Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками"

На правах рукописи

003169138

ЕФРЕМОВ Артем Константинович

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КИНЕТОХОРОВ ХРОМОСОМ С МИКРОТРУБОЧКАМИ

03 00 02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 5 МАЙ 2008

Москва 2008

003169138

Работа выпочнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Фазоил Иноятович Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Иван Андреевич Воробьев

доктор физико-математических наук, доцент Вавилин Василий Александрович

Ведущая организация - институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Защита состоится «22» 2008г в "го часов

на заседании диссертационного совета Д 501 002 11 при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу Москва, Ленинские горы, МГУ имени M В Ломоносова, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им Ломоносова

Автореферат разослан « Z.Z- » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук, доцент / Хомутов Г Б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Микротрубочки - биополимеры цитоскелета, играющие важную роль в жизни клетки Они активно участвуют в поддержании формы клетки и транспортной системе Но самая важная функция микротрубочек - распределение точных копий генетического материала по дочерним клеткам во время деления клетки - митоза Дтя решения этой задачи природа в течение эволюции создала специальный белковый комплекс, собирающийся на центромерном участке каждой хроматцды, - кинетохор За него во время митоза могут зацепляться микротрубочки, участвующие в транспорте хромосом Раньше считалось, что за перемещение хромосом в митозе отвечают моторные белки на кинетохоре, а кинето-хорные микротрубочки просто играют роль «рельсов» по которым идут эти белки Однако недавно было показано, что это не так - для транспорта хромосом во время митоза необходимо и достаточно только динамической нестабильности микротрубочек Основа этого явления состоит в том, что микротрубочка может находиться в двух состояниях - быстрой разборки или медленного роста Причем переход из одного состояния в другое является случайным процессом у свободных микротрубочек Сокращающаяся микротрубочка, зацепленная за кинетохор, тянет за собой хромосому, в то время как растущая микротрубочка наоборот толкает хромосому То, что микротрубочки действительно могут создавать силы достаточные для движения хромосом во время митоза, было показано экспериментально Однако до сих пор ни одна из существующих моделей взаимодействия кинетохора и микротрубочки не может полностью описать их структурные данные и динамические характеристики, полученные в недавних экспериментах, несмотря на частичные успехи этих моделей

Целью данной работы было теоретическое и экспериментальное исследование механизма движения кинетохорного Оаш1 комплекса, ответственного за взаимодействие микротрубочек с кинетохорами хромосом и образующего кольца вокруг микротрубочек

Задачи исследования:

1 Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре и кинетики деполимеризации При этом модель должна включать в себя тепловые флуктуации, которые не были учтены 1га в одной предшествующей модели микротрубочки

2 Создать и объединить с моделью микротрубочки модель кинетохорных белковых комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, основываясь на их структурных и динами-

3

ческих данных

3 С помощью получившейся математической модели определить, какими свойствами должны обладать кинетохорные белки, взаимодействующие с микротрубочкой, для наиболее эффективного развития тянущей силы деполимеризукяцейся кинетохорной микротрубочкой

4 Понять, как удается кинетохорным белковым комплексам быть сильно связанными с микротрубочкой и при этом быстро передвигаться

5 Экспериментально определить по какому из известных теоретических механизмов происходит движение кинетохора во время деления клетки

Научная новизпа. Впервые была разработана наиболее полная модель кинетохора и его взаимодействия с микротрубочкой, включающая в себя все известные на сегодняшний день структурные и динамические экспериментальные данные В результате введения дополнительной гипотезы в модель о существовании подвижных белковых мостиков - линкеров у кинетохора, ответственных за связывание со стенкой микротрубочки, впервые было показано, каким образом удается совместить высокую эффективность движения кинетохора вдоль микротрубочки с сильным связыванием кинетохора и микротрубочки Этого свойства кинетохора до сих пор не могла объяснить ни одна существующая на сей день математическая модель Не смотря на такое чисто теоретическое предположение, подобные линкеры были совсем недавно обнаружены на электронных фотографиях f Wang 2007], что свидетельствует в пользу созданной нами модели Сравнение результатов модели с существующими экспериментальными данными по динамике кинетохорного белкового комплекса, ответственного за зацепление хромосомы к микротрубочкам, показало, что в природе реализуется силовой механизм движения (power stroke mechanism) кинетохора при разборке микротрубочки, а не механизм диффузии со смещением (biased diffusion mechanism) Этот результат также подтверждается проведенными мной экспериментальными исследованиями Кроме того теоретические расчеты показали, что кинетохор движется наподобие моторных белков - его линкеры перешагивают из одного сайта взаимодействия на микротрубочке в другой, используя вместо энергии АТФ энергию упругих напряжений, запасенную в стенке микротрубочки Подобный механизм движения до сих пор не был никем описан Кроме того было экспериментально показано существование ш vitro никем ранее не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках Эти структуры обладают ки-

нетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов

Научно-практическое значение. Исследование механизмов, участвующих в делении клеток, очень важно при изучении развития раковых заболеваний Знание процессов, протекающих во время митоза и принципов их действия, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения Результатом данной работы является вклад в понимание механизма движения и взаимодействия кинетохора с микротрубочкой, а также выяснение механизма генерации сил, развиваемых киветохорньши микротрубочками во время деления клетки

Положения, выносимые на защиту:

1 Создана оригинальная математическая модель взаимодействия микротрубочки и кинетохора, хорошо согласующаяся со всеми существующими экспериментальными дшшыми

2 С помощью полученной математической модели определены необходимые свойства кинегохорных белков, связывающихся с микротрубочкой, для обеспечения наиботее эффективного функционирования кинетохора

3 Показано, каким образом можно совместить в кинетохоре два противоречивых свойства- сильное связывание с микротрубочкой и высокую подвижность

4 Экспериментально определен механизм, по которому происходит движете кинетохора во время деления клетки

5 Экспериментально показано существование ранее никем не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов

Апробация работы состоялась 13-ого марта 2008 г на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН

Материалы диссертации докладыва-шсь на III съезде биофизиков России (Воронеж, 24-29 июня 2004), 46-ой и 47-ой конференциях annual ASCB meeting (December 9-13,2006, San Diego, CA и December 1-5, 2007, Washington, DC), конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (29 октября - 2 ноября, 2007, Пущино)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 5-и конференций и 2статей

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, библиографического указателя, включающего 106 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо, США (зав лабораторией проф. Ричард Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Модель микротрубочки. За основу была взята модель микротрубочки из статьи [Molodtsov 2005а] с небольшими изменениями, описанными ниже. В этой модели рассматривается микротрубочка, состоящая из 13 протофиламентов с 3-х заходной спиралью, ось микротрубочки направлена вдоль оси г. Считалось, что каждый протофила-мент все время находится в плоскости, проходящей через ось микротрубочки и начальное

вертикальное положение протофиламента. Это предположение не ограничивает применение модели, т.к. на электронных томограммах видно, что протофиламенты практически полностью лежат в таких плоскостях. Конформационное изменение формы протофиламента при выгибании из стенки микротрубочки происходит благодаря изгибанию между аир субъединицами внутри димеров тубулина и наклону между соседними дн-мерами тубулина [Nicholson 1999, Gigant 2000, Steinmetz 2000]. Поэтому в модели протофиламенты состояли из твердых сферических мономеров одинакового диаметра (4 нм), которые могут наклоняться друг относительно друга. Предполагалось, что каждый мономер имеет четыре точки взаимодействия с соседними мономерами. Две из них соответствуют взаимодействию «голова к хвосту», это связи мономеров внутри протофиламентов (темно-серые кружочки на рис. 1). Две другие - по бокам, соответствующие боковым связям мономеров внутри стенки микротрубочки (светло-серые кружочки на рис. 1). Как и в статьях [Molodtsov 2005а, 2005b] считалось, что все взаимодействия между мономерами одинаковы для а- и ß-мономеров.

Координаты первого мономера в каждом протофиламенте были зафиксированы. Продольные связи «голова к хвосту» мы считали нерастяжимыми и отвечающими только за из-

а,Р-тубулин линкеры

0ат1 г ^ЛПг. -

комплексы

Рис.1. Схематическое изображение положения силовых центров в модели.

гибание протофиламентов, а потенциал этого взаимодействия описывался функцией gk.„ = В (Хкп-/о)2/2 , где/£„ = гк„~ tkin - угол между i-ьш и (к-1)-ьш мономерами в п-оч прото-филаменте, ц„ - угол между к-ым мономером в п-ом протофиламенте и осью микротрубочки, эти углы являются независимыми переменными в модели, В - параметр, характеризующий изгибную упругость связи Потенциал боковых взаимодействий мономеров мы описывали функцией v(r) = A (r/r0)2 ехр(-г/г0), где А и г0 - параметры потенциала, г = г (t^J - расстояние между боковыми центрами взаимодействия тубулинов

Модель ДАМ-кольца Из экспериментальных данных известно, что ДАМ-кольцо состоит из ~ 16 субъединиц Но для упрощения модели считалось, что кольцо состоит из 13 Такое упрощение не ограничивает общности модели, поскольку образование дополнительных 3 связей стерически не возможно Кольцо в расчетах имело внутренний диаметр 33 нм [Westermann 2005, Miranda 2005] От каждой из 13 субъединиц кольца к одному из 13 протофиламентов идет линкер - белковый мостик комплекса Daml, ответственный за взаимодействие с микротрубочкой Каждый линкер описывался линейным стержнем длиной 4 нм Считалось, что каждый линкер может сжиматься в продольном направлении, а также выгибаться из плоскости кольца, при этом в расслабленном состоянии все линкеры направлены в центр кольца Исходя из результатов статьи [Westermann 2005] я предположил, что центр связывания линкера с димером тубулина находится на а- мономере тубулина Положение сайта взаимодействия линкера с а- мономером тубулина показан белым кружочком на рис 1 Для простоты расчетов считалось, что подвижный конец каждого линкера все время движется по внешней поверхности соответствующего протофиламента Следовательно, каждый линкер будет описываться одной степенью свободы, не включая координат ДАМ-кольца В качестве нее бьи взят угол а„ между плоскостью кольца и направлением линкера Эти углы, так же как и углы rt „ являются независимыми переменными в нашей модели Кроме того к независимым переменным относятся три координаты положения центра ДАМ-кольца в пространстве Хс, Yс, Zc и три угла Эйлера для него 0, гр, у/ Таким образом, углы т<„, а„, 0, у, у и координаты Хс, Yc, Zc составляют весь набор независимых переменных системы, который обозначим Í2

Энергия продольной деформации п-го линкера равна qn(Al0) = kspnng Д1„2/2 , где kspn„s - коэффициент продольной жесткости линкера, А1„ = 41„(0) — абсолютное изменение длины линкера А энергия изгибания п-го линкера равна р„(рп) = кпех Р„2/2 , где kj¡a - коэффициент

изгабной жесткости линкера, /?„ = {¡„(Q) - угол отклонения линкера от равновесного положения

Кроме этих двух энергий, описывающих свойства упругости линкеров в модель была введена энергия взаимодействия подвижного конца линкера с а-мономерами тубулина Она аппроксимировалась формулой dn(p„) = -кПлм exp(-pD2/rDAM2). где кОАм - параметр, описывающий глубину ямы, rDm - параметр, характеризующий ширину потенциальной ямы, р„ -p„(Q) - расстояние от подвижного конца п-го линкера до центра взаимодействия на ближайшем а-мономере

Выбор значений констант модели Параметр /„ бьш выбран исходя из структурных данных [Muller-Reichert 1998] - угол между соседними ГДФ-димерами тубулина в протофила-менте в расслабленном состоянии равен 0 4 радиана Для простоты считалось, что этот угол есть сумма равных интердимерного и интрадимерного изгибания между мономерами тубулина, т е равновесный угол д;„ = 0 2 радиана в обоих случаях Другой параметр - В в формуле был выбран из соображения, что вся энергия гидролиза ГТФ, связанного с р-мономером тубулина, -£//=73 ккал/моль =123 kBT, [Lehnmger 1993], запасается в стенке микротрубочки в виде упругих напряжений Следовательно, В = EH/yJ я 300 квТ/рад2 Для соответствия температурной зависимости скорости разборки микротрубочки был подобран параметр А, который оказался равен 28 квТ, а величина барьера боковой связи Еьатсг = 4Ле2 ~ 15 квТ Поэтому разность энергии барьера боковой связи мономера и энергии запасенной в продольной связи мономера равна AElhllor = Etarrter - Ен/2 - 15 kBT - 6 kBT = 9 kBT, что соответствует экспериментальным данным ЛЕар = (4 8 ± 0 6) ккал/моль ~ (8 ± 1) kBT [Molodtsov 2005b]

Дальнейшие расчеты модели показали, что от изменения величины kspn„g на порядок полученные далее динамические зависимости не сильно меняются, поэтому эта величина во всех приведенных ниже расчетах была фиксирована и равна kspnng = 0 13 Н/м Такой коэффициент упругости для стержня длиной 4 нм площадью поперечного сечения 1 нм1 соответствует модулю Юнга Е = 5 10s Н/м2, характерному для многих белков

Расстояние типичного белок-белкового взаимодействия составляет 1-2 A [Jiang 2002] Поэтому параметр г0 из формулы был выбраны равными г0 = 0 8 А, т к длина связи равна 2r„ = 1 6 А Это же касается и параметра rDAM, который был взят равным 1 4 А

Также в модели необходимо задать коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольца в

воде Для этой цели были взяты данные по измерению коэффициента диффузии Daml дека-меров в воде [Miranda 2005] и был оценен коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольца в растворе по порядку величины как D = 107 см2/с

Таким образом, в модели микротрубочки, взаимодействующей с ДАМ-кольцом, есть только два важных параметра - кра, коли, от которых сильно зависят конечные результаты

Экспериментальная установка Все эксперименты с проточной камерой были сделаны на световом микроскопе Zeiss Axiophoto2, адаптироваппым под конструкцию лазерной ловушки Изображения движущихся флуоресцентных Daml комплексов были получены с интервалом в 5 секунд в виде z-стеков, включающих в себя 3-4 плоскости с шагом в 0 3 мкм Это было необходимо, т к мккротрубочки, на которых сидят ДАМ-пятна, совершают колеба-течьные тепловые движения и часто выходят из фокальной плоскости микроскопа, что сильно сказывается на величине интенсивности ДАМ-пятен Экспозиция камеры в каждой плоскости была равна 400 мс Изображения движущихся шариков, покрытых Daml комплексом, при деполимеризации мшсротрубочки, снимались с использованием DIC микроскопии и выдержкой видеокамеры 100 мс для каждого кадра

Реагенты и белки Большинство реагентов были куплены у Sigma и Molecular Probes Не-гидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience Тубулин был получен из коровьих мозгов путем по протоколу из [Weingarten, 1975] Мечение тубулика родамином и биотипом было выполнено по стандартному протоколу из [Hyman, 1991] В качестве центров нуклеации тубулина использовались лизированные шкурки тетрахимены или аксонемы, присланные из университета штата Миннесоты Стеклянные микрошарики были приобретены у Splierotech Inc и обработаны по протоколу из [Asbury, 20061

Приготовление проточной камеры к экспериментам Эксперимент проводился в термо-стати-руемой (32°С) проточной камере, основой которой служили предметное и покровное стекла, разделенные слоем двустороннего скотча Схема эксперимента представлена на рис 2 До начала эксперимента шкурки тетрахимены (или аксонемы) помещались на покровное стекло, после чего камера заполнялась буфером А (BRB-80, 4 мМ MgCb, 2 мМ DTT, 0 5 мг/мл казеина), собиралась и запечатывалась силиконом (Kwik-cast, WPI, Inc) После этого не адсорбировавшиеся на покровном стекле шкурки тетрахимены (аксонемы) вымывались из камеры 300 мкл буфера А на скорости 100 мкл/мин Затем в камеру вмывался ГТФ-тубулин концентрации 1 4 мг/мл (с 1 мМ ГТФ) со скоростью 30 мкл/мин Спустя 15 мин,

когда микротрубочки вырастали до размеров ~ 10 мкм, камера промывалась четырьмя объемами GMPCPP-тубулина (1 3 тубулин был мечен родамином) в концентрации 0 4 мг/мл (с 1 мМ GMPCPP) со скоростью 30 мкл/мин За время промывки камеры на плюс концах микротрубочек нарастало несколько слоев GMPCPP-тубулина и микротрубочки становились устойчивыми и не чувствительными к разбавлению концентрации свободно плавающих димеров тубулина Благодаря этому камеру можно было хорошо отмыть от остатков свободно плавающего в растворе меченого родамином тубулина Кроме того, благодаря наличию крашеного родамином тубулина на GMPCPP кончиках микротрубочек, можно было инициировать деполимеризацию микротрубочек, находящихся в поле зрения микроскопа, уничтожая GMPCPP кончики микротрубочек путем их освещения зеленым светом, на котором поглощает родамин Отмывка камеры производилась все тем же буфером А на скорости 10 мкл/мин в течение 5 минут Затем камера промывалась буфером Б, за основу которого брался буфер А с добавлением BSA до концентрации 0 5 мг/мл и 1% 2-меркалтоэтанолом

В некоторых экспериментах в проточную камеру добавлялся раствор буфера Б с Daml комплексом там, где это отдельно оговаривается в тексте Меченный краской Daml комплекс был любезно предоставлен Вестерманом, университет Беркли, Калифорния Непосредственно перед введением в проточную камеру Daml разводился в буфере Б до концентраций порядка 3-30 нМ

Результаты.

Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца с микротрубочкой Расчеты модели для разных показали, что с ростом изгибной жесткости линкеров падает количество связей между ДАМ-кольцом и микротрубочкой При кЛа -2000 квТ/рад, максимальное количество линкеров, взаимодействующих с сайтами связывания на микротрубочке, в каждый момент времени < 3 и эта цифра не зависит от коли При жесткости к)1а = 200 квТ/рад с сайтами взаимодействия на микротрубочке связываются по 79 линкеров кольца, а при крех = 20 квТ/рад все линкеры кочьца находятся в связанном со-

поировное стекло

ГДФ-слой тубулина

GMPCPP-слой тубулина

У*

сокращающаяся микротрубочка

Рис 2 Схематическое изображение эксперимента

стоянии для глубин ДАМ-потенциала в интервале 10-16 квТ С уменьшением kDAU наблюдается уменьшение максимального количества связанных линкеров до 3 Следовательно, можно заключить, что кольцо с более гибкими линкерами образует больше связей, чем кольцо с жесткими линкерами, т к такому кольцу легче наклониться относительно оси микротрубочки, чтобы образовать больше связей Кроме того нашей группой было ранее показано, что жесткое кольцо с внутренним диаметром, приблизительно равным диаметру микротрубочки, имеет низкое КПД преобразования упругой энергии, запасенной в стенке микротрубочки в механическую работу [Molodtsov 2005b] А поскольку кольцо с жесткими линкерами (kj¡a = 2000 kgT/рад) эквивалентно жесткому кольцу с внутренним диаметром равным диаметру микротрубочки, то можно уже на этой стадии заключить, что конфигурация кольца с жесткими линкерами не является оптимальной

ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки Дальнейшие расчеты показали, что для колец с гибкими линкерами к_р€Х = 20 квТ/рад и глубиной ДАМ-потснциала коли~ 12-14 квТ наблюдается совпадение распределения углов наклона кольца относительно оси микротрубочки с экспериментально померенным [Miranda 2005] с достоверностью 95%, см рис 3 На этом рисунке черным цветом изображена диаграмма распределения для теоретических расчетов в предположении, что на димере тубулина есть только один сайт связывания линкера кольца - на а-мономере Белым цветом изображена диаграмма распределения для экспериментальных данных Для сравнения была также посчитана серая диаграмма распределения в случае, когда на димер тубулина приходится два сайта связывания линкера кольца - один на a-мономере, другой - на [i-мономере С достоверностью 95% эта теоретическая диаграмма отличается от экспериментальной диаграммы Эти данные хорошо согласуются с экспериментальными наблюдениями [Westermann 2005],

-0 50

'025-

_теория, одна связь на димер

1-I средний угол 0 27 ± 0 07, N=586

теория, две связи на димер средний угол 0 113 ± 0 004, N=282 эксперимент

средний угол 0.25 ± 0 03, N=28

02 03 04 05 ОБ угол наклона рад

Рис 3 Диаграммы распределения углов наклона кольца относительно оси микротрубочки ку,„ = 20 квТ/рад и кши =13 квТ

которые свидетельствуют о том, что субъединицы ДАМ-кольца связываются только с а-мономерами димсров тубулина

У кольца есть несколько выгодных наклонных положений относительно оси микротрубочки Их можно проиллюстрировать с помощью полярной диаграммы, как это сделано на рис 4 На диаграмме каждая точка изображает проекцию конца единичного вектора коллинеарного оси кольца на плоскость, перпендикулярную оси микротрубочки Радиальные круги на диаграмме, идущие с шагом 0 05, показывают абсолютную величину проекции, равную sin 0, где 8 - угол Эйлера кольца Азимутальные направления показывают расположение плоскостей протофилачен-тов, если смотреть от плюс конца к минус концу микротрубочки Из диаграммы видно, что точки расположены неравномерно, что объясняется спиральностью микротрубочки И наиболее часто кольцо образует угол 0 27±0 07рад с наклоном в сторону 5 протофиламента

Слабосвязывающссся с микротрубочкой ДАМ-кольцо движется по механизму направленной диффузии Расчеты по зависимости эффективного коэффициента диффузии кольца,

связанного с микротрубочкой, от kj¡a и kDiK, показали, что наибольшее влияние на этот параметр оказывает величина кол w, в то время как зависимость от kj¡a небольшая Результаты расчетов изображены на рис 5, на котором показаны зависимости эффективного коэффициента диффузии кольца от глубины ямы кПАМ для различных изгибных жесткостей линкеров kflex Из графиков видно, что когда взаимодействие кольца с микротрубочкой очень слабое (кВМ1 < 2 квТ), кольцо диффундирует очень быстро При этом эффективный коэффициент диффузии на этом участке мало зависит от глубины ДАМ-потенциала При увеличении силы связывания {коли ~ 2-5 квТ) наблюдается экспоненциальная зависимость - увеличение силы связывания на 1 квТ приводит к 10 кратному

Рис 4 Угловая диаграмма устойчивых положений ДАМ-кольца k¡t„ = 20 кцТ/ради кшч = 13 квТ _

юМ

о

S 2 io-'I kiiex (квТ/рад)

-о—20

—»-200

St —ir— 2000

а 10-3.

0 1 2 3 4 5 коды, энергия связывания, квТ

Рис 5 Зависимость коэффициента диффузии кольца от энергии связывания линкеров с тубулином

уменьшению эффективного коэффициента диффузии ДАМ-кольца в модели

При таких неглубоких ДАМ-потенциалах кольцо во время укорочения микротрубочки двигается по механизму диффузии со смещением, см рис б, на котором изображено изменение положения центра кольца и деполимеризующегося конца микротрубочки с течением времени Из графика видно, что кольцо совершает случайные движения вдоль микротрубочки, однако деполимеризующийся конец микротрубочки ограничивает движение кольца, не давая ему слететь с микротрубочки Это происходит благодаря тому, что деполимеризующийся конец микротрубочки очень сильно раскрывается, и его диаметр превышает диметр ДАМ-котьца Поэтому такой конец микротрубочки играет роль энергетического барьера, который кольцо не может преодолеть, тк для этого понадобилась бы энергия >100 квТ для распрямления протофиламентов микротрубочки

Сильносвязываюшееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания При увеличении глубины ДАМ-потенциала наблюдаются сильные изменения в

динамическом поведении кольца Так при кОАЫ — 10-15 квТ кольцо имеет очень маленький эффективный коэффициент диффузии (<1016 см2/с), те такое кольцо при характерном времени проведения эксперимента порядка часа выглядело бы неподвижным Но при деполимеризации микротрубочки изгибающиеся прото-филаменты развивают силу давления на линкеры кольца, достаточную для того, чтобы кольцо начало двигаться со скоростями порядка скорости разборки микротрубочки При этом такое кольцо перемещается вдоль оси микротрубочки

X _ 160

о 5 О X —ц^ —центр ДАМ-кольца

1 I1201 1 |Шг - - конец микротрубочки

О £ г 5 V I

га *§. 80 1/ 1г КП И ''

¡5 Э Ч & 40

О 1 Р. л

0 50 100 150 200 250

время, мс

Рис 6 Зависимость положения центра

ДАМ-кольца и конца микротрубочки при

ее деполимеризации кра = 20 квТ/рад и

колм= 4квТ

Б ° 1 5 |100-О х ° 10 КС • 12 кТ «апс!» 14 кТ "ДЧЦ * 15 И

О О га «О Й а 50. £ О 1 § 1 0 * С 1 \ '^ЧГ^Н-

05 10 15 время, с

Рис 7 Зависимость положения центра

ДАМ-кольца от временя при деполиме-

ризации микротрубочки для разных

коли к/>а = 20квТ/рад

шагами (см рис 7), что разительно отличается от диффузии слабосвязанного с микротрубочкой кольца (см рис 6) На рис 7 разными оттенками изображены графики смещения центра кольца вдоль оси микротрубочки в зависимости от времени для разных значений к0Лм Из рис 7 видно, что центр сильно связанного с микротрубочкой кольца всегда движется в направлении деполимеризации микротрубочки и не испытывает случайно диффузии как у слабосвязанного с микротрубочкой кольца Однако и здесь наблюдается некий элемент случайности - движение кольца часто прерывается паузами, являющимися результатом стохастического поведения протофиламентов при разборке микротрубочки и вероятностными переходами кольца между устойчивыми положениями относительно мнкротрубоч-ки При этом длительность пауз тем больше, чем больше сила связывания линкеров кольца с поверхностью микротрубочки Из-за чего с увеличением силы связывания наблюдается замедление скорости движения ДАМ-кольца и деполимеризации микротрубочки, см рис 8

Т к сильносвязанное с микротрубочкой кольцо перемещается вдоль оси мнкротрубочхи шагами под действием силы со стороны деполимеризующегося конца микротрубочки, то такой механизм движения можно назвать «силовым шаганием» При этом линкеры передвигаются 8нм шагами, что довольно таки очевидно, тк на протофиламентах микротрубочки сайты связывания линкеров идут как раз с этим шагом, равным длине димера тубулина Центр же самого кольца передвигается с менее регулярным шагом в отличие от линкеров, т к движение кольца является усреднением движения всех 13 линкеров, которые шагают асинхронно

Сильносвязываюшееся с микротрубочкой ДАМ-кольпо обладает более лучшими динамическими характеристиками, чем слабосвязываюшееся ДАМ-кольпо Для сравнения двух типов колец - сильносвязывающихся {kDAM = 10-15 kBT) и слабосвязывающихся (kDAM =1-5 kBT) было исследовано две зависимости - сила остановки (stalling force) и сила отрыва кольца от глубины ДАМ-потенциала В первом случае нагрузка, приложенная к кольцу, равномерно распределялась между 13 субъединицами кольца и искалась такая величина нагрузки, при которой кольцо останавливалось при деполимеризации микротрубочки Во вто-

к^м энергия связывания, kgT

Рис 8 Зависимость скорости движения ДАМ-кольца при разборке микротрубочки от кык{ к^ех = 20 квТ/рад_

ром случае бралась неразбирающаяся стабильная микротрубочка с ДАМ-кольцом, к которому опять же была приложена равкораспределенная по кольцу нагрузка Только на этот раз искалась такая величина нагрузки, при которой кольцо начинало двигаться в сторону нагрузки, преодолевая ДАМ-потенциалы на поверхности микротрубочки и, в конечном счете, отрываясь от конца микротрубочки

Так, например, оказалось, что сила остановки для случая колм ~ 5 квТ равна ~ 60-70 лН, а для случая крАм ~ 13 квТ она равна ~ 40-50 пН И, следовательно, в первом случае КПД системы ~ 80-90%, а во втором ~ 50-60%, тк максимально развиваемая микротрубочкой сила по теоретическим оценкам равна 80пН Но КПД системы -не единственный параметр, определяющий оптимальность конструкции ДАМ-кольца На рис 9 изображено два графика 1) светлый - зависимость силы остановки от глубины ДАМ-потенциала, 2) темный - зависимость силы отрыва от глубины ДАМ-потенциала В районе точки пересечения этих двух графиков и немного правее находится область оптимального значения параметра кши, изображенная на рисунке штрихованным прямоугольником, т к ДАМ-кольца, которые под действием деполимеризующей-ся микротрубочки развивают силу, большую, чем сила отрыва кольца от микротрубочки, будут постоянно терять связь с микротрубочками С другой стороны также невыгодно иметь слишком большую силу связывания ДАМ-кольца с микротрубочкой, т к это приводит к маленькому КПД системы или вообще ее полной остановке Таким образом, можно заключить, что клепсе более выгодно иметь ДАМ-кольца с гибкими линкерами, взаимодействующими с димерами тубулина микротрубочки с энергией кым ~ 13-15 квТ

На закрепленных к покровному стеклу микротрубочках образуются как нормальные ДАМ-кольца, так и ДАМ-структуры в виде недостроенных ДАМ-колец Мной были проведены эксперименты, аналогичные [\Vestermanii 2006] по диффузии флуоресцентных ДАМ-пятен вдоль стабилизированных таксолом микротрубочек, закрепленных за покровное микроскопное стекло При этом мы использовали микротрубочки, выращенные из биотинили-рованного тубулина, а стекло непосредственно перед экспериментом было покрыто стреп-

оптимальная

область

75j L sari /

i 50" д

остановка

я с

§ 25- отрыв \ * ' \

0 i > 1 i IV

0 5 10 15

Кодм, энергия связывания, квТ

Рис 9 Зависимость сил оста-

новки и отрыва ДАМ-кольца от

küAM V« = 20 квТ/рад

50 нм

тавидином. В результате связывания микротрубочек с покровным микроскопным стеклом,

ДАМ-кольца с трудом могли образовываться вокруг них, исходя из стерических соображений. Это предположение подтверждается и электронными фотографиями ДАМ-пятен, сделанных Грищук E.J1., которые образовывались на таких связанных с поверхностью микротрубочках, см. рис. 10В. Из изображения видно, что Daml чаще образует структуры в виде недостроенных ДАМ-колец, - ДАМ-патчей (Daml-patches).

Все флуоресцентные ДАМ-пятна, связанные с микротрубочками, делились на две категории, см. килограмму, изображенную на рис. 12. Первая категория - более яркие пятна, которые совсем не двигались и сидели на одном месте на микротрубочке в течение всего эксперимента. Вторая -очень подвижные пятна, которые часто сливались друг с другом или наоборот разбивались на пару более слабых диффундирующих пятен. Динамические более слабьте ДАМ-пятна никогда не проходили сквозь яркие неподвижные пятна, «отскакивая» от них. Это говорит о том, что такое яркое ДАМ-пятно занимает все протофиламенты микротрубочки, поэтому нет ни одной обходной дороги вокруг этой структуры. Т.к. в электронный микроскоп

Рис. 10. А. Электронная фотография биотинилиро-ванной мшеротрубочки, лежащей на связывающей поверхности в отсутствии Daml в растворе. В. Тоже, что и в А, только на этот раз с Daml в растворе. Daml образовал на поверхности микротрубочки структуры, часть из которых точно не являются замкнутыми кольцами (показаны белыми стрелками). С. Электронная фотография свободноплавающей микротрубочки с ДАМ-кольцом на ней.

не было видно образования каких-либо агрегатов из Оат1, покрывающих все протофиламенты, кроме ДАМ-колец, то, по-видимому, эти яркие ДАМ-точки как раз представляли собой эти

0.10

12 14 16 яркость пятна, у.е.

Рис. П. Зависимость эффективного коэффициента диффузии флуоресцентных ДАМ-пятен вдоль микротрубочек от их относительной яркости.__

слияние деление

кольца.

Характерно, что при увеличении яркости ДАМ-пятна падал его коэффициент диффузии, см. диаграмму на рис. 11, что говорит о присутствии на микротрубочках ДАМ-комплексов с разным количеством Daml комплексов и связей, образованных с микротрубочкой, и состоящих из разного количества Dam 1. Причем чем больше флуоресценция ДАМ-пятна, тем больше крашеного Daml входит в его состав, тем больше образуется у такого пятна связей с микротрубочкой и тем меньше его коэффициент диффузии, начиная от значений, обнаруженных в работе [Wcstennann 2006] и кончая полной остановкой ДАМ-пятна. Если взять верхнюю оценку коэффициента диффузии для самых ярких пятен из диаграммы на рис. 16 и подставить в теоретический график на рис. 6, то оказывается, что соответствующая глубина ДАМ-потенциала будет не менее 6-7 квТ.

В заключении об этом эксперименте стоит сказать, что, по-видимому, в работе [Westermann 2006] как раз и наблюдали диффузию таких ДАМ-патчей на адсорбированных к стеклу микротрубочках, хотя приписывали ее движениям полных ДАМ-колец, что, по-видимому, оказалось неверным. В нашей экспериментальной работе была впервые показана возможность существования высокодинамичных ДАМ-патчей на микротрубочке, которые вполне возможно могут играть немалую роль во время митоза.

Микрошарики, покрытые Daml комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обладают высокой процессивностью движения. Для того чтобы исследовать более подробно возможность ДАМ-патчей трансформировать упругую энергию напряжений в стенке микротрубочки в механическую работу, были использованы микрошарики, покрытые меченым алексой 488 Daml комплексами. Микротрубочки выращивались из шкурок тетрахимен, адсорбированных на покровном стекле. Затем в проточную камеру вмывались покрытые шарики, большинство из которых повисало на микротрубочках. Непосредственно перед вмы-

Рис. 12. Кимограмма флуоресцентных ДАМ-пятен, сидящих на микротрубочке, которая закреплена на связывающей поверхности. Из рисунка видно, что все пятна делятся на две группы - яркие неподвижные и более слабые, диффундирующие вдоль микротрубочки (белые стрелки).

ванием в проточную камеру эти шарики тщательно были отмьгты от свободных Daml комплексов, не связавшихся с поверхностью шариков и плавающих в растворе. Таким образом,

эти шарики при зацеплении за микротрубочку не образовывали ДАМ-колец. Это подтверждалось наблюдениями в течение всего эксперимента — на микротрубочках не было видимых во флуоресцентном канале ДАМ-пятен. При инициации разборки микротрубочек путем облучения их зеленым светом 44% шариков отваливались от микротрубочек, но оставшиеся 56% (231 шарик) начинали двигаться за разбирающимися концами микротрубочек вплоть до самого сайта нуклеации. В среднем такие шарики проходили порядка 7-10 мкм. При этом средняя скорость движения этих шариков была равна 29.8±3,4 мкм/'мин (N=248), см. рис. 13, что было больше, чем средняя скорость разборки свободных микротрубочек 21.8±0.6 мкм/мин (N=57) в той же системе в отсутствии шариков, см. рис. 18. Следовательно, шарики, покрытые Daml комплексом в отсутствии свободноплавающего Daml в растворе, обладают деполимеризующей активностью и двигаются при разборке по механизму диффузии со смещением аналогично шарикам в [bombillo, Peskin 1995, Тао 1998].

Уменьшение плотности покрытия Daml комплексом поверхности шариков ведет к уменьшению их скорости движения за деполимеризующимися концами микротрубочек. При проведении экспериментов аналогичным тем, что упоминались в предыдущем пункте, с разными плотностями покрытия поверхности шариков Daml, была получена зависимость, изображенная на рис. 14. И хотя график состоит всего из трех точек, хорошо заметна тенденция уменьшения скорости движения шариков с уменьшением количества Daml на их поверхности. Это служит доказательством того, что в такой постановке эксперимента не наблюдается формирование ДАМ-колец при присоединении шарика к микротрубочке. Т.к.

ЕЕЗ в присутствии растворимого Datwt (N=113) ■Ш в отсутствии растворимою Daml #=248)

30 50 70 30 110 130 150 170 скорость движения, мкм/мин

Рис. 13. Диаграммы распределения скоростей движения шариков, покрытых 1>ат1, при деполимеризации микротрубочек для случаев отсутствия (серая) и присутствия (черная) Г)ат 1 в растворе.

иначе понижение плотности Баш1 на шариках приводило бы к меньшему числу образующихся ДАМ-колец, соединенных с шариком. А это бы приводило в свою очередь к увеличению скорости движения шариков при деполимеризации микротрубочки. Такое поведение шариков в зависимости от плотности покрытия Оат1 наряду с их свойством ускорять деполимеризацию микротрубочек хорошо объясняется моделью диффузии со смещением, предложенной в [Рмкт 1995] для аналогичных экспериментов, правда с другим белком.

Проводя такие же эксперименты, только в присутствии Пат1 комплекса в растворе оказалось, что в этом случае средняя скорость движения шариков за разбирающимися концами микротрубочек равна 9.4 + 2.9 мкм/мин (N=119), что приблизительно в три раза меньше, чем в отсутствии свободно плавающих Оат1 комплексов, см. рис. 13. Это объясняется образованием ДАМ-колец вокруг микротрубочек в месте присоединения шариков.

В пользу этого говорят измерения, проведенные на шариках с помощью лазерной ловушки. Оказалось, что сила, развиваемая деполимеризующейся микротрубочкой, на стрептавидиновые шарики, зацепленные за биотиншшрованные микротрубочки [йпзЬсЬик 2005] по своей амплитуде и продолжительности гораздо меньше, чем в случае шариков, покрытых Оат1, с присутствием Оат1 в растворе, см. диаграмму на рис. 15. Эти экспериментальные данные объясняются тем, что в первом случае нет ДАМ-кояьца между шариком и микротрубочкой, поэтому шарики гораздо легче

1 э-4

Iй! 5а ! £ 1 : о Щ

о 3 и. о — О X о 1-Г

<-> О

160' 140' 120' 100

о- -1ПП' т.

N=129

N=32

НН

i

N=248

чь

свободная микротруВочка

10 102 Ю3 Ю4 0ат1 комплексов на шарик

Рис. 14. Зависимость относительной скорости движения шариков при деполимеризации микротрубочек от плотности их покрытия Оат1 комплексами.

Ш начальное натяжение _ т

Ш амплитуда силы I—| длительность сита В время релаксяирм

стрептав. шарики

0.5 цт Д^М-кольца

Рис. 15. Диаграммы динамических характеристик сигналов, возникающих при перемещении шариков под действием деполимеризую-щихся микротрубочек, измеренных в опыте с лазерной ловушкой.

отваливаются от деполимеризующихся концов микротрубочек, что и дает маленькую продолжительность силы Кроме того, в первом случае на эти шарики давление оказывают всего 2-3 протофиламента, исходя из стерических соображений Во втором случае, по-видимому, образуется ДАМ-кольцо между шариком и микротрубочкой, в результате чего на шарик посредством ДАМ-кольца давят все 13 протофиламентов, что создает силу раз в шесть большую, чем в случае стрептавидиновых шариков, что и наблюдается в экспериментах Таким образом, эти данные говорят о наличии ДАМ-колец вокруг микротрубочек, связанных с шариками, в присутствии Daml в растворе При этом на самих микротрубочках во флуоресцентном канале видны неподвижные ДАМ-пятна, которые, следовательно, являются кандидатами на ДАМ-кольца

Более детальная обработка экспериментов с лазерной ловушкой показала наличие прецессии оси ДАМ-кольца вокруг оси микротрубочки, которая также наблюдается и в теории

ДАМ-кольпа m vitro двигаются по механизму силового давления В дальнейшем я решил выяснить - как влияет разборка микротрубочки на движение ДАМ-колец В этих экспериментах проточная камера с микротрубочками, выращенными из аксонем, приготовлялась, как описано в «методах и материалах» При этом в конце промывки проточной камеры в нее добавлялся буфер Б с Daml с такой концентрацией, чтобы на микротрубочках образовались отчетливо видимые ДАМ-пятна, которые, как было показано выше, представляли собой ДАМ-кольца Исходя из верхней оценки коэффициента диффузии таких пятен, глубина ДАМ-потенциала взаимодействия имеет значение > 6-7 квТ И, следовательно, такое кольцо при деполимеризации микротрубочки должно было бы двигаться по механизму силового давления Т к механизм диффузии со смещением не может объяснить, как малоподвижное ДАМ-кольцо двигается со скоростями 7 2 ± 0 3 мкм/мин (N = 209), померенными в этих экспериментах Как видно из графика на рис 8, такая скорость движения ДАМ-кольца соответствует глубине ДАМ-потенциала порядка 13-14 квТ, при которой также наблюдается согласие со структурными данными ДАМ-колец, полученных с помощью электронной микроскопии, см рис 3 Но тогда из-за такого сильного связывания наблюдалась бы остановка ДАМ-кольца, движущегося за деполимеризующим концом микротрубочки, при столкновении с любым ниже лежащим на микротрубочке ДАМ-кольцом, но в [Westermann 2006] наблюдалось скоплением ДАМ-пятеп на конце деполимеризующегося конца микротрубочки без замедления скорости деполимеризации Поэтому было решено воспроизвести опыты [Wester-

mann 2005, 2006] в нашей системе, где инициация деполимеризации микротрубочек происходила с помощью промывки проточной камеры от свободноплавающих димеров тубулина. Непосредственно перед этим на микротрубочках можно было видеть в основном образование очень слабых ДАМ-шгген, диффундировавших вдоль микротрубочек, в отличие от четких неподвижных ДАМ-пятен, образовавшихся при использовании стандартного протокола. Это свидетельствует о том, что это были по большой части ДАМ-патчи с редко попадающимися ДАМ-кольцами на микротрубочках. Поэтому можно заключить, что плавающий в растворе тубу-лин, по-видимому, обладает инги-баторным действием на образование ДАМ-колец на микротрубочках.

При деполимеризации микротрубочек можно было действительно наблюдать увеличение интенсивности концевого ДАМ-пятна (см. рис. 16), что объясняется не сбором ДАМ-колец, как делали это авторы в [Westermann 2005,20061, а накоплением более подвижных ДАМ-патчей на конце микротрубочки, возможно при этом упаковывающихся в ДАМ-кольцо. Если же ДАМ-пятно, следующее за деполимеризующимся концом микротрубочки, наталкивалось во время своего движения на другое яркое ДАМ-пятно (ДАМ-кольцо), то происходила остановка деполимеризации микротрубочки. В таком положении система обычно находилась несколько секунд, после чего движение концевого ДАМ-пятна восстанавливалось. При этом было заметно понижение интенсивности концевого пятна по сравнению с тем, которое оно имело во время паузы. Это свидетельствует о сбрасывании с конца микротрубочки липших DamI комплексов. Чтобы определить, какое из двух ДАМ-шгген на микротрубочке - ближнее или дальнее от разби-

время, С

Рис. 16. Графики зависимости положения концевого флуоресцентного ДАМ-пятна (черный) относительно минус конца микротрубочки и его относительной интенсивности (серый) с течением времени при деполимеризации микротрубочки. Слева графика показано начальное изображение микротрубочки, покрытой ДАМ-пятнами. Видны только наиболее яркие пятна, хотя в микроскоп можно было наблюдать и очень слабые ДАМ-патчи, диффундирующие вдоль микротрубочки.

рающегося конца, продолжает движение после окончания паузы, были сделаны эксперименты с обесцвечиванием крашенных Daml комплексов путем облучения их лазером с длиной волны 488 нм. Оказалось, что при вхождении в эту зону обесцвечивания, интенсивность концевого ДАМ-пятна резко падала, а затем возрастала после выхода из зоны. Это говорит о том, что при столкновении одного ДАМ-пятна с другим во время деполимеризации микротрубочки разбирается то, которое стоит ближе к концу микротрубочки, а дальнее от конца пятно затем продолжает движение.

Эти экспериментальные данные не описываются моделью Хилла [Hill, 1985].

ДАМ-кольца С-мутанта Daml двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем в случае нативного Daml. скоростями. В статьях [Wang, Miranda 2007] было показано, что С-концы Damlp белков подходят на роль линкеров между ДАМ-кольцом и микротрубочкой,

поэтому возникает вопрос - как же влияет отсутствие этих линкеров на движение ДАМ-колец, которые все еще образуются вокруг микротрубочек, хотя и при больших концентрациях. Для этой цели были поставлены эксперименты, в которых из аксонем, прикрепленных к покровному стеклу проточной камеры, выращивались микротрубочки, растущие внутрь проточной камеры. Затем туда вмывался С-мутантный Daml комплекс, у которого были удалены С-концы Damlp белков. Большинство ДАМ-пятен, образовавшихся вдоль микротрубочек, обладали довольно таки сильной диффузией и не большой яркостью, что говорит об образовании ДАМ-патчей на микротрубочках мутантным Daml комплексом и о его пониженных свойствах образовывать ДАМ-кольца, хотя они иногда присутствовали на микротрубочках. При этом при инициализации деполимеризации микротрубочек можно бы-

Рис. 17. Справа изображена кимограмма движения концевого ДАМ-пятна, состоящего из С-мутантного Оат1. при деполимеризации микротрубочки. Слева изображены графики зависимости положен™ концевого ДАМ-пятна относительно минус конца микротрубочки (черный) и его относительной яркости с течением времени, построенные для этой кимограммы (серый).

ло наблюдать увеличении яркости концевого ДАМ-пятна с ростом пройденного расстояния, см. рис. 17. А средняя скорость его движения была равна 20 ± 1 мкм/мин (N = 177), т.е. очень близка к скорости разборке свободной микротрубочки, и приблизительно в три раза больше, чем для ДАМ-колец, состоящих из нативного Daml, см. диаграмму на рис. 18. Эти экспериментальные данные говорят о том, что в природе не реализуется качественная гипотеза электростатического скольжения ДАМ-кольца [Wang, 2007].

ВЫВОДЫ

1. На основе последних экспериментальных данных построена детальная молекулярно-механическая модель взаимодействия микротрубочки и ДАМ-кольца, включающая в себя гипотезу линкеров - белковых мостиков, соединяющих ДАМ-кольцо с микротрубочкой.

2. С помощью полученной математической модели показано, что кольцо с жесткими линкерами обладает малым КПД ~10%, в то время как линкеры с маленькой изгибной жесткостью позволяют кольцу эффективно преобразовывать энергию деполимеризации микротрубочки в полезную механическую работу с КПД - 50% даже при сильном связывании линкеров с поверхностью микротрубочки ~ 13 кТ.

3. Показано, что в модели существует два типа движения кольца при разборке микротрубочки - по механизму диффузии со смещением при слабом связывании линкеров с микротрубочкой и по механизму силового давления при сильном связывании. При этом во втором случае наблюдается перешагивание линкеров кольца с одного сайта связывания на микротрубочке в другой подобно движению кинезинов.

4. На основе экспериментальных измерений доказано, что ДАМ-кольца двигаются по

2 n <jn

ЕВ бш Dami. N=57 CD дикий тип Demi, N=209 HDamt-18. N=177

10 20 30 40 50 60 70 скорость деполимеризации, мкм/мин

Рис. 18. Диаграммы распределения скоростей движения концевых ДАМ-пятен при деполимеризации микротрубочек для случая нативного Оат1 (белая) и С-мутантного Оат1 (черная). Также приведена диаграмма распределения скоростей деполимеризации микротрубочек в отсутствии какого бы то ни было Баш! (серая).

механизму силового давления во время деполимеризации микротрубочек Во время этого процесса наблюдается прецессия оси кольца вокруг оси микротрубочки

5 Экспериментально показано существование ни кем ранее не описанных не кольцевых ДАМ-стурктур, которые в отличие от ДАМ-колец имеют большой коэффициент диффузии вдоль микротрубочки

6 При деполимеризации микротрубочек не кольцевые ДАМ-патчи следуют за разбирающимся концами микротрубочек подобно ДАМ-кольцам

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Molodtsov МI, Gnshchuk Е L , Efrcmov А.К, Mcintosh J R, Ataullakhanov FI 2005 Force production by depolymcnzmg microtubules a theoretical study Proc Natl Acad Sci USA, 102 4353-8

2 Efrcmov A.K., Gnshchuk E L, Mcintosh J R, Ataullakhanov FI 2007 In search of an optimal ring to couple microtubule depolymenzation to processive chromosome motions Proc Natl Acad Sci USA, 104 19017-22

3 Ефремов А К., Кочиков И В , Трубецков М К, Тихонравов А В , Атауллаханов Ф И, Механическая модель микротрубочки // III Съезд Биофизиков России, сборник тезисов докладов, Воронеж, 24-29 июня 2004, стр 38

4 Е L Gnshchuk, М I Molodtsov, A.K.Yefremov, IS Spindonov, FI Ataullakhanov and J R Mcintosh. 2006 Mechanisms of poleward chromosome movement 2006 46lh annual ASCB meeting December 9-13 San Diego, CA

5 EL Gnshchuk, A.K. Efremov, I S Spindonov, VA Volkov, S Westermann, IM Cheeseman, A Desai, D Drubin, G Barnes, F I Ataullakhanov, J R Mcintosh Biomechamcal design of molecular couplers that transduce microtubule depolymenzation into chromosome movement 2007 47th annual ASCB meeting December 1-5 Washington, DC p 451

6 J Mcintosh, M Morphew, D Mastronarde, A. Yefremov, К Zhudenkov, E Gnshchuk, F Ataullakhanov Kmetochore-microtubule interactions visualized by EM tomography 2007 47th annual ASCB meeting December 1-5 Washington, DC p 603

7 Жуденков K.B, Ефремов A.K., Гршцух E Л, МакИнтош Р , Атауллаханов О И Исследование структуры кинетохорных элементов, взаимодействующих с микротрубочкой 11-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", сборник тезисов докладов Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, стр 9

Подписано в печать 22 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 324 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Ефремов, Артем Константинович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Митоз.

1.2 Микротрубочки.

1.2.1 Структура микротрубочек.

1.2.2 Динамическая нестабильность.

1.3 Строение кинетохора.

1.4 Daml комплекс и ДАМ-кольцо in vitro.

1.4.1 Структурные данные.

1.4.2 Динамические характеристики.

1.5 Модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки.

1.5.1 Механизм диффузии со смещением.

1.5.2 Механизм силового давления.

1.5.3 Электростатический механизм.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ МИКРОТРУБОЧКИ И ДАМ

КОЛЫДА

2.1 Модель микротрубочки.

2.2 Модель ДАМ-кольца и его взаимодействия с микротрубочкой.

2.3 Выбор значений констант модели.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Компьютерные алгоритмы.

3.1.1 Метод Метрополиса Монте-Карло.

3.1.2 Генератор случайных чисел.

3.2 Экспериментальные методы и материалы.

3.2.1 Приготовление тубулина и нуклеирующих центров.

3.2.2 Проточная камера.

3.2.3 Подготовка камеры к эксперименту.

3.2.4 Приготовление микрошариков, покрытых Daml комплексами.

3.2.5 Коррекция интенсивности флуоресценции при обработке результатов экспериментов.

3.2.6. Принцип действия лазерной ловушки.

3.2.7 Инструменты и сбор данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца с микротрубочкой.

4.2 ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки.

4.3 Слабосвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо движется по механизму диффузии со смещением.

4.4 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания.

4.5 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо обладает более лучшими динамическими характеристиками, чем слабосвязывающееся ДАМ-кольцо.

4.6 На закрепленных к покровному стеклу микротрубочках образуются как нормальные ДАМ-кольца, так и ДАМ-структуры в виде недостроенных ДАМ-колец.

4.7 Микрошарики, покрытые Daml комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обладают высокой процессивностью движения.

4.8 Уменьшение плотности покрытия Daml комплексом поверхности шариков ведет к уменьшению их скорости движения за деполиме-ризующимися концами микротрубочек.

4.9 Подтверждение существования ДАМ-колец между шариками и микротрубочкой в присутствии растворенного Daml в эксперименте с лазерной ловушкой.

4.10 ДАМ-кольца in vitro двигаются по механизму силового давления.

4.11 ДАМ-кольца С-мутанта Dami двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем в случае нативного Daml, скоростя

4.12 ДАМ-кольцо, движущиеся за деполимеризующимся концом микротрубочки, совершает прецессивные колебания.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками"

Микротрубочки - биополимеры цитоскелета, играющие важную роль в жизни клетки. Они активно участвуют в поддержании формы клетки и транспортной системе. Но самая критически важная функция микротрубочек - распределение точных копий генетического материала по дочерним клеткам во время деления клетки - митоза. Для решения этой задачи природа в течение эволюции создала специальный белковый комплекс, собирающийся на центромерном участке каждой хроматиды, — кинетохор. За него во время митоза могут зацепляться микротрубочки, участвующие в транспорте хромосом. Раньше считалось, что за перемещение хромосом в митозе отвечают моторные белки на кинетохоре, а кинетохорные микротрубочки просто играют роль «рельсов» по которым идут эти белки. Однако недавно показано [Grish-chuk 2006, Huang 2006], что это не совсем верно, так как для транспорта хромосом во время митоза необходимо и достаточно только наличие динамической нестабильности микротрубочек. Явление динамической нестабильности микротрубочек состоит в том, что каждая микротрубочка может находиться в двух состояниях — быстрой разборки или медленного роста [Walker 1988]. Причем переход из одного состояния в другое является случайным процессом у свободных микротрубочек, который называется катастрофой при переходе от роста к разборке или спасением при обратном процессе. С окращающаяся микротрубочка, зацепленная за кинетохор, тянет за собой хромосому, в то время как растущая микротрубочка наоборот толкает хромосому. Поэтому благодаря динамической нестабильности кинетохорных микротрубочек наблюдаются характерные колебания хромосом во время прометафазы и метафазы во время митоза между полюсами веретена деления. То, что микротрубочки действительно могут создавать силы достаточные для движения хромосом во время митоза, было показано экспериментально [Grishchuk 2005]. Более того, именно эта сила, создаваемая разбирающимися кинетохорными микротрубочками, является наиболее важной для сегрегации хромосом [Grishchuk 2006]. Однако до сих пор ни одна из существующих моделей взаимодействия кинетохора и микротрубочки [Hill 1985, Jogle-kar 2002, Molodtsov 2005b, Jian Liu 2006], несмотря на их частичные успехи, не может полностью описать структурные данные и динамические характеристики кинетохорных белковых копмлексов [Miranda 2005, 2007, Westermann 2005, 2006, Wang 2007]. Кроме того ни одна из этих моделей не может объяснить как достигается высокая 5 эффективность движения кинетохора за разбирающимся концом микротрубочки при очень сильном связывании кинетохора с микротрубочкой [Westermann 2005, 2006].

Целью данной работы было создание модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки, описывающей все известные на сегодняшний день экспериментальные данные об их структуре и динамическом поведении. С помощью этой модели предсказать, а затем и провести новые эксперименты для выяснения источников разногласий в уже существующих данных. Также выяснить с помощью теории и эксперимента механизм движения кинетохора при деполимеризации кинетохорной микротрубочки.

Задачи исследования:

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре и кинетики деполимеризации. При этом модель должна включать в себя тепловые флуктуации, которые не были учтены ни в одной предшествующей модели микротрубочки.

2. Создать и объединить с моделью микротрубочки модель кинетохорных белковых комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, основываясь на их структурных и динамических данных.

3. С помощью получившейся математической модели определить, какими свойствами должны обладать кинетохорные белки, взаимодействующие с микротрубочкой, для наиболее эффективного развития тянущей силы деполимери-зующейся кинетохорной микротрубочкой.

4. Понять, как удается кинетохорным белковым комплексам быть сильно связанными с микротрубочкой и при этом быстро передвигаться.

5. Экспериментально определить по какому из известных теоретических механизмов происходит движение кинетохора во время деления клетки.

Научная новизна:

Была разработана наиболее полная модель кинетохора и его взаимодействия с микротрубочкой, включающая в себя все известные на сегодняшний день структурные и динамические экспериментальные данные. В результате введения дополнительной гипотезы в модель о существовании подвижных белковых мостиков - линкеров у кинетохора, ответственных за связывание со стенкой микротрубочки, было показано, каким образом удается совместить высокую эффективность движения кинетохора вдоль микротрубочки с сильным связыванием кинетохора и микротрубочки. Этого свойства кинетохора до сих пор не могла объяснить ни одна существующая на сей день математическая модель. Не смотря на такое чисто теоретическое предположение, подобные линкеры были совсем недавно обнаружены на электронных фотографиях [Wang 2007], что свидетельствует в пользу созданной нами модели. Сравнение результатов модели с существующими экспериментальными данными по динамике кинетохорного белкового комплекса, ответственного за зацепление хромосомы к микротрубочкам, показало, что в природе реализуется силовой механизм движения (power stroke mechanism) кинетохора при разборке микротрубочки, а не механизм диффузии со смещением (biased diffusion mechanism). Этот результат также подтверждается проведенными мной экспериментальными исследованиями. Кроме того теоретические расчеты показали, что кинетохор движется наподобие моторных белков — его линкеры перешагивают из одного сайта взаимодействия на микротрубочке в другой, используя вместо энергии АТФ энергию упругих напряжений, запасенную в стенке микротрубочки. Подобный механизм движения до сих пор не был никем описан. Кроме того нами было экспериментально показано существование in vitro никем ранее не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов, участвующих в делении клеток, очень важно при изучении развития раковых заболеваний. Знание процессов, протекающих во время митоза и принципов их действия, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание механизма движения и взаимодействия кинетохора с микротрубочкой, а также выяснение механизма генерации сил, развиваемых кинетохорными микротрубочками во время деления клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана оригинальная математическая модель взаимодействия микротрубочки и кинетохора, хорошо согласующаяся со всеми существующими экспериментальными данными.

2. С помощью полученной математической модели определены необходимые свойства кинетохорных белков, связывающихся с микротрубочкой, для обеспечения наиболее эффективного функционирования кинетохора.

3. Показано, каким образом можно совместить в кинетохоре два противоречивых свойства - сильное связывание с микротрубочкой и высокую подвижность.

4. Экспериментально определен механизм, по которому происходит движение кинетохора во время деления клетки.

5. Экспериментально показано существование ранее никем не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ефремов, Артем Константинович

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. На основе последних экспериментальных данных построена детальная моле-кулярно-механическая модель взаимодействия микротрубочки и ДАМ-кольца, включающая в себя гипотезу линкеров - белковых мостиков, соединяющих ДАМ-кольцо с микротрубочкой.

2. С помощью полученной математической модели показано, что кольцо с жесткими линкерами обладает малым КПД ~10%, в то время как линкеры с маленькой изгибной жесткостью позволяют кольцу эффективно преобразовывать энергию деполимеризации микротрубочки в полезную механическую работу с КПД ~ 50% даже при сильном связывании линкеров с поверхностью микротрубочки ~ 13 кТ.

3. Показано, что в модели существует два типа движения кольца при разборке микротрубочки — по механизму диффузии со смещением при слабом связывании линкеров с микротрубочкой и по механизму силового давления при сильном связывании. При этом во втором случае наблюдается перешагивание линкеров кольца с одного сайта связывания на микротрубочке в другой подобно движению кинезинов.

4. На основе экспериментальных измерений доказано, что ДАМ-кольца двигаются по механизму силового давления во время деполимеризации микротрубочек. Во время этого процесса наблюдается прецессия оси кольца вокруг оси микротрубочки.

5. Экспериментально показано существование ни кем ранее не описанных некольцевых ДАМ-стурктур, которые в отличие от ДАМ-колец имеют большой коэффициент диффузии вдоль микротрубочки.

6. При деполимеризации микротрубочек некольцевые ДАМ-патчи следуют за разбирающимся концами микротрубочек на подобии ДАМ-колец.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении выражаю свою глубокую благодарность научному руководителю доктору биологических наук профессору Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову и профессору Ричарду Макинтошу из университета штата Колорадо за плодотворные научные дискуссии и ценные замечания. Также хочу поблагодарить докторов физико-математических наук Кочикова Игоря Викторович, Трубецкого Михаил Кирилловича из Научно Исследовательского Вычислительного Центра при МГУ им. Ломоносова и директора Научно Исследовательского Вычислительного Центра при МГУ им. Ломоносова доктора физико-математических наук Тихонравова Александра Владимировича за интересные идеи и обсуждения при порграммировании математической модели. Неоценимую помощь при приготовлении белков и реагентов для проведения эксперимента оказали Максим Молодцов, Пола Гриссом и Томас Фидлер. Данная работа невозможна была бы без помощи Екатерины Грищук, которая обучила меня работе на микроскопе и помогла в проведении многих сложных экспериментов. Большое спасибо Илье Спиридонову, Володе Волкову и Кириллу Жуденкову за помощь в обработке и оформлении результатов. И, конечно же, огромное спасибо Да-ниелле Никастро за дружескую поддержку в трудные минуты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Ефремов, Артем Константинович, Москва

1. Alberts В. 1989. Molecular biology of the cell. (Garland, New York)

2. Asbury C.L., Gestaut D.R., Powers A.F., Franck A.D., Davis T.N. 2006. The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9873-8.

3. Ashkin A. 1970. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys. Rev. Lett., 24:156-9.

4. Biggins S., Severin F.F., Bhalla N., Sassoon I., Hyman A.A., Murray A.W. 1999. The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev., 13:532-44.

5. Block S.M., Svoboda K. 1995. Analysis of high resolution recordings of motor movement. Biophys. J., 68:230S-241S.

6. Block S.M., Asbury C.L., Shaevitz J.W., Lang M.J. 2003. Probing the kinesin reaction cycle with a 2D optical force clamp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2351-6.

7. Brouhard G.J., Schek H.T. 3rd, Hunt A.J. 2003. Advanced optical tweezers for the study of cellular and molecular biomechanics. IEEE Trans. Biomed. Eng., 50:1215.

8. Caplow M., Shanks J. 1990. Mechanism of the microtubule GTPase reaction. J. Biol. Chem., 265:8935-41.

9. Caplow M., Shanks J. 1996. Evidence that a single monolayer tubulin-GTP cap is both necessary and sufficient to stabilize microtubules. Mol. Biol. Cell, 7:663-75.

10. Carlier M.F., Pantaloni D. 1982. Assembly of microtubule protein: role of guano-sine di- and triphosphate nucleotides. Biochemistry, 21:1215-24.

11. Carmichael R.D. 1909-1910. Note on a new number theory function. Bull. Amer. Math. Soc., 16:232-8.

12. Chan C.S., Botstein D. 1993. Isolation and characterization of chromosome-gain and increase-in-ploidy mutants in yeast. Genetics, 135:677-91.

13. Cheeseman I.M., Drubin D.G., Barnes G. 2002a. Simple centromere, complex kinetochore: linking spindle microtubules and centromeric DNA in budding yeast. J. Cell Biol., 157:199-203.

14. Cheeseman I.M., Anderson S., Jwa M., Green E.M., Kang J., Yates J.R. 3rd, Chan C.S., Drubin D.G., Barnes G. 2002b. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipllp. Cell, 111:163-72.

15. Cheeseman I.M., Niessen S., Anderson S., Hyndman F., Yates J.R. 3rd, Oegema K., Desai A. 2004. A conserved protein network controls assembly of the outer kineto-chore and its ability to sustain tension. Genes Dev., 18:2255-68.

16. Cheeseman I.M., Chappie J.S., Wilson-Kubalek E.M., Desai A. 2006. The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kineto-chore. Cell, 127:983-97.

17. Chretien D., Fuller S.D., Karsenti E. 1995. Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol., 129:1311-28.

18. Chretien D., Flyvbjerg H., Fuller S.D. 1998. Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur. Biophys. J., 27:490-500.

19. Cleveland D.W., Mao Y., Sullivan K.F. 2003. Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell, 112:407-21.

20. Coveyou R.R. 1960. Serial correlation in the generation of pseudorandom numbers. J.A.C.M., 7:72-74.

21. De Wulf P., McAinsh A.D., Sorger P.K. 2003. Hierarchical assembly of the budding yeast kinetochore from multiple subcomplexes. Genes Dev., 17:2902-21.

22. Desai A., Rybina S., Muller-Reichert Т., Shevchenko A., Hyman A., Oegema K. 2003. KNL-1 directs assembly of the microtubule-binding interface of the kinetochore in C. elegans. Genes Dev., 17:2421-35.

23. Downing K.H., Nogales E. 1998a. New insights into microtubule structure and function from the atomic model of tubulin. Eur. Biophys. J. 27:431-6.

24. Downing K.H., Nogales E. 1998b. Tubulin and microtubule structure. Curr. Opin. Cell Biol. 10:16-22.

25. Erickson H.P., O'Brien E.T. 1992. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 21:145-66.

26. Espelin C.W., Kaplan K.B., Sorger P.K. 1997. Probing the architecture of a simple kinetochore using DNA-protein crosslinking. J. Cell Biol., 139:1383-96.

27. Espelin C.W., Simons K.T., Harrison S.C., Sorger P.K. 2003. Binding of the essential Saccharomyces cerevisiae kinetochore protein NdclOp to CDEII. Mol. Biol. Cell, 14:4557-68.

28. Feigner H., Frank R., Schliwa M. 1996. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J. Cell Sci., 109:509-16.

29. Fichthorn K.A., Weinberg W.H. 1991. Theoretical foundations of dynamical Monte Carlo simulations. J. Chem. Phys., 95:1090-6.

30. Francisco L., Chan C.S. 1994. Regulation of yeast chromosome segregation by Ipll protein kinase and type 1 protein phosphatase. Cell. Mol. Biol. Res., 40:207-13.

31. Fygenson D.K., Braun E., Libchaber A. 1994. Phase diagram of microtubules. Phys. Rev. E Stat. Phys. Plasmas Fluids Relat. Interdiscip. Topics, 50:1579-88.

32. Gigant В., Curmi P.A., Martin-Barbey C., Charbaut E., Lachkar S., Lebeau L., Sia-voshian S., Sobel A., Knossow M. 2000. The 4 A X-ray structure of a tubu-lin:stathmin-like domain complex. Cell, 102:809-16.

33. Gillett E.S., Espelin C.W., Sorger P.K. 2004. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J. Cell Biol., 164:535-46.

34. Greenberger M. 1961. An A priori determination of serial correlation in computer generated random numbers. Math. Comput., 15:383-9.

35. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., Ataullakhanov F.I., Mcintosh J.R. 2005. Force production by disassembling microtubules. Nature, 438:384-8.

36. Grishchuk E.L., Mcintosh J.R. 2006. Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. EMBO J., 25:4888-96.

37. Gupta M.L.Jr., Carvalho P., Roof D.M., Pellman D. 2006. Plus end-specific de-polymerase activity of Kip3, a kinesin-8 protein, explains its role in positioning the yeast mitotic spindle. Nat. Cell Biol., 8:913-23.

38. He X., Rines D.R., Espelin C.W., Sorger P.K. 2001. Molecular analysis of kineto-chore-microtubule attachment in budding yeast. Cell, 106:195-206.

39. Heermann D.W. 1990. Computer Simulation Methods in Theoretical Physics. (Springer, New York).

40. Hill T.L. 1985. Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4404-8.

41. Hofmann С., Cheeseman I.M., Goode B.L., McDonald K.L., Barnes G., Drubin D.G. 1998. Saccharomyces cerevisiae Duolp and Damlp, novel proteins involved in mitotic spindle function. J. Cell Biol., 143:1029-40.

42. Huang В., Huffaker T.C. 2006. Dynamic microtubules are essential for efficient chromosome capture and biorientation in S. cerevisiae. J. Cell Biol., 175:17-23.

43. Hyman A.A., Middleton K., Centola M., Mitchison T.J., Carbon J. 1992a. Micro-tubule-motor activity of a yeast centromere-binding protein complex. Nature, 359:533-6.

44. Hyman A.A., Salser S., Drechsel D.N., Unwin N. Mitchison T.J. 1992b. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell, 3:1155-67.

45. Jian Liu, Onuchic J.N. 2006. A driving and coupling "Pac-Man" mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:18432-7.

46. Jiang L., Gao Y., Mao F., Liu Z., Lai L. 2002. Potential of mean force for protein-protein interaction studies. Proteins, 46:190-6.

47. Joglekar A.P., Hunt A.J. 2002. A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys J., 83:42-58.

48. Joglekar A.P., Bouck D.C., Molk J.N., Bloom K.S., Salmon E.D. 2006. Molecular architecture of a kinetochore-microtubule attachment site. Nat. Cell Biol., 8:581-5.

49. Kikkawa M., Ishikawa Т., Nakata Т., Wakabayashi Т., and Hirokawa N. 1994. Direct visualization of the microtubule lattice seam both in vitro and in vivo. J. Cell Biol., 127:1965-71.

50. Kitagawa K., Hieter P. 2001. Evolutionary conservation between budding yeast and human kinetochores. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2:678-87.

51. Koshland D.E., Mitchison T.J., Kirschner M.W. 1988. Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature, 331:499-504.

52. Kwok B.H., Yang J.G., Kapoor T.M. 2004. The rate of bipolar spindle assembly depends on the microtubule-gliding velocity of the mitotic kinesin Eg5. Curr. Biol., 14:1783-8.

53. Lang M.J., Asbury C.L., Shaevitz J.W., Block S.M. 2002. An Automated Two-Dimensional Optical Force Clamp for Single Molecule Studies. Biophys. J., 83:491-501.

54. Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. 1993. Principles of Biochemistry. (Worth, New York), 2nd Ed., p. 377.

55. Li Y., Bachant J., Alcasabas A.A., Wang Y., Qin J., Elledge S.J. 2002. The mitotic spindle is required for loading of the DASH complex onto the kinetochore. Genes Dev., 16:183-97.

56. Lombillo V.A., Stewart R.J., Mcintosh J.R. 1995. Minus-end-directed motion of ki-nesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature, 373: 161-4.

57. Mandelkow E.M., Mandelkow E. 1985. Unstained microtubules studied by cryo-electron microscopy. Substructure, supertwist and disassembly. J. Mol. Biol., 181:123-35.

58. Mandelkow E.M., Mandelkow E., Milligan R.A. 1991. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study. J. Cell Biol., 114:977-91.

59. McAinsh A.D., Tytell J.D., Sorger P.K. 2003. Structure, function, and regulation of budding yeast kinetochores. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 19:519-39.

60. Meluh P.B., Koshland D. 1995. Evidence that the MIF2 gene of Saccharomyces ce-revisiae encodes a centromere protein with homology to the mammalian centromere protein CENP-C. Mol. Biol. Cell, 6:793-807.

61. Meraldi P., McAinsh A.D., Rheinbay E., Sorger P.K. 2006. Phylogenetic and structural analysis of centromeric DNA and kinetochore proteins. Genome Biol., 7:R23.

62. Meurer-Grob P., Kasparian J., Wade R. H. 2001. Microtubule structure at improved resolution. Biochem. 40:8000-8.

63. Middleton К., Carbon J. 1994. KAR3-encoded kinesin is a minus-end-directed motor that functions with centromere binding proteins (CBF3) on an in vitro yeast ki-netochore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:7212-6.

64. Miranda J.J., De Wulf P., Sorger P.K., Harrison S.C. 2005. The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat. Struct. Mol. Biol., 12:138-43.

65. Miranda J.J., King D.S., Harrison S.C. 2007. Protein arms in the kinetochore-microtubule interface of the yeast DASH complex. Mol. Biol. Cell, 18:2503-10.

66. Mitchison Т., Kirschner M. 1984. Dynamic instability of microtubule growth. Nature, 312:237-42.

67. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., Mcintosh J.R., Ataullakhanov F.I. 2005b. Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:4353-8.

68. Munson K.M, Mulugeta P.G., Donhauser Z J. 2007. Enhanced Mechanical Stability of Microtubules Polymerized with a Slowly Hydrolyzable Nucleotide Analogue. J. Phys. Chem. B, 111:5053-7.

69. Nicholson W.V., Lee M., Downing K.H., Nogales E. 1999. Cryo-electron microscopy of GDP-tubulin rings. Cell Biochem. Biophys., 31:175-83.

70. Nicklas B. 1983. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol., 97:542-8.

71. Nogales E., Whittaker M., Milligan R.A., Downing K.H. 1999. High-Resolution Model of the Microtubule. Cell. 96:79-88.

72. Ortiz J., Stemmann 0., Rank S., Lechner J. 1999. A putative protein complex consisting of Ctfl9, Mcm21, and Okpl represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes Dev., 13:1140-55.

73. Perez F., Diamantopoulos G.S., Stalder R., Kreis Т.Е. 1999. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell, 96:517-27.

74. Peskin C.S., Oster G.F. 1995. Force production by depolymerizing microtubules: load-velocity curves and run-pause statistics. Biophys. J., 69:2268-76.

75. Pinsky B.A., Biggins S. 2005. The spindle checkpoint: tension versus attachment. Trends Cell Biol., 15:486-93.

76. Pinsky B.A., Kung C., Shokat K.M., Biggins S. 2006. The Ipll-Aurora protein kinase activates the spindle checkpoint by creating unattached kinetochores. Nat. Cell Biol., 8:78-83.

77. Rieder C.L., Salmon E.D. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol., 8:310-8.

78. Sanchez-Perez I., Renwick S.J., Crawley K., Karig I., Buck V., Meadows J.C., Franco-Sanchez A., Fleig U., Toda Т., Millar J.B. 2005. The DASH complex and Klp5/Klp6 kinesin coordinate bipolar chromosome attachment in fission yeast. EMBO J., 24:2931-43.

79. Sandall S., Severin F., McLeod I.X., Yates J.R. 3rd, Oegema K., Hyman A., Desai A. 2006. A Birl-Slil5 complex connects centromeres to microtubules and is required to sense kinetochore tension. Cell, 127:1179-91.

80. Sandblad L., Busch K.E., Tittmann P., Gross H., Brunner D., Hoenger A. 2006. The Schizosaccharomyces pombe EB1 homolog Mal3p binds and stabilizes the microtubule lattice seam. Cell, 127:1415-24.

81. Sheetz M.P. 1998. Laser tweezers in cell biology. Methods in cell biology, vol. 55 (Academic press, San Diego).

82. Smith M.M. 2002. Centromeres and variant histones: what, where, when and why? Curr. Opin. Cell Biol., 14:279-85.

83. Steinmetz M.O., Kammerer R.A., Jahnke W., Goldie K.N., Lustig A., van Oostrum J. 2000. Opl8/stathmin caps a kinked protofilament-like tubulin tetramer. EMBO J., 19:572-80.

84. Tanaka K., Mukae N., Dewar H., van Breugel M., James E.K., Prescott A.R., Antony C., Tanaka T.U. 2005. Molecular mechanisms of kinetochore capture by spindle microtubules. Nature, 434:987-94.

85. Tao Y.C., Peskin C.S. 1998. Simulating the role of microtubules in depolymeriza-tion driven transport: a Monte Carlo approach. Biophys. J., 75:1529-40.

86. Tytell J.D., Sorger P.K. 2006. Analysis of kinesin motor function at budding yeast kinetochores. J. Cell Biol., 172:861-74.

87. VanBuren V., Cassimeris L., Odde D.J. 2005. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys. J., 89:2911-26.

88. Varga V., Helenius J., Tanaka K., Hyman A.A., Tanaka T.U., Howard J. 2006. Yeast kinesin-8 depolymerizes microtubules in a length-dependent manner. Nat. Cell Biol., 8:957-62.

89. Visscher K., Block S.M. 1998. Versatile optical traps with feedback control. Methods Enzymol., 298:460-89.

90. Visscher K., Schnitzer M.J., Block S.M. 1999. Single kinesin molecules studied with a molecular force clamp. Nature, 400:184-9.

91. Visscher K., Schnitzer M.J., Block S.M. 1999. Single kinesin molecules studied with a molecular force clamp. Nature, 400:184-9.

92. Walker R.A., O'Brien Т., Pryer N.K., Soboeiro M.F., Voter W.A., Erickson H.P., Salmon D.E. 1988. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J. Cell Biol., 107: 1437-48.

93. Wei R.R., Sorger P.K., Harrison S.C. 2005. Molecular organization of the Ndc80 complex, an essential kinetochore component. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:5363-7.

94. Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y., M.W. Kirschner. 1975. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1858-62.

95. Westermann S., Cheeseman I.M., Anderson S., Yates J.R. 3rd, Drubin D.G., Barnes G. 2003. Architecture of the budding yeast kinetochore reveals a conserved molecular core. J. Cell Biol., 163:215-22.

96. Westermann S., Avila-Sakar A., Wang H.W., Niederstrasser H., Wong J., Drubin D.G., Nogales E., Barnes G. 2005. Formation of a dynamic kinetochore-microtubule interface through assembly of the Daml ring complex. Mol. Cell, 17:277-90.

97. Westermann S., Wang H.W., Avila-Sakar A., Drubin D.G., Nogales E., Barnes G. 2006. The Daml kinetochore ring complex moves processively on de-polymerizing microtubule ends. Nature, 440:565-9.

98. Westermann S., Drubin D.G., Barnes G. 2007. Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu. Rev. Biochem., 76:563-91.

99. Winey M., Mamay C.L., O'Toole E.T., Mastronarde D.N., Giddings Т.Н.Jr., McDonald K.L., Mcintosh J.R. 1995. Three-dimensional ultrastructural analysis of the Saccharomyces cerevisiae mitotic spindle. J. Cell Biol., 129:1601-15.