствии кинезина. Таким образом, взаимодействие хромаффянных гранул с микротрубочками осуществляется, по-видимому, посредством Оолка МАР2. Тем не менее мы решили проверить, не будет ли вызывать очищенный кинезин движения гранул по микрогрубочкам. Для этого хромаффшшые гранулы смешивали с суспензией микротрубочек, добавляли хроматогрзфически очищенный кинезин, АТФ, и исследовали полученную смесь с помощью микроскопии с видеоусилением. Как и предполагалось, АТФ не препятствовал образованию комплексов гранул с шжротрубочками. В то ге время, хромаффишше гранулы не двигались по микротрубочкам, а микротрубочки перемещала по стеклу движимые адсорбированным на стекле кинезином. Таким образом, кинезин в наших опытах был активен, но взаимодействие гранул с микротрубочками опосредовалось, очевидно, не кинезином. Соосаадение шпсротруОочек с везикулярной фракцией хромаффин-ных клеток. Итак в наших условиях белки-транслокаторы не вносили никакого вклада во взаимодействие хромаффинных гранул с млкротрубочками. Можно предположить, однако, что в процессе подготовки препарата белки-транслокаторн по каким-то причинам теряли сродство к хромаффинным гранулам. Чтобы исследовать это предположение, мы исследовали взаимодействие с мнкротрубочками компонентов везикулярной фракции хромаффинных клеток. Хотя

основную массу этой фракции составляют хромаффинные гранулы, в ней содержатся и отличные от них везикулы. Для получения такой фракции финальный этап очистки хромаффшшых гранул был исключен,

Взаимодействие компонентов везикулярной фракции с микротрубочками изучали описанным вше методом соосаждения. Для осаждения образовавшихся комплексов были использованы более высокие скорости центрифугирования чем те, которые использовались в аналогичных экспериментах с очищенными хромаффннными гранулами. Осадки анализировались с помощью электронной микроскопии. На электронной микрофотографии осадка полученного при центрифугировании смеси везикулярной фракции с интактными микротрубочками были видны хромаффинные гранулы и мембранные везикулы неизвестной природы, морфологически отличные от хромаффшшых гранул.

Таким образом, хромаффинные гранулы - не единственный компонент везикулярной фракции, взаимодействующий с микротрубочками.

Одинаково ли взаимодействуют с микротрубочками хромаффинные гранулы и отличные от них везикулы? Ответом на этот вопрос служат результаты экспериментов, в которых мы сравнили соосавдение компонентов везикулярной фракции с интактными микротрубочками и с микротрубочками, обработанными субтилизином. Судя по результатам электрофореза, оказалось, что, в отличие от препарата очищенных хромаффинных гранул, в препарате везикулярной фракции имелись компоненты, соосаадавшиеся с обработанными субтилизином микротрубочками. Этот результат указывал на то, что в везикулярной фракции

имелись компоненты, взаимодействовавшие с микротрубочками посредством белков-транслокэторов. Действительно, в присутствии АТФ, взятого в концентрации 2 мМ, взаимодействие этих компонетов везикулярной фракции с обработанными субтилизином микротрубочками подавлялось. Результаты измерений количества белка в осадках подтвердили результаты электорофореза.

Итак, везикулярная фракция содержала небольшое количество мембранных везикул, взаимодействовавших с микротрубочками, обработанными субтилизином, и это взаимодействие было АТФ-чувствительным. Наиболее вероятно, что этот кошонент - 'не хромаффинные гранулы, гак как гранулы составляют основную массу везикулярной фракции.

Таким образом, опыты с везикулярной фракцией можно рассматривать как еще одно подтверждение того, что белки-транслокаторы не принимают участия во взаимодействии хромаффинных гранул с микротрубочками.

Хромаффшшые гранулы содержат в своей мембране белок MAP 2. Наиболее вероятно, что именно MAP 2 опосредует взаимодействие гранул с микротрубочками. Этот вывод следует из нескольких независимых наблюдений. Во-первых, некоторые свойства связывания гранул с микротрубочками идентичны свойствам взаимодействия MAP 2 с микротрубочками. Такими свойствами являются нечувствительность связывания к АТФ и неспособность взаимодействовать с молекулами тубулина, лишенными С-концевых фрагментов. Во-вторах, MAP 2 является единственным' белком тратонового экстракта хромаффинных гранул, связывавшимся с микротрубочками. Это следует из . результатов афинной

хроматографии тритововогб экстракта белков гранул на колонке с иммобилизованными микротрубочками, а также из результатов опытов по соосавдешш белков тритонового экстракта гранул с микротрубочками.

. Какую физиологическую роль играет опосредованное MAP 2 взаимодействие хромзффжшых гранул и микротрубочек? Возможно, хромаффинные гранулы, заякоренные на микротрубочках вблизи районов зкзоцитоза, "дожидаются" сигнала к началу секреции. Исследование нового 170 кД-белка, вызывающего образование пучкеd шжрогрубочек.

Во второй части работы мы идентифицировали новый ассоциированный с микротрубочками белок из хромаф&шных клеток, вызывающий образование пучков микротрубочек. Частичная очистка 170 кД белка.

Разработанный наш метод выделения 170 кД белка ( см. схему выделения) заключался ' в. следующем. Мозговое вещество надпочечников (20 г) гомогенизировали на льду в буфере,

- содержавшем 0,3 М сахарозу. Гомогенат центрифугировали 15 мин.

\

при 800 д. К супернатанту добавляли ингибиторы протеаз и центрифугировали 15 мин. при 27 ООО д.

Полученный, супернатант смешивали с 20 мл суспензии стабилизированных таксолом микротрубочек и добавляли тршолифэсфат до концентрации 2,5 мм. Смесь инкубировали 5 мин, при 37° и микротрубочки осаждали черкз слой буфера, содержащего глицерин (4 М), триполифосфат (2,5 ым> и таксол-(5 мкМ). Следующим этапом было центрифугирование при 22е, при 120 ООО э, в течение 60 мин. Осадок суспендировали в 1,5 мл. буфера с 20 мкн таксола и 0,2 М kci. В некоторых случаях буфер

Схема выделения 170 кД-белка гомогенизация надпочечников, центрифугирование гомогената

I

добавление к супернатанту суспензии микротрубочек и триполифосфата

i

осаждение микротрубочек через слой 4 М глицерина для удаления несвязавшгася с ниш белков

I

злиция связавшихся белков 0,2 М kci и, иногда, АТФ.

I

осаждение мюсрогрубочек центрифугированием

I

разделение белков супернаталта на колонке sup6 1

хроматография фракций, содержащих 170 кД-белок, на monoQ

для суспендировэния также содержал 2 мм АТФ. После этого материал центрифугировали при 20° в течение 40 мин. при 150 ООО д. Супернатант собирали и вновь центрифугировали в. течении 20 мин. в том то режиме. Белки,' содержавшиеся в супернатанте, разделяли с помощью fplc. Для этого на колонку sup б наносили 0,5 мл. материала и собирали фракции по 0,5 мл. Результаты анализировали с помощью электрофореза. Злектрофоретический анализ показал, что основными белками, содержавшимися в полученных фракциях были белки с молекулярными массами 120 кД, 170 кД и 270 кД. С помощью

окрашивания блотов специфическими антителами, белки с молекулярными массами 120 кД и 270 кД были идентифицированы как тяжелая цепь кинезина и MAP 2 соответственно. В то же время 170 кД-белок не реагировал с антителами к известным MAP: с. антителами к MAP 2, к 200 кД МАР4, к белку с массой 170 кД из Heia и с антителами к кинезину.

Хорошо известно, что многие MAP, перманентно ассциированные с микротрубочками, выдерживают нагревание до 100°С. Так, MAP 2, тау и ЫАР 4 не преципитируют при нагревании и сохраняют способность связываться с микротрубочками. Чтобы проверить, обладает ж 170 кД-белок такой способностью, частично очищенный препарат белка прогревали при Ю0°С в течении 5 мин. Выяснилось, что содержащийся в препарате 170 кД-бедок полностью прецшштировал в результате такой обработки. Таким образом, 170-кД белок не принадлежит к числу термостабильных MAP.

Итак, можно было предположить, что мы обнаружили неизвестный ранее белок, ассоциированный с микротрубочками.

Для окончательной очистки 170 кД-белка была использована ионообменная хроматография на колонке monoQ. Для этого фракции, содержащие 170 кД-белок, полученные при хроматографии на кэлонке sup6 объеденили, нанесли на колонку monoQ объемом 2 мл и связавшиеся белки элшровали градиентом kci ( см схему). Присутствие 170 кД-бежа обнаруживали электрофорезом. Содержавшие 170 кД белок фракции объединяли, удаляли kci диализом и использовали полученный препарат для изучения свойств 170 кД-белка. При нагрузке I мкг на доржку в окрашенных гелях обнаруживалась единственная полоса,

соответствовавшая 170 кД белку.

170 кД-белок вызывает образование пучков микротрубочек. Необычным свойством 170 кД-белка оказалась способность стимулировать образование пучков микротрубочек. Такие пучки можно было обнаружить с помощью видеомикроскопии после добавления препарата очищенного 170 кД-балка (концентрация белка 10 мкг/мл) к суспензии стабилизированных таксолом микротрубочек (конечная концентрация тубулинз - 10 мкг/мл). Пучки образовывались после инкубации смеси в течение нескольких минут при комнатной температуре.

Электронная микроскопия негативно окрашенных образцов подтвердила образование пучков микротрубочек. Число микротрубочек в каждом пучке варьировало от 2-3 до нескольких десятков. На электронных микрофотографиях можно было видеть также частицы диаметром около 100 нм, соответсвупцие, вероятно, индивидуальным молекулам 170 кД-белка.

Поскольку микротрубочки - полярные структуры, концы каждой микротрубочки различаются между собой. Было интересно выяснить, хаотична полярность микротрубочек в пучках, образованных в присутствии 170 кД-белка, или все микротрубочки в пучке имеют одинаковую полярность. Для выяснения этого вопроса к пучкам шпсротрубочек были добавлен белок-транслокатор кинезин. Кинезин вызывает скольтение микротрубочек по стеклу, причем это движение отличается полярностью: передний конец каждой микротрубочки соответствует ее так называемому минус-концу, а задний - гак ' называемому плюс-концу- После добавления кинезина к пучкам составлявшие их микротрубочки приходили в движение, причем они "выползали" из

каадого пучка в обе стороны, что говорит о том, что полярность шкротрубочек в пучках была хаотичной.

Мы охарактеризовали затем взаимодействие 170 кД-белка с шпсротру бочками. Для этого мы сравнили связывание с микротрубочками 170 кД-белка, белков-транслокаторов и MAP, перыаанентно ассоциированных с микротрубочками. Хорошо известно, что взаимодейтвие белков-транслокаторов,кинезина и данеина, подавляется АТФ, взятом в миллимолярных концентрациях. Мы проверили, образуются ли пучки микротрубочек в присутствии АТФ и показали, что ни АТФ, ни другие нуклеозидтрифосфаты, взятые в концентрации 1-2 мМ, образования пучков не подавляли. Это наблюдение, а также то обстоятельство, что наши многочисленные попытки вызвать' движение микротрубочек добавлением 170 кД-бежа кончились неудачей, позволяют заключить, что этот белок не является транслокатором.

MAP, перманентно ассоциированные с микротрубочками, (MAP I, MAP 2, тау, МАР4 и др.) связываются с С-концевыми фрагментами субъедениц тубулина. Чтобы выяснить, связывается ли 170 кД-бвлок с теми же сайтами, что и MAP, перманентно ассоциированные с микротрубочками, мы использовали обработанные субтапизином микротрубочки. В таких микротрубочках субъеденицы тубулина лишены С-концевых фрагментов. Поскольку 170 кД-белок вызывал образование пучков мшсротрубочек, обработанных субгилизином, мы заключили, что он взаимодействует с микротрубочками отлично от перманентно ассоциированных MAP.

Таким образом, обнаруженный наш 170 кД-белок из мозгшового

вещества надпочечников обладает необычным набором свойств: он образует пучки микротрубочек, и его связывание с полимерным тубулином отличается как от связывания Селков-транслокаторов, так и от MAP, перманентно ассоциированных с микротрубочками.

Вывода

1. Показано, что хромаффинные гранулы взаимодействуют с микротрубочками m vitro, и это взаимодействие опосредуется белковым компонентом хромаффгоных гранул.

2. Взаимодействие не ингибируется АТФ, гранулы не связываются с микротрубочками, состоящими из субъедевиц тубулина, лишенных С-концевых фрагментов. Следовательно, взаимодействие обеспечивается белками, отличными от белков-транслокаторов.

3. Тритоновый экстракт хромаффинных гранул содержит единственный белок, имеющий сродство к микротрубочкам. Этот белок был идентифицирован как МАР2.

4. Из мозгового вещества надпочечников выделен неизвестный ранее белок с мол. массой 170 кД, способный соосавдаться с микротрубочками.

5. Показано, что 170 кД-белок вызывает образование пучков стабилизированных таксолом микротрубочек.

6. Образование пучков микротрубочек под действием 170 кД-белкз не ингибируется АТФ; обработанные субтилизином микротрубочки образуют пучки в присутствии 170 кД-белка. Следовательно, свойства 170 кД белка из мозгового вещества надпочечников отличаются от свойств описанных ранее MAP.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Ф.Ф. Северин. Белки, ассоциированные с микротрубочками //

Биохимия -I99I, -т. 56, -стр. 963-976.

2. Ф.Ф. Северин, H.A. Ванина, С.А. Кузнецов, В.И. Гельфанд. Взаимодействие хромаффшшых гранул с микротрубочками in vitro //-Второй Всесоюзный Симпозиум по торетичаскиы и прикладный аспекта« иолакулярной биологии.-1991, -Самарканд, -Абстракты, -стр 170.

3. F.F. Severin, N. A. Shanina, S. A Kuznetsov, V.l. Gelfand. MAP2-raediated binding of chromaffin granules to microtubules // FEBS Letters -1991, -v.282, -pp 65-68.

4. F.F. Severin, (I.A. Shanina, S.A Kuznetsov, v.l. Gel fand. MAP2-mediated binding of chromaffin granules to microtubules // FEBS-EMBO Winter School -1991, Schladming, Abstracts, p. Tu7.