Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом"

На правах рукописи

ЖУДЕНКОВ Кирилл Владимирович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КИНЕТОХОРОВ И МИКРОТРУБОЧЕК: НОВЫЙ МЕХАНИЗМ ДВИЖЕНИЯ ХРОМОСОМ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003463543

Москва 2009

003463543

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллахаков

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор И.А. Воробьев

доктор физико-математических наук, профессор В.В. Смолянинов

Ведущее учреждение - Институт математических проблем биологии РАН. Защита состоится «// 2009 г. в ¿Стасов

на заседании Диссертационного совета Д 001.042.02 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН. Автореферат разослан « 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из наиболее общих законов в биологическом мире является принцип обязательной репродукции биологических систем. В этом заключается условие существования этих систем на протяжении длительных периодов времени. Репродукция биологических систем может быть сведена к репродукции клеток.

Митоз - часть клеточного цикла, в ходе которой происходит деление биологической клетки и осуществляется корректное распределение генетической информации по дочерним клеткам. В ходе митоза в нуклеоплазме работает молекулярная машина, называемая митотическим веретеном. Задача митотического веретена - распределение сестринских хроматид по дочерним ядрам будущих клеток. Митотическое веретено включает в себя полюса деления, микротрубочки (МТ), молекулярные моторы, регуляторные белки и кинетохоры хромосом. МТ состоят из полимеризованного белка тубулина и имеют конформацию трубки длиной в несколько микрон и диаметром около 25 нм. Вертикальные нити тубулиновых димеров, формирующие боковую стенку МТ, называются протофнламентами (ПФ). МТ обладают динамической нестабильностью - постоянным чередованием стадий роста и деполимеризации.

Кинетохоры - массивные белковые комплексы, локализующиеся на хромосомах, включающие в себя десятки различных белков и способные взаимодействовать с МТ.

Изгиб протофиламентов в процессе укорачивания МТ может стать источником силы, производящей механическую работу (КшЫапс! е1 а!., 1988). В ряде экспериментов было продемонстрировано процессивное движение микроскопических шариков, связанных с деполимеризующимися МТ (ЬотЫНо е! а1., 1995). Даже статические связи между шариками и МТ (например, биотин-стрептавединовая связь) позволяют наблюдать силовой импульс при разборке МТ (ОпБЬсЬик е( а1., 2005). Если кинетохоры прикреплены к МТ с помощью некоторого механизма, то энергия, освобождаемая при деполимеризации МТ, может стать источником силы в движении хромосомы к полюсу (Е1гетоу й а1., 2007; НШ, 1985; Мо1оЛбоу е1 а!., 2005). Таким образом, деполимеризация МТ сама по себе является мотором, так что возникает вопрос о том, какова же должна быть структура кинетохора для того, чтобы позволить работать такой

машине.

Среди современных методов исследования микроскопических структур биологических объектов можно отметить электронную томографию (ЭТ), ЭТ -метод исследования, позволяющий получать трехмерные структуры макромолекулярных объектов (Downing et al., 2007).

Чтобы найти ответ на вопрос о строении механизма взаимодействия МТ и кинетохора, было проведено исследование методами ЭТ, позволившее изучить трехмерную структуру индивидуальных ПФ на плюс-концах МТ (концах МТ, на которых происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация тубулина и осуществляется закрепление МТ к кинетохору) в митотических клетках PtKl (Grishchuk et al., 2008). Методы получения и обработки данных позволили впервые получить детальную информацию о кривизнах ПФ в различных типах МТ. Около половины Г1Ф на плюс-концах КМТ (МТ, взаимодействующих с юшетохорами) имели кривизны, существенно отличающиеся от кривизн ПФ в полимеризующихся и деполимеризующихся МТ in vitro. Проведенные исследования показывают, что такие необычные формы ПФ возникают не только за счет динамики МТ, но и по причине наличия фибриллярных кинетохорных структур, взаимодействующих с концами КМТ.

Исследование функционирования митотического веретена - одна из важных задач современной науки. Данная работа посвящена детальному исследованию одного из ключевых взаимодействий в митотической системе -взаимодействию кинетохоров хромосом с МТ.

Цель работы. Исследование механизма взаимодействия кинетохоров и микротрубочек в клетках высших эукариот (PtKl).

Задачи исследования.

1. Разработать программный комплекс, позволяющий изучить детальную форму и кривизну протофиламентов из различных микротрубочек.

2. Провести анализ форм протофиламентов из экспериментальных данных и сравнить их с теоретическими данными, полученными в ходе моделирования взаимодействия микротрубочек с кинетохорами с помощью различных механизмов.

3. Сформулировать представления о механизме закрепления протофиламентов на кинетохорах в клетках высших эукариот.

Научная новнзна.

Для детального анализа форм и кривизн ПФ, полученных в экспериментах (Grishchuk et al., 2008), была написана специальная программа, которая позволила не только оценивать усредненные кривизны и формы больших групп ПФ, но и производить автоматическую сортировку ПФ по углам наклона. Расчеты показали, что наборы ПФ по степени наклона и локальной кривизне существенно отличаются друг от друга для различных типов МТ, которым принадлежат данные ПФ. Программа позволила провести группировку ПФ, принадлежащих КМТ, и выявить среди них доминирующую по форме группу. Детальный анализ экспериментальных изображений данных ПФ позволил отчетливо наблюдать фибриллярную структуру, что явилось четким подтверждением новой гипотезы о механизме взаимодействия кинетохоров и МТ.

Работа была проведена в тесном сотрудничестве экспериментальной и теоретической групп, что для современных исследований является необходимым качеством. Дело в том, что объект данного исследования (ПФ и МТ) имеет размеры единиц и десятков нанометров, и наблюдение его в динамике через световой микроскоп оказывается невозможным. Исследования методами ЭТ позволяют получать относительно четкие трехмерные изображения, но не позволяют наблюдать объект в динамике и далеко не всегда дают возможность получить четкое изображение с малым количеством шумов. В связи с этим важным оказывается постоянное использование средств ЭВМ по моделированию свойств этих микроскопических объектов, обработке экспериментальных изображений, проведения статистического анализа и оценке геометрических свойств данных объектов.

Данная работа включает в себя один из важных компонентов любого современного биофизического исследования - изучение биологических объектов физико-математическими методами.

Научно-практическое значение.

Исследование механизмов деления клеток имеет большое значение для исследования развитая раковых заболеваний. Большинство препаратов, которые применятся в современности для остановки неконтролируемого роста клеток, стабилизирует длину всех МТ в организме. Это позволяет остановить процесс митоза в клетках, но оказывает токсическое действие на здоровые клетки организма. Если бы препараты действовали более избирательно, например, только на специфические компоненты митотической системы, которые наиболее интенсивно работают в раковых клетках, то токсический эффект от таких препаратов будет малым. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и, в частности, механизма взаимодействия МТ и кинетохора, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создана специальная программа, позволяющая анализировать кривизны сотен протофиламентов из микротрубочек одновременно, автоматически оценивать их наклон, сортировать протофиламенты по типам и проводить статистический анализ.

2. Сравнение форм экспериментальных и теоретических протофиламентов в сочетании с детальным рассмотрением результатов экспериментов позволило предложить новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот. Основным рабочим элементом в новом механизме является не кольцо, а множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Апробация работы состоялась 11-ого декабря 2008 г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года); на 7-й Международной молодежной конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 12.11.2007-14.11.2007); 47-й и 48-й конференциях The American Society for Cell

Biology. Annual Meeting (Washington, DC December 4,2007 и San Francisco, CA December 17,2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 7-и конференций и 1 статья в издании, рекомендованном ВАК.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, библиографического указателя, включающего 62 источника, списка сокращений и приложения. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Ф.И. Атауллаханов) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф. Р.Дж. Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

По вопросам клеточной и молекулярной биологии работу консультировали:

к.б.н. Е.Л. Грищук профессор Р.Дж. Макинтош.

Современные представления.

Деление клетки. Митотичеекое веретено, согласно (Rieder and Salmon, 1998), состоит из 2 перекрывающихся и направленных друг навстречу другу пучков МТ, которые испускаются центросомами (Рис. 1).

г

Рис 1. Схема пространственной организации митотического веретена (Rieder and Saimón. 1998). Черные изгибающиеся стержни - МТ с отмеченными плюс-концами. МТ нуклеируются на полюсах деления и способны взаимодействовать с кинетохорами хромосом. Подписи А-Д соответствуют набору характерных стадий во взаимодействии МТ и кинетохоров хромосом. А — первичный захват МТ одного из сестринских кинетохоров, сопровождающийся стремительным полярным движением хромосомы. После осуществленного таким образом монополярного закрепления (закрепления к МТ от одного из полюсов), хромосома начинает осуществлять колебательные движения Б и В вместе с динамически нестабильными МТ, которые продолжаются вплоть до момента, когда МТ с другого полюса тоже войдут во взаимодействие хромосомой, тем самым, осуществляя успешную биоринетацию и выстраивание кинетохора в центральной области митотического веретена Г. После успешного осуществления биполярного закрепления всех хромосом начинается анафаза митоза Д, в ходе которой хроматиды разделяются и растаскиваются по направлению к полюсам.

Движение хромосом сопряжено с динамикой КМТ. Хромосома двигается к полюсу тогда, когда есть МТ, соединяющая ее кинетохор с этим полюсом. Во время движения МТ меняет свою длину, полимеризуясь во время движения хромосомы от полюса и деполимеризуясь во время движения хромосомы к полюсу. При этом полимеризация и деполимеризация происходят в месте прикрепления МТ к кинетохору (Geuens et al., 1989; Mitchison et al., 1986), a химические вещества, стимулирующие деполимеризацию МТ, вызывают и ускоряют направленные к полюсу движения хромосом.

Исторически сложились различные точки зрения на то, что является основной причиной движения хромосом. Согласно первой, движение хромосом происходит благодаря наличию молекулярных моторов на кинетохорах хромосом, которые используют энергию гидролиза АТФ, чтобы перемещаться к заданному концу МТ (Pfarr et al., 1990; Hyman and Mitchison, 1991). Согласно второй точке зрения, энергии высвобождаемой при деполимеризации МТ и запасенной во время полимеризации, благодаря расщеплению ГТФ, достаточно, чтобы приводить к движению хромосом (Koshland et al., 1988; Grisbchuk et al., 2005). В исследовании (Molodtsov et al., 2005) было показано, что МТ может развивать силу, благодаря освобождению энергии, заключенной в ПФ, в ходе деполимеризации МТ. В пользу второй гипотезы также говорит тот факт, что каждый известный молекулярный мотор может быть удален из кинетохора генетически без потери способности веретена деления к перемещению хромосом.

Структура микротрубочки. МТ - это полимеры, состоящие из молекул тубулина - димеров, состоящих из а - и (3 -мономеров (Рис. 2А). Плюс-конец заканчивается субъединицами /?, а зафиксированный на полюсе деления минус-конец - а -субъединицами тубулина (Hirose et al., 1995; Mitchison, 1993). Каждый мономер тубулина связан с молекулой ГТФ. Во время полимеризации МТ ГТФ, связанная с р -субъединицей, гидролизуется, фосфат уходит, а ГДФ остается связанной с мономером. Таким образом, большая часть МТ состоит из ГДФ-тубулина, или просто Д-тубулшт. Во время полимеризации ГТФ тубулин, связанный с а -субъединицей, не гидролизуется.

\ р - ту^улии

-4 ДИМйр

\тубулика''*<-

У* \

S tt

I

в £

m^f

а - тубупин протофиламент

Рис 2. Структура и динамика МТ (из Alberts et al., 2002). А. Димер тубулина -составляющая часть ПФ в МТ. Красным показаны связанные с тубулином ГТФ, Б. Электронные микрофотографии и условные изображения концов растущей и деиолимеризующекся МТ.

Внутри полимера димеры тубулина организованы в линейные ПФ. Несколько ПФ, взаимодействуя латерально, образуют цилиндрическую стенку МТ диаметром 25 нм. Когда тубулин полимеризуется в МТ in vitro, число ПФ может колебаться от 10 до 18-ти (Chretien et al., 1998; Meurer-Grob et al., 2001). In vivo и когда МТ нуклеированы на центросомах или аксонемах, число ПФ равно 13-ти.

ГДФ-тубулин в составе стенки МТ находится в напряженном состоянии и удерживается в ней связями с соседними тубулинами. Это напряжение высвобождается, когда в процессе деполимеризации конца МТ ПФ, принимают равновесную конформцаию, закручиваясь в колечки (Mandelkow et al., 1991). Такая форма ПФ соответствует энергетическому минимуму конфигурации ГДФ-тубулмна, в то время как ГТФ-тубулиновые ПФ являются сравнительно прямыми (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998). Таким образом, морфология конца МТ отражает динамическое состояние МТ.

Динамика микротрубочек и хромосом. Хромосомы прикрепляются к веретену через взаимодействие кинетохоров с плюс-концами МТ, растущими из полюсов деления. Для разделения сестринских хроматид в анафазе веретено генерирует силы, действующие со стороны МТ на хромосомы и направленные к полюсам деления.

Одним из первых теоретических исследований взаимодействия кинетохора и конца МТ было осуществлено в 1985 году в работе (Hill, 1985). В модели

предполагается, что МТ вставлена и удерживается внутри некого рукава, расположенного во внешних слоях кинетохора (Рис. 3). При этом полимеризация и деполимеризация МТ осуществляется в более глубоких и менее плотных слоях кинетохора.

......

«..........:...'...... ШШ ................1

*?

Я

: !

I,., а ............МШш

Рис 3. Взаимодействие МТ с хромосомой согласно гипотезе Хилла (КозЫагк) е! а!., 1988). Показана работа механизма кинетохор-МТ взаимодействия в 3 стадиях, А -МТ помещена в рукав, способный взаимодействовать с боковой стенкой МТ и имеющий на своей внутренней поверхности сайты связывания с МТ. Б -деполимеризация МТ приводит к частичному выходу конца МТ из рукава. В -тепловые колебания кинетохора в сочетании со способностью рукава закрепляться на МТ приводят к смешению кинетохора в сторону конца МТ.

В альтернативной модели конформационных волн, предложенной Кошландом (КовШапс! е1 а!., 1988), была выдвинута гипотеза о том, что движение кинетохора по направлению к минус-концу М'Г может быть вызвано изменением конформации изгибающихся ПФ плюс-конца МТ при ее деполимеризации - изгибающиеся ПФ могут оказывать давление на структуру кинетохора и вызывать ее направленное движение (Рис. 4).

Рис 4. Взаимодействие МТ с хромосомой в соответствии с теорией конформационных волн (КозЫапс! е1 а1., 1988). А - МТ помещается в рукав, не имеющий сайтов взаимодействия с МТ. Б - деполимеризация МТ сопровождается растрескиванием ее на отдельные изогнутые ПФ, которые за счет энергии своего изгиба оказывают давление на рукав, и он смещается в сторону уменьшения длины МТ. В - дальнейшая деполимеризация МТ сопровождается отщеплением от конца МТ сегментов уже изогнутых ПФ и дальнейшим растрескиванием МТ на ПФ, что повторяет шаг механизма, описанный в Б.

Авторы исследования (Ко8Ыапс1 й а1., 1988) дали предпочтение второй из описанных гипотез в связи с тем, что механизм конформационных волн не предъявляет дополнительных требований к свойствам боковой стенки сайта связывания МТ на кинетохоре. Но структур кинетохора, подобных предложенным авторами рукавов, во всех последующих экспериментах не было обнаружено.

В 2006 году было опубликовано исследование соотношения динамики МТ и движения хромосом в Б-РотЬе (ШзЬсЬик е1 а!., 2006) с помощью оптической флуоресцентной микроскопии и электронной томографии. В данном исследовании много внимания было уделено не только вкладу динамической нестабильности МТ в движение хромосом, но и влиянию различных моторных белков на систему. В присутствии всех естественных для митоза 8.РотЬе моторов митотическая система организма демонстрировала существенную устойчивость и успешность в поиске, захвате и транспортировке разнообразно ориентированных кинетохоров. При делеции минус-направленных моторов

(например, динеина) система практически не теряла своих качеств в плане скорости перемещения хромосом, но поиск, захват и перемещение значительно удаленных от полюсов кинетохоров становился более длительным. Особенно это касалось биориентации хромосом, которая заключается в закреплении 2 сестринских хроматид хромосомы к 2 полюсам деления (каждая хроматида крепится к одному полюсу) с помощью растущих из этих полюсов МТ. Эти факты показывают, что ключевая причина движения хромосом кроется в динамике МТ, а не в активности молекулярных моторов.

Роль Dam 1-комплекса в митозе. В 2007 году было опубликовано исследование (Tanaka et а)., 2007), в котором был проведен подробный анализ взаимодействия кинетохоров хромосом с МТ в почкующихся дрожжах. Исследователи показали, что полярное движение кинеточора может осуществляться двумя способами - латеральным скольжением, при котором кинетохор движется вдоль боковой поверхности МТ с помощью взаимодействия деполимеризующейся МТ и белков Dam 1-комплекса. Dam! является декамерным белком (Рис. 5), жизненно необходимым для почкующихся дрожжей.

Рис 5. Схема способов размещения колец Daml вокруг МТ и характерные соотношения размеров в системе Daml-MT (Miranda et а!., 2005). Внешний диаметр кольца Daml (50 нм) в 2 раза превышает диаметр МТ. В ходе олигомеризации Daml может образовывать как кольцевые, так и спиральные структуры.

Dam 1 входит в состав кинетохоров и способен к взаимодействию с МТ in vitro. Исследования in vitro показали, что несколько белков Daml-комплекса способны собираться вместе и формировать вокруг МТ кольцевые структуры, способные передвигаться вдоль МТ. Авторы (Tanaka et al., 2007) обнаружили, что белки Daml-комплексэ локализуются в области плюс-концов МТ in vivo.

280 А

300 А

Наиболее простая интерпретация данного факта заключатся в допущении, что данные молекулы действительно формируют кольцевые структуры в живых клетках, и эти кольцевые структуры способны эффективно передвигаться вдоль МТ по мере того, как в ней происходит деполимеризация. Однако в живых клетках кольцевые структуры Daml не наблюдались. При этом нарушение взаимодействия Daml с МТ ведет к нарушению полярного движения кинетохоров. Предположительно, в метафазе Daml-комплекс необходим для организации натяжения между биориентированными сестринскими хроматидами, стабилизируя закрепление кинетохоров на МТ и понижая чувствительность данного закрепления к разного рода механическим стрессам.

Потеря функциональности комплекса Daml приводит к нарушению стабильности биполярного закрепления кинетохоров и разрушению митотического веретена в почкующихся дрожжах (Miranda et al., 2005). Авторы работы предполагают, что Daml может работать на плюс-концах МТ. Данная гипотеза поддерживает гипотезу Кошланда о существовании некого рукава (Koshland et al., 1988), в который входит МТ, взаимодействующая с кинегохором. Исследование (Miranda et al., 2005) показало, что Daml-комштекс является вероятным претендентом на роль основного связующего звена кинетохора и МТ в почкующихся дрожжах. Но имеется и ряд замечаний, не позволяющих выдвинуть Daml-комплекс на роль универсального связующего звена в составе кинетохоров всех организмов. Дело в том, что белки, подобные Daml, существуют далеко не во всех организмах. Результаты исследования (Miranda et al., 2005) были достигнуты на организме in vitro. Но in vivo столь упорядоченных кольцевых структур на кинетохорах не найдено пока даже у почкующихся дрожжей, из которых Daml и был выделен.

Роль фибриллярных кинетохорных белков в митотической системе. Существуют и другие кинетохорные белки, являющиеся жизненно-необходимыми и отвечающие за кинетохор-МТ взаимодействие. Среди них следует отметить Ndc80/Hecl (Wigge and Kilmartin, 2001). При этом ко.мачекс Ndc80 является универсальным и неотъемлемым белком в механизме кинетохор-МТ взаимодействия у многих организмов (DeLuca et al., 2006; McAinsh et al., 2006). Несмотря на то, что такие фибриллярные белки исключительно важны для закрепления МТ на кинетохорах, механизмы такого взаимодействия пока не известны.

Экспериментальные исследования клеточных культур высших позвоночных. Экспериментальные данные (Grishchuk et al., 2008), полученные при исследовании клеточной культуры PtKl методами ЭГ, стали основой для детального анализа форм и кривизн ПФ из МТ in vivo с целыо исследования механизма взаимодействия кинетохоров и МТ.

К настоящему времени опубликовано довольно большое количество работ, посвященных исследованию взаимодействия кинетохоров и МТ, а также некоторым аспектам пространственного строения кинетохоров и МТ, но ясности в вопросе об устройстве механизмов развития сил на кинетохорах хромосом пока не нет.

Дальнейший прогресс в данной области не возможен без тщательного моделирования МТ и сопрягающих структур с целью получения количественных оценок развиваемых сил и эффективности механизма. Также необходимым оказывается использование современных средств обработки данных с помощью ПК, так как единичные результаты микроскопических исследовании часто оказываются довольно сильно зашумленными, и без специальной обработки и статистического анализа невозможно оценить устройство механизма взаимодействия кинетохоров хромосом и МТ. Задачей данного исследования было: исходя из полученных экспериментальных данных по клеткам PtK.1 и данных математического моделирования МТ, провести комплексный анализ форм ПФ с целью выявления структуры механизма закрепления МТ на кинетохорах хромосом.

Методы обработки данных

Описание программы расчета локачьиых кривизн. Для детального анализа формы экспериментальных и теоретических ПФ бы разработан программный продукт «Curvature Calculation Program» или ССР. Программа ССР написана в среде Borland Delphi 7, предназначена дая использования в операционных системах MS Windows 98 или более современных и не требует для своей работы каких-либо дополнительных программных пакетов, кроме операционной системы. Системные требования для работы с программой - IBM-совместимый ПК, оснащенный процессором Intel Pentium4 3000 MHz, AMD Athlon64 3000+ или более современными их аналогами. Для работы программа ССР использует файлы, содержащие в себе координаты ПФ, полученные при обработке данных

ЭТ с помощью пакета ¡МОО (Кгетег й а1., 1996) или же координаты ПФ, полученные в ходе теоретических расчетов.

Описание алгоритма расчета локальных кривизн. Вычисление локальных кривизн в ССР производится по методу наименьших квадратов (МНК), в ходе реализации которого находится оптимальная дуга окружности, проходящая через набор точек в составе сегмента ПФ (Рис. 6). Обратная величина радиуса полученной окружности является кривизной данного сегмента. Все полученные значения кривизн (изначальная единица измерения - нм"1), обозначенные в данной работе, были пересчитаны в угловое отклонение двух последовательных димеров тубулина при изгибе ПФ (то есть, единица измерения кривизны -градус на димер).

Все точки, образующие рассматриваемый ПФ, разбиваются на интервалы, каждый из которых содержит некоторое количество последовательных точек в составе ПФ. Эти интервалы располагаются друг относительно друга с наложением. Например, все ПФ из экспериментальных и теоретических исследований разбивались на интервалы по 10 точек со смещением друг относительно друга на 1 точку. То есть при таком разбиении в последовательные интервалы попадают точки с номерами 1-10, 2-11, 3-12, 4-14 и так далее. Внутри каждого интервала программа производит поиск наиболее подходящей дуги окружности (Рис. 6), проходящей через эти точки по алгоритму метода главных осей (Gegenfurtner, 1992).

/У

р /

'"ом..

Рис 6. Результат поиска оптимальной окружности, характеризующей кривизну сегмента ПФ. Масштаб осей - нанометры.

В ходе реализации алгоритма минимизации проводился поиск наиболее оптимальных положений четырех полуокружностей (двух горизонтальных и двух вертикальных) относительно набора точек ПФ в интервале:

(1) (2)

(3)

(4)

j=^

и4 = £ [л'; + [А-„+.(¡¡,4^

После минимизации четырех функционалов и. окружность выбиралась с параметрами, соответствующими минимальной величине и,. Такой подход оказачся наиболее продуктивен, так как позволял найти оптимальную окружность для любого расположения точек рассматриваемого интервата ПФ на плоскости Х\'.

Автоматический расчет наклона протофиламентов вблизи стенки микротрубочки. Программа ССР, помимо расчета усредненных кривизн и форм ПФ, также производит анализ наклона ПФ вблизи стеики МТ (на расстоянии 612 нм от стенки). Размеры интервала вдоль оси X, внутри которого производится анатиз наклона, можно варьировать. Внутри области, ограничиваемой данными параметрами, ССР методом МНК производит аппроксимацию точек ПФ полиномом первой степени и, исходя из величины коэффициента при члене в первой степени, осуществляет расчет наклона участков каждого из ПФ, выбранных пользователем:

I. -

К

Кое//М1^Кк = агсГап

X^¡х * ~ * Х *X2¡4

И

м

(5)

н Л у=1 М

В соответствии с получаемыми результатами, программа сортирует ПФ по степени их наклона.

Результаты

Детальный анализ формы протофиламептов как способ изучения динамического состояния микротрубочек. На Рис. 7 А изображено сравнение форм ПФ из МТ in vitro (данные Mandelkow et al., 1991) с неКМТ и KMT из клеток PtKl в метафазе. Большинство ПФ из МТ in vivo имеют формы, которые напоминают нечто среднее между формами ПФ из Д-МТ и П-МТ (деполимеризующихся и полимеризующихся МТ in vitro). Полученные средние локальные кривизны для ПФ из МТ in vivo расположены между кривизнами ПФ из П-МТ и Д-МТ, подтверждая различие в формах между ПФ из МТ in vivo и in

Рис 7. А - формы ПФ из концов разных типов МТ: П-МТ (зеленый) и Д-МТ (синий) типы МТ in vitro (Mandelkow et a!., 1991). ПФ из неКМТ (красный) принадлежат плюс-концам МТ, располагающимся близко к полюсом метафазных клеток PtKl. ПФ из КМТ показаны черным цветом. ПФ из Д-МТ показаны в разных масштабах для большего удобства при сравнении. Б - определение локальной кривизны ПФ. На графике показана зависимость локальной кривизны ПФ от расстояния до стенки МТ, цвета соответствуют А. В качестве ошибок показаны среднеквадратичные отклонения среднего. В - оценка ориентации ПФ. В квадрате показан метод измерения ориентации ПФ на любом расстоянии от стенки МТ. На графике показаны нормализованные распределения ориентации ПФ на расстоянии от 6 до 12 им от стенки МТ в четырех наборах данных (цвета соответствуют А). В качестве ошибок показаны

среднеквадратичные отклонения среднего для всех ПФ данного типа МТ. Г - ПФ были рассортированы на 4 группы, основываясь на их углах ориентации. N - число ПФ в каждом наборе данных.

Получив такое разнообразие в локальных формах ПФ, необходимо было найти величины, позволяющие найти статистически значимые различия между ПФ из разных групп МТ. В качестве ключевого параметра группировки ПФ по типам был выбран угол между перпендикуляром к оси МТ и направлением сегмента ПФ, расположенного на расстоянии 6-12 нм от оси МТ (Рис.. 7В), потому что данный сегмент был ближайшей к оси МТ областью ПФ, которая демонстрировала заметное отличие наклона ПФ из П-МТ и Д-МТ. Такой подход к описанию ПФ показал для ПФ из Д-МТ в диаграмме распределения ПФ по углам один пик на относительно малых углах (26°-34°), как и ожидалось для сильно искривленных ПФ (Рис. 7В). ПФ из П-МТ были преимущественно прямыми, так что вышеописанный угол для них составил около 90°, но распределение углов также в себе содержало и пик на уровне 72°, соответствующий слегка искривленным ПФ, а также небольшой пик на уровне 26°, соответствующий по форме ПФ ситуации, характерной для Д-МТ (Рис. 7В). Последний из упомянутых случаев демонстрирует наличие в группе П-МТ деполимеризующихся МТ, случайно попавших в выборку в самом начале замораживания.

Мы использовали полученные ориентации ПФ для их объективной сортировки в пределах 4 отдельных групп (Рис. 7Г). «Короткие прямые» ПФ имеют угол наклона, близкий к 90°, «Удлиненные прямые» имеют угол наклона в области от 72° до 90°, и они вместе составляют около 90% всех ПФ для Г1-МТ in vitro. Таким образом, разумно предположить, что ПФ с такой формой in vivo (21% ПФ из КМТ и 29% ПФ из не КМТ) находились к моменту заморозки в состоянии полимеризации. Третья группа, названная «Бараньи рожки» (для них угол составил менее 40°), демонстрирует состояние деполимеризации, поскольку около 70% ПФ из Д-МТ in vitro имели такую ориентацию. Только 29% ПФ из КМТ и 40% из неКМТ имели такой же угол. Все вышеупомянутые группы не включают в себя большой массив ПФ средней кривизны (угол от 40° до 72°). Данная группа содержит в себе 17% ПФ из Д-МТ и 0% ПФ из II-MT, но зато включает в себя 30% ПФ из неКМТ и 50% ПФ из КМТ (Рис. 7В,Г). Эти соотношения показывают, что внутриклеточная среда модифицирует структуру

многих МТ, так что их ПФ имеют отличную от ПФ in vitro форму, и, кроме того, имеются измеримые отличия между формами ПФ из неКМТ и КМТ.

Закретение фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек. Мы исследовали пространство вокруг ПФ из КМТ в поисках структур, ответственных за такие изменения кривизн. Невозможно было наблюдать ни хорошо обозначенной кинетохорной пластинки, ни каких-либо располагающихся вокруг МТ колец (Рис. 8А), но ветвящиеся ПФ часто оказывались ассоциированными с фибриллами диаметром 2-4 нм и 50-150 нм длиной, и эти фибриллы простирались от ПФ по направлению к хроматину (Рис. 8А). Фибриллы не демонстрировали жесткости или периодичности, так что их описание вызвало определенные трудности. В томографических срезах толщиной около 2 нм вещество над фибриллами и под фибриллами убиралось из видимой области, так что их можно было видеть с хорошим контрастом, но их извилистые формы потребовали использования нескольких последовательных томографических срезов для выявления направления и формы фибрилл. В удачных случаях, почти вся фибрилла в своем протяжении могла наблюдаться на одном срезе (Рис. 8А). Большинство фибрилл связывались с изогнутыми ПФ, но некоторые направлялись прямо к стенкам МТ. Такие фибриллы наблюдались на КМТ в течение всех стадий митоза, но они отсутствовали на неКМТ. Эти фибриллы были названы кинетохорными фибриллами (КФ).

• Ш J Ш

шг

■

в

«J

s ®j

Ч © Sfl rs -*'.<£ гзтна КФ (w.l) бараньи рожкк

яеШТ| Г%|{

1 в ш ЯШ Ш 5»Ш5 т * * i» 11 ян

ШШШ т - ¡ШшЖ ■ш

6m»«} 8 ъл*** h

расстояний от етеюж МТ (нк)

Рис 8. А - томографические срезы концов КМТ. Аналогичный набор изображений показан в нижнем ряду, где изображения КФ были наложены на изображения ПФ. Б - ПФ из КМТ. восстановленные из данных ЭТ для метафазы (!, II) и анафазы (III, IV). ПФ на схемах показаны темно-серым цветом, КФ - серым, а область локализации хроматина - светло-серым. В - Гистограмма длин КФ, основанная на данных по 40 случайно выбранным КМТ из всех обработанных КМТ. Г и Д - ПФ из всех КМТ, восстановленные из данных ЭТ для одного метафазного кинетохора. ПФ были сгруппированы с помощью про1раммы ССР, основываясь на углах ориентации ПФ вблизи стенки МТ Средние локальные кривизны были показаны на Д. Шкала -!0нм. Е - усреднения многих томографических срезов, содержащих ПФ из разных групп (числа показаны). Средняя по кривизне группа ПФ из неКМТ может быть легко сформирована, но никаких КФ не просматривается. Средние по кривизне группы ПФ из КМТ из одной метафазной и одной анафазной клетки позволяют наблюдать КФ длиной 90-100 нм, прикрепленные к участкам ПФ и тянущиеся по направлению к хроматину под небольшим наклоном. Группа ПФ с большими кривизнами («Бараньи рожки») из тех же метафазных и анафазных клеток не демонстрирует какой-либо повышенной электронной плотности в окрестности траекторий ПФ.

Для мучения влияния КФ на форму ПФ из КМТ были рассортированы в каждой клетке от метафазы до анафазы и ПФ из неКМТ в метафазе по их углам ориентации (Рис. 7В,Г). Например, 52 из 98 ПФ из КМТ из метафазных клеток оказалось в группе средних кривизн (Рис. 8Б); их начальные сегменты были прямыми и составляли небольшие углы с осью МТ, но на определенном расстоянии вариации в их кривизнах существенно росли (Рис. 8В). Чтобы выяснить вопрос о том, взаимодействуют ли эти ПФ с какими-либо специфическими структурами кинетохора, изображения этих ПФ были наложены друг на друга и усреднены так, чтобы выявить какие-либо постоянные структуры, кроме изогнутых ПФ (Рис. 8Г). Прямые и изогнутые участки усредненных ПФ (изгибаются направо) были видны с хорошим контрастом, но более удаленные от стенки МТ участи выглядели существенно более размытыми (Рис. 8Г). Усредненные изображения таких ПФ из метафазы и анафазы демонстрировали КФ, простирающиеся от конца хорошо согласующихся по форме ПФ по направлению к хроматину. Но никаких КФ не было обнаружено при подобном анализе ПФ из неКМТ или же ПФ группы «Бараньих рожек» из КМТ, что показало, что КФ специфичны только для ПФ группы средних кривизн из КМТ. Данные результаты подсказывают, что формы этих средних по кривизнам ПФ вызваны взаимодействием стремления ПФ изогнуться под влиянием ГДФ-тубулина и препятствующего этому натяжения КФ. Такое взаимодействие однообразно выпрямило бы сегменты ПФ, расположенные близко к стенке МТ, но не оказало бы существенного влияния на стохастическое разнообразие локальных кривизн ПФ на удалении от стенки МТ.

Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных

микротрубочек. Наш новый метод анализа формы ПФ на концах МТ показал отличия между МТ in vivo и in vitro в рамках детального рассмотрения форм и кривизн ПФ. КФ, связанные с ПФ, могут быть ответственны за необычную форму ПФ в КМТ. Имеются весомые доказательства гипотезы о том, что деполимеризация тубулина может привести к полярному движению хромосом (Inoue and Salmon, 1995), но предыдущие модели такого механизма были основаны на схеме рукава (Hill, 1985) или кольца (Koshland et al., 1988; Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2006), или моторного механизма, или механизма АТФ-независимых связей со стенкой МТ (bombillo et al., 1995). Полученные

нами изображения КФ между кинетохорами и изогнутыми ПФ из КМТ демонстрируют концептуально новый способ связывания МТ с хромосомой и обеспечения полярного движения хромосом.

Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек. Биомеханические особенности фибриллярных механизмов взаимодействия отличают их от кольцевых структур (например, Daml-комплекса). Кольцевые механизмы требуют сильного связывания со стенкой МТ для поддержания стабильности, что понижает скорость движения и энергетическую выгодность такого механизма (Efremov et at., 2007). В случае же КФ (Рис. 9Б) сила связывания повышает эффективность работы механизма. Максимальная сила, развиваемая МТ в случае фибриллярного закрепления, довольно велика, и данный способ закрепления может передать почти 100% энергии, освобождающейся в ходе деполимеризации МТ, в движение

Рис 9. А - зависимости силы от скорости для укорачивающихся ПФ, находящихся во взаимодействии с двумя типами механизмов. Для кольцевого механизма данные взяты из (Ейетоу е1 а1., 2007). Б - сравнение индивидуальных МТ из группы средних по кривизне ПФ из одного метафазного кинетохора с набором теоретических ПФ, находящихся под средней нагрузкой в 3,1 пН на один ПФ. Модель описывает согласование форм ПФ вблизи стенки МТ хорошо, но широкое распределение кривизн экспериментальных ПФ на удалении от стенки МТ показывает присутствие неких

дополнительных влияющих на форму ПФ факторов. В - усредненные формы ПФ из П-МТ (45 ПФ) или Д-МТ (65 ПФ) в сравнении с усредненной формой средних по кривизне ПФ (505 ПФ). Кривые в градациях серого цвета показывают теоретические формы ПФ, находящиеся под разной нагрузкой случайно распределенных КФ. Показаны также и стандартные ошибки среднего. Показана МТ, окруженная кольцом, подобным Daml, под нагрузкой 30 пН, что соответствует максимальной силе, которую кольцо может передать МТ, так как большие силы, приложенные со стороны кольца, вызывают его отрыв от МТ (Efremov et al, 2007).

Мы использовали форму ПФ в качестве критерия оценки типа механизма взаимодействия МТ и кинетохора. Свойства кинетохорного комплекса Daml в почкующихся дрожжах были исследованы в ряде теоретических работ (Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005), так что удалось проанализировать, является ли кольцевой механизм ответственным за наблюдаемые вариации формы ПФ. Исследования показали, что не является (Рис. 9Б), поскольку кольцо, достаточно сильно связанное с МТ для обеспечения процессивного движения вдоль МТ, взаимодействует с МТ в области, расшюженной ближе к стенке МТ, чем область заметного искривления ПФ (Efremov et al., 2007). Таким образом, можно поддержать предположение о том, что фибриллярные механизмы являются принципиальными для связывания МТ с кинетохором и обеспечивают полярное движение хромосом в клетках PtKl. Возможно, кольцевой механизм имеет ценность, когда на одни кинетохор приходится лишь одна МТ, как б почкующихся дрожжах, но КФ позволяют создать гибкий и эффективный механизм, когда правильная сегрегация хромосом происходит с участием многих МТ.

выводы

1. Разработана специатьная методика и программа для визуализации и детального анашза формы и кривизны протофиламентов по данным электронной томографии и данным математического моделирования взаимодействия микротрубочки и кинетохора.

2. С помощью программы детального анализа форм протофиламентов показано, что в клетках PtKl более половины всех протофиламентов из кинетохорных микротрубочек имеет форму, отличную от формы протофиламентов в полимеризующихся и деполимеризующихся микротрубочках in vitro.

3. Сортировка и отбор протофиламентов, имеющих необычную форму, позволили провести усреднение соответствующих электронно-микроскопических изображений. В результате были обнаружены новые элементы в структу ре кннетохора - фибриллы, соединяющие кинетохор с концами протофиламентов кинетохорных микротрубочек.

4. Исследование формы протофиламентов, полученных в математических моделях взаимодействия микротрубочек с кинегохорами, показа.до, что механизм, основанный на существовании колец в структуре кинетохора, не описывает формы протофиламентов, наблюдаемые в эксперименте. Предложен и проанализирован новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот, в котором основным рабочим элементом является множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Жуденков К., Атауллаханов Ф. Математическое моделирование динамики митотического веретена // Труды конференции. Конференция РАСО '2006, Москва, 2006.

2. Жуденков К., Атауллаханов Ф. Математическое моделирование митотического веретена // Тезисы. VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 23.11.2006-24.11.2006.

3. Zhudenkov К., Ataullakhanov F. The spacial aspects of fission yeast mitosis // Тезисы. Biological Motility: Basic Research and Practice conference, Pushchino Moscow region, 2006.

4. Жуденков К., Ефремов А., Грищук E., МакИнтош P., Атауллаханов Ф. Исследование структуры кинетохорных элементов, взаимодействующих с микротрубочкой // Тезисы. 11-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года.

5. Жуденков К.,, Ефремов А., Грищук Е., МакИнтош Р., Атауллаханов Ф. Исследование взаимодействия кинетохоров хромосом и микротрубочек // Тезисы. VII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 12.11.2007-14.11.2007.

6. J. Mcintosh, М. Morphew, D. Mastronarde, A. Efremov, К. Zhudenkov, Е. Grishchuk, F. Ataullakhanov. Kinetochore-Microtubule Interactions Visualized by EM Tomography. // The American Society for Cell Biology. 47th Annual Meeting Annual Meeting Washington, DC December 4,2007

7. Mcintosh J., Grishchuk E., Morphcw M.,Efremov A., Zhudenkov K., Volkov V., Cheeseman I., Desai A., Mastronarde D., Ataullakhanov F. (2008). Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochorcs: A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. // Cell, Volume 135 , Issue 2, Pages 322-333.

8. J. Mcintosh, E. L. Grishchuk, E. O'Toole, A. K. Efremov, К. V. Zhudenkov, D. Mastronarde, F. I. Ataullakhanov. Structures of Kinetochore Microtubule Plus Ends from Yeasts to Mammals, Visualized by Electron Tomography. // The American Society for Cell Biology. 48th Annual Meeting San Francisco, CA December 17, 2008.

Список сокращений:

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота;

ГДФ - гуанозиндифосфорная кислота;

ГТФ - гуапозинтрифосфорная кислота;

ДПК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

Д-МТ - деполимеризующаяся in vitro микротрубочка;

КМТ - микротрубочка, взаимодействующая с кинетохором in vivo;

КФ - кинетохорная фибрилла;

МНК - метод наименьших квадратов;

МТ - микротрубочка;

неКМТ - микротрубочка, не взаимодействующая с кинетохором in vivo;

ПФ - протофиламент;

П-МТ - полимеризующаяся in vitro микротрубочка;

ЭТ - электронная томография;

Daml - кинетохорньш декамерный белковый комплекс, участвующий во

взаимодействии МТ с кинетохором;

ССР - программа расчета локальных кривизн ПФ;

Heel - компонент комплекса Ncd80, обнаруженный у человека;

1MOD - программный комплекс, разработанный для анализа и обработки

изображений, получаемых методом ЭТ;

Ndc80 - тетрамерный фибриллярный белок, взаимодействующий с МТ;

PtKl - культура клеток почки кенгуровой крысы Potorous tridactylis.

Подписано в печать 3 февраля 2009 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 85

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жуденков, Кирилл Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Деление клетки.

1.2 Структура микротрубочки и экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочкой.

1.3 Динамика микротрубочек и хромосом.

1.4 Кинетохор: структура и взаимодействие с микротрубочкой.

1.4.1 Структура и функционирование кинетохора.

1.4.2 Сила, развиваемая микротрубочкой при взаимодействии с кинетохором

1.4.3 Роль молекулярных моторов во взаимодействии между микротрубочкой и кинетохором.

1.4.4 Dam 1-комплекс и его роль в митозе.

1.5 Экспериментальные исследования клеточной культуры PtKi.

1.5.1 Приготовление срезов, микроскопия и трехмерная реконструкция.

1.5.2 Получение изображений концов микротрубочек.

1.5.3 Качественное описание структуры концов микротрубочек.

1.5.4 Подход к исследованию подвижности, вызванной деполимеризацией микротрубочек in vitro.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ.

2.1 Описание программы расчета локальных кривизн.

2.1.1 Особенности интерфейса программы расчета локальных кривизн и формат исходных данных.

2.1.2 Изменение масштабов отображения'протофиламентов и их кривизн в программе расчета локальных кривизн.

2.1.3 Алгоритмы вычисления кривизн отдельных протофиламентов.

2.1.4 Определение усредненных кривизн и форм протофиламентов.

2.1.5 Автоматический расчет наклона протофиламентов вблизи стенки микротрубочки и группировка выбранных пользователем протофиламентов.

2.2 Сохранение результатов расчетов, произведенных с помощью программы расчета локальных кривизн.

2.3 Математическое моделирование кинетохорных структур, взаимодействующих с микротрубочками.

2.3.1 Описание модели.

2.3.2 Энергетические соотношения.

2.3.3 Выбор параметров модели.

2.3.4 Результаты модели.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Детальное рассмотрение форм протофиламентов из кинетохорных микротрубочек.

3.1.1 Разнообразие форм протофиламентов на плюс-концах различных микротрубочек.

3.1.2 Отличие форм протофиламентов из микротрубочек in vivo и in vitro.

3.1.3 Детальный анализ формы протофиламентов как способ изучения динамического состояния микротрубочек.

3.2 Различия между формами протофиламентов in vivo и in vitro.

3.2.1 Роль адгезии протофиламентов.

3.2.2 Факторы, влияющие на форму протофиламентов из кинетохорных микротрубочек.

3.2.3 Изменение формы протофиламентов в различных фазах митоза.

3.3 Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Новый способ взаимодействия микротрубочек с хромосомой.

4.1.1 Связывание протофиламентов с кинетохорными фибриллами и аспекты физиологии митотического веретена.

4.1.2 Химия взаимодействия кинетохорных фибрилл и протофиламентов.

4.1.3 Сравнение с опубликованными сведениями о структуре взаимодействия кинетохоров с микротрубочками.

4.2 Связь форм протофиламентов средней кривизны с взаимодействием кинетохорными фибриллами.

4.3 Способность изогнутых протофиламентов поддерживать процессивное движение хромосомы.

4.4 Роль фибриллярного кинетохорного комплекса Ndc80.

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом"

Одним из наиболее общих законов в биологическом мире является принцип обязательной репродукции биологических систем. В этом заключается условие существования этих систем на протяжении длительных периодов времени.

Репродукция биологических систем может быть сведена к репродукции клеток. Субклеточные организмы, например вирусы, не могут поддерживать свое существование в течение неопределенно долгого времени без параллельной репродукции тех клеток, внутри которых они обитают.

Клетки многоклеточного организма чрезвычайно разнообразны по выполняемым функциям. В соответствии со специализацией клетки имеют разную продолжительность жизни. Например, нервные и мышечные клетки после завершения эмбрионального периода развития перестают делиться и функционируют на протяжении всей жизни организма. Клетки же других тканей — костного мозга, эпидермиса, эпителия тонкого кишечника — в процессе выполнения своей функции быстро погибают и замещаются новыми в результате непрерывного клеточного размножения.

Таким образом, жизненный цикл клеток обновляющихся тканей включает функционально активную деятельность и период деления. Деление клеток лежит в основе развития и роста организмов, их размножения, а также обеспечивает самообновление тканей на протяжении жизни организма и восстановление их целостности после повреждения. Процессы, сопровождающие и лежащие в основы клеточного деления, исследуются уже более ста лет.

Митоз - часть клеточного цикла, в ходе которой происходит деление биологической клетки и осуществляется корректное распределение генетической информации по дочерним клеткам. В ходе митоза в нуклеоплазме работает молекулярная машина, называемая митотическим веретеном. Задача митотического веретена — распределение сестринских хроматид по дочерним ядрам будущих клеток. Митотическое веретено включает в себя полюса деления, микротрубочки (МТ), молекулярные моторы, регуляторные белки и кинетохоры хромосом. МТ состоят из полимеризованного белка тубулина, имеющего конформацию трубки длиной в несколько микрон и диаметром около 25 нанометров. Кинетохоры — массивные белковые комплексы, локализующиеся на хромосомах, включающие в себя десятки различных белков и способные взаимодействовать с МТ.

В составе митоза были выделены пять фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Удвоение хромосом и центриолей (в клетках животных) происходит еще в ходе интерфазы (фазы роста в клеточном цикле). В результате этого в митоз хромосомы вступают уже удвоенными, напоминающими букву X (идентичные копии материнской хромосомы соединены друг с другом в области кинетохора). В профазе происходит конденсация хромосом и начинается формирование митотического веретена. В клетках животных начинается расхождение пары полюсов. Прометафаза начинается с разрушения ядерной оболочки. Хромосомы начинают двигаться, и их кинетохоры вступают в контакт с МТ митотического веретена, а полюса продолжают расхождение друг от друга. К концу прометафазы формирование митотического веретена завершается. В метафазе движение хромосом почти полностью останавливается, и кинетохоры хромосом располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от полюсов деления) в одной плоскости, образуя метафазную пластинку. Хромосомы остаются в таком положении в течение довольно длительного времени. В это время в клетке происходят существенные перестройки, которые обеспечивают последующее расхождение хромосом. В анафазе хромосомы делятся (соединение в районе кинетохора разрушается) и расходятся к полюсам деления. Параллельно полюса веретена также расходятся друг от друга. В телофазе происходит разрушение митотического веретена и образование ядерной оболочки вокруг двух групп хромосом, которые деконденсируются, после чего образуются дочерние ядра.

Исследование функционирования митотического веретена — одна из важных задач современной науки. Данная работа посвящена детальному исследованию одного из ключевых взаимодействий в митотической системе — взаимодействию кинетохоров хромосом с МТ.

Механизм взаимодействия между кинетохором и прикрепленными к нему МТ способен генерировать силы, вызывающие движение хромосом (Rieder and Salmon, 1998). Устройство данного механизма таково, что оно также позволяет осуществлять полимеризацию деполимеризацию МТ в процессе движения хромосом. Более того, кинетохоры способны детектировать неправильное прикрепление сестринских хромосом к МТ веретена и задерживать начало анафазы, так что строение всего этого механизма играет ключевую роль в организации нормального протекания митоза (Rieder and Salmon, 1998). Идентификация белков, входящих в данный комплекс, сейчас успешно осуществляется в исследованиях на почкующихся дрожжах (Westermann et al., 2007) и высших эукариотах (Cheeseman and Desai, 2008; Liu et al., 2006).

Деполимеризация МТ может генерировать силы за счет гидролиза ГТФ, происходящего в димерах тубулина в МТ. ГТФ, связанная с тубулином, быстро гидролизуется после закрепления димера в стенке МТ (полимеризации), так что подавляющее большинство молекул тубулина в составе стенки МТ несет в себе ГДФ. Однако тубулин с уже гидролизованной ГТФ не имеет возможности встраиваться в стенку полимеризующейся МТ, возможно, потому что его равновесная форма не вписывается в структуру МТ (Wang and Nogales, 2005). Таким образом, ГДФ-тубулин в составе стенки МТ оказывается в напряженном состоянии и удерживается в ней связями с соседними тубулинами. Это напряжение высвобождается, когда в процессе деполимеризации конца МТ нити тубулиновых димеров, называемые протофиламентами (ПФ), принимают равновесную конформацию, закручиваясь в колечки (Mandelkow et al., 1991). Предположительно, такая форма ПФ соответствует энергетическому минимуму конфигурации ГДФ-тубулина, в то время как ГТФ-тубулиновые ПФ являются сравнительно прямыми (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998). Таким образом, морфология конца МТ отражает динамическое состояние МТ.

Изгиб ПФ в процессе укорачивания МТ может стать источником силы, производящей механическую работу (Koshland et al., 1988). В самом деле, в ряде экспериментов было продемонстрировано процессивное движение микроскопических шариков, связанных с деполимеризующимися МТ (Lombillo el al., 1995). Даже статические связи между шариками и МТ (например, биотин-стрептавединовая связь) позволяют наблюдать силовой импульс при разборке МТ (Grishchuk et al., 2005). Если бы кинетохоры были прикреплены к МТ с помощью некоторого механизма, то энергия, освобождаемая при деполимеризации МТ, могла быть источником силы в движении хромосомы к полюсу (Efremov et al., 2007; Hill, 1985; Molodtsov et al., 2005). Таким образом, деполимеризация МТ сама по себе является мотором, так что возникает вопрос о том, какова же должна быть структура кинетохора для того, чтобы позволять работать такой машине.

Существуют гипотезы о том, как структура элементов кинетохор-МТ взаимодействия может играть ключевую роль в митозе. Такая структура может быть представлена в форме кольца (Davis and Wordeman, 2007). Белковый комплекс Daml/DASH, формирующий кольца вокруг МТ in vitro (Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2006), необходим для правильной сегрегации хромосом у почкующихся дрожжей (Cheeseman et al., 2002). Можно также рассмотреть и другие кинетохорные белки, такие как Birl/Sli 15 (Sandall et al., 2006), CENP-F (Feng et al., 2006) и Ndc80/Hecl (Wigge and Kilmartin, 2001). При этом комплекс Ndc80 является как универсальным, так и неотъемлемым белком в механизме кинетохор-МТ взаимодействия у многих организмов (DeLuca et al., 2006; McAinsh et al., 2006). Один конец этого фибриллярного, собранного из 4 полипептидов комплекса связывается с МТ, а другой конец - с внутренней областью кинетохора (Cheeseman et al., 2006; DeLuca et al., 2006; Wei et al., 2007). Несмотря на то, что такие фибриллярные белки исключительно важны для кинетохор-МТ взаимодействия, механизмы такого взаимодействия пока не известны.

Электронная микроскопия хромосом позвоночных показала, что МТ, взаимодействующие с кинетохорами (КМТ), проникают глубоко во внешнюю элетронно-плотную область кинетохора (Rieder and Salmon, 1998), что интерпретировалось как визуализация принципов присоединения МТ к хромосоме.

Среди современных методов исследования микроскопических структур биологических объектов можно отметить электронную томографию (ЭТ). ЭТ -метод исследования, позволяющий получать трехмерные структуры макромолекулярных объектов (Downing et al., 2007). Метод основан на прохождении пучка электронов через образец под различными углами относительно центра исследуемого объекта. Каждое такое прохождение пучка фиксируется с помощью электронного микроскопа и дает представление о расположении и электронной плотности объектов в пределах данной плоскости. Характерные пределы разрешения у современных систем составляют 1-10 нм, что позволяют отчетливо наблюдать макроглобулярные белковые структуры.

ЭТ хорошо сохранившихся кинетохоров в клетках PtKi показала, что внешняя электронно-плотная область кинетохора сформирована фибриллярными белками, связывающими МТ и хроматин (Dong et al., 2007). Во многих KMT можно явно различить ПФ, распускающиеся от оси МТ и касающиеся хроматина (VandenBeldt et al., 2006). Количество KMT с такими распущенными ПФ возрастает при переходе от метафазы к анафазе, что может быть дополнительным подтверждением доминирующей деполимеризации МТ в течение анафазы. Однако наблюдения показали, что около 70% всех метафазных КМТ находятся так же в состоянии с распущенными ПФ. В связи с этим обращает на себя внимание постоянство длины деполимеризующихся КМТ, что вызывает вопрос о факторах, влияющих на форму ПФ на концах КМТ.

Чтобы найти ответ на этот вопрос о строении механизма взаимодействия МТ и кинетохора, было проведено исследование методами ЭТ, позволившее изучить трехмерную структуру индивидуальных ПФ на плюс-концах МТ (концах МТ, на которых происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация тубулина и осуществляется закрепление МТ к кинетохору) в митотических клетках PtKi (Grishchuk et al., 2008). Данные методы получения и обработки данных позволили впервые получить детальную информацию о кривизнах ПФ в различных типах МТ. Около половины ПФ на плюс-концах КМТ имели кривизны, существенно отличающиеся от кривизн ПФ в полимеризующихся и деполимеризующихся МТ in vitro. Проведенные исследования показывают, что такие необычные формы ПФ возникают не за счет динамики МТ, а по причине наличия фибриллярных кинетохорных структур, взаимодействующих с концами КМТ.

Цель работы: Исследование механизма взаимодействия кинетохоров и микротрубочек в клетках высших эукариот (PtKi).

Задачи исследования:

1. Разработать программный комплекс, позволяющий изучить детальную форму и кривизну протофиламентов из различных микротрубочек.

2. Провести анализ форм протофиламентов из экспериментальных данных и сравнить их с теоретическими данными, полученными в ходе моделирования взаимодействия микротрубочек с кинетохорами с помощью различных механизмов.

3. Сформулировать представления о механизме закрепления протофиламентов на кинетохорах в клетках высших эукариот.

Научная новизна:

Для детального анализа форм и кривизн ПФ, полученных в экспериментах (Grishchuk et al., 2008), была написана специальная программа, которая позволила не только оценивать усредненные кривизны и формы больших групп ПФ, но и производить автоматическую сортировку ПФ по углам наклона, что дало очень интересный результат. Оказалось, что наборы ПФ по степени наклона и детальной кривизне существенно отличаются друг от друга для различных типов МТ, которым принадлежат данные ПФ. Программа позволили провести группировку ПФ, принадлежащих КМТ, и выявить среди них доминирующую по форме группу. Детальный анализ экспериментальных изображений данных ПФ позволил отчетливо наблюдать фибриллярную структуру, что явилось четким подтверждением новой гипотезы о механизме взаимодействия кинетохоров и МТ.

Работа была проведена в тесном сотрудничестве экспериментальной и теоретической групп, что для современных исследований является необходимым качеством. Дело в том, что объект данного исследования (ПФ и МТ) имеет размеры единиц и десятков нанометров, и наблюдение его в динамике через световой микроскоп оказывается невозможным. Исследования методами ЭТ позволяют получать относительно четкие и даже трехмерные изображения, но не позволяют наблюдать объект в динамике и далеко не всегда дают возможность получить четкое не зашумленное изображение. В связи с этим важным оказывается постоянное использование средств ЭВМ по моделированию свойств этих микроскопических объектов, обработке экспериментальных изображений, проведения статистического анализа и оценке геометрических свойств данных объектов.

Данная работа включает в себя один из важных компонентов любого современного биофизического исследования — изучение биологических объектов физико-математическими методами.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов деления клеток имеет большое значение для исследования развития раковых заболеваний. Дело в том, что большинство препаратов, которые применятся в современности для остановки неконтролируемого роста клеток, стабилизирует длину всех МТ в организме. Это позволяет остановить процесс митоза в клетках, но оказывает токсическое действие на здоровые клетки организма. Если бы препараты могли действовать более избирательно, например, только на специфические компоненты митотической системы, которые наиболее интенсивно работают в раковых клетках, то токсический эффект от таких препаратов должен быть малым. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и, в частности, механизма взаимодействия МТ и кинетохора, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана специальная программа, позволяющая анализировать кривизны сотен протофиламентов из микротрубочек одновременно, автоматически оценивать их наклон, сортировать протофиламенты по типам и проводить статистический анализ.

2. Сравнение форм экспериментальных и теоретических протофиламентов в сочетании с детальным рассмотрением результатов экспериментов позволило предложить новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот. Основным рабочим элементом в новом механизме является не кольцо, а множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Жуденков, Кирилл Владимирович

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

1. Разработана специальная методика и программа для визуализации и детального анализа формы и кривизны протофиламентов по данным электронной томографии и данным математического моделирования взаимодействия микротрубочки и кинетохора.

2. С помощью программы детального анализа форм протофиламентов показано, что в клетках PtKi более половины всех протофиламентов из кинетохорных микротрубочек имеет форму, отличную от формы протофиламентов в полимеризующихся и деполимеризующихся микротрубочках in vitro.

3. Сортировка и отбор протофиламентов, имеющих необычную форму, позволили провести усреднение соответствующих электронно-микроскопических изображений. В результате были обнаружены новые элементы в структуре кинетохора - фибриллы, соединяющие кинетохор с концами протофиламентов кинетохорных микротрубочек.

4. Исследование формы протофиламентов, полученных в математических моделях взаимодействия микротрубочек с кинетохорами, показало, что механизм, основанный на существовании колец в структуре кинетохора, не описывает формы протофиламентов, наблюдаемые в эксперименте. Предложен и проанализирован новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот, в котором основным рабочим элементом является множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жуденков, Кирилл Владимирович, Москва

1. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Ra M., Roberts К. and Walter P. (2002).

2. Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, 4th edition.

3. Asbury C., Gestaut D., Powers A., Franck A. and Davis T. (2006). The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 9873-9878.

4. Cheeseman I., Chappie J., Wilson-Kubalek E. and Desai A. (2006). The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore. Cell 127, 983-997.

5. Cheeseman I. and Desai A. (2008). Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 33-46.

6. Cheeseman I., Drubin D. and Barnes G. (2002). Simple centromere, complex kinetochore: linking spindle microtubules and centromeric DNA in budding yeast. J Cell Biol 157, 199-203.

7. Chretien D., Fuller S. and Karsenti E. (1995). Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. JCell Biol 129, 1311-1328.

8. Coue M., Lombillo, V. and Mcintosh, J. (1991). Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol 112, 11651175.

9. Davis T. and Wordeman L. (2007). Rings, bracelets, sleeves, and chevrons: new structures of kinetochore proteins. Trends Cell Biol 17, 377-382.

10. DeLuca J., Gall W., Ciferri C., Cimini D., Musacchio A. and Salmon, E. (2006). Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Heel. Cell 127, 969-982.

11. Dogterom M. and Yurke B. (1997). Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278:856-860.

12. Dong, Y., Beldt Vanden K., Meng X., Khodjakov A. and McEwen B. (2007). The outer plate in vertebrate kinetochores is a flexible network with multiple microtubule interactions. Nat Cell Biol 9, 516-522.

13. Downing К., Sui H. and Auer M. (2007). Electron Tomography: A 3D View of the Subcellular World. Anal. Chem., 79 (21), 7949-7957.

14. Efremov A., Grishchuk E., Mdntosh J. and Ataullakhanov F. (2007). In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromsome motions. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19017-22.

15. Feng J., Huang H., and Yen T. (2006). CENP-F is a novel microtubule-binding protein that is essential for kinetochore attachments and affects the duration of the mitotic checkpoint delay. Chromosoma 115, 320-329.

16. Franck A., Powers A., Gestaut D., Gonen Т., Davis T. and Asbury, C. L. (2007). Tension applied through the Daml complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat Cell Biol 9, 832837.

17. Ganem N. and Compton D. (2006). Functional roles of poleward microtubule flux during mitosis. Cell Cycle 5, 481-485.

18. Gegenfurtner K. (1992) PRAXIS: Brent's algorithm for function minimization Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, 24 (4), 560-564

19. Grishchuk E. and Mcintosh, J. (2006). Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. Embo J 25, 4888-4896.

20. Grishchuk E., Molodtsov M., Ataullakhanov F. and Mcintosh, J. (2005). Force production by disassembling microtubules. Nature 438, 384-388.

21. Hill T. (1985). Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. ProcNatlAcadSciUSA 82, 4404-4408.

22. Hirose К., Fan J. and Amos L. (1995). Re-examination of the polarity of microtubules and sheets decorated with kinesin motor domain. J Mol Biol. 251:329-333.

23. Hunt A. and Mcintosh J. (1998). The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol. Biol. Cell. 9:2857-2871.

24. Hyman A., and Mitchison T. (1991). Two different microtubule-based motor activities with opposite polarities in kinetochores. Nature. 351(6323):206-211

25. Inoue S. and Salmon E. (1995). Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol Biol Cell 6, 16191640.

26. Janson M. and Dogterom M. (2004). Scaling of microtubule force-velocity curves obtained at different tubulin concentrations. Phys Rev Lett. 92:248101.

27. Jensen C. and Bajer A. (1973). Spindle dynamics and arrangement of microtubules. Chromosoma 44, 73-89.

28. Koshland D., Mitchison T. and Kirschner M. (1988). Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature 331, 499-504.

29. Kremer J., Mastronarde D. and Mcintosh, J. (1996). Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol 116, 71-76.

30. Liu J. and Onuchic J. (2006). A driving and coupling "Pac-Man" mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 18432-18437.

31. Liu S., Rattner J., Jablonski S. and Yen T. (2006). Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol 775,41-53.

32. Lombillo V., Stewart R. and Mcintosh J. (1995). Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature 373, 161-164.

33. Mandelkow E. M., Mandelkow E. and Milligan R. (1991). Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo- electron microscopy study. JCell Biol 114, 977-991.

34. Mastronarde D. (1997). Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution. JStructBiol 120, 343-352.

35. McAinsh A., Meraldi P., Draviam V., Toso A. and Sorger P. (2006). The human kinetochore proteins NnflR and Mcm21R are required for accurate chromosome segregation. Embo J 25, 4033-4049.

36. Mcintosh J., Grishchuk E. and West R. (2002). Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol 18, 193-219.

37. Meurer-Grob P., Kasparian J. and Wade R. (2001). Microtubule structure at improved resolution. Biochemistry. 40:8000-8008.

38. Miranda J., De Wulf P., Sorger P. and Harrison S. (2005). The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat Struct Mol Biol 12, 138-143.

39. Mitchison T. (1989). Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J. Cell Biol. 109:637-652.

40. Mitchison T. (1993). Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science. 261:1044-1047.

41. Mitchison Т., Evans L., Schulze E. and Kirschner M. (1986). Sites of microtubule assembly and disassembly in the mitotic spindle. Cell. 45:515-527.

42. Molodtsov M., Grishchuk, E., Efremov A., Mcintosh J. and Ataullakhanov F. (2005). Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4353-4358.

43. Moores C., Yu M., Guo J., Beraud C., Sakowicz R. and Milligan R. (2002). A mechanism for microtubule depolymerization by KinI kinesins. Mol Cell 9, 903909.

44. Morphew M. and Mcintosh J. (2003). The use of filter membranes for high-pressure freezing of cell monolayers. J Microsc 212, 21-25.

45. Morrison E. (2007). Action and interactions at microtubule ends. Cell Mol Life Sci 64, 307-317.

46. Nicklas B. (1983). Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol. 97:542-548.

47. O'Toole E., McDonald K., Mantler J., Mcintosh J., Hyman A. and Muller-Reichert, T. (2003). Morphologically distinct microtubule ends in the mitotic centrosome of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol 163, 451-456.

48. O'Toole E., Winey M. and Mcintosh J. (1999). High-voltage electron tomography of spindle pole bodies and early mitotic spindles in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 10, 2017-2031.

49. Pfarr C., Coue M., Grissom P., Hays Т., Porter M. and Mcintosh J. 1990. Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature. 345(6272):263-265.

50. Rieder C. and Salmon E. (1998). The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol 8, 310-318.

51. Sanchez-Perez L, Renwick S., Crawley K., Karig I., Buck V., Meadows J., Franco-Sanchez A., Fleig U., Toda T. and Millar J. (2005). The DASH complex and Klp5/Klp6 kinesin coordinate bipolar chromosome attachment in fission yeast. Embo J 24, 2931-2943.

52. Sandall S., Severin F., McLeod I., Yates J., Oegema K., Hyman A. and Desai A. (2006). A Birl-Slil5 complex connects centromeres to microtubules and is required to sense kinetochore tension. Cell 127, 1179-1191.

53. Tanaka K., Kitamura E., Kitamura Y. and Tanaka T. (2007). Molecular mechanisms of microtubule-dependent kinetochore transport toward spindle poles. J Cell Biol 178, 269-281.

54. VandenBeldt K., Barnard R., Hergert P., Meng X., Maiato H. and McEwen, B. (2006). Kinetochores use a novel mechanism for coordinating the dynamics of individual microtubules. Current Biol 16, 1217-1223.

55. Wang H. and Nogales E. (2005). Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly. Nature 435, 911-915.

56. Wei R., Al-Bassam J. and Harrison S. (2007). The Ndc80/HEC1 complex is a contact point for kinetochore-microtubule attachment. Nat Struct Mol Biol 14, 5459.

57. Westermann S., Drubin D. and Barnes G. (2007). Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu Rev Biochem 76, 563-591.

58. Westermann S., Wang H., Avila-Sakar A., Drubin D., Nogales E. and Barnes G. (2006). The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature 440, 565-569.

59. Wigge P. and Kilmartin J. (2001). The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol 152, 349-360.

60. СПИСОК СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИИ 6His гексагистидиновая метка

61. Birl/Slil5 кинетохорные белки, участвующие с сегрегации хромосом CBF3 (c-repeat-binding factor) комплекс белков, формирующих кинетохор

62. DASH кинетохорный белковый комплекс, включающий в себя Daml Dsnl кинетохорный белковый комплекс, поддерживающий структуру кинетохора1. Ероп

63. Araldite разновидность эпоксидной смолы.гуанилил-(альфа, бета)-метилен-дифосфонат) негидролизуемый аналог GMPCPP тубулина, используемый для сборки стабильных МТ.

64. Ned моторный белок, имеющий минус-направленную активность

65. Ndc80 тетрамерный фибриллярный белок, взаимодействующий с МТ Ndc80p белок, входящий в состав Ncd80

66. NK350 химерный кинезин, не проявляющий моторной активности Nuf2p компонент комплекса Ncd80 pentaHIS пентагистидин

67. PET (polyethylene terephthalate) разновидность мембранpkllp минус-направленный молекулярный мотор

68. PRAXIS (principal axis) метод минимизации, предложенный Р. Брентом

69. PtKi эпителиальные клетки почки кенгуровой крысы

70. Spc24p белок, входящий в состав Ncd80

71. Spc25p белок, входящий в состав Ncd801. АТФ аденозин трифосфат1. ГДФ гуанозин дифосфат1. ГТФ гуанозин трифосфат

72. Д-МТ деполимеризующаяся МТ1. Д-тубулин тубулин, содержащий гидролизованную ГТФ

73. КМТ взаимодействующая с кинетохором МТкриоЭТ криоэлектронная томография1. КФ кинетохорная фибрилла1. МТ микротрубочканеКМТ не взаимодействующие с кинетохором МТ1. П-МТ полимеризующаяся МТ1. ПФ протофиламент1. ЭТ электронная томография