Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек

Гудимчук, Никита Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек"

На правах рукописи

Гудимчук Никита Борисович

Взаимодействие кинезина СЕЫР-Е и белкового комплекса Оатп1 с динамическими концами микротрубочек

Специальность 03.01.02. — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

5 ДЕК 2013

005542367

Пущино-2013

005542367

Работа выполнена совместно в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук (ДТП ФХФ РАН), в Университете Колорадо (Боудцер, США) и в Университете Пенсильвании (Филадельфия, США)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Фазоил Иноятович Атауллаханов (директор ЦТП ФХФ РАН)

Научные консультанты: профессор Ричард МакИнтош

(Университет Колорадо, г. Боулдер, США)

профессор Екатерина Грищук

(Университет Пенсильвании, г. Филадельфия, США)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Надеждина Елена Сергеевпа (г.н.с., руководитель группы клеточной биологии Института белка РАН, г. Пущино)

доктор физико-математических наук Морозов Виктор Николаевич (зав. лаб. наноструктур и нанотехнологий Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва

Защита диссертации состоится «25» декабря 2013 года в 13:30 часов на заседании диссертационного совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «25» ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Митотическое деление клеток (или митоз) - это важнейший процесс, который обеспечивает рост и регенерацию тканей многоклеточных организмов. При делении критически важно, чтобы каждая дочерняя клетка унаследовала точную копию набора хромосом матери. Распределение хромосом по дочерним клеткам достигается в результате сложной последовательности перемещений, осуществляемых посредством митотического аппарата, состоящего главным образом из микротрубочек и кинетохоров. Микротрубочки представляют собой линейные полимеры белка тубулина. Они динамически нестабильны: удлиняются и укорачиваются, развивая при этом толкающие и тянущие силы, соответвенно. Кинетохоры - белковые суперкомплексы на хромосомах, которые помогают осуществлять закрепление хромосом за динамические концы микротрубочек и использовать силы, развиваемые микротрубочками, для перемещения хромосом. Механизмы сопряжения кинетохорами динамики микротрубочек и движений хромосом, однако, остаются плохо изученными.

В дрожжевых клетках сопряжение движения хромосомы с динамикой конца микротрубочки происходит посредством Daml комплекса, образующего кольцо вокруг микротрубочки [Westermann et al. 2005]. Теоретически предсказано, что Daml комплекс является эффективным устройством для передачи силы от микротрубочки к сопряженному с ней микрогрузу [Efremov et al. 2007]. Эти предсказания, однако, все еще ожидают прямой экспериментальной проверки.

В животных клетках гомологи Daml отсутствуют, а структурные данные указывают на то, что сопряжение между хромосомой и концом микротрубочки может осуществляться неизвестными длинными фибриллярными компонентами [Mcintosh et al. 2008]. Кандидатом на роль такого сопрягающего устройства является один из наиболее длинных фибриллярных компонентов кинетохора - кинезин CENP-E. Удаление его из кинетохоров ведет к 50% уменьшению числа связанных с кинетохором хромосом [Putkey et al. 2002]. Кроме того, как и многие другие кинезины, CENP-E может транспортировать хромосомы вдоль микротрубочек,

совершая механическую работу за счет энергии гидролиза АТФ. По причине необычно большого размера белка CENP-E (более 300 кДа), осложняющего его очистку и исследование, на настоящий момент в литературе были предприняты лишь попытки характеризации небольшого N-концевого фрагмента CENP-E. Экспериментальные данные о поведении индивидуальных молекул полноразмерного белка CENP-E полностью отсутствуют.

Цель работы: исследование взаимодействия кинетохорного белка CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек.

Задачи исследования:

1. Измерить максимальную силу, которую микротрубочка может развивать через сопрягающее устройство в виде Daml комплекса.

2. Охарактеризовать движение индивидуальных молекул полноразмерного белка CENP-E и его фрагментов вдоль микротрубочек in vitro. Определить зависимость моторных характеристик белка CENP-E от приложенной внешней силы.

3. Экспериментально исследовать взаимодействие индивидуальных молекул белка CENP-E с динамическими концами микротрубочек in vitro. Определить роль различных доменов белка CENP-E в этом взаимодействии.

4. Построить математическую модель взаимодействия белка CENP-E с динамическими концами микротрубочек. Сформулировать представления о механизме работы CENP-E как плюс-концевого белка (т.е. белка способного следовать за плюс-концами микротрубочек).

Научная новизна

В данной работе была впервые измерена сила, которую может развивать деполимеризующаяся микротрубочка с помощью дрожжевого белкового комплекса Daml. Показано, что геометрия закрепления микрогруза за конец микротрубочки критически важна для эффективности передачи силы. Кроме того, были впервые изучены характеристики движения полноразмерной молекулы CENP-E по микротрубочкам. Показано, что наличие немоторных доменов CENP-E не влияет на его движение по стенке микротрубочки в широком диапазоне приложенных

внешних сил. Впервые продемонстрирована способность белка СЕМР-Е следовать за динамическими концами микротрубочек, а также сопрягать динамику микротрубочек и движение микрогрузов. Обнаружено, что для данной активности СЕЫР-Е достаточно одного димера полноразмерной молекулы СЕМР-Е. Впервые охарактеризовано движение хвостового домена белка СЕМР-Е по микротрубочке на уровне отдельных молекул. Показано, что ни моторный домен, ни хвостовой домен не способны автономно следовать за динамическими концами микротрубочек, в то время как их комбинация необходима и достаточна для данной активности. На основе экспериментальных данных предложен механизм работы СЕМР-Е как плюс-концевого белка и разработана компьютерная модель, количественно согласующаяся с этими представлениями.

Научно-практическая значимость

Проведенное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия хромосом и митотического аппарата клетки. В частности, экспериментально обосновывается возможность развития большой силы микротрубочкой с помощью кольцевого Бат! комплекса и формулируются представления о роли и конкретном молекулярном механизме работы белка СЕМР-Е как стабилизатора взаимодействия между микротрубочками и хромосомами на различных стадиях митоза. Изучение механизмов клеточного деления в целом и работы белка СЕМР-Е в частности может также привести к созданию новых антираковых препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Измерена сила, развиваемая деполимеризующейся микротрубочкой при ее сопряжении с микрогрузом с помощью белкового комплекса Оаш1.

2. Измерены моторные характеристики М-концевого фрагмента СЕМР-Е, содержащего моторный домен, и полноразмерной молекулы СЕМР-Е в диапазоне внешних сил от -6 пН до 6 пН.

3. Обнаружена способность полноразмерной молекулы СЕМР-Е следовать за динамическими концами микротрубочек. Продемонстрирована способность

полноразмерных молекул CENP-E сопрягать разборку микротрубочек с движением искусственных микрогрузов, имитирующих хромосомы.

4. На уровне отдельных молекул исследовано взаимодействие С-концевого фрагмента CENP-E с микротрубочками.

5. Построена математическая модель вхаимодействия CENP-E с динамическими концами микротрубочек. Предложен и подтвержден компьютерными расчетами и экспериментами принципиально новый механизм следования за динамическими концами микротрубочек.

Апробация работы состоялась 20 ноября 2013 г. на секции «Молекулярная биофизика» ученого совета Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук.

Результаты работы были представлены на международных и региональных конференциях: "The Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" (Филадельфия, США, декабрь 2010 г.), "The Annual Biophysical Meeting" (Балтимор, США, март 2011 г.), "The Annual Biophysical Meeting" (Сан-Диего, США, февраль 2012 года), "Biophysical Society Pennsylvania Network Meeting" (Бетлехем, США, сентябрь 2012 года), "The Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" (Сан-Франциско, США, декабрь 2012г.), "The Annual Biophysical Meeting" (Филадельфия, США, февраль 2013 года).

Публикации

По результатам диссертационной работы было опубликовано три статьи и тезисы в сборниках шести конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описания результатов и их обсуждения), заключения, выводов, списка сокращений и библиографического указателя, включающего 148 источников. Работа выполнена совместно в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН (зав. лаб. проф. Ф.И. Атауллаханов), в Университете Колорадо,

г. Боулдер, США (зав. лаб. проф. Ричард МакИнтош) и в Университете Пенсильвании г. Филадельфия, США (зав. лаб. проф. Е.Л. Грищук).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о клеточном делении и перемещении хромосом в ходе этого процесса. Изложена информация о работе основных источников сил во время митоза: моторных белков и динамических микротрубочек. Приведены сведения об устройстве кинетохора и проблеме его закрепления за динамические концы микротрубочек. Описаны известные функции и свойства кинетохорного белка CENP-E. Рассмотрены методы изучения отдельных молекул: микроскопия полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) и лазерные ловушки.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе.

Очистка белков

Тубулин был очищен из коровьих мозгов методом термического циклирования и мечен родамином или Hilyte-647 (Anaspec) по ранее опубликованным протоколам [Hyman et al. 1991]. Рекомбинантный комплекс Daml, фибриллярные белки-подвески, а также полноразмерный белок CENP-E и его фрагменты были предоставлены коллегами автора диссертации.

Измерение сил, развиваемых микротрубочкой

Опыты по измерению сил, развиваемых деполимеризующейся микротрубочкой при прямом латеральном закреплении микросферы, проводились по ранее опубликованным протоколам [Grishchuk et al. 2008]. В опытах с латерально закрепленным Daml кольцом микросферы покрывались Daml комплексом, и эксперимент проходил в буфере, содержащим растворимый белок Daml. В опытах с торцевым закреплением микросферы покрывались Daml комплексами следующим образом. С помощью бифункционального соединения, несущего малеимид на одном конце и сукцинимидил на другом конце, стеклянные микросферы с амино-группами на поверхности (Bangs Laboratories) ковалентно прищивались к С-концевому

цистеику химеры миозина-GBP. Химеры миозина-GBP служили в качестве фибриллярных подвесок для Daml комплекса. Наличие GBP (англ.: GFP-binding protein) в составе фибриллярной подвески позволяло связывать фибриллярные подвески с GFP-меткой в составе Daml комплекса.

TIRF микроскопия CENP-E на стабильных микротрубочках.

Исследование движения белков CENP-E, меченных GFP (англ.: green fluorescent protein), вдоль стабилизированных микротрубочек осуществлялось внутри проточных камер, которые содержали микротрубочки, иммобилизованные на покровном стекле и раствор белка CENP-E в «рабочем буфере»: BRB80 с 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 6 мг/мл глюкозы, 68 мкг/мл каталазы, 0.1 мг/мл глюкозооксидазы, 0.5% Р -меркаптоэтанола и 2 мМ Mg-АТФ с 10 мкМ таксола. Концентрации белков CENP-E варьировались в пределах 0.5-10 нМ. Для наблюдения проточная камера помещалась под объектив инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E. Флуоресценция возбуждалась лазером с длиной волны 488 нм. В режиме полного внутреннего отражения. Температура объектива поддерживалась равной 32°С с помощью нагревательного ошейника на объективе (Bioptechs). Съемка экспериментов осуществлялась с помощью камеры Andor 512x512 10 MHz EMCCD, охлаждаемой до температуры -80°С. Движение белковых конструкций CENP-E по микротрубочкам записывалось в виде последовательности около 800 кадров в зеленом флуоресцентом канале с выдержкой от 20 до 100 мс и нулевым интервалом между кадрами.

TIRF микроскопия CENP-E на динамических микротрубочках

Исследование движения белков CENP-E, меченных GFP, вдоль динамических микротрубочек осуществлялось внутри герметичных проточных камер, промываемых с помощью насоса. Камеры содержали затравки микротрубочек, иммобилизованные на покровном стекле и раствор белков CENP-E и тубулина в рабочем буфере без таксола, дополненном 1 мг/мл казеина, 1 мМ ГТФ и 0.15-0.3% метил-целлюлозы. Концентрации белков CENP-E варьировались в пределах 2-10 нМ. Концентрация тубулина была равна 5 мкМ. Растворимый тубулин был мечен Hilyte647 со степенью мечения 1:15 .

В данных условиях микротрубочки были динамически нестабильны, наблюдалось их удлинение и укорачивание в растворе. Температура объектива поддерживалась равной 32°С. Съемка динамических микротрубочек проводилась в режиме автоматизированного переключения освещения между двумя лазерами с длинами волн 488 нм и 640 нм. Переключение освещения осуществлялось с помощью акусто-оптического фильтра АСПТ и было синхронизировано с выдержкой камеры. Записывались последовательности около 800 кадров двухканальной съемки с выдержкой от 20 до 100 мс.

Измерение аффинности белков CENP-E к полимерам тубулина Для получения ГДФ-связанного полимера тубулина использовались микротрубочки, стабилизированные таксолом. В качестве полимеров тубулина, имитирующих удлиняющиеся концы микротрубочек, использовались микротрубочки полимеризованные в присутствии негидролизуемого аналога ГТФ, ОМРСРР. В качестве имитаторов концов укорачивающихся микротрубочек, использовались спирали тубулина, полимеризованные в присутствие винбластина [Ьис1иепа ее а1. 1981]. Измерение связывания СЕЫР-Е с имитаторами концов микротрубочек происходило следующим образом. Белки СЕЫР-Е были диализованы в буфер В11В80 с 1 мМ ЭТТ в течение 1 часа при 4°С. Далее 6 нМ СЕЫР-Е инкубировался в течение 15 минут при 23°С в пробирках с различными концентрациями полимеров тубулина. Буфер на основе В11В80, в котором происходила инкубация, содержал 2 мМ М§-АДФ, 4 мг/мл БСА, 2 мМ БТТ и 10 мкМ таксола или винбластина.

Комплексы СЕОТ-Е и полимеров тубулина осаждались центрифугированием на воздушной центрифуге ^гйще, Вескшап) при 81,000g в течение 3 мин в случае микротрубочек или 126,000§ в течение 30 минут в случае винбластиновых спиралей тубулина. Надосадки, содержащие несвязавшийся белок СЕЫР-Е, собирались и анализировались с помощью флуоресцентного микроскопа.

Измерение характеристик CENP-E с помощью лазерной ловушки Для проведения измерений моторных характеристик СЕ№-Е и манипуляции микросферами во время экспериментов с сегментными микротрубочками была

построена и использована лазерно-микроскопная установка на основе прямого микроскопа Zeiss Axiolmager Z2. Оптическая ловушка была реализована с помощью лазера (Manlight) с длиной волны 1064 нм, который фокусировался объективом микроскопа. Детекция положения микросферы в оптической ловушке осуществлялась с помощью лазера с длиной волны 780 нм, совмещенного в объективе с ловушечным лазером, и квадрантного фотодетектора (КФД).

На покровном стекле простой проточной камеры иммобилизовались стабилизированные таксолом микротрубочки. В камеру вводилась разбавленная суспензия микросфер, покрытых CENP-E, в рабочем буфере. Индивидуальная микросфера в камере захватывалась в лазерную ловушку и подносилась в контакт с микротрубочкой. Съемка эксперимента проводилась помощью метода микроскопии Номарского с 100 мс выдержкой. Проведение эксперимента в режиме постоянной силы происходило аналогично. Дополнительно проводилась вольт-нанометровая калибровка КФД и калибровка жесткости оптической ловушки. Как только микросфера смещалась из центра ловушки более чем на 200 нм, запускался режим обратной связи, приводящий к таким смещениям пьезоподставки, которые компенсировали смещение микросферы по микротрубочки, поддерживая смещение центра микросферы из центра ловушки на заданном уровне. При этом положения пьезостолика обновлялись с частотой 100 Гц и коэффициентом обратной связи 0.30.5. Сила, действующая на микросферу, определялась как произведение расстояния между центрами микросферы и ловушки на коэффициент жесткости лазерной ловушки.

Эксперимент с сегментными микротрубочками.

Сегментные микротрубочки с GMPCPP шапочками, меченными родамином, полимеризовались как описано в статье [Grishchuk et al. 2005]. В проточную камеру с сегментными микротрубочками вводились микросферы, покрытые CENP-E, в рабочем буфере без таксола. Свободно-плавающая микросфера захватывалась в лазерную ловушку с жесткостью 0.02 пН/нм и подносилась к сегментной микротрубочке, растущей из аксонемы. После этого жесткость ловушки снижалась до 0.0025 пН/нм, позволяя микросфере свободно выходить из ловушки при

зацеплении активного мотора за микротрубочку. После начала движения микросферы вдоль микротрубочки, поле наблюдения освещалось ртутной лампой в красном флуоресцентном канале, что приводило к разрушению родаминизированных сегментов, стабилизирующих микротрубочки. Для разрушения родаминизированных сегментов было достаточно около 5 секунд облучения ртутной лампой, после чего наблюдение возобновлялось методом микроскопии Номарского. Запись эксперимента происходила с выдержкой 100 мс с интервалом между кадрами около 300 мс.

Глава 3 содержит результаты работы и их обсуждение.

Механика сопряжения грузов с разборкой микротрубочек белковым комплексом Оаш1

В работе [ОпзЬсЬик ^ а1. 2005] было показано, что при разборке микротрубочка может оказывать силы на латерально присоединенные к ней микросферы. Источником энергии для этого процесса является энергия гидролиза ГТФ, запасенная в виде механического напряжения протофиламентов. При дестабилизации микротрубочки ее протофиламенты начинают выгибаться, высвобождая запасенную энергию в виде механической работы. Существующая оценка силы разбирающейся микротрубочки базируется на двух предположениях: 1) возможность собрать с помощью кольцевого сопрягающего устройства силу в 6-13 раз больше, чем при прямом латеральном закреплении микросферы за микротрубочку и 2) наличие эффекта рычага в опытах по измерению толчков выгибающихся протофиламентов. В этой диссертационной работе были проведены прямые экспериментальные измерения с целью проверить каждое из этих предположений.

Для проверки первого предположения, была измерена сила, развиваемая микротрубочкой через латерально закрепленное на ней кольцо из белкового Баш1 комплекса. Измерения показали, что наличие Оат1 кольца увеличивает максимальный толчок, оказываемый на микросферу в 5.7 раз (2.3 пН против 0.45 пН без Баш! кольца). Этот коэффициент увеличения амплитуды развиваемой силы

близок к теоретически предсказанному коэффициенту 6.5, ожидаемому за счет увеличения количества вовлеченных в работу протофиламентов с двух до 13.

В процессе измерения силы микротрубочки с помощью лазерной ловушки микросфера вращается относительной точки закрепления за микротрубочку. При этом условием механического равновесия системы является равенство моментов действующих сил. Плечо оптической силы (равное радиусу микросферы) превышает плечо силы, развиваемой микротрубочкой (сопоставимое с радиусом Ваш1 кольца). В результате возникает эффект рычага, приводящий к тому, что сила, развиваемая на самом деле микротрубочкой, не равна силе, измеряемой в центре ловушки. Эффект рычага возникает из-за того, что оптическая сила и сила микротрубочки не соосны друг другу. Для достижения соосного закрепления, было принято решение изменить геометрию эксперимента. Для этого микросферы были прикреплены к микротрубочкам с помощью Оагп1 колец, подвешенных на фибриллярных подвесках длиной 100 нм. Длина фибриллярных подвесок позволяла микросферам быть переориентированными под воздействием силы со стороны оптической ловушки так, чтобы закрепление микросферы к концу микротрубочки оказалось не латеральным, а торцевым. Амплитуда силы, измеренной при торцевом (соосном) закреплении Ват1 комплекса, достигала 30 пН (рис. 1).

Таким образом, в данном исследовании была экспериментально измерена сила развиваемая микротрубочкой с помощью сопрягающего устройства в виде Бат1 комплекса. Полученный результат с оценками силы микротрубочки, полученными на основе косвенных измерений [ОпвИсЬик е! а1. 2005].

Взаимодействие между белком СЕ№-Е и стенкой микротрубочки

Поведение индивидуальных молекул белка СЕМ>-Е на микротрубочках изучалось с помощью метода ТШР микроскопии и путем наблюдения движения

Латеральное -г I закрепление с 201

Торцевое . закрепление ¡у

Я 1

2 0 1 2 3 4 Время, сек

Рис. 1. Силы, измеренные при различных способах закрепления микросферы к микротрубочке через Оат1 кольцо.

гласуется с ранее опубликованными

микросфер, покрытых CENP-E. Исследовались два типа белковых конструкций: (1) полноразмерный белок CENP-E, меченный GFP, и (2) N-концевой фрагмент CENP-E (473 аминокислотных остатка), также меченный GFP. Для удобства далее эти белковые конструкции будут обозначены как FL CENP-E (от англ. full length) и TR CENP-E (от англ. truncated), соответственно.

Движение TR CENP-E по стабильным микротрубочкам было регулярным со средним пробегом 2.7 ± 0.2 мкм и скоростью 17.6±0.7 мкм/мин. Молекулы FL CENP-E двигалась либо аналогичным образом с близкими характеристиками, либо связывались с микротрубочками на короткое время (< 1 с) и диффундировали вдоль их поверхности. Последний тип поведения был интерпретирован как результат автоингибирования CENP-E в согласии с опубликованной работой [Espeaut et al. 2.008].

Для измерения зависимости характеристик подвижности белков CENP-E от приложенной внешней силы была использована оптическая ловушка в режиме постоянной силы (англ.: force clamp). На основе этих измерений были построены зависимости скорости и пробега белков CENP-E от приложенной внешней силы (рис. 2). Формы этих кривых близки для FL и TR CENP-E, указывая на то, что немоторные домены в FL CENP-E не влияет на АТФ-зависимое движение по микротрубочкам. Останавливающая сила для обоих белков составила около -6 пН. Открепляющая сила составила 2.0 ± 0.3 пН и 2.1 ± 0.5 пН для FL CENP-E

Следование за динамическими концами микротрубочек

Чтобы определить поведение белка CENP-E на более физиологичных, динамических микротрубочках, была использована технология двухцветной TIRF микроскопии.

♦ FLCENP-E -О- TRCENP-E

■ FL CENP-E о TR CENP-E

4030 20^ 10" о

• в

* Ô

-2 0 2 4 6 Сила, пН

-6 4 -2 0 2 4 6 Сила, пН

Рис. 2. Зависимости скорости и времени жизни СЕ№Р-Е на микротрубочках от приложенной внешней силы.

и TR CENP-E, соответственно.

В ходе эксперимента наблюдались динамически нестабильные микротрубочки, которые удлинялись со скоростью около 1 мкм/мин и укорачивались со скоростью около 15 мкм/мин. При этом к ним из раствора могли присоединяться молекулы СЕМ^Е. Как и в эксперименте со стабильными микротрубочками, присоединившиеся моторы РЬ СЕМР-Е либо диффундировали вдоль стенок микротрубочек, либо двигались однонаправленно. При этом некоторые молекулы достигали концов удлиняющихся или укорачивающихся микротрубочек:. После достижения динамических концов микротрубочек молекулы РЬ СЕМР-Е, но не ТЯ СЕМР-Е, часто оставались связанными с этими концами (рис. 3). Связывание прямолинейно двигающихся молекул РЬ СЕМР-Е с удлиняющимися концами микротрубочек происходило примерно в 29.6% случаев, а связывание с

Ми-,ср0" Р1 СЕ^-Е Наложение РЬ СЕ№-Е Наложение Рис. 3. Кимограммы

трубочка трубочка

взаимодеиствия Р1_ СЕЫР-Е с концами укорачивающейся, растущей и микротрубочки с чередованием роста-укорачивания

Расстояние вдоль микротрубочки (масштабный отрезок 3 мкм) укорачивающимися концами наблюдалось с частотой 64.3%. При этом критерием связывания считалось нахождение на динамическом конце в течение как минимум 4 с. Времена жизни и пробеги молекул РЬ СЕМР-Е на концах удлиняющихся микротрубочек составили 17.9±1.3 с и 0.3±0.1 мкм, соответственно. Времена жизни и пробеги молекул РЬ СЕИР-Е на концах укорачивающихся микротрубочек составили 11.6±1.4 с и 2.1±0.3 мкм, соответственно. Анализ яркостей комплексов РЬ СЕИР-Е на концах микротрубочек показал, что даже одиночные димеры СЕКР-Е были достаточны для следования за плюс-концами микротрубочек.

Количественный анализ скоростей роста, скоростей укорачивания и частот катастроф (т.е. переходов от роста к укорачиванию) микротрубочек в присутствии и

отсутствии СЕ№-Е на их концах показал, что небольшие комплексы СЕ1ЧР-Е не влияют на динамику микротрубочек.

Сопряжение белком СЕ№-Е движения грузов с разборкой микротрубочки

Чтобы проверить, что СЕ№-Е способен сопрягать с динамикой микротрубочек довольно большие грузы (такие как хромосома), было исследовано взаимодействие микросфер, покрытых СЕТчГР-Е, с укорачивающимися микротрубочками. В данном эксперименте микросфера была присоединена к хвостовой части СЕ1ЧР-Е (близко к домену, связывающему кинетохор) и таким образом имитировала хромосому. Микросферы, покрытые СЕКР-Е, вводились в проточную камеру, после чего индивидуальная микросфера захватывалась в лазерную ловушку и приводилась в контакт с сегментной микротрубочкой. Как только СЕ№-Е начинал перемещать микросферу вдоль микротрубочки, лазерная ловушка отключалась и микротрубочка облучалась ртутной лампой, чтобы разрушить стабилизирующую шапочку и тем самым запустить деполимеризацию микротрубочки. Микросферы, покрытые БЕ СЕКР-Е, в отличие от микросфер, покрытых ТЯ СЕТчПР-Е, были способны следовать за разбирающимся концом микротрубочки (рис.4).

Обнаруженная способность СЕМР-Е связываться с динамическими концами

0 4.5 9 13.5 18 22.5 27 Рис. 4. Схема (слева)

микро I трубочка/ / С *} > г \ : к | ъ. и кадры движения микросферы, покрытой Р1. СЕ^-Е по сегментной микротрубочке (с интервалом 4.5 с.)

микротрубочек говорит о его потенциальном прямом участии в сопряжении динамических концов микротрубочек с движением хромосом.

Необходимые и достаточные условия следования за динамическими концами микротрубочек белком CENP-E

Аффинность БЕ СЕКР-Е к динамическим концам микротрубочек Для изучения механизма следования за концами динамических микротрубочек белком БЕ СЕКР-Е важно установить, имеет ли данный белок повышенную аффинность к этим динамическим концам.

Удлиняющиеся микротрубочки характеризуются относительно прямыми концами, в которых молекулы ГТФ еще не гидролизованы до ГДФ, как в основной части тела микротрубочки. Поэтому для имитации конца микротрубочки были использованы полимеры тубулина, выращенные в присутствии негидролизуемого аналога ГТФ, GMPCPP. Укорачивающиеся микротрубочки имеют на своих концах изогнутые протофиламенты, которые по структуре близки к спиралевидным полимерам тубулина, образованным в присутствии химического соединения -винбластина [Marantz and Shelanski 1970]. Поэтому эти спирали тубулина были применены в качестве структур, которые имитируют концы укорачивающихся микротрубочек.

Для того чтобы выяснить, имеет ли FL CENP-E повышенную аффинность к концам растущих и/или укорачивающихся микротрубочек, было проведено сравнение аффинности FL CENP-E к «обычным» ГДФ-связанным микротрубочкам (стабилизированным таксолом), к GMPCPP-связанным микротрубочкам и к спиралям тубулина, образованным в присутствии винбластина. Измерения показали, что константы связывания FL CENP-E с этими полимерам тубулина составляют 41 ± 4 мкМ, 68 ± 23 мкМ и 133 ± 22 мкМ, соответственно. Это свидетельствует против гипотезы о том, что FL CENP-E распознает динамические концы микротрубочек за счет повышенной аффинности к ним.

Характеристика С-концевого сайта связывания микротрубочек

Поскольку только FL CENP-E, но не TR CENP-E обладал способностью следовать за динамическими концами микротрубочек, был предпринят поиск немоторного домена FL CENP-E, определяющего эту активность. Из ранее опубликованных данных было известно, что в составе FL CENP-E кроме моторного домена присутствует еще и другой, С-концевой сайт связывания микротрубочек, расположенный в хвостовом домене CENP-E [Liao et al. 1994]. Для того чтобы охарактеризовать данный сайт на уровне отдельных молекул, был очищен фрагмент CENP-E, содержащий 199 С-концевых аминокислотных остатков, GFP и гексагистидиновую метку (англ.: 6His tag). Методом TIRF микроскопии было изучено взаимодействие хвостового фрагмента CENP-E (далее просто «хвоста

Концентрация Концентрация 5 нМ 1 нМ

ш î

1 J j

CENP-E») со стенкой микротрубочки. Данный фрагмент действительно связывался с микротрубочками и диффундировал вдоль их поверхности. Характерное время жизни хвоста CENP-E на стенке микротрубочки составило 0.47±0.03 с. Коэффициент диффузии хвоста CENP-E по микротрубочке составил 1.6 мкм2/с. Исследование поведения хвоста CENP-E на динамических микротрубочках методом

двухцветной TIRF микроскопии показало, что хвост CENP-E не накапливается на динамических концах микротрубочек и не следует за ними по достижении концов при диффузии по стенке микротрубочек (рис. 5). Однако, было замечено, что несмотря на отсутствие связывания с динамическим концом микротрубочки, хвост CENP-E и не отсоединяется в раствор сразу же после достижения конца микротрубочки. Напротив, происходит как будто бы «отражение» хвоста от границы микротрубочки, после чего он продолжает диффузию.

Математическая модель CENP-E и динамической микротрубочки

Описание модели

С целью количественного анализа поведения полноразмерной молекулы CENP-E на динамической микротрубочке, была создана математическая модель этого процесса. Модель движения CENP-E по микротрубочке основана на кинетических схемах, изображенных на рис. 6. В модели предполагается, что молекула CENP-E состоит из трех частей: мотора, хвоста и гибкой связки между ними. Кинетика отсоединения-присоединения к микротрубочке доменов CENP-E и субъединиц тубулина описывается константами р (рис. 6). Мотор делает шаги величиной 8 нм к плюс-концу микротрубочки со скоростью Vmolor. Хвост одномерно диффундирует вдоль микротрубочки с коэффициентом диффузии Dtail. Мотор, достигающий конца микротрубочки, перестает двигаться. Отсоединение мотора и

Расстояние вдоль микротрубочки (масштабный отрезок 2 мкм)

Рис. 5. Два примера кимограмм, демонстрирующих типичное поведение хвоста СЕ№Р-Е (зеленый цвет) на динамических микротрубочках (красный цвет).

хвоста от терминального димера тубулина происходит с той же константой скорости, что и всюду на стенке микротрубочки, но они отсоединяются от микротрубочки и в случае, если оказываются на отсоединяющемся от нее терминальном димере тубулина. Важно отметить, что в модели нет никаких предположений об особом характере взаимодействия доменов СЕМР-Е с концом удлиняющейся или укорачивающейся микротрубочки.

Ь А

Ргг.с:ог Ри»

РтоКг

Рй

<я>«

Рш

V___у

Ргеэ^ас*

Ро«РР + Рто'О'

Ро«РР * Рй. -

/ РгеаЯэс* РоИРР

РоъРР

Обозначения: хвост

гибкая связка

микротрубочка

мотор

Рис. 6. Кинетическая схема модели CENP-E на динамической микротрубочке: (а) на стенке (Ь) на конце

Сопоставление экспериментальных наблюдений с предсказаниями модели

Модель воспроизводит поведение СЕ№-Е СЕИР-Е в расчетах способна следовать как за удлиняющимися концами микротрубочек, а Т11 СЕКР-Е отсоединяется от микротрубочки практически немедленно после встречи с динамическим концом. Параметры модели были выбраны таким образом, чтобы времена жизни БЕ СЕКР-Е на стенке микротрубочки были равны экспериментальным. При этом было получено хорошее количественное согласие теории с экспериментом при описании времен жизни БЕ СЕ№-Е на концах микротрубочек (рис.7).

в эксперименте: молекула БЕ укорачивающимися, так и за

П)

О. 20

и 15

и_

^ 10

ГО

? и

си

О.

со

■ эксперимент □теория

III

¿1

Укорами- Удлиня-взющийся ющийся конец конец

Рис. 7. Времена жизни Р1_ СЕ^-Е на стенке и концах микротрубочки

Механизм следования белка СЕЫР-Е за динамическими концами микротрубочек

Анализ модели позволил выявить механизм, который может лежать в основе наблюдаемой активности СЕМР-Е на концах динамических микротрубочек. Суть этого механизма заключается в следующем. Молекула СБОТ-Е, двигаясь направленно к плюс-концу микротрубочки за счет моторной активности белка, достигает терминального тубулина динамической микротрубочки. При этом моторный домен отсоединяется, но это не влечет за собой отсоединения всей полноразмерной молекулы, т.к. она остается связанной с микротрубочкой своим хвостом. Хвост, хотя и способен автономно удерживать СЕЫР-Е на микротрубочке в среднем лишь в течение 0.47 с, все же позволяет молекуле не отсоединиться сразу. За счет быстрой диффузии хвоста от конца микротрубочки молекула СЕОТ-Е оказывается на некотором расстоянии от терминального тубулина, и моторный домен, будучи привязанным к микротрубочке через линкер, может присоединиться к микротрубочке снова. После этого вся молекула вновь направленно устремляется к плюс-концу микротрубочки, и цикл повторяется. Так, не имея способности связываться непосредственно с самым концом микротрубочки, СЕОТ-Е удерживается в окрестности динамического конца микротрубочки за счет совместной активности своего хвостового и моторного доменов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной диссертационной работе исследована работа двух компонентов кинетохоров, которые могут в различных организмах выступать в качестве сопрягающих устройств для динамических концов микротрубочек: белкового комплекса Оат1 и кинезина СЕЫР-Е. Комплекс Оаш1 более изучен в этом контексте и выполняет основную сопрягающую роль у дрожжей. Проведенные в данной работе измерения показали, что при оптимальном закреплении за микротрубочку Баш1 является эффективным сопрягающим устройством и способен передавать от микротрубочки силы до 30 пН. В работе также представлено экспериментальное и теоретическое исследование свойств и механизмов работы одного из потенциальных сопрягающих белков животного кинетохора - кинезина

CENP-E. На уровне отдельных молекул были охарактеризованы два аспекта взаимодействия CENP-E с микротрубочками: транспортные свойства при движении вдоль стенки микротрубочки и сопрягающие свойства при движении с динамическим концом микротрубочки.

Согласно полученным данным о транспортных свойствах белка CENP-E, он, как и его моторный фрагмент, обладает всеми свойствами быстрого, сильного и процессивного мотора, т.е. по своим характеристикам аналогичен кинезину-1 [Carter and Cross 2005]. Присутствие немоторных доменов в белке CENP-E практически не оказывает влияния на его моторную активность и характер ответа на внешние воздействия при транспорте под воздействием сил в диапазоне от -6 пН до 6 пН. В диссертационной работе обнаружена способность CENP-E автономно следовать за динамическими концами микротрубочек. В связи с этим можно предположить, что CENP-E осуществляет стабилизацию взаимодействия между хромосомами и микротрубочками, являясь непосредственным прямым механическим сопрягателем. Однако на основе имеющихся данных нельзя исключить и возможности опосредованного участия CENP-E в стабилизации закрепления хромосом за микротрубочки, например, путем доставки на динамические концы микротрубочек таких белков как фосфатаза РР1 [Kim et al. 2010] или модуляторов динамики микротрубочек CLASP 1/2 [Maffini et al. 2009]. Исследование этой возможности может быть одним из перспективных направлений будущих исследований.

В данной работе теоретически формулируется и экспериментально обосновывается принципиально новый механизм связывания белка с динамическими плюс-концами микротрубочек. Двунаправленное процессивное следование за динамическими концами микротрубочек принципиально отличается от непроцессивного следования за плюс-концами микротрубочек большинством известных плюс-концевых белков, таких как, например, белок ЕВ1. Хотя CENP-E является единственным известным мотором, способным к двунаправленному процессивному следованию за концами микротрубочек, механизм работы CENP-E на концах микротрубочек может быть универсальным для кинезинов с плюс-концевой активностью. Так, например, для будущих исследований представляется

интересным применение модели, предложенной в диссертационной работе, к моторам из семейства кинезинов-8, которые способны однонаправленно процессивно двигаться на концах удлиняющихся микротрубочек [Stumpff et al. 2011; Mayr et al. 2011].

ВЫВОДЫ

1. Разбирающаяся микротрубочка может развивать силу до 30 пН при помощи кольцевого белкового комплекса Daml. Эффективность передачи силы от разбирающейся микротрубочки к микрогрузу зависит от геометрии их закрепления.

2. При транспорте вдоль микротрубочки белок CENP-E может развивать ненулевую скорость под действием внешних тормозящих сил до 6 пН, и открепляется от микротрубочки под воздействием средней силы 2.0 ± 0.3 пН. Немоторные домены белка CENP-E практически не влияют на формы зависимостей скорости и времени пробега белка CENP-E от приложенной внешней силы.

3. Одиночные молекулы CENP-E способны ассоциироваться с полимеризующимися и деполимеризующимися микротрубочками с характерными временами 17.9 i 1.3 с и 11.6 ± 1.6 с, соответственно. Молекулы CENP-E способны сопрягать разборку микротрубочек с движением искусственных микрогрузов, имитирующих хромосомы.

4. С-концевой домен CENP-E размером 199 аминокислотных остатка связывается со стенкой микротрубочки с характерным временем жизни 0.47 ± 0.03 с и диффундирует вдоль микротрубочки с константой диффузии 1.6 мкм2/с.

5. Предложен и подтвержден компьютерными расчетами и экспериментами принципиально новый механизм следования за динамическими концами микротрубочек, основанный на совместной активности моторного и хвостового доменов CENP-E.

Список публикаций, опубликованных по теме диссертации:

1. Gudimchuk, N. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips / Gudimchuk, N; Vitre, В; Kim, Y; Kiyatkin, A; Cleveland,

DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Nature Cell Biology. -2013. -V. 15. -Issue 9. -P. 1079-1088.

2. Gudimchuk, N. Long tethers provide high-force coupling of the Daml ring to shortening microtubules / Volkov, VA; Zaytsev, AV; Gudimchuk, N; Grissom, PM; Gintsburg, AL; Ataullakhanov, FI; Mcintosh, JR; Grishchuk, EL // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2013. -V. 110. -Issue 19. -P. 7708-7713.

3. Gudimchuk, N. The Daml ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion / Grishchuk, EL; Efremov, A; Volkov, VA; Spiridonov, IS; Gudimchuk, N; Westermann, S; Drubin, D; Barnes, G; Mcintosh, JR; Ataullakhanov FI // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2008. -V. 105. -Issue 40. -P. 15423-15428.

4. Gudimchuk, N. Kinesin-like protein CENP-E adopts a folded conformation while exhibiting high motor activity / Gudimchuk, N; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2010. -V.21. -Abstract 1939.

5. Gudimchuk, N. Coiled-Coil Stalk of Active Kinesin-Like Protein CENP-E is Stably Folded / Gudimchuk, N; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2011. - V. 100. -Issue 3. -Abstract 123.

6. Gudimchuk, N. Mitotic Kinesin CENP-E is a Robust Tracker of Dynamic Microtubule ends / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2012. - V. 102. - Abstract 703.

7. Gudimchuk, N. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive tracker of dynamic microtubule tips / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2012. -V.23 (suppl). -Abstract 210.

8. Gudimchuk, N. A tethered Daml ring suffices for a minimal force-bearing unit of a kinetochore / Volkov, VA; Zaytsev, AV; Gudimchuk, N; Grissom, PM; Ataullakhanov, FI; Mcintosh, JR; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2012. -V.23 (suppl). -Abstract 1954.

9. Gudimchuk, N. Kinetochore Kinesin CENP-E Tracks the Tips of Dynamic Microtubules via the "Tethered Motor" Mechanism / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2012. - V. 104.-Abstract 326.

Подписано в печать 24.11.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 380 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Гудимчук, Никита Борисович, Москва

ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

УНИВЕРСИТЕТ ПЕНСИЛЬВАНИИ (ФИЛАДЕЛЬФИЯ, США)

УНИВЕРСИТЕТ КОЛОРАДО (БОУЛДЕР, США)

На правах рукописи

04201450523 Гудимчук Никита Борисович

Взаимодействие кинезина СЕОТ-Е и белкового комплекса Бат1 с динамическими концами микротрубочек

Специальность 03.01.02. - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.б.н. профессор, Ф.И.Атауллаханов

Консультанты: профессор Е.Л. Грищук профессор Дж.Р. МакИнтош

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................10

1.1. Общие сведения о клеточном делении...............................................................................................10

1.1.1. Фазы митоза и общий план строения митотического аппарата....................................................10

1.1.2. Микротрубочки..................................................................................................................................11

1.1.3. Кинетохоры........................................................................................................................................12

1.1.4. Проблема сопряжения кинетохора с динамическими микротрубочками....................................14

1.1.5. Моторные белки.................................................................................................................................16

1.1.6. Микротрубочки как генераторы сил................................................................................................18

1.1.7. Развитие сил и перемещение хромосом во время митоза..............................................................18

1.2. Кинетохорный мотор CENP-E.............................................................................................................21

1.2.1. Локализация и клеточные функции.................................................................................................21

1.2.2. Исследования CENP-E in vitro..........................................................................................................23

1.2.3. Открытые вопросы............................................................................................................................24

1.3. Методики исследования индивидуальных молекул in vitro...........................................................25

1.3.1. Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF).................................................................25

1.3.2. Лазерные ловушки.............................................................................................................................26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................29

2.1. Очистка белков.......................................................................................................................................29

2.1.1. Тубулин...............................................................................................................................................29

2.1.2. Daml и фибриллярные подвески.....................................................................................................29

2.1.3. Полноразмерный белок CENP-E и его фрагменты.........................................................................29

2.2. Измерение сил, развиваемых микротрубочкой................................................................................29

2.2.1. Измерение сил при латеральном закреплении без Daml комплекса............................................30

2.2.2. Измерение сил при латеральном закреплении с помощью Daml кольца....................................30

2.2.3. Измерение сил при торцевом закреплении с помощью Daml кольца..........................................30

2.3. TIRF микроскопия CENP-E на стабильных микротрубочках......................................................30

2.3.1. Приготовление стабилизированных микротрубочек.....................................................................30

2.3.2. Приготовление простых проточных камер.....................................................................................31

2.3.3. Иммобилизация стабилизированных микротрубочек на покровном стекле...............................31

2.3.4. Одноцветная TERF микроскопия на стабильных микротрубочках...............................................31

2.3.5. Анализ движения белков CENP-E вдоль стабильных микротрубочек.........................................32

2.4. TIRF микроскопия CENP-E на динамических микротрубочках..................................................32

2.4.1. Приготовление затравок для роста динамических микротрубочек..............................................32

2.4.2. Приготовление герметичных проточных камер.............................................................................33

2.4.3. Иммобилизация затравок микротрубочек на покровном стекле..................................................33

2.4.4. Двуцветная TIRF микроскопия на динамических микротрубочках.............................................33

2.4.5. Ингибирование моторной активности CENP-E..............................................................................34

2.4.6. Эксперименты с фрагментами CENP-E на квантовых точках......................................................34

2.4.7. Анализ движения белков CENP-E на динамических микротрубочках........................................35

2.5. Измерение аффинности белков CENP-E к полимерам тубулина..................................................35

2.5.1. Приготовление имитаторов концов микротрубочек......................................................................35

2.5.2. Измерение связывания CENP-E с имитаторами концов микротрубочек.....................................35

2.6. Измерение характеристик CENP-E с помощью лазерной ловушки.............................................36

2.6.1 Лазерно-микроскопная установка.....................................................................................................36

2.6.2. Приготовление микросфер, покрытых белками CENP-E..............................................................38

2.6.3. Наблюдение транспорта микросфер белками CENP-E..................................................................38

2.6.4. Проведение эксперимента в режиме постоянной силы (Force Clamp).........................................39

2.6.5. Вольт-нанометровая калибровка квадрантного фотодетектора....................................................39

2.6.6. Калибровка жесткости оптической ловушки..................................................................................41

2.7. Эксперимент с сегментными микротрубочками..............................................................................41

2.7.1. Иммобилизация аксонем микротрубочек на покровном стекле...................................................41

2.7.2. Приготовление сегментных микротрубочек...................................................................................42

2.7.3. Проведение эксперимента с сегментными микротрубочками......................................................42

2.7.4. Анализ положения микросфер на микротрубочках.......................................................................43

2.8. Компьютерное моделирование............................................................................................................43

2.8.1. Алгоритм расчетов движения CENP-E по микротрубочке............................................................43

2.8.2. Определение параметров модели и калибровка.............................................................................44

2.8.3. Проведение расчетов.........................................................................................................................45

2.8.4. Визуализация расчетов......................................................................................................................46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................48

1.1. Механика сопряжения грузов с разборкой микротрубочек белковым комплексом Daml 48

3.1.1. Сопрягающие свойства Daml кольца при латеральном закреплении..........................................48

3.1.2. Сопрягающие свойства Daml кольца при торцевом закреплении...............................................49

3.2. Взаимодействие между белком CENP-E и стенкой микротрубочки.............................................51

3.2.1. Характеристики свободно движущихся белков CENP-E...............................................................51

3.2.2. Характеристики белков CENP-E, транспортирующих микросферы............................................53

3.2.3. Влияние внешней силы на движение белков CENP-E...................................................................56

3.3. Следование за динамическими концами микротрубочек..............................................................60

3.4. Необходимые и достаточные условия следования за динамическими концами микротрубочек белком СЕ№-Е.................................................................................................................64

3.4.1. Аффинности БЬ СЕОТ-Е к динамическим концам микротрубочек.............................................64

3.4.2. Взаимодействие 1Ч-концевого фрагмента СЕЫР-Е с динамическими концами микротрубочекбб

3.4.3. Характеризация С-концевого сайта связывания для микротрубочек...........................................68

3.4.4. Взаимодействие С-концевого фрагмента СЕКР-Е с динамическими микротрубочками...........70

3.4.5. Воссоздание активности БЬ СБОТ-Е путем объединения К- и С-концевых фрагментов СЕМ*-Е.....................................................................................................................................................................72

3.5. Математическая модель CENP-E и динамической микротрубочки............................................73

3.5.1. Описание модели...............................................................................................................................73

3.5.3. Сопоставление экспериментальных наблюдений с предсказаниями модели..............................76

3.6. Сопряжение белком СЕ№-Е движения искусственных грузов с разборкой микротрубочки 79

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................................................83

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................................86

БЛАГОДАРНОСТИ..............................................................................................................................87

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ........................................................88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................90

ВВЕДЕНИЕ

Митотическое деление клеток (или митоз) - это важнейший процесс, который обеспечивает рост и регенерацию тканей многоклеточных организмов. При делении из каждой материнской клетки создаются две ее дочерние копии. Полная информация об устройстве клетки и о том, как построить новые клетки, записана в виде последовательности клеточной ДНК. Поэтому критически важно, чтобы каждая дочерняя клетка унаследовала точную копию ДНК матери. Для этого митозу предшествует удвоение материнской ДНК. Основная задача митоза - точно распределить удвоенную ДНК между образующимися дочерними клетками. Чтобы манипулировать чрезвычайно длинными цепями ДНК, клетка плотно упаковывает их в специальные червеобразные структуры, называемые хромосомами. Распределение хромосом по дочерним клеткам достигается в результате сложной последовательности перемещений, осуществляемых посредством митотического аппарата, который состоит главным образом из микротрубочек и кинетохоров. Микротрубочки представляют собой линейные полимеры белка тубулина, организованные в структуру, напоминающую веретено. Они динамически нестабильны: удлиняются и укорачиваются, развивая при этом толкающие и тянущие силы, соответственно. Кинетохоры - белковые суперкомплексы на хромосомах, которые помогают осуществлять закрепление хромосом за динамические концы микротрубочек и использовать силы, развиваемые микротрубочками, для перемещения хромосом. Механизмы сопряжения кинетохорами динамики микротрубочек и движений хромосом, однако, остаются плохо изученными.

В дрожжевых клетках сопряжение движения хромосомы с динамикой конца микротрубочки происходит посредством Оат1 комплекса, образующего кольцо вокруг микротрубочки. Теоретически предсказано, что Баш1 комплекс является эффективным устройством для передачи силы от микротрубочки к сопряженному с ней микрогрузу. Эти предсказания, однако, все еще ожидают экспериментальной проверки.

В животных клетках гомологи Оаш1 отсутствуют, а структурные данные указывают на то, что сопряжение между хромосомой и концом микротрубочки может осуществляться неизвестными длинными фибриллярными компонентами. Кандидатом на роль такого сопрягающего устройства является один из наиболее длинных фибриллярных белков кинетохора - кинезин СЕЫР-Е. Удаление его из клетки ведет к 50% уменьшению числа связанных с кинетохором хромосом. Кроме того, как и многие другие кинезины, СЕОТ-Е может транспортировать хромосомы вдоль микротрубочек, совершая механическую работу за счет энергии гидролиза АТФ. По причине чрезвычайно большого размера белка СЕ№-Е (более 300 кДа), осложняющего его очистку и исследование, на настоящий момент в литературе были предприняты лишь попытки характеризации небольшого 1Ч-концевого фрагмента СЕЫР-Е.

Экспериментальные данные о поведении индивидуальных молекул полноразмерного белка CENP-E полностью отсутствуют.

Актуальность изучения фундаментального вопроса сопряжения динамики микротрубочек с движением хромосом обусловлена последними достижениями молекулярной и структурной биологии. Эти исследования позволили впервые за более чем 100 лет изучения митоза, установить конкретные белковые кандидатуры на роль сопрягающих устройств между хромосомами и микротрубочками в клетках дрожжей и животных. Эти потенциальные сопрягающие устройства (белки комплекса Daml и полноразмерный белок CENP-E), были впервые экспрессированы рекомбинантно и очищены для работы in vitro, что позволяет осуществить прямое экспериментальное исследование их свойств. С другой стороны, за последние 10 лет в различных лабораториях, включая лабораторию профессора Ф.И.Атауллаханова, были разработаны уникальные биофизические методы исследования свойств моторных белков и взаимодействия кинетохорных белков с динамическими концами микротрубочек in vitro. Применение этих методов к изучению очищенного полноразмерного белка CENP-E и белкового комплекса Daml сегодня дает беспрецедентную возможность исследовать их взаимодействие с динамическими микротрубочками и таким образом лучше понять механизмы их работы в клетке.

Задачи исследования:

Научная новизна

В данной работе была впервые измерена сила, которую может развивать деполимеризующаяся микротрубочка с помощью дрожжевого белкового комплекса Оат1. Показано, что геометрия закрепления микрогруза за конец микротрубочки критически важна для эффективности передачи силы. Кроме того, в данной работе были впервые изучены характеристики движения полноразмерной молекулы СЕЫР-Е по микротрубочкам. Показано, что наличие немоторных доменов СЕЫР-Е не влияет на его движение по стенке микротрубочки в широком диапазоне приложенных внешних сил. Впервые продемонстрирована способность белка СЕ№-Е следовать за динамическими концами микротрубочек и сопрягать динамику микротрубочек с движением микрогрузов. Обнаружено, что для данной активности достаточно одного димера полноразмерной молекулы СЕЫР-Е. Впервые охарактеризовано на одномолекулярном уровне поведение хвостового домена белка СЕИР-Е на микротрубочке. Данный белковый фрагмент обладает необычно большим коэффициентом диффузии на стенке микротрубочки при относительно большом времени жизни: 0.5 с. Показано, что ни моторный домен, ни хвостовой домен не способны автономно следовать за динамическими концами микротрубочек, в то время как их комбинация необходима и достаточна для данной активности. На основе экспериментальных данных предложен механизм работы СЕИР-Е как плюс-концевого белка и разработана компьютерная модель, количественно подтверждающая эти представления. Данная модель является первой количественной попыткой объяснить способность моторных белков следовать за концами динамических микротрубочек, и может быть распространена и на моторные белки из других семейств, например, семейство кинезинов-8.

Научно-практическая значимость

Данное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия хромосом и митотического аппарата клетки. В частности, эксперименнтально обосновывается возможность развития большой силы микротрубочкой с помощью кольцевого Оаш1 комплекса и формулируются представления о роли и конкретном молекулярном механизме работы белка СЕОТ-Е как стабилизатора взаимодействия между микротрубочками и хромосомами на различных стадиях митоза.

Изучение принципов работы клеточного деления в целом и кинетохорного мотора СЕИР-Е в частности может также привести к созданию новых анти-раковых препаратов. Ингибиторы моторной активности СЕЫР-Е уже прошли клинические испытания, и возможно, в

скором времени будут применяться как антираковые агенты. Данное исследование проливает свет на механизм действия уже существующих ингибиторов в клетках и расширяет список возможных мишеней для новых ингибиторов, указывая на важность С-концевого домена CENP-Е.

Методология и методы исследования

Для исследования взаимодействия белкового комплекса Daml и кинетохорного кинезина CENP-E с микротрубочками применялись методы флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), биохимические протоколы и лазерные ловушки. Часть методик, использованных в работе, являются полностью оригинальными, и были разработаны автором в ходе выполнения диссертационной работы специально для исследования взаимодействия кинетохорных белков и разбирающихс�

Информация о работе

Гудимчук, Никита Борисович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы