Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционная активность прицентромерной сателлитной ДНК в клетках человека и мыши

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционная активность прицентромерной сателлитной ДНК в клетках человека и мыши"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВАЙСЕРТРЕЙГЕР Ирина Саша-Рувнповиа

Транскрипционная активность прицентромерной сателлитной ДНК в клетках человека и мыши

03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология 03.01.03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

4 ?01[)

003493647

Работа выполнена в Институте Цитологии РАН

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук

Подгорная Ольга Игоревна Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Енукашвили Нателла Иосифовна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Родионов Александр Викентьевич Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН

профессор, доктор биологических наук Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Ведущее учреждение:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертации при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

Защита диссертации состоится «

часов на заседании совета

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан «

2010 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Сателлитная ДНК (сатДНК) состоит из тандемно организованных повторяющихся последовательностей и составляет от 5 до 50% от суммарного количества ДНК в геноме эукариот (Беридзе, 1982). СатДНК в основном локализуется в области центромерного гетерохроматина, располагающегося в области первичной перетяжки хромосомы, и прицентромерного, фланкирующего его по краям (Lee et al., 1997; Choo, 1997).

Центромерный и прицентромерный конститутивный гетерохроматин собираются на основе разных последовательностей сатДНК. У человека центромерный гетерохроматин всех хромосом формируется на основе альфоидной ДНК, прицентромерный - на основе классических сателлитов, таких как сателлиты 1,2, 3 (Lee et al., 1997). Сателлит 3 хромосомы 1 (HS3-1 - human satellite 3 of chromosome 1) образует один из самых крупных хромосомспецифичных массивов сагДНК в геноме человека, поэтому в массиве легче наблюдать изменения морфологических характеристик.

У мыши в центромере располагается минорный сателлит (МиСат), отделенный от эухроматина длинного плеча хромосомы большим доменом мажорного сателлита (МаСат) (Mitchell, 1996), являющегося основой для формирования прицентромерного гетерохроматина.

Конститутивный гетерохроматин традиционно считается компактизованным в течение всего клеточного цикла, а ДНК, входящая в его состав, долгое время считалась транскрипционно инертной (Muller, 1930; Dillon, 2004). К настоящему времени транскрипция сатДНК показана у многих организмов. Полагают, что это может быть общим феноменом (Plohl et al., 2007). Однако еще не выяснено, насколько распространена транскрипция в клетках млекопитающих, и при каких обстоятельствах транскрибируются центромерные и прицентромерные сателлиты.

Существует гипотеза, что транскрипты сатДНК вовлечены в гетерохроматинизацию посредством РНК-интерференции. У S. pombe длинные двуцепочечные транскрипты, полученные путем транскрипции центромерной ДНК и прицентромерных сателлитов в обоих направлениях, расщепляются рибонуклеазой Dicer на короткие молекулы РНК длиной = 22 п.н. Малые интерферирующие РНК являются компонентами подавляющего транскрипцию РНК-индуцируемого комплекса и определяют локализацию комплекса в гетерохроматине (Buhler and Moazed, 2007). Считается, что РНК-интерференция ведет к гетерохроматинизации привлечением через малые интерферирующие РНК метилтрансфераз, инициирующих специфические эпигенетические модификации гетерохроматина (Martens et

al., 2005). По аналогии с дрожжевой моделью, длинные транскрипты сатДНК у млекопитающих могут быть предшественниками малых двуцепочечных РНК, задействованных в формировании или поддержании того или иного состояния гетерохроматина. Цель и задачи работы

Целью работы являлось исследование транскрипционной активности прицентромерной и центромерной сатДНК в клетках человека и мыши. Для достижения этой цели сформулированы следующие задачи:

1. определить, транскрибируются ли МаСат и МиСат в эмбриональных стволовых клетках Е-14 мыши до и после индукции ретиноевой кислотой, и в клетках культуры L929, полученной из дифференцированных фибробластов мыши

2. определить, транскрибируются ли альфоидная ДНК и HS3-1 в клетках плаценты и лимфоцитах, культуре фибробластов MRC5 и в клетках культур А431 и HeLa человека

3. охарактеризовать обнаруженные транскрипты - определить цепь ДНК, с которой идет транскрипция, проверить наличие модификаций 3'-конца РНК

4. исследовать локализацию транскриптов в клетках исследуемых линий

5. определить локализацию и степень компактизации и метилирования центромерной и прицентромерной сатДНК в исследуемых клетках

Научная новизна работы. Впервые описана деконденсация HS3-1 в опухолевых интерфазных клетках человека. Показана транскрипция и описан транскрипт HS3-1 в опухолевых интерфазных клетках и в стареющих клетках человека. Показано усиление транскрипции МаСат в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) после индукции. Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы используются при чтении специальных курсов лекций для студентов Санкт-Петербургского Государственного Университета. Они могут быть использованы в курсах лекций по частным разделам цитологии и клеточной биологии при подготовке специалистов в других высших учебных заведениях биологического профиля и включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.

Апробация диссертации. Результаты работы представлены на международной конференции "FISH Digital Scientific Meeting" (Cambridge, UK, 2005), XV Всероссийском совещании "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь 2005); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, апрель 2006), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в

культуре на тему "Культивируемые клетки как основа клеточных технологий" (Санкт-Петербург, октябрь 2009), международной конференции «Современные методы микроскопии в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, октябрь 2009). Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 6 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (207 источников).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Клеточные линии и клетки, полученные из тканей: использованы клетки человека линий А431 и HeLa (получены из эпидермоидных опухолей), нестимулированные лимфоциты и клетки плаценты человека, фибробласты линии MRC5 человека (молодая культура - 11-ый, стареющая - 32-ой пересевы); клетки линии L929 мыши (получены из дифференцированных фибробластов) и ЭСК Е-14 мыши.

Для индукции клетки Е-14 рассевали в среде, не содержащей фактора подавления лейкемии LIF, на следующий день добавляли 1 мкМ РК (ретиноевая кислота) (Sigma, США) и культивировали 2 сут. Далее клетки культивировали еще 1 сут. среде без РК (Jirmanova et al., 2002). Клетки для анализа отбирали ежедневно.

Реакция обратной транскрипции: тотальную РНК всех образцов выделяли с использованием гуанидин изотиоцианата и обрабатывали ДНК-азой I, свободной от РНК-азной активности (Fermentas, Литва).

Для поиска транскриптов альфоидной ДНК использовали специфичные праймеры (Weisenberger et al., 2005). Для детекции транскрипции с HS3-1 последовательности ДНК, указанной в GenBank (прямой цепи), использовали смысловой праймер, а для детекции транскрипции с комплементарной ей последовательности (обратной цепи) - антисмысловой праймер (Enukashvily et al., 2007). кДНК получали с помощью обратной транскриптазы с использованием смыслового или антисмыслового праймеров.

Для проверки, полиаденилированы ли полученные транскрипты, использовали метод обратной транскрипции с праймером - M13RpolyT (M13R с 12 тиминовыми остатками и произвольным нуклеотидом в конце).

Для детекции транскрипции с прямой цепи МиСат использовали МиСатР праймер, а для детекции транскрипции с обратной цепи - МиСатЫ. Для поиска транскриптов с прямой цепи МаСат использовали MaCarF праймер, а с обратной - MaCatR (Kuznetsova et al., 2005).

кДНК амплифицировали с использованием пар МаСатЕ/М 1 ЗЯро1уТ и МаСатКУМ13Яро1уТ праймеров. Секвенировали в фирме Синтол (Москва).

Использованные зонды: в работе использовали зонды, перечисленные в табл. 1

Таблица 1. Использованные ДНК-зонды:

Мишень Зонд (меченые дигоксигенином)

Центромеры всех хромосом человека Центромерный коктейль all CEN (смесь альфоидных ДНК разных хромосом, Appligen-Oncor, Франция)

Хромосома 1 человека Хромосомная краска хромосомы 1 (Appligen-Oncor, Франция)

Прицентромерный район хромосомы 1 человека Клонированный в векторе PUC19 фрагмент HS3-1 (336 п.н.), кДНК HS3-1 (GenBank № Х60726)

Транскрипт Н83-1 Одноцепочечный зонд кДНК HS3-1, полученный с использованием только антисмыслового праймера

Центромерные районы хромосом мыши Клонированный в векторе pGEM7 фрагмент МиСат (362 п.н.) (GenBank № Z22170)

Прицентромерные районы хромосом мыши Клонированный в векторе pBluescriptIIKS+ фрагмент МаСат (471 п.н.) (GenBank № М17407), кДНК МаСат

Транскрипт МаСат Одноцепочечный зонд кДНК МаСат, полученный с использованием только MaCaxF праймера

ДНК-ДНК Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) и nM\iyiioFISH: гибридизацию

проводили, как описано (Вайсертрейгер и др., 2007). Ядра окрашивали DAPI (2 нг/мл).

При проведении иммуноШБН на стадии нанесения AT против DIG одновременно наносили первые AT мыши против 5-метилцитозина.

РНК-ДНК FISH: препараты отмывали в lx PBST 40 мин и обрабатывали 0.5% Triton Х-100 5 мин на льду, после чего отмывали 3 раза по 5 мин lx PBST и 2xSSC 30 мин при 37°С. Далее добавляли зонд и проводили гибридизацию в течение ночи при 42°С. Постгибридизационные отмывки проводили в 2х SSC при 37°С 2 раза по 30 мин. Зонд детектировали AT против DIG-11-dUTP (1:100), ассоциированными с флюорохромом.

Микроскопирование: препараты анализировали с помощью микроскопа Zeiss Axioscope и конфокального микроскопа Zeiss LSM 5.

Гибридизация на фильтрах по Саузерну: человеческую геномную ДНК выделяли стандартными методами (Чан, 1999). ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Bspl 191, которая не расщепляет ДНК по сайту распознавания, если он метилирован. Зонд HS3-1 детектировали антителами (AT) против DIG-11-dUTP, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Относительное метилирование сатДНК определяли как отношение

интенсивности окрашивания щелочной фосфатазой, наблюдающегося выше позиции 2 т.п.н., к интенсивности окрашивания по всей дорожке (М-отношение, Vilain et al., 2000) Морфометпнчеекин анализ и статистическая обработка данных: морфометрический анализ проводили, как описано (Enukashvily et al., 2007). Статистическую достоверность различий оценивали t-критерием Стьюдента при 5%-ом уровне значимости. РЕЗУЛЬТАТЫ

Локализация, уровни компактизаиии и метилирования альфоидиой ДНК и HS3-1

Локализацию и степень компактизации центромерной и прицентромерной сатДНК оценивали методом FISH и морфометрическим анализом (табл. 1; рис. 1-3). Степень метилирования сатДНК оценена методом HMMyHoFISH (см. табл. 1 ,рис. 5).

Таблица 2. Локализация, уровень компактизаиии и степень метилирования центромерной и прицентромерной ДНК в клетках человека.

Клетки Центромерная ДНК Прицентромерная ДНК хромосомы 1 (Н83-1)

Плацента Компактные сильно метилированные гранулы по всему ядру (рис. 3, а). Две небольшие 0.7 мкм) компактные сильно метилированные гранулы, прилежащие к ядерной оболочке (рис. 1 ,а, рис. 3, д).

Лимфоциты Компактные сильно метилированные кластеры по всему ядру (рис. 3, б). Две компактные 0.6 мкм) сильно метилированные гранулы, прилежащие к ядерной оболочке (рис. 1, б, рис. 3, е).

Фибробласты МЯС5, 11 -ый пересев Компактные сильно метилированные гранулы. Две компактные (~ 0.6 мкм) сильно метилированные гранулы, прилежащие к ядерной оболочке (рис. 1, д).

Фибробласты МЯС5, 32-ой пересев Сильно метилированные компактные гранулы по всему ядру (рис. 3, г). Две гранулы (~ 1.3 мкм) в ядре. В 30% клеток Н83-1 ДНК частично декомпактизована и деметилирована (рис. 1, е, рис. 3, з). Компактные участки остались сильно метилированными.

Клетки линии А431 Компактные сильно метилированные гранулы по всему ядру (рис. 3, в). 74% клеток содержали более двух гранул НБЗ-1, размером ~ 1 мкм. Два из этих сигналов сохраняли периферическое положение, остальные располагались как во внутреннем пространстве ядра, так и на периферии. ШЗ-1 ДНК частично декомпактизована и деметилирована (рис. 1, г, рис. 3, ж). Компактные участки, остались сильно

метилированными.

Клетки линии HeLa Компактные сильно метилированные гранулы 89% клеток содержали более двух компактных (рис.1, в) сильно метилированных гранул Н83-1, размером ~ 0.8 мкм. Два из этих сигналов сохраняли периферическое положение, остальные располагались как во внутреннем пространстве ядра, так и на периферии.

Рис. 1. FISH с зондом HS3-1 (красный) интерфазных ядер клеток плаценты (а), лимфоцитов (б), клеток HeLa (в), А431 (г), MRC5 11 -ого (д) и 32-ого (е) пассажей. Хромосомы и ядра окрашены DAPI (синий). Масштабные линейки - 5 мкм.

Объем территории хромосомы 1 оставался неизменным в ядрах HeLa, А431 и в фибробластах MRC5 (рис.2, /, II), и занимал -14-18% объема ядра. Среднее отношение территории HS3-1 к территории хромосомы 1 в ядрах А431 больше на -10% по сравнению с таковым в клетках HeLa и молодых MRC5. В стареющих MRC5 это отношение было в два раза больше, чем в ядрах HeLa и молодых MRC5. На метафазных пластинах средние отношения объемов HS3-1 к объемам территории хромосомы 1, вычисленные для каждой линии, не различались. Таким образом, разворачивание HS3-1 наблюдается только в интерфазе, при этом территория хромосомы 1 не изменяется.

а - • Я 6 f ' 4 г JW Щ 4 д * >

ES в В и 4 * *

Рис. 2. FISH с зондом HS3-1 (красный) метафазных пластин (I) и интерфазных ядер (II) клеток HeLa (а, е), А431, где HS3-1 конденсирован (б, ж), А431, где HS3-1 деконденсирован (в, з), MRC5 на 11-ом пассаже (г, и) и MRC5 на 32-ом пассаже (д, к). Хромосомы и ядра окрашены DAPI (синий). Хромосома 1 окрашена хромосомспецифичной краской (зеленый). Масштабные линейки — 10 мкм.

Рис. 3. ИммуноИБН с AT против 5-метилцитозина (красный) и зондами (зеленый) all CEN (I), HS3-1 (II) интерфазных ядер клеток плаценты (а, д), лимфоцитов (б, е), клеток А431 (в, ж) и MRC5 32-ого пассажа (г, з). Масштабные линейки: а-в, д-ж — 5 мкм, г, з — 10 мкм.

Декомпактизованные участки Н83-1 слабее окрашиваются АТ к 5-метилцитозину, но возможно сигнал ослабевает при декомпактизации нитей. Поэтому уровень метилирования ГОЗ-1 проверили с помощью гибридизации на фильтрах по Саузерну. Оказалось, что в лимфоцитах и клетках плаценты №3-1 сильно метилирован: длина практически всех фрагментов превышала 2 тыс. п.н. (рис. 4). В стареющих фибробластах и в клетках малигнизированной культуры А431 уровень метилирования заметно снижен (рис. 4).

Транскрипционная активность альфоидной ДНК и ШЗ-1

Проверили, встречаются ли транскрипты альфоидной ДНК и Н83-1 в разных типах клеток. Транскрипты альфоидной ДНК не найдены. Во всех типах клеток при использовании антисмыслового, но не смыслового, праймера Н53-1 для синтеза кДНК обнаружили продукт обратной транскрипции 300 п.н. (рис. 5, а). В клетках МЯС5 и А431 количество транскрипта оказалось большим, чем в лимфоцитах и клетках плаценты (рис. 5, а).

М 1 2 3 4

1246

Рис. 4. Гибридизация на фильтрах по Саузерну тотальной ДНК, обработанной эндонуклеазой рестрикции Bsp 1191 из лимфоцитов (1), из клеток плаценты (2), из MRC5 32-ого пассажа (3), из клеток А431 (4). Зонд — HS3-1. Стрелка показывает пограничную молекулярную массу (2 тыс. п.н.) при расчете М-отношения (MR, раздел «Материалы и методы»). М — маркер (п.н)

Mr

М 1 2 J А

V Ulli M!V«C СЛ Ulli: М'МС СЛ£

I 1 II ......i I

Рис. 5. (а) Обратная транскрипция с тотальной РНК, полученной из А431 (1), лимфоцитов (2), из MRC5 32-ого пассажа (3) и клеток плаценты (4) с использованием антисмыслового праймера, специфичного для HS3-1. (б) Обратная транскрипция с тотальной РНК, полученной из А431 (1), и из MRC5 32-ого пассажа (2) с использованием М13ро1уТ праймера. кДНК амплифицированы с использованием различных пар праймеров (приведены над дорожками). М— 100 п.н. молекулярный маркер, зоны внизу некоторых дорожек — праймеры-димеры . С — смысловой праймер, АС — антисмысловой праймер, М13 - М13ро1уТ праймер.

При использовании M13RpolyT праймера в реакции обратной транскрипции выявлены транскрипты HS3-1 в клетках линий MRC5 и А431 (рис. 5, б). Значит, транскрипты HS3-1 полиаденилированы. Амплификация кДНК HS3-1 происходила только в присутствии смыслового, но не антисмыслового, праймера, добавленного в реакционную смесь вместе с M13RpolyT праймером. Это еще раз подтвердило происхождение транскриптов с обратной цепи ДНК. Продукт амплификации выглядел, как единственная полоса 420 п.н. (рис. 5, б, 1 -М13/С, 2 - М13/С). Секвенирование показало, что в этой зоне присутствуют разные транскрипты. Все они содержат полный фрагмент HS3-1 (336 п.н.), но первые 90 п.н. с 3'-конца различаются между собой.

Провели определение хромосомспецифичности полученной кДНК HS3-1 методом FISH с зондом кДНК HS3-1 и метафазными пластинами из клеток А431. Гибридизационный сигнал выявлен только в одной паре хромосом, которую морфологически охарактеризовали, как первую (рис. 6, I, б). Значит, полученная кДНК хромосомспецифична. При гибридизации кДНК HS3-1 с ДНК ядер А431 наблюдали два-три компактных сигнала (рис. 6,1, а).

Рис. 6. (I) FISH с зондом кДНК HS3-1 (красный) на ядрах (а) и метафазных пластинах (б) клеток А431. (II) РНК-ДНК FISH со смысловым одноцепочечным зондом кДНК HS3-1 (красный). Хромосомы и ядра окрашены DAPI (синий). Масштабные линейки - 5 мкм.

Методом РНК-ДНК FISH проверили локализацию транскриптов HS3-1 в клетках А431. Смысловой зонд кДНК HS3-1 выявлял 2-4 компактных гибридизационных сигнала исключительно внутри ядра за пределами областей, ярко окрашиваемых DAPI (рис. 6, II). Локализация и транскрипционный статуе МаСат и МиСат в ЭСК мыши

Исследовали локализацию и транскрипционный статус центромерного МиСат и прицентромерного МаСат в ЭСК Е-14 и в культуре L929.

Используя FISH с зондами МаСат и МиСат, проверили локализацию сателлитов в клетках Е-14 перед удалением (день 0) и после (дни 2 и 4) удаления LIF. Сферические ядра неиндуцированных клеток малы (10-15 мкм в диаметре) и однородно окрашивались DAPI (рис. 7, день 0). Оба сателлита (0,5-1 мкм) прилежали к периферии ядра. После индукции PK, на второй день, большинство индуцированных клеток имело овальные распластанные ядра (20-25 мкм) (рис. 7, день 2). Хотя окрашивание ядер DAPI неоднородно, участки, ярко окрашенные DAPI, не содержали МаСат и МиСат. На четвертый день после удаления LIF сатДНК перемещалась в участки, окрашенные DAPI. (рис. 7, день 4).

Рис 7. FISH с зондами МаСат (зеленый) и МиСат (красный) ядер Е-14 перед удалением LIF (день 0), через 24 (день 2) и 72 часа после удаления LIF (день 4). Ядра окрашивали DAPI (белый). Каждое изображение - один оптический срез. Масштабные линейки - 5 мкм.

Далее проверили, есть ли в образцах РНК из клеток Е-14 транскрипты МиСат и МаСат (рис. 8). Ни в одном из образцов РНК не выявлено значимого количества транскрипта МиСат. Перед индукцией транскрипция МаСат также обнаружена в следовых количествах, но после индукции в клетках Е-14 начали накапливаться транскрипты МаСат, достигнув максимума на четвертый день.

Рис. 8. Обратная транскрипция с тотальной РНК из Е-14 клеток мыши с MaCaTF/M13RpolyT и МаСатЯ/М 13RpolyT парами праймеров. День 0 - перед удалением LIF, день 1-24 часа после удаления LIF, дни 2 и 3 - 24 и 48 часов после начала инкубации с PK, M13RpolyT и MaCaTF M13RpolyT и MaCarR день 4 . 24 часа после удаленИя PK. М — 100 п.н.

...„ ^Ssfell""?^ молекулярный маркер, зоны внизу дорожек — Д"к 5 днк (транскрипция праймеры-димеры.

MaC*TF с прямой мели)

Также получены транскрипты МаСат в индуцированных клетках при использовании M13RpolyT праймера в реакции обратной транскрипции (рис. 8). Значит, транскрипты полиаденилированы. кДНК амплифицировалась только с МаСатЯ и M13RpolyT праймерами, что доказывает происхождение транскриптов с прямой цепи. Продукт амплификации выглядел как широкая полоса, размером ~ 350 п.н., и узкая, размером ~ 650 п.н. Короткий фрагмент совпадает по размеру с теоретически предсказанным, исходя из позиции отжига праймеров. Длинный фрагмент является димером, формирующимся благодаря тандемной организации амплифицированной последовательности.

Используя FISH с кДНК МаСат зондом, выявили сигнал в прицентромерных участках (рис. 9, а, II). В интерфазных ядрах L929 сигнал располагался в хромоцентрах (рис. 9, а, I).

а i . и . >* > б

i i

Рис. 9. а. FISH с зондом кДНК МаСат (красный) ядер (I) и метафазных пластин (11) L929 б. FISH с зондом МаСат (зеленый) и РНК-ДНК FISH одноцепочечным зондом кДНК МаСат (красный) ядер L929. Хромосомы и ядра окрашены DAPI (синий). Масштабные линейки - 5 мкм.

Использование РНК-ДНК FISH показало отсутствие транскрипта в неиндуцированных клетках Е-14 (рис. 10). Через четыре дня после начала эксперимента процент клеток, содержащих транскрипт, достиг 68%. Транскрипт локализован внутри ядра и не представлен в цитоплазме. Число кластеров сигнала составляло ~ 11-12 на клетку.

Дни

М 0 1 2 3 4 01 234

I

~i—If

Рис. 10. Результат статистической обработки распределения транскрипта в клетках Е-14 перед удалением (день 0), через 24 часа после удаления 1ЛР (день 1), через 24 и 48 часов после начала инкубации с РК (дни 2 и 3), через 24 часа после удаления РК (день 4). Ось У - количество клеток, содержащих транскрилт МаСат, выраженное как процент от общего числа клеток. Ось X— дни индукции.

Клеточную культуру L929 использовали как пример клеток, полученных из дифференцированных. Транскрипт МаСат, найденный в большинстве клеток L929, формировал 1 или 2 гранулы (каждая ~ 2 мкм в диаметре) вне хромоцентров (рис. 9, б). Сигнал в хромоцентрах очень слабый или не определялся. Колокализации транскрипта МаСат с МаСат в ядрах клеток L929 не обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ Транскрипционная активность прицеитромерной ДНК

В соматических клетках в ходе клеточного цикла в митозе экспрессируется небольшое количество транскрипта сатДНК и исчезает при выходе клетки из митоза. Второй, основной, пик транскрипции сатДНК наблюдается при коммитации клеток к пролиферации в Gl фазе (Lu and Gilbert, 2007). Клетки плаценты являются пролиферирующими, в популяциях лимфоцитов, выделенных из крови пациентов, всегда присутствует некоторое количество уже активированных лимфоцитов. Этим объясняются обнаруженные небольшие количества транскриптов HS3-1 в этих препаратах.

В дифференцирующихся клетках Е-14 показана транскрипция МаСат, количество антисмыслового одноцепочечного транскрипта возрастало после индукции РК. Ранее выявлены транскрипты МаСат в эмбриональных и взрослых тканях мыши (Rudert et al., 1995). Транскрипция с прямой и обратной цепи МаСат пространственно и временно разделены регуляцией в течение эмбрионального развития. Дифференциальная транскрипция МаСат возможно совпадает со специфическими и радикальными перестройками хроматина, например, при коммитации к дифференцировке ЭСК (Misteli, 2004; Enukashvily et al., 2009).

Известно, что с МаСат взаимодействует белок РНК-хеликаза р68 (Enukashvily et al., 2009), являющийся, в том числе, коактиватором транскрипции и регулятором дифференцировки (Endoh et al., 1999; Rossow and /anknccht, 2003; Fuller-Pace et al., 2008; Yang et al., 2007; Stevenson et al., 1998). РНК-хеликаза p68 экспрессируется в течение

дифференцировки клеток Е-14 одновременно с транскрипцией МаСат. После индукции РК клеток Е-14 часть внутриклеточного пула р68 попадает в формирующиеся хромоцентры. На этом этапе дифференцировки определенное количество белка р68 остается ассоциированным с МаСат (Enukashvily et al., 2009). Возможно, взаимодействие р68 с транскриптами МаСат способно играть роль в регуляции дифференцировки ЭСК Е-14.

HS3-1 транскрипт обнаружен в клетках линии А431 и в стареющих фибробластах MRC5 в больших количествах, чем в клетках плаценты и лимфоцитах. В клетках, подвергнутых тепловому шоку, транскрибируется HS3 хромосомы 9, что сопровождается его деконденсацией (Jolly et al., 2004). Ни в лимфоцитах и клетках плаценты, ни в клетках А431 и MRC5 деконденсации и транскрипции HS3 хромосомы 9 не обнаружено (Enukashvily et al., 2007). Это подтверждает избирательность транскрипции HS3-1.

Секвенирование кДНК подтвердило, что транскрипт образуется с последовательности HS3-1. Точка инициации транскрипции и терминирующая последовательность в выделенной кДНК не обнаружены. Следовательно, данная последовательность не является полным транскриптом, и ПЦР амплифицирует только его часть. Известно, что прицентромерные участки состоят не только из сатДНК, на хромосоме 10 вплотную к HS3-1 лежат несколько псевдогенов и фрагментов генов, с которых экспрессируются транскрипты, содержащие участки сатДНК (Guy et al., 2000). Скорее всего, HS3-1 является частью подобного транскрипта. Его гетерогенность предполагает, что существует более одной точки инициации, с которой транскрибируются последовательности, включающие HS3-1.

HS3-1 транскрипт полиаденилирован, но не удалось его обнаружить за пределами ядра методами РНК-ДНК FISH. Видимо, HS3-1 транскрипт функционирует в пределах ядра.

В этой работе транскрипция сателлитов выявлена только в одном направлении, что не совпадает с моделью РНК-интерференции у S. pombe, где РНК транскрибируются в обоих направлениях. Согласно гипотезе РНК-интерференции, должны транскрибироваться и центромерные, и прицентромерные сателлиты (Eymery et al., 2009), но ни транскриптов альфоидной ДНК, ни транскриптов МиСат в образцах не выявлено. Малые интерферирующие РНК специфично связываются с их кодирующей последовательностью (Grewal and Elgin, 2007), соответственно, они должны локализоваться в гетерохроматиновых районах. В клетках линий А431, MRC5 и L929 не выявлено локализации транскриптов только в пределах гетерохроматина. Еще один факт против участия HS3 транскриптов в РНК-интерференции - это хромосомспецифичность транскрипции, в тех же условиях транскрипция HS3 с хромосомы 9 не показана (Enukashvily et al., 2007). Видимо, даже если обнаруженные в работе транскрипты и задействованы в гетерохроматинизации, то этот

механизм отличается от описанной РНК-интерференции у делящихся дрожжей. Это предположение совпадает с мнениями других авторов, считающих, что обнаруженная ими транскрипция HS3-1 и МаСат не задействована в РНК-интерференции. В С127 фибробластах найдены 200 п.н. транскрипты МаСат, синтезированные во время митоза de novo, а не полученные путем процессинга более длинных РНК перед ним (Lu and Gilbert, 2007).

Гетерохроматинизация в основном осуществляется за счет эпигенетических модификаций ДНК и гистонов (Craig, 2004; Dillon, 2004). У человека длинные одноцепочечные некодирующие Xist РНК ассоциируются с хроматином в течение инактивации и компактизации Х-хромосомы, вызывая модификации гистонов (Pezer and Ugarkovic, 2008). Возможно, подобным же образом задействованы транскрипты прицентромерной ДНК в гетерохроматинизации прицентромерных районов во время дифференцировки, а также для поддержания структуры гетерохроматина в стареющих и раковых клетках. В последних двух типах клеток происходят нарушения организации гетерохроматина, наблюдается деметилирование и деконденсация этих участков. Возможно, что в этом случае активируются механизмы формирования и поддержания его структуры, в норме работающие лишь во время клеточной дифференцировки. Локализация, уровень компактизации и степень метилирования сатДНК

Показано, что в клетках Е-14 МаСат и МиСат начинают проникать в формирующиеся хромоцентры только через четыре дня после удаления LIF. Ранее выявлено, что хромосомы, участки хромосом и гены перемещаются в течение клеточной дифференцировки для приобретения тканеспецифичной пространственной организации (Taddei et al. 2004). Перемещение сателлитов после индукции в хромоцентры отражает процесс дифференцировки.

В стареющих фибробластах MRC5 HS3-1 деконденсируется. Известно, что деконденсация прицентромеров наблюдается и в других линиях фибробластов при старении культуры. В клетках пациентов с некоторыми формами синдрома преждевременного старения деконденсация прицентромеров начинается на более ранних пассажах по сравнению со здоровыми пациентами близкого возраста (Enukashvily et al., 2007). Наиболее вероятно, что деконденсация прицентромеров отражает глубокие изменения в стареющей клетке, которая более неспособна поддерживать нормальную трехмерную структуру ядра.

Линии HeLa и А431 происходят из эпидермоидных опухолей. В клетках линии HeLa (карцинома молодой женщины) HS3-1 конденсирован, но в А431 клетках, происходящих из карциномы 85-летней женщины, показана деконденсация HS3-1. Скорее всего,

обнаруженные различия в степени конденсации HS3-1 между А431 и HeLa отражают процессы старения, происходившие в клетках донора А431.

Декоцденсация HS3-1 в стареющих фибробластах MRC5 и в клетках А431 сопровождается его деметилированием. Малые дозы деметюшрующих агентов сильно подавляют конденсацию конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом человека (Haaf and Schmid, 2000). Скорее всего, одной из причин деконденсации HS3-1 в MRC5 и А431 является деметилирование этой последовательности.

Таким образом, транскрипция сатДНК может сопровождаться ее декомпактизацией и деметилированием, то есть, потерей признаков, характерных для конститутивного гетерохроматина.

ВЫВОДЫ

1. В ЭСК мыши транскриггты прицентромерного МаСат, но не центромерного Мисат появляются после индукции РК. В культурах, полученных из дифференцированных клеток мыши, транскрипты обнаруживаются только в отдельных клетках.

2. В малигнизированных клетках и в стареющих фибробластах человека транскрибируется прицентромерный HS3-1.

3. Все выявленные транскрипты полиаденилированы, но транскрибируются с разных цепей. У человека накапливаются гетерогенные смысловые транскрипты HS3-1, а у мыши - антисмысловые транскрипты МаСат

4. Обнаруженные транскрипты располагаются во всех исследованных клетках компактными кластерами в ядре. Но только в индуцированных ЭСК эти кластеры прилежат или совпадают с хромоцентрами или DAPI-окрашенными участками хромосом.

5. Транскрибируемая прицентромерная сатДНК частично деконденсирована и деметилирована в стареющих и раковых клетках.

6. В клетках человека и мыши транскрибируется прицентромерная, но не центромерная, ДНК. Обнаруженные транскрипты не вовлечены в механизм поддержания гетерохроматина путем РНК-интерференции в том виде, в каком она происходит у дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И. С. Р. Вайсертрейгер. О. И. Подгорная, Н. И. Енукашвили, 2007. ДНК прицентромерных участков конститутивного гетерохроматина деметилирована и деконденсирована в клетках MRC5 и А431. Цитология. 49(1):62-69.

-172. Enukashvily N. I., Donev R., Waisertreiger t. S.. Podgornaya О. I. 2007. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is decondensed, demethylated and transcribed in senescent cells and in A431 epithelial carcinoma cells. Cytogenet Genome Res. 118(l):42-54.

3. Enukashvily N. I., Malashicheva А. В., Waisertreiger I. S-R. 2009. Satellite DNA spatial localisation and transcriptional activity in mouse embryonic E-14 and IOUD2 stem cells. Cytogenet Genome Res. 2009; 124:277-287.

4. H. И. Енукашвили, И. С. Вайсертрейгер. О. И. Подгорная, 2005. Положение прицентромерного сателлита 3 относительно хромосомных территорий в ядрах клеток человека. Цитология. 47(9):809-810.

5. И. С. Вайсертрейгер. Н. И. Енукашвили, 2006. Степень компактизации центромерных и прицентромерных сателлитных ДНК в клетках человека. Сборник тезисов IXВсероссийской медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и Здоровье»: 48-51.

Подписано в печать 29.01.2010. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ 31

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вайсертрейгер, Ирина Саша-Рувиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Цель и задачи работы:.

1.2. Положения, выносимые на защиту:.

1.3. Научная новизна работы:.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы.

1.5. Апробация диссертации.

1.6. Публикации по теме диссертации.

1.7. Структура и объем диссертации.

2. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ САТДНК В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ

КЛЕТКИ.

2.1. Организация генома эукариот. Конститутивный гетерохроматин.

2.2. Структурные особенности организации центромерного и прицентромерного конститутивного гетерохроматина.

2.3. СатДНК.

2.3.1. СатДНК человека.

2.3.1.1. Альфоидная ДНК.

2.3.1.2. Классические сатДНК человека.

2.3.2. СатДНК домовой мыши Mus musculus.

2.3.3. Несателлитные ДНК, лежащие в центромериой и пргщентромерной области

2.4. Транскрипция сатДНК.

2.4.1. Механизм транскрипции сатДНК.

2.5. Возможные механизмы формирования конститутивного гетерохроматина.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Молекулярно-биологические методы.

3.1.1. ДНК-зонды.

3.1.2. Получение тотальной РНК с использованием гуанидина изотиоцианата.

3.1.3. Реакция обратной транскрипции.

3.1.4. Определение уровня метилирования сатДНК.

3.2.4. Микроскопирование.

3.4. Морфометрический анализ и статистическая обработка данных.

3.5. Секвенирование.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Транскрипционная активность сателлитной ДНК в клетках мыши.

4.2. Локализация сателлитной ДНК в клетках мыши.

4.3. Транскрипционная активность сателлитной ДНК в клетках человека.

4.4. Локализация, уровень компактизации и степень метилирования центромерной и прицентромерной ДНК в клетках человека.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Различия в транскрипции центромерной и прицентромерной ДНК.

5.2. Транскрипционная активность прицентромерной ДНК в клетках человека и мыши.

5.3. Локализация, уровень компактизации и степень метилирования сатДНК в клетках человека и мыши.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транскрипционная активность прицентромерной сателлитной ДНК в клетках человека и мыши"

Одной из задач современной биологии является проблема изучения структурно-функциональной организации генома.

При этом особое место занимает исследование некодирующей ДНК. Функции же избыточной, или некодирующей, ДНК практически не исследованы. Значительную часть некодирующей ДНК составляют повторяющиеся последовательности. Среди них выделяют рассеянные по геному повторы и сателлитную ДНК (сатДНК). СатДНК состоит из тандемно организованных повторяющихся последовательностей и составляет от 5 до 50% от суммарного количества ДНК в геноме эукариот (Беридзе, 1982). История изучения сатДНК насчитывает более 40 лет, однако ее роль в функционировании генома до сих пор не ясна. Возможно то, что сатДНК есть почти у всех эукариот, предполагает существование какой-либо общей функции, но точных доказательств этому нет. Существуют работы, которые приписывают сатДНК ряд функций. Например, считается, что она принимает обязательное участие в образовании и поддержании структурно-функциональной организации центромер и кинетохоров (Grady et ah, 1992, Guenatri et al., 2004). Обнаружена рибозимная активность сатДНК (Rojas et al., 2000). Предложена общая модель функционирования сатДНК, согласно которой, определенные белки в интерфазе связываются с эухроматическими участками, а в метафазе - с сатДНК. Согласно этой модели сателлитные кластеры ДНК, связываясь с белками, обеспечивают стабилизацию митотического процесса (Csink and Henikoff, 1998).

СатДНК в основном локализуется в области конститутивного центромерного и прицентромерного гетерохроматина. Центромерный хроматин располагается в области первичной перетяжки хромосомы, а прицентромерный его фланкирует по краям (Lee et al., 1997; Choo, 1997).

Центромерный и прицентромерный конститутивный гетерохроматин собираются на основе разных последовательностей сатДНК. У человека центромерный гетерохроматин всех хромосом формируется на основе альфоидной ДНК, прицентромерный - на основе простых классических сателлитов; таких как сателлиты I, 2, 3 (human satellite 3 - HS3) (Lee et al., 1997). В настоящее время выделено и охарактеризовано несколько хромосомспецифичных субсемейств HS3 (Cooke and Hindley, 1979). HS3 хромосомы 1 (HS3-1) является одним из. самых крупных массивов сатДНК в геноме человека и считается хромосомспецифичным, поэтому в нем легче визуально наблюдать изменения морфологических характеристик: степени конденсации, размера и положения в ядре.

У мыши непосредственно в центромере располагается минорный сателлит (МиСат), отделенный от эухроматина длинного плеча хромосомы большим доменом мажорного сателлита (МаСат) (Mitchell, 1996), являющегося основой для формирования прицентромерного гетерохроматина. В отличие от хромосомспецифичных классических сателлитов человека МаСат и МиСат весьма однородны по нуклеотидной последовательности; в МаСат нуклеотидные последовательности мономеров различаются не более чем на 5% (Vissel and Choo, 1989), а в МиСат — примерно 5,6% (Kipling et al., 1994).

Считается, что сателлиты этих районов играют разные роли в функции центромеров. Участки центромерного сателлита являются основой для сборки кинетохоров, а прицентромерные - могут помогать в обеспечении когезии сестринских хроматид. Различия в организации центромерного и прицентромерного районов вносят существенный вклад в структуру и функцию центромеров (Guenatri et al., 2004; Sullivan et Karpen, 2004).

Конститутивный гетерохроматин традиционно считается компактизованным и транскрипционно инертным в течение всего клеточного цикла. Следовательно, сатДНК центромерного и прицентромерного районов должна быть транскрипционно инертна в течение клеточного цикла. Но, в последнее время появились работы, где был показан феномен ее транскрипционной активности (например, Jolly et al., 2004, Rudert et al., 1995; Lehnertz et al., 2003). У делящихся дрожжей малые некодирующие РНК, необходимы для поддержания функции центромеров и подавления экспрессии определенных генов (Martienssen et al., 2005). Прицентромерные сателлиты человека транскрибируются в малигнизированных клеточных линиях и при опухолях различного происхождения (Alexiadis et al., 2007).0днако еще не выяснено, насколько распространена транскрипция в клетках млекопитающих, и при каких обстоятельствах транскрибируются центромерные и прицентромерные сателлиты.

Существует гипотеза, что транскрипты сатДНК вовлечены в гетерохроматинизацию посредством РНК-интерференции. У S. Pombe длинные двуцепочечные транскрипты, полученные путем транскрипции центромерных и прицентромерных сателлитов в обоих направлениях, расщепляются рибонуклеазой Dicer в короткие молекулы РНК длиной 22 п.н. Э ти малые молекулы РНК, вместе с Agol (гомолог белка Argonaute у делящихся дрожжей), Chpl (белок, несущий хромодомен, и ассоциированный с гетерохроматином) и Tas3, являются компонентами подавляющего транскрипцию РНК-индуцируемого комплекса и определяют локализацию этого комплекса в гетерохроматине. В результате появляются и амплифицируются малые интерферирующие РНК, задействованные в поддержании структуры гетерохроматиновых районов (Buhler and Moazed, 2007). Считается, что РНК интерференция ведет к гетерохроматинизации привлечением через малые интерферирующие РНК метилтрансфераз, чтобы получить следующие эпигенетические модификации: гистон НЗ триметилированный по лизину 9 и 27, и Н4 метилированный по лизину 20 (Martens et al., 2005). Таким образом, по аналогии с дрожжевой моделью, длинные транскрипты сатДНК у млекопитающих могут быть предшественниками малых двуцепочечных РНК, задействованных в формировании или поддержании того или иного состояния ге герохроматина.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Вайсертрейгер, Ирина Саша-Рувиновна

7. ВЫВОДЫ

1. В ЭСК мыши транскрипты прицентромерного МаСат, но не центромерного Мисат появляются после индукции РК. В культурах, полученных из дифференцированных клеток мыши, транскрипты обнаруживаются только в отдельных клетках.

2. В малигнизированных клетках и в стареющих фибробластах человека транскрибируется прицентромерный HS3-1.

3. Все выявленные транскрипты полиаденилированы, но транскрибируются с разных цепей. У человека накапливаются гетерогенные смысловые транскрипты, а у мыши - антисмысловые транскрипты МаСат

4. Обнаруженные транскрипты располагаются во всех исследованных клетках компактными кластерами в ядре. Но только в индуцированных ЭСК эти кластеры прилежат или совпадают с хромоцентрами или DAPI-окрашенными участками хромосом.

5. Транскрибируемая прицентромерная сатДНК частично де конденсирована и деметилирована в стареющих и раковых клетках.

6. В клетках человека и мыши транскрибируется прицентромерная, но не центромерная, ДНК. Обнаруженные транскрипты не вовлечены в механизм поддержания гетерохроматина путем РНК-интерференции в том виде, в каком она происходит у дрожжей.

8. БЛАГОДАРНОСТИ

Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКГ1 "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях".

Я хотела бы выразить благодарность Dr. D. Sheer и Dr. R. Donev за плодотворное сотрудничество в течение всего времени работы над проектом. Я также благодарны Банку клеточных культур (Санкт-Петербург) и Cancer Research Company (Лондон, Великобритания) за огромную помощь в работе с клетками линии MRC5. Также я хочу выразить благодарность к.б.н. Инне Корицкой за любезное предоставление нам очищенной фракции лимфоцитов человека и к.б.н. Анне Малашичевой за неоценимую помощь в работе с клетками линии Е-14.

В заключение, я хотела бы поблагодарить за оказанную помощь и поддержку весь состав группы Некодирующей ДНК, под руководством Ольги Игоревны Подгорной, в особенности Алексея Комисарова и Инну Кузнецову.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе показано, что после индукции ЭСК Е-14 центромерный МиСат и прицентромерный МаСат перемещаются с периферии в формирующиеся хромоцентры, в это же время в ядрах Е-14 клеток начинают накапливаться транскрипты прицентромерного МаСат. Перемещение сателлитов после индукции в хромоцентры отражает процесс дифференцировки. Также показано, что транскрибируемая прицентромерная сатДНК частично деконденсирована и деметилирована в стареющих и раковых клетках. Таким образом, транскрипция сатДНК может сопровождаться се декомпактизацией и деметилированием, то есть, потерей признаков, характерных для конститутивного гетерохроматина.

Показано, что в клетках человека и мыши транскрибируется прицентромерная, но не центромерная, ДНК. Все выявленные транскрипты полиаденилированы, но транскрибируются с разных цепей. У человека накапливаются гетерогенные смысловые транскрипты HS3-1, а у мыши - антисмысловые транскрипты МаСат. Обнаруженные транскрипты располагаются во всех исследованных клетках компактными кластерами в ядре, но только в индуцированных ЭСК Е-14 эти кластеры прилежат или совпадают с хромо центрами или D API-окрашенными участками хромосом. Все это указывает на то, что транскрипты МаСат и HS3-1 не вовлечены в механизм поддержания гетерохроматина путем РНК-интерференции в том виде, в каком она происходит у дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вайсертрейгер, Ирина Саша-Рувиновна, Санкт-Петербург

1. Беридзе Т. Г. Сателлитная ДНК. М., 1982. Наука. 121с.

2. Маниатис Т., Фрич Е., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984. Мир. 474 с.

3. Подгорная О.И., Остромышенский Д.И., Кузнецова И.С., Матвеев И.В., Комиссаров А.С. Парадоксы организации центромера и гетерохроматина. Цитология. 2009; 51(3): 204-211.

4. Полторацкий В. П., Деи Р., Белгрейдер Ф., Березней Р., Подгорная О. И. Белок, связанный с сателлитной ДНК, присутствует в препаратах ядерного матрикса клеток человека. Мол. Биол. 1991; 25(1): 83-90.

5. Чан В. Т.-В. Выделение нуклеиновых кислот из клинических образцов и культур. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М., 1999. Мир. 558 с.

6. Alazami А. М., Mejia J. Е., Monaco Z. L. Human artificial chromosomes containing chromosome 17 alphoid DNA maintain an active centromere in murine cells but are not stable. Genomics. 2004; 83: 844—851.

7. Alexiadis V., Ballestas M. E., Sanchez C., Winokur S., Vedanarayanan V., Warren M., Ehrlich M. RNAPol-ChIP analysis of transcription from FSHD-linked tandem repeats and satellite DNA. Biochim Biophys Acta. 2007 Jan; 1769(l):29-40.

8. Amor D. J., Choo К. H. Neocentromeres: role in human disease, evolution, and centromere study. Am J Hum Genet. 2002 Oct; 71(4):695-714.

9. Basu J., Willard H.F. Artificial and engineered chromosomes: non-integrating vectors for gene therapy. Trends Mol Med. 2005 May; 11(5):251-8.

10. Bernard P., Allshire R. Centromeres become unstuck without heterochromatin. Trends Cell Biol. 2002 Sep; l2(9):419-24.

11. Bernstein E., Allis C.D. RNA meets chromatin. Genes Dev 2005; 19:1635-1655.

12. Billy E., Brondani V., Zhang H., Muller U., Filipowicz W. Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:14428-14433.

13. Blower M. D., Sullivan B. A., Karpen G. H. Conserved organization of centromeric chromatin in flies and humans. Dev Cell. 2002 Mar; 2(3):319-30.

14. Bouzinba-Segard H., Guais A., Francastel C. Accumulation of small murine minor satellite transcripts leads to impaired centromeric architecture and function. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:8709-8714.

15. Bridger J. M., Kill I. R., Lichter P. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Res. 1998 Jan; 6(1): 13-24.

16. Britten R.J., Kohne D.E. Repeated sequences in DNA. Hundreds of thousands of copies of DNA sequences have been incorporated into the genomes of higher organisms. Science. 1968 Aug 9; 161(841):529-40.

17. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA. Trends Genet. 2002 Jul; I8(7):352-8.

18. Brown K.E., Guest S.S., Smale S.T., Hahm K., Merkenschlager M., Fisher A.G. Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin. Cell. 1997; 91:845-854.

19. Buhler M., Moazed D. Transcription and RNAi in heterochromatic gene silencing. Nat Struct Mol Biol. 2007 Nov 5; 14(11):1041-1048.

20. Calabrese J.M., Seila A.C., Yeo G.W., Sharp P.A. RNA sequence analysis defines Dicer's role in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:1809718102.

21. Choo К. H. 1997. The centromere. Oxford-NY-Tokyo, Oxford University Press. 403 p.

22. Coats S.R., Zhang Y., Epstein L.M. Transcription of satellite 2 DNA from the newt is driven by a snRNA type of promoter. Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11; 22(22):4697-704.

23. Cobb B.S., Morales-Alcelay S., Kleiger G., Brown K.E., Fisher A.G., Smale, S.T. Targeting of Ikaros to pericentromeric heterochromatin by direct DNA binding. Genes Dev. 2000; 14,2146-2160.

24. Cooke H. J., Hindley J. Cloning of human satellite III DNA: different components are on different chromosomes. Nucleic Acids Res. 1979 Jul 25;6(10):3177-97.

25. Corneo G., Ginelli E., Polli E. A satellite DNA isolated from human tissues. J Mol Biol. 1967 Feb 14; 23(3):619-22.

26. Corneo G., Zardi L., Polli E. Elution of mammalian nuclearsatellite DNA's on methylated albumin kieselguhr and hydroxyapatite chromatographic columns. Biochim Biophys Acta. 1970 Oct 15; 217(2):249-58.

27. Craig J. M. Heterochromatin many flavours, common themes. Bioessays. 2005 Jan; 27(1): 17-28.

28. Csink A.K., Henikoff S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats. Trends Genet. 1998 May; 14(5):200-4.

29. Dai J., Sullivan B.A., Higgins J.M. Regulation of mitotic chromosome cohesion by Haspin and Aurora B. Dev Cell. 2006 Nov; 11(5):741-50.

30. Dante R., Dante-Paire J., Rigal D., Roizes G. Methylation patterns of long interspersed repeated DNA and alphoid repetitive DNA from human cell lines and tumors. Anticancer Res. 1992 Mar-Apr; 12(2):559-63.

31. Denegri M., Moralli D., Rocchi M., Biggiogera M., Raimondi E., Cobianchi F., De Carli L., Riva S., Biamonti G. Human chromosomes 9, 12, and 15 contain the nucleation sites of stress induced nuclear bodies, Mol. Biol. Cell 2002; 13: 2069-2079.

32. Dillon N. Heterochromatin structure and function. Biol Cell. 2004 Oct; 96(8):631-7.

33. Dillon N., Festenstein R. Unravelling heterochromatin: competition between positive and negative factors regulates accessibility. Trends Genet. 2002 May; 18(5):252-8.

34. Durand-Dubief M. I., Ekwall K. Heterochromatin tells CENP-A where to go. BioEssays. 2008; 30: 526—529.

35. Eymery A., Callanan M., Vourc'h C. The secret message of heterochromatin: new insights into the mechanisms and function of centromeric and pericentric repeat sequence transcription. Int. J. Dev. Biol. 2009; 53: 259-268 (2009)

36. Fazzari M. J., Greally J. M. Epigenomics: beyond CpG islands. Nat. Rev., Genet. 2004 May; 5:446-455.

37. Fisher A.G., Merkenschlager M. Gene silencing, cell fate and nuclear organisation. Curr Opin Genet Dev. 2002 Apr; 12(2):193-7.

38. Fukagawa Т., Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki Т., Takami Y., Nakayama Т., Oshimura M. Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat Cell Biol. 2004 Aug; 6(8):784-91.

39. Fuller-Pace F.V., Ali S. The DEAD box RNA helicases p68 (Ddx5) and p72 (Ddxl7): novel transcriptional co-regulators. Biochem Soc Trans. 2008 Aug; 36(Pt4):609-12.

40. Gaff C., du Sart D., Kalitsis P., Iannello R., Nagy A., Choo К. H. A novel nuclear protein binds centromeric alpha satellite DNA. Hum Mol Genet. 1994 May; 3(5):711-6.

41. Gaubatz J.W., Cutler R.G. Mouse satellite DNA is transcribed in senescent cardiac muscle. J Biol Chem 1990; 265: 17753-17758.

42. Georgopoulos K. Haematopoietic cell-fate decisions, chromatin regulation and Ikaros. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2:162-174.

43. Gilbert N., Allan J. Distinctive higher-order chromatin structure at mammalian centromeres. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 Oct 9; 98(21): 11949-54.

44. Golob J.L., Paige S.L., Muskheli V., Pabon L., Murry C.E. Chromatin remodeling during mouse and human embryonic stem cell differentiation. Dev Dyn. 2008 Ma)'; 237(5): 1389-98.

45. Gosden J.R., Mitchell A.R., Buckland R.A., Clayton R.P., Evans H.J. The location of four human satellite DNAs on human chromosomes. Exp Cell Res. 1975 Apr; 92(1): 14858.

46. Grady D. L., Ratliff R. L„ Robinson D. L., McCanlies E. C., Meyne J., Moyzis R. K. Highly conserved repetitive DNA sequences are present at human centromeres. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1; 89(5): 1695-9.

47. Grewal, S.I., Elgin, S.C. Transcription and RNA interference in the formation of heterochromatin. Nature 2007; 447: 399-406.

48. Guenatri M, Bailly D, Maison C, Almouzni G. Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin. J Cell Biol. 2004 Aug 16; 166(4):493-505.

49. Haaf Т., Willard H.F. Organization, polymorphism, and molecular cytogenetics of chromosome-specific alpha-satellite DNA from the centromere of chromosome 2. Genomics. 1992 May; 13(l):122-8.

50. Hannon G. RNA interference. Nature 2002; 418; 244-251.

51. Haraguchi Т., Mizutani Т., Yamamichi N., Ito Т., Minoguchi S., Iba H. SiRNAs do not induce RNAdependent transcriptional silencing of retrovirus in human cells. FEBS Lett 2007; 581:4949-4954.

52. He D., Brinkley B.R. Structure and dynamic organization of centromeres/prekinetochores in the nucleus of mammalian cells. J Cell Sci. 1996 Nov; 109 (Pt 11):2693-704.

53. Heitz E. Das heterochromatin der moose. Jahrb.Wiss.Botanik. 1928.

54. Henikoff S., Ahmad K., Malik H. S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA. Science. 2001; 293: 1098—1102.

55. Hibino Y., Nakamura K., Asano S., Sugano N. Affinity of a highly repetitive bent DNA for nuclear scaffold proteins from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 184: 853—858.

56. Hosouchi Т., Kumekawa N., Tsuruoka H., Kotani H. Physical mapbased sizes of the centromeric regions of Arabidopsis thaliana chromosomes 1, 2, and 3. DNA Res. 2002; 9: 117-121.

57. Howe M., Dimitri P., Berloco M., Wakimoto B.T. Cis-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster. Genetics 1995;140: 1033-1045.

58. Ikeno M., Grimes В., Okazaki Т., Nakano M., Saitoh K., Hoshino H„ McGill N. I., Cooke H., Masumoto H. Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes. Nat. Biotechnol. 1998; 16: 431—439.

59. Jabs E.W., Wolf S.F., Migeon B.R. Characterization of a cloned DNA sequence that is present at centromeres of all human autosomes and the X chromosome and shows polymorphic variation. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Aug; 81(15):4884-8.

60. Jackson K., Yu M.C., Arakawa K„ Fiala E., Youn В., Fiegl H„ Muller-Holzner E., Widschwendter M., Ehrlich M. DNA hypomethylation is prevalent even in low-grade breast cancers. Cancer Biol Ther. 2004 Dec; 3(12): 1225-31.

61. Jehan Z., Vallinayagam S., Tiwari S., Pradhan S., Singh L., Suresh,A., Reddy H.M., Ahuja Y.R., Jesudasan, R.A. Novel noncoding RNA from human Y distal heterochromatic block (Yql2) generates testisspecific chimeric CDC2L2. Genome Res 2007; 17: 433-440.

62. Jolly C., Lakhotia S. C. Human sat III and Drosophila hsr omega transcripts: a common paradigm for regulation of nuclear RNA processing in stressed cells. Nucleic Acids Res. 2006; 34(19):5508-14.

63. Jolly C., Metz A., Govin J., Vigneron M., Turner В. M., Khochbin S., Vourc'h C. Stress-induced transcription of satellite III repeats. J Cell Biol. 2004 Jan 5; 164(l):25-33.

64. Joseph A., Mitchell A. R, Miller O. J. The organization of the mouse satellite DNA at centromeres. Exp. Cell. Res. 1989; 183 (2): 494-500.

65. Kalitsis P., Earle E., Vissel В., Shaffer L. G., Choo К. H. A chromosome 13-specific human satellite I DNA subfamily with minor presence on chromosome 21: further studies on Robertsonian translocations.Genomics. 1993 Apr; 16(1):104-12.

66. Kanellopoulou C., Muljo S.A., Kung A.L., Ganesan S., Drapkin R., Jenuwein T, Livingston D.M, Rajewsky K. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 2005 Feb 15; 19(4):489-501.

67. Kaplan F. S., O'Connor J. P. Topographic changes in a heterochromatic chromosome block in humans (15P) during formation of the nucleolus. Chromosome Res. 1995 Aug; 3(5):309-14.

68. Kellum R. HP1 complexes and heterochromatin assembly. Curr Top Microbiol Immunol. 2003; 274:53-77.

69. Kipling D., Wilson H. E., Mitchell A. R., Taylor B. A., Cooke H. J. Mouse centromere mapping using oligonucleotide probes that detect variants of the minor satellite. Chromosome. 1994; 103 (1): 46-55.

70. Kit S. Equilibrium sedimentation in density gradients of DNA preparations from animal tissues. J Mol Biol. 1961 Dec; 3:711-6.

71. Koipally J., Helle E.J., Seavitt J.R., Georgopoulos K. Unconventional potentiation of gene expression by IkarosJ. Biol: Chem. 2002; 277, 13007-13015.

72. Kurek R., Reugels A.M., Lammermann U., Bunemann H. Molecular aspects of intron evolution in dynein encoding mega-genes on the heterochromatic Y chromosome of Drosophila sp. Genetica 2000; 109: 113-123.

73. Kuznetsova I., Podgornaya O., Ferguson-Smith M. A. High-resolution organization of mouse centromeric and pericentromeric DNA. Cytogenet. Genome Res. 2006; 112: 248—255.

74. Kuznetsova I.S., Prusov A.N., Enukashvily N.I., Podgornaya O.I. New types of mouse centromeric satellite DNAs. Chromosome Res. 2005; 13(l):9-25.

75. Lachner M., O'Sullivan R. J., Jenuvvein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J Cell Sci. 2003 Jun 1; 116(Pt 11):2117-24.

76. Lam A.L., Boivin C.D., Bonney C.F., Rudd M.K., Sullivan B.A. Human centromeric chromatin is a dynamic chromosomal domain that can spread over noncentromeric DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103: 4186^1191.

77. Lee C., Critcher R., Zhang J.G., Mills W., Farr C.J. Distribution of gamma satellite DNA on the human X and Y chromosomes suggests that it is not required for mitotic centromere function. Chromosoma. 2000 Sep; 109(6):381-9.

78. Lee C., Wevrick R., Fisher R. В., Ferguson-Smith M. A., Lin С. C. Human centromeric DNAs. Hum Genet. 1997 Sep; 100(3-4):291-304.

79. Lee H.R., Neumann P., Macas J., Jiang J. Transcription and evolutionary dynamics of the centromeric satellite repeat CentO in rice. Mol. Biol. Evol. 2006; 23, 2505-2520.

80. Lin C.C., Sasi R., Lee C., Fan Y.S., Court D. Isolation and identification of a novel tandemly repeated DNA sequence in the centromeric region of human chromosome 8. Chromosoma. 1993 May; 102(5):333-9.

81. Lippman Z., Martienssen R. The role of RNA interference in heterochromatic silencing.Nature. 2004 Sep 16; 431(7006):364-70.

82. Lobov I. В., Tsutsui К., Mitchell A. R., Podgornaya О. I. SAF-A and lamin В binding specificity in vitro correlates with the satellite DNA bending state. J. Cell. Biochem. 2001; 83:218—229.

83. Lorite P., Renault S., Rouleux-Bonnin F., Bigot S., Periquet G., Palomeque T. Genomic organization and transcription of satellite DNA in the ant Aphaenogaster subterranea (Hymenoptera, Formicidae). Genome 2002; 45, 609-616.

84. Lu J., Gilbert D.M. Proliferation-dependent and cell cycle regulated transcription of mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol 2007; 179: 411-421.

85. Maio J. J. DNA strand reassociation and polyribonucleotide binding in the African green monkey, Cercopithecus aethiops. J Mol Biol. 1971 Mar 28; 56(3):579-9563.

86. Manuelidis L. Repeating restriction fragments of human DNA. Nucleic Acids Res. 1976 Mar; 3 (11): 3063-3076.

87. Manuelidis L. A view of interphase chromosomes. Science. 1990 Dec 14; 250(4987): 1533-40.

88. Manuelidis L., Wu J.C. Homology between human and simian repeated DNA. Nature. 1978 Nov 2; 276(5683):92-4.

89. Maraschio P., Zuffardi O., Dalla Fior Т., Tiepolo L. Immunodeficiency, centromeric heterochromatin instability of chromosomes 1, 9, and 16, and facial anomalies: the ICF syndrome. J Med Genet 1988; 25: 173- 180.

90. Martens J. H., O'Sullivan R. J., Braunschweig U., Opravil S., Radolf M., Steinlein P., Jenuwein T. The profile of repeat-associated histone lysine methylation states in the mouse epigenome. EMBO J. 2005 Feb 23; 24(4):800-12.

91. Martienssen R. A., Zaratiegui M., Goto D. B. RNA interference and heterochromatin in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Trends Genet. 2005 Aug; 21(8):450-6.

92. Martienssen R.A. Maintenance of heterochromatin by RNA interference of tandem repeats. Nat. Genet. 2003; 35: 213-214.

93. Martin D. I. Activators antagonize heterochromatic silencing: reply to Eissenberg. Bioessays. 2002 Jan; 24(1): 102

94. Martine-Balbas A., Rodriguez-Campos A., Garcia-Ramirez M., Sainz J., Carrera P., Aymami J., Azorin F. Satellite DNAs contain sequence that induce curvature. Biochemistry. 1990; 9:2342—2348.

95. McKinsey T.A., Zhang C.L., Olson E.N. Signaling chromatin to make muscle. Curr. Opin. Cell Biol. 2002; 14: 763- 772.

96. Mette M., Aufsatz W., Van derWinden J., Matzke, M., Matzke A.Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA. EMBO J. 2000; 19: 5194-5201.

97. Metz A., Soret J., Vourc'h C., Tazi J., Jolly C. A key role for stress-induced satellite III transcripts in the relocalization of splicing factors into nuclear stress granules. J Cell Sci. 2004 Sep 1; 117(Pt l9):4551-8.

98. Mitchell A. R. The mammalian centromere: its molecular architecture. Mutat Res. 1996 Feb; 372(2): 153-62.

99. Morita S., Horii Т., Kimura M., Goto Y., Ochiya Т., Hatada I. One Argonaute family member, Eif2c2 (Ago2), is essential for development and appears not to be involved in DNA methylation. Genomics 2007; 89:687-696.

100. Morris K.V. RNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 320:211-224.

101. Mravinac В., Sullivan L.L., Reeves J.W., Yan C.M., Kopf K.S., Farr C.J., Schueler M.G., Sullivan B.A. Histone modifications within the human X centromere region. PLoS One. 2009 Aug 12; 4(8):e6602.

102. Muller H.I. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 1930 May; 22: 299-334.

103. Muchardt C., Guilleme M., Seeler J.S., Trouche D„ Dejean A., Yaniv M. Coordinated methyl and RNA binding is required for heterochromatin localization of mammalian HPlalpha. EMBO Rep 2002; 3:975-981.

104. Murchison E.P., Partridge J.F., Tam O.H., Cheloufi S., Hannon G.J! Characterization of Dicer-deficient murine embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:1213512140.

105. Narayan A., Ji W., Zhang X.Y., Marrogi A., Graff J.R., Baylin S.B., Ehrlich M. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer. 1998 Sep 11; 77(6):833-8.

106. Ng S.Y., Yoshida Т., Georgopoulos K. Ikaros and chromatin regulation in early hematopoiesis. Curr. Opin. Immunol. 2007; 19:116-122.

107. Okada Т., Ohzeki J., Nakano M., Yoda K., Brinkley W.R., Larionov V., Masumoto H. CENP-B controls centromere formation depending on the chromatin context. Cell. 2007 Dec 28; 131(7):1287-300.

108. O'Neill R.J., Carone D.M. The role of ncRNA in centromeres: a lesson from marsupials. Prog Mol Subcell Biol. 2009; 48:77-101.

109. Pal-Bhadra M., Leibovitch В., Gandhi S., Rao M., Bhadra U., Birchler J., Elgin S. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 2004; 303: 669-672.

110. Papait R., Pistore C., Negri D., Pecoraro D., Cantarini L., Bonapace I.M. Np95 is implicated in pericentromeric heterochromatin replication and in major satellite silencing. Mol Biol Cell. 2007 Mar; 18(3): 1098-106.

111. Pardue M., Gall J. Chromosomal localization of the mouse satellite DNA. Science. 1970; 168 (937): 1356-1358.

112. Partridge J. F., Borgstrom В., Allshire R. C. Distinct protein interaction domains and protein spreading in a complex centromere. Genes Dev. 2000 Apr 1; 14(7):783-91.

113. Pathak, D., et al. Chromosomal localization, copy number assessment, and transcriptional status of BamHI repeat fractions in water buffalo Bubalus bubalis. DNA Cell Biol. 2006; 25: 206-214.

114. Pattanayak D., Agarwal S., Sumathi S., Chakrabarti S.K., Naik P.S., Khurana S.M. Small but mighty RNA-mediated interference in plants. Indian J Exp Biol. 2005 Jan; 43(1 ):7-24.

115. Plohl M., Luchetti A., Mestrovic N., Mantovani B. Satellite DNAs between selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin. Gene. 2008 Feb 15; 409(l-2):72-82.

116. Podgornaya О. I., Voronin A. P., Enukashvily N. I., Matveevl. V., Lobov I. B. Structure-specific DNA-binding proteins as the foundation for 3-dimensional chromatin organization. Int. Rev. Cytol. 2003; 224: 227—296.

117. Podgornaya O., Dey R., Lobov I., Enukashvili N. Human satellite 3 (HS3) binding protein from the nuclear matrix: isolation and binding properties. Biochim Biophys Acta. 2000 Jul 21; 1497(2):204-14.

118. Prosser J., Frommer M., Paul C., Vincent P. C. Sequence relationships of three human satellite DNAs. J Mol Biol. 1986 Jan 20; 187(2): 145-55.

119. Provost P., Dishart D., Doucet J., Frendewey D., Samuelsson В., Radmark O. Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. Embo J 2002; 21:5864-5874.

120. Pruitt K., Zinn R.L., Ohm J.E., McGarvey K.M., Kang S.H., Watkins D.N., Herman J.G., Baylin S.B. Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation. PLoS Genet. 2006 Mar; 2(3):e40.

121. Qu G., Grundy P.E., Narayan A., Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumors of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16. Cancer Genet Cytogenet 1999; 109:34-9

122. Radic M. Z., Lundgren K., Hamkalo B. A. Curvature of mouse satellite DNA and condensation of heterochromatin. Cell. 1987; 50 (7): 1101-1108.

123. Rand E., Cedar H. Regulation of imprinting: A multi-tiered process. J Cell Biochem. 2003 Feb 1; 88(2):400-7.

124. Reinhart В., Bartel D. Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats. Science 2002; 297: 1831.

125. Richmond, Т., Widom J. Chromatin Structure and Gene Expression. Oxford University Press, Oxford, UK. 2000. 327 pp.

126. Ritchie R.J., Mattei M.G., Lalande M. A large polymorphic repeat in the pericentromeric region of human chromosome 15q contains three partial gene duplications. Hum Mol Genet. 1998 Aug; 7(8): 1253-60.

127. Roizes G. Human centromeric alphoid domains are periodically homogenized so that they vary substantially between homologues. Mechanism and implications for centromere functioning. Nucleic Acids Res. 2006 Apr 5; 34(6): 1912-24.

128. Ronni Т., Payne K.J., Ho S., Bradley M.N., Dorsam G., Dovat S. Human Ikaros function in activated T cells is regulated by coordinated expression of its largest isoforms. J. Biol. Chem. 2007; 282:2538-2547.

129. Rossow K.L., Janknecht R. Synergism between p68 RNA helicase and the transcriptional coactivators СВР and p300. Oncogene. 2003 Jan 9; 22(1): 151-6.

130. Rudd M.K, Willard H.F. Analysis of the centromeric regions of the human genome assembly. Trends Genet. 2004; 20: 529-533.

131. Rudd M.K., Wray G.A., Willard H.F. The evolutionary dynamics of alpha-satellite. Genome Res. 2006; 16, 88-96.

132. Rudert F., Bronner S., Gamier J.M., Dolle P. Transcripts from opposite strands of gamma satellite DNA are differentially expressed during mouse development. Mamm Genome 1995; 6: 76-83.

133. Rudert F., Gronemeyer H. Retinoic acid-response elements with a highly repetitive structure isolated by immuno-selection from genomic DNA. J Steroid Biochem Mol Biol. 1993 Aug; 46(2):121-33.

134. Saffery R., Irvine D. V., Griffiths В., Kalitsis P., Choo К. H. Components of the human spindle checkpoint control mechanism localize specifically to the active centromere on dicentric chromosomes. Hum. Genet. 2000; 107 (4): 376-384.

135. Saffery R., Sumer H., Hassan S., Wong L. H., Craig J. M., Todokoro K., Anderson M., Stafford A., Choo К. H. Transcription within a functional human centromere. Mol Cell. 2003 Aug; 12(2):509-16.

136. Schmidt, Т., Heslop-Harrison, J.S. Genomes, genes and junk: the largescale organization of plant chromosomes. Trends Plant Sci. 1998; 3: 195-199.

137. Schnedl W., Mikelsaar A.V., Breitenbach M., Dann O. DlPI and DAPI: fluorescence banding with only negliglible fading. Hum Genet. 1977 Apr 15; 36(2): 167-72.

138. Schramke V., Allshire R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing. Science 2003; 301: 1069-1O74.a

139. Sengupta S„ Parihar R., Ganesh S. Satellite HI non-coding RNAs show distinct and stress-specific patterns of induction. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Apr 24; 382(1): 102-7.

140. Shelby R.D., Hahn K.M., Sullivan K.F. Dynamic elastic behavior of alpha-satellite DNA domains visualized in situ in living human cells. J Cell Biol. 1996 Nov; 135(3):545-57.

141. Shicls C., Coutelle C., Huxley C. Contiguous arrays of satellites 1, 3, and beta form a 1.5-Mb domain on chromosome 22p. Genomics. 1997 Aug 15; 44(l):35-44.

142. Singhal R. P., Mays-Hoopes L. L., Eichhorn G.L. DNA methylation in aging of mice. Mech Ageing Dev. 1987 Dec; 41(3):199-210.

143. Skibbens R.V., Skeen V.P., Salmon E.D. Directional instability of kinetochore motility during chromosome congression and segregation in mitotic newt lung cells: a push-pull mechanism. J Cell Biol. 1993 Aug; 122(4):859-75.

144. Smith A. G., Hooper M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Devi Biol. 1987; 121: 1-9.

145. Smith C.D., Shu ,S.,Mungall C.J., Karpen G.H. TheRelease 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science 2007; 316, 1586-1591.

146. Sullivan B. A., Karpen G. H. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin. Nat Struct Mol Biol. 2004 Nov; 11(11):1076-83

147. Suzuki Т., Fujii M., Ayusawa D. Demethylation of classical satellite 2 and 3 DNA with chromosomal instability in senescent human fibroblasts. Exp Gerontol. 2002 Aug-Sep; 37(8-9): 1005-14.

148. Tagarro 1., Fernandez-Peralta A. M., Gonzalez-Aguilera J. J. Chromosomal localization of human satellites 2 and 3 by a FISH method using oligonucleotides as probes. Hum Genet. 1994 Apr; 93(4):383-8.

149. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E., Nordenskjold M., Ponder B.A., Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, 1992; 13; 718-725

150. Terranova R., Sauer S., Merkenschlager M., Fisher A.G. The reorganisation of constitutive heterochromatin in differentiating muscle requires HDAC activity. Exp Cell Res 2005;310:344-356.

151. Therkelsen A. J., Nielsen A., Kolvraa S. Localisation of the classical DNA satellites on human chromosomes as determined by primed in situ labelling (PRINS).Hum Genet. 1997 Sep; 100(3-4):322-6.

152. Topp C.N., Zhong C.X., Dawe R.K. Centromere-encoded RNAs are integral components of the maize kinetochore. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 15986-15991.

153. Trifonov E.N. Curved DNA. Crit Rev Biochem. 1985; 19(2):89-106. .

154. Trowell H. E., Nagy A., Vissel В., Choo К. H. Long-range analyses of the centromcric regions of human chromosomes 13, 14 and 21: identification of a narrow domain containing two key centromeric DNA elements. Hum Mol Genet. 1993 Oct; 2(10): 163949.

155. Tsien F., Fiala E. S., Youn В., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet Genome Res. 2002; 98(1):13-21.

156. Tyler-Smith C., Brown W.R. Structure of the major block of alphoid satellite DNA on the human Y chromosome. J Mol Biol. 1987 Jun 5; 195(3):457-70.

157. Usakin L., Abad J., Vagin V.V., de Pablos В., Villasante A., Gvozdev V.A. Transcription of the 1.688 satellite DNA family is under the control of RNA interference machinery in Drosophila melanogaster ovaries. Genetics. 2007 Jun; 176(2): 1343-9.

158. Valgardsdottir R., Chiodi L, Giordano M., Cobianchi F., Riva S., Biamonti G. Structural and Functional Characterization of Noncoding Repetitive RNAs Transcribed in Stressed Human Cells. Mol Biol Cell. 2005 Jun; 16(6):2597-604.

159. Valgardsdottir R., Chiodi I., Giordano M., Rossi A., Bazzini S., Ghigna C., Riva S., Biamonti G. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 423-434.

160. Vansant G., Reynolds W.F. The consensus sequence of a major Alu subfamily contains a functional retinoic acid response element. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 29; 92(18):8229-33.

161. Varadaraj K., Skinner D.M., Cytoplasmic localization of transcripts of a complexG+C-rich crab satellite DNA. Chromosoma (Berlin) 1994; 103: 423-431.

162. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama Т., Gygi S., Grewal S., Moazed D. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the R1TS complex. Science 2004; 303: 672676.

163. Verdel A., Moazed D. RNAi-directed assembly of heterochromatin in fission yeast. FEBS Lett 2005; 579:5872-5878.

164. Vig В. K. Sequence of centromere separation: a possible role for repetitive DNA. Mutagenesis. 1987 May; 2(3): 155-9.

165. Vig B.K., Willcourt M. Decondensation of pericentric heterochromatin alters the sequence of centromere separation in mouse cells. Chromosoma. 1998 Dec; 107(6-7) :417-23.

166. Vilain A., Bernardino J., Gerbault-Seureau M., Vogt N., Niveleau A., Lefrancois D., Malfoy В., Dutrillaux B. DNA methylation and chromosome instability in lymphoblastoid cell lines.Cytogenet Cell Genet. 2000; 90(l-2):93-101.

167. Vissel В., Nagy A., Choo K.H. A satellite III sequence shared by human chromosomes 13, 14, and 21 that is contiguous with alpha satellite DNA. Cytogenet Cell Genet. 1992; 61(2):81-6.

168. Volpe Т., Schramke V., Hamilton G., White S., Teng G., Martienssen R., Allshire R. RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chromosome Res. 2003; 11, 137-146.

169. Wang F., Koyama N., Nishida H., Haraguchi Т., Reith W., Tsukamoto T. The assembly and maintenance of heterochromatin initiated by transgene repeats are independent of the RNA interference pathway in mammalian cells. Mol Cell Biol 2006; 26:4028-4040.

170. Waye J.S., Willard H.F. Human beta satellite DNA: genomic organization and sequence definition of a class of highly repetitive tandem DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Aug; 86(16):6250-4.

171. Weierich C., Brero A., Stein S., von Hase J., Cremer C., Cremer Т., Solovei I. Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human and murine lymphocytes. Chromosome Res. 2003 May; ll(5):485-502.

172. Weisenberger D.J., Campan M., Long Т.1., Kim M. Woods C., Fiala E., Ehrlich M., Laird P.W. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic Acids Res. 2005 Dec 2; 33(21 ):6823-36.

173. Willard H.F. Centromeres of mammalian chromosomes. Trends Genet. 1990 Dec; 6(12):410-6.

174. Wilson A. S., Power В. E., Molloy P. L. DNA hypomethylation and human diseases. Biochim Biophys Acta. 2007 Jan; 1775(1): 138-62.

175. Wong A. K., Rattner J. B. Sequence organization and cytological localization of the minor satellite of mouse. Nucleic Acids Res. 1988; 16(24): 11645-11661.

176. Wong N. C., Wong L. H., Quach J. M., Canham P., Craig J. M., Song J. Z., Clark S. J., Choo К. H. Permissive transcriptional activity at the centromere through pockets of DNA hypomethylation. PLoS Genet. 2006 Feb; 2(2):el7.

177. Woodcock C. L., Dimitrov S. Higher-order structure of chromatin and chromosomes. CurrOpin Genet Dev. 2001 Apr; ll(2):130-5.

178. Wu J. C., Manuelidis L. Sequence definition and organization of a human repeated DNA. J Mol Biol. 1980 Sep 25; 142(3):363-86.

179. Wu R., Singh P.B., Gilbert. D.M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J. Cell Biol. 2006; 174:185-194.

180. Yan H., Jiang J. Rice as a model for centromere and heterochromatin research. Chromosom. Res. 2007; 15: 77-84.

181. Yang L., Lin C., Zhao S., Wang H., Liu Z.R. Phosphorylation of p68 RNA helicase plays a role in platelet-derived growth factor-induced cell proliferation by up-regulating cyclin D1 and c-Myc expression. J Biol Chem. 2007 Jun 8; 282(23): 16811-9.

182. Yoda K., Nakamura Т., Masumoto H., Suzuki N., Kitagawa K., Nakano M., Shinjo A., Okazaki T. CENP-B of African green monkey cells: gene structure, cellular expression, and centromeric localization. Mol. Cell Biol. 1996; 16 (9): 5169-5177.

183. Yoshioka H., McCarrey J.R., Yamazaki Y. Dynamic nuclear organization of constitutive heterochromatin during fetal male germ cell development in mice. Biol Reprod. 2009 Apr; 80(4):804-12.

184. Yu W., Gius D., Onyango P., Muldoon-Jacobs K., Karp J, Feinberg A.P., Cui H. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene pi 5 by its antisense RNA. Nature 2008; 451:202-206.

185. Zaratiegui M., Irvine D.V., Martienssen R.A. Noncoding RNAs and gene silencing. Cell 2007; 128:763-776.

186. Zinkowski R.P., Meyne J., Brinkley B.R. The centromere-kinetochore complex: a repeat subunit model. J Cell Biol. 1991 Jun; 113(5):1091-110.