Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение

Волков, Владимир Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение"

ВОЛКОВ Владимир Алексеевич

ИЗУЧЕНИЕ КОЛЬЦЕВЫХ И ФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ, ПРЕОБРАЗУЮЩИХ ЭНЕРГИЮ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК В ДВИЖЕНИЕ.

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. Ф.И. Атауллаханов

Москва, 2011 <1 2 МАЙ 2011

4845874

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор И. А. Воробьев

доктор биологических наук, профессор Е. С. Надеждина

Ведущее учреждение - институт Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. U.M. Эмануэля РАН

Защита состоится « » 2011г. в часов

на заседании диссергациошюго совета Д.002.252.01 при Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Автореферат разослан « » 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, Николаева И. С. -2-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основная задача делящейся клетки - обеспечить равное разделение генетического материала между дочерними клетками (Алов 1972). Каждая из двух сестринских хроматид в хромосоме должна уйти в свою клетку. Это возможно с помощью полярных белковых полимеров -микротрубочек, которые во время митоза образуют веретено деления. Микротрубочки являются механическими элементами цитоскелета, и в то же время высоко динамичны. Своими минус-концами они прикрепляются к полюсам веретена деления, а плюс-концы постоянно удлиняются и укорачиваются, и способны присоединяться к хромосомам и двигать их. Хромосомы присоединяются к микротрубочкам с помощью белкового суперкомплекса, называемого кинетохором (Mcintosh et al. 2002, Maiato et al. 2004, Westermann et al. 2007). Каждая хроматида из пары, составляющей хромосому, прикрепляется к микротрубочкам, идущим от своего полюса. Кинетохоры крепко связываются с динамическими концами (плюс-концами) микротрубочек, однако субъединицы тубулина по-прежнему могут добавляться или отсоединяться от концов микротрубочек. Понимание механизма, который бы позволял этому закреплению быть одновременно стабильным (нестабильные закрепления приводят к потере хромосом и анеуплоидии) и в то же время динамичным (нарушение динамики микротрубочек останавливает митоз) - один из основных вопросов в области биологии, изучающей деление клетки. Сегодня известно более 100 белков, входящих в состав кинетохора, однако ясной картины механической машины, обеспечивающей его связь с микротрубочкой, до сих пор нет. Сложность связана как с разнообразием теоретических представлений о потенциальном принципе работы такого устройства, так и с тем, что экспериментальная проверка подобных гипотез зачастую была невозможна из-за отсутствия биохимических кандидатов на роль этих устройств.

Daml/DASH, а также компоненты супер-комплекса KMN (K.NL-1, Misl2, Ndc80). Комплекс Daml/DASH может существовать в виде колец и спиралей, также предполагается существование олигомеров меньшего размера. Компоненты суперкомплекса KMN Ndc80 и KNL1 имеют форму фибрилл. В качестве необходимого этапа такие исследования должны включать сравнение полученных данных с математическими моделями передвижения груза разбирающейся микротрубочкой посредством кольца (Efremov et al., 2007) или фибрилл (Mcintosh et al., 2008).

Цель работы: Экспериментальное исследование движения белковых комплексов Daml, Ndc80, Misl2 и белка KNL1 за деполимеризующимися микротрубочками.

Задачи исследования:

1. Исследовать свойства кольцевых и иных комплексов Daml, взаимодействующих с деполимеризующимися микротрубочками. Выяснить возможный механизм сопряжения движения груза с деполимеризацией микротрубочки при помощи кольцевых комплексов Daml.

2. Выяснить экспериментальную возможность работы такого сопрягателя на основе фибриллярных белковых комплексов.

Научная новизна.

микротрубочки, не разрушится. Показано, что существует два различных механизма движения груза (стеклянного шарика) за концом микротрубочки с участием комплексов Daml. В случае, когда шарик прикреплен к микротрубочке через кольцо, шарик двигается медленно, не меняя своей ориентации относительно микротрубочки. Если же шарик, покрытый Daml, прикреплен без участия кольца, то он двигается быстро и катится по поверхности микротрубочки. На основании совокупности полученных данных сделан вывод, что движение хромосом в клетке почкующихся дрожжей происходит с участием колец. Методами флюоресцентной и электронной микроскопии установлено, что комплексы Daml, которые не образуют колец, весьма разнообразны по своему размеру и форме. Показано, что такие комплексы также способны двигаться с концом разбирающейся микротрубочки. Установлено, что фибриллярные белки, которые не могут образовывать колец в принципе, также способны преобразовывать усилие, развиваемое при деполимеризации микротрубочки, в движение груза. Этот результат подтверждает опубликованные данные о разной роли компонентов суперкомплекса KMN в связывании кинетохора с микротрубочкой.

Научно-пракггическое значение.

Фундаментальным результатом данной работы является вклад в понимание механизмов присоединения кинетохоров к микротрубочкам во время деления клетки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Описаны два принципиально отличающихся механизма взаимодействия комплекса Daml с микротрубочкой: кольца (19 ± 3 гетеродекамеров), и более мелкие олигомеры (9 ± 1 гетеродекамеров). Более крупные олигомеры не двигаются по микротрубочке.

2. Охарактеризованы два механизма, с помощью которых Daml трансформирует энергию деполимеризации микротрубочки в

движение груза. Первый механизм существует в отсутствие колец, и шарик в этом случае быстро катится по микротрубочке. Второй механизм представляет собой медленное скольжение шарика, связанного с кольцом на микротрубочке.

3. Фибриллярные комплексы, входящие в состав суперкомплекса KMN, охарактеризованы в отношении их сопрягающих свойств. Наилучшими сопрягателями из них являются белок KMN и комплекс Ndc80, которые обеспечивают непрерывное движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Daml (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.

Апробация работы состоялась 15 февраля 2011 г. на заседании межлабораторного семинара лаборатории молекулярных механизмов гемостаза и лаборатории физиологии и биофизики клетки в Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Материалы диссертации докладывались на международной конференции 48th annual meeting of American Society for Cell Biology (San Francisco, CA, США, 13-17 декабря 2008 г.) и международной конференции 54th Annual Meeting of the Biophysical Society (San Francisco, CA, США, 20-24 февраля 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 2-х конференций и 3 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах

машинописного текста, состоит из введения, шести глав (глава 1 - обзор

литературы, глава 2 - материалы и методы исследования, глава 3-5 - описание

результатов, глава 6 - обсуждение результатов) и библиографического

указателя, включающего 77 источников. Диссертация содержит 1 таблицу и 33

рисунка. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии наук

Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в

-6-

лаборатории физиологии и биофизики клетки (зав. лабораторией д.б.н. проф. Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф. Ричард Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Современные представления. Микротрубочки - элементы цитоскелета клетки, играющие важнейшую роль при ее делении и образующиеся в результате полимеризации тубулина в присутствие гуанозинтрифосфата (ГТФ). Димеры а и р-тубулина формируют линейные цепи, протофиламенты, которые латерально соединяются и образуют полые трубочки диаметром 25 нм. По мере полимеризации микротрубочки ГТФ, связанный с молекулами тубулина в ее стенке, гидролизуется, и равновесная конформация протофиламентов меняется с выпрямленной на изогнутую, затем происходит деполимеризация микротрубочки (Chretien et al., 1995). Показано, что микротрубочки, деполимеризующиеся in vitro, способны переносить грузы (Coue et al. 1991) и развивать силу без участия дополнительных структур (Grishchuk et al. 2005). Сила, которая потенциально может быть развита микротрубочкой, была экспериментально оценена в =70 пН (Молодцов 2007), что на порядок превышает силы, развиваемые АТФ-зависимыми молекулярными моторами.

Теоретические исследования потенциальных механизмов преобразования силы, развиваемой выгибающимися протофиламентами, в полезное движение, предсказали, что оптимальным с энергетической точки зрения сопрягающим устройством является кольцо, диаметр которого на 3-5 нм больше диаметра микротрубочки (Molodtsov et al. 2005). Подобный белковый комплекс, названный Daml или DASH, был найден в клетках почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae и было показано, что удаление его компонентов из клетки ведет к нарушению связи микротрубочек с хромосомами во время митоза и гибели клетки. При экспрессии всех 10 компонентов этого комплекса в бактериальных клетках, последующей биохимической очистке и исследовании смеси очищенного препарата Daml и микротрубочек in vitro

было обнаружено, что на микротрубочках образуются кольца диаметром около 35 нм (Miranda et al. 2005, Westermann et al. 2005).

Более детальное теоретическое исследование кольца Daml было проведено в работе (Efremov et al. 2007). Было предсказано два потенциальных механизма движения подобного кольца вдоль микротрубочки. Если кольцо связано с микротрубочкой слабо, работает механизм «ограниченной диффузии»: тепловые движения кольца вдоль микротрубочки ограничены лишь раскрытым «венчиком» протофиламентов на плюс-конце микротрубочки. В этом случае кольцо не должно замедлять разборку микротрубочки, и максимальная сила, которую может развить микротрубочка на груз, присоединенный через такое кольцо, не превышает 15 пН. В случае же сильного связывания кольца с микротрубочкой работает механизм «вынужденного движения»: самопроизвольные тепловые движения кольца на микротрубочке пренебрежимо малы и протофиламентам необходимо приложить усилие, чтобы сдвинуть кольцо. В этом случае кольцо замедляет скорость разборки микротрубочки в 2-3 раза, а максимальная сила составляет около 40 пН.

В экспериментах in vitro было показано, что флюоресцентные комплексы Daml способны передвигаться за концами деполимеризующихся микротрубочек (Westermann et al. 2006). При этом на основании комбинации этих данных с исследованиями при помощи электронной микроскопии был сделан вывод о том, что за концом микротрубочки могут следовать кольца и комплексы из многих колец. Известно, что пробоподготовка для электронной микроскопии весьма специфична и часто приводит к частичному искажению клеточных структур (HüOg et al. 2010), поэтому такой метод определения строения двигающихся комплексов Daml кажется сильно опосредованным.

В другой работе к динамическим микротрубочкам присоединялись микросферы, покрытые Daml (Asbury et al. 2006), и затем движения шариков отслеживались при помощи лазерного пинцета. В этом исследовании было установлено, что на шарики, присоединенные к микротрубочкам через Daml, способны двигаться за концом разбирающейся микротрубочки как без нагрузки, так и при постоянной приложенной нагрузке в 0.5-3 пН. На основе того, что

шарик, передвигаемый ловушкой, не мог продвинуться дальше предполагаемого места прикрепления микротрубочки к покровному стеклу, авторы делают вывод о том, что шарик прикреплен к микротрубочке посредством кольца. Однако такой метод определения структуры олигомера также является весьма непрямым и спорным. Кроме того, дальнейшие исследования, проведенные этой группой, показали, что даже мономеры Daml способны связываться с микротрубочкой и передвигаться по ней (Gestaut et al. 2008), следовательно кольца не являются необходимыми для поступательного движения Daml по микротрубочке.

Гомологи Daml не встречаются за пределами царства грибов, другие кольцеобразующие комплексы также пока не обнаружены. Считается, что основным устройством, сопрягающим разборку микротрубочек с передвижением хромосом в высших эукариотах служит супер-комплекс KMN, состоящий из двух фибриллярных микротрубочко-связывающих комплексов Knll и Ndc80 и соединяющего их комплекса Misl2 (Cheeseman et al. 2006). Удаление любого из этих комплексов из делящихся клеток ведет к практически полному отсутствию связывания между микротрубочками и кинетохорами хромосом. Исследование возможности прямого сопряжения передвижения груза с деполимеризацией микротрубочки с помощью этих комплексов in vitro является важной, но еще не решенной задачей.

Материалы и методы исследования.

Реагенты и белки. Daml выделялся и метился как описано в работе (Westermann et al. 2005). Тубулин очищался из коровьего мозга по методу циклической полимеризации с последующим разделением на фосфо-целлюлозной смоле как описано в работе (Weingarten et al., 1975), и затем метился родамином по стандартному протоколу (Hyman et al. 1991). Негидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience. Микро-шарики были приобретены у Bangs Laboratories, Inc. и Spherotech. Остальные реактивы закупались у Sigma-AIdrich.

Работа с динамическими микротрубочками. Приготовление проточных

камер и очистка тубулина проводились как описано в работах (Grishchuk et al.,

-9-

2005; Grishchuk and Ataullakhanov, 2010). В экспериментах, где требовалось геометрически заблокировать образование колец, микротрубочки полимеризовались из смеси немеченного и биотинилированного тубулина в соотношении 2.5:1, стабилизировались добавлением таксола и прикреплялись к покровному стеклу, покрытому стрептавидином. В остальных экспериментов для нуклеации микротрубочек использовались адсорбированные на покровное стекло очищенные аксонемы, полученные из хламидомонад, или инактивированные клетки Tetrahymena. Рост микротрубочек индуцировался вмыванием в проточную камеру, находящуюся под микроскопом при температуре 32°С, 1-3 мкМ тубулина в 40 мкл буферного раствора, содержащем 1 мМ ГТФ, 80 мМ K-Pipes рН 6.9 (BRB-80), 0.5 мг/мл казеина и 1 мМ DTT. После 5-10 минут инкубации немеченый тубулин заменялся на меченый родамином, а ГТФ - на GMPCPP. После еще 5-10 минут инкубации тубулин и нуклеотиды удалялись и в камеру вводился раствор, содержащий 1-20 нМ Daml или 0.01% стрептавидиновых шариков, покрытых анти-пентагистидиновыми антителами и затем Daml (по массе). Для приготовления шариков с неравномерной флюоресценцией мы использовали монослой равномерно покрытых анти-пентагистидиновыми антителами шариков диаметром 0.97 мкм путем кратковременного центрифугирования через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм (Nanosep MF, Pall corp.). Затем на нижнюю поверхность фильтра наносилась 1-микролитровая капля немеченного Daml и фильтра оставлялся на 10 минут, чтобы белок мог продиффундировать вверх к шарикам, но не выше 0.5 мкм. Затем шарики отмывались и насыщались флюоресцентным Daml.

Шарики, покрытые компонентами KMN. Для преодоления этого препятствия 0.97-микронные полистиреновые шарики с ковалентно присоединенным стрептавидином (Bangs Laboratories) до инкубаций с белками помещались в 2% желатиновый гель, что предотвращало их взаимодействие друг с другом во время инкубаций, но позволяло взаимодействие с растворенными белками. Шарики затем инкубировались с биотинилирован-ными анти-пентагистидиновыми антителами, либо с биотинилированными F(ab) фрагментами анти-кроличьих вторичных антител (Invitrogen) и затем с приготовленными в лаборатории Иена Чизмана кроличьими антителами к

специфическим субъединицам белковых комплексов (анти-5рс24 или анти-Брс25 для комплекса N^80, анти-КВР1 для комплексов \1isl2 и Misl2-K.NL!, анти-КЫЫ для белка КЫЫ и анти-Ыи(2 для «головы» комплекса Мс80, состоящей из белков Шс80 и Ыи12). Результаты, полученные для анти-пентагистидиновых и специфичных антител, не различались, поэтому были сгруппированы. После отмывки и 3-часовой инкубации с необходимым компонентом комплекса КМЫ гель расплавлялся при 37°С и шарики отмывались еще два раза. Присоединение шариков к микротрубочкам проводилось как описано выше.

Результаты.

Размер комплексов Оат\, следующих за концом микротрубочки. После введения комплексов Бат], меченых флюоресцентной краской А1еха-488, в проточную камеру с сегментированными микротрубосками, они образовывали вдоль микротрубочек неподвижные зеленые точки различной интенсивности. После разрушения стабилизирующей шапки на сегментированной микротрубочки, декорированной А1е,\а488-Оаш1, за ее укорачивающимся концом с постоянной скоростью следовала зеленая точка (Рис. 1). На участках линейного движения по трубочке, свободной от других комплексов, яркость концевого комплекса также была неизменной, что указывает на постоянство структуры концевого комплекса. Тем не менее, устойчивое движение комплексов Иат! иногда прерывалось. Когда двигающийся комплекс

▼

8 «ИШ?/ <1 Щр

.,: ) плюс-конец ^ I пауза # V ■• 11Р - . с о •л <ч

снижение яркости *"" - ЩД-} . V

линейные сегменты 2 мкм

0 Время (с) 200

Рис. 1. Кимограмма (А) и обработка (Б) движения А1еха488-Оаш 1 по деполимеризующейся микротрубочке. Большинство образованных из Оаш1 дикого типа точек не двигаются до тех пор, пока до них не дойдет конец микротрубочки. Диффузия комплексов, помеченногых треугольником, составила < 10"13 см2/с. Вертикальные цветные линии на этой и других кимограммах показывают флюоресцентный канал, в котором производилась съемка.

сталкивался с другим ярким комплексом на поверхности трубки, движение обычно приостанавливалось. Чаще всего движение продолжалось после снижения суммарной яркости комплекса до начального уровня (Рис. I), что является сильным аргументом в пользу существования устойчивого размера двигающегося комплекса. Для того, чтобы оценить количество субъединиц Daml в двигающихся комплексах, мы вначале измерили кинетику выцветания флюоресценции неподвижно прикрепленных к стеклу точек Alexa488-Daml. Если подобные слабо светящиеся точки расфокусированным лучом аргонового лазера с длиной волны в 488 нм их интенсивность снижается ступенчато (Рис. 2). Чтобы удостовериться в этом наблюдении и определить размер единичной ступеньки, мы использовали два алгоритма: аппроксимация распределения интенсивностей функцией Гаусса (Park et al., 2005) или методом распределения попарных разностей (Block et al., 1995). С помощью каждого из методов мы обнаружили статистически достоверное ступенчатое изменение интенсивности флюоресценции (р < 10-5). Яркость единичного флюорофора А1еха488 в нашей системе составила по результатам этих алгоритмов, соответственно 15800 ± 1200 или 16362 ± 1990 условных единиц (Рис. 2). Используя молярное соотношение количества флюорофоров и белка (2.1 ±0.1), из начальной яркости пятна можно вычислить количество субъединиц Daml в этом пятне. Тусклые, неподвижно прикрепленные к стеклу точки сождержапи в себе 1.9 ± 0.4 (п = 44)

Время (с)

1 2 3 4 5 6 Интенсивность ТО* (у.е.)

0 5, 10 15202530

Количество субъединиц Daml

Рис. 2. (А) Типичные кривые выцветания прикрепленных к покровному стеклу тусклых точек Бат1. Размер ступеньки на этих кривых соответствует значению, определенному с помощью двух разных алгоритмов. (Б) Гистограмма интенсивностей для 17 выцветающих точек Оаш1 (всего 486 значений интенсивностей) и аппроксимация эквидистантными Гауссовыми распределениями. (В) Распределение размеров комплексов, двигающихся за концом микротрубочки.

гетеродекамера, то есть являлись димерами. Распределение интенсивностей точек, двигающихся за концом разбирающихся микротрубочек и снятых в тех же экспериментальных камерах и в идентичных условиях, имело отчетливый пик, который, при аналогичном пересчёте, соответствовал 19 ± 3 (п = 18) гетеродекамерам (Рис. 2). Мы делаем вывод, что олигомеры, которые отслеживают концы укорачивающихся микротрубочек, могут быть единичными кольцами, но не двойными.

Взаимодействие покрытых Dam/ шариков с микротрубочками. В предыдущих исследованиях было показано, что шарики, покрытые белком Daml, могут поступательно двигаться за концом разбирающейся микротрубочки (Westermann et al., 2006; Asbury et al., 2006; Franck et al., 2007). В нашей системе шарики, покрытые Daml, тоже часто связывались с трубочками, преинкубированными с AIexa488-Daml, а когда запускалась их разборка, поступательно двигались. В нашей системе шарики, следующие за концом микротрубочки, были крепко связаны с кольцом Daml, что подтверждается следующими двумя наблюдениями. Во-первых, при низком

Рис. 3. Покрытый Оат1 шарик следовал за концом сокращающейся микротрубочки, пока не отсоединился при встрече со связанным со стенкой микротрубочки комплексом Оат1 (черная линия). На вставке показано начальное изображение микротрубочки, декорированной Оаш1, с шариком (зеленый) и шапкой (красный).

Время (с)

120

170

уровне декорации микротрубочки комплексами Daml поступательно движение шариков было аналогично непрерывному отслеживанию конца микротрубочки комплексами Daml на участках микротрубочек, свободных от других комплексов. При более высокой плотности Daml на трубочках двигающиеся шарики иногда встречали неподвижные комплексы Daml. Подобные события часто приводили к отсоединению шарика (Рис. 3), как и ожидалось по результатам описанных выше экспериментов по изучению потери субъениц Daml. Во-вторых, мы протестировали гипотезу о закреплении через кольцо, изучив движения шариков, которые следовали за концом укорачивающихся микротрубочек, в трех измерениях. Если шарик присоединен к трубочке через кольцо, это движение должно представлять собой простое скольжение вдоль ее стенки, так что любая точка на поверхности шарика, а не только его центр, будет двигаться параллельно оси микротрубочки. Чтобы проверить это предположение, мы пометили одну сторону наших шариков флюоресцентным Daml, а затем насытили все остальные сайты связывания немеченым Daml. Подобная Во-вторых, мы протестировали гипотезу о закреплении через кольцо, изучив движения шариков, которые следовали за концом укорачивающихся микротрубочек, в трех измерениях. Если шарик присоединен к трубочке через кольцо, это движение должно представлять собой простое скольжение вдоль ее стенки, так что любая точка на поверхности шарика, а не только его центр, будет двигаться параллельно оси микротрубочки. Чтобы проверить это предположение, мы пометили одну сторону наших шариков флюоресцентным Daml, а затем насытили все остальные сайты связывания немеченым Daml. Подобная обработка позволила нам получить шарики, однородно покрытые белком, но неоднородно флюоресцентные. Когда такие шарики были помещены в камеру с микротрубочками в присутствии растворимого Daml, они скользили вдоль трубочек, как и ожидалось при закреплении через кольцо.

Нужны ли кольца для транспортировки шариков разбирающимися микротрубочками? Чтобы ответить на этот вопрос, мы покрыли шарики AIexa488-Daml, затем тщательно отмыли их от свободного белка. Эти шарики связывались только с частью микротрубочек, выращенной в присутствии GMPCPP, и не связывались с ГДФ-содержащими сегментами. Даже если

шарики были прижаты к стенке трубки с помощью лазерной ловушки, в отстутствие Daml в расторе они не связывались с ГДФ-содержащими микротрубочками. Из этого следует, что в отсутствие растворимого Daml связи между шариком и микротрубочками образуются с участием только нескольких гетеродекамеров Daml, а кольцо не образуется. Эти слабые связи, видимо, стабилизируются более высокой аффинностью Daml к GMPCPP-содержащим сегментам микротрубочек (Westermann et al., 2005).

После фото-разрушения GMPCPP-содержащих шапок 46% из 420 шариков отсоединились, а остальные поступательно двигались в сторону минус-конца микротрубочек со скоростью 30 ± 1 мкм/мин. Подобное отслеживание конца трубочек шариками, покрытыми Daml в отсутствие Daml в растворе, ранее было интерпретировано как результат действия связанных с шариками колец, которые неким образом образовывались из Daml, отсоединяющегося от шариков (Asbury et al., 2006; Franck et al., 2007). Если эта интерпретация верна, то добавление растворимого Daml в систему не повлияет на кинетику, однако в присутствие Daml в растворе скорость движения шариков упала до 8 ± 1 мкм/мин (Рис. 4А). Следует заметить, что шарики, покрытые Daml, ускоряли деполимеризацию микротрубочек (в нашей системе 22 ± 2 мкм/мин, п = 57), когда в растворе отсутствовал Daml. В противоречие гипотезе о том, что кольца образуются из отсоединяющегося от шариков белка,

тствие Daml в растворе

в отсутствие Daml в растворе (N=280)

140-

S 'g 120° £

fi 4

s ° юо-U

N=12

N=32

N=248 свободная МТ

30 50 70 90 1 10 130 150 скорость движения шарика (мкм/мин)

10 102 103 10" Количество комплексов Daml на шарике

Рис. 4. (А) Распределение скоростей движения покрытых Оат! шариков под действием разборки микротрубочек. Когда в растворе есть свободный Оат1, шарики движутся значительно медленнее, чем в его отсутствие. (Б) Зависимость относительных скоростей движения покрытых Оат1 шариков (в отсутствие растворимого Оаш1) от плотности Оат] на поверхности шарика, выраженной в числе молекул и отложенной на логарифмической шкале.

Есть кольцо, ша]эик скользит

присоединен к стеклу покрыт стрептавидином

fS Ш

< ■ -Wb » W ■ ^^ wtv

покрыт Daml + Daml i в растворе

Ш ф S Ф w Щ W « покрыт Daml без Daml il sk, Ш ife ■ * Щ W Ш i в растворе Ф

Ф # m Ф Ф # § 0.-Щ шш

¡2 и

0.2-

х х

Н U 0.0

о.о-

А.

до начала движения во время движения

покрытые Dam 1 (N=12; N=12)

Рис. 5. (А) Схема экспериментальной системы, в которой исследовалась вращательные движения шариков в присутствие (вверху) и в отсутствие колец (внизу) (не в масштабе). Красным отмечены проекции на ось МТ вектора от центра шарика до яркой флюоресцентной точки. Ротационные движения шариков шариков диаметром 1 мкм, покрытых стрептавидином или Daml и прикрепленных к МТ, были исследованы до и после начала деполимеризации МТ (двигались только шарики, покрытые Daml). Шарики с Daml на поверхности исследовались в присутствие и отсутствие Daml в растворе, шарики со стрептавидином на поверхности присоединялись к биотинилированным МТ, шарики, прикрепленные к стеклу, служили дополнительным контролем. На (Б) представлены экспериментальные фотографии шариков из четырех исследованных групп. Вращение яркого пятна относительно центра шарика видно только для шарика, покрытого Daml в отсутствие Daml в растворе. (В) Средние значения стандартных отклонений проекций вектора, соединяющего центр шарика с центром флюоресцентного пятна, для всей выборки шариков.

скорость движения шариков увеличивалась еще больше при увеличении концентрации Daml на шарике (Рис. 4Б). Кроме того, шарики, покрытые фосфо-миметическим комплексом Daml S4D, у которого нарушена олигомеризация (Wang et al., 2007), тоже двигались за концами микротрубочек. Наконец, Daml-шарики двигались за концами микротрубочек даже в отсутствие рМЕ. Это означает, что для такого типа движений нужны биохимически иные требования по сравнению с движением колец. Из этих результатов следует, что

шарики, покрытые Daml, могут транспортироваться деполимеризующейся микротрубочкой и в отсутствие колец. В более ранние исследованиях, в которых такие шарики использовались без Daml и PME в растворе (Asbury et al., 2006; Franck et al., 2007), скорее всего наблюдались движения, не зависящие от наличия колец.

Ранее высказывалось предположение о том, что шарик, покрытый микротрубочко-связывающим белком, может катиться по поверхности микротрубочки (bombillo et al., 1995b, Peskin et al., 1995; Tao et al., 1998). Чтобы проверить эту модель, мы использовали описанный выше подход с использованием неоднородно флюоресцентных шариков. В отсутствие свободного Daml некоторые из шариков, покрытых Daml, явственно вращались во время движения по разбирающейся микротрубочке (Рис. 5Б), что несовместимо с идеей прикрепления через кольцо. Однако вращение было очевидным только в случае, когда плоскость вращения шарика перпендикулярна оптической оси. Поскольку положение шарика случайно, а тепловые движения значительны, для оценки величины вращения шарика мы измеряли проекцию наиболее яркой точки шарика на ось микротрубочки в плоскости изображения (Рис. 6). Шарики, двигающиеся за разбирающейся микротрубочкой, вращались гораздо сильнее, чем (а) те же шарики до начала движения; (б) шарики, наблюдаемые в присутствие растворимого Daml; (в) шарики, неподвижно прикрепленные к трубочке с помощью биотин-стрептавидиновой связи или (г) просто шарики, прилипшие к покровному стеклу (Рис. 5В). Хромосомы не вращаются во время митоза, поэтому кажется маловероятным, что механизм, которым некольцевые комплексы Daml обеспечивают движение шариков, имеет отношение к ситуации in vivo.

-17-

7 6

2 5 I4

>-3 2 1

3 1 0.5-

о ' § § ■

« 2 0.0' В ю

аа-о.5-

С X

Покрытый Оат1 без Оат 1 в растворе......

А**

X(мкм)

Покрытый 1)»п11 + Оат I в растворе

— центр флюоресценции

-центр шарика

X (мкм)

1 2 3 4 5 6 7 80=0.20

0 1 2 3 4 5 6 7

0.5

ло г

/о

0.0

Время (с)

-0.5-1

80=0.09

2.5

5.0

7.5

Время (с)

7 6

>-3 2

Покрытый стрептавидином

л * о 2

о 1

0.5т

X (мкм)

Прикрепленный к стеклу

центр флюоресценции -центр шарика

X(мкм)

2 3 4 5 6 7

£ р 0.05 о

Я ю

£ ^0.5.

о о О- о.

с *

80=0.08

0 1

0.5

2 3 4 5 6 7

41 Время (с)

0.0-0.51

80=0.09

Время (с)

Рис. 6. Здесь представлены движения одиночных шариков из каждой категории. На верхних графиках представлены траектории центра шарика (красные кривые) и яркого пятна на поверхности шарика (зеленые кривые). Вставки показывают движения яркого пятна (зеленые кривые) на поверхности шарика относительно его центра (красный кружок). Размер сетки 0.25 мкм. На нижних графиках представлены временные зависимости проекций на ось МТ вектора, соединяющего центр шарика и яркое пятно на его поверхности для этих четырех шариков. Стандартные отклонения этих кривых от среднего значения (БО) были выбраны мерой вращательной активности шариков.

-18-

Некольцевые и фибриллярные сопрягающие устройства. Результаты, описанные выше, свидетельствуют о том, что гетеродекамеры Daml могут связываться с микротрубочкой и даже обеспечивать движение шариков, не образуя колец. Тем не менее, структурные исследования методами электронной микроскопии говорят о преобладающе высокой частоте встречаемости колец по сравнению с некольцевыми комплексами (Рис. 3.1 Б, Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2005). Однако если кольца выдерживают пробоподготовку лучше мелких комплексов или просто лучше видны, может наблюдаться систематическая ошибка в оценке частоты их встречаемости. Будет ли Daml связываться с микротрубочкой в ситуации, когда кольца не могут образовываться? Для ответа на этот вопрос мы прикрепили биотинилированные трубочки к покровному стеклу, покрытому стрептавидином, по всей длине трубочки, таким образом мешая образованию опоясывающих микротрубочки структур (Рис. 7А). Точки Alexa488-Daml по-прежнему связывались с такими микротрубочками, образуя быстро диффундирующие флюоресцентные точки, которые часто соединялись и разъединялись между собой (Рис. 7Б). Как и следовало ожидать для случайно диффундирующих частиц, связанных с субстратом различным количеством связей, скорость движения этих пятен уменьшалась с увеличением числа связей олигомера с микротрубочкой, что положительно коррелировало с интенсивностю флюоресценции (Рис. 7В). При исследовании таких препаратов с помощью электронной микроскопии после легкой фиксации для стабилизации слабых взаимодействий, мы обнаружили комплексы различной формы и размера, некоторые из которых напоминали дуги (Рис. 7Г). Таким образом, гетеродекамеры Daml могут связываться с микротрубочками не только в виде кольцеобразных образований (Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2005), но и в виде подвижных, структурно разнообразных комплексов, которые мы назвали «бляшками».

В литературе описаны данные, подтверждающие идею о возможности процессивного движения груза за концом деполимеризующейся микротрубочки с помощью нитевидных белков. Хромосомы могут двигаться за деполимеризующимися трубочками in vitro в присутствие менее 1 нМ свободных нуклеотидов (Coue et al., 1991), и это движение блокируется домен-

иммобилизующий | слой

и б л

- L и \

прикрепленная микротрубочка

I 38 пятен Daml были отслежены в течение временных точек

10 12 14 16 18 Интенсивность пятна (у.е.)

Рис. 7. (А) Схема экспериментальной системы, позволяющей пространственно помешать образованию колец (не в масштабе). (Б) Кимограмма, иллюстрирующая временные изменения в положении и яркости точек А1еха488-Эат1 на прикрепленной к стеклу микротрубочке. (В) Зависимость коэффициентов диффузии комплексов Эат1 от их начальной интенсивности. (Г) Электронные микрофотографии микротрубочек, присоединенных к иммобилизирующему слою в отсутствие (1) и в присутствие (2, 3) Оаш1, полученные методом окраски уранил-ацетагом. Изображение на панели 3 было получено предварительной инкубацией микротрубочек с растворимым Оаш1, затем их присоединением к иммобилизирующему слою в присутствие Оат1, так, чтобы могли образоваться и кольца, и некольцевые структуры (отмечены белыми стрелками). На панели 4 показан пример кольца Оаш1, которое образуется на микротрубочке, погруженной в раствор.

специфичными антителами к шейке кинетохорного кинезина CENP-E (Lombillo et al., 1995а). Этот фибриллярный процессивный плюс-концевой мотор может присоединять кинетохоры к микротрубочкам таким образом, чтобы обеспечивалось их минус-концевое движение с концами укорачивающихся трубочками.

Другим кандидатом в фибриллярные сопрягающие устройства служит 57-нанометровый четырехкомпонентный комплекс Ndc80 (Heel), который является высоко консервативным компонентом кинетохора и необходим для взаимодействия кинетохоров с микротрубочками во многих организмах (Davis and Wordeman 2007). В опубликованном недавно исследовании этот комплекс из С. elegans был восстановлен in vitro (Cheeseman et al., 2006). Это дало нам методическую возможность экспериментально проверить, не может ли он обеспечить движение шариков за деполимеризующимися микротрубочками. Шарики, покрытые Ndc80, хорошо связывались с трубочками, причем 90% шариков связывалось с родамин-сордержащей стабильной «шапкой» (Рис. 8А, Б). После запуска разборки микротрубочки большинство шариков

\ \

1-микронный шарик, покрытый комплексом NDC80

инактивированная клетка Tetrahymena

Рис. 8. (А) Схема эксперимента (не в масштабе). (Б) Последовательные изображения шарика, снятые в указанное время в секундах. Последнее изображение показывает траекторию движения центра шарика (зеленая кривая). (В) Расстояния от шарика до места нуклеации микротрубочки в зависимости от времени для семи отдельных экспериментов. Движение ш'арика начиналось вскоре после разрушения шапки на микротрубочке.

Белок или комплекс на поверхности шарика Успешность присоедине ния подтаержде на антителами Связывание (шариков на клетку Tetruhyme па) N (процес-сивных/ всего) Скорость движения ± ст. ошибка (мкм/мин) Пройденное расстояние ± ст. ошибка (мкм) Мак-сималь ный пробег (мкм)

Контроль (анта- пентагист. AT) + 0-5 0/20 н. д. н. д. н. д.

Стрептавидин н. д. 2-5 на аксонему 5/80 42 ±9 2.3 ± 0.8 5.5

МАР2 и tau н. д. 5-10 на аксонему 8/107 37 ± 14 2.3 ± 0.3 4

Misl2 + 2-5 2/48 15 ± 2 0.8 ±0.1 0.9

KNL1 н. д. 5-10 9/56 24 ±6 1.7 ±0.4 2.4

KNL1-Misl2 н. д. 5-10 н. д. н. д. н. д. н. д.

Полный суперкомплекс KMN + 10-20 1/7 17.6 0.5 0.5

Ndc80p + Nuf2p + 20 0/17 н. д. н. д. н. д.

Комплекс Ndc80 + 20 21/211 18 ± 3 2.1 ±0.4 9.1

Daml Флюоресцентный Daml 20 193/420 30 ±1 вся длина микротрубочки 10

Daml + растворимый Daml 20 96/200 8±1 10

Таблица 1. Шарики диаметром 1 или 0.5 мкм покрывались белком или комплексом, указанным в первом столбце, как правило с помощью антител к шести-гистидиновому тэгу (кроме стрептавидина - через биотинилированный альбумин, и MAP - с помощью адсорбции). Специфичность и плотность присоединения оценивались с помощью соответствующих антител, меченых флюоресцентной меткой, или по флюоресценции самого комплекса. Затем шарики вмывапись в камеру с динамическими сегментированными микротрубочками, запускалась разборка микротрубочек и изображения шариков записывались в режиме ДИК с частотой 2-5 кадров в секунду. «Н. д.» = нет данных.

отсоединялись, но 10% двигались в сторону минус-конца трубочки (п = 211). Эти движения были менее длительными, чем движения шариков, покрытых Daml, - средняя длина пробега составила 2.1 мкм, тем не менее некоторые шарики проходили до 9 мкм (Рис. 8Б, В). Эти движения были однонаправлены с движением деполимеризующегося конца микротрубочки с вероятностью > 0.95. Средняя скорость движения составила 18 ± 3 мкм/мин, примерно такая же, как скорость укорочения микротрубочки в нашей системе. Комплекс Ndc80 является частью кинетохорного супер-комплекса KMN, состоящего из белка Knll и комплексов Misl2 и Ndc80 (Cheeseman et al.,v 2006). При исследовании

-22-

компонентов этого комплекса в нашей системе подтвердились полученные биохимически данные по связыванию компонентов этого комплекса с микротрубочкой: шарики, покрытые комплексом Misl2, связывались с МТ и двигались процессивно реже по сравнению с комплексом Ndc80, a Knll и полный супер-комплекс KMN связывались и двигались за концом микротрубочки чаще, чем сам Ndc80 (Таблица 1).

Результаты работы вносят важный вклад в понимание тонких механизмов передачи энергии деполимеризации микротрубочек в движение кольцевых сопрягателей и грузов, прикрепленных с их помощью. Кроме того, показаны способы передвижения грузов с помощью некольцевых приспособлений, а именно неполных колец и фибриллярных белковых комплексов.

ВЫВОДЫ.

1. Исследован характер взаимодействия кинетохорного комлпекса Daml с динамическими микротрубочками in vitro. Обнаружено, что они существуют в виде двух классов олигомеров: одиночных колец, состоящих из 19 ± 3 гетеродекамеров, и более мелких некольцевых олигомеров, содержащих от 2 до 16 гетеродекамеров.

2. Исследованы свойства этих классов олигомеров Daml в отношении передвижения грузов с концом микротрубочки, обнаружено два различных механизма движения шариков. В отсутствие растворимого Daml шарики катятся по микротрубочке со скоростью 30 ± 1 мкм/мин, а при добавлении Daml в раствор шарики скользят вместе с кольцами со скоростью 8 ± 1 мкм/мин.

3. KNL1 и Nd80, фибриллярные компоненты супер-комплекса KMN, обеспечивают движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Daml (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Grishchuk EL, Spiridonov IS, Volkov VA, Efremov A, Westermann S, Drubin D, Barnes G, AtauIIakhanov FI, Mcintosh JR. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. (2008), Proc. Natl. Ac. Sei, 105 (19): 6918-6923.

2. Mcintosh JR, Grishchuk EL, Morphew MK, Efremov AK, Zhudenkov KV, Volkov VA, Cheeseman IM, Desai A, Mastronarde DN, AtauIIakhanov Fl. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores: A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. (2008) Cell 135: 322-333.

3. Mcintosh JR, Volkov V, AtauIIakhanov Fl, Grishchuk EL. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. (2010) J Cell Sei 123: 3425-3434.

4. V. A. Volkov, E. L. Grishchuk, I. S. Spiridonov, A. Efremov, N. Gudimchuk, S. Westermann, D. Drubin, G. Barnes, J. R. Mcintosh, and F. I. AtauIIakhanov. Mechanisms of DAM 1 complex motility with the ends of shortening microtubules. 48th annual ASCB meeting. December 13-17, 2008. San Francisco, CA.

5. V. A. Volkov, A. Zaytsev, F.l. AtauIIakhanov , J.R. Mcintosh, E.L. Grishchuk. In vitro assays to study the coupling properties of the various kinetochore-associated protein complexes. 54lh Biophysical Society Meeting. February 22-25,2010. San Francisco, CA.

6. E.L. Grishchuk, V. A. Volkov, A. Zaytsev, F.I. AtauIIakhanov, J.R. Mcintosh. In vitro Assays to Study Tracking of the Shortening Microtubule Ends and Measurement of the Associated Forces. 49th annual ASCB meeting. December 5-9,2009. San Diego, CA.

Подписано в печать:

18.04.2011

Заказ № 5342 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волков, Владимир Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Возможные механизмы митоза.

1.2 Микротрубочка - древний биологический мотор.

1.3 Механизм перемещения груза деполимеризующейся микротрубочкой.

1.4 Генерация сил выгибающимися протофиламентами.

1.5 Сопряжение объектов с разбирающейся микротрубочкой.

1.5.1 Кольцевые сопрягающие устройства.

1.5.2 Количественный флюоресцентный анализ комплексов Daml.

1.5.3 Неколъцевые сопрягатели.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.

2.1 Бактериальная экспрессия, очистка и мечение комплекса DamI.

2.2 микроскопические исследования взаимодействия флюоресцентных комплексов DamI с микротрубочками.

2.3 Работа с шариками, покрытыми DamI.

2.4 Шарики, покрытые компонентами комплекса KMN.

2.5 Получение изображений и сбор данных.

2.6 Электронная микроскопия.

2.7 Анализ данных.

2.8 Математический анализ кинетики выцветания точек.

2.8.1 Математический анализ кривых выцветания.

2.8.2 /Алгоритм аппроксимации Гауссовыми распределениями.

2.8.3 Алгоритм PDF.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ DAM1 С МИКРОТРУБОЧКОЙ.

3.1 Комплексы DamI, устойчиво двигающиеся с концом разбирающихся микротрубочек, не меняют свой размер.

3.2 Следующий за концом микротрубочки комплекс DamI является кольцом, но не большим комплексом.

3.3 Двигающийся комплекс DamI теряет субъединицы, когда наталкивается на крупный неподвижный комплекс.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ШАРИКОВ, ПОКРЫТЫХ DAM1, С МИКРОТРУБОЧКОЙ.

4.1 Связанный с концом микротрубочки шарик скользит вдоль ее поверхности в присутствие Dami в растворе.

4.2 Покрытые DamI шарики могут следовать за концами микротрубочек в отсутствие колец.

4.3 В отсутствие растворимого DamI шарики, покрытые DamI, катятся, а не скользят.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ. НЕКОЛЬЦЕВЫЕ И ФИБРИЛЛЯРНЫЕ СОПРЯГАТЕЛИ.

5.1 Некольцевые комплексы DamI имеют разный размер и быстро диффундируют.

5.2 Некольцевые комплексы DamI могут следовать за концом разбирающейся микротрубочки.

5.3 Фибриллярные сопрягатели.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6.1 Кинетические и сопрягающие свойства олигомеров DamI in vitro.

6.2 По поводу структуры комплексов DamI, функционирующих на кинетохорах почкующихся дрожжей.

6.3 Поведение покрытых DamI шариков в отсутствие растворимого DamI: сравнение наших результатов с опубликованными данными.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение"

Основная задача делящейся клетки - обеспечить равное разделение генетического материала между дочерними клетками (Алов 1972). Каждая из двух сестринских хроматид в хромосоме должна уйти в свою клетку. Это возможно с помощью полярных белковых полимеров - микротрубочек, которые во время митоза образуют веретено деления. Микротрубочки являются механическими элементами цитоскелета, и в то же время высоко динамичны. Своими минус-концами они прикрепляются к полюсам веретена деления, а плюс-концы постоянно удлиняются и укорачиваются, и способны присоединяться к хромосомам и двигать их. Хромосомы присоединяются к микротрубочкам с помощью белкового суперкомплекса, называемого кинетохором (Mcintosh et al. 2002, Maiato et al. 2004, Westermann et al. 2007). Каждая хроматида из пары, составляющей хромосому, прикрепляется к микротрубочкам, идущим от своего полюса. Кинетохоры крепко связываются с динамическими концами (плюс-концами) микротрубочек, однако субъединицы тубулина по-прежнему могут добавляться или отсоединяться от концов микротрубочек. Понимание механизма, который бы позволял этому закреплению быть одновременно стабильным (нестабильные закрепления приводят к потере хромосом и анеуплоидии) и в то же время динамичным (нарушение динамики микротрубочек останавливает митоз) - один из основных вопросов в области биологии, изучающей деление клетки. Сегодня известно более 100 белков, входящих в состав кинетохора, однако ясной картины механической машины, обеспечивающей его связь с микротрубочкой, до сих пор нет. Сложность связана как с разнообразием теоретических представлений о потенциальном принципе работы такого устройства, так и с тем, что экспериментальная проверка подобных гипотез зачастую была невозможна из-за отсутствия биохимических кандидатов на роль этих устройств.

В связи с этим актуальны исследованиия сопрягающих свойств наиболее вероятных кандидатов на роль посредника между микротрубочкой и кинетохором. Такими кандидатами в настоящее время считаются комплекс а Daml/DASH, а также компоненты супер-комплекса KMN (KNL-1, Misl2, Ndc80). Комплекс Daml/DASH может существовать в виде колец и спиралей, также предполагается существование олигомеров меньшего размера. Компоненты суперкомплекса KMN Ndc80 и KNL1 имеют форму фибрилл. В качестве необходимого этапа такие исследования должны включать сравнение полученных данных с математическими моделями передвижения груза разбирающейся микротрубочкой посредством кольца (Efremov et al., 2007) или фибрилл (Mcintosh et al., 2008).

Задачи исследования:

Научная новизна.

В работе впервые установлено, что комплекс Daml образует на динамических микротрубочках как кольца, так и комплексы меньшего размера. Показано, что максимальный размер олигомера, который способен двигаться под действием деполимеризации микротрубочки, не превышает одиночного кольца. Установлено, что кольца замедляют разборку микротрубочки, причем размер и скорость двигающегося комплекса не изменяются во время движения. При этом, если олигомеры большего размера образуются спонтанно или в результате столкновения двух колец, то разборка микротрубочки приостанавливается до тех пор, пока кольцо, находящееся ближе к плюс-концу микротрубочки, не разрушится. Показано, что существует два различных механизма движения груза (стеклянного шарика) за концом микротрубочки с участием комплексов Daml. В случае, когда шарик прикреплен к микротрубочке через кольцо, шарик двигается медленно, не меняя своей ориентации относительно микротрубочки. Если же шарик, покрытый Бат1, прикреплен без участия кольца, то он двигается быстро и катится по поверхности микротрубочки. На основании совокупности полученных данных сделан вывод, что движение хромосом в клетке почкующихся дрожжей происходит с участием колец. Методами флюоресцентной и электронной микроскопии установлено, что комплексы Ват1, которые не образуют колец, весьма разнообразны по своему размеру и форме. Показано, что такие комплексы также способны двигаться с концом разбирающейся микротрубочки. Установлено, что фибриллярные белки, которые не могут образовывать колец в принципе, также способны преобразовывать усилие, развиваемое при деполимеризации микротрубочки, в движение груза. Этот результат подтверждает опубликованные данные о разной роли компонентов супер-комплекса КМИ в связывании кинетохора с микротрубочкой.

Научно-практическое значение.

Фундаментальным Результатом данной работы является вклад в понимание механизмов присоединения кинетохоров к микротрубочкам во время деления клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Описаны два принципиально отличающихся механизма взаимодействия комплекса Ваш1 с микротрубочкой: кольца (19 ± 3 гетеродекамеров), и более мелкие олигомеры (9 ± 1 гетеродекамеров). Более крупные олигомеры не двигаются по микротрубочке.

2. Охарактеризованы два механизма, с помощью которых Баш1 трансформирует энергию деполимеризации микротрубочки в движение груза. Первый механизм существует в отсутствие колец, и шарик в этом случае быстро катится по микротрубочке. Второй механизм представляет собой медленное скольжение шарика, связанного с кольцом на микротрубочке.

Фибриллярные комплексы, входящие в состав супер-комплекса КМ1Ч, охарактеризованы в отношении их сопрягающих свойств. Наилучшими сопрягателями из них являются белок КМЧ и комплекс N<1080, которые обеспечивают непрерывное движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Ваш1 (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Волков, Владимир Алексеевич

выводы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волков, Владимир Алексеевич, Москва

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. 1972. «Медицина». Москва.

2. Молодцов М. И. Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил: дис. канд. биол. наук: 03.00.02 Москва, 2007 91 с. РГБ ОД, 61:07-3/544

3. Asbury, С. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D. and Davis, Т. N. (2006). The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 9873-9878.

4. Block SM, SvobodaK(1995) Analysis of high resolution recordings of motor movement. Biophys J 68:230S-239S.

5. Brouhard GJ, Stear JH, Noetzel TL, Al-Bassam J, Kinoshita K, Harrison SC, Howard J, Hyman AA. (2008) XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell 132:79-88.

6. Cheeseman I, Niessen S, Anderson S: Hyndman F, Yates JR, Oegema K, Desai A (2004) A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension. Genes Dev, 18:2255-2268.

7. Cheeseman, I. M., Chappie, J. S., Wilson-Kubalek, E. M. and Desai, A. (2006). The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore. Cell 127, 983-997.

8. Chen Y, Riley DJ, Chen PL, Lee WH (1997) Нес, a novel nuclear protein rich in leucine heptad repeats specifically involved in mitosis. Mol Cell Biol 17:6049-6056.

9. Chretien, D., Fuller, S. D. and Karsenti, E. (1995). Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol. 129, 1311-1328.

10. Cottingham, F. R., Gheber, L„ Miller, D. L. and Hoyt, M. A. (1999). Novel roles for saccharomyces cerevisiae mitotic spindle motors. J. Cell Biol. 147, 335-350.

11. Coue, M., Lombillo, V. A. and Mcintosh, J. R. (1991). Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J. Cell Biol. 112, 1165-1175.

12. DeLuca JG, Dong Y, Hergert P, Strauss J, Hickey JM, Salmon ED, McEwen BF (2004) Heel and Nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Mol Biol Cell 16(2):519-31.

13. Desai A, Rybina S, Muller-Reichert T, Shevchenko A, Hyman A, Oegema K (2003) KNL-1 directs assembly of the microtubule-binding interface of the kinetochore in C. elegans. Genes Dev, 17:2421-2435.

14. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R. and Ataullakhanov, F. I. (2007). In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 1901719022.

15. Elie-Caille, C., Severin, F., Helenius, J., Howard, J., Muller, D. J. and Hyman, A. A. (2007). Straight GDP-tubulin protofilaments form in the presence of taxol. Curr. Biol. 17, 1765-1770.

16. Franco, A., Meadows, J. C. and Millar, J. B. (2007). The Daml/DASH complex is required for the retrieval of unclustered kinetochores in fission yeast. J. Cell Sci. 120, 3345-3351.

17. Fygenson DK, Braun E, Libchaber A (1994) Phase diagram of microtubules. Phys Rev E 50:1579-1588.

18. Gachet, Y., Reyes, C., Courtheoux, T., Goldstone, S., Gay, G., Serrurier, C. and Tournier, S. (2008). Sister kinetochore recapture in fission yeast occurs by two distinct mechanisms, both requiring Daml and Klp2. Mol. Biol. Cell 19, 1646-1662.

19. Garcia, M. A., Koonrugsa, N. and Toda, T. (2002). Spindle-kinetochore attachment requires the combined action of Kin I-like Klp5/6 and Alpl4/Disl-MAPs in fission yeast. EMBO J. 21, 6015-6024.

20. Gelfand, V. I. Cytoplasmic microtubular motors. (1989) Curr Opin Cell Biol. 1989 Feb;l(l):63-6.

21. Grishchuk EL and Ataullakhanov FI. (2010) In vitro assays to study the tracking of shortening microtubule ends and to measure associated forces. Methods Cell Biol. 95:657-76.

22. Grishchuk, E. L. and Mcintosh, J. R. (2006). Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. EMBO J. 25, 48884896.

23. Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Molodtsov, M. and Ataullakhanov, F. I. (2010). Force generation by dynamic microtubule polymers. In Biophysics, Vol. 7 (ed. Y. E. Goldman and E. M. Ostap). Elsevier (in press).

24. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. and Mcintosh, J. R. (2005). Force production by disassembling microtubules. Nature 438, 384388.

25. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S. and Mcintosh, J. R. (2007). Mitotic chromosome biorientation in fission yeast is enhanced by dynein and a minus-end-directed, kinesin-like protein. Mol. Biol. Cell 18, 2216-2225.

26. Hill, T. L. (1985). Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4404-4408.

27. Inoue, S. and Salmon, E. D. (1995). Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol. Biol. Cell 6, 1619-1640.

28. Ishikawa, M., Yogi, O., Ye, J. Y., Yasuda, T., and Maruyama, Y., (1998) Anal. Chem., 70, 5198.

29. Joglekar AP, Bouck DC, Molk JN, Bloom KS, Salmon ED (2006) Molecular architecture of a kinetochore-microtubule attachment site. Nat Cell Biol 8:581-585.

30. Joglekar, A. P. and Hunt, A. J. (2002). A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys. J. 83, 42-58.

31. Jordan, M. A., Toso, R. J., Thrower, D. and Wilson, L. (1993). Mechanism of mitotic block and inhibition of cell proliferation by taxol at low concentrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9552-9556.

32. Kerres, A., Jakopec, V., Fleig U. (2006) The conserved Spc7 protein is required for spindle integrity and links kitetochore proteins in fission yeast. Mol Biol Cell, 18: 2441-2454.

33. Kim, Y„ Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. (2008) CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. J Cell Biol 181(3):411-9.

34. Kirschner, M. W., Honig, L. S. and Williams, R. C. (1975). Quantitative electron microscopy of microtubule assembly in vitro. J. Mol. Biol. 99, 263276.

35. Koshland, D. E., Mitchison, T. J. and Kirschner, M. W. (1988). Poleward chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature 331, 499-504.

36. Maiato H, DeLuca J, Salmon ED, Earnshaw WC. (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci. 117(Pt 23):5461-77.

37. Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. and Milligan, R. A. (1991). Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo- electron microscopy study. J. Cell Biol. 114, 977-991.

38. Mao, Y., Varma, D. and Vallee, R. 2010. Emerging functions of forceproducing kinetochore motors. Cell Cycle 9, 715-719.

39. Mcintosh JR, Grishchuk EL, West RR. (2002) Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol. 18: 193-219.

40. Meraldi P, Draviam VM, Sorger PK (2004) Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell, 7:45-60.

41. Miranda, J. J., De Wulf, P., Sorger, P. K. and Harrison, S. C. (2005). The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 138-143.

42. Miranda, J. J., King, D. S. and Harrison, S. C. (2007). Protein arms in the kinetochore-microtubule interface of the yeast DASH complex. Mol. Biol. Cell 18, 2503-2510.

43. Mitchison, T. J. and Kirschner, M. W. (1985). Properties of the kinetochore in vitro. I. Microtubule nucleation and tubulin binding. J. Cell Biol. 101, 755765.

44. Molodtsov, M. I., Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., Mcintosh, J. R. and Ataullakhanov, F. I. (2005a). Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 4353-4358.

45. Nicklas, R. B. (1997). How cells get the right chromosomes. Science 275, 632-637.

46. Park M, Kim H-H, Kim D, SongNW(2005) Counting the number of fluorophores labeled in biomolecules by observing the fluorescence-intensity transient of a single molecule. Bull Chem Soc Jpn 78:1612-1618.

47. Pearson CG, Yeh E, Gardner M, Odde D, Salmon ED, Bloom K. (2004) Stable kinetochore-microtubule attachment constrains centromere positioning in metaphase. CurrBiol 14:1962-1967.

48. Putkey, F.R., Cramer, T., Morphew, M.K., Silk, A.D., Johnson, R.S., Mcintosh, J.R., and Cleveland D.W. (2002) Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Dev. Cell 3 : 351 -365 .

49. Rieder, C. L., and Salmon, E. D. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug;8(8):310-8.

50. Schmidt, T., Schutz, G. J., Gruber, H. J. and Schindler, H. (1996). Anal. Chem., 68,4397

51. Shang C, Hazbun TR, Cheeseman IM, Aranda J, Fields S, Drubin DG, Barnes G. (2003) Kinetochore protein interactions and their regulation by the Aurora kinase Ipllp. Mol Biol Cell 14:3342-3355.

52. Sharp, D. J., Rogers, G. C. and Scholey, J. M. (2000). Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat. Cell Biol. 2, 922-930.

53. Tan D, Asenjo AB, Mennella V, Sharp DJ, Sosa H. (2006) Kinesin-13s form rings around microtubules. J Cell Biol. 175(1):25-31.

54. Tanaka, K., Kitamura, E., Kitamura, Y. and Tanaka, T. U. (2007). Molecular mechanisms of microtubule-dependent kinetochore transport toward spindle poles. J. Cell Biol. 178, 269-281.

55. Wang, HW, and Nogales, E. (2005) Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly. Nature. 435(7044):911-5.

56. Welburn, J. P., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., 3rd and Cheeseman, I. M. (2009). The human kinetochore Skal complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell 16, 374-385.

57. Westermann S, Drubin DG, Barnes G. (2007) Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu Rev Biochem. 76: 563-91.

58. Westermann, S., Avila-Sakar, A., Wang, H. W., Niederstrasser, H., Wong, J., Drubin, D. G., Nogales, E. and Barnes, G. (2005). Formation of a dynamic kinetochore-microtubule interface through assembly of the Daml ring complex. Mol. Cell 17, 277-290.

59. Westermann, S., Wang, H. W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E. and Barnes, G. (2006). The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature 440, 565-569.

60. Wigge PA, Kilmartin JV (2001) The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol, 152:349-360.

61. Wood, K.W., Sakowicz, R., Goldstein, L.S., and Cleveland D .W. (1997) CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 : 357 366 .

62. Wordeman, L., Wagenbach, M. and von Dassow, G. (2007). MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J. Cell Biol. 179, 869-879.

63. Yang, Z„ Tulu, U. S., Wadsworth, P. and Rieder, C. L. (2007). Kinetochore dynein is required for chromosome motion and congression independent of the spindle checkpoint. Curr. Biol. 17, 973-980.

64. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K.F., and Cleveland D.W. (2000) CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nat. Cell Biol. 2 : 484 491 .

65. Zheng L, Chen Y, Lee WH (1999) Heclp, an evolutionarily conserved coiled-coil protein, modulates chromosome segregation through interaction with SMC proteins. Mol Cell Biol, 19:5417-5428.

Информация о работе

Волков, Владимир Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы