Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека

Трофимова, Ирина Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

005056492

ТРОФИМОВА Ирина Леонидовна

ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ ФЛУОРОХРОМОМ АКРИДИНОВЫМ ОРАНЖЕВЫМ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ РАЙОНОВ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ДЕК 2012

Санкт-Петербург - 2012

005056492

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук и на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Кузнецова Татьяна Владимировна,

ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Козикова Лариса Васильевна, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИ генетики и разведения с.х. животных РАСХН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук

Медведева Лина Владимировна,

научный сотрудник лаборатории нейрогенетики

института физиологии им. И П. Павлова РАН,

Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение" Научно-исследовательский институт медицинской генетики" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск

Защита состоится « ¿У» 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета

Д 212.232.12 при Санкт-петербургским государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «0¥» ШХЯ^лЛ 2012

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12

доктор биологических наук

Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Организация и функциональная значимость таких специализированных участков хромосом как гетерохроматиновые районы (ГХР) привлекают особое внимание цитогенетиков человека с конца 1950-х гг., когда было обнаружено явление хромосомного полиморфизма. Особенно значительные и вариабельные по размерам блоки гетерохроматина (ГХ) локализованы в прицентромерных районах хромосом 1, 9 и 16, а также в дистальном отделе длинного плеча Y-хромосомы. Методами дифференциальной окраски (CBG, DA/DAPI, MG/QFH) был установлен гетероморфизм гомологичных районов прицентромерного ГХ (ПЦГХ) и для других хромосом (акроцентрические хромосомы, хромосомы 3 и 4). ГХР lqh, 9qh, 16qh и Yqh издавна отводится особая роль в нарушениях репродукции у человека (см. Прокофьева-Бельговская, 1986; Назаренко, 1993; Баранов, Кузнецова, 2007; Ворсанова и др., 2010), однако биологический смысл С- и Q-гетероморфизма ГХР и механизмы участия этих районов в нормальном и патологическом эмбриогенезе человека остаются предметом дискуссий.

В настоящее время традиционные представления о молекулярной организации и функциональной инертности ПЦГХ подверглись существенному пересмотру. В составе ПЦГХ млекопитающих и человека, кроме различных по протяженности и нуклеотидному составу сатДНК обнаружено высокое содержание ретротранспозонов, которые, по-видимому, принимают участие в ренрограммировании генома и регулируют экспрессию многих генов на начальных стадиях эмбриогенеза (Peaston et.al., 2004; Tomilin, 2008; Eymery et.al., 2009). Показана транскрипция сатДНК ПЦГХ у разных организмов (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004, 2006; Enukashvily et.al., 2007; Jehan et.al., 2007; Probst, Almouzni, 2011). Предполагается, что образующиеся РНК-транскрипты принимают участие в моделировании структуры хроматина в ответ на стресс (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004), участвуют в регуляции клеточного цикла (Lu, Gilbert, 2007) и клеточной дифференцировки (Eymery et.al., 2009; 2010). Полученные за последние годы сведения позволили сформулировать гипотезу, согласно которой программа индивидуального развития закодирована в специфических последовательностях ДНК в ПЦГХ, нарушения транскрипции которых могут пагубно отражаться на функциях генома, проявляться в виде синдромов, приводить к остановке развития и даже гибели эмбриона на ранних стадиях (Parris, 2009; 2010). Однако данных о транскрипции ПЦГХ в эмбриогенезе человека пока не получено.

Поиск причин нарушений и остановки эмбрионального развития у человека проводится, в основном, при спонтанных абортах и реже при других клинических формах патологии беременности — неразвивающейся беременности и анэмбрионии, при которых развитие хориона продолжается в течение нескольких недель после гибели эмбриона. Доминирующим фактором в ранней внутриутробной гибели признан хромосомный дисбаланс (Лебедев и др., 2006; Баранов, Кузнецова, 2007), при этом летальные для эмбриона доимплантационных стадий хромосомные аномалии могут быть совместимы с развитием и дифференцнровкой экстраэмбриональных тканей после имплантации (Лебедев, 2006). Поэтому исследования структурно-функциональных особенностей ГХР хромосом в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях, развитие которых происходит по разным программам, вызывают особый интерес.

К настоящему времени показано, что ГХР хромосом в цитотрофобласте (ЦТБ) хориона по сравнению с клетками эмбриональных органов деконденсированы и гипометилированы, а также рано реплицируются (Perez et.al., 1991; Назаренко, Карагеоргий, 1995; Баранов, Кузнецова, 2007). В свете современных представлений о функциях ГХ особую актуальность приобретают исследования процессов пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта, нарушения которых также могут сопровождаться гибелью эмбриона при имплантации и плацентации.

Учитывая, что сведения о параметрах клеточного цикла и митотической активности клеток ЦТБ хориона от эмбрионов при нормальной беременное™ и спонтанных абортусов скудны и противоречивы (Брусиловский, 1976; Terzoli et.al., 1985; Zahed et.al., 1988; Барцева, 1989; Kennerknehct et.al., 1992), представлялось целесообразным исследовать особенности

пролиферации клеток ЦТБ при неразвивающейся беременности. При выполнении этой задачи на краткосрочных органных культурах ворсин хориона с помощью метода «меченых митозов» мы обратили внимание на необычный спектр и избирательность окраски флуорохромом акридиновым оранжевым (АО) полиморфных ГХР хромосом. Аналогичная флуоресценция районов ПЦГХ была также обнаружена на препаратах из нативных и культивированных в отсутствии БДУ образцов хориона, не подвергавшихся каким-либо деконденсирующим или денатурирующим предобработкам, как при неразвивающейся, так и нормальной физиологической беременности. Известно, что для АО характерна метахромазия, обусловленная взаимодействием флуорохрома с нуклеиновыми кислотами, белками и другими биополимерами. Так, двуцепочечные нуклеиновые кислоты АО окрашивает в зеленый цвет, а одноцепочечные -в красный (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999; Jlynna, 1980). При рН выше 7.0 краситель способен образовывать комплексы с белками и флуоресцировать в красной области спектра (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999).

Исходя из особенностей взаимодействия флуорохрома с нуклеопротеиновым составом хромосом, целью исследования явилось изучение причин обнаруженной нами избирательной окраски АО ГХР хромосом человека. Конкретные задачи включали:

1) Анализ влияния различных условий приготовления и окрашивания препаратов на характер флуоресценции АО в районах lqh, 9qh и 16qh в клетках ЦТБ, эмбриональных органов и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека.

2) Выяснение распространенности феномена избирательной окраски ПЦГХ с помощью АО на препаратах из различных типов клеток человека и мыши.

3) Изучение особенностей флуоресценции АО в ГХР хромосом 1, 9, 16 в ЦТБ и в эмбриональных клетках после обработок эндонуклеазами и протеолитическими ферментами.

4) Определение транскрипционной активности сатДНКЗ хромосомы 1 (HS3-1 - human satellite 3 of chromosome 1) в эмбриональных и экстраэмбриональных клетках на разных стадиях эмбрионального развития человека.

5) Исследование локализации HS3-1 в ядрах клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека.

Научная новизна. Впервые обнаружен феномен и изучена природа хромосом-специфичной избирательной окраски флуорохромом АО районов ПЦГХ хромосом человека. Установлено, что этот феномен характерен для ГХР хромосом спонтанно делящихся клеток человека и мыши. Впервые проведено комплексное исследование метафазных хромосом человека с помощью РНКазы А, РНКазы Н, ДНКазы I и ДНК-лигазы Т4, результаты которого свидетельствуют в пользу наличия разрывов в ДНК ГХР хромосом 1, 9, 16 в ЦТБ хориона и эмбриональных клетках, а также одноцепочечных нуклеиновых кислот и дуплексов РНК-ДНК в клетках ЦТБ.

Впервые исследована локализация HS3-I в интерфазных ядрах эмбриональных и экстраэмбриональных клеток человека. Показано, что в клетках хориона раннего срока 4-5 недель беременности (н.б.) HS3-1 располагается ближе к центру ядра и граничит с хромоцентрами, тогда как, начиная с 5-6 н.б., в клетках зрелой плаценты, а также в клетках собственно эмбриональных тканей (печень, почка, позвоночник), HS3-1 расположен ближе к периферии ядра и входит в состав хромоцентров.

Впервые обнаружены полиаденилированные транскрипты HS3-1 в эмбриональных органах и в хорионе на сроке 7-9 н.б Показано, что транскрипция HS3-1 в разных тканях происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК, но не с обеих цепей одновременно. На более поздних сроках транскрипты HS3-1 не обнаружены ни в эмбриональных, ни в экстраэмбриональных тканях.

Показано, что в условиях in vitro в течение 24-96 ч клетки ЦТБ хориона проходят не более двух последовательных клеточных делений.

Получены данные, свидетельствующие о недорепликации ГХР, а также подтверждена асинхронная репликация ГХР хромосом 1,9, 16 в ЦТБ хориона.

Теоретическая и практическая значимость результатов. Результаты работы вносят вклад в понимание структуры и функциональной роли ГХ в эмбриогенезе человека. При анализе транскрипции и репликации сатДНК в хорионе и плаценте следует учитывать особенности митотической активности, а также лимит последовательных клеточных делений клеток ЦТБ в условиях in vitro. Установленный факт недорепликации ДНК в ГХР расширяет представления о механизмах пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток ЦТБ хориона в период активного органогенеза. Феномен метахроматической окраски флуорохромом АО указывает на своеобразную организацию ГХР метафазных хромосом в бластных клетках и акцентирует внимание на необходимости детальных исследований ПЦГХ в разных типах клеток.

Полученные данные свидетельствуют, что органная культура образцов хориона в течение 24-96 ч в сочетании с методом дифференциальной окраски RBA, предполагающем использование БДУ, может повысить результативность и разрешающую способность цитогенетической диагностики при анализе причин неразвивающейся беременности.

Результаты могут быть использованы в курсах лекций по организации интерфазного ядра, структуре хромосом, цитогенетике и биологии развития человека для студентов кафедр генетики и селекции, цитологии и гистологии, эмбриологии биолого-почвенного факультета СПбГУ. Избирательная окраска АО ГХР хромосом 1, 9, 16 благодаря воспроизводимости, простоте, скорости и экономичности может быть рекомендована в качестве экспресс-метода для анализа полиморфных ГХР хромосом человека в цитогенетической пренатальной диагностике и в онкогематологии. Положения, выносимые па защиту.

1) В условиях краткосрочной органной культуры клетки ЦТБ хориона при физиологической и неразвивающейся беременности проходят, как правило, не более двух последовательных клеточных цикла. Репликация районов lqh, 9qh, 16qh в ЦТБ хориона происходит асинхронно. Недорепликация ГХР является характерным свойством клеток ЦТБ.

2) Специфическая избирательная окраска флуорохромом АО полиморфных блоков lqh, 9qh, 16qh на необработанных препаратах из хориона свидетельствует о цитохимических и конформационных особенностях организации ГХР хромосом в клетках ЦТБ.

3) В эмбриональных клетках и в клетках плаценты HS3-1 располагается в хромоцентрах и ближе к периферии ядерной оболочки. В клетках хориона на сроке 4-5 н.б. HS3-1 занимает более центральное положение в ядре и граничит с хромоцентрами.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на V съезде ВОГИС (Москва, 2009); конференции с международным участием Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine (г. Санкт-Петербург, 2009); конгрессах Европейского общества генетики человека (Вена, 2009; Гётеборг, 2010; Амстердам, 2011; Нюренберг, 2012); VII конференции Европейского цитогенетического общества (Стокгольм, 2009); Международной конференции общества IFPA «Плацента человека» (Аделаида, 2009); XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010); VI съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); IX научной конференции «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликованы 21 работа, в том числе 5 статей в журналах перечня ВАК, 2 статьи в сборниках, 14 тезисов отечественных и международных конференций. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Данные

проиллюстрированы 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 214 источников, из них 43 опубликованы в отечественной печати.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для исследования послужили образцы ворсинчатого хориона и эмбриональных органов (от 86 и 28 эмбрионов соответственно), полученные после прерывания беременности по медицинским или социальным показаниям в срок 5-12 н.б.; 13 образцов плацент в срок 36-40 н.б.; 2 образца пуповинной крови (20 и 22 н.б.) и 30 образцов периферической крови взрослых индивидов; 5 образцов костного мозга; 2 образца амниоцитов; биоптат яичка от пациента с бесплодием; мезенхимальные и эмбриональные стволовые клетки (3 и 1 образец соответственно); образцы костного мозга и семенников от 1-го взрослого самца мыши. Методы исследования.

Приготовление препаратов метафазных хромосом из хориона (плаценты) и эмбриональных органов прямым и полупрямым методами проводили согласно стандартным протоколам (Баранов, Кузнецова, 2007) и с модификациями на этапах гипотонической обработки, фиксации, получения и нанесения клеточной суспензии из ворсин хориона ши кусочка эмбрионального органа на препарат (Кузнецова и др., 2012).

Приготовление препаратов хромосом из костного мозга и семенников мыши проводили, Kai описано (Dyban, Baranov, 1987). В качестве гипотонического раствора использовали 0.55% КС и 0.9% цитрат натрия.

Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови проводили по стандартной методике (Кузнецова и др., 1999). Препараты хромосом из других тканей. Препараты из пунктата костного мозга от пациентов страдающих лейкозом, любезно предоставлены И.С.Мартынкевич, НИИ гематологии i трансфузиологии; пунктата яичка от пациента с бесплодием - И.Д. Федоровой, НИИАГ им. Д.О Отта; из образцов культивированных клеток амниотической жидкости - Ю.А.Логиновой клиника Ава-Петер; из клеточных линий мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (4 6 и 205 пассажи) - А.В.Воскресенской, НИИАГ им. Д.О. Отта и Г.Р.Акопян, Институ-наследственной патологии НАМН Украины; препараты из культуры эмбриональных стволовыз клеток - Н.Б.Рубцовым и Т.В.Карамышевой, ИЦиГ СО РАН. Препараты были приготовлень согласно стандартным протоколам.

Для анализа кариотипа использовали метод дифференциальной окраски хромосом QFH/AcL (Кузнецова и др., 1999).

Окраска АО. Препараты окрашивали раствором АО (0.1%; 0.01% или 0.001%), приготовленныи на натрий-фосфатном буфере (рН 5.0 или 7.0) или цитратно-фосфатном буферном раствор! Мак-Ильвейна (рН 5.5 или 7.0) (Кузнецова и др., 2012); и на ацетатном буферном растворе р} 4.2 (Сайфитдинова, 2008). Препарат заключали под покровное стекло в соответствующий буферный раствор.

Метод «меченных» митозов. Образцы хориона и эмбриональных органов инкубировали i течение 24, 48, 72, 96 ч с однократным введением БДУ в конечной концентрации 15 мкг/мл npi постановке органной культуры. Препараты готовили согласно стандартному протоколу (Кузнецова и др., 1999) и окрашивали 0.01% АО.

Иммупоцитохимическое определение сегментов хромосом, включивших БДУ, проводили, Kai описано в монографии В.С Баранова и Т.В. Кузнецовой (2007).

Митотический индекс (МИ) рассчитывали согласно формуле: МИ = (количество митозов/10000 ядер)* 100%.

Обработка препаратов хромосом эндонуклеазами и протеолитическими ферментами Обработку препаратов метафазных хромосом РНКазой-А (DNAse free), РНКазой-Н (DNAsc free), ДНКазой I, последовательную обработку РНКазой-А и ДНКазой I, ДНК-лигазой Т4 протеиназой К, 0.01% пепсином и 0.01% трипсином проводили, как описано (Трофимова и др. 2012). В качестве контроля использовали препараты после обработки соответствующим* буферными растворами.

Приготовление препаратов иптерфазных ядер для 3D-FISH анализа проводили, как описано (Вайссертрейгер и др., 2007).

2-D FISH и 3-D FISH проводили согласно стандартным протоколам (Баранов, Кузнецова, 2007; Solovei et.al., 2002) и инструкции фирмы-производителя ДНК-зонда СЕР1 (Abbot Molecular, USA).

Анализ препаратов проводили на универсальных микроскопах ЕС ЛЮМАМ-РП011 (JIOMO) и LEICA DM LS, оснащенных блоками светофильтров для флуорохромов Hoechst 33258, АО, FITC, DAPI и PI. Для получения видеоизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain и Adobe Photoshop 7.0. Анализ локализации HS3-1 в ядрах проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа «LSM 510 МЕТА» (Carl Zeiss, Германия). Получение, обработку, пространственную реконструкцию изображений и измерение расстояния между флуоресцентными сигналами в ядре осуществляли с помощью программного обеспечения "LSM 510" (Heidelberg, Germany).

Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР. Тотальную РНК выделяли из эмбриональных и экстраэмбриональных тканей с использованием Trizóle™ (Sigma Aldrich). Реакцию обратной транскрипции и ПЦР проводили, как описано (Кузнецова и др., 2012). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «In Start Graph Pad Prism» и формул (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности репликации прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9,16 в клетках хориона человека

Анализ репликации хромосом в клетках ЦТБ проводили на образцах хориона при физиологически нормальной беременности (группа ФБ, N=6) и при остановке развития плода (группа НБ, N= 8). «Меченные» митозы регистрировали с помощью окраски АО, при которой участок хромосомы, включивший БДУ, флуоресцирует в красной области спектра, не включивший - в желто-зеленой.

Для 450 метафазных пластинок в группе НБ и 277 в группе ФБ на всех препаратах, независимо от времени инкубирования образца с БДУ, была обнаружена красная флуоресценция ГХР хромосом 1,9, 16 и желто-зеленая вдоль плеч всех хромосом. Аналогичная окраска ГХР, характерная для хромосом после одного раунда репликации в присутствии БДУ, наблюдалась также на всех контрольных препаратах, то есть инкубированных в среде, не содержащей БДУ, или приготовленных ускоренным прямым методом (без инкубации) (рисЛа). В некоторых метафазных пластинках в красном спектре флуоресцировали также прицентромерные ГХР, спутники акроцентрических хромосом и район Yqh (рисЛа). Так как указанные районы четко визуализировались не во всех образцах, а с мужским кариотипом оказалась только их часть, в дальнейшей работе основное внимание мы уделяли окраске ГХР хромосом 1, 9 и 16.

На остальных метафазах наблюдалась дифференциальная окраска сестринских хроматид и сестринские хроматидные обмены (СХО). При этом в 11-ти метафазах из 106 в группе НБ и 10 из 133 в группе ФБ красная флуоресценция ГХР регистрировалась совместно с СХО (рис.1 б).

Таким образом, очевидно, что красная флуоресценция АО не связана с включением БДУ, а обусловлена иными причинами.

С помощью детекции БДУ специфическими антителами (АТ-БДУ) проанализировано 143 и 37 метафазных пластинок (группа ФБ, N=4 и НБ, N=3, соответственно). Независимо от времени инкубирования с БДУ в большинстве метафазных пластинок сигнал АТ-БДУ был равномерно распределен вдоль плеч хромосом, но отсутствовал в ГХР одного или обоих гомологов хромосом 1, 9 и 16 (рис. 2). Это можно объяснить как асинхронным вступлением клеток ЦТБ в деление, так и асинхронной репликацией ГХР, показанной ранее с помощью импульсного введения БДУ (Баранов, Кузнецова, 2007). Отсутствие сигнала, возможно, обусловлено недоступностью хроматина в ГХР для АТ-БДУ (Moran et.al., 1985; Buck et.al., 2008). Однако более вероятной представляется недорепликация ГХР в клетках ЦТБ хориона,

которая может индуцировать вступление клетки либо в апоптоз, либо в следующий цикл без завершения предыдущего. Эндоредупликация рассматривается как механизм полиплоидизации трофобласта (2уЫпа е!.а1., 2004), а метафазные пластинки с диплохромосомами регулярно отмечаются на препаратах из хориона (Баранов, Кузнецова, 2007). Апоптоз и дифференцировка, как и деление клеток ЦТБ происходят на протяжении всей беременности (НирреЛг, Негт1ег, 2005), однако выраженность этих процессов может быть различной в зависимости от разных факторов (срока развития, патологии беременности, особенностей кариотипа и др.).

Unit и п

1-3 «

is ик ftj ц и *

6-12

II 41 XI ** ал

13-15 16-18

** *К АА АА ||

. г ■ > _

АА АА

21-22

Рис. 1. Кариограмма (а) и метафазная пластинка (б) из ЦТБ хориона. Окраска 0.01% АО. На кариограмме (а) представлены хромосомы из метафазной пластинки на препарате, приготовленном из хориона ускоренным прямым методом. Дифференциальная окраска ГХР (показано стрелками) и сестринских хроматид после двух раундов репликации в присутствии БДУ (б).

1 9 1 • Ц 9 1 •#»у г 9 Л5® ДА« « ,6 v^s^X- и 9 DAPI+ СуЗ

1 16 DAPI 9 is 9 СуЗ

Рис. 2. Метафазная пластинка из ЦТБ хориона, иммунофлуоресцентная детекция AT к БДУ после его включения в течение всей S-фазы. Отсутствие сигнала антител к БДУ во всех ГХР хромосом 1, 9 и 16.

Анализ митотической активности клеток ЦТБ в группах ФБ и НБ проводили с помощью оценки МИ и регистрации метафаз, прошедших два последовательных раунда репликации в присутствии БДУ. Результаты суммированы в таблице и на рис.3.

Полученные данные свидетельствуют о внутри- и межиндивидуальной вариабельности митотической активности клеток ЦТБ, которая, вероятно, обусловлена различной интенсивностью роста и рамификации ворсин (Koulecher et al., 1985). Возможно, поэтому, а также в силу малочисленности и гетерогенности выборок, значимого влияния особенностей кариотипа, срока развития, условий и продолжительности инкубирования образца на МИ выявить не удалось. Только для двух образцов в группе ФБ отмечено влияние БДУ на деление клеток (табл.), а для группы НБ - тенденция к снижению митотического индекса клеток ЦТБ в нативных ворсинах (табл.) и доли клеток, прошедших 2 клеточных цикла (рис.3), что, возможно, указывает на их сниженный пролиферативный потенциал. Однако способность к пролиферации таких клеток повышается в условиях in vitro (табл., рис. 3). При

увеличении времени инкубировании образцов с БДУ до 96 ч (ФБ, N=2; НБ, N=1; 272 и 91 метафазные пластинки соответственно, данные не показаны), нами не было зарегистрировано метафаз с хромосомами, прошедшими три последовательных раунда репликации. Полученные результаты согласуются с немногочисленными данными литературы (Zahed et.al., 1988; Kennerknehct et.al., 1992) и, вероятно, свидетельствуют о «лимите деления», т.е. ограниченном числе циклов, которое проходит клетка ЦТБ в органной культуре.

Следует отметить, что в первичных культурах клетки трофобласта также быстро утрачивают способность к делению, вступают в апоптоз или дифференцируются (Genbacev, Miller, 2000). Возможно, что в органной культуре, как и in vivo, часть клеток ЦТБ после выхода из цикла вступают в состояние пролиферативного покоя, особенно характерное для стволовых клеток, в том числе и клеток ЦТБ, которые на протяжении всей беременности обладают способностью к самоподцержанию и дифференцировке в функционально специализированные клетки (Genbacev, Miller, 2000; Bischof, Irminger-Finger, 2005).

Таблица. Митотический индекс (в %) на препаратах из образцов хориона при физиологической и неразвивающейся беременности._

Зразца, ютип Срок (Ц.6.) Без инкубирования Инкубация без БДУ, ч Инкубация с БДУ, ч Коэф. регрессии Коэф. Стью-дента

24 1 48 1 72 24 1 48 1 72

Образцы ЦТБ группы НБ

,ХУ 4/5 0,06 0,59 0,37 0,41 0,49 0,06 0,18 0,00198 3,486

,ХХУУ 5/6 0,29 0,17 0,44 0,48 0,27 0,42 0,21 0,01725 0,5811

,хх 7 0,25 0,49 0,16 0,05 0,50 0,41 0,50 0,5223 1,861

,ХУ,+15 7/8 0,28 0,79 1,04 0,51 0,62 0,77 0,79 0,8455 0,3153

,ХХ,+9 7/8 0,20 0,21 0,29 0,19 0,27 0,39 0,23 0,1056 3,780

,ХХ 8/9 0,19 0,66 0,59 0,25 0,61 0,79 0,23 0,01750 0,5498

,ХХХ 8/9 0,30 0,77 0,41 0,19 0,49 0,23 0,26 0,1761 1,249

.ХХ.+9 8/9 0,02 0,06 0,18 0,12 0,11 0,08 0,22 0,7708 0,2774

нее ± ¡ка »его 0,19±0,04 0,47±0,10 0,44 ±0,10 0,28±0,06 0,42± 0,06 0,ЗЙЛ,10 0,32±0,08

Образцы ЦТБ группы ФБ

,ХУ 5/6 0,35 0,41 0,35 0,43 0,22 0,25 0,38 0,4045 2,767

,хх 6 0,50 0,6 0,57 0,53 0,62 0,56 0.39 0,2634 0,8825

дх 6/7 0,35 0,5 0,43 0,51 0,4 0,4 0,42 0,8243 3,355

,ХУ 7 0,38 0,45 0,59 0,52 0,41 0,5 0,4 0,1327 3,571

,хх 9 0,18 0,32 0,37 0,23 0,29 0,33 0,17 0,0003 4,914"

,ХУ 9/10 0,21 0,37 0,26 0,27 0,23 0,13 0,19 0,2286 6,286'

нее± >ка iего 0,33±0,05 0,44±0,04 0,43±0,05 0,42±0,05 0,36±0,06 046±0,07 0,33±0,05

Примечание: 'отмечены статистически значимые различия (Р< 0,05)

Тканеспецифичные особенности окраски флуорохромом акридиновым оранжевым районов прицентромерного гетерохроматина метафазных хромосом.

После окраски АО необработанных препаратов из ЦТБ (рис. 1а) и эмбриональных органов (рис.4а) мы регулярно регистрировали красную флуоресценцию ГХР метафазных хромосом 1, 9, 16, во многих пластинках - ГХР хромосом 13, 14, 15, 21, 22 и У. На препаратах из ФГА-стимулированных лимфоцитов, как и ожидалось, была зарегистрирована равномерная желто-зеленая флуоресценция вдоль плеч всех хромосом (рис.5а).

0.7-1

O.fr

S 0.+

г 0.3-

1 0.2'

0.1

■ Группа НБ

■ Группа ФБ

20 30 40 Ю 60 70 •ммя инкуб и dob амия, час

Рис. 3. Доля клеток 2-й генерации в ЦТБ хориона в группах НБ и ФБ.

Хорошо известно, что С- или R-рисунки дифференциальной окраски с помощью АО можно получить только после солевой, щелочной и/или термической предобработки препаратов, а в их отсутствии АО окрашивает хромосомы относительно равномерно в желто-зеленый цвет (de la Chapelle et.al., 1971, 1973; Bobrow, Madan, 1973; Wyandt et.al., 1974; Benyush, Tupitsyna, 1975; Verma, Babu, 1975; Lin et.al., 1980; Захаров и др., 1982). Специфичность окрашивания зависит также от партии и концентрации красителя, состава и рН буферного раствора (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999), способа нанесения фиксированных клеток на препарат и срока его хранения (de la Chapelle et.al., 1971, 1973; Wyandt et.al., 1974). Мы провели анализ окраски хромосом на препаратах из хориона, эмбриональных органов и лимфоцитов, свежеприготовленных и хранившихся до одного месяца, используя при этом разные концентрации, буферные растворы и партии АО, а также модифицируя методики приготовления препаратов. Было проанализировано 307 метафаз из ЦТБ, 116- эмбриональных органов и 358 -лимфоцитов периферической крови. Результаты экспериментов показали, что особенности окраски ГХР не зависят от условий приготовления (условий in vitro, состава гипотонического раствора, мацерации образца в 60% уксусной кислоте, способа нанесения фиксированного материала на стекло), окрашивания (концентрации и партии красителя, рН и состава буферного раствора) и срока хранения препаратов. При всех условиях на препаратах из ЦТБ и эмбриональных органов наблюдалась красная флуоресценция ГХР хромосом 1, 9, 16 и желто-зеленая вдоль плеч хромосом (рис.4а-в), а хромосомы всего набора на препаратах из ФГА-стимулированных лимфоцитов равномерно окрашивались в желто-зеленый цвет (рис.4г).

JL..:

•V Ï » *

Рис.4. Метафазные пластинки из клеток роговицы эмбрионального глаза (а), ЦТБ хориона (б-в), ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови (г). Прямые методы с мацерацией в 60% уксусной кислоте (а-б), клеточная суспензия, без мацерации в 60% уксусной кислоте (в). Гипотоническая обработка -цитрат натрия (а, в, г), хлористый калий (б). Окраска 0.01% АО натрий-фосфатный буфер, рН 7.0.

Как и на препаратах из лимфоцитов периферической крови (рис.5а) избирательного окрашивания ГХР хромосом не наблюдалась на необработанных препаратах метафазных хромосом из лимфоцитов пуповинной крови (рис.56), амниоцитов (рис.5в) и мезенхимальных стволовых клеток (рис.5г). При этом красная флуоресценция блоков ПЦГХ была хорошо воспроизводима на хромосомах из ЦТБ плаценты (рис.6а), эмбриональных стволовых клеток (рис.66), клеток костного мозга (рис.бв) и семенника человека (рис.бг), а также клеток костного мозга (рис.бд) и семенника мыши (рис.бе).

I ЪХ ' '1I «"V_ ■ 4 » ■

Рис. 5. Метафазные пластинки, из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической (а) и пуповинной (6) крови; культур мезенхимальных стволовых клеток (в); амниоцитов (г). Окраска 0.01% АО.

Избирательная окраска АО прицентромерных ГХР хромосом мыши на необработанных препаратах из тимуса, селезенки и семенников мыши, приготовленных прямым методом, упоминалась ранее лишь в одном исследовании (Stocken, Lisanti, 1972). Феномен избирательной окраски ПЦГХ хромосом человека на препаратах, приготовленных прямым методом и не подвергнутых каким-либо специальным предобработкам при приготовлении и перед окрашиванием АО, обнаружен нами впервые. Очевидно, что причиной феномена является структурно-функциональная организация ГХР хромосом в спонтанно делящихся митотических и мейотических клетках.

Рис. 6. Митотические (а-в, д) и мейотические (г, е) хромосомы человека (а-г) и мыщи (д,е): из ЦТБ плаценты (а); эмбриональных стволовых клеток (б); костного мозга (в) и сперматоцита человека (г); костного мозга (д) и сперматоцита мыши (е). Окраска 0.01% АО.

Цитохимические особенности районов прицентромерного гетерохроматина метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона и эмбриональных органов, выявляемые с помощью флуорохрома акридинового оранжевого.

Для проверки предположения о наличии однонитевых РНК и ДНК, одноцепочечных разрывов, а также особенностей белкового состава ГХР хромосом 1, 9 я 16, был проведен анализ окрашивания АО метафазных хромосом после предобработок препаратов in situ с помощью эндонуклеаз и протеаз. Всего было проанализировано 464 метафазные пластинки из ЦТБ хориона и 163 - из эмбриональных органов.

После обработки трипсином, пепсином и протеиназой К изменений в окраске ГХР хромосом из ЦТБ (рис.71б-г) и эмбриональных органов (рис.7Пб-г) не обнаружено. После обработки препаратов ДНК-лигазой Т4 наблюдалось снижение интенсивности красной флуоресценции ГХР хромосом из ЦТБ и эмбриональных клеток (рис.бз). Обработки РНКазой А, РНКазой Н и последовательная обработка РНКазой А и ДНКазой I приводили к аналогичным

* 4 •С Ч * 1

м д 1 —>•«. е

изменениям окраски, особенно заметными в районе lqh, только на хромосомах из ЦТБ (рис.7д-ж, 71и).

Известно, что РНКаза А гидролизует одноцепочечные РНК, в то время как РНК-аза Н удаляет РНК только из дуплексов ДНК-РНК (Rychlik et.al.,2010). Кроме этого, в красной области спектра флуоресцируют участки хроматина с фрагментированной ДНК (Evenson et.al., 1984). Опираясь на полученные результаты, можно предположить, что в районе lqh в клетках ЦТБ имеются одноцепочечные РНК и РНК-ДНК дуплексы, что косвенно подтверждается результатами окрашивания препаратов после предобработок ДНК-лигазой Т4, "восстанавливающей" разрывы фосфодиэфирных связей в двуцепочечной ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах (Knopf, 1977). Результаты окрашивания препаратов после обработки ДНК-лигазой свидетельствуют, что одноцепочечные разрывы, по-видимому, вносят больший вклад в особенности флуоресценции ГХР на метафазных хромосомах из клеток эмбриональных органов по сравнению с таковыми из клеток ЦТБ хориона.

i IЛ

• * ч у i • 4 *

i(«,hj 2 ;

а о к I л

а О и I л с ж j

Рис.7. Окраска 0.01% АО хромосом 1, 9, 16 из ЦТБ хориона (I) и эмбриональных органов (II). Контрольный препарат (а); после предобработки трипсином (б); пепсином (в); протеиназой К (г); РНКазой А (д); РНКазой Н (е); ДНКазой I (ж); ДНК - лигазой Т4 (з); совместной предобработки РНКазой А и ДНКазой 1 на препарате из ЦТБ (и).

Наличие РНК в центромерных и прицентромерных районах хромосом человека показано и другими исследователями (Pierpont, Yunis, 1977; Probst, Almouzni, 2008; Mahieu-Williame et.al., 2010). Происхождение РНК может быть различно: одиночные рибонуклеотиды в двуцепочечной ДНК как следствие «ошибок включения» во время репликации; остатки фрагментов Оказаки, не полностью удаленных из вновь синтезированной цепи; а также РНК-транскрипты, ассоциированные с ДНК (Rychlik et.al., 2010).

В наших экспериментах предобработка ДНКазой I, гидролизующей одно- и двуцепочечные ДНК, не влияла на спектр флуоресценции, тогда как последовательная обработка РНКазой А и ДНКазой I приводила к заметному снижению красной флуоресценции в районах 9qh и 16qh и ее отсутствию в районе lqh во всех метафазных пластинках из ЦТБ. Однако, косвенные данные о наличии однонитевой ДНК в ГХР хромосом 1, 9 и 16 в хорионе, но не эмбриональных органах, были получены ранее с помощью ник-трансляции in situ, опосредованной ДНКазой I (Баранов, Кузнецова, 2007).

Следует допустить, что специфическое окрашивание районов ПЦГХ может быть обусловлено и другими причинами. Так, красная флуоресценция характерна для комплекса АО с кислотными группами белков (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999). Показано, что ассоциированные с ГХР метафазных хромосом 1, 9, 16 белковые комплексы факторов HSF-1, участвующие в транскрипции сатДНК, устойчивы к обработкам протеиназой К и пепсином и чувствительны к нуклеазам (Jolly et.al., 2002). Возможно, такие белковые комплексы вместе с РНК вносят вклад в красную флуоресценцию районов ПЦГХ в исследованных нами клетках.

Обнаруженная нами красная флуоресценция АО в районах ПЦГХ, вероятно, обусловлена не только химическим составом (одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, гистоновыми и

негистоновыми белками), но и аномальной упаковкой и деконденсацией хроматина (Бенюш, Тупицына, 1975; Захаров и др., 1982; Evenson et.al., 1984; Zelenin, 1999). В свою очередь' степень компактизации ГХР может быть связана с уровнем метилирования ДНК (Назаренко! Карагеоргий, 1995). Однако флуоресцирующие в красном спектре блоки гетерохроматина в хорионе, в сперматогониях и сперматоцитах I порядка деконденсированы и гипометилированы (Perez et.al., 1991; Назаренко, Карагеоргий, 1995; Kokalj-Vokac et.al., 1998; Пендина и др., 2001; Баранов, Кузнецова, 2007), но они окрашиваются точно так же в плаценте и эмбриональных тканях, где - конденсированы и метилированы (Назаренко, Карагеоргий, 1995; Баранов, Кузнецова, 2007). Напротив, гипометилированные и деконденсированные ГХР в амниоцитах (Fernandez et.al., 1996) не дифференцируются при окраске АО, так же как и в лимфоцитах, где они конденсированы и гиперметилированы (Баранов, Кузнецова, 2007). Следовательно, компактизация и степень метилирования ДНК ПЦГХ не могут быть причинами обнаруженной флуоресценции при окраске АО.

Очевидно, что для выяснения природы феномена красной флуоресценции АО в ГХР хромосом в спонтанно делящихся клетках требуются дальнейшие исследования. Вместе с тем, полученные нами данные указывают на необычную организацию района lqh в ЦТБ хориона. Следует отметить, что особая структура, демонстрирующая одновременно свойства гетеро- и эухроматина (отсутствие типичных для гетерохроматина эпигенетических маркеров и различная степень компактизации хроматиновых фибрилл) показана только для района 9qh в клетках с транскрипционной активностью сатДНКЗ хромосомы 9 (Jolly et al., 2004; Rizzi et al., 2004).

Локализация и транскрипционная активность HS3-1 в эмбриональных и экстраэмбриональпых тканях.

Интересным представлялось проверить, связано ли выявленное нами значительное снижение интенсивности флуоресценции АО в районе lqh на препаратах метафазных хромосом хориона после обработок РНКазами, с транскрипционной активностью сатДНК 2 и 3, входящих в его состав. Транскрипция сатДНК 3 хромосомы 1 (HS3-1) была показана ранее (Вайсертрейгер и др., 2007). Нами был проведен анализ транскрипции HS3-1 в 6 образцах хориона и 13 эмбриональных органов от 6 абортусов сроком 7-13 н.б. Транскрипты HS3-1 были обнаружены в хорионе абортусов только в срок 7 н.б. У 7-нед. эмбриона транскрипты выявлены в продолговатом мозге, но не в почках. При этом транскрипты в почках зарегистрированы в срок 9 н.б. У 9-нед. эмбрионов транскрипты также были выявлены в легком, продолговатом мозге, надпочечнике, сердце и кишечнике. В образцах тканей после 11 н.б. транскрипты выявлены не были (продолговатый мозг, надпочечник, печень) (рис. 8).

Обнаружено несколько вариантов транскриптов HS3-1, наиболее частые из них - длиной около 250 и 600 пар нуклеотидов. Короткие транскрипты 100 п.н. обнаружены в сердце. Все выявленные транскрипты были полиаденилированы. Во всех тканях, кроме почек и сердца транскрипция происходила со «смысловой» нити. В почках и сердце транскрипты считывались с антисмысловой цепи ДНК.

Обнаруженная нами транскрипция HS3-1, вероятнее всего стадиоспецифична и связана с пролиферативной активностью клеток, так как транскрипты прицентромерных сателлитов обычно обнаруживаются в интенсивно делящихся клетках (Lu, Gilbert, 2007). Возможно, она также связана с процессами клеточной дифференцировки. Причины транскрипции с разных цепей ДНК не совсем ясны. Однако показано, что инактивация цепь-специфичной транскрипции ПЦГХ на стадии двух клеток приводит к гибели эмбриона мыши (Probst, Almouzni, 2011).

зм г»

<r Hs3-1

Рис.8. Электрофореграмма продуктов ОТ-ГЩР Н53-1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях. Стрелками отмечены зоны расположения кДНК транскриптов. САРИН использован в качестве контроля амплификации.

7 недель

9 недель

10-12 недель

По-видимому, выявленные нами транскрипты HS3-1 не принимают прямого участия в процессе интерференции РНК, так как для этого необходима транскрипция в обоих направлениях одновременно (Ugarkovic, 2005). Вероятно, в эмбриональных клетках процесс гетерохроматинизации осуществляется в основном за счет эпигенетических модификаций, а транскрипты ПЦГХ влияют на связывание с хроматином ферментов, осуществляющих метилирование ДНК и модификации гистонов, косвенно участвуя, таким образом, в поддержании структуры ГХ. В хорионе, для которого характерны деметилирование и деконденсация ГХР хромосом, по-видимому, активируются иные механизмы формирования и поддержания структуры ГХ.

Учитывая транскрипционную активность HS3-1, представлялось интересным исследовать пространственную организацию районов lqh в интерфазном ядре. При локализации HS3-1 мы оценивали положение FISH-сигнала (ДНК-зонд к району lql2) по отношению к границе ядра и относительно хромоцентра на оптических срезах (рис.9а, б). Согласно полученным результатам, в срок 8-10 н.б. в ядрах эмбриональных клеток сателлит HS3-1, как правило, занимает периферическое положение (рис. 10а) и расположен в хромоцентрах (рис.9а и 106). Однако, 36,9% FISH-сигналов, соответствующих HS3-1, в ядрах клеток почки оказались не в хромоцентрах (рис. 106), что, по-видимому, связано с его деконденсацией в этих клетках.

Рис.9. FISH с зондом СЕР 1 (HS3-1, красный) на интерфазных ядрах клеток эмбриональной печени (а) и ЦТБ хориона 4-5 н.б. (б). Стрелкой показан декомпактизованный сигнал. Масштабные линейки - 10 мкм.

В хорионе наблюдалось стадио-специфичное расположение сателлита в ядре. Следует отметить, что в ядрах клеток хориона абортусов 4-5 н.б. один из FISH-сигналов визуально занимал больший объем ядра по сравнению с другими образцами, поэтому был морфологически охарактеризован как декомпактизованый. Кроме того, FISH-сигналы были локализованы преимущественно во внутренней части ядра и на границе, но не внутри хромоцентров (рис.96). Аналогичные характеристики этого сателлита были отмечены при малигнизации клеток, их старении и дифференцировке (Enukashvily et.al., 2007), а также в ядрах лимфоцитов больных

синдромом ICF (Dupont et.al., 2011), ГХР хромосом 1, 9, 16 которых имеют схожие характеристики (деконденсация, гипометилирование) с таковыми в клетках хориона. В ядрах клеток хориона абортусов 5-6 и 10-11 н.б. FISH-еигналы занимали преимущественно периферическое положение и входили в состав хромоцентров (рис.Юв, г). В плаценте HS3-1 также был выявлен в составе хромоцентров на периферии ядра, что согласуется с данными других авторов (Weierich et.al., 2003; Enukashvily et.al., 2007).

в DiiyipeHHH» облзаь ндро

средняя част ь ядра ■ периферия ядра

позвоночник

■ периферия ядра

средняя час1ь ядра II внутренняя область ядра

4-5 н.б. 5-6 н.б. 10-11 н.6. 36 н.б.

■ печень, N= 92 позвоночник, N- 102

■ почка, N= 84

в хромоцентрах

98.1

60.7

■

■ хромоцентрах

■ ядра хориона, А -5 нед H=10 $ «дра хориона. 5 6 нед N=84 ■ядра хориона. 10-11 нед N° 12 ядра плаценты, 36 нед М=102

Рис. 10. Локализация ШЗ-/ в ядрах клеток эмбриональных органов (а, б), хориона и плаценты (в, г) по отношению к оболочке ядра (а, в) и хромоцентрам (б, г). N - число сигналов.

Известно, что локализация хромосомного сегмента в ядре, время репликации и транскрипционная активность генов, входящих в его состав, а также эпигенетический статус хроматина находятся в тесной взаимосвязи (ВЪат ег а1., 1989; \Voodfine еЫ., 2003; МепЦег еШ., 2009). Однако остается неясным, является ли размещение транскрибирующегося #&?-/ в центре ядра следствием или причиной его «необычного» структурно-функционального статуса в клетках ЦТБ 4-5 н.б. (ранняя репликация, гипометилирование и деконденсация), а также, почему при сохранении транскрипционной активности и статуса сателлита, происходит его перемещение к периферии ядра уже в срок 5-6 н.б. Очевидно, что тканеспецифичные особенности локализации сателлита в ядре требуют дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1) Клетки цитотрофобласта хориона при физиологической и неразвивающейся беременности проходят не более двух последовательных клеточных цикла.

2) Репликация полиморфных блоков íqh, 9ф, 16яЬ в цитотрофобласте хориона происходит асинхронно.

3) Избирательная окраска флуорохромом АО полиморфных гетерохроматиновых блоков \qh,

специфична для клеток из тканей с естественной митотической активностью (хориона, плаценты, эмбриональных органов, костного мозга).

4) В районах прицентромерного гетерохроматина хромосомы 1 в клетках цитотрофобласта хориона присутствуют одноцепочечные нуклеиновые кислоты, а также дуплексы РНК-ДНК.

5) В гетерохроматиновых районах lqh, 9qh, 16qh хромосом из эмбриональных клеток и клеток цитотрофобласта хориона имеются одноцепочечные разрывы ДНК.

6) В интерфазных ядрах клеток хориона 4-5 недель беременности HS3-1 локализован ближе к центральной части ядра и не входит в состав хромоцентров. В ядрах клеток хориона 5-6 и 10-11 недель беременности, а также плаценты и эмбриональных органов HS3-1 локализован ближе к периферической области ядра и входит в состав хромоцентров.

7) В клетках хориона обнаружены полиаденилированные транскрипты HS3-1 до 7, а в клетках эмбриональных органов - до 9 недели беременности. Транскрипция HS3-1 происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Трофимова И.Л., Ляпунова М.С., Жолнерович Е.В., Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Особенности окраски гетерохроматиновых районов хромосом хориона человека акридиновым оранжевым // Цитология,- 2010. - Т. 52.- № 8,- с.685-686.

2. Кузнецова Т.В., Трофимова ИЛ., Ляпунова М.С., Евдокименко Е.В., Баранов B.C. Феномен избирательной окраски полиморфных гетерохроматиновых блоков хромосом в спонтанно делящихся клетках с помощью флуорохрома акридинового оранжевого // Генетика. - 2012. - Т. 48.- № 4. - с. 451-456. (Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Evdokimenko E.V., Baranov V.S. Phenomenon of selective staining of pericentomeric heterochromatin regions in chromosomes from spontaneously dividing cells by acridine orange flurochrome // Genetika. - 2012. - Vol. 48,- № 4. - p. 369-375).

3. Трофимова И.Л., Ляпунова M.C., Евдокименко E.B., Кузнецова T.B. Влияние различных предобработок на окраску прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 флуорохромом акридиновым оранжевым // Мед.генетика.- 2012.-T.il,- № 4 (118).- с. 50-54.

4. Трофимова ИЛ., Евдокименко Е.В., Кузнецова Т.В. Особенности митотической активности клеток цитотрофобласта хориона у эмбрионов первого триместра беременности // Журнал акушерства и женских болезней,- 2012.- Т. LX I.- выпуск 3.- с. 115122.

5. Кузнецова Т.В., Енукашвили H.H., Трофимова И.Л., Горбунова А., Вашукова Е.С., Баранов B.C. Локализация и транскрипция прицентромерного гетерохроматина хромосомы 1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях человека // Мед.генетика,- 2012.-T.il,-№ 4 (118).- с.19-24.

В сборниках работ:

1. Трофимова ИЛ., Жолнерович Е.В., Мыльников C.B., Кузнецова Т.В. Сравнительный анализ пролиферативного статуса цитотрофобласта ворсинчатого хориона при физиологической и неразвивающейся беременности // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып. 13 .- Новосибирск: Альфа Виста. - 2009.- с. 259-264.

2. Трофимова ИЛ., Соловьев К.В., Федорова Е. М., Васильев В.Б., Паткин Е.Л., Кузнецова Т.В. Особенности пространственного расположения районов конститутивного гетерохроматина в интерфазном ядре эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека // Генетика человека и патология / Под редакцией В.П. Пузырева. Вып. 9.- Томск: Печатная мануфактура. - 2011,- с.88- 91.

Тезисы конференций:

1. Trofimova I.L., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. Constitutive heterochromatin traits as revealed by Acridine Orange in human embryos // Chromosome Res.-2009. - V17.- Suppl- p.235-236.

2. Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Martynkevich I.S., Baranov V.S. Human Constitutive Heterochromatin: a New Intrigue // Chromosome Res.-2009.- VI7,- Suppl - p.236-237.

3. Trofimova I.L., Mylnikov S.V.Kuznetzova T.V. Cell cycle studies of human cytotrophoblast cells in missed abortion // Europ. J. Hum. Genetics- 2009,- V17.-Suppl.2. -p.153-154.

4. Трофимова ПЛ., Мыльников C.B., Кузнецова Т.В. Сравнительный анализ клеточного цикла цитотрофобласта хориона при неразвивающейся и прогрессирующей беременности // V съезд ВОГиС,- 2009.-Ч.2.-С.267.

5. Trofimova I.L., Kuznetzova T.V. Features of constitutive heterochromatin regions extraembryonic and embryonic tissue in human embryos // Placenta -2009.-V.30.-Issue 9.-A.22.

6. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Functional status of constitutive heterochromatin in embryonic and extraembrionic human's tissues // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009,- p.29-30.

7. Lyapunova M.S., Trofimova I.L., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Functional characteristics of heterochromatic regions of human chromosomes in the embryogenesis // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009.- p. 18-19.

8. Zolnerovich E.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Kuznetzova T.V. Proliferative activity of human chorionic villi cytotrophoblast // Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine -2009,- p.34.

9. Трофимова II.JI., Ляпунова M.C., Жолнерович Е.В., Кузнецова Т.В. Особенности конститутивного гетерохроматина в цитотрофобласте хориона и эмбриональных тканях человека //Медицинская генетика: Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону,- 2010.-е. 181.

10. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. Some cytochemical peculiarities of constitutive heterochromatin in cytotrophoblast chromosomes from human chorionic villi//Europ. J. Hum. Genetics - 2010.- V18.-Suppl.l. -p. 111.

11. Lyapunova M.S., Trofimova I.L., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Cytochemical characteristics of constitutive heterochromatin regions from cytotrophoblast from human chorionic villi // Europ. J. Hum. Genetics - 2010.- V18.-Suppl. 1. - p. 112.

12. Kuznetzova T.V., Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Baranov V.S. A simple and rapid method for heterochromatin regions selective staining on direct chromosomal preparations from tissues with spontaneous mitotic activity // Europ. J. Hum. Genetics - 2010 -V18.- Suppl.l. -p.127.

13. Trofimova I.L., Lyapunova M.S., Zolnerovich E.V., Kuznetzova T.V. Peculiarities of replication of lqh, 9qh, 16qh and Yqh regions of human chromosome from chorionic villi and embryonic tissues // Europ. J. Hum. Genetics - 2011,- V19.- Suppl.2. -p.156.

14. Trofimova I.L., Solovyov K.V., Fedorova E.M., Vasilyev V.B., Kuznetzova T.V. 3D position of constitutive heterochromatin regions within the nucleus of chorionic villi and embryonic tissues // Europ. J. Hum. Genetics - 2012,- V.20. - Suppl.l -p.110.

Список сокращений

АО — акридиновый оранжевый

АТ-БДУ - антитела к БДУ

БДУ — бромдезоксиуридин

ГХ - гетерохроматин

ГХР - гетерохроматиновые районы

МИ - митотический индекс

НБ - неразвивающаяся беременность

н.б. — недель беременности

ПЦГХ- прицентромерный гетерохроматин

СатДНК - сателлитная ДНК

СХО - сестринские хроматидные обмены

ФБ — физиологическая беременность

ЦТБ - цитотрофобласт

1183-1 - сателлит 3 хромосомы 1

Подписано в печать 26.10.2012г. Формат 60x84/16 П.л. 1 Уч.-изд.л 1. Тир.100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13418 от 26.10.2012г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трофимова, Ирина Леонидовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Конститутивный (прицентромерный) гетерохроматин.

1.2. Структурно - функциональная роль прицентромерного гетерохроматина.

1.2.1. Структурные функции прицентромерного гетерохроматина.

1.2.2. Степень конденсации прицентромерного гетерохроматина в ядре.

1.2.3. Функциональная роль прицентромерного гетерохроматина.

1.2.3.1. Гены в составе прицентромерного гетерохроматина.

1.2.3.2.Эпигенетические модификации прицентромерного гетерохроматина: метилирование ДНК и модификации гистонов.

1.2.3.3. Взаимодействие негистонового белка НР1 с прицентромерным гетерохроматином.

1.2.3.4. Особенности репликации прицентромерного гетерохроматина в. клеточном цикле.

1.2.3.5. Транскрипционная активность ДНК прицентромерного гетерохроматина.

1.3. Вклад прицентромерного гетерохроматина в топологию интерфазного ядра.

1.4. Гипотеза Главной Программы Развития.

1.5. Особенности прицентромерного гетерохроматина в эмбриональных и экстраэмбриональных клетках человека.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1 Материал исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методика приготовления препаратов метафазных хромосом из клеток хориона (плаценты) и эмбриональных органов человека.

2.2.2. Методика приготовления препаратов метафазных хромосом из хориона (плаценты) и эмбриональных тканей без мацерации в уксусной кислоте.

2.2.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом из ворсин хориона и эмбриональных органов человека «полупрямым» методом.

2.2.4. Методика приготовления препаратов митотических хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови человека.

2.2.5. Методика приготовления препаратов интерфазных ядер для 3 D FISH анализа.

2.2.6. Методика приготовления препаратов хромосом из костного мозга и семенников мыши.

2.2.7. Препараты хромосом из других тканей.

2.2.8. Хранение препаратов.

2.3. Методы дифференциальной окраски препаратов метафазных хромосом.

2.3.1. QFH окрашивание препаратов метафазных хромосом.

2.3.2. Окрашивание препаратов метафазных хромосом акридиновым оранжевым.

2.3.3.Окрашивание препаратов метафазных хромосом акридиновым оранжевым, приготовленным на буфере с кислым pH.

2.4. Обработки препаратов эндонуклеазами in situ.

2.4.1. Обработки препаратов метафазных хромосом РНКазой-А и РНКазой-Н.

2.4.2. Обработки препаратов метафазных хромосом ДНКазой 1.

2.4.3. Обработки препаратов метафазных хромосом лигазой Т4.

2.4.4. Последовательные обработки препаратов метафазных хромосом РНКазой- А и ДНКазой 1.

2.5. Обработки препаратов протеолитическими ферментами.

2.5.1. Обработки препаратов метафазных хромосом протеиназой К.

2.5.2. Обработки препаратов метафазных хромосом пепсином.

2.5.3. Обработки препаратов метафазных хромосом трипсином.

2.5.4. Контрольные эксперименты.

2.6. Методы изучения спонтанной митотической активности клеток и репликации ДНК.

2.2.6.1. Метод «меченных» митозов.

2.2.6.2. Иммуноцитохимическое определение сегментов хромосом, включивших БДУ.

2.7. Определение митотического индекса.

2.8. 2-D FISH анализ.

2.9. 3-D FISH анализ.

2.9. Анализ препаратов.

2.9.1. Люминисцентная микроскопия.

2.9.2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

2.10. Измерение расстояний 3D изображений.

2.10.1. Измерение расстояний между HS3-1 и ядерной периферией.

2.10.2. Ассоциация HS3-1 с хромоцентром.

2.10. 3. Коррекция расстояний.

2.11. Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР.

2.12. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Анализ репликации гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 в нескольких клеточных циклах при физиологической беременности и при остановке развития плода.

3.2. Особенности митотической активности клеток цитотрофобласта хориона при физиологической беременности и при остановке развития плода.

3.3. Характер окрашивания акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 при различных условиях приготовления и флуорохромирования препаратов.

3.4. Анализ окраски прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 флуорохромом акридиновым оранжевым после различных цитохимических предобработок.

3.6. Локализация НБЗ-1 в интерфазных ядрах клеток эмбриона, хориона и плаценты.

3.7. Анализ транскрипционной активности Я55-7.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Особенности митотической активности клеток хориона и репликации прицентромерного гетерохроматина хромосом 1,9, 16 в клетках хориона.

4.2. Тканеспецифичные особенности окраски флуорохромом акридиновым оранжевым районов прицентромерного гетерохроматина хромосом.

4.3. Цитохимические особенности районов прицентромерного гетерохроматина метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона и эмбриональных органов, выявляемые с помощью флуорохрома акридинового оранжевого.

4.4. Локализация и транскрипционная активность НБЗ-1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека"

В настоящее время традиционные представления о молекулярной организации и функциональной инертности ПЦГХ подверглись существенному пересмотру. В составе ПЦГХ млекопитающих и человека, кроме различных по протяженности и нуклеотидному составу сатДНК обнаружено высокое содержание ретротранспозонов, которые, по-видимому, принимают участие в репрограммировании генома и регулируют экспрессию многих генов на начальных стадиях эмбриогенеза (Peaston et.al., 2004; Tomilin, 2008; Eymery et.al., 2009). Показана транскрипция сатДНК ПЦГХ у разных организмов (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004, 2006; Enukashvily et.al., 2007; Jehan et.al., 2007; Probst, Almouzni, 2011). Предполагается, что образующиеся РНК-транскрипты принимают участие в моделировании структуры хроматина в ответ на стресс (Rizzi et.al., 2004; Jolly et.al., 2004), участвуют в регуляции клеточного цикла (КЦ) (Lu, Gilbert, 2007) и клеточной дифференцировки (Eymery et.al., 2009; 2010). Полученные за последние годы сведения позволили сформулировать гипотезу, согласно которой программа индивидуального развития закодирована в специфических последовательностях ДНК в ПЦГХ, нарушения транскрипции которых могут пагубно отражаться на функциях генома, проявляться в виде синдромов, приводить к остановке развития и даже гибели эмбриона на ранних стадиях (Parris, 2009; 2010). Однако данных о транскрипции ПЦГХ в эмбриогенезе человека пока не получено.

Поиск причин нарушений и остановки эмбрионального развития у человека проводится, в основном, при спонтанных абортах и реже при других клинических формах патологии беременности - неразвивающейся беременности и анэмбрионии, при которых развитие хориона продолжается в течение нескольких недель после гибели эмбриона. Доминирующим фактором в ранней внутриутробной гибели признан хромосомный дисбаланс (Лебедев и др., 2006; Баранов, Кузнецова, 2007), при этом летальные для эмбриона доимплантационных стадий хромосомные аномалии могут быть совместимы с развитием и дифференцировкой экстраэмбриональных тканей после имплантации (Лебедев, 2006). Поэтому исследования структурно-функциональных особенностей ГХР хромосом в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях, развитие которых происходит по разным программам, вызывают особый интерес.

Учитывая, что сведения о параметрах КЦ и митотической активности клеток ЦТБ хориона от эмбрионов при нормальной беременности и спонтанных абортусов скудны и противоречивы (Брусиловский, 1976; Terzoli et.al., 1985; Zahed et.al., 1988; Барцева, 1989; Kennerknehct et.al., 1992), представлялось целесообразным исследовать особенности пролиферации клеток ЦТБ при неразвивающейся беременности. При выполнении этой задачи на краткосрочных органных культурах ворсин хориона с помощью метода «меченых митозов» мы обратили внимание на необычный спектр и избирательность окраски флуорохромом акридиновым оранжевым (АО) полиморфных ГХР хромосом. Аналогичная флуоресценция районов ПЦГХ была также обнаружена на препаратах из нативных и культивированных в отсутствии БДУ образцов хориона, не подвергавшихся каким-либо деконденсирующим или денатурирующим предобработкам, как при неразвивающейся, так и нормальной физиологической беременности. Известно, что для АО характерна метахромазия, обусловленная взаимодействием флуорохрома с нуклеиновыми кислотами (НК), белками и другими биополимерами. Так, двуцепочечные НК АО окрашивает в зеленый цвет, а одноцепочечные - в красный (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999; Луппа, 1980). При рН выше 7.0 краситель способен образовывать комплексы с белками и флуоресцировать в красной области спектра (Зеленин, 1967; Zelenin, 1999).

Конкретные задачи включали:

5) Исследование локализации HS3-1 в ядрах клеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей человека.

Научная новизна. Впервые обнаружен феномен и изучена природа хромосом-специфичной избирательной окраски флуорохромом АО районов ПЦГХ хромосом человека. Установлено, что этот феномен характерен для ГХР хромосом спонтанно делящихся клеток человека и мыши. Впервые проведено комплексное исследование метафазных хромосом человека с помощью РНКазы А, РНКазы Н, ДНКазы I и ДНК-лигазы Т4, результаты которого свидетельствуют в пользу наличия разрывов в ДНК ГХР хромосом 1,9, 16 в ЦТБ хориона и эмбриональных клетках, а также одноцепочечных НК и дуплексов РНК-ДНК в клетках ЦТБ.

Впервые исследована локализация HS3-1 в интерфазных ядрах эмбриональных и экстраэмбриональных клеток человека. Показано, что в клетках хориона раннего срока 4-5 недель беременности (н.б.) HS3-1 располагается ближе к центру ядра и граничит с хромоцентрами, тогда как, начиная с 5-6 н.б., в клетках зрелой плаценты, а также в клетках собственно эмбриональных тканей (печень, почка, позвоночник), HS3-1 расположен ближе к периферии ядра и входит в состав хромоцентров.

Впервые обнаружены полиаденилированные транскрипты HS3-1 в эмбриональных органах и в хорионе на сроке 7-9 н.б. Показано, что транскрипция HS3-1 в разных тканях происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК, но не с обеих цепей одновременно. На более поздних сроках транскрипты HS3-1 не обнаружены ни в эмбриональных, ни в экстраэмбриональных тканях.

Получены данные, свидетельствующие о недорепликации ГХР, а также подтверждена асинхронная репликация ГХР хромосом 1,9, 16 в ЦТБ хориона. Теоретическая и практическая значимость результатов. Результаты работы вносят вклад в понимание структуры и функциональной роли ГХ в эмбриогенезе человека. При анализе транскрипции и репликации сатДНК в хорионе и плаценте следует учитывать особенности митотической активности, а также лимит последовательных клеточных делений клеток ЦТБ в условиях in vitro. Установленный факт недорепликации ДНК в ГХР расширяет представления о механизмах пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток ЦТБ хориона в период активного органогенеза. Феномен метахроматической окраски флуорохромом АО указывает на своеобразную организацию ГХР метафазных хромосом в бластных клетках и акцентирует внимание на необходимости детальных исследований ПЦГХ в разных типах клеток.

КЦ. Репликация районов lqh, 9qh, 16qh в ЦТБ хориона происходит асинхронно. Недорепликация ГХР является характерным свойством клеток ЦТБ.

4) Транскрипция HS3-1 происходит в клетках хориона и эмбриональных органов до 9 н.б. Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы выполнена автором самостоятельно. Часть исследования, связанная с изучением локализации и транскрипции HS3-1 выполнена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики ИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и лаборатории морфологии клетки ИНЦ РАН (Санкт-Петербург), статистическая обработка экспериментальных данных проводилась при участии к.б.н. Мыльникова С.В., что отражено в совместных публикациях. Апробация работы. Результаты исследования были представлены на V съезде ВОГИС (Москва, 2009); конференции с международным участием Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine (г. Санкт-Петербург, 2009); конгрессах Европейского общества генетики человека (Вена, 2009; Гётеборг, 2010; Амстердам, 2011; Нюренберг, 2012); VII конференции Европейского цитогенетического общества (Стокгольм, 2009); Международной конференции общества IFPA «Плацента человека» (Аделаида, 2009); XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010); VI съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); IX научной конференции «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 21 работа, в том числе 5 статей в журналах перечня ВАК, 2 статьи в сборниках, 14 тезисов отечественных и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Данные проиллюстрированы 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 214 источников, из них 43 опубликованы в отечественной печати.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Трофимова, Ирина Леонидовна

выводы

1) Клетки цитотрофобласта хориона при физиологической и неразвивающейся беременности проходят не более двух последовательных клеточных циклов.

2) Репликация полиморфных блоков ЦЬ, 9яЬ, 16цЬ в цитотрофобласте хориона происходит асинхронно.

3) Избирательная окраска флуорохромом АО полиморфных гетерохроматиновых блоков ЦЬ, 9цЬ, 16яЬ специфична для клеток из тканей с естественной митотической активностью (хориона, плаценты, эмбриональных органов, костного мозга).

5) В гетерохроматиновых районах ЦЬ, 9qh, 16цЬ хромосом из эмбриональных клеток и клеток цитотрофобласта хориона имеются одноцепочечные разрывы ДНК.

6) В интерфазных ядрах клеток хориона 4-5 недель беременности НБЗ-! локализован ближе к центральной части ядра и не входит в состав хромоцентров. В ядрах клеток хориона 5-6 и 10-11 недель беременности, а также плаценты и эмбриональных органов ШЗ-1 локализован ближе к периферической области ядра и входит в состав хромоцентров.

7) В клетках хориона обнаружены полиаденилированные транскрипты НБЗ-1 до 7, а в клетках эмбриональных органов - до 9 недели беременности. Транскрипция НБЗ-1 происходит либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трофимова, Ирина Леонидовна, Санкт-Петербург

1. Баранов В. С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. — СПб.: Изд-во Н-Л. 2007. - 439 с.

2. Баранов B.C., Пендина A.A., Кузнецова Т.В. и др. Некоторые особенности статуса метилирования метафазных хромосом у зародышей человека доимплантацинных стадий развития // Цитология. 2005. - Т. 47. - №8.- С. 723-730.

3. Барцева О.Б. Эффективность пренатальной цитогенетической диагностики в I и II триместрах беременности: Автореф. . канд. биол. наук. М., 1989. —21 с.

4. Бенюш В.А., Тупицина Л.П. Двуцветная флуоресценция дифференциально конденсированных хромосом, окрашенных акридиновым оранжевым // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1975. - Т.79. - № 4. - с. 108-110.

5. Босток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М: Мир. - 1981. -600с.

6. Брусиловский А.И. Функциональная морфология плацентарного барьера человека. — Киев: Здоровье.- 1976. — 129 с.

7. Вайсертрейгер И. С. -Р. Транскрипционная активность прицентромерной сателлитной ДНК в клетках человека и мыши: Автореф. канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2010. -17 с.

8. Вайсертрейгер И.С. -Р., Подгорная О.И., Енукашвили Н.И. ДНК прицентромерных участков конститутивного гетерохроматина деметилирована и деконденсирована в клетках MRC5 и А431 // Цитология. 2007. - Т.49. - №1. - С. 62-69.

9. Виноградова Ю.Е., Шинкаркина А.П., Поверенный A.M. Аутоиммунный тиреоидит при заболеваниях системы крови // Тер. арх. 2003. -Т. 75. - № 12.-е. 83-92.

10. Волощук И.Н., Горбачева Ю.В., Дышева Н.М. Морфология ворсинчатого хориона при спонтанных абортах с хромосомными аномалиями // Мед. Генетика. — 2002. — Т. 1 .№1,— С.38-41.

11. Воробьева A.B. и др. Особенности репликации прицентромерного гетерохроматина хромосом 1,9, 16 в клетках хориона и эмбриональных тканей человека // Цитология. -2002. Т. 44,- № 9. - С. 868.

12. Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Гетерохроматиновые районы хромосом человека: клинико-биологические аспекты. М.: Медпрактика-М., 2008. - 300с.

13. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Электронная книга. М.: Практика, 1999. -459с.

14. Гринберг К.Н. Клеточный синдром нарушение цитодифференцировки при хромосомных аномалиях. Цитологические появления хромосомного дисбаланса у человека. Прогресс в медицинской генетике / под ред. Н.П. Бочкова. — М.: Медицина,-1978. —С. 151-186.

15. Груздев А.Д. Гетерохроматин и однонитевые разрывы ДНК (гипотеза) // Генетика. -1999. Т. 35,- № 7. - С. 869-872

16. Дукельская A.B. Изучение изменчивости интерфазного гетерохроматина курицы Gallus domesticus / A.B. Дукельская. дисс. . канд. биол. наук. - Л.: ЛГУ, 1986. - 157 С.

17. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. — М.: Товарищество научных изданий КМК,- 2003, — 160 с.

18. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та.- 2003. -458 с.

19. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. Атлас-М.: Медицина. 1982. -264с.

20. Зеленин A.B. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М.: Наука. -1967,- 136 с.

21. Зыбина Е.В. Цитология трофобласта. Ленинград: Наук.-, 1986. - 192с.

22. Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток. Пущино: Электронное изд-во "Аналитическая микроскопия",- 2002. - 131 с.

23. Кнорре А.Г. Эмбриональный гистогенез (морфологические очерки). — Л.: Медицина,- 1971. —429 с.

24. Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Цитогенетика цитотрофобласта: фундаментальные и прикладные аспекты // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып. 13 .- Новосибирск: Альфа Виста. 2009.-c.281-192.

25. Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Чиряева О.Г. Цитогенетические методы // Медицинские лабораторные технологии: под ред. Карпищенко А.И. СПб: Интермедика.- 1999.

26. Кулиев A.M. Фенотипические аспекты хромосомных эмбриолеталей человека: Автореф. . д-ра мед. наук. — М., 1976. — 48 с.

27. Кухаренко В.И. Клеточные и биохимические аспекты эмбриопатий человека с аномальным набором хромосом: Автореф. . д-ра мед. наук. — М., 1995. — 47 с.

28. Лебедев И.Н., Никитина Т.В., Токарева А.Г., Суханова H.H., Назаренко С.А. и др. Патогенетические эффекты нестабильности эмбрионального генома в развитии человека // Вестник ВОГиС. — 2006. —Т. 10,- № 3. — С. 520-529.

29. Луппа X. Основы гистохимии. М.: Мир. - 1980. - 332с.

30. Мудрак О.С. Архитектура хромосом в ядре сперматозоида человека // Автореф. канд. биол. наук. Санкт-Петербург. 2006. - 24 с.

31. Назаренко С.А., Карагеоргий Н.М. Межтканевые различия С-полиморфных районов хромосом у эмбрионов человека: возможная роль метилирования ДНК // Генетика,- 1995,- Т. 31.- №11.-С. 1578-1581.

32. Паткин Е.Л. Динамика структурно-функциональной организации метафазных и интерфазных хромосом в раннем эмбриогенезе млекопитающих в исследовании in situ: Автореф. докт. биол. наук. Санкт-Петербург. 1995. - 39с.

33. Паткин Е. Л., Сучкова И. О. Регуляторные механизмы импринтинга у млекопитающих // Цитология. 2006. - Т . 48. - № 7. - с. 578-594.

34. Пендина A.A. Кузнецова Т.В. Баранов B.C. Распределение ник-трансляционного сигнала на метафазных хромосомах эмбрионов человека // Цитология. 2000. - Т. 42. -№ 3. - С. 300-301.

35. Петрова Н.В. Пространственная организация хромосомных территорий в ядрах нормальных и анеуплоидных клеток: Автореф. канд. биол. наук. Москва, 2007. 24 с.

36. Прокофьева-Бельговская A.A. Гетерохроматиновые районы хромосом. М.: Наука. - 1986. - 432с.

37. Прохорович М. А. Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESMO 1-04: Автореф.канд. биол. наук. Новосибирск, 2009. 18с.

38. Рубцов Н.Б. Трехмерная и структурно-функциональная организация хромосом // Медицинская Генетика. 2007. - Т. 6. - №10. - с.3-10.

39. Сайфитдинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: Учебно-методическое пособие. СПб.: «СОЛО».- 2008. - 72 с.

40. Смирнов А.Ф. Структурно-функциональная организация хромосом. СПб.: Нестор-История,- 2009. - 204с.

41. Усов К. Е., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярно- цитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы Drosophila Melanogaster // Цитология. 2008. - Т. 50. - № 12. - с. 1044-1049.

42. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М.: Академкнига. - 2004. - 495с.

43. Ahmad K., Henikoff S. Centromeres are specialized replication domains in heterochromatin.// Cell Biol. -2001. -V. 153. -P.101-109.

44. Alonso R.A., Cantu J.M. Cell cycle time and possible early DNA replication in C-band regions in the domestic pig lymphocytes // Ann Genet. 1983. - V.26. - №4. - P.202-205.

45. Almeida A., Kokalj-Vokac N., Lefrancois D. Hypomethylation of classical satellite DNA and chromosome instability in lymphoblastoid cell lines // Hum. Genet.- 1993. -V. 91.- №6.-P.538-546.

46. Bannister A.J., Schneider R., Myers F.A., Thorne A.W., Crane- Robinson C., Kouzarides T. Spatial distribution of diand tri-methyl lysine 36 of histone H3 at active genes // Biol. Chem. -2005. Vol. 280. - P. 17732-17736.

47. Bailis J. M., Forsburg S. L. It's all in the timing: linking S phase to chromatin structure and chromosome dynamics // Cell Cycle. 2003. - № 2. - P.303—306.

48. Barski A., Cuddapah S., Cui K., Roh T. -Y., Schönes D. E., Wang Z., Wei G., Chepelev I., Zhao K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome // Cell. -2007. - Vol. 129. - P. 823-837.

49. Bensaada M., Kiefer H., Tachdjian G. et al. Altered patterns of DNA methylation on chromosomes from leukemia cell lines: identification of 5-methylcytosines by indirect immunodetection // Cancer Genet. Cytogenet. -1998. V. 103. -№ 2,- P.101-109.

50. Bernstein B., Meissner A., Lander E. The mammalian epigenome // Cell. -2007. №128. -P.669-681.

51. Bischof P., Irminger-Finger I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon // Int. J.Biochem.Cell Biol. — 2005. — V. 37,- P. 1-16.

52. Brero A., Leonhardt H., Cardoso M.C. Replication and translation of epigenetic information // Microbiol. Immunol. 2006. - Vol. 301. - P. 21-44.

53. Bobrow M., Madan K. The effects of various banding procedures on human chromosomes, studied with acridine orange // Cytogenet Cell Genet. 1973. - Vol.12.- № 3. -P.143-156.

54. Bottone M., Malgara R., Pellicciari C., Fuhrman Conti A. Treatments with saline solutions and DNase I have different effects on DNA content and distribution in human and in mouse chromosomes // Eur. J. Histochem. 1996. - Vol. 40,- № 2. - P.101-108.

55. Buhler M., Haas W., Gygi S. P., Moazed D. RNAi-dependent and -independent RNA turnover // Cell. 2007. - № 129. - P.707—721.

56. Burkholder G.D. Morphological and biochemical effects of endonucleases on isolated mammalian chromosomes in vitro // Chromosoma. 1989. - Vol. 97. - P. 347-355.

57. Camargo M., Cervenka J. Patterns of DNA Replication of Human Chromosomes. II. Replication Map and Replication Model.// Hum.Genet. 1982. -Vol.34. - P.757-780

58. Chen E.S., Zhang K., Nicolas E., Cam H.P., Zofall M., Grewal S.I. Cell cycle control of centromeric repeat transcription and heterochromatin assembly // Nature. 2008. - Vol. 451. -Issue 7179. - P. 734-737.

59. Choi J., Howe L. Histone acetylation: truth ore consequences? // Biochem Cell Biol. -2009. Vol.87. - P. 139-150.

60. Christman J. K. 5-azacytidine and 5-aza-2R-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy // Oncogene. 2002. -№21.-P.5483—5495.

61. Corradini N., Rossi F., Giordano E., Caizzi R., Verm F., Dimitri P. Drosophila melanogaster as a model for studying protein-encoding genes that are resident in constitutive heterochromatin // Heredity.- 2007,- № 98.- P. 3-12.

62. Craig J. M. Heterochromatin many flavours, common themes // Bioessays. - 2004. - № 27.-P. 17—28.

63. Cremer T., Cremer M., Dietzel S., Muller S., Solovei I., Fakan S. Chromosome territories a functional nuclear landscape // Cell Biology. - 2006. - № 18. -P. 307-316.

64. Croft J., Bridger J., Boyle S., Perry P., Teague P., Bickmore W. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus // Cell Biol. 1999. -Vol.145. -№ 6. - P. 1119-31.

65. Creusot F., Acs G., Christman J. K. Inhibition of DNA methyltransferase and induction of Friend erythroleukemia cell differentiation by 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine // Biol.Chem. 1982. -№ 357. - P.2041—2048.

66. Delcuve G., Rastegar M., Davie J. Epigenetic Control // Cell. Physiol. 2009. - Vol. 219. - P. 243-250.

67. Dillon N. Heterochromatin structure and function // Biology of the Cell. 2004. -№ 96. -P. 631-637

68. Dimitri P., Caizzi R., Giordano E. Constitutive heterochromatin: a surprising variety of expressed sequences // Chromosoma. -2009.- Vol.118,- № 4,- P. 419-35.

69. Dimitri P., Corradini N., Rossi F., Verni F. The paradox of functional heterochromatin // Bioessays. 2005. - Vol. 21.- №1.- P. 29-41.

70. Dong F., Jiang J. Non-Rabl patterns of centromere and telomere distribution in the interphase nuclei of plant cells // Chrom. Res. 1998. - Vol. 6. - № 7. - P. 551-558.

71. Dunn K., Griffith J. The presence of RNA in a double helix inhibits its interaction with histone protein // Nucleic Acids Res.- 1980.- Vol.8.- № 3.- P. 555-566.

72. Eissenberg, J.C., Elgin, S.C. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. // Curr. Opin. Genet. Dev. -2000. №10. - P.204-210.

73. Eberl D.F., Duyf B.J, Hilliker A.J. The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogaster // Genetics. 1993. - Vol.134. -№1. -P.277-292.

74. Elder J., Turner B., Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes // Q. Rev. Biol. 1995. -№ 70. - P. 297-320.

75. Epstein L. M., Kathleen A., Gall M., Gall J. Transcription of a Satellite DNA in the Newt //Cell Biol. 1986. -Vol. 103.-P. 1137-1144.

76. Evenson D.P., Klein F.A., Whitmore W.F., Melamed M.R. Flow cytometric evaluation of sperm from patients with testicular carcinoma // Urol. 1984. - Vol. 132.- № 6. - P. 1220-1225.

77. Eymery A. Heat shock factor 1 binds to and transcribes satellite II and III sequences at several pericentromeric regions in heat-shocked cells // Exp.Cell Res. 2010. - Vol. 316. - № 11. -P. 1845-1855.

78. Eymery A., Callanan M., Vourc'h C. The secret message of heterochromatin: new insights into the mechanisms and function of centromeric and pericentric repeat sequence transcription // Dev. Biol. 2009. - №53. -P.259-268.

79. Farber R.A., Davidson R.L. Differences in the order of termination of DNA replication in human chromosomes in peripheral blood lymphocytes and skin fibroblasts from the same individual // Cytogenet Cell Genet. 1977. - Vol.18. - P.349-363.

80. Fedorova E. and Zink D. Nuclear architecture and gene regulation // Biochimica et Biophysica Acta. 2008. - Vol. 178. - P. 2174-2184.

81. Ferguson M., Ward D.C. Cell cycle dependent chromosomal movement in pre-mitotic human T-lymphocyte nuclei // Chromosoma.- 1992. Vol. 101. - № 9. - P. 557-65.

82. Ferrai C., I. J. de Castro, Lavitas L., Chotalia M., Pombo A. Gene Positioning // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010,- Vol. 2.-№ 6,- P. 1-17.

83. Ferree P., Prasad S. How can satellite DNA divergence cause reproductive isolation? Let us countthe chromosomal ways // Genetics Research International.- 2012,- P. 1-11.

84. Folle G.A. Nuclear architecture, chromosome domains and genetic damage // Mutat Res. -2008,- Vol.658.-№3.-P.172-183.

85. Genbacev O. Regulation of human placental development by oxygen tension. // Science. — 1997. — Vol. 277,- № 5332. — P. 1669-1672.

86. Genbacev O., Miller R. K. Post-implantation Differentiation and Proliferation of Cytotrophoblast Cells: In Vitro Models—A Review // Placenta. —2000. — Suppl. A, Trophoblast Res. —Vol. 14. — P. 45^19.

87. Goto T., Monk M. Regulation of X-chromosome inactivation in development in mice and humans // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. -№ 62. - P. 362—378.

88. Grasser F., Neusser M., Fiegler H., Thormeyer T., Cremer M, Carter N.P., Cremer T., Müller S. Replication-timing-correlated spatial chromatin arrangements in cancer and in primate interphase nuclei // J Cell Sei.- 2008.-Vol.l21(Pt 11).- P. 1876-1886.

89. Grewal S. I., Moazed D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression // Science. 2003. - № 301. - P. 798—802.

90. Grigoryev S.A., Bulynko Y. A., Popova E. Y. The end adjusts the means: Heterochromatin remodelling during terminal cell differentiation // Chrom. Res. 2006. - Vol. 14. - P. 53-69.

91. Guenatri M., Bailly D., Maison C., Almouzni G. Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin// The Journal of Cell Biology.- 2004,- Vol. 166,-№ 4.-P. 493-505.

92. Habermann F.A., Cremer M., Walter J., Kreth G., von Hase J., Bauer K., Wienberg J., Cremer C., Cremer T., Solovei I. Arrangements of macro- and microchromosomes in chicken cell // Chromosome Res. 2001. - Vol. 9,- № 7. - P. 569-584.

93. Hall I. M., Grewal S. I. A Guide To Gene Silencing / ed. Hannon, G. J. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Press.- 2003. - P.205-232.

94. Hollo G., Keresx J., Praznovszky T., Cserpan I., Fodor K., Katona R., Csonka E., Fatyol K., Szeles A., Szalay A. Evidence for a megareplicon covering megabases of centromeric chromosome segments // Chrom. Res. 1996. - Vol. 4. - P. 240-247.

95. Horakova A. H., Galiova G., Legartova S., Kozubek S., Matula P., Bartova E. Chromocentre integrity and epigenetic marks // Structural Biology.- 2010,- Vol.169.- P. 124-133.

96. Hemberger M. Genetic-epigenetic intersection in trophoblast differentiation: implications for extraembryonic tissue function.- Epigenetics.- 2010.- Vol. 5,- № 1.- P. 24-29.

97. Horvath J.E., Schwartz S., Eichler E.E. The mosaic structure of human pericentromeric DNA: a strategy for characterizing complex regions of the human genome // Genome Res. -2000,- Vol.10. -№ 6,- P. 839-852.

98. Houlard M., Berlivet S., Probst A.V., Quivy J.P., Hery P., Almouzni G. and Gerard M. CAF-1 is essential for heterochromatin organization in pluripotent embryonic cells // PLoS Genet. 2006. - № 2. - P. 181 -196.

99. Huisinga K.L., Brower-Toland B., and Elgin S.C. The contradictory definitions of heterochromatin: transcription and silencing // Chromosoma-2006. № 115. - P.110-122.

100. Huppertz B., Herrler A. Regulation of proliferation and apoptosis during development of the preimplantation embryon and the placenta // Buth Defects Res.- 2005,- Vol.75.- Part C.1. P.249-261.

101. Jackson D. A. Regulating gene expression in mammalian cells: how nuclear architecture influences mRNA synthesis and export to the cytoplasm // Exp. Biol.-2004. -Vol. 56. -P. 135-55.

102. Jeanpierre M. Human satellites 2 and 3 // Ann. Genet. -1994. -Vol. 37. -№ 4.- P.163-171.

103. Jin Q., Trelles-Stricken E., Scherthan H., Loidl J. Yeast nuclei display prominent centromere clustering that is reduced in nondividing cells in meiotic prophase. 1998. - Cell Biol. - Vol. 141. -P.21-29.

104. Jolly C., Konecny L., Grady D., Kutskova Y., Cotto J., Morimoto R., Vourc'h C. In vivo binding of active heat shock transcription factor 1 to human chromosome 9 heterochromatin during stress // Cell Biology. 2002. -Vol. 156. - № 5. - P. 775-778.

105. Jolly C., Lakhotia S.C. Human sat III and Drosophila hsr omega transcripts: a common paradigm for regulation of nuclear RNA processing in stressed cells // Nucleic Acids Res.2006. -Vol. 34. № 19,- P. 5508-5514.

106. Jolly C., Metz A., Govin J., Vigneron M., Turner B., Khochbin S., Vourc'h C. Stress induced transcription of satellite III repeats // The journal of Cell Biology. 2004. - Vol.164.- № 1. - P.25-33.

107. Jurisicova A., Detmar J., Caniggia I. Molecular mechanisms of trophoblast survival: from implantation to birth // Birth Defects Res C Embryo Today. — 2005. -Vol.75. № 4.-P. 262-280.

108. Kar M., Ghosh D., Sengupta J. Histochemical and morphological examination of proliferation and apoptosis in human first trimester villous trophoblast // Human Reproduction.2007,- Vol. 22,- № 11,- P. 2814-2823.

109. Kennerknehct I., Baur-Aubele S., Terinde R., Vogel W. Nuclear and chromosomal replication patterns in chorionic villi cells by bromodeoxyuridine labelling and DNA flow cytometry // Cell. Prolif. — 1992. — Vol. 25,- № 4. — P. 321-336.

110. Kim S., Dubey D., Huberman J. Early-replicating heterochromatin. // Genes. Dev. -2003.- Vol.17. -№3. -P.330-335.

111. Kloc A., Martienssen R. RNAi, heterochromatin and the cell cycle // Trends in Genetics.- 2008. Vol. 24. - № 10. - P. 511-517.

112. Knopf K. -W. Simple isolation method and assay for T4 DNA Ligase and characterization of the purified enzyme // Eur. J. Biochem. 1977. - Vol. 73. - P. 33-38.

113. Kokalj-Vokac N., Zagorac A., Pristovnik M. et al. DNA methylation of the extraembryonic tissues: an in situ study on human metaphase chromosomes // Chromosome Res.- 1998. -Vol. 6. -№ 3,- P. 161-166.

114. Kokawa K., Shikone T., Nakanoa R. Apoptosis in Human Chorionic Villi and Decidua During Normal Embryonic Development and Spontaneous Abortion in the First Trimester // Placenta.- 1998.-Vol. 19.-P. 21-26.

115. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function // Cell. 2007. - №128. -P.693-705.

116. Lachner M., O'Sullivan R. J., Jenuwein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation//Cell Sei.-2003. -№116.-P.2117—2124.

117. Leach T.J., Mazzeo M., Chotkowski H.L., Madigan J.P., Wotring M.G., Glaser R.L. Histone H2A.Z is widely but nonrandomly distributed in chromosomes of Drosophila melanogaster // Biol. Chem. 2000. - № 275. - P.267-272.

118. Lee C., Li X., Jabs E.W., Court D.R., Lin C.C. Human gamma X satellite DNA: an X chromosome specific centromeric DNA sequence // Chromosoma. 1995.-Vol. 104,- P.103-112.

119. Lee C., Wevrick R., Fisher R.B., Ferguson-Smith M.A., Lin C.C. Human centromeric DNAs // Hum. Genet. 1997. - Vol.100. - P.291-304.

120. Leitch A. Higher Levels of Organization in the Interphase Nucleus of Cycling and Differentiated Cells //Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000. - № 3. - P.138-152.

121. Lin C.C., Jorgenson K.F., van de Sande J.H. Specific Fluorescent Bands on Chromosomes Produced by Acridine Orange After Prestaining with Base Specific Non-Fluorescent DNA Ligands // Chromosoma.- 1980,- Vol. 79,- № 3,- P. 271-286.

122. Li E., Bestor T.H., and Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality // Cell. 1992. - № 69. - P. 915-926.

123. Li Q., Zhang Z. Linking DNA replication to heterochromatin silencing and epigenetic inheritance // Acta Bioch. Bioph. Sin.- 2012.-Vol. 44.-Is.l.-P. 3.11.

124. Li Y.X., Kirby M.L. Coordinated and conserved expression of alphoid repeat and alphoid repeat-tagged coding sequences // Dev. Dyn. 2003. - Vol. 228. -№ 1. - P. 72-81.

125. Lu J., Gilbert D.M. Proliferation-dependent and cell cycle-regulated transcription of mouse pericentric heterochromatin // J. Cell Biol.- 2007. Vol. 179. -№ 3. - P.411-421.

126. Luger K., Hansen J.C. Nucleosome and chromatin fiber dynamics // Curr. Opin. Struct. Biol. -2005. -№15. P. 188-196.

127. Lyko F., Ramsahoye B. H., Kashevsky H., Tudor M., Mastrangelo M. A., Orr-Weaver T. L., Jaenisch R. Mammalian (cytosine- 5) methyltransferases cause genomic DNA methylation and lethality in Drosophila // Nat. Genet. -1999. Vol. 23. - P. 363—366.

128. Ma Y., Jacobs S.B., Jackson-Grusby L., Mastrangelo M.A., Torres-Betancourt J.A., Jaenisch R., Rasmussen T.P. DNA CpG hypomethylation induces heterochromatin reorganization involving the histone variant macroH2A // Cell Sci. 2005.- №118.-P.1607-1616.

129. Matsumoto L., Gerbi S. Early initiation of bovine satellite I DNA replication // Exp. Cell Biol. 1982. -Vol. 140. - P. 47-54.

130. Mattei M.G., Luciani J. Heterochromatin, from Chromosome to Protein // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2003.

131. Mayer R., Brero A., von Hase J., Schroeder T. Common themes and cell type specific variations of higher order chromatin arrangements in the mouse // BMC Cell Biology. 2005. -Vol. 6. - Issue 44. - P. 1-22.

132. Méndez J. Temporal regulation of DNA replication in mammalian cells // Crit. Rev.Bioch. Mol. Biol.- 2009,- Vol. 44.-№ 5,- P.343-351.

133. Meneveri R.,Agresti A.,Marozzi A.,Saccone S. Molecular organization and chromosomal location of human GC-rich heterochromatic blocks //Gene.-1993.-Vol. 123.-P. 227-234.

134. Meshorer E., Misteli T. Chromatin in pluripotent embryonic stem cells and differentiation // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006.-№ 7. - P.540-546.

135. Metz A., Soret J., Vourch C., Tazi J., Jolly C. A key role for stress-induced satellite III transcripts in the relocalization of splicing factors into nuclear stress granules // Cell Science. -2004. -№ 117.-P. 4551-4558

136. Mine E., Allory Y., Worman H., Courvalin J., Buendia B. Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle in mammalian cells // Chromosoma. -1999.-№ 108.-P. 220-34.

137. Mine E., Courvalin J., Buendia B. HP 1 gamma associates with euchromatin and heterochromatin in mammalian nuclei and chromosomes // Cytogenet Cell Genet. 2000. - № 90. - P. 279-84.

138. Moran R., Darzynkiewicz Z., Staiano-Coico L., Melamed M. Detection of 5-Bromodeoxyuridine (BrdUrd) incorporation by monoclonal antibodies: role of the DNA denaturation step. // Histoch.and Cytoch. 1985. - Vol. 33. - № 8. - P. 821-827.

139. Murapa P., Gandhapudi S., Skaggs H., Sarge K., Woodward J. Physiological Fever Temperature Induces a Protective Stress Response in T Lymphocytes Mediated by Heat Shock Factor-1 (HSF1) // Immunol. 2007. - Vol. 179. - P. 8305-8312.

140. Nakayama J.,Rice J.,Strahl B.,Allis C.,Grewal S.Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly //Science.-2001.-№ 29.-P.110-113.

141. Nielsen A.L., Oulad-Abdelghani, M., Ortiz, J.A., Remboutsika, E., Chambon,P., and Losson, R. Heterochromatin formation in mammalian cells:interaction between histones and HP1 proteins // Mol. Cell. 2001. -№ 7. - P. 729-739.

142. Parris G.E. A hypothetical Master Development Program for multi-cellular organisms: Ontogeny and phylogeny // Biosci Hypotheses. 2009. - № 2. - P. 3-12.

143. Parris G.E. Developmental diseases and the hypothetical Master Development Program // Medical Hypotheses. 2010. - № 74. - P.564-573.

144. Peaston A., Rossant J., Li L., Knowles B.B. Retrotransposons regulate host genes in mouse oocytes and preimplantation embryos // Dev.Cell. 2004,- Vol. 7. P. 597-606.

145. Perez M., Miguez L., Fuster C. Heterochromatin decondensation in chromosomes from chorionic villus samples // Prenat. Diagn. 1991. - Vol.11. - № 9. - P. 697-704.

146. Pichugin A., Beaujean N., Vignon X., Vassetzky Y. Ring-Like Distribution of Constitutive Heterochromatin in Bovine Senescent Cells // PLoS One. Vol. 6. - Is.l 1.- P. 1-7.

147. Pierpont M., Yunis J. Localization of chromosomal RNA in human G-banded metaphase chromosomes // Exp. Cell Res. 1977. - Vol.106. - P. 303-308.

148. Plohl M., Luchetti A., Mestrovic N., Mantovani B. Satellite DNAs between selfishness and functionality: Structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin // Gene. 2008. - Vol. 409. - Issue 1-2. - P. 72-82.

149. Probst A. V., Almouzni G. Pericentric heterochromatin: dynamic organization during early development in mammals // Differentiation. 2008. -№ 76. - P. 15-23.

150. Probst A. V., Almouzni G. Heterochromatin establishment in the context of genome-wide epigenetic reprogramming//Trends in Genetics.- 2011,- Vol.27.- №5.- P. 177-185.

151. Rici R.E.G., Facciotti P.R., Ambrysio C.E., Maria D.A., Kfoury J.R., Bertolini M., Miglino M.A. Cell cycle and apoptosis in normal and cloned bovine near-term placentae // Animal Reproduction Science.- 2009,- Vol. 115,- P. 29-38.

152. Richards E., Elgin S. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell. 2002. - № 108. - P.489-500.

153. Rieder C.L., Cole R.W. Cold-shock and the Mammalian cell cycle // Cell Cycle.- 2002,-Vol.l.- № 3.-P.169-175.

154. Roman-Gomez J., Jimenez-Velasco A., Agirre X. Repetitive DNA hypomethylation in the advanced phase of chronic myeloid leukemia //Leuk.Res.-2008.-Vol. 32,- № 3.-P. 487-490.

155. Rosenfeld J. A., Wang Z., Schönes D. E., Zhao K., DeSalle R. , Zhang M. Q. Determination of enriched histone modifications in non-genic portions of the human genome // BMC Genomics. 2009. - Vol. 10. -№ 143. - P. 1-11.

156. Rudert, F., Bronner, S., Gamier, J.M. And Dolle, P. Transcripts from opposite strands of gamma satellite DNA are differentially expressed during mouse development // Mamm. Genome. 1995. -№ 6. -P.76-83.

157. Santos A., Shaw P. Interphase chromosomes and the Rabl configuration: does genome size matter? // Microsc. 2004. - Vol. 214(Pt 2). - P. 201-206.

158. Schmidt T., Heslop-Harrison J. Genomes, genes and junk: the largescale organization of plant chromosomes // Trends Plant Sci. 1998. - № 3. - P. 195-199.

159. Schubeler D., Scalzo D., Kooperberg C., van Steensel B., Delrow J., Groudine M. Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing.// Nat. Genet. 2002. - Vol. 32. - № 3. -P. 438-442.

160. Sharp A., Robinson D., Jacobs P. Absence of correlation between late-replication and spreading of X inactivation in an X / autosome translocation // Hum. Genet. 2001. -Vol. 109. -P. 295-302.

161. Shemer R., Birger Y., Dean W. L., Reik W., Riggs A. D., Razin A. Dynamic methylation adjustment and counting as part of imprinting mechanisms // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. -№93.-P. 6371—6376.

162. Sengupta S., Parihar R., Ganesh S. Satellite III non-coding RNAs show distinct and stress-specific patterns of induction // Biochemical and Biophysical Research Communications. -2009.-Vol. 382.-P. 102-107.

163. Serman L., Dodig D. Impact of DNA methylation on trophoblast function// Clinical Epigenetics. 2011. - P. 1-6.

164. Stockert J.C., Lisanti J.A. Acridine-orange differential fluorescence of fast- and slow-reassociating chromosomal DNA after in situ DNA denaturation and reassociation // Chromosoma.- 1972,- Vol.37.- № 2,- P. 117-30.

165. Strahl, B.D., Allis, C.D. The language of covalent histone modifications // Nature. -2000. -№ 403. -P.41-45.

166. Sullivan B., Karpen G. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004.-Vol. 11. -№ 11. -P. 1076-1083.

167. Sullivan B., Karpen G. Centromere identity in Drosophila is not determined in vivo by replication timing. // Cell Biol. 2001. - Vol.144. - P.683-690.

168. Suzuki T., Fujii M., Ayusawa D. Demethylation of classical satellite 2 and 3 DNA with chromosomal instability in senescent human fibroblasts // Experimental Gerontology.- 2002.-Vol. 37,- P. 1005-1014.

169. Szulwach K.E., Li X., Li Y. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells // PLoS Genetics. 2011.- Vol. 7.-№. 6.-P. 1553-7390.

170. Takebayashi S., Sugimura K., Saito T., Sato C., Fukushima Y., Taguchi H., Okumura K. Regulation of replication at the R/G chromosomal band boundary and pericentromeric heterochromatin of mammalian cells // Exp. Cell Res. 2005. - № 304. - P. 162- 174.

171. Tamaru H. Confining euchromatin/heterochromatin territory: jumonji crosses the line // Genes and development.- 2010.- № 24,- P. 1465-1478.

172. Tomilin N.V. Regulation of mammalian gene expression by retroelements and non-coding tandem repeats // BioEssays. 2008. -Vol. 30. - P. 338-348.

173. Ugarcovic D. Functional elements residing within satellite DNAs // EMBO Rep. 2005. -Vol. 6. -№11. -P.1035-1039.

174. Vaissiere T., Sawan C., Herceg Z. Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing // Mutation Res. 2008. - Vol. 659. - P. 40^18.

175. Vakoc C. R., Mandat S. A., Olenchock B. A., Blobel G. A. Histone H3 lysine 9 methylation and HP1 gamma are associated with transcription elongation through mammalian chromatin // Mol. Cell. 2005. - № 19. - P.381—391.

176. Valgardsdottir R., Chiodi I., Giordano M., Cobianchi F., Riva S., Biamonti G. Structural and functional characterization of noncoding repetitive RNAs transcribed in stressed human cells // Mol. Biol. Cell. -2005. № 16. - P. 2597-2604.

177. Vanderlaan M., Thomas C.B. Characterisation of monoclonal antibodies to bromodeoxyuridine // Cytometry. 1985. - Vol.6. - P. 501-505.

178. Verma R.S., Lub H. A. A Simple R Banding Technic //Am J Hum Genet.-1975.-Vol.27.- P.110-117.

179. Vogel W., Auteurieth M., Speit G. Detection of bromodeoxyuridine-incorporation in mammalian chromosomes by a bromodeoxyuridine-antibody. I. Demonstration of replication patterns // Hum. Genet. — 1986. — Vol.72. — P.129-132.

180. Vujcic M., Miller C.A., Kowalski D. Activation of silent replication origins at autonomously replicating sequence elements near the HML locus in budding yeast // Mol. Cell Biol.- 1999. Vol. 19. - № 9. - P. 6098-6109.

181. Wallrath L.L. Unfolding the mysteries of heterochromatin // Curr. Opin. Genet. Dev.-1998.-Vol. 8,-№2.-P. 147-53.

182. Weidtkamp-Peters S., Rahn H., Cardoso M., Hemmerich P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase // Histochem. Cell Biol. 2006. - Vol. 125. -P .91-102.

183. Weierich C., Brero A., Stein S., von Hase J., Cremer C., Cremer T., Solovei I. Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human and murine lymphocytes // Chromosome Res. 2003. - Vol. 11. - № 5. - P. 485-502.

184. Woodfine K., Fiegler H., Beare D.M., Collins J.E., McCann O.T., Young B.D., Debernardi S., Mott R., Dunham I., Carter N.P. Replication timing of the human genome // Hum. Mol. Genet.-2003. Vol. 13. -№ 2. - P. 191-202.

185. Wright W., Tesmer V., Liao M., Shay J. Normal human telomeres are not late replicating.// Exp. Cell Res. -1999. Vol. 251. - P. 492-499.

186. Yunis J., Yasmineh W. Heterochromatin, satellite DNA, and cell function. Structural DNA of eucaryotes may support and protect genes and aid in speciation // Science. -1971. -Vol. 174. -Issue 4015. P. 1200-1209.

187. Zahed L., Murer-Orlando M., Bobrow M. Cell cycle studies in chorionic villi // Hum. Genet. — 1988. — Vol. 80,- № 2. — P. 127-134.

188. Zeng W., Ball A. R., J. Yokomori, K. Yokomori HP1: Heterochromatin binding proteins working the genome // Epigenetics. 2010. - Vol. 5. - № 4. - P. 287-292.

189. Выражаю благодарность заведующему лабораторией пренатальной диагностикиинститута АиГ им. Д.О.Отта Владиславу Сергеевичу Баранову за всемерную поддержку,понимание и помощь.

190. Хотелось бы выразить слова благодарности Елене Романовне Гагинской и сотрудникам центра «Хромас» в помощь при работе и за советы по оформлению теста автореферата.

Информация о работе

Трофимова, Ирина Леонидовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы