Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле"

РГ6 од

Московский Государственный Университет 1 Т; П'^В им.М.В.Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

КУДРЯВЦЕВ ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

УДК 576.353:576.311

Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата билогических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Института физико - химической биологии им. А.Н.Белозерского (директор -

академик РАН В.П.Скулачев ) Университета им. М.В.Ломоносова.

Московского Государственного

Научный руководитель:

доктор биологических наук, О.В.Зацепина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Ю.Ф.Богданов

кандидат биологических наук, В.В.Бураков

Ведущее учреждение:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита диссертации состоится "_"_ 1997 г.

в " " часов на заседании специализированного ученого совета Д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 23 " ^е-^гДа-ч, 1996 г.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Точная сегрегация генома, необходимая для сохранения постоянства генетической информации в ряду клеточных поколений, осуществляется благодаря работе центромерного района хромосом, или центромерного комплекса. При делении клеток в этой зоне формируется кинетохор - ДНК-белковая структура, обеспечивающая правильную сегрегацию хромосомного материала. "Зрелый", т.е. полностью сформированный кинетохор, состоит из трех слоев: наружной и внутренней пластинок, разделенных промежуточным слоем - средней пластинкой (Eamshaw 1994). Пластинки кинетохора обеспечивают взаимодействие и прочную свзь митотических хромосом с микротрубочками веретена деления. По-видимому, именно в этой зоне расположены специфические моторные белки, осуществляющие движение и сегрегацию хромосом, а также факторы, регулирующие процесс клеточного деления (piuta et ai.-,i995).

Благодаря многочисленным исследованиям центромерного района метафазных хромосом человека в составе этого домена было обнаружено несколько классов специфических белков, включая

CENP, INCENP И CLIP беЛКИ (Schulman, Bloom 1991). ДЛЯ МНОГИХ ИЗ

них установлены точная аминокислотная последовательность, кодирующая их последовательность ДНК, ультраструктурная локализация в области центромеры (Piuta et ai.,1995).

В литературе, однако, имеется очень мало сведений о динамике структурных преобразований центромерного комплекса в ходе клеточного цикла. Не известно, каким образом происходит сборка и разборка кинетохоров в митозе, не понятен принцип организации "зрелых" кинетохоров и характер их взаимодействия с материалом хромосом, не установлена роль многих центромерных белков при функционировании центромеры.

Особенно удобным объектом для исследований такого рода являются клетки мыши. У этого объекта, в отличие от клеток человека и многих других млекопитающих, блоки центромерного гетерохроматина морфологически выявляются не только в митозе, но и на стадии интерфазы, когда они формируют индивидуальные хромоцентры (Natarajan, Gropp, 1972). Это обстоятельство

позволяет изучать центромерный район хромосом в течение всего клеточного цикла. Однако литературные данные об организации центромерного комплекса у мыши практически отсутствуют.

В связи с этим, основной целью настоящей работы стало исследование ультраструкгурной организации и антигенных свойств центромерного комплекса мышиных фибробластов в динамике клеточного цикла, включая последовательные стадии митоза и интерфазу, а также при искусственной модификации центромеры и патологии штоза.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи;

1. С помощью электронной микроскопии и серийных ультратонких срезов описать морфологию центромерного комплекса последовательно на всех стадиях митоза в клетках мыши. Определить фазы митоза, когда формируется и полностью исчезает характерная структура кинетохоров.! Описать особенности ульграструктурной организации кинетохора в условиях прометафазного, метафазного и анафазного движения хромосом.

2. Отработать методику получения препаратов митотических хромосом для ишуноцитохимического анализа. С помощью антицентромерных сывороток описать поведение основных центромерных белков сеыр-а, в и с в динамике штоза в клетках мыши.

3. Описать распределение и взаимное расположение центромерного гетерохроматина (хромоцентров) и прекинетохоров в интерфазных ядрах шли.

4. Описать динамику появления растянутых центромерных районов хромосом в митозе при инкубации клеток мыши с бензимидом Хехст 33258. Изучить ультраструктуру, антигенные свойства и функциональное состояние искусственно модифицированной центромеры.

5. Принимая во внимание данные о появлении патологических митозов при цитомегаловирусной инфекции, провести ультраструктурное и иммуноцитохимическое исследование центромеры и кинетохоров в фибробластах человека в норме и при патологии.

Научная новизна и практическое значение работы

В работе впервые был проведен детальный анализ поведения центромерного комплекса клеток мыши последовательно на всех стадиях митоза и в интерфазе. Подробно изучен процесс формирования и . разборки кинетохоров, а также проведено исследование их ультраструктурной организации на всех стадиях активного движения хромосом. Показано, что кинетохоры появляются на хромосомах в ранней прометафазе, одновременно с возникновением первых разрывов в ядерной оболочке. Впервые показано, что наружная пластинка мегафазных кинетохоров мыши в нормальных условиях состоит из отдельных фрагментов, каждый из которых взаимодействует с одной микротрубочкой. Установлено, что разрушение кинетохоров происходит в течение короткого периода времени в ранней телофазе и не является "обратным" повторением динамики их формирования.

С целью поиска новых белков центромеры проведен скрининг более 100 сывороток крови от аутоиммунных больных и найдены три сыворотки, содержащие антитела к центромерным районам хромосом.

Разработана методика получения препаратов митотических хромосом для иммуноцитохимического исследования центромеры и других участков митотических хромосом. С помощью этого метода с использованием аутоиммунных сывороток исследовано поведение центромерных белков cenp-a,b и с последовательно на всех стадиях митоза.

Изучено распределение хромоцентров и прекинетохоров в интерфазных ядрах мыши. Впервые показано их пространственное взаимодействие.

Впервые подробно исследовано влияние бензимида Хехста 33258 на морфологию, ультраструктуру, антигенные свойства и функцию центромеры мыши в митозе. Показано, что действие Хехста 33258 на живые клетки l- 929, приводящее к растяжению центромеры на стандартных препаратах хромосом (Hiiwig, Gropp, 1973), не приводит к нарушению структуры кинетохоров и их антигенных свойств, а также способности хромосом к движению и сегрегации в митозе.

Впервые изучены структура и антигенные свойства центромерного района метафазных хромосом в фибробластах человека при цитомегаловирусной инфекции, вызывающей появление в культуре клеток патологических митозов (Makarova et al., 1995). Показано, что при патологии типичные кинетохоры на хромосомах не формируются, хотя- основные центромерные белки - cenp-a,в,с, сохраняются в составе хромосом. Высказано предположение, что при заражении клеток человека цитомегаловирусом наблюдается особый тип К-митозов, при котором блокировка клеточного деления происходит не за счет разборки митотического веретена, а в результате нарушения структуры кинетохоров.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на хххи Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Денвер, США, 15-19 ноября 1992 г.), на vi Международной Конференции "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Москва, РОССИЯ, 18-22 декабря

1995 г.), на xri Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, Россия, 22-24 октября

1996 г.), а также докладывались на семинарах в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского и на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I.Объект исследований. В качестве объекта исследований в работе использовали, главным образом, клетки культуры мыши l-929, а также человека неьа. Для изучения патологических эффектов цитомегаловирусной инфекции использовали первичную культуру фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЗЧ). Монослой клеток выращивали на покровных стеклах или в матрасиках на среде Игла MEM (L-929) и среде 199 ( неьа) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотиков. За исключением специальных случаев, клетки использовали на 2-3 сутки после посадки в

экспоненциальной фазе роста. Первичную культуру мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) получали из 4-5 дневных зародышей мыши и выращивали на среде Игла MEM при описанных выше условиях.

2.Стандартные препарата митотических хромосом. Для анализа общей морфологии центромерного района готовили препараты митотических хромосом, фиксированные спиртом с уксусной кислотой и распластанные на предметных стеклах по стандартной методике

(Rothfels,Siminovitch 1958).

3.Прижизненные наблюдения за клетками. Для изучения влияния бензимида Хехста 33258 на функцию центромеры в митозе проводили прижизненные наблюдения за клетками L-929. Их выращивали в стеклянных камерах в среде с Хехстом 33258 в концентрации 40 мкг/мл в течение времени от 0,5 до 2 ч и от 16 до 24 ч. В качестве контроля служили клетки, культивируемые в тех же условиях, но без добавления бензимида.

4.Радиоавтография. С целью выяснения, на какой стадии клеточного цикла происходит модификация центромерных районов хромосом Хехстом 33258, в матрасики с растущими клетками добавляли н3-тимидин (10 мкКюри) и бензимид. Через 20 мин изотоп отмывали и клетки инкубировали в среде с Хехстом 33258 I, 2 и 4 часа. Далее готовили стандартные хромосомные препараты, которые покрывали мелкозернистой эмульсией типа "М" (НИИХИМФОТО). По истечении срока экспозиции автографы проявляли и фиксировали по общепринятой методике (Епифанова и др.,1977).

5 • Характеристика___сывороток__и__антител,__использованных__в

работе. Для изучения антигенных свойств центромеры использовали аутоиммунную сыворотку gs, предоставленную проф.Эрншоу, которая содержит антитела к центромерным белкам cenp-a, вис (Earnshaw et ai., 1989). Кроме того, в работе была использована аутоиммунная сыворотка M8I, обнаруженная нами в ходе скрининга материала от аутоиммунных больных, полученного из Медицинской Академии Последипломного Образования (МАЛО, С.-Петербург, Россия). Для изучения репликации хромоцентров были использованы коммерческие моноклональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток, pcna (Sigma), предетавлявдему собой

добавочный белок к сигма-субъединице ДНК-полимеразы

(Waseem,Lane, 1990; Celis.Celis, 1985).

6.Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез тотальных белков, экстрагированных из клеток L-929 и неьа, проводили в градиенте полиакриламидного геля с додещглсульфатом натрия по стандартной методике (ьаешцу, 1970). Иммуноблоттинг выполняли методом полусухого переноса на нитроцеллюлозную мембрану по Товбину (Towbin et al., 1979).

7.Световая иммуноцитохимия. Для иммуноцитохимического анализа in situ клетки фиксировали холодным метанолом (-20°С, 10 мин) или 3% параформальдегидом на фосфатном буфере pbs при комнатной температуре 10 мин. После фиксации параформальдегидом клетки дополнительно обрабатывали 0,05% Тритоном Х-100 10 мин. В качестве первых антител использовали сыворотки M8I и gs, разведенные на pbs 1:50 и 1:500 соответственно, а также антитела к pcna, разведенные 1:100. Клетки инкубировали с первыми антителами 30 мин при 37°С. После отмывки в буфере pbs, их обрабатывали при тех же условиях вторыми антителами, конъюгированными с красителями ФИТЦ, ТРИТЦ или Техасским красным, разведенными 1:50 на том же буфере. Готовые препараты изучали в эпифлуоресцентный микроскоп "Оптон", используя объектив 63х и набор соответствующих фильтров.

8•Приготовление препаратов хромосом для иммуноцитохимического' анализа. За основу была взята методика, предложенная в работе Эрншоу с соавторами (Earnshaw et ai., 1989). Клетки, растущие на покровных стеклах, обрабатывали 0,8% раствором цитрата натрия 20 мин при 37°С, затем помещали в чашки Петри и центрифугировали в течение I мин на центрифуге Jouan (France) с бакет-ротором при 24оо об/мин с максимальным ускорением. Клетки фиксировали параформальдегидом и окрашивали антителами как описано выше.

9.Электронная микроскопия. Клетки ь-э29.растущие на покровных стеклах, фиксировали 2,5$ глутаровым альдегидом на фосфатном буфере Зеренсена (рн 7.2-7.4), постфиксировали 1% осмиевой кислотой, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в Эпон-812. После полимеризации клетки, находящиеся на определенной стадии митоза, метили и резали на серийные

ультратонкие срезы, которые докрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу и изучали в электронный микроскоп ни-ив.

10.Электронная иммуноцитохимия. Для изучения тонкой локализации центромерных белков в интерфазе готовили криосрезы по методу Токуяшу (Tokuyasu 1989). Клетки фиксировали 4% парафоральдегидом на буфере pipes (рн 6,95), переносили в 2,3 М раствор сахарозы с 25% поливинилпироллидона и замораживали в

ЖИДКОМ азоте (Raska et al.,1995; Griffiths et al., 1984).

Ультратонкие криосрезы получали на ультрамикротоме uitracut е , оборудованном приставкой FС4 (Reichert-Jung). Препараты окрашивали антицентромерной сывороткой gs в разведении 1:50 и докрашивали вторыми антителами к иммуноглобулинам человека,

МеЧеННЫМИ КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ (Диаметр ЧаСТИЦ 5 HM)(Sigma).

II. Изучение свойств центромерного комплекса при заражении клеток цитомегаловирусом. Для исследования свойств центромерного района хромосом при цитомегаловирусной инфекции клетки ФЛЭЧ заражали цитомегаловирусом (штамм ad 169) со множественностью заражения I Бое/кл. Для изучения общей морфологии патологических митозов монослой зараженных клеток фиксировали 70% метанолом на разные сроки после инфицирования и окрашивали карболовым фуксином по Лилли (Лилли 1969). Для анализа ультраструктурной организации и антигенных свойств центромеры применяли световую иммунофлуоресцентную микроскопию и электронную микроскопию ультратонких срезов, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Макроструктура центромерного района хромосом в митотических и интерфазных клетках мыши.

В составе метафазных пластинок, полученных из клеток ь-929, содержится в среднем 64 хромосомы (в разных клетках - от 53 до 120 хромосом). Из них около 20 являются мета- и субметацентриками, а остальные - акроцентриками. Во многих пластинках встречается маркерная для данной культуры, мультицентрическая, хромосома. После окраски хромосом

флуорохромом Хехст 33258 или по С-методике в районе их первичной перетяжки наблюдаются крупные блоки центромерного гетерохроматина (ЦГХ) размером около 0,8 мкм. Клетки МЭФ имеют более стабильный кариотип, соответствующий дикому типу. В их составе выявляется 40 хромосом, все из которых являются акроцентриками. После окрашивания Хехстом 33258 во всех хромосомах, за исключением одной, видны блоки ЦГХ. Их средний размер в клетках МЭФ выше, чем в клетках ь-эгэ, и составляет 1,2 мкм.

Дискретные блоки ЦГХ, хромоцентры, обнаруживаются в мышиных клетках также на стадии интерфазы. В ядрах МЭФ их число варьирует от 10 до 45, составляя в среднем 23. Это в два раза меньше числа хромосом, характерного для данной культуры (40). Размеры хромоцентров в составе одного ядра варьируют от 0,6 до 2,4 мкм, а их средний диаметр составляет 1,6 мкм. При этом ядра с небольшим числом хромоцентров, как правило, имеют диаметр около 12 мкм, а ядра с большим числом хромоцентров имеют размер не менее 15-20 мкм. Редуцированное, по сравнению с числом хромосом, количество хромоцентров и значительное разнообразие их размеров свидетельствуют о том, что центромерные участки соседних хромосом могут сливаться. Поскольку среднее число хромоцентров в интерфазных ядрах МЭФ (23) оказывается примерно в два раза меньше числа хромосом (40), можно предположить, что в ассоциации чаще всего принимают участие две хромосомы.

3. Иммуноцитохимический анализ центромерного комплекса мыши в динамике клеточного цикла.

а) скрининг аутоиммунных сывороток

Для получения антител к центромерным белкам был проведен скрининг материала от аутоиммунных больных с синдромом crest (Earnshaw,Rothfield, 1985). В ХОДе СКРИНИНГЭ бЫЛО выявлено три

антицентромерных сыворотки, одна их которых, M8I, в тотальных клеточных экстрактах клеток HeLa и ь-эгэ специфически выявляла одну белковую полосу в районе 16 кД. Согласно литературным данным, это значение близко к молекулярной массе центромерного

бежа cenp-a, являющегося специфическим для центромерного района вариантом гистона НЗ (Sullivan et al.,1987).

б ) приготовление хромосомных препаратов__для__шмуноцитохими-

ческого окрашивания

Анализ окраски центромерных районов хромосом в митозе при фиксации клеток in situ был значительно затруднен из-за сильного перекрывания митотических хромосом. Вместе с тем, стандартные методы получения хромосомных препаратов, путем фиксации смесью спирта с уксусной кислотой и распластывания на поверхности стекла, также оказались непригодными из-за нарушения антигенных свойств клеток под действием уксусной кислоты (Earnshaw et al., 1989 ). Поэтому для проведения иммуноцитохимического исследования центромеры в митозе был применен метод получения распластанных препаратов митотических хромосом путем центрифугирования клеток на покровных стеклах и их фиксации параформальдегидом (Earnshaw et ai., 1989). В настоящей работе были подобраны условия для получения таких препаратов из клеток l-9 29 и проведено их окрашивание аутоиммунными сыворотками M8I и gs.

в) характер_окраски__аутошллушвлда__сывороткаш__центромерных

райднов_хромосом_м™и_в_митозе

В профазе, когда конденсация хромосом только начинается, после окраски клеток сыворотками M8I и gs над хромосомами, как правило, наблюдаются крупные одиночные светящиеся пятна диаметром 1,3 мкм. Среднее число окрашенных районов в клетке (61) примерно соответствует количеству хромосом, характерному для данной культуры (63) (табл.1).

В ходе конденсации хромосом в прометафазе происходит уменьшение среднего размера окрашенных участков до 0,8 мкм и появление среди них парных зон флуоресценции (табл.1).

Метафазные хромосомы характеризуются максимальной степенью конденсации. При этом становится хорошо видно, что метка располагается исключительно в зоне первичной перетяжки хромосом над блоками ЦГХ. Окрашенные районы имеют вид двойных мелких точек, диаметр которых не превышает 0,5 мкм. Доля одиночных

окрашенных гранул составляет не более Кроме того, в

метафазе происходит увеличение расстояния между флуоресцирующими зонами, соответствующими центромерным участкам сестринских хроматид (табл.1).

В поздней анафазе вновь наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции и размеров окрашенных зон. В поздней телофазе -начале когда хромосомы значительно деконденсируются и

принимают вид ингерфазных ядер, размеры окрашенных участков увеличиваются до 0,7 мкм (табл.1). Центромерные районы, насколько об этом можно судить по фотографиям, отснятым в одной оптической плоскости, оказываются распределенными по всему объему ядра.

Таблица I. Характер окраски антицентромерной сывороткой М31 хромосомных препаратов из клеток 1.-929 на разных стадиях митоза*.

Стадия клеточного цикла Средний диаметр окрашенных районов, мкм ДОЛЯ двойных окрашенных районов, мкм Расстояние между двойными окрашенными районами, мкм

профаза 1,3 ± 0,1** - -

прометафаза 0,7 - 0,1 70 0,4 ± 0,2

метафаза 0,5 - 0,1 90 0,7 ± 0,1

анафаза 0,5 - 0,1 - -

телофаза 0,6 - 0,1

Для каждой стадии расчет проводился по 5 клеткам м - т, Среднее - ошибка определения среднего

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках мыши l-929 характер окрашивания центромеры на разных стадиях митоза зависит от степени конденсации хромосом. При ее повышении уменьшаются размеры окрашенных центромерных участков, но увеличивается число парных "центромер" и расстояние между ними. Наиболее ярко это проявляется в мегэфазе, когда хромосомы максимально спирализованы. С нашей точки зрения, эти переходы, отчасти, могут объясняться различиями в доступности антител к антигену, которая, вероятно, может изменяться при разной степени конденсации хромосомного материала. Однако, в целом, они говорят о том, что характер организации (упаковки) центромерных белков на разных стадиях митоза подвергается существенным изменениям.

г) иммуноцитохимический анализ центромерных__районов__хромосом

МШИ_в_1Штерфазе

Для детального анализа локализации центромерных белков в интерфазе и их связи с хромоцентрами была использована первичная культура мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).

После окраски клеток МЭФ аутоиммунными сыворотками в интерфазных ядрах наблюдаются ярко флуоресцирующие районы в виде точек диаметром 0,4-0,6 мкм. Эти зоны соответствуют участкам локализации центромерных белков в интерфазных ядрах и называются прекинетохорами (Brenner et ai.,1981). Число прекинетохоров в среднем составляет 38. Это примерно соответствует числу хромосом, характерному для данного объекта (40), и может указывать на то, что прекинетохоры, в отличие от хромоцентров, обычно не ассоциируют друг с другом.

д)взаимная локализация прекинетохоров и хромоцентров

Для изучения взаимной локализации прекинетохоров и хромоцентров клетки МЭФ окрашивали аутоиммунной сывороткой и флуорохромом Хехстом 33258 одновременно. Изображения прекинетохоров и хромоцентров одного и того же ядра фотографировали и совмещали при помощи прозрачной пленки. Как показал анализ 100 интерфазных клеток, от 75 до 100% прекинетохоров в них были связаны с хромоцентрами. В среднем на

одно интерфазное ядро приходилось 2 "свободных" прекинетохора

кинетохоры)

Наличие "свободных" прекинетохоров можно объяснить присутствием в использованных клетках одной хромосомы (вероятно у хромосомы), не имеющей в центромерной зоне блока ЦГХ и не формирующей хромоцентр в интерфазе (Прокофьева-Бельговская, 1986). Можно было бы предполагать также, что частичная деконденсация хромоцентров и появление "свободных" прекинетохоров происходит при репликации ЦГХ в Б-периоде.

е )характер__упаковки__центромерных__районов и_их__связь___с

центромерными белками при репликации ЦГХ

Для исследования характера структурной организации центромерных районов хромосом в момент репликации их ДНК интерфазные клетки мыши (ь-929) окрашивали антителами к рсыа, антицентромерной сывороткой бз и флуорохромом Хехстом 33258 одновременно. Анализ препаратов показал, что в зоне энти-рсма метки, соответствующей гетерохроматиновым районам, наблюдаются компактные хромоцентры со средним диаметром 1,2 мкм. При этом в них хорошо выявляются прекинетохоры в виде флуоресцирующих точек диаметром 0,5 - 0,7 мкм. Средние размеры хромоцентров и прекинетохоров при репликации ЦГХ не отличаются от соответствующих значений, полученных для немеченных, т.е. нерепляцирующихся центромерных районов. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что при репликации ЦГХ хромоцентры сохраняют компактное состояние и связь с центромерными белками.

(Рис.1).

Рис.Г Взаимное расположение хромоцентров и прекинетохоров в интерфазных ядрах мыши.

(хрмц - хромоцентры, прк -прекинетохоры; стрелками отмечены "свободные" пре-

4,Ультраструктурная организация центромерного комплекса мыши.

а)митоз

Анализ большого числа серийных ультратонких срезов клеток ь—929 показал, что впервые структура кинетохоров наблюдается на поверхности митотических хромосом в ранней прометафазе, когда появляются первые небольшие разрывы ядерной оболочки. В отличие от интерфазных и профазных ядер, на поверхности прометафазных хромосом, расположенных вблизи этих разрывов, выявляются кинетохоры. Их ультраструктурная организация заметно отличается от хорошо описанной трехслойной структуры кинетохоров в метафазе (ЕагпзЬаы 1994). Основные отличия состоят в том, что в ранней прометафазе кинетохоры имеют подковообразную форму, микротруСочки вблизи них отсутствуют, наружная кинетохорная пластинка имеет ярко выраженную двуслойность. Расстояние между этими слоями составляет примерно 10-15 нм. Кроме того, на поверхности наружной пластинв$1 хорошо заметно фибриллярное гало, отходящее от нее на расстояние 50 нм. Внутренняя пластинка на этой стадии митоза не выявляется. Расстояние между

кинетохорами сестринских хроматид составляет около 0,7 мкм (Рис.2, Табл.2).

В поздней прометафазе, когда полностью разрушается ядерная оболочка, хромосомы оказываются расположенными в цитоплазме. На этой стадии около половины кинетохоров в клетке формируют контакты с микротрубочками. Фибриллярное гало исчезает, наружная кинетохорная пластинка становится более плотной и выглядит однослойной. В некоторых кинетохорах удается наблюдать внутреннюю пластинку (Рис.2, Табл.2).

В метафазе основной особенностью структуры кинетохоров является фрагментация наружной пластинки, каждый из фрагментов которой связан с одной микротрубочкой. Толщина наружной пластинки по сравнению с прометафазой уменьшается. На некоторых срезах хорошо видна внутренняя кинетохорная пластинка. Кинетохоры плоские, как бы вытянутые. Расстояние между сестринскими кинетохорами по сравнению с прометафазой увеличивается и составляет около 0,9 мкм (Рис.2, Табл.2).

При сегрегации хромосом в анафазе ультраструктура кинегохоров по сравнению с метафазой изменяется. Кинетохоры вновь приобретают подковообразную форму и внутренняя пластинка в их составе, как правило, не выявляется. Однако, толщина наружной пластинки кинетохоров, по сравнению с предшествующей стадией, заметно не меняется (Рис.2, Табл.2).

В телофазе, когда движение хромосом прекращается и начинается их деконденсация, структуры кинетохоров выявляются крайне редко - несколько наблюдений на клетку. Лишь иногда в местах контакта пучков микротрубочек с хроматином можно различить наружную пластинку кинетохора. Ее диаметр, по сравнению с другими стадиями митоза, значительно уменьшается, а толщина, по сравнению с мета - и анафазой, увеличивается. На серийных ультратонких срезах такая структура занимает 1-2 среза (70-140 нм) (Рис.2, Табл.2).

Таблица 2. Морфологический анализ кинетохоров на разных стадиях митоза в мышиных фибробластах ь-эгэ*

Длина Толщина Толщина средней

Стадия наружной наружной пластинки,

митоза пластинки, пластинки,

мкм нм нм

ранняя промета- фаза 0,23 - 0,02**(I) 25 ± 1<5> 19 ± I

метафаза 0,22 - 0,01(2) 18±1<6> 20-2

анафаза 0,20 ± 0,01(3) 22 1 2(7) 17-1

ранняя телофаза 0,16 - 0,01(4) 26 ± 2(8) 20-2

Число наблюдений для каждой стадии 12 **м - т, Среднее - ошибка определения среднего

По критерию Стьюдента достоверно различаются выборки: (1-3) и (4), (6-7) и (5-8).

Рис. 2 Схема ультраструктурных изменений центромерного комплекса в клеточном цикле мышиных фибробластов.

(ХР - хромоцентр, ЦГХ - центромерный гетерохроматин, ЯО -ядерная оболочка, НП и ВП - наружная и внутренняя пласт инки кинетохора, Г - гало, МТ - микротрубочки )

МЕТАФАЗА

Таким образом, динамика ультраструктурных изменений в митотических клетках мыши, в целом, соответствует характеру морфологических перестроек кинетохора в митозе, описанных ранее для клеток человека и некоторых других млекопитающих (Roos, 1973; Cooke et ai.( 1990). Однако, выявлены некоторые особенности ульстраструктурной организации кинетохоров, отличающие клетки мыши от других, ранее исследованных объектов. Так, нами была отмечена фрагментированность наружной пластинки кинетохоров в метафазе в нормальных условиях in situ, что ранее было описано только после искусственных воздействий на хромосомы (Фролова И др., 1989; Zinkowski et al.,1991).

В работе впервые была подробно описана динамика телофазной разборки кинетохоров. Как показывают полученные данные, способ их разрушения в телофазе не повторяет этапы формирования кинетохоров в начале митоза. Так, микротрубочки сохраняют связь с кинетохорами вплоть до полного разрушения последних, а фибриллярное гало в конце митоза не формируется. Также происходит уменьшение размеров наружной кинетохорной пластинки, которая при этом как-бы "тает" и, возможно, распадается на фрагменты.

б)интерфаза

Для поиска возможной структурной организации центромерных белков в составе прекинетохорв в интерфазе было проведено электронномикроскопическое исследование серийных ультратонких срезов хромоцентров, с которыми, согласно полученным нами данным, ассоциированы ценгромерные белки в интерфазных ядрах мыши. В ходе детального анализа тонкой организации хромоцентров в клетках ь-9 29 специфических структур, которые могли бы соответствовать кинетохорам, обнаружено не было. Отчетливо выявлялись лишь блоки центромерного гетерохроматина, состоящие из фибрилл ДНП диаметром 10-15 нм (собственные данные; Бураков и др.,1976), на периферии которых в некоторых случаях удавалось видеть скопления рыхлого фибриллярного материала неизвестной природы.

Для изучения тонкой локализации центромерных белков в

интерфазе был применен также метод криоэлектронной шмуноцитохимии клеток L-929, окрашенных аутоиммунной сывороткой gs. Как показал анализ криосрезов в электронный микроскоп, специфическая метка в виде скоплений частиц коллоидного золота, соответствующих зонам локализации центромерных белков, обнаруживалась чаще всего на периферии плотных участков хроматина или над ними. В некоторых случаях отмечалось парное мечение в виде двух кластеров, расположенных на расстоянии 0,5 мкм друг от друга. При данных условиях фиксации препаратов нам также не удалось наблюдать никакой специфической структурной организации в районе мечения. Однако в некоторых случаях можно было видеть, что метка располагается над рыхлым электронно-светлым материалом, образующим на периферии плотного хроматина гало диаметром 0,3 - 0,4 мкм.

Результаты электронно-микроскопического анализа вместе с данными электронной иммуноцитохимии интерфазных ядер мыши свидетельствуют о том, что несмотря на присутствие в интерфазном ядре компактных кластеров центромерных белков, специфической структуры прекинетохоров на этой стадии клеточного цикла не формируется. Эти данные соответствуют результатам, полученным ранее на клетках человека (Earnshaw 1994). Однако, в некоторых случаях на периферии хромоцентров наблюдается тонко фибриллярное электронно-светлое гало, которое может являться скоплением белков и/или других компонентов прекинетохора. Вопрос о том, почему в интерфазных ядрах мыши не формируются структуры, аналогичные митотическим кинетохорам, остается открытым. Можно полагать, что отсутствие структуры кинегохоров в интерфазе не связано с изменением уровня упаковки ЦГХ, поскольку в клетках мыши центромерный гетерохроматян остается в компактном состоянии в течение всего клеточного цикла. Вероятно, лишь в митозе необходимо наличие специфической структуры кинетохора, которая могла бы обеспечить взаимодействие микротрубочек веретена с хромосомами и выдерживать значительные механические нагрузки, возникающие в этом районе при движении хромосом (Mcintosh,

Pfarr, 1991).

5.Структура, антигенные свойства и поведение хромосом в митозе при искусственной модификации центромерного комплекса бензимидом Хехстом 33258.

а) динамика___структурных___изменений__центромерных___районов

хромосом при разных сроках воздействия Хехста 33258

Как известно, инкубация живых клеток с бензимидом Хехст 33258 приводит к задержке конденсации центромерного гетерохроматина и появлению на стандартных препаратах митотических хромосом растяжки центромерных районов (Hilwig,Gropp, 1973; Marcus et al., 1979).

В настоящей работе было проведено исследование динамики появления "растянутых" центромерных районов в зависимости от продолжительности действия агента. Наши результаты показывают, что после 30 мин инкубации клеток с Хехстом 33258 растяжение центромерных районов не наблюдается. Впервые "растяжка" вазоне первичной перетяжки хромосом выявляется через 1'час инкубации с бензимидом. При этом изменения структуры центромер были обнаружены в 10% метафазных клеток, в которых примерно половина хромосом имели "растяжку". Максимальный эффект действия Хехста 33258 наблюдался через 2 ч инкубации. В этих условиях растяжка проявлялась во всех метафазных клетках и в подавляющем большинстве хромосом. Кроме того наблюдалось сильное удлинение плеч хромосом. После длительной инкубации-клеток с бензимидом (24 часа) эффект его воздействия на хромосомы по сравнению с 2 и 16 часовой обработкой уменьшался (Табл.3).

Таблица 3. Растяжение центромерных районов хромосом после инкубации клеток мыши (ь-эгэ) с бензимидом Хехстом 33258 (40 мкг/мл).

Время инкубации с Хехстом 33258, ч Доля клеток с растяжкой хромо сом$^ % Доля хромосом с растяжкой центромеры Р ^ % Средняя длина центромерных районов!3^ мкм

0,5 - - 0,1 ± 0,1*

I 10 42,8 0,3± 0,1

2 roo 75,8 1,1 ± 0,1

16 100 72,7 1,3 - 0,2

24 90 73,4 0,9 - 0,2

Инкубация без Хехста - - 0,1 - 0,1

*м - ш, Среднее - ошибка определения среднего ^На каждый срок изучено около 500 клеток кавдый срок изучено около 50 клеток ^На каждый срок изучено около 250 хромосом

б)радиавтография клеток, инкубирующихся с Хехстом 33258 Для определения стадии клеточного цикла, на которой происходит специфическое воздействие бензимида на ЦГХ был применен метод радиоавтографии с использованием импульсного мечения н3-тимидином. Как показал анализ стандартных препаратов метафазных хромосом, через I и 2 часа инкубации клеток после введения изотопа метка наблюдалась над интерфазными ядрами, но не встречалась над метафазными хромосомами. Впервые метка над хромосомами появлялась через 4 часа после введения радиактивного предшественника в среду культивирования. Аналогичным образом

метились клетки в присутствии Хехста 33258. Эти данные говорят о том, что продолжительность вг периода в клетках ь-929 после добавления Сензимида не отличается от контроля и составляет 4 часа. Принимая во внимание динамику появления растянутых хромосом в этих клетках, можно заключить, что взаимодействие Хехста 33258 с ЦГХ, проявляющееся в митозе в виде растянутых центромер, происходит до начала митоза, по крайней мере, в ъг периоде интерфазы.

в)антигенные свойства модифицированных центромерных районов

Для окрашивания митотических хромосом антителами к

центромерным белкам клетки, инкубировавшиеся с Хехстом 33258, центрифугировали в монослое на покровных стеклах, фиксировали параформальдегидом и окрашивали аутоиммунной сывороткой сэ как описано выше. Анализ препаратов показал, что в центромерных районах хромосом на всех стадиях митоза выявляются одиночные или парные светящиеся зоны. В метафазе большинство из зон - парные, их диаметр составляет 0,5 - 0,7 мкм. При этом блоков ЦГХ в районе первичной перетяжки хромосом, обычно наблюдаемых при окраске Хехстом 33258, не обнаруживается. Это подтверждает частичную деконденсацшо (неполную конденсацию) гетерохроматина центромеры в метафазе после инкубации живых клеток с бензимидом Хехстом 33258.

г) ультраструктура центромерных районов хромосом,__обработанных Хехстом 33258

При исследовании феномена растяжки центромерных райнов при действии Хехста 33258 мы предполагали, что изменения центромеры будут проявляться в изменении ультраструктуры кинетохоров. Однако заметного удлинения или разрыхления кинетохоров в метафазных или анафазных хромосомах нам наблюдать не удалось. На поверхности всех хромосом обнаруживались нормальные трехслойные кинетохоры, к которым подходили пучки микротрубочек веретена деления.

Д) влияние Хехста___33258__на поведение хромосом____и

продолжительность стадий митоза

Для изучения влияния бензимида на функцию центромеры в митозе были проведены прижизненные наблюдения за клетками, инкубированными с этим агентом в течение разного периода времени. Функциональное состояние центромерных районов оценивали по способности клеток вступать в анафазу, а также по продолжительности тех стадий митоза, на которых наблюдается активное движение хромосом. К началу выполнения работы данные о подобных наблюдениях в литературе отсутствовали.

В контрольных клетках ь-929 средняя продолжительность стадий митоза по нашим данным составляла: в прометафазе - 14,4 мин, в метафазе - 27,5 мин, в анафазе - 4,0 мин (Табл.4). Инкубация с Хехстом 33258 вплоть до 24 ч не препятствовала вступлению клеток в митоз и завершению телофазы. Значение митотического индекса даже через 24 ч после добавления бензимида находилось на уровне контроля (30-40 °/оо). Это говорит о том, что общая продолжительность митоза в присутствии Хехста 33258 значительно не изменялась. Данный вывод был подтвержден наблюдениями за продолжительностью индивидуальных фаз митотического деления, включая прометафазу и метафазу (Табл.4). Однако при 16-24 ч инкубации клеток с бензимидом нами было выявлено достоверное, по сравнению с контролем, удлинение анафазы, продолжительность которой составила 6 мин против 4 мин в необработанных клетках (Табл.4). Кроме того при сегрегации хромосом наблюдались аномалии митозов, связанные с возникновением хромосомных мостов и отставаний отдельных хромосом в анафазе. Доля подобных аномалий прогрессивно возрастала по мере увеличения сроков инкубации клеток с Хехстом 33258. Причины этого явления, скорее всего, связаны не столько с растяжением центромеры, а с общим цитопатогенным действием агента на хромосомы, поскольку хромосомные мосты и отставания хромосом проявлялись в клетках даже на ранних сроках действия бензимида (30 мин), когда эффект удлинения центромерных районов еще не проявлялся. Напротив, увеличение продолжительности анафазы может быть связано с увеличением общей длины хромосом и центромеры, поскольку в этих

условиях дочерние хромосомы (хроматиды) должны пройти большее расстояние для достижения полной сегрегации в анафазе.

Таблица 4. Средняя продолжительность фаз митоза в фибробластах мыши (ь-929), инкубированных с Хехстом 33258 (40мкг/мл).*

Инкубация Прометафаза, Метафаза, Анафаза,

с Хестом мин мин мин

1-30 мин - - 3,8 ± 0,2 (5)

I - 2 Ч - - 5,4 - 0,3 (6)

16 - 24 Ч II,5 ± 0,7**(Г) 27,2 ± 2,9 (3) 6,0 ± 0,5 (7)

Инкубация 14,4 - 2,5 (2) 27,5 ± 3,1 (4) 4,0 - 0,2 (8)

без Хехста

* Каждое значение получено при наблюдении 25 клеток **м £ т, Среднее £ ошибка определения среднего По критерию Стьюдента достоверно различаются выборки: (5) и (6), (5) и (7), (7) и (8).

7.Антигенные свойства и ультраструктурная организация центромерных районов хромосом человека при цитомегаловирусной инфекции.

Ранее, цри исследовании характера патологических изменений в фибробластах человека, зараженных цитомегаловирусом (ЩШ), было показано, что на ранних этапах инфицирования клеток ЦМВ в культуре наблюдаются К-митозы, в которых, несмотря на разрушение метафазной пластинки, сохраняется двухполюсное веретено деления. Было высказано предположение, что блокировка клеток в митозе при данной патологии может быть связана с нарушением синтеза центромерных белков (Маках^а et а1., 1995).

Для изучения белкового состава и ультраструктурной организации центромерных районов хромосом при цитомегаловирусной инфекции клетки ФЛЭЧ (фибробласты легкого эмбриона человека) заражали цитомегаловирусом и фиксировали для

иммуноцитохимического и электронномикроскопического анализа на 4-е сутки после заражения, когда отчетливо проявляется описанный цитопатогенный эффект (Макагоуа et а1., 1995).

В культуре инфицированных фибробластов наблюдались патологические митозы, доля которых среди всех митотических клеток составляла 90%. Метафазные пластинки в таких клетках не формировались, а хромосомы, разбросанные в цитоплазме, были сильно конденсированы. После окраски патологических митозов антицентромерной сывороткой вБ над хромосомами наблюдалась специфическая флуоресценция в виде светящихся точек, подобно тому, как это можно видеть в нормальных, не зараженных вирусом, метафазных клетках. Однако при патологии окрашенные центромерные зоны располагались более рыхло, их диаметр был больше, а интенсивность флуоресценции несколько слабее, чем в контроле.

Как показали данные электронной микроскопии, ультраструктура хромосом при патологии сильно нарушалась. При этом наблюдалось их уплотнение, кроме того в них отсутствовали петли хроматина, хромонемы, характерные для нормальных клеток. Вокруг можно было видеть пучки микротрубочек, иногда подходящие к хромосомам. Однако кинетохорных структур на хромосомах обнаружено не было.

Согласно полученным результатам, в патологических митозах происходит либо разрушение сформировавшихся кинетохоров, либо нарушение процесса сборки кинетохорных структур, что приводит, в свою очередь, к остановке клеточного деления. Блокировка клеток в митозе может быть связана с нарушением синтеза одного из центромерных белков, входящего в состав кинетохорных пластинок или ответственного за формирование зрелого кинетохора. Одним из таких белков является сеыр-с, присутствие которого в центромерной области необходимо для сборки нормального зрелого кинетохора в митозе (Тогак1е1 еЬ а1., 1994). При иммуноцитохимическом окрашивании патологических клеток сывороткой сб, содержащей антитела к белкам сеыр-а, в и с, наблюдалось некоторое уменьшение интенсивности флуоресценции центромерных райнов по сравнению с нормальными митозами. Это наблюдение можно объяснить уменьшением количества или полным отсутствием белка сеир-с в центромерной области хромосом.

выводы

1. Отработана методика получения распластанных препаратов митотических хромосом мыши для иммуноцитохимического анализа. С помощью этой методики показано, что интенсивность окраски центромерных районов в клетках ь-929 аутоиммунными сыворотками меняется в зависимости от стадии митоза и степени конденсации хромосом. Это говорит о том, что центромерные белки подвергаются определенной реорганизации в динамике митоза.

2. Впервые показано, что в интерфазных ядрах мыши ь-929 и МЭФ прекинетохоры ассоциированы с блоками центромерного гетерохроматина - хромоцентрами. Это дает основания для препаративного выделения центромерного комплекса с целью его биохимического анализа.

3. Макроструктура хромоцентров и их связь с прекинетохорами не нарушается при репликации ДНК центромерного гетерохроматина.

4. В интерфазе в зоне хромоцентров специфической ультраструктуры, соответствующей митотическим кинетохорам, не. обнаруживается.

5. Сборка кинетохорных структур начинается в ранней прометафазе, однако "зрелые" кинетохоры формируются только после установления их контакта с микротрубочками в поздней прометафазе. Ультраструктура кинетохоров подвергается значительным преобразованиям в зависимости от стадии митоза, при этом наиболее заметными оказываются изменения наружной пластинки. Динамика разборки кинетохоров в ранней телофазе не повторяет этапов, выявляемых при их формировании.

6. Растяжение центромерных районов хромосом клеток ь-929 бензимидом Хехстом 33258 не приводит к изменениям локализации основных центромерных белков, структуры кинетохоров и не препятствует митотическому движению хромосом. Это указывает на то, что только часть ДНК центромеры ассоциирована с кинетохором.

7. В патологических митозах, возникающих при заражении клеток человека цитомегаловирусом, основные центромерные белки в составе хромосом сохраняются, однако структура кинетохоров в этих условиях не выявляется. Можно полагать, что отсутствие

кинетохоров.является причиной блокировки инфицированных клеток в митозе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кудрявцев И.С..Зацепина О.В.(1993) Структура центромерного района и поведение хромосом в анафазе после инкубации клеток мыши с флуорохромом Хехстом 33258. Цитология т.35, n I, с.30-35.

2. Зацепина О.В., Дудник О.А., Кудрявцев И.С. (1996) Динамика внутриклеточного распределения ядрыппсового белка В23 в штерфазных и митотнческих клетках некоторых культур млекопитающих. Цитология т.38, n 7, с.758-763.

3. Пуденко А.С., Кудрявцев И.С., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. Пространственная ассоциация хромоцентров и центромерных белков в фибробластах mm. Биол.мембраны (в печати).

4. Kudryavzev I.,Zatsepina О. Action of bisbenzimid Hoechst 33258 on the structure and anaphase behavior of mouse chromosomes. 32 Ann.Meet.of Amer.Soc.of Cell Biol., 15-19 November 1992, Denver, USA, in suppl.to Mol.Biol.of the Cell v.3,p.137a, N 796.

5. Kudryavtsev I. Kinetochore proteins in mitosis and interphase. VI International Conference "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legasy of Andrey Belozersky.", 18-22 December 1995, Moscow, Russia.

6. Пуденко А.С..Кудрявцев И.С..Зацепина О.В..Ченцов Ю.С. Динамика поведения центромерных белков и их взаимная локализация с блоками центромерного гетерохроматина в митотических и интерфазных клетках мышиных фибробластов L-929. хи Всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 22-24 октября 1996, С.-Петербург, Россия.

7. Зацепина О.В., Дудник О.А., Кудрявцев И.С. Иммунолокализация ядрышкового белка В23 в интерфазных и митотических клетках, хи Всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 22-24 октября 1996, С.-Петербург, Россия.