Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса"

На правах рукописи

Зайцев Анатолий Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРОТРУБОЧЕК С БЕЛКАМИ КИНЕТОХОРНОГО КОМПЛЕКСА

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9АПР 2015

Москва-2015

005568159

005568159

Работа выполнена совместно в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук (ЦТП ФХФ РАН) и в Университете Пенсильвании (Филадельфия, США).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Фазоил Иноятович Атауллаханов (директор ЦТП ФХФ РАН) Научный консультант: профессор Екатерина Грищук

(университет Пенсильвании, г. Филадельфия, США) Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Морозов Виктор Николаевич (зав.лаб. лаборатории наноструктур и нанотехнологий Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН) доктор биологических наук, профессор Надеждина Елена Сергеевна (г.н.с., руководитель группы клеточной биологии Института белка РАН) Учреждение Российской академии наук Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН (ИИФ УрО РАН)

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится 22 апреля 2015 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.002.252.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук (ЦТП ФХФ РАН) в помещении Федерального Научно-клинического Центра детской гематологии, онкологии и иммунологии им Д. Рогачева по адресу: ул.Саморы Машела, д.1, г.Москва, ГСП-7, 117997. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина д. 4.

Автореферат разослан «_»_2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Николаева И.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Митоз является важнейшим этапом в клеточном цикле, в результате которого из одной материнской клетки образуются две дочерние клетки. Митотическое деление клеток лежит в основе развития и роста многоклеточных организмов, обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни организма, а также регенерацию после повреждений. Важнейшей задачей митоза является точное распределением генетической информации материнской клетки по двум дочерним клеткам, что обеспечит их нормальное функционирование и последующее деление. Это происходит через распределение сестринских хромосом материнской клетки по двум дочерним клеткам. Хромосомы перемещаются в процессе митоза посредством взаимодействия с митотическим веретеном - сложным митотическим аппаратом, который состоит главным образом из двух полюсов деления и растущих из них микротрубочек. Микротрубочки представляют собой динамические полимеры белка тубулина, которые случайным образом переходят из состояния полимеризации в состояние быстрой деполимеризации. Взаимодействие хромосом и микротрубочек происходит через специальные белковые структуры на хромосомах, называемые кинетохоры. Кинетохор играет ключевую роль в установлении закрепления хромосомы и веретена деления, регуляции этих закреплений в процессе митоза и поддержании этих закреплений в процессе деполимеризации микротрубочки. Механизмы того, как кинетохор взаимодействует с микротрубочками, однако, остаются плохо изученными.

Кинетохоры в клетках человека в среднем устанавливают закрепления с 2025 микротрубочками. Важнейшей особенностью взаимодействия кинетохор-микротрубочка является то, что закрепившись за кинетохор, каждая микротрубочка через некоторое время отсоединяется, т.е. взаимодействие кинетохор-микротрубочка носит динамический характер. Время полуобмена микротрубочек на кинетохоре на начальных фазах митоза составляет 2-4 минуты и к метафазе увеличивается до 4-8 минут (Стнш й а1., 2006; ОеЬиса ^ а1., 2006). На данный момент хорошо известно, что нарушения в регуляции динамики взаимодействия микротрубочек и кинетохора приводят к ошибкам в процессе деления, таким как анеуплоидия, когда дочерняя клетка получает дополнительно или теряет и одну или несколько хромосом (ВакЬоиш й а1., 2009). Анеуплоидные клетки крайне опасны для организма, так как они могут привести к возникновению раковых опухолей.

За последние десятилетия было предложено несколько теоретических моделей того, как микротрубочка может закрепляться за кинетохор. К таким моделям относятся предыдущие теоретические работы, в которых кинетохор моделировали как совокупность отдельных сайтов связывания МТ, каждый из которых содержит микротрубочко-связывающие комплексы, организованные в структуру цилиндра (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002; Shtylla and Keener, 2010) или кольца (Molodtsov et al., 2005; Liu and Onuchic, 2006; Efremov et al., 2007). Эти модели привели к значительному пониманию того, как хромосомы могут перемещаться вместе с разбирающимся концом деполимеризующейся микротрубочки. Но все предыдущие теоретические модели не рассматривали аспект динамики закрепления микротрубочки к кинетохору, и микротрубочки в данных моделях могли открепляться от кинетохора только под действием тянущей силы. Возникает необходимость разработки теоретической модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора, в которой закрепления микротрубочек будут носить динамический характер и будут обеспечиваться не через жесткие структуры типа цилиндра или кольца, существование которых в клетках млекопитающих не подтверждается экспериментально, а через ансамбль отдельных кинетохорных белков взаимодействующих с микротрубочками независимым образом.

В клетках эукариот ключевым кинетохорным белковым комплексом, взаимодействующим с микротрубочками, является комплекс NDC80 (Cheesenam et al., 2006). Кинетохор клетки человека содержит примерно 600 комплексов NDC80. Комплекс NDC80 состоит из гетеродимера Spc24-Spc25, обеспечивающего локализацию комплекса NDC80 на кинетохоре и гетеродимера Hecl-NuO, обеспечивающего связывание комплекса с микротрубочкой. Белок Heel комплекса NDC80 содержит бесструктурный полипептидный участок длиной 80 аминокислот на своем N-конце. Известно, что данный участок белка Heel необходим для связывания комплекса NDC80 с микротрубочками in vitro (Wei et al., 2007) и необходим для установления закреплений кинетохор-микротрубочка в клетках in vivo (Guimaraes et al., 2008). Данный 80-ти аминокислотный участок белка Heel содержит 9 аминокислот, являющихся мишенями для митотических киназ и известно, что фосфорилирование данных аминокислот изменяется в ходе митоза. Известно, что на начальных стадиях митоза данные аминокислоты белка Heel находятся в фосфорилированном состоянии, но в ходе митоза степень фосфорилирования белка Heel уменьшается до состояния, при котором белок Heel содержит 0-1 фосфатную группу (DeLuca et al., 2011). Предыдущие работы in vitro на очищенном рекомбинантном

комплексе NDC80 содержащего мутации на аспарагиновую кислоту, имитирующие отрицательный заряд фосфатных групп, показали, что внесение таких мутаций во все 9 аминокислот расположенных в сайтах фосфорилирования уменьшает аффинность комплекса NDC80 к микротрубочкам более чем в 10 раз (Umbreit et al., 2012). Однако эффект внесения промежуточного числа фосфо-миметических мутаций на аффинность комплекса NDC80 к микротрубочке остается неизвестным. Так же неизвестен и характер зависимости характеристик взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой от числа фосфо-миметических мутаций - будет ли эффект изменятся градуально или имеется скачкообразное изменение аффинности при достижении некоторого порогового числа фосфорилирований (Salazar and Hofer, 2009). Другие работы предлагают модель, в которой фосфорилирование комплекса NDC80 регулирует как сродство комплекса к микротрубочке, так и способность комплекса NDC80 олигомеризоваться на поверхности микротрубочке в зависимости от состояния фосфорилирования белка Heel расположены фосфатные группы (Alushin et al., 2010; Alushin et al., 2012). Однако эти выводы были сделаны на основе структурных данных и не дают количественных характеристик такой регуляции. Таким образом, присутствует необходимость систематического экспериментального изучения и количественной характеризации взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой, а так же анализа влияния фосфорилирования белка Heel на это взаимодействие. Так же отсутствует связь между молекулярными характеристиками взаимодействия комплекса NDC80-микротрубочка с динамикой закрепления микротрубочек на кинетохоре.

Цель работы:

Исследовать взаимодействие микротрубочки с кинетохорным комплексом NDC80, изучить влияние фосфорилирования белка Heel на это взаимодействие. Построить математическую модель кинетохора, позволяющую описать наблюдаемую in vivo регуляцию закрепления микротрубочек и кинетохора на основе полученных в экспериментах in vitro данных о взаимодействии комплекса NDC80 и микротрубочки.

Задачи исследования:

1. Построить математическую модель кинетохора, в которой взаимодействие микротрубочки и кинетохорных белков будет динамическим.

2. Экспериментально изучить взаимодействие как единичных комплексов NDC80, так и ансамблей комплексов NDC80 с микротрубочками in vitro.

3. Экспериментально изучить влияние фосфорилирования гибкого N-концевого участка белка Heel на взаимодействие комплекса NDC80 с микротрубочкой и на кооперативность взаимодействия комплекса NDC80.

4. Использовать полученные in vitro молекулярные параметры взаимодействия комплекса NDC80 и его фосфорилированных форм в построенной математической модели для анализа влияния фосфорилирования комплекса NDC80 на регуляцию взаимодействия кинетохора и микротрубочек.

Научная новизна:

В данной работе была впервые предложена теоретическая модель закрепления микротрубочки и кинетохора через ансамбль независимо связывающихся с микротрубочкой кинетохорных комплексов, в которой закрепление имеет динамический характер. Теоретически было показано, что для того, чтобы обеспечить закрепление микротрубочки и кинетохора с физиологическим значением характеристического времени взаимодействия 2-10 минут, молекулярные времена взаимодействия кинетохорных комплексов и микротрубочки должны составлять доли секунды (50 - 500 мс).

Впервые были экспериментально изучены характеристики взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой и его фосфорилированных форм, в том числе и промежуточных форм с неполным числом фосфорилированных сайтов в физиологическом буфере. Показано, что увеличение числа фосфомиметических мутаций в N-терминальном домене белка Heel (часть комплекса NDC80) приводит к постепенному снижению аффинности взаимодействия единичных комплексов NDC80 и микротрубочки. Был разработан новый метод получения кривых связывания белков и микротрубочек на основе флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Через использование данного метода впервые было количественно охарактеризовано влияние фосфорилирования на константу диссоциации KD комплексов NDC80 и микротрубочки, а так же кооперативность взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочки. Так же был разработан метод количественного анализа кооперативности взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой на основе метода анализа восстановления флуоресценции после фотовыцветания. С использованием данного метода были получены значения параметра кооперативности для нефосфорилированной и фосфорилированной формы комплекса NDC80, которые оказались статистически неразличимы. Это хорошо согласуется с выводом, сделанным на основе кривых связывания комплекса NDC80 и микротрубочки.

Полученные экспериментально значения скоростей диссоциации k0ff и параметра кооперативности для комплексов NDC80 с различной степенью фосфорилирования были использованы для построения математической модели кинетохора человека. Было показано, что наблюдаемая in vivo регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохора фосфорилированием комплексов NDC80 достигается только при определенном способе организации комплексов NDC80 на кинетохоре - в виде «динамического газона».

Научно-практическая значимость

Проведенное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия кинетохоров и митотического аппарата клетки. В частности, демонстрируется, что наблюдаемая в клетках регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохоров может быть описана молекулярными параметрами взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками и их фосфорилированных форм. Причем это возможно достичь только при определенной организации комплексов NDC80 на кинетохоре в виде «динамического газона». Разработанные математические модели взаимодействия микротрубочек и кинетохоров и измеренные in vitro молекулярные параметры кинетохорных белков служат базой для дальнейшего количественного изучения механизмов сегрегации хромосом в здоровых клетках и понимания, как могут быть предотвращены или исправлены ошибки в клетках с хромосомной нестабильностью.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана математическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки через ансамбль независимо взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных комплексов позволяющая описать обмен кинетохорным микротрубочек.

2. Было изучено взаимодействие с микротрубочками кинетохорных комплексов NDC80 на уровне отдельных молекул.

3. Впервые для белков, взаимодействующих с микротрубочками, был охарактеризован механизм плавной регуляции аффинности взаимодействия через множество сайтов фосфорилирования.

4. Полное число фосфорилирований в N-концевом участке белка Heel, а не конкретное расположение сайтов фосфорилирования регулирует взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой.

5. Фосфорилирование N-концевого участка белка Heel комплекса NDC80 не влияет на кооперативность взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой.

6. Предложена новая модель организации комплексов NDC80 на кинетохоре - модель динамического газона, в которой комплексы NDC80 не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочкой, а распределены по поверхности кинетохора случайным образом. Расчеты, проведенные с помощью данной модели, позволяют описать наблюдаемую in vivo в клетках регуляцию взаимодействия кинетохор-микротрубочка через молекулярные параметры комплексов NDC80 измеренные в экспериментах in vitro.

Апробация работы состоялась 1 февраля 2013 года на заседании межлабораторного семинара Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты работы были представлены на международных и региональных конференциях: "The Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" (Филадельфия, США, декабрь 2010 г.), "The Annual Biophysical Meeting" (Балтимор, США, март 2011 г.), "Biophysical Society Pennsylvania Network Meeting" (Бетлехем, США, сентябрь 2012 г.), "The Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" (Сан-Франциско, США, декабрь 2012г.), "The Annual Biophysical Meeting" (Филадельфия, США, февраль 2013 г.), "The Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" (Филадельфия, США, декабрь 2014г.).

Публикации

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 статьи и тезисы в сборниках 6 конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав (глава 1 - обзор литературы, глава 2 - описание материалов и методов, глава 3 - описание результатов и их обсуждение), заключения, выводов, списка сокращений и библиографического указателя, включающего 71 источников. Работа выполнена совместно в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук (зав. лаб. проф. Ф.И. Атауллаханов) и в Университете Пенсильвании, Филадельфия, США (зав. лаб. проф. E.JI. Грищук).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследования, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены общие сведения о процессе митоза. Дается описание имеющихся данных о строении кинетохора.

Описаны известные сведения о динамике закреплений микротрубочек и кинетохора. Приведен обзор существующих теоретических подходов к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора. Описаны свойства и строение кинетохорного комплекса NDC80. Рассмотрены имеющиеся данные о влиянии фосфорилирования комплекса NDC80 на его взаимодействие с микротрубочкой. Рассматриваются предложенные в литературе механизмы влияния фосфорилирования комплекса NDC80 на взаимодействия микротрубочек и кинетохора.

В главе 2 описаны используемые в работе материалы и методы.

Очистка белков для работы in vitro

Тубулин был выделен и очищен из коровьего мозга методом термического циклирования по ранее опубликованному протоколу (Hyman et al., 1991). Рекомбинантный комплекс NDC80 и его фосфомиметические мутантные версии были предоставлены коллегами автора диссертации. Для работы использовалась конструкция NDC80-Bonsai, в которой был удален участок суперспирали соединяющий домен взаимодействия с микротрубочкой (Hecl-Nuf2) и домен локализации на кинетохоре (Spc24-Spc25). Для изучения эффекта фосфорилирования гибкого N-концевого участка белка Heel комплекса NDC80 были очищены комплексы NDC80 содержащие 0, 1, 2, 3, 4 или 9 точечных мутаций в сайтах фосфорилирования на аспарагиновую кислоту, отрицательных заряд которой имитирует фосфорилирование.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Покровные стекла были очищены и силанизированы по разработанному автором диссертации и опубликованному протоколу (Volkov et al., 2013) и собирались в герметичные проточные камеры по опубликованным ранее протоколам (Grishchuk and Ataullakhanov, 2010). Через последовательность промывок на поверхность покровного стекла наносились анти-тубулиновые антитела (Serotec), после чего поверхность пассивировалась через использование полимера Pluronic F-127 (Sigma Aldrich). Далее на поверхности к анти-тубулиновым антителам закреплялись стабилизированные таксолом микротрубочки. Комплексы NDC80 разводились до концентрации 50 пМ (для наблюдения за единичными молекулами) или 1 нМ - 2 мкМ (для получения кривых связывания) в экспериментальном буфере: BRB80 (K-Pipes 80 мМ, рН 6.9 , 4 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA) с 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 6 мг/мл глюкозы, 68 мкг/мл каталазы, 0.1 мг/мл глюкозооксидазы, 0.5% Р -меркаптоэтанола и 10 мкМ таксола. Для наблюдения проточная камера помещалась под объектив (CFI АРО ЮОх Nikon-TIRF, численная апертура 1.49)

инвертированного флуоресцентного TIRF микроскопа Nikon Eclipse Ti-E. Флуоресценция возбуждалась лазером с длиной волны 488 нм. в режиме полного внутреннего отражения. Температура объектива поддерживалась равной 32°С с помощью нагревательного ошейника на объективе (Bioptechs). Съемка экспериментов осуществлялась с помощью камеры Andor 512x512 10 MHz EMCCD, охлаждаемой до температуры -80°С. Взаимодействие комплексов NDC80-GFP с микротрубочками записывалось в виде последовательности около 2000 кадров в зеленом флуоресцентом канале. Для скоростной съемки с выдержкой от 5 до 10 мс и нулевым интервалом между кадрами дополнительно использовалась оптическая маска OptoMask (CAIRN Research), позволяющая камере работать с частью сенсора в режиме "Fast Kinetics".

Глава 3 содержит результаты и их обсуждение.

Математическая модель динамического связывания микротрубочки и кинетохора.

Была создана математическая модель взаимодействия микротрубочки и кинетохора, в которой связывание микротрубочки с кинетохором происходит через взаимодействия с N0 = 12 кинетохорными комплексами, каждый из которых может случайным образом связываться и отсоединяться от микротрубочки. Реакции связывания и отсоединения комплексов от микротрубочки описывались параметрами коп и koff - скорость ассоциации и диссоциации, соответственно. Так же в модели был введен параметр со - фактор кооперативное™, для анализа влияния кооперативности связывания кинетохорных белков с микротрубочкой на стабильность закрепления кинетохора и микротрубочки (рис. 1). Модельные параметры, такие как общее число кинетохорных комплексов взаимодействующих с микротрубочкой (N0) или концентрация комплексов NDC80 на кинетохоры были выбраны на основе имеющихся литературных данных. В рамках разработанной математической модели было выведено аналитической выражение для среднего времени закрепления микротрубочки за кинетохор в зависимости от молекулярных параметров кот koff и со взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных белков.

сайт связывания микротрубочки на

кинетохоре с N0 белками *

сайт свободен (1 состояние)

К»* Wo

V

ko„x(N0-1)

V

1 белок связан с микротрубочкой (N0 возможных состояний)

2к0„/ш

Л V

М„ х fis(r/w J

Wo белков связано (1 состояние)

Рис. 1. Схема молекулярных взаимодействий микротрубочки и Nn кинетохорных комплексов лежащая в основе разработанной математической модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора. Комплексы могут независимо связываться с микротрубочкой (со скоростью ассоциации коп) и отсоединяться от микротрубочки (со скоростью диссоциации k0ff).

Было показано, что в данной модели в широком диапазоне значений констант коп, koff и со можно получить физиологические значения времени закрепления микротрубочки за кинетохор для прометафазы (время полуобмена кинетохорных микротрубочек 2-4 мин), для метафазы (время полуобмена кинетохорных микротрубочек 6 - 10 мин) и для случая, когда связывание микротрубочек с кинетохором искусственно усиливалось, через ингибирование фосфорилирования кинетохорных белков (время полуобмена кинетохорных микротрубочек ~ 150 мин). Было выявлено, что характерной особенностью закрепления микротрубочки к кинетохору через множество независимых связывающихся с микротрубочкой кинетохорных белков, является то, что физиологические значения стабильности закрепления кинетохорных микротрубочек (2 - 10 мин) достигаются только тогда, когда времена

молекулярных взаимодействий связывающихся с микротрубочкой кинетохорных белков составляют 0.05 - 0.5 с (рис. 2). С помощью разработанной модели было показано, что для изменения стабильности закрепления микротрубочки и кинетохора соответствующему переходу из прометафазы в метафазу достаточно изменения скорости диссоциации кинетохорных комплексов к.„# от микротрубочки всего на 20%.

>103 7

ю2 -

N(,=20 N,,=12

стабилизированные закрепления

^ значение для метафазы ^значение для прометафазы

-1-1-1

О 0.1 0.2 0.3 время закрепления отдельного белка за МТ (1 №„»■), с

Рис. 2. Полученная в модели зависимость времени закрепления микротрубочки и кинетохора от времени закрепления отдельного комплекса за микротрубочку (1 lk0fj). Зависимость была посчитана для двух случаев, когда сайт связывания состоял из No — 12 комплексов и N0 = 20 комплексов, так как оценки этого параметра варьируются в литературе (Johnston et al., 2010; Lawrimore et al., 2011).

Характеризация взаимодействия единичных комплексов NDC80 и микротрубочек

Взаимодействие индивидуальных комплексов NDC80 с микротрубочками in vitro изучалось с помощью метода флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (T1RF микроскопия). Рекомбинантный комплекс NDC80 меченный зеленым флуоресцентным белком был выделен и очищен коллегами автора диссертации. Кроме нативного комплекса NDC80 были выделены и очищены так же мутантные версии комплекса NDC80, в которых хвостовой домен белка Heel содержал различное число точечных мутаций на аспарагиновую кислоту (D) расположенных в одном или нескольких сайтах фосфорилирования белка Heel. Данные мутации позволяют имитировать фосфорилирование, что позволяет изучить взаимодействие с микротрубочками комплексов NDC80 содержащих различное число фосфо-миметичеких мутаций.

Для удобства далее нативный комплекс N0080 будет обозначен как "по!) N0080", а комплекс N0080 содержащий X фосфомиметических замен будет обозначаться как ХО N0080.

Через сигнал ОРТ на микроскопе регистрировались события связывания комплексов N0080 с микротрубочкой, процесс их диффузии по поверхности микротрубочки и последующая диссоциация (рис. 3). Были проанализированы интенсивности флуоресценции наблюдаемых сигналов ОРР-меченных комплексов N0080 взаимодействующих с микротрубочками. Через соотнесение полученных значений с независимо определенной стандартной интенсивностью флуоресценции одной молекулы ОБР было продемонстрировано, что для всех исследуемых комплексов N0080 при рабочей концентрации 50 пМ более 95% наблюдаемых событий связывания комплексов N0080 и микротрубочек соответствуют взаимодействию единичных комплексов N0080. Всего было проанализировано более 600 событий связывания с микротрубочкой для каждого мутантного комплекса N0080 и проведено как минимум два независимых эксперимента.

Рис. 3. Кимограммы взаимодействия с микротрубочками комплексов N0080 с различным числом фосфо-миметических замен. Горизонтальное измерение - расстояние вдоль микротрубочки; вертикальное измерение - время.

Было продемонстрировано, что последовательное внесение фосфомиметических замен увеличивает коэффициент одномерной диффузии комплексов N0080 по поверхности микротрубочки от 0.078 ± 0.006 мкм7с для комплекса поО N0080 до 0.793 ± 0.041 мкм2/с для комплекса 90 N0080, причем зависимость коэффициента диффузии от числа фосфомиметических мутаций

носит экспоненциальный характер. Так же было измерено, что характеристическое время взаимодействия комплексов N130 80 с микротрубочкой уменьшается при каждом последовательном внесении фосфо-миметических мутаций в комплекс N0080 от 417 ± 23 мс для поБ ЖС80 до 22 ± 1 мс для 9Б N0080, причем форма зависимости носит экспоненциальный характер (рис. 4).

Рис. 4. Коэффициент одномерной диффузии по поверхности микротрубочки (А) и характерное время взаимодействия с микротрубочкой (Б) единичных комплексов NDC80 с различным числом фосфо-миметических замен. Красные линии — аппроксимации экспоненциальной зависимостью.

Полученное значение скорости ассоциации для комплексов NDC80 с различным числом фосфо-миметических замен было статистически неразличимо между различными мутантами и в среднем составило 3.7 ± 0.5 с"1 мкМ"'. Полученные значения коэффициентов одномерной диффузии комплексов были использованы для определения стандартной свободной энергии связывания комплексов NDC80 с микротрубочками, абсолютное значение которой составило 9.09 ± 0.06 квТ для комплекса noD NDC80 и 6.45 ± 0.10 квТ для 9D NDC80. Для комплексов NDC80 с промежуточным числом фосфомиметических мутаций, стандартная свободная энергия связывания линейно убывала по абсолютному значению на 0.30 ± 0.02 квТ с каждым последующим добавлением фосфомиметических мутаций в комплекс NDC80 (рис. 5). Похожее значение уменьшения энергии на единичный заряд было опубликовано ранее для других белок-белковых и для белок-ДНК систем (Okada and Hirokawa, 2000; Pufall et al., 2005; Lee et al., 2010).

A

Б

0 2 4 6 8 10 число фосфо-миметических замен

0 2 4 6 8 10 число фосфо-миметических замен

число фосфо-миметических замен

Рис. 5. Стандартная свободная энергия взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой для различного числа фосфо-миметических замет вычислялась на основе полученных значений коэффициентов одномерной диффузии по поверхности микротрубочки на основе (Festa and Galleani, 1978). Черная прямая - аппроксимация линейной зависимостью.

Было так же проведено сравнение характерного времени взаимодействия с микротрубочкой и коэффициента диффузии по микротрубочке для различных фосфо-миметических форм комплекса NDC80 содержащих одинаковое полное число фосфо-миметических замен, но расположенных в различных сайтах фосфорилирования в гибком N-концевом участке белка Heel. Было проанализировано три варианта комплексов ID NDC80 (S8D, S15D и S55D, где номера обозначают номер аминокислоты с фосфо-миметической мутацией) и два варианта комплексов 4D NDC80 (S8,15,44,55D и S8,44,55,69D). Было установлено, что различные варианты комплексов ID NDC80 имеют близкие характерные времена взаимодействия с микротрубочкой (от 218 ± 19 мс до 256 ± 12 мс) и коэффициенты диффузии по микротрубочке (от 0.090 ± 0.002 мкм2/с до 0.110 ± 0.007 мкм2/с), но статистически отличающиеся от времен и коэффициентов диффузий для обоих вариантов комплексов 4D NDC80, для которых времена взаимодействия с микротрубочкой составляли 88 ± 4 мс и 100 ± 9 мс; коэффициенты диффузии - 0.28 ± 0.01 мкм2/с и 0.34 ± 0.02 мкм2/с (рис. 6). Полученные результаты означают, что взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой регулируется полным числом фосфорилирований в N-концевом домене белка Heel, а не конкретным положением сайта фосфорилирования.

Рис. 6. Сравнение характерных времен взаимодействия с микротрубочкой и коэффициентов диффузии по поверхности микротрубочки различных вариантов комплексов ID NDC80 и 4D NDC80. Условные обозначения: lDa - S8D, lDb - S15D, 1D0 - S55D, 4Da - S8,15,44,55D, 4Db - S8,44,55,69D, где номер обозначает номер аминокислоты с фосфо-миметической мутацией в N-концевом участке белка Heel.

Характеризация взаимодействия ансамбля комплексов NDC80 и микротрубочек

Белки NDC80 были диализованы в буфер BRB80 с ImM DTT в течение 4 часов при 4°С. Различные фосфо-миметические мутантные формы комплексов NDC80-GFP разводились до концентраций в диапазоне от нМ до мкМ и последовательно вмывались в микроскопную камеру, где предварительно на покровном стекле были иммобилизованы стабилизированные таксолом микротрубочки (рис. 7).

Рис. 7. "ПИР изображения в зеленом флуоресцентном канале полей с микротрубочками и указанными концентрациями комплексов N0080-0?? в растворе. Приведены примеры полей для поЭ N0080 и 2В N0080.

Процесс связывания комплексов NDC80-GFP с микротрубочками регистрировался по сигналу ОБР на микротрубочках. Всего для каждой формы комплексов N0080 было проведено как от 2-х до 6-ти независимых экспериментов. Была разработана программа для анализа яркости сигнала флуоресценции на микротрубочки, которая затем была применена для анализа экспериментальных данных. В результате были получены зависимости яркости сигнала флуоресценции на микротрубочки в зависимости от концентрации комплекса N0080 в растворе для различны фосфо-миметических форм комплекса N0080 (рис. 8). Полученные кривые аппроксимировались моделью связывания, которая состояла из константы диссоциации отдельных комплексов N0080 (Ко), параметра кооперативное™ (со) и уровня насыщения (Втах). Было установлено, что константа диссоциации Кц возрастает экспоненциально с увеличением числа фосфо-миметических мутаций в комплексах N0080 от 0.53 ± 0.05 цМ для поО N0080 до 5.50 ± 0.11 цМ для комплекса 9В N0080. Полученные значения параметров кооперативное™ со для всех фосфо-миметических форм комплексов N0080 лежали в диапазоне от 2.00 ± 0.40 до 3.3 ± 0.44 и не показывали какого-либо тренда в зависимости от числа фосфомиметических мутаций в комплекса N0080. Статистический критерий Краскела - Уоллиса примененный к полученных значениям кооперативное™ показал, что нулевая гипотеза об отсутствии зависимости параметров кооперативное™ со от числа фосфо-миметических мутаций верна (величина р = 0.42). Параметр В,„ах описывающий уровень связывания комплексов N0080 с микротрубочкой при насыщении не зависел от числа фосфо-миметических мутаций и среднее значение Втах составило (8.4 ± 0.6)х104 у.е. Используя значение интенсивности флуоресценции единичного белка ОБР, получено значение параметра Втах было пересчитано на количество комплексов N0080 на тубулин в насыщении, которое составило 1.9 ± 0.2 комплексов N0080 на димер тубулина, что хорошо согласуется с опубликованными ранее структурными данными для взаимодействия N0080 и микротрубочки (АШбЫп е1 а1., 2010).

О 200 400 600 800 концентрация NDC80 в растворе, нМ

Рис. 8. Степень связывания NDC80-GFP с микротрубочкой полученная на основе интенсивности сигнала GFP на микротрубочках в зависимости от концентрации комплексов NDC80 в растворе (точки) для различных фосфо-миметических форм комплекса NDC80 (различные цвета). Гладкие кривые — аппроксимация экспериментальных данных моделью связывания основанной на (McGhee and von Hippel, 1974). Исследование влияния фосфорилирования комплекса NDC80 на кооперативность взаимодействия с микротрубочкой

Для независимой проверки вывода о нечувствительности параметра кооперативности со комплексов NDC80 к фосфорилированию был разработан метод основанный на анализе кинетики восстановления сигнала после фотовыцветания. Идея метода заключалась в использовании сфокусированного лазера 488 нм для выжигания небольшого участка микротрубочки, с которым связаны комплексы NDC80-GFP. После выжигания, сигнал флуоресценции от NDC80-GFP на микротрубочке восстанавливался, из-за наличия динамического обмена связанных с микротрубочкой комплексов NDC80 и растворимых комплексов NDC80 (рис. 9).

перед выжиганием выжигание

Рис. 9. Схема эксперимента по определению кооперативное™ взаимодействия комплексов NDC80-GFP с микротрубочками на основе анализа кинетики восстановления сигнала после выжигания. Приведены показательные изображения в зеленом флуоресцентном канале из различных фаз эксперимента. Выжигание проводилось сфокусированным лучом 488 нм лазера в течение 3 с. Сигнал NDC80-GFP на микротрубочке в области выжигания (красный квадрат) анализировался как функция от времени.

Кинетика восстановления аппроксимировалась экспоненциальной зависимостью, показатель которой (1/т) характеризовал кинетику диссоциации комплексов NDC80 от микротрубочки. Данный анализ кинетики диссоциации комплексов был проведен для концентрации, при которой плотность заполнения комплексов NDC80 на поверхности микротрубочки была минимально детектируемая, что соответствовало единичным комплексам NDC80 на поверхности микротрубочки. В этом случае кинетика восстановления сигнала после фотовыцветания (1/т0) характеризовала скорость диссоциации k0¡¡ единичных комплексов NDC80 с поверхности микротрубочки. Затем эксперимент повторялся для концентрации комплексов NDC80 соответствующей насыщению связывания с микротрубочкой. В этом случае кинетика восстановления сигнала (1/т/) была медленнее, так как диссоциация комплексов NDC80 происходила медленнее из-за наличия кооперативного взаимодействия между комплексами NDC80 на поверхности микротрубочки. Для комплекса noD NDC80 кинетика восстановления интенсивности флуоресценции при низкой плотности связывания (концентрация 8 нМ) составила т0 = 0.28 ± 0.06 с, а при насыщении (концентрация 200 нМ) составила т/ = 1.21 ± 0.07 с. Для комплекса 41) NDC80 кинетика восстановления интенсивности флуоресценции при низкой плотности связывания (концентрация 50 нМ) составила т0 = 0.08 ± 0.04 с, а при насыщении (концентрация 2.4 мкМ) составила т, = 0.50 ± 0.05 (рис. 10). Всего для каждого из сценариев было проанализировано 6-8 сигналов восстанозления. Параметры кооперативности со для noD NDC80 и для 4D NDC80 вычисленные на основе полученных данных составили 2.0 ± 0.9 и 2.4 ± 1.1, соответственно, и статистически не различимы (параметр р = 0.8, t-критерий). Полученный результат хорошо согласуется с описанным выше результатом эксперимента с кривыми связывания и позволяет сделать вывод, что кооперативность взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой не зависит от фосфорилирования хвостового фрагмента белка Hecl.

А

Б

. noD NDC80; 8 нМ; z = 0.3 с • 4D NDC80; 50 нМ; г = 0.08 с

noD NDC80; 200нМ;т=12с 4D NDC80; 2,400 нМ; т = 0 5 с

т-г-ЧН

1 восстановление

к Е

га ^

-5-4-3 0 время, с

2

-4-3 0 время, с

2 3

Рис. 10. Кинетика восстановления сигнала флуоресценции ЫОСВО-СИ Р на микротрубочке для комплексов по Г) N00 80 (синие точки) и 40 N0080 (красные точки). Графики на панели А для случая низкой плотности покрытия микротрубочек комплексами N0080. Графики на панели Б были получены при концентрации комплексов N0080 соответствующих насыщению. Гладкие кривые - аппроксимации экспоненциальной функцией.

Математическое моделирование взаимодействия кинетохора и микротрубочек и его регуляция через фосфорилирование комплекса NDC80

Построенная математическая модель динамического взаимодействия кинетохора и микротрубочки, описанная в выше, затем была использована для анализа, можно ли описать изменение аффинности кинетохора к микротрубочкам фосфорилированием комплексов NDC80 исходя из полученных in vitro значений молекулярных параметров взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой. В лаборатории Jennifer DeLuca, университет штата Колорадо, США коллегами автора диссертации были проведены эксперименты с клеточными культурами PtKl, в которых ген Heel был нокаутирован и заменен на ген Heel содержащий различное число фосфомиметических мутаций. Было показано, что клетки, содержащие ID NDC80, показывают фенотип наиболее близкий к контролю. Увеличение числа фосфомиметических мутаций в комплексе NDC80 изменяло число кинетохорных микротрубочек, которое детектировалось по яркости кинетохорного пучка микротрубочек.

Разработанная модель сайта связывания была обобщена для описания кинетохора, способного связывать более одной микротрубочки. Такой сложный кинетохор состоял из идентичных сайтов связывания одной микротрубочки, полное число которых составляло Nsiles = 50, что соответствует максимально

наблюдаемому числу кинетохорных микротрубочек (McEwen et al., 1997). Концепция строения кинетохора млекопитающих основанная на независимых сайтах связывания с микротрубочкой является общепринятой в области (Alberts et al., 2008). Каждый сайт связывания содержал N0 = 12 комплексов NDC80, полное число которых на кинетохор составляло N,ota¡ = 600, что согласуется с имеющимися в литературе оценками (Lawrimore et al., 2011). В данной модели новые микротрубочки связываются с сайтами случайным образом со скоростью ка„ = 4 min"1, которая была оценена исходя из литературных данных. Связавшись со свободным сайтом, микротрубочка взаимодействовала с находящимися в сайте комплексами NDC80, и это взаимодействие описывалось скоростью ассоциации (коп), скоростью диссоциации (k„jf) и параметром кооперативное™ (со). Значения параметров k0g и со брались напрямую из экспериментов in vitro для различных фосфо-миметических форм комплекса NDC80. Свободный параметр к0„ использовался для калибровки модели — его значение варьировалось для получения среднего стационарного числа микротрубочек на кинетохоре наблюдаемого в клетках - 25 микротрубочек на кинетохор - при параметрах к0д- и со соответствующих ID NDC80 комплексу. Было показано, что после калибровки модель использующая параметры для комплексов ID NDC80 хорошо описывала так же и кинетику формирования кинетохорного пучка и распределение числа микротрубочек на кинетохоре.

Далее был произведен анализ того, как изменение параметра кад- на значения полученные для различных фосфо-миметических форм комплексов NDC80 в экспериментах in vitro . Параметры к0„ и со при этом не изменялись, в соответствии с экспериментальным результатом полученным in vitro, что скорость ассоциации и параметр кооперативное™ комплексов NDC80 не зависит от фосфорилирования. Было показано, что в полученной сайтовой модели кинетохора, несмотря на хорошее согласование с экспериментом результатов расчетов для комплексов ID NDC80, предсказанное моделью поведения для других форм фосфорилирования комплексов NDC80 резко отличается от полученных in vivo экспериментальных зависимостей. Стационарное число кинетохорных микротрубочек предсказанное моделью было крайне чувствительно к состоянию фосфорилирования комплексов NDC80. Внесение даже одной дополнительной фосфомиметической мутации в модели и переход от ID NDC80 к расчету с параметрами для 2D NDC80 приводил к тому, что стационарное число кинетохорных микротрубочек уменьшалось до 1-2 от 25 -физиологического значения для метафазы, что означало резкое ослабление закреплений микротрубочек к кинетохору. В то время как удаление всего одной

фосфомиметической мутации и переход к расчету с параметрами соответствующими комплексам noD NDC80 приводил к гипер-стабильным закреплениям микротрубочка-кинетохора, при которых почти все 50 сайтов связывания на кинетохоре оказывались заняты микротрубочками (рис. 11). Полученные результаты на сайтовой модели не согласовывались с результатами экспериментов in vivo, которые показывают, что кинетохоры в клетках экспрессирующих комплексы NDC80 с фосфомиметическими мутациями демонстрируют меньшую чувствительность числа кинетохорных микротрубочек от числа фосфо-миметических мутаций в комплексе NDC80 — в клетках уменьшение числа кинетохорных микротрубочек в кинетохорном пучке происходило в среднем на 20% после внесения одной фосфомиметической мутации. Обнаруженный в сайтовой модели эффект гиперчувствительности числа кинетохорных микротрубочек к состоянию фосфорилирования комплексов NDC80 сохранялся в широком диапазоне модельных параметров, которые были систематически проварьированы. Был сделан вывод о том, что наблюдаемый эффект чувствительности стабильности кинетохорных микротрубочек к изменению состояния фосфорилирования комплексов NDC80 является следствием заложенного в модель предположения об организации комплексов NDC80 на поверхности микротрубочки в виде независимых сайтов связывания.

сайтовая модель ^ кинетохора

Б

сайтовая модель кинетохора

число фосфомиметических

Рис. 11. На панели (А) схематически изображено устройство кинетохора в сайтовой модели. Комплексы N0080 образуют сайт связывания микротрубочки и могут взаимодействовать только с одной микротрубочкой. Взаимодействие описывается молекулярными параметрами кф коп и со (см. текст). На панели (Б) приведен расчет относительного размера кинетохорного пучка микротрубочек при изменении состояния

22

фосфорилирования комплексов NDC80, и дано сравнение с экспериментальным результатом. Значение для ID NDC80 в модели совпадает с экспериментальным в результате калибровки.

Модель «динамического газона» полного кинетохора

Для попытки связать экспериментальные данные in vivo с молекулярными параметрами измеренными in vitro была предложена новая альтернативная модель организации комплексов NDC80 на поверхности кинетохора, которая была названа моделью «динамического газона». Отличие данной модели от модели сайтов связывания состояло в том, что комплексы NDC80 не были объединены в независимые сайты связывания с микротрубочками, а были случайным образом распределены по поверхности кинетохора, который моделировался прямоугольной площадкой со стороной Lkm = 430 нм (McDonald et al., 1992). Как и в сайтовой модели, микротрубочки соударялись с кинетохором случайным образом, но взаимодействие с комплексами NDC80 не было ограничено отдельными сайтами как было в рассмотренной выше модели, а происходило с любыми комплексами NDC80 на поверхности кинетохора, которые могли геометрически дотянуться до микротрубочки. Длина комплекса NDC80 описывалась параметром Lsdcso — 60 нм (Ciferri et al., 2008). Как и в сайтовой модели, в модели динамического газона молекулярные параметры k0jf и со для комплексов NDC80 брались из результатов экспериментов in vitro. Аналогично сайтовой модели кинетохора, разработанная модель динамического газона калибровалась с помощью варьирования скорости ассоциации комплексов NDC80 к микротрубочке коп при остальных параметрах соответствующих комплексу ID NDC80 для получения физиологического стационарного числа микротрубочек на кинетохор (25 микротрубочек на кинетохор). После калибровки модель динамического газона была использована для расчетов, как изменение состояния фосфорилирования взаимодействующих с микротрубочкой комплексов NDC80 будет влиять на стабильность закрепления микротрубочек к кинетохору (рис. 12). Для этого, как и в сайтовой модели, скорость диссоциации с микротрубочкой (kgff) различных фосфо-миметических форм комплексов NDC80 изменялись в соответствии с полученными in vitro значениями. Ответ модели регистрировался по количеству кинетохорных микротрубочек (размер кинетохорного пучка) и сравнивался с экспериментальными данными полученными в клетках in vivo. Было получено, что зависимость размеров кинетохорного пучка в зависимости от состояния фосфорилирования комплексов NDC80 находится в хорошем согласии с экспериментальными данными.

А модель динамического ^ газона

газона

Б модель динамического газона -*-эксперимент

комплексы NDC80 могут взаимодействовать с различными МТ

noD 123456789 число фосфомиметических замен

Рис. 12. На панели (А) схематически изображена кинетохорная модель динамического газона. В отличие от сайтовой модели кинетохора кинетохорные микротрубочки взаимодействуют с любыми комплексами N0080, которые до них могут геометрически дотянуться (штрихпунктирные области), а не с определенными сайтами (рис. 11). Комплексы N0080, которые могут дотянуться до нескольких микротрубочек (как комплексы, расположенные в заштрихованной области, выделенные голубым), взаимодействуют с обеими микротрубочками, стохастически связываясь то с одной, то с другой микротрубочкой. На панели (Б) приведен расчет относительного размера кинетохорного пучка микротрубочек при изменении состояния фосфорилирования комплексов N0080, и дано сравнение с экспериментальным результатом.

Полученный результат позволяет сделать вывод о том, что комплексы NDC80 на кинетохоре не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочками, как часто считается в области (Alberts et al., 2008), а распределены по поверхности кинетохора случайным образом взаимодействуя со многими микротрубочками, связаться до которых им позволяет их длина (60 нм).

В данной диссертационной работе исследовано взаимодействие с микротрубочкой ключевого компонента кинетохоров эукариотических клеток -комплекса NDC80. Было изучено, как фосфорилирование белка Heel, части комплекса NDC80, регулирует взаимодействие комплексов NDC80 и микротрубочек. В экспериментах in vitro были измерены такие характеристики

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками, как скорости ассоциации, скорости диссоциации, коэффициент диффузии, константа диссоциации, параметр кооперативности и плотность связывания в насыщении. Были получены зависимости приведенных параметров от числа фосфо-миметических мутаций в комплексе NDC80. Было показано, что последовательное добавление фосфо-миметических мутаций в комплекс NDC80 линейно уменьшает абсолютное значение свободной энергии связывания комплексов NDC80 с микротрубочкой, в то время как, кооперативность взаимодействия с микротрубочкой остается постоянной.

В данной работе была построена теоретическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки основанная на связывании с множеством независимых кинетохорных комплексов стохастически взаимодействующих с микротрубочкой. Ключевой особенностью разработанной модели является наличие динамики закреплений микротрубочка-кинетохор, которая приводит к динамическому обмену кинетохорных микротрубочек - важнейшему физиологическому свойству кинетохора, благодаря которому происходит исправление ошибок в митозе. С помощью разработанной математической модели были получены соотношения между временем закрепления микротрубочки к кинетохору и молекулярными характеристиками белков, взаимодействующих с микротрубочкой. Было показано, что для достижения физиологического времени полуобмена кинетохорных микротрубочек 2-10 мин, отдельные молекулярные взаимодействия кинетохорных комплексов с микротрубочкой должны быть короткоживущими с временами 50 — 500 мс.

На основе разработанной математической модели и полученных в экспериментах in vitro параметров было показано, что наблюдаемая в клетках регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохора не может быть описана в рамках широко распространенной парадигмы независимых сайтов взаимодействия с микротрубочкой на кинетохоре. Переход к новой предложенной в диссертационной работе модели организации комплексов NDC80 на кинетохоре — в виде «динамического газона» — позволил получить хорошее согласование наблюдаемых in vivo изменений во взаимодействии кинетохора с микротрубочками в ответ на фосфорилирование комплексов NDC80 с молекулярными параметрами взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками, которые были получены в экспериментах in vitro. Для будущих исследований представляется интересным продолжить разработку построенных математических моделей для описания процессов исправления

ошибок в ходе митоза на основе динамики закреплений кинетохорных микротрубочек.

ВЫВОДЫ

1. Разработана математическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки через ансамбль независимо взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных комплексов. Физиологические времена полуобмена кинетохорных микротрубочек 2-10 мин достигаются в модели только тогда, когда времена молекулярных взаимодействий кинетохорных комплексов и микротрубочек составляют 50 — 500 мс.

2. Одиночные комплексы NDC80 в зависимости от состояния фосфорилирования способны ассоциироваться с микротрубочками с характерными временами от 22 ± 1 мс до 417 ± 23 мс и диффундировать по поверхности микротрубочки с коэффициентами диффузии от 0.078 ± 0.006 мкм2/с до 0.793 ±0.041 мкм2/с.

3. Впервые для белков, взаимодействующих с микротрубочками, охарактеризован механизм плавной регуляции взаимодействия через множество сайтов фосфорилирования. Фосфорилирование N-концевого участка белка Hecl комплекса NDC80 регулирует аффинность к микротрубочке, последовательно уменьшая абсолютное значение свободной энергии связывания комплекса NDC80 с микротрубочкой на 0.30 ± 0.02 кВТ на каждый внесенный единичный заряд.

4. Взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой регулируется полным числом фосфорилированных сайтов, а не их конкретным расположением в N-концевом участке белка Hecl.

5. Комплексы NDC80 демонстрируют кооперативное связывание с микротрубочкой (параметр кооперативное™ со = 2.5 ± 0.5), причем параметр кооперативное™ со не зависит от фосфорилирования N-концевого участка белка Hecl комплекса NDC80.

6. Предложена новая модель организации комплексов NDC80 на кинетохоре — модель динамического газона, в которой комплексы NDC80 не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочкой, а распределены по поверхности кинетохора случайным образом. Расчеты, проведенные с помощью данной модели, позволяют описать наблюдаемую in vivo в клетках регуляцию взаимодействия кинетохор-микротрубочка через молекулярные параметры комплексов NDC80, измеренные в экспериментах in vitro.

Список публикаций, опубликованных по теме диссертации: 1. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2014) Toward quantitative theoretical description of the kinetochore-microtubule interactions and their rôles in

ensuring accurate chromosome segregation. American Society for Cell Biology Annual Meeting. December 6-10, Philadelphia, Pennsylvania, USA.

2. Zaytsev, A.V., Sundin L.J.R., DeLuca K.F, Grishchuk E.L. and DeLuca J.G. (2014) Accurate phosphoregulation of kinetochore-microtubule affinity requires unconstrained molecular interactions. J. Cell Biol. 206(l):45-59.

3. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Grishchuk E.L. (2014) Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85).

4. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2013) Highly transient molecular interactions underlie stability of kinetochore-microtubule attachment during cell division. Cell Mol. Bioeng. 6(4).

5. Zaytsev A. V., Sundin L. J. R., Nikashin B., DeLuca K. F., Mick J., Guimaraes G. J., Ataullakhanov F. I., Grishchuk E. L., DeLuca J. G. (2013) Incremental phosphorylation of a dynamic lawn of NDC80 complexes provides graded control of kinetochore-microtubule affinity. Poster presentation. The 57th Annual Biophysical Society Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA.

6. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Gudimchuk N., Grissom P.M., Gintsburg A.L., Ataullakhanov F.I., Mcintosh J.R., Grishchuk E.L. (2013) Long tethers provide highforce coupling of the Daml ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 110(19).

7. Zaytsev A. V., Sundin L. J. R., Nikashin B., DeLuca K. F., Mick J., Guimaraes G. J., Ataullakhanov F. I., Grishchuk E. L., DeLuca J. G., (2012) Incremental phosphorylation of competing NDC80 complexes tunes kinetochores for diverse mitotic functions. Abstract # 385-Poster. American Society for Cell Biology Annual Meeting. San Francisco, California, USA.

8. Zaytsev A.V., Sundin L.J.R., Nikashin B., Guimaraes G.J., DeLuca K.F., Mick J., Grishchuk E.L., DeLuca J.G., (2012) Incremental phosphorylation of Heel tunes kinetochore-microtubule binding affinity for diverse mitotic functions. Research Retreat and Symposium "Building Cellular Complexity One Molecule at a Time", Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA.

9. Zaytsev A.V., Sundin L.J.R., Nikashin B., Guimaraes G. J., DeLuca K. F., Mick J., Grishchuk E.L., DeLuca J.G. (2011) Incremental phosphorylation of Heel tunes kinetochore-microtubule binding affinity for diverse mitotic functions. Poster presentation. American Society for Cell Biology Annual Meeting. Denver, Colorado, USA.

9. Ataullakhanov F.I., Zaytsev A.V., Welburn J., Cheeseman I., Grishchuk E.L., (2011) Molecular-Mechanical Model of Kinetochore-Microtubule Interactions Identifies Flexibility of the Kinetochore Mesh as a Key Determinant of Errorless Bi-Orientation. Abstract# 862-Poster. The 55th Annual Biophysical Society Meeting. Baltimore, Maryland, USA.

10. Ataullakhanov F.I., Zaytsev A.V., Welburn J., Cheeseman I., Grishchuk E.L., (2010) Spatial phospho-regulation of microtubule affinity in a flexible kinetochore mesh is necessary and sufficient for expedient error-correction during chromosome segregation. Abstract #784 American Society for Cell Biology Annual Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA.