Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная морфология хромосом-ламповых щеток из ооцитов сизого голубя

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная морфология хромосом-ламповых щеток из ооцитов сизого голубя"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА К ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ '

Ка правах рукописи

ХУТКНАЕВА Гарина Александповна

УДК 576.312.541:591.465.12

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ ХРОД'ОСОМ-ЛДШОВЫХ ЩЕТОК КЗ 00Ц7.ТОВ СИЗОГО ГОЛУБЯ

(03.00.11 - ЭМБРИОЛОГИЯ. ГИСТОЛОГИЯ И ЦИТОЛОШ)

АВТОРЕСЕРАГ

диссертации на соискание ученой стеденг кандидата биологических наук

■ ЛЕНИНГРАД 1990

Работе выполнена в лаборатории электпонной микроскопии и сравнительной гистологии БиНКИ ЛГУ.

Научный руководитель -доктор биологических наук Е.Р. Гагинская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Б. Ильинская, кандидат биологических наук Т.Е. Кузнецова

Ведущее учреждение: Всесоюзный НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Защита состоится "НО " декабря 1990 г. в " часов на заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук Д C6S.57.22 при Ленинградском государственном университете по адресу: 199034, Ленинград, Университетская набережная, 7/9, ауд. 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.И.Горького Ленинградского государственного университета.

Автореферат разослан " " /с^оД^?_ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук А.Г.Десницкий

Актуальность, проблемы. Хромосомы ламповых щеток (ЛЩ) дг.бко привлекают внимание исследователей, так как, в счлу специфических особенностей организации (гигантские резмзры, своеобразная "открытость" структуры, обусловленная декомпакти-заиией сразу большого числа хроматиповых доменов), ^та частная цорка о5-дестьованкп хромосом представляет собой уникальную модель для исследования ряда общзбиологическпх проблрч. К числу таких проблей могло отнести закономерности организации и функционирования эукарпотического генома, механизмы транскрипции, экспрессии генов и другие.

В ЛЩ преобразится на дпплотеккоЛ стадии мейоза хромосомы в ооцитах представителей всех крупных групп зшботных с солн-тарпкгл и поллпкулярнкл типами оогенеза, характеризующимися вн-сокой транскрипционной активностью ядра ооцита (Восток, Сам-нер, 1981). По современным данным, значение ЛЦ не исчерпывается синтезом большого количества разнообразных РНК, необходимых для раннего развития зародыша; однако дс настоящего времени удовлетворительного объяснения феномену .111 не найдено.

Плодотворным в решении этой проблемы мог бы оказаться сравнительный подход к изучении ЛЩ. До недавнего времени они интенсивно исследовались лишь на призере амфибий (Gall, 1963; Мес^гесог, 19ею, 1932; Callan, 1966). 2а последние несколько лет накоплены знания об организации JQ другого класса позвоночных - птиц (Кропотова, 1S84; KutchlBon, 1937; Гагипская, 1S35). Сравнение ЛЩ представителей этих двух классов жпт'отгшх те« бо^ее актуально, что птицы клеят кнуп, чем у амфибий, организацию генома (Гинатулин,1584) и своеобразный оогенез, за-нпматсцлй промежуточное положение мезду солитарным и алиментарным типами (Гагннская. 1975).

При исследовании ЛЩ птиц, наряду с общими с амфибиями чертами организации, были выявлены к частные особенности, характеризуйте -ЕД птиц, а. также отмечены меквидовые различия в строении Х.Ц внутри кл.Птицы (Кропотова, 1984; Гагинская, 1989). Наиболее сложной ;; наименее понятной морфологией хромосом-ЛЩ и сопутствующих им структур обладал, по предварительным описаниям, представитель отр.Голубеобразных - сизый голубь (Кропотова, 1964) . В ядрах оспитов этого вида были обнаружена многочисленные сферы различных типов с неизвестными функциями;

непонятной осталась организация концевых отделов хромосом со специфической морфологией, не »злевдхх типичного хрокомерно-петлевого строения. Выяснение природы указанных структур па ЛЩ этого Еида представлялось вахням в сЕете возможного участия их в процессах амплификации керибосомных генов, в конденсации хромосом, в процессе накопления специфэтеских белков в ядре ооцжга (Гаггаская, 19SS).

В то по время, такие характерные особенности кариотшш Голубеобразных, как большое, по сравнению с другими птицы.®, количество ДНК в геноме (Гикатулин,1984), а также высокое со-дссжание гетерохроматика (Еапгааг'Во,1967) делают интересным сопоставление организации хромосом представителей этого отряда на стадии ЛЩ с ЛЩ представителей других огрядсз птиц, важное для понимания обцих закономерностей функционирования хромосом этого тала.

Цель и задачи исследования. Цель нашего исследования заключалась в подробном анализе корфо-функциональкой организации ЛЩ сизого голубя. В связи с этюд били поставлена следующие задачи:

1. Подобрать условия приготовления постоянных препаратов ЛЩ голубя, ойеспечиваю!Д2е наиболее полную сохранность хромосом и связан"ых с ними структур.

2. Детально изучить и охарактеризовать общи морфологию ЛЩ и связанных с ними структур на разных стадиях роста и созревания ооцита, а такяе разработать систему идентификации возмокно большего ЧИСЛа бивалентов.

3. Провести цитохимическое исследование хромосом и связанных с ними структур в ооцятах голубя.

4. Провести сравнительное исследование митотических хромосом и ЛЩ голубя с помочь» нуклеотид-специфичпых флуорохромов.

5. Вцявить ядршзсообразующие хромосомы в кариотше голубя и nonoTaTbJH идентифицировать их на стадии ЛЩ, используя метод -серебрения.

6. Локализовать в ЛЩ голубя с помощью метода in situ гибридизации нуклеиновых кислот консервативную умеренноповторявщуя-ся последовательность ДНК из генома мши (обнаруженную в геноме голубя молекулярными методами - Газарян и др.,1984), а также Еисокоповторявщусся ДНК из генома голубя.

7. Проследить закономерности конденсация хромосом в ооцитах

голубя по окончании стадии Ж.

Научная новизна. Работа представляет собой первое подробное морфологическое исследование ЛТЦ из растущих оокитов сизого голубя с применением ряда цитологических и молекулярпобиолсги-чеьких методов. Параллельно исследовались митотическле мета-фазные хромосомы голубя. Впервые методом явторадиографжи показана высекая транскрипционная активность ЛЩ в ооцитах предета-ьителя кл.Птицы. Описан пример корреляции меэду блочной организацией китотических хромосом и локализацией специфических структур в ЛЩ. В дрителомерных районах мктотических хромосом голубя обнаружены блоки ГЦ-обогаденнсго гетерохроматина; показано, что именно эти блоки гетерохроматина фермирупт на стадии ЛЩ гигантские петли со специфической морфологией. Сложная организация районов ЛЩ, которые мы идентифицировали как при^ент-ромерные, обусловлена, по-видимому, присутствием здесь блока припентрог/еркого гетерохроматина, часть которого транскрибируется на стадии ЛЩ в составе специфических петель и, возможно, сфер, другая же часть сохраняет конденсированное состояние. Проведено гатохпклческое я авторадиографэтеское исследование сфер на ЛЩ голубя и прослежена динамика их взаимоотношений дрзт с другом и с хромосомам б ходе роста и созревания ооцита.

Идентифицированы все макробиваленты голубя. Получены убедительные доказательства, что половые хромосомы птиц но стадии ЛЩ с-бразувт бивалент.

Методом серебрения в хромосомном наборе голубя выявлены ядркзжообразукже хрокосогш. Показано, что на стадии ЛЩ у птиц эти: методом ядршкообразувщие хромосомы не идектифвдируптся. Выявлена линейная неоднородность в окраске бивалентов серебром.

Прослекекы закономерности конденсации ЛЩ голубя в вител-логеннкх ооцитах.

Научная и практическая значимость. Полученные данные углубляют знания о морфо-функциональней организации ядерного аппарата в растущих ооцитах птиц. Они также вносят вклад в решение одной из важнейших проблем цитогзнетики, связанной с изучением свойств конститутивного гетерохроматина. Результаты работы демонстрируют перспективность сравнительного подхода к изучению хромосом-ЛЩ, а также перспективность использования ЛЩ птиц в качестве модельного объекта для исследования закономер-

ностей структурной и функциональной оргапзацяи хромосом, локализации определенных генетических последовательностей, способов конденсации и компакти?ацж хромосом при их инактивации. Материалы работы могут быть использованы при чтении курса цитологии, а также специальных курсов на кафедрах цитологии и гистологии, генетики и эмбриологии.

Апробация работы. Материалы работы доложены на IX Всесоюзном симпсзьуме по структуре и функциям клеточного ядра (Черноголовка. 1Э87), на У1 Всесоюзном совещании по структуре и функциям хромосом (Пущшю, 1388), на УШ ыевдунородном симпозиуме по проблемам генетики птиц (Смоленице, 1982), на Ш шко-ле-семкнаре по генетике и селекции животных (Новосибирск, 1989), на УП Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" ('Лос.ква, 1930), на X Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Гродно, 1990), на семинаре кафедры цитологии и гистологии ЛГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав и внеодов. Список цитированной литературы содержит 2С6 работ (66 отечественных и 140 иностранных). Кляю-стратигчый материал представлен 68 микрофотографиями и рисунками, вынесенными в Приложение. Текст диссертации составляет 98 страниц.

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили хромосомы-ЛЩ и митотические хромосомы СИЗОГО голубя Со1шпЪа 11У1е Ь. (стр. Со1игаМ£огшев).

Постоянные препараты ЛИ приготавливали по методике, применявшейся при исследовании ЛЩ других видов птиц (Кропотова, 1984). Для выделения и дисперсии содержимого ядер ооцитов голубя использовали среды, предложенные Кэлланом (СоНаи е; а1., 1987). В качестве морфологических красителей использовали Ку-масси-Р250 и 1фаситель Гимза.

Препараты метаТазных хромосом голубя ползали из клеток 3-х суточных вибрионов по методу Родионова (Родионов,1984).

Парафиновые срезы яичников и отдельных изолированных ядер оощгтов получали по стандартным методикам.

Цитохимическое исследование хромосом проводили с использованием ДНК-специфичных красителей Хехст 33258 (Hol.-nquist, 19'.5) и оливог.ицин (Sande et al.,1977) с применением нефлуо-ресцирутапдх контрастируюэдх агентов Актиномицяня Д (АкД) для Хехста (Родионов, 1981; Sch.veizer,198i) п дистамицттка А (ДА) для оливомицина (schv/eizer et ai.,1978); красителя акридиновый оранжевый (АО), обусловливающего дифференциальное окрашивание ДНК и РНК (Зеленин,1967), и метилового зеленого - пиро-нина по Браие. Ферментативные обработки осуществляли с применением ДККазы I, РККазы А, протеиназн К и трипсина. Для выявления ядрмякообразующях хромосом и получения дифференциальной окраски ЛЩ применяли окрашивание азотнокислым серебром по методу Хауэлла и Блока в модификации Мамаева и соавторов (Мамаев и др., 1984).

Для исследования синтеза ДНК и возможной амплификации генов в оогенезе голубя применяли метод тимздиновоЯ автора- • диографки. Отдельные ооциты и кусочки яичников инкубировали в среде для выделения ядер ооцитсв, содержащей 3Е-тимздин (20 мкСи/мл) при комнатной температуре или при 27°С. Иггкубяшш длилась от 4-х до 10-ти часов. Применялись также однократные внутримышечные инъекции 3Н-тимяцина из расчета 10 мкСи на грамм веса птицы.

Для исследования транскрипционной активности ЛЩ голубя ооцитк и кусочки япчников инкубировали в среде, содержащей ГН-урядин, как описано выпе для тимидиновой автсрадпографик.

Для исследования локализации в ЛЩ голубя умеренноповто-ряющейся консервативной последовательности, выделенной из генома лист вместе с плазмидоЗ uiiAsi и обнаруженной в геноме голубя молекулярными методами (Газарян,1984), а такхе высоко-повторяющейся последовательности, выделенной из ретчкулоцятов и эритробластов голубя и клонированной в плазмиде pi (Тарантул и др.,1973,1985), др^леняда метод ДНК/ДНК гибридизации in nitu по прописям, содержащимся в работах Голла и Маниатиса (Gall et al.,1981; Маниатис и др.,1984). Оба 3К-ДНК-зояда. были любезно предоставлены В.3.Тарантулом (Институт молекулярной генетики АН СССР) и тлели удельную активность 2х106 имп/мкн.

Измерение хромосом производили на микрофотографиях с по-

моацью курвиметра и на рксз'жах с использование;.: рисовального аппарата.

П. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ШТОГЛЧЕСКИХ МЕТАСАЗ'ШХ ХРОМОСОМ СИЗОГО ГСЛУЕЯ

Хромосомны!! набор сизого голубя содержит БО хромосом, из которых первые 6 пар - ото так называемые макрохромосомы, а остальные принадлежат к модальному классу млкрсхрсмосом (Benirschire , 1971). Подавляющее большинство микрохромосом но идентифицировано из-за чрезвычайно мелких размеров.

Митотические хромосомы голубя исследовали путем окрашивания нуклеотид-специфичными флуорохромаки Хехст 33258, связына-юдася с АТ-парами нуклеотидов, и оливсмицин, специфичным на ГЦ-пары, а также методом серебрения по Хауэллу к Блэку.

Выявлена неоднородность нуклеотидного состава разных, участков хромосом. При окрашивании ояивомицином в комплексе с не-фяуоресцирукцкм контрастирующим агентом ДА, усиливающим избирательность связывания, на концах всех хромосом обнаруживаются блоки Щ-эбогащенного гетерохроматина, особенно крупные на микрохрскосомах. При альтернативном окрашивании Хехстом таких блоков не наблюдается. В литературе нет никаких сведений о • прителомерном гетерохроматине в хромосомах Голубеобразных, и сизого голубя в частности. В хромосомах отого вида был обнаружен ТОЛЬКО прИцентрОМерНЫЙ ГеТерОХрОМаТШ! (Stock et al.,1974). Нами блоки прицентромерного гетерохроматина у голубя также были выявлены ранее (Родионов и др.,1987) с помощью метода С-ок-рашивания.

Хромосомы голубя окрашивали такуч азотнокислым серебром с цельа- выявить ядрюкообразухдае хромосомы. До недавнего времена ядрышкообразугощие хромосомы в кариотляе сизого голубя не были известны. 3 1988 году в работе Роха и дэ Лвкка'(Roch, de Lucca,1:38) была описана одна пара микрохромосом, несущих Ag(+) блоки в хромосомном наборе голубя. В нашем наследовании мы выявили две пара ядрыажообразулщях шжрохромосом. содер;ка-щих крупные Ag(+) блоки в притедсмерных районах. Эти две пары хромосом хорошо различаются по морфологии и обычно обнаруки-ваятся в метафазных пластинках одновременно.

Ш. ОСОБЕННОСТИ ЫОРСО.ЮПГЛ ЛЦ СИЗОГО ГОЛУБЯ

Для исследования Л1Д мы использовали нефиксированные ооци-т!1, из которых удавалось вручную изолировать хромосомы - от 10г мвя в диаметре до самых крупных оошгтов в яичнике взрослой сажи, а также парафиновые срезы яичников и отдельлых изолированных ядер ооцитов.

ЛЩ голубя обладалт всеми основными чертами организации, свойственными хромосомам этого типа и описанными при исследовании других вэдое птиц (Кропотоза,1934; Гагинская,1989). Размеры диплотенных бивалентов голубя превышают таковые, известные для других изученных видов птиц(Кропотова, 1934), что коррелирует с большим содержанием ДНК в геноме голубя. Ста корреляция была впервые отмечена при исследовании ЛЩ амфибий (.'.Гаозге^ог, 1980,1932) и подтвердилась при исследования ЛЩ птиц (Кропотова,1984; Гагинская, 1989). Макся ильный размер I бивалента у голубя достигает 400 ига т.

Наряду с общими с другими птица;™ характеристиками, ЛЩ голубя клеит специфические особенности, наиболее ярки»,я из которых является гэтерсмор^зм бивалентов, проявляющийся в особой организации протяженных прнтеясмерных сегментов хромосом, а такяе наличие большого числа связанных с хромое омл:ти сфер. Эти особенности явились предметом специального исследования в нашей работе.

17. ПРИТЕЛОЖРИНЗ РАЙОНЫ ЛЩ ГОЛУБЯ

Центральная, наибольшая часть как в макро-, так и в мик-робкьалэнтах, имеет типичную для ЛЩ хромомерно-петлевуэ организация. Напротив, в концевых участках хромосом не выявляются хромоморы и бокозыз пзтли, и они выглядят как равномерно плотные тя:ки (рис. 2). Хромосомная ось з таких районах обычно разделена на хроматиды. Их длина достигает 10$ у макро- и 30% у микрохрмюсом от общей длины бивалента. В ооцитах диачетром менее 500 мкм концевые отделы бивалентов имеют вид рыхлых клубков. Подобная гетер'оморфность ЛЩ была описана также у зяблика (Кропотова,1984), однако у голубя она выракена значительно сильнее. Б предварительном исследовании ЛЩ голубя концевые тякл бивалентов трактовались как конденсированные участей.хромосомных осей, транскрипция на которых подавлена (Кропотова,

1984). Неполная дековдеасация хромосом ir стадии ЛЩ и транскрипционная инертность их дистальных отделов представлялись как существенное отличие ЛЩ голубя и зяблика от ЛЩ представителей других видов птиц, а также амфибий (Кропотова,1984; Га-игасхая,1989). Однако, с чем связана эта особенность организации ЛЩ голубя и зяблика, оставалось неясным.

В результате окрапивания ЛЩ голубя флуоресцентным красителем акридилозый оранжевый мы получили зеленую флуоресценцию хромомеров и красную - боковых петель и концевых тяжей. Красная флуоресценция снималась обработкой РНКазой. Известно, что АО специфически обусловливает в комплексе с ДНК зеленое, а с РНК - красное свечение. Содержание в концевых тяжах ЛЩ РНК также подтверждается их пиронияофшглей при окраске метиловым зеленым'- дирокином. Авторадиографическое исследование показало включение меченого урэдина как в боковые петли, так и в концевые тяжи ЛЩ голубя. Из результатов наших наблюдений и экспериментов, таким образом, следует, что концевые районы ЛЩ голубя со специфической морфологией транскрипционно активны и представляпт собой гигантские петли, суперскрученные в мелких ооцитах и релаксированные в более крупных. В последнем состоянии они часто рвутся в процессе выделения и центрифугирования хромосом и приобретают вид тяхей.

В нашей работе с помощью окрашивания нуклеотид-специфич-ными флуорохрокамл Хехст S3259 и оливомицин мы получили данные, которые свидетельствуют о неоднородности нуклеотидного состаза по длине ЛЩ голубя. Более интенсивное окрашивание оли-вомицином позволяет сделать вывод об относительной обогащенно-сти ГЦ-парами нуклеотадов боковых и концевых гигантских петель .бивалентов. Этот вывод подтверждается также результатами проведенной наш гибридизации in si-tu денатурированных препаратов ЛЩ с ДНК-зондом, содержащим внсокоиовторяющиеся последова-телъносы из генома голубя, о которых известно, что они Щ-обогащены (Тарантул и др. ,1973,1985'). С эта® же районами хромосом гибркдизовались и консервативные умеренные повторы из генома мши. Полученные данные позволяют заключить, что концевые отделы ЛЩ голубя, несущие гигантские петли, соответствуют выявленным нал® блоком Щ-обогащенного гетерохроматина на концах митотических хромосом. Отсутствие выраженной поляризации

РКП-у-тгрикса по оси гигантской петли можно предположительно объяснить наличием в ее составе большого числа мелких транскрипционных единиц, считываю:цихся отдельно. Кегьзя также исключить возможность процессинга РНК-транскриптов пря ю на ДНК-матрице, описанного на примере ЛЩ амфибий (массге£ог, х9ао ), что также препятствует прогрессивному нарастанию длины дочерних РНП-фибрилл в составе одной транскрипционной единицы. Плотность материала, образующего концевые петли, по-ввдимому, очень высока, с чем, вероятно, связана их специфическая арген-тофияяя, обнаруженная как в нашем, так и в бол^е раннем исследования (Кропотова, 1984). ГЦ-обогащенность ДНК-осей этих ле-. тель такие может усиливать юс сродство к ионам серебра (С1ауа-зиега еЪ з1.,1988).

Таким образом, мы приали к заключении, что прптеломерный гетерохроматин а хромосомах сизого голубя транскрибируется но стадии ЛЩ в соотаве гигантских лригеломеряых петель со специфической морфологией РНП-матрикса.

7. СОЗРЫ В ЯДРАХ ООЦИТОВ ГОЛУБЯ

Еще одной особенности! ЛЩ голубя являются связанные с ними сферы. Аналогичные сферы можно обнаружить и лежащими отдельно от хромосом в окружающей нуклеоплазме. Некоторые сферы выглядят разномерно плотными; другие, имеющие больший диаметр (до 15 мкм) - тонкостенными, с крупной полость» внутри. В более ранних исследованиях (Кропотова,1984; Гагинская,1989) плотные сферы на ЛЩ голубя отождествлялись о белковыми телами на ЛЩ зяблика, для которых было показано их участие в образовании каряосф>еры по окончании стадии ЛЩ. Однако процесс конденсации ЛЩ у голубя не был прослежен. В тонкостенной периферической части крупных полых сфер была обнаружена ДНК. Допускалась возможность, что это - эксграхрсмосомнаэ ДНК нерибо-сомной природы (Гагинская,1989).

Наше исследование парафиновых срезов ооцитов разного диаметра показало наличие преемственности мевду плотными и крупными полыми сферами: обнаружено, что плотные сферы присутствуют в ядрах даже самых мелких из исследованных ооцитов; увеличение диаметра плотных сфер сопровождается появлением вакуолей, увеличением объема последних и их слиянием с образованием

одной крупной полости. При этом материал, образующий сферу, оттесняется к периферии. По окончании стадии ЛЩ, как это видно па срезах ядер из крупных гителлогенних ооцитов, сферы отделяются от конденсирующихся хромосом в окружаю;аую нуклесплаз-му. Предполагаемая судьба отдельно взятой сферы проиллюстрирована рисунком (1).

Нами показана прицзнтромеркая локализация опер, связанных о ЛЩ голубя. Центромеры в ЛЩ птиц точно не идентифицированы (Кропотова,1984; Гагинская, 1289), "одчако расположение сферооб-разуо.пих локусов (СОЛ), чглло которых в биваленте равно двум -по одному на кахдоа гомологе -, в ЛЩ голубя четко коррелирует с положением центромеров в митотическлх хромосомах с соответствующими порядковыми номерами. Подобная корреляция била стме-чена к в ли зяблика (Гагинская,1389). Количество сфер в одном СОЛ, как правило, не превышает 2-х, чаще всего они сливаются в единул; ь редких случаях о одним СМ бывает связано несколько сфер разного диаметра. На препаратах видно, что участок хромосомной оси, прилегающий к сфере, образован слившимися конденсированными хромомерачи. Б этом районе обнарушваотск только одна пара крупных маркерных петель со специфической морфологией РНП-матрикса.

Цитохимическое исследование выявило в составе связанных с хромосомами сфер ДНК, FHK и бежа. Окраска на РНК (АО, метиловый зеленый - пиронш»х не снималась обработкой РНКазой и исчезала только после щелочного гидролиза, как я в РНК-сод ержащях сферах на ЛЩ амфибий (Call, Callsa,19зэ). В сферах, отделившихся от хромосом Физиологически, а не вследствие манипуляций з процессе приготовления препарата, что монно вплоть на парафиновых срззах ядер ооцитов или кусочков яичников, ДНК не об-

Рис.1.

ВС

ПС

плс - плотные сферы; во -вакуолизиро-ьакныз сферы; по - полая

ctT'epa.

нарут'/шаотся.

При инкубации кусочков яичников и отдельных соцчтов в среде, содержащей меченые предшественники синтеза РНК, обнаружено пклачение в сферы аН-уридина. После инкубации в присутствии 3Н-тимидина включения не вдавлено.

Сферы аргентофпльны, однако они ие являются ядрычк&ми, так как располагаются на всех без исключения макро- и мшсроби-валентэх. В то se время, из результатов нашего исследования известно, что только две мкхрохромосомы у голубя являются яд-ркжообразую'дими. Идентифицировать ядрышкообра-утощие хромосомы на стадии ЛЩ у голубя кал не далось, так как рисунок окраски серебром всех бивалентов был одинаков. То, что метод серебрения не является эффективным для идентификации ядрыпковых организаторов на ЛЩ, показано т;кже в других исследованиях на птицах (Кропотова,1934), а такие амфибиях (Varley, Morcan, • 1978). Спещф. вескую аргентофилию сфер на ЛЩ голубя, как и в случаи гигантских концевых петель, можно, по-видимому, объяснить относительно большей концентрацией материала, образующего эти структуры.

Результаты нашего исследования сфер на ЛЩ голубя в совокупности с данными об их ультраструктуре (Гагинская,1989) позволяют заключить, что сферы формируются в результате накопления большее количеств РНП-матрикса на особых петлях, функционирующих в прицентромерных районах хромосом. Порции матрикса з виде сэров разных размеров периодически отделяются от этих петель в нутслеоплазму на протяжении всей стадии ЛЩ. Этот процесс прекращается с началом ко'зденсацпи хромосом, так что в крупных вителлогенпых ооцитах на конденсированных хромосомах сферы отсутствуют. Подобные по морфологическим и цитохимическим характеристикам сферы б или описаны на ЛЩ амфибий, а таклге других организмов; показано, что они содержат мяРЯП (Gall, Callan, 1S89).

Природа РНК, содержащейся в сфер-ах на ЛЩ голубя, пока неизвестна, однако их расположение в прицентромерных районах всех без исключения хромосом позволяет допустить, что в СОЛ может транскрибироваться часть прицентромеркого гетерохромати-на. Вопрос о значении синтеза и накопления на ЛЩ тралскриптов ДНК, содержащейся в районах гетерохроматиновых блоков, свягая

с загадкой феномена ЛЩ.

Рис. 2. Изменения ядерных структур в процессе роста ооцита. пп - прителонерные петли ЛЩ; сф - сферы; кх - конденсированные хромосомы.

У1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛЩ К ПОЛОВЫЕ ХР0:ЛШ.Ы В ОоЦЯТАХ ГОЛУБЯ

Основой для идентификации ЛЩ голубя послужили относительные длины бивалентов в ооцитах одного и того же диаметра, расположение СОЛ, маркирующих цектромеряые районы хромосом, а такке рисунок распределения петель и других маркерных структур на ЛЩ.

Нами идентифицированы все 8 макробивалентоЕ голубя, включая половой z/ff бивалент.

В более ранних исследованиях (Кропотова.1984; Кропотова, Гагинская, 1984) половой z/w бивалент в ооцитах голубя, как и других еидов птиц, был описан как унивалентная z хромосома; и хромосома при этом не обнаруживалась. Б дальнейшая данные литературы о том, что половые хромосомы у птиц спарены на стадии пахитены (Raím, Solari. 1Э86), а также подробны!' анализ морфологии оси половой ЛЩ в ооцитах курицы (Соловей и др.,1990) позволили предположить, что описанная как z-унивалент полова;/ хромосома-ЛЩ птиц представляет собой z/w бивалент. В нашей работе получены убедительные данные в пользу этого предположения, основанные на анализе структуры хромосомных осей, распо-

ложег-тя маркерных петель и СОЛ. Половой бивалент на стации ЛЩ у голубя песет 2 СОЛ, расположенные в соответствии с положением центромеров в метацентрических г и 17 хромосомах' (0а11оп, ЗгейЬигу,1966; Веп1гасМсе, 1971). ОСЬ У/ хрОМОСОМЫ-Л, ИДеНТИфицированной нами, практически полностью конденсирована; в то же'время известно, что митотическая хромосома голубя почти целиком образована гетерохрокатином (СаНоп, ВгеЛЬигу, 1966; 31еГоа, Агг1сЫ, 1971). На границе мевду о с яга 2 я "/ хромосом обнаруживаются две пары крупных маркерных петель, принадлежащих, по-видимому, соответственно ъ и 'я хромосо<..ам.

УП. КОНДЕНСАЦИЯ ХРОМОСОМ

Конденсация хромосом по окончании стадии ЛЩ начинается с укорочения и втягивания боковых петель и слияния хромомероь. Последнее происходит неравномерно по длине бивалента, а как бы блоками, которые затем сливаются мехду собой. Объединения сфер разных бивалентов и образования кариосфера, как ото было описано у зяблика (Гагинская,1972,1889; Кропотова,1984). в ооци-тах голубя мы ня наблюдали.

ЕЬВОДЦ

1. Хромосомы-ЛЩ из растущих ооцитов сизого голубя имеют характерную организацию хромосом этого типа: хромомерно-петле-вое строение, Енсокую транскрипционную активность, приуроченную к боковым петлям. Частные особенности морфологии ЛЩ голубя (большие по сравнению с доугими изученными птицами размеры; специфические структуры, связанные с хромосомами) обусловлены особенностями строения кариотипа и генома у этого вида (больнее по сравнению с другими птицами содержание ДНК в геноме, легализация блоков гетерохроматина в хромосомах).

2. Прлтело.мерный ГЦ-обогащеяпиЙ гатерохроматин, обнаруженный нами в мктотических хромосомах, на стадии ЛЩ транскрибируется в составе гигантских петель специфической морфологии.

2. Районы хрогтосоя-ЛЩ, адентифицкровашше нами как при-центромерныэ, характеризуются сложной морфо-функциональной организацией и включают беспетлевой участок конденсированной хромосомной оси, пару маркерных петель специфической морфологии и сферы.

4. Лорнирующиеся б прицентромерных районах ЛЩ сферы представляют собой форму накопления РНП-ма,трикса на особых петлях; они периодически отделяется в окружающую нуклеоплазму. На конденсированных хромосомах-ЛЩ сферы не обнар5гжива,отся.

6. В карпог/ле сизого голубя выявлены две пари ядрншкосб-разующих микрохромосом. На стадии ЛЩ ялрь."икообразую>цяе хромосомы с помощью метода серебрения не идентифицируются.

6. Идентифицированы все макробиваленты голубя, включая половой г/?; бивалент. Получены новые убедительные данные в пользу того, что половые хромосомы птиц на стадии ЛЩ образуют асимметричный бивалент.

?. Конденсация хромосом голубя по окончании стадии ЛЩ не сопровождается образованием кариосферы. как это было описано для ооцктов зяблика я других воробьиных (Гагинская,1972).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хутипазва ft.A., Кропотова Е.В., Родионов A.B., Гагинская Е.Р. Структурные и цитохимические особенности ламповых щеток голубя // Структура и функции клеточного ядра: Матер. IX Бсесоазн. симп., Черноголовка, 1937. Черноголовка: Наука, 1987. С.37.

2. Родионов A.B., Челшева Л.А., Хутинаева Г1.А., Гольцов В.А., Тарантул В.Б. Картирование умеренных повторов геномов пт;<ц методом гибридизации нуклеиновых кистот in situ. Сообщение I. Распределение консервативной последовательности Р48 по митотическим хромосомам голубя // Е сб.: Бюллетень Всессюз. НИИ раззедения и генетики жиеотных. 19S7. Выл.95. С.32.

3. Тарантул В.З.. Гольцов В.А., Родионов A.B., Чзлыкева Л.Д., Хутинаева H.A., Гагинская Б.Р., Газарян К.Г. Молекулярный и цитологический анализ кластеров умеренных повторов геномов птиц // Молекул, биология. 1989. 7.23, Бкп.2. С.481--490.

4. Тарантул В.З., Родионов А.З., Макарова И.В., Гольцов В.А., Челштва Л.А., Хутинаева М. А., Гагинская Е.Р., Газарян К.Г. Молекулярный и цитологический анализ транскрипции эеолюпи- -онно консервативных уверенно повторяющихся последовательностей геномов позвоночных // Цитология. 1989. Т.El, ^ 6.

С.610-625.

5. Хутинаева М.А., Кропотова Е.В., Гагинокая Е.Р. Особенности мор^о-функциональноЕ организации хромосом ламповых щеток сз ооцитов голубя // Цитология. 1989. Т.31, JS 10. Т. 1185— -1192.

6. Гагинская Е.Р., Коыина H.A., Кропотова Е.В., Лукина H.A., Родионов A.B., Соловей И.В., Стрельцова Е.В., Хутинаева

Г,!.А., Цветков А.Г., Челышева Л.А. Хромоеомы-ламповые щетки птиц // Матер. Ш школы-семинара по генетике и селекции животных, 10В9. Но.осибирск: Наука, 1989. С. 20.

7. (Хутинаева Ц.А., Кропотова S.B., Гагинская Е.Р.) Hutinieva

:,:.А. , Krcpotovu E.V., Gagin3kayE E.R. Lanpbrush chromosomes from the domestic pigeon oocytes // Proceedings of the 3th International Synpoaium on current problems of avian p;enetic3. Smolenice, Czechoslovakia, 19B9. P. 239-2*13 •

8. Гагинская E.i., Хутинаева U.A., Челышева .I.A., Родионов А.З. Изучение транскрипционной активности хромоеом-лампо-Еые щетки птиц методом гибридизации in situ // Молекулярные механизмы генетических процессов: Матер. 7-го Всесоюз. симпозиума. М., 1990. С.13.

9. Хутинаева U.A., Гагинская Е.Р. Окрашивание серебром мито-тических хромосом и ламповых щеток сизого голубя // Структура и функции клеточного ядра: Матер. X Всесоюз. симп., Гродно, 1990. Гродно: Наука, 19S0.

10. Соловей И.В., Хутинаева М.А., Челышева I.A., Родионов A.B., Гагинская Е.Р. Ичентифыгация и строение полового бивалента у птиц па стадии ламповых щеток // Цитология. 1990. Т.32, И 8. С.816-824.