Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Коилин-содержащие тельца в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columba livia)

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Коилин-содержащие тельца в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columba livia)"

На правах рукописи

005060198

ХОДЮЧЕНКО Татьяна Александровна

ту

КОИЛИН-СОДЕРЖАЩИЕ ТЕЛЬЦА В ЯДРАХ РАСТУЩИХ ООЦИТОВ ГОЛУБЯ СИЗОГО (COLUMBA LIVIA)

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 0 МАЙ 2013

Санкт-Петербург 2013

005060198

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории структуры и функции хромосом кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Красикова Алла Валерьевна доцент кафедры цитологии и гистологии ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Боголюбов Дмитрий Сергеевич заведующий лабораторией морфологии клетки ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор медицинских наук, профессор

Дыбан Павел Андреевич

ведущий научный сотрудник отдела

молекулярной генетики

ФГБУ НИИ экспериментальной медицины

РАМН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: ФГБУН Институт цитологии и генетики

СО РАН, Новосибирск

Защита состоится « ЩО » ЦЛСМХ 2013 года в то часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук и кандидата биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и биотехнологии, ауд. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « » ^м.ОлА^ 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ядро представляет собой структурно обособленную часть клетки, в которой содержится генетический материал и реализуются скоординированные в пространстве и во времени этапы дифференциальной экспрессии генов. По современным представлениям координация биохимических процессов в ядре достигается путем формирования не ограниченных мембранами динамичных компартментов. За счет создания специализированного микроокружения, в котором в высокой концентрации присутствуют только участники процесса, компартменты позволяют увеличить эффективность различных метаболических процессов в ядре (Dundr, Misteli, 2001; 2010; Misteli, 2007; Kumaran et al., 2008). Многие компартменты ядра представляют собой внутриядерные тельца, которые можно отличить друг от друга и от нуклеоплазмы на основании их ультраструктуры и наличия определенных маркерных компонентов (Zimber et al., 2004; Spector, 2006). К наиболее актуальным проблемам в области компартментализации клеточного ядра относят определение состава, динамики и функций различных внутриядерных доменов, выяснение механизмов их образования и поддержания их целостности (Misteli, 2007; 2009; Trinkle-Mulcahy, Lamond, 2008; Machyna et al., 2013).

На сегодняшний день описано большое количество разных типов внутриядерных телец, молекулярный состав которых подробно охарактеризован, однако об их функциях известно меньше. Активно развивающимся направлением в этой области является изучение гетерогенной группы коилин-содержащих телец, к которым относятся универсальные и наиболее хорошо охарактеризованные тельца Кахала (ТК) и тельца гистонового локуса (ТГЛ) (Nizami et al., 2010а).

Тельца Кахала - это внутриядерные домены, принимающие участие в биогенезе сплайсосомных малых ядерных и ядрышковых РНК (мяРНК, мяшРНК), которые необходимы для осуществления сплайсинга предшественников матричной РНК (пре-мРНК) и раннего процессинга рибосомной РНК (рРНК) (Gall et al., 1999). Несмотря на то, что ТК были впервые описаны более ста лет назад, их молекулярный состав и функции остаются не полностью изученными (Gall, 2000; Сioce, Lamond, 2005; Morris, 2008). Накопленные данные свидетельствуют о том, что в ТК осуществляются заключительные этапы созревания (модификации) сплайсосомных мяРНК. Для ТК соматических клеток характерны такие компоненты, как белок коилин и специфичные для ТК малые РНК (англ. - «small Cajai body-specific RNA, scaRNA» (Gall, 2000; Xie et al., 2007).

В настоящее время ведется интенсивная работа над выяснением значения формирования коилин-содержащих телец для функционирования клетки. Перспективным подходом к определению функций различных ядерных телец может служить исследование существующих в природе вариаций структурно-функциональной организации ядра (Gall, 2000; Liu et al., 2006; Bogolyubov et al., 2009). Удобную модель для такого рода исследований представляют ооциты животных с гипертранскрипционным типом оогенеза. Ядро (зародышевый пузырёк (ЗП)) такого ооцита характеризуется гигантскими размерами и высокой транскрипционной активностью хромосом, приобретающих форму ламповых щеток (ЛЩ) (Гагинская, 1989; Gall et al., 1999; Morgan, 2002; Bogolyubov, Parfenov, 2008; Gaginskaya et al., 2009). Также несомненным преимуществом модельной системы ооцит-фолликул является то, что благодаря тесной кооперации между геномами ооцита и окружающих его фолликулярных клеток, в ядре ооцита может происходить полная инактивация некоторых генов «домашнего хозяйства», таких как гены, кодирующие рРНК (Гагинская, Грузова, 1969; Гагинская, 1975; Чинь и др., 1979; Hutchison, 1987). Кроме

того, гигантский размер как самих ядер растущих ооцитов, так и различных внутриядерных структур дает возможность получать изображения с очень высоким уровнем детализации и позволяет проводить эксперименты, которые сложно или невозможно осуществить на маленьких ядрах соматических клеток (Gall et al., 2004).

Благодаря внедрению новых методик, ядра ооцитов птиц также стали использовать в качестве перспективных объектов для изучения трехмерной архитектуры генома и функциональной компартментализации ядра (Маслова, Красикова, 2011; Maslova, Krasikova, 2012). Вместе с тем, характеристика внутриядерных компартментов, участвующих в динамике компонентов аппарата транскрипции и процессинга РНК, в ооцитах взрослых самок птиц далека от завершения.

Коилин-содержащие тельца, в том числе ТК, охарактеризованы в ооцитах насекомых, амфибий и млекопитающих (Gall et al., 2004; Bogolyubov et al., 2009; Nizami et al., 20106). В то же время эти, претендующие на роль универсальных, ядерные органеллы до сих пор не были обнаружены в ядрах ооцитов птиц (Krasikova et al., 2004; 2005). Вместе с тем, ранее описанные на морфологическом уровне сферические внутриядерные структуры - так называемые «плотные шары» (ПШ) и «полые сферы» (ПС) - в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columba livid) (Хутинаева и др., 1989) претендуют на роль эквивалентов телец Кахала у птиц.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было идентифицировать и охарактеризовать молекулярный состав телец, подобных тельцам Кахала, в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columba livia).

В настоящей работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Идентифицировать в ядрах маленьких ооцитов неполовозрелых самок С. livia эквиваленты телец Кахала и телец гистонового локуса соматических клеток.

2. Проверить наличие белка коилина в составе экстрахромосомных телец («плотных шаров» и «полых сфер») в ядрах больших ооцитов на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

3. Проанализировать распределение фактора сплайсинга SR-белка SC35, малых ядерных РНК, Sm-белков, входящих в состав малых ядерных РНП, и белка симплекина в экстрахромосомных ядерных доменах в больших ооцитах на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

4. Проверить наличие белков ядрышка (Noppl40, фибрилларина и N038) в составе экстрахромосомных ядерных телец в больших ооцитах на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

5. Определить, к какому типу ядерных телец относятся экстрахромосомные «плотные шары» и «полые сферы», формирующиеся в ядрах больших ооцитов на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок С. livia.

Научная новизна работы. В данной работе впервые продемонстрирована возможность формирования экстрахромосомных коилин-содержащих телец в ядрах растущих ооцитов птиц иа стадии диплотены профазы первого деления мейоза, в отсутствие функционирующих ядрышек. Получены первые данные о молекулярном составе особых внутриядерных телец, так называемых «плотных шаров» и «полых сфер», формирующихся в ядрах больших ооцитов голубя сизого на стадии хромосом-ламповых щеток. В частности, показано, что эти тельца обогащены белком коилином, зрелыми мяРНК и связывающимися с ними Sm-белками мяРНП.

Подтверждено предположение о том, что, формирующиеся в ядрах растущих ооцитов самок голубя «плотные шары» и «полые сферы» представляют собой тельца, подобные ТК, и участвуют в биогенезе или запасании сплайсосомных малых ядерных РНП. Вместе с тем показано, что эти тельца не эквивалентны ТК или ТГЛ. Доказана

гетерогенность по молекулярному составу группы коилин-содержащих телец в ядрах ооцитов.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа имеет фундаментальную направленность. Результаты исследования расширяют имеющиеся представления о структурной и функциональной организации внутриядерных доменов, а также открывают новые аспекты в понимании процессов дифференцировки и созревания ооцитов у организмов с фолликулярным типом оогенеза.

Полученные результаты включены в курс лекций «Организация интерфазиого ядра» для студентов магистратуры биолого-почвенного факультета СПбГУ и используются при проведении практикума «Структурный и молекулярный анализ биологических систем» для студентов СПбГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 12-ой международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), международном научно-методическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008), международной конференции «Modem Microscopy Techniques in Biology and Medicine» (Санкт-Петербург, 2009), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009), международной конференции ЕМВО «Nuclear structure and dynamics» (Иль-сюр-ла-Сорг, Франция, 2009), XVI всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010), LXXV международном симпозиуме по количественной биологии «Nuclear Organization and Function» (Колд Спринг Харбор, США, 2010), 22-ой международной конференции по клеточному ядру «Wilhelm Bernhard workshop on cell nucleus» (Рига, Латвия, 2011) и на научных семинарах лаборатории структуры и функции хромосом и кафедры цитологии и гистологии.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04-01328, 12-04-01807), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (Госконтракт № 14.740.11.1189), базовой НИР СПбГУ № 1.38.66.2011 и при технической поддержке ресурсного центра «Хромас» СПбГУ.

Публикации. Материалы исследования изложены в 14 публикациях в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 193 ссылки. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста, содержат 4 таблицы и иллюстрированы 23 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ

Объектами исследования служили голубь сизый Columba livia var. domestica (отр. Columbi formes) и африканская шпорцевая лягушка Xenopus laevis (отр. Anura) В качестве материала исследования использовали ооциты, находящиеся в периоде большого роста (стадия вителлогенеза), из яичников самок, изолированные из растущих ооцитов ядра и препараты содержимого ядер ооцитов. Кроме того, материалами служили ткани печени и яйцевода голубя, а также фиксированные соматические клетки линии MDCC-MSB1 (клетки лимфобластомы курицы).

Микрохирургическое выделение ядер из ооцитов птиц и амфибий и приготовление препаратов внутриядерных структур ооцитов проводили, используя стандартные методики (Кропотова, Гагинская, 1984; Lacroix et al., 1985; Solovei et al., 1993; 1994), с некоторыми модификациями.

Таблица 1. Список первых антител, использованных в работе.

№ Название Выявляемый антиген Производители

1 R288 С-концевой домен белка коилина Andrade et al., 1991

2 H-300 С-концевой домен белка коилина человека (аминокислоты 277-576) Santa Cruz Biotechnology

3 мАТ aSC35 SR-белок SC35 Abeam

4 мАТ Y12 Симметричный диметиларгинин Sm-белков («Sm-эпитоп») Lerner et al., 1981

5 MATK121 Триметилгуанозиновый кэп мяРНК Santa Cruz Biotechnology

6 мАТ N0185 Ядерный белок N038 X. laevis Schmidt-Zachmann, Franke, 1988

7 мАТ Noppl40 Ядерный белок Noppl40 X. laevis Schmidt-Zachmann, Franke, 1988

8 мАТ 17c 12 Фибрилларин X. laevis Pollard et al., 1997

9 мАТ V22 Фосфорилированный С-концевой домен РНК-полимеразы II Проф. У. Шер (Вюрцбург, Германия)

10 мАТ HYB331-01 Двухцепочечная ДНК Abeam

11 мАТ асимплекин С-концевой домен белка симплекина человека (аминокислоты 914-1080) BD Transduction Laboratories

12 мАТ agemin2 Рекомбинантный белок человека гемин 2 Sigma

Непрямое иммунофлуоресцентиое окрашивание целых ооцитов, изолированных из ооцитов ядер, препаратов содержимого зародышевых пузырьков, тканей яйцевода, соматических клеток линии MDCC-MSB1 проводили согласно описанным методикам (Khodyuchenko et al., 2012; Krasikova et al., 2012). Список использованных в работе первых антител приведен в таблице 1. В качестве вторых антител использовали антитела, коныогированные с флуорохромом Alexa 488 или СуЗ. Для заключения использовали среду, содержащую фотопротектор (DABCO, Merck) и DAPI (1 мкг/мл) (Sigma).

Флуоресцентная гибридизация in situ. Для выявления мяРНК на препаратах содержимого зародышевых пузырьков, тканей яйцевода, соматических клеток линии MDCC-MSB1 флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) проводили без обработки РНКазой и без денатурации препаратов, согласно описанному протоколу (Frey, Matera, 1995). Для улучшения проникновения экзогенных молекул ткани яйцевода голубя инкубировали в 0,5%-ном растворе Triton XI00 на lxPBS (фосфатный буфер) в течение ночи. В качестве зонда использовали антисмысловой биотинилированный олигонуклеотид к мяРНК U7: 5-CTAAAAGAGCTGAAATCACTG-3' (Синтол, Москва) (Khodyuchenko et al., 2012). Гибридизацию проводили при комнатной температуре в течение 12-16 часов. Результаты гибридизации детектировали, используя один раунд амплификации гибридизациоиного сигнала с помощью конъюгата авидин-А1еха 488 (Molecular Probes Inc.). Препараты заключали в среду, содержащую фотопротектор (DABCO, Merck) и DAPI (1 мкг/мл) (Sigma).

Флуоресцентная микроскопия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (JICKM). Для анализа препаратов использовали универсальный флуоресцентный микроскоп Leica DM4000B (Germany, Leica Wetzlar GmbH) с программным обеспечением CW 4000 FISH (Leica Cambridge Ltd) и лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 (Germany, Leica Microsystems CMS GmbH) с программным обеспечением LAS AF (Leica Microsystems). Для

возбуждения флуорохромов использовали следующие лазеры: диодный (405 им), аргоновый (488 им) и гелий-неоновый (543 им).

Получение белкового экстракта из ядер печени голубя было проведено согласно методике Дишама и соавторов (Dignam et al., 1983).

Иммуноблотпшиг. Электрофоретическое разделение белков проводили в 10%-ном разделяющем полиакриламидном геле согласно методу, описанному Лэммли (Laemmli, 1970). Далее белки по методу Тоубила и соавторов (Towbin et al., 1979) электрофоретически переносили на нитронеллюлозные или PVDF мембраны (MP Biomedicals, LLC). В качестве вторых антител использовали антитела, коныогированные со щелочной фосфатазой (Sigma) или пероксидазой хрена (Cell Signaling). В случае фермента щелочной фосфатазы детекцию проводили, добавляя смесь, содержащую АР-буфер (50 мМ Трис-HCl рН 9,5, 120 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2), 17мкг/мкл BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат, Fennentas) и 0,33 мкг/мкл NBT (нитросиний тетразолиевый, Fermentas). В случае фермента пероксидазы хрена детекцию проводили, добавляя смесь равных объемов Lumigen ТМА-6 раствора А и Lumigen ТМА-б раствора В (GE Healthcare, UK).

Компьютерный анализ первичных последовательностей белков проводили с помощью ресурсов сети интернет (National Center for Biotechnology Information) и программного обеспечения открытого доступа BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul etal., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе впервые проведен детальный анализ экстрахромосомных ядерных телец в растущих ооцитах птиц на примере голубя сизого (С. ¡¡via). С помощью современных методик мы охарактеризовали молекулярный состав экстрахромосомных телец в ядрах ооцитов (зародышевых пузырьках, ЗП) С. livia, находящихся в периоде большого роста (стадия вителлогенеза), и сравнили их с известными РНК-содержащими тельцами ядер ооцитов других видов. Ооциты голубя, находящиеся в периоде большого роста, на стадии вителлогенеза, были разделены по размеру на три группы, коррелирующие со степенью активности ядерного аппарата. Так, термин «маленькие ооциты» в настоящей работе использовали применительно к ооцитам с ранней активацией ядерного аппарата до принятия хромосомами формы ЛЩ; термин «большие ооциты» был применен к ооцитам, находящимся на стадии хромосом-ЛЩ. Кроме того, в работе рассматривали ооциты, находящиеся на стадии формирования кариосферы, которая характеризуется почти полной инактивацией генома ооцита.

Трехмерная архитектура гигантских транскрипционно активных ядер ооцитов голубя

Детальный анализ трехмерной архитектуры ядер, изолированных из больших ооцитов половозрелых самок голубя, окрашенных специфичным к нуклеиновым кислотам флуоресцентным красителем Sytox green, с помощью ЛСКМ показал, что хромосомы-ЛЩ расположены в пространстве ядра равномерно и не связаны с ядерной оболочкой (рис. 1а). Известно, что в ядрах растущих ооцитов голубя сизого, находящихся на стадии хромосом-ЛЩ, присутствует два типа экстрахромосомных сферических телец: не содержащие вакуолей «плотные шары» (ПШ) и тонкостенные «полые сферы» (ПС). Морфология ПШ и ПС была охарактеризована ранее на свето-оптическом и ультраструктурном уровнях (Гагинская, 1989; Хутинаева и др., 1989). Окрашивание ядер ооцитов с помощью красителя Sytox green выявило интенсивную флуоресценцию в обоих типах телец. В пространстве ядра ооцита большая часть ПШ и ПС лежит свободно, не взаимодействуя с хромосомами (рис. 1а). Расположение их

внутри ядра не равномерное: тельца часто локализуются на периферии ядра, но могут быть обнаружены и в его центральной части. На начальных стадиях формирования кариосферы наблюдается группировка ПШ и ПС недалеко от конденсированных бивалентов. На препаратах микрохирургически изолированных хромосом-ЛЩ не выявлено постоянных локусов формирования ПШ и ПС на макро- или микрохромосомах, хотя иногда небольшие ПШ обнаруживали в ассоциации с половым бивалентом или терминальными районами хромосом. Результаты проведенного исследования подтверждают тот факт, что ПШ и ПС содержат большое количество нуклеиновых кислот.

Экстрахромосомные «плотные шары» и «полые сферы» в ядрах ооцитов голубя содержат РНК, по не ДНК

В предыдущих работах допускалось наличие экстрахромосомной ДНК в составе ПС в ооцитах голубя, а ПШ принимали за конденсированные микробиваленты (Хутинаева, 1990). Используя иммуноокрашивание препаратов содержимого ядер ооцитов и интактных ядер с помощью антител, специфичных к двухцепочечной ДНК, мы установили, что экстрахромосомные ядерные тельца в растущих ооцитах голубя не содержат ДНП-ось (рис. 16). В то же время, хромомеры и оси латеральных петель хромосом-ЛЩ, но не ассоциированные центромерные белковые тела, демонстрировали яркое окрашивание, представляя внутренний контроль в данном эксперименте. Яркое окрашивание ПШ и ПС красителем Sytox green, наряду с отсутствием аффинности к антителам против двухцепочечной ДНК, позволяет сделать вывод о том, что эти внутриядерные тельца являются РНК-содержащими структурами.

Белок коплип - маркерный компонент экстрахромосомпых сферических телец в ядрах ооцитов голубя

Известно, что белок коилин является одним из компонентов, характерных для телец Кахала (ТК) (Nizami et al., 2010а). Анализ доменной организации белка коилина у птиц, в сравнении с ранее охарактеризованной доменной организацией коилина у амфибий и млекопитающих (Bellini, 2000), показал, что у птиц данный белок содержит все характерные для белков-ортологов других видов домены. Наименее консервативный центральный домен коилина курицы (от 85 до 500 а.о.) несколько длиннее, чем центральный домен белка коилина человека или шпорцевой лягушки. В центральном домене белка коилина курицы найдены сигнал ядерной локализации и RG-богатый домен (от 411 до 441 а.о.), который отвечает за связывание коилина с белком SMN и рекрутирование последнего в ТК (Hebert et al., 2001; Shpargel, Matera, 2005).

В представленном исследовании для выявления белка коилина птиц были использованы два типа антител (антитела 1-2, табл. 1). Специфичность антител R288 к белку коилину птиц была проверена ранее с помощью иммуноблоттинга белкового экстракта ядер клеток печени петуха и иммунофлуоресцентного окрашивания ТК в гепатоцитах (Ochs et al., 1995). В свою очередь, специфичность антител Н-300 к коилину птиц в настоящей работе также подтверждена с помощью иммуноблоттинга на пробах белкового экстракта из ядер печени голубя. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание соматических клеток яичника голубя с помощью антител Н-300 выявило в интерхроматиновом пространстве интерфазных ядер от одного до трех ярко флуоресцирующих телец.

С целью идентификации ТК мы провели иммунофлуоресцентный анализ распределения белка коилина в ядрах больших ооцитов голубя на стадии хромосом-ЛЩ. Этот подход позволил установить, что матрикс экстрахромосомных телец аккумулирует белок коилин. Наблюдаемая картина флуоресценции ПШ и ПС после проведения иммунофлуоресцентного окрашивания микрохирургически изолированных из ооцитов голубя и фиксированных интактных ядер с помощью антител R288 и Н-300 (рис. 1в)

а Ч*"- f « f VVf\rU 4 * ~ J Jr, • \ Ji; 4 6 \ ч ' Л L -vf Г9Ч r J f'r- . / * Yi:, • ' • . X ' ^ ■ дцДНК KOII'IIIH ___

8

Sm-белки мяРНП

КОИ.I Mil — KOIIJIIIll

Рисунок 1. Внутриядерные структуры ооцитов голубя, выявленные с помощью окрашивания флуоресцентным красителем Sytox green, специфичным к нуклеиновым кислотам (а), антителами против двухцепочечной ДНК и белка коилина (б), антителами против белка коилина (в), антителами против Sm-коровых белков малых ядерных РНП и белка коилина (г). Изображения получены с помощью ЛСКМ. Стрелками показаны плотные шары, головками стрелок - полые сферы. Масштабные линейки - 50 мкм.

полностью совпадает с картиной флуоресценции экстрахромосомных сфер на препаратах диспергированного содержимого ЗП голубя. При этом коилин не выявлялся на хромосомах-ЛЩ и в центромерных белковых телах, что соответствует ранее опубликованным данным (Krasikova et al., 2004). На основании измерений интенсивности флуоресценции различных ядерных структур после иммуноокрашивания ядер и целых ооцитов с помощью антител против коилина, мы установили, что концентрация белка коилина в ПШ в среднем в четыре раза выше, чем в нуклеоплазме ооцита.

Полученные результаты позволяют утверждать, что в ядрах растущих ооцитов голубя на стадии хромосом-ЛЩ формируются коилин-содержащие тельца, а именно «плотные шары» и «полые сферы». При этом коилин можно считать молекулярным маркером ПШ и ПС в ядрах больших растущих ооцитов голубя на стадии хромосом-ЛЩ и использовать для идентификации этих телец.

Я ТМГ-кэпированная мяРНК

КОІІЛІІН

V "

■ .о N;

Л Я'

о о о о О

КОІІЛІ1II Sm-белки совмещение

мяРНП

о О о

О О

В КОИЛИН в'мяРНК совмещение

• © ©

——

Рисунок 2. Распределение малых ядерных РНК (мяРНК) в ядрах растущих ооцитов голубя. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание интактных зародышевых пузырьков (а) и изолированных ядерных структур (б, в) с помощью антител против триметилгуанозинового кэпа мяРНК (а, в-в') или 8т-коровых белков малых ядерных РНП (б-б') и белка коилина. Стрелками показаны плотные шары. Масштабные линейки: а - 50 мкм; б, в - 10 мкм.

Количество и размеры экстрахромосомных внутриядерных телец в ооцитах голубя

Анализ количества и линейных размеров экстрахромосомных ПШ и ПС был проведен на 57 ядрах, изолированных из ооцитов разного размера (начиная от стадии хромосом-ЛЩ и заканчивая стадией конденсации бивалентов). Диаметр проанализированных ядер варьировал от 100 до 287 мкм, а число выявленных экстрахромосомных телец составляло от 1 до 34 штук на ядро. При этом в разных ядрах диаметр ПШ и ПС варьировал от 1 до 10 мкм и от 5 до 28 мкм, соответственно. Диаметр ПШ, не содержащих вакуолей или полостей, был обычно меньше диаметра ПС. Интересно отметить, что среди проанализированных особей встречались самки с большим количеством экстрахромосомных внутриядерных телец (от 18 до 34) в растущих ооцитах, а также самки только с одним экстрахромосомным тельцем на той же стадии оогенеза.

Обнаруженная вариабельность общего числа коилин-содержащих телец в ядрах растущих ооцитов голубя у разных самок может быть связана с функциональным состоянием молекулы коилина, а именно уровнем фосфорилирования его С-концевого домена. Показано, что сайты, подвергающиеся фосфорилированию в С-концевом домене белка коилина, участвуют в контроле общего числа ТК в клетке (Shpargel et al., 2003; Toyota et al., 2010). Митотическое гиперфосфорилирование коилина, совпадающее с разборкой ТК, коррелирует с уменьшением взаимодействий между молекулами коилина. В то же время, экспрессия фосфатазы индуцирует появление ТК. Более того, белок коилин у разных видов имеет разный потенциал к регуляции числа ТК в клетке (Shpargel et al., 2003). Вероятно, потенциал регуляции функций белка коилина птиц за счет фосфорилирования С-концевого домена относительно высокий.

Рисунок 3. Внутриядерные тельца в растущих ооцитах голубя разных стадий развития. В ядрах ооцитов на стадии хромосом-ламповых щеток в яичниках половозрелых самок коилин-содержащие тельца не аккумулируют белок симплекин (а). В ядрах ооцитов неполовозрелых самок присутствуют симплекин-содержащие тельца (эквиваленты ТГЛ; желтая стрелка) и коилин-содержащие тельца (эквиваленты ТК; белая стрелка) (б). В ядрах клеток линии МБСС-М5В1 формируются тельца, содержащие симплекин (в) и мяРНК Ш (г) (желтые стрелки). Эквиваленты ТК (стрелки) в ядрах маленьких ооцитов неполовозрелых самок голубя аккумулируют белки коилип (д) и гемин 2 (д'). Ядрышки (головка стрелки) и коилин-содержащие тельца (стрелка) в ядрах растущих ооцитов неполовозрелых самок голубя (е-е"). Масштабные линейки: а - 50 мкм, б, в, г, д"-10 мкм, е"— 25 мкм.

Обозначения

• ядрышко • плотный шар

• тельце, содержащее О полая сфера

симплекин

© тельце, содержащее У хромосомы-ламповые щетки

Ч. коилин и гемин 2 л

диспергированы ы й хроматин * конденсированный бивалент

Рисунок 4. Схема организации внутриядерных структур во время роста ооцитов в яичнике самок Columba livia. а - ооцит, находящийся в периоде малого роста; б — ооцит на стадии хромосом-ламповых щеток; в - ооцит на начальной стадии формирования кариосферы (подробные обозначения приведены на рисунке; соотношение размеров ядер ооцитов не соблюдено).

Экстрахромосомные содержащие коилин тельца в ядрах ооцитов голубя накапливают компоненты малых ядерных РНП, но не фактор сплайсинга SC35

Анализ распределения компонентов аппарата сплайсинга, а именно мяРНП и SR-белка SC35, в ядрах ооцитов голубя проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Присутствие характерных для ТК мяРНП в коилин-содержащих внутриядерных тельцах (ПШ и ПС) проверяли на основании иммуноокрашивания с помощью антител Y12 против симметричного диметиларгинина Sm-белков мяРНП и антител К121 против триметилгуанозинового (ТМГ) кэпа зрелых мяРНК (табл. 1). Специфичность этих антител к соответствующим белкам птиц была проверена ранее с помощью иммуноблоттинга (Красикова, 2007). Результаты иммунофлуоресцентного анализа продемонстрировали, что ПШ и ПС, как и РНП-матрикс простых латеральных петель и гигантских терминальных петель хромосом-ЛЩ голубя, аккумулируют Sm-белки мяРНП (рис. 1г, 26'). При этом латеральные петли хромосом-ЛЩ представляют собой сайты активной транскрипции, где происходит котранскрипционный процессинг образующейся РНК (обзор: Gaginskaya et al., 2009).

Аналогичные результаты были получены и при исследовании распределения мяРНК. Подобно Sm-белкам мяРНП, ТМГ-кэпированная мяРНК также была локализована в ПШ, ПС и РНП-матриксе латеральных петель (рис. 2а, в'). Таким образом, в коилин-содержащих тельцах ядер ооцитов голубя присутствуют зрелые мяРНК, прошедшие цитоплазматический этап процессинга, и связывающиеся с ними коровые Sm-белки мяРНП.

Известно, что белки гемины (гемин 2, гемин 3, гемин 4, гемин 5, гемин 6, гемин 7, гемин 8) вместе с белком SMN являются частью большого молекулярного комплекса, играющего важную роль в цитоплазматической сборке U мяРНП (Kolb et al., 2007).

Уменьшение уровня белков SMN, i емина 2, гемипа 3 и гемина 4 независимо подавляет сборку U мяРНП, уменьшая эффективность сборки РНП-частиц в несколько раз (Shaw et al., 2008). Гемипы преимущественно колокалпзуются с белком SMN в ТК и цитоплазме. В представленной работе с помощью иммуноокрашивання нам удалось установить, что матрикс ПШ и ПС не аккумулирует белок гемии 2.

В свою очередь, двойное иммунофлуоресцентное окрашивание интактных ядер ооцитов с помощью антител против коплииа и фактора сплайсинга SC35 показало, что SR-белок SC35 накапливается только в хромосомах-ЛЩ, но не в матриксе коилин-содержащих телец (ПШ и ПС). Таким образом, отсутствие в ПШ и ПС одного из ключевых компонентов кластеров иптерхроматиповых гранул (КИГ) позволяет говорить о том, что экстрахромосомные сферы не являются эквивалентами КИГ или SC35-доменов соматических клеток. Кроме того, в отличие от сложных коилин-богатых телец в ооцитах шпорцевой лягушки или домового сверчка (Gall et al., 2004; Stepanova et al., 2007), ПШ и ПС в ооцитах голубя не содержа! в своем матриксе или внутри вакуолей никаких включений, накапливающих фактор сплайсинга SC35.

Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител V22 против гиперфосфорилированиой формы РНК-полнмеразы II препаратов содержимого ядер ооцитов голубя показало, что РНК-нолимераза II локализуется, как и ожидалось, в осях латеральных петель хромосом-ЛЩ. Помимо этого наблюдалось слабое связывание антител V22 с ПШ и поверхностью ПС, Х01Я не ясно, обусловлено ли это связывание наличием РНК-нолимеразы II в матриксе этих структур. Действительно, РНК-нолимераза II присутствует в больших количествах в нуклеоплазме ооцита, и может налипать на внутриядерные структуры при их мнкроизоляции (Doyle et al., 2002).

Экстрахромосомные содержащие коилин тельца в ядрах ооцитов голубя не эквивалентны тельцам гиспюнового локуса

Наличие коилипа и мяРНК характерно как для ТК, так и для телец гистонового локуса (ТГЛ), по крайней мере, в определенных типах клеток (Nizami, Gall, 2012), ТГЛ принимают участие в процессинге З'-коина пре-мРНК гистоиов. Для того чтобы определить, являются ли ПШ и I1C аналогами ТГЛ, в данной работе проанализировали распределение некоторых характерных для ТГЛ компонентов, а именно белка симплекина и мяРНК U7 (Wu, Gall, 1993; Sullivan et al., 2009).

Симплекин представляет собой чемпературно-чувствигельный компонент фактора, необходимого для З'-нроцессинга ире-мРНК гистоиов (Kolev, Steitz, 2005; Millevoi, Vagner, 2010) и считается одним из маркерных компонентов ТГЛ (Sullivan et al., 2009). Специфичность антител против симплекина к соответствующим белкам птиц была проверена с помощью иммуноблоттпнга. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов содержимого ЗП голубя с помошыо антител против симплекина и коилина не выявило никакого накопления белка симплекина в экстрахромосомиых коилин-содержащих тельцах (ПШ и ПС) (рис. За). При этом оказалось, что РНП-матрикс латеральных петель хромосом-ЛЩ обогащен данным белком. Симплекин, будучи общим компонентом двух различных комплексов разрезания, участвует как в процессинге пре-мРНК гистоиов, так и в пропессннге остальной пре-мРНК (Sullivan et al. 2009; Millevoi, Vagner, 2010), и поэтому обнаруживается в РНП-матриксе латеральных петель. В то же время, симплекин-содержащие тельца выявлялись в соматических клетках яичника голубя и клетках линии MDCC-MSB1, использованных в качестве контроля. Эти тельца, по-видимому, представляют собой активно функционирующие ТГЛ (рис. Зв).

Наличие мяРНК U7 в ПШ и ПС проверяли па препаратах содержимого ЗП голубя с помощью флуоресцентной ДНК/РНК in situ гибридизации (FISH) с зондом к мяРНК U7. Олигоиуклеотидный зонд был подобран в соответствии с данными по расшифровке

последовательности гена мяРНК U7 курицы (Frey, Matera, 1995; Marz et al., 2007). В контрольных экспериментах на ткани топкого кишечника голубя и культуре соматических клеток курицы обнаружены от одного до двух внутриядерных доменов, накапливающих мяРНК U7 (рис. Зг). В то же время ни РНК ПШ, ни РНК ПС из ядер ооцитов голубя не гибридизовалась с олигонуклеотидным зондом к мяРНК U7.

Более того, в недавних исследованиях было показано, что кластер генов гистонов не транскрибируется на хромосомах-ЛЩ у курицы, а в ЗП ооцитов поздних стадий развития курицы (Gallus gallus domesticas), перепела (Coliirni.v coliirnix japónica) и зяблика (Fringilla coelebs) не формируется сколько-нибудь заметное ТГЛ (Krasikova et al., 2012). На основании результатов сравнительного анализа карпотппов курицы и голубя (Deijusheva et al., 2004) с высокой вероятностью можно ожидать, что кластер генов гистонов в геноме голубя располагается на одной из макрохромосом, по-видимому, на хромосоме 1. При исследовании пространственного распределения коилии-содержащих телец и хромосом-ЛЩ в целых ЗП голубя никаких ассоциаций макрохромосом 1 или 2 с коилин-содержашпми тельцами не обнаружено. Полученные данные таким образом не подтверждают высказанную ранее гипотезу о существовании на хромосомах-ЛЩ определенною локуса образования экстрахромосомных сфер (Хутинаева, 1990). Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что ПШ и ПС не являются эквивалентами ТГЛ в ядрах растущих ооцитов голубя.

Экстрахромосомные содержащие коилнп тельца в ядрах ооцитов голубя не накапливают белков ядрышек

Многочисленные исследования показали, что в коилнн-содержаших тельцах ооцитов амфибий концентрируются ядрышковые белки, такие как белок Noppl40, взаимодействующий с коилином, основной белок C/D мяшРНП фибрилларин, который участвует в метилировании РНК, и основной фактор сборки рибосомпых субчастиц белок N038 (Bellini, 2000; Kiss et al., 2002; Gall et al., 2004). Для того чтобы выяснить, рекрутируют ли коилин-содержашие тельца в ооцитах голубя данные белки, было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание содержимого ЗП с помощью антител, специфичных к фибрилларину, белку Noppl40 и белку N038 (табл. 1). В этих экспериментах ни ПШ, ни ПС не окрашивались ни одним из перечисленных антител. Вместе с тем, используемые в работе антитела против белков ядрышек были ранее успешно применены для детекции ядрышек в соматических клетках птиц (Красикова, 2007). Таким образом, экстрахромосомные тельца (ПШ и ПС) в ядрах растущих ооцитов голубя не содержат ядрышковых белков Noppl40, фибрилларина и N038. Это свидетельствует о том, что внутриядерные коилин-содержащие тельца в больших ооцитах голубя не представляют собой остаточные инактивированные ядрышки.

Внутриядерные тельца в ооцитах неполовозрелых самок голубя

Как и в соматических клетках, в ядрах маленьких ооцитов (размер ядра около 20 мкм), находящихся в периоде большою роста, в яичнике трехнедельных самок голубя присутствуют ядрышки (рис. Зе-е"). Представлялось интересным проверить, формируются ли в таких ооцитах тельца Кахала (ТК) и тельца гистоиового локуса (ТГЛ). Полученные результаты позволяют говорить о том, что в ядрах маленьких ооцитов голубя присутствуют эквиваленты канонических ТК и ТГЛ, которые содержат основные компоненты данных типов телен. Так, эквиваленты ТК в маленьких ооцитах голубя содержат белки коилин и гемии 2 (рис. Зд-д"), тогда как эквиваленты ТГЛ содержат характерный для них белок симплекин; две структуры не колокализуются друг с другом (рис. 36).

На рисунке 4 представлена сравнительная схема организации маленьких ооцитов в яичнике неполовозрелых самок и больших ооцитов в яичнике половозрелых самок. Маленькие ооциты неполовозрелых самок содержат эквиваленты ТК и эквиваленты

ТГЛ, а также ядрышки (рис. 4а). По мере созревания ооцита в нем исчезают симплекин-содержащие тельца (рис. 46, в). В результате, большие ооииты половозрелых самок содержат только накапливающие белок коилнн внутриядерные тельца (ПШ и ПС) (рис. 46). В ядрах ооцитов маленького размера (менее 100 мкм в диаметре) у половозрелых самок отсутствуют крупные коилин-содержашие «полые сферы» с вакуолью, которые часто встречаются в ооцитах большого размера, в особенности на начальной стадии формирования кариосферы (рис. 4в). У голубя, «канонические» ТК, формирующиеся в ядрах маленьких ооцитов, во время роста ооцита, скорее всего, исчезают, а вместо них появляются коилин-содержашие тельца другого типа, которые постепенно увеличиваются в размерах и количестве.

Сравнение «плотных шаров» и «полых сфер» ядер ооцитов голубя с известными коилин-содержащими тельцами зародышевых пузырьков

До настоящего времени ТК и ТГЛ в ядрах ооцитов птиц ие были охарактеризованы. Информация о молекулярном составе ядерных телец в ооцитах птиц была ограничена работами о цен громерных белковых гелах (Krasikova et al., 2004; 2005). В представленной работе с использованием ряда современных методик в ядрах вителлогепных ооцитов в яичниках половозрелых самок голубя сизого идентифицированы экстрахромосомпые коилин-содержашие тельца, которые морфологически представлены «плотными шарами» и «полыми сферами». Согласно полученным данным, ПШ и ПС имеют сходный молекулярный состав и аккумулируют белок коилнн, ТМГ-кэпированные зрелые мяРНК и Sin-белки мяРНП, но не SR-белок SC35 (табл. 2). Гетерогенная по молекулярному составу группа телец, объединенная наличием белка коилипа, включает в себя тельца Качала, тельца гистонового локуса и так называемые «жемчужины» (англ. - "pearls") (Nizami, Gall, 2012). Полученные данные доказывают, что охарактеризованные коилин-содержащие тельца в ядрах поздних ооцитов С. livia не -эквивалентны ТК, поскольку не содержат некоторых ключевых компонентов ТК, а именно белков фнбрплларина и гемина 2.

Анализ распределения основных компонентов ТГЛ в ядрах растущих ооцитов голубя показал, что ни ПШ, ни ПС не аккумулируют белок симплекин и мяРНК U7, и, таким образом, представляют собой структуры, отличные от ТГЛ ооцитов лягушки поздних стадий развития (табл. 2). Для коилин-содержащих ядерных телец, не эквивалентных ТК или ТГЛ, предложен термин «тельца, подобные тельцам Кахала» (англ. - "CB-like bodies"). Выявленные особенности молекулярного состава ПШ и ПС позволили нам отнести исследуемые сферические тельца в ооцитах голубя к группе телец, подобных тельцам Кахала.

По своей морфологии, коилин-богатые ПШ и ПС из зрелых ооцитов голубя сильно напоминают «кольценодобные» (англ. - "ring-like") или «серпоподобные» (англ. -"crescent-shaped") коилин-богатые «жемчужины», описанные недавно в ооцитах Xenopus (Nizami et al., 2010b; Nizami, Gall, 2012). Более того, при сравнении молекулярного состава ПШ и ПС с «жемчужинами» видно, что оба тина телец обогащены коилином, но не накапливают белок симнлекин или мяРНК U7 (табл. 2). Однако в отличие от экстрахромосомных коилии-богатых телец ооцитов голубя, коилин-богатые «жемчужины» в ооцитах лягушки формируются только в ассоциации с определенными локусами хромосом и не содержат снлайсосомиых мяРНК (Nizami, Gall, 2012). Таким образом «жемчужины» не эквивалентны ПШ и ПС.

Результаты проведенного исследования поднимают вопрос о классификации коилин-содержаших телец, описанных в ооцитах и соматических клетках животных разных таксономических групп. В настоящее время не совсем понятно, относятся ли охарактеризованные ранее тельца, содержащие белок коилнн и мяРНК, к ТК или к ТГЛ, или представляют собой особый тип ядерных телец.

Таблица 2. Сравнение молекулярної о состава содержащих коилин ядерных телец в ооцитах африканской шпорцевой лягушки н в оошггах голубя сизого поздних стадий

развития.

Тельца гистоновою локуса в поздних ооцитах Xenopus laevisа «Жемчужины» в ядрах ооцигов Xenopus laevis 6 Коилин-содержанше плотные шары и полые сферы в больших ооцитах Columba liria

Наличие на хромосомах локусов формирования телец Да Да Нет

РНК + + +

ДНК - - -

Коилин + + +

ТМГ-кэпированные мяРНК + - +

8т-белкн мяРНК + -/+ +

мяРНК 177 + - -

Симплекии + - -

Фактор сплайсинга вС35 +/- 1 le определено -

РНК-полимераза II + - -/+

Фибрилларнн + + -

Белок 1Чорр140 + 1 le определено -

Белок N038 + I le определено -

в соответствии с опубликованными данным» (VVu, Gall, 1993; VVu et al., 1994; Gall et a!., 1999; Gall et al., 2004; Nizami et al., 2010 a, b).

б- в соответствии с опубликованными данными (Nizami, Gall, 2012).

Особенности модульной организации экстрахромосомиых содержащих коилин телец в ядрах ооцитов голубя

Следует подчеркнуть, что характерной особенностью оогенеза птиц, в том числе голубя сизого, является отсутствие функционирующих ядрышек в растущих ооцитах у половозрелых самок (Greenfield, 1966; Гагинская, Грузова, 1969, 1975; Гагинская, 1972, 1975). В представленной работе мы впервые продемонстрировали, что тельца, принадлежащие классу телец, подобных ТК, могут формироваться в транскрипционно активном ядре и в отсутствие ядрышек.

К настоящему времени известно достаточно большое количество белков, принадлежащих как ядрышкам, так и ТК, так как показано, что ТК принимают участие в биогенезе мяшРНК. Более тою, в малых специфичных для ТК РНП (англ. - "scaRNPs"), содержатся некоторые белки мяшРНП, в частности, фибрнлларин (Matera, Shpargel, 2006; Lemm et al., 2006; Kaiser et al., 2008; Shaw et al., 2008). Результаты проведенного исследования убедительно демонстрируют, что в ядрах ооцигов голубя, как в ПШ, так и в ПС отсутствуют белки ядрышек (а именно Noppl40, N038 и фибрилларнн). Данный факт можно объяснить тем, что из-за инктивапнн ядрышкового организатора механизм процессинга рРНК в ядре неактивен. Отсутствие фибрилларина, одного из основных компонентов C/D-мяшРНП и scaPHn. необходимого для направленного 2'-0-метилирования мяРНК (Galardi el al., 2002; Jády et al., 2004), в составе РНП-частиц, накапливающихся в ПШ и ПС в ЗП голубя, представляет особый интерес. До сих пор не ясно, как осуществляется модификация снлайсосомных мяРНК в ядрах растущих ооцитов голубя при наличии в них телек, принадлежащих труппе ТК, в которых не

накапливается белок фибрилларип. Суля но отсутствию гемина2 в составе ПШ и ПС, в них с большой долей вероятности отсутствует и белок SMN. Однако, высокая концентрация частично зрелых мяРНК (но не мяРНК U7) и ассоциированных коровых белков мяРНП в этих тельцах свидетельствует о том, что в ПШ и ПС могут происходить определенные этапы биогенеза или рециклирования мяРНК.

Наблюдаемые различия в молекулярном составе ПШ и ПС ооцитов голубя и ТК соматических клеток животных поднимаю! актуальные вопросы, связанные с модульной организацией телец, принадлежащих группе ТК. В настоящее время в ТК выделяют несколько молекулярных модулей, участвующих в различных путях процессинга РНК. Среди них выделяют модуль мяРНП, модуль мяшРНП/всаРНП, а также модуль, содержащий компоненты теломеразы (Lemm et al., 2006; Matera, 2006; Matera, Shpargel, 2006). На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой во внутриядерных обогащенных белком коилином тельцах в ооцитах голубя поздних стадий развития отсутствует молекулярный модуль, отвечающий за биогенез и функционирование мяшРНП/8саРНП, что в условиях ооцита подтверждает постулируемую многими авторами модульную организацию ТК.

В представленной работе впервые сообщается о формировании в растущих ооцитах птиц ядерных телец, обогащенных белком коилином. По-видимому, образование телец, подобных тельцам Кахала, в ядрах ооцитов голубя сизого происходит по принципу самоорганизации и может служить для запасания компонентов, необходимых для ранних стадий эмбриогенеза. Можно заключи'!ь, что растущие ооциты С. livia, в которых присутствуют тельца, подобные ТК, и при этом выключается ЯОР, являются новой перспективной моделью для исследования механизмов формирования коилин-содержащих телец и понимания их функций.

ВЫВОДЫ

1. В маленьких ооцитах неполовозрелых самок голубя сизого (Columba livia) присутствуют тельца, содержащие белки коилнп и гемин 2 (эквиваленты телец Кахала), и тельца, содержащие белок снмплекпн (эквиваленты телец гистоновго локуса).

2. В транскрипционпо активных ядрах больших ооцитов, находящихся на стадии хромосом-ламповых щёток, половозрелых самок голубя экстрахромосомные «плотные шары» и «полые сферы», но не другие внутриядерные структуры, содержат белок коилин.

3. Содержащие коилнп ядерные тельца («плотные шары» и «полые сферы») в растущих ооцнгах, находящихся па стадии хромосом-ламповых щёток, половозрелых самок голубя накапливают зрелые малые ядерные РНК и связывающиеся с ними Sm-белки мяРНП, но не фактор сплайсинга SC35.

4. Содержащие коилин ядерные тельца в растущих ооцитах голубя, находящихся на стадии хромосом-ламповых щёток, не накапливают белок симплекин и малую ядерную РНК U7 и таким образом не являются эквивалентами телец гистонового локуса.

5. В ядрах растущих ооцитов половозрелых самок голубя, находящихся на стадии хромосом-ламповых щёток, эксграхромосомпые содержащие коилин тельца («плотные шары» и «полые сферы») формируются в отсутствие ядрышек и не накапливают белков ядрышка Noppl40, фибрилларина и N038.

6. Формирующиеся в ядрах растущих ооцитов самок голубя «плотные шары» и «полые сферы» представляют собой тельца, подобные тельцам Кахала, и участвуют в биогенезе или запасании малых ядерных РНП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Khodyuchenko Т., Gaginskaya Е., Krasikova Л. Non-canonical Cajal bodies form in the nucleus of late stage avian oocytes lacking functional nucleolus // Histochemistry and Cell Biology. 2012. V. 138. № l.P. 57-73.

2. Krasikova Л., Khodyuchenko Т., Maslova Л., Vasilevskaya E. Three-dimensional organisation of RNA-processing machinery in avian growing oocyte nucleus // Chromosome Research. 2012. V. 20. № 8. P. 979-994.

3. Ходюченко T.A., Красикова Л.В. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия как оптимальный метод исследования внутриядерных доменов на примере канонических телец Кахала из ядер ооцитов птиц // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине / Усанов Д. А. (ред.). Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 2012. С. 154-156.

Тезисы:

4. Khodyuchenko Т., Krasikova Л. Extrachromosoma! intranuclear bodies in pigeon oocytes of different stages of development // Сборник трудов 22-oii международной конференции «Wilhelm Bernhard workshop on the cell nucleus», Рига, Латвия. 2011. С. 88.

5. Krasikova A., Khodyuchenko Т., Maslova Д., Kulikova T. Coilin containing nuclear organelles with unusual molecular composition in late-stage oocytes of birds // Сборник тезисов «4th Conference on Nuclear Structure and Dynamics», Авиньон, Франция. 2011. С. 54.

6. Khoduchenko Т., Krasikova Д., Gaginskaya E. Identification of Cajal bodies in pigeon (Columba livid) oocyte nucleus with inactivated nucleolar organizer // Сборник трудов 75-ой международной конференции «Nuclear Organization and Function», Колд Спринг Харбор, США. 2010. С. 122.

7. Ходюченко Т.А., Красикова Д.В., Гагинская Е.Р. Телыш Кахала в ядрах ооцитов голубя сизого (Columba livia) с инактивированным ялрышковым организатором // Сборник трудов XVI всероссийского симпозиума «Структура и функции клеточного ядра» / Цитология (РАН). 2010. Т. 52, № 8. С. 688.

8. Krasikova A., Khodyuchenko Т., Vasilevskaya Е., Gaginskaya Е. Germinal vesicles with different activity of housekeeping genes - advantageous model to study the determinant variations in nuclear body formation // Сборник трудов международной конференции «EMBO Nuclear structure and dynamics», Иль-сюр-ла-С'орг. Франция. 2009. С. 011.

9. Ходюченко Т.А., Красикова Д.В., Гагинская Е.Р. Идентификация и характеристика молекулярного состава телец Кахала в ядрах ооцитов голубя сизого (Columba livia) // Материалы международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, Россия. 2009. С. 159-160.

10. Khoduchenko Т., Krasikova Д., Gaginskaya Е. RNЛ-containing intranuclear bodies in avian growing oocytes // Материалы международной конференции «Modem Microscopy Techniques in Biology and Medicine», Санкт-Петербург. Россия. 2009. С. 12.

11. Krasikova Д., Vasilevskaya Е., Khoduchenko Т., Maslova Д., Gaginskaya Е. Functional link between the formation of various intranuclear domains and transcriptional activity of defined genetic loci // Материалы международной конференции «Modem Microscopy Techniques in Biology and Medicine», Санкт-Петербург, Россия. 2009. С. 15-16.

12. Ходюченко Т.А., Красикова А.В., Гагинская Е.Р. Исследование локализации мяРНК U7 в ядрах ооцитов шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) и тритона Карелина (Trituras cristatus karelinii) II Сборник тезисов международного научно-методического семинара: «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем», Санкт-Петербург, Россия. 2008. С. 44-45.

13. Красикова Д., Маслова А., Ходюченко Т., Василевская Е., Гагинская Е. Трехмерная топография хромосом-ламповых щеток в ядрах растущих ооцитов птиц и амфибий // Сборник тезисов международного научно-методического семинара: «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем», Санкт-Петербург, Россия. 2008. С. 20-21.

14. Ходюченко Т.А., Красикова Д.В., Гагинская Е.Р. Исследование телец Кахала в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columbia livia) // Сборник тезисов 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущино, Россия. 2008. С. 60.

Подписано в печать 06.05.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10617Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии И здательетва Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ходюченко, Татьяна Александровна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

04201358867

ХОДЮЧЕНКО Татьяна Александровна

КОИЛИН-СОДЕРЖАЩИЕ ТЕЛЬЦА В ЯДРАХ РАСТУЩИХ ООЦИТОВ ГОЛУБЯ СИЗОГО (COLUMBA LIVIA)

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат биологических наук, доцент А.В. Красикова

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

Оглавление

Введение 6

1. Обзор литературы 12

1.1. Внутриядерные домены 12

1.1.1. Компартментализация внутриядерных процессов в

пространстве ядра 12

1.1.1.1. Ядрышко 14

1.1.1.2. Кластеры интерхроматиновых гранул 16

1.1.1.3. Ядерные РМЬ-тельца 17

1.1.1.4. Ядерные тельца, содержащие белки группы Ро1усошЬ 18

1.1.1.5. Ядерные тельца, содержащие белок 5 3 ВР1 18

1.1.1.6. Тельца, содержащие факторы процессинга 3' -конца РНК 19

1.1.2. Динамика внутриядерных компонентов 19

1.1.3. Самоорганизация внутриядерных доменов 23

1.2. Тельца Кахала 26

1.2.1. Коилин и тельца Кахала 26

1.2.2. Молекулярный состав и модульная организация телец Кахала 30

1.2.2.1. Факторы сплайсинга РНК 30

1.2.2.2. Малые РНК ядрышек и РНК, специфичные для телец Кахала 34

1.2.2.3. Дополнительные компоненты телец Кахала 35

1.2.2.4. Участие коилина в поддержании целостности телец Кахала 37

1.2.3. Динамика телец Кахала 38

1.3. Тельца гистонового локуса 40

1.3.1. Молекулярный состав телец гистонового локуса в

соматических клетках 41

1.3.2. Механизм формирования телец гистонового локуса 42

1.3.3. Взаимоотношения телец гистонового локуса с

тельцами Кахала 45

1.4. Внутриядерные структуры ооцитов 46 1.4.1. Типы оогенеза 46

1.4.2. Ядро растущего ооцита 50

1.4.2.1. Транскрипционно неактивный ядерный аппарат 52

1.4.2.2. Транскрипционно активный ядерный аппарат 53

1.4.2.3. Внутриядерные тельца в ооцитах птиц 57

2. Материалы и методика 62

2.1. Объекты и материал исследования 62

2.2. Микрохирургическое выделение ядер из ооцитов птиц 62

2.3. Приготовление препаратов внутриядерных структур из

ооцитов птиц и амфибий 64

2.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание целых ооцитов 65

2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер ооцитов птиц 66

2.6. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов

содержимого ядер ооцитов 68

2.7. Флуоресцентная гибридизация in situ 69

2.8. Получение белкового экстракта из ядер клеток печени голубя 70

2.9. Иммуноблоттинг 70

2.10. Флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия 72

2.11. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Компьютерная обработка изображений и морфометрический анализ 72

2.12. Компьютерный анализ первичных последовательностей белков 73

3. Результаты 74

3.1. Трехмерная архитектура гигантских транскрипционно активных

ядер ооцитов голубя сизого 74

3.2. Экстрахромосомные «плотные шары» и «полые сферы» в ядрах ооцитов голубя содержат РНК, но не ДНК 79

3.3. Количество и размеры экстрахромосомных внутриядерных

телец в ооцитах голубя на стадии хромосом типа ламповых щеток 81

3.4. Белок коилин-маркерный компонент экстрахромосомных внутриядерных телец в ооцитах голубя 83

3.5. Молекулярный состав содержащих коилин сферических телец в

ядрах ооцитов голубя на стадии хромосом типа ламповых щеток 93

3.5.1. Экстрахромосомные содержащие коилин тельца в ядрах ооцитов голубя накапливают компоненты малых ядерных РНП, но

не фактор сплайсинга SC35 93

3.5.2. Экстрахромосомные содержащие коилин тельца в ядрах ооцитов голубя не эквивалентны тельцам гистонового локуса 97

3.5.3. Экстрахромосомные содержащие коилин тельца в ядрах ооцитов голубя не накапливают белков ядрышек 104

3.5.4. Другие компоненты экстрахромосомных содержащих коилин

телец в ядрах ооцитов голубя 104

3.6. Внутриядерные тельца в ооцитах неполовозрелых самок голубя 105

4. Обсуждение 108

4.1. Организация ядер маленьких ооцитов неполовозрелых

самок голубя 108

4.2. Организация ядер больших ооцитов на стадии хромосом типа ламповых щеток половозрелых самок голубя 109

4.2.1. Сравнение «плотных шаров» и «полых сфер» ядер ооцитов голубя

с известными содержащими коилин тельцами зародышевых пузырьков 111

4.2.2. Особенности модульной организации телец, содержащих коилин,

в ядрах ооцитов голубя 113

4.2.3. Особенности распределения телец, содержащих коилин, в пространстве ядра ооцита голубя 117

4.3. Заключение 118 Выводы 122 Список литературы 124

Список сокращений

а.о. - аминокислотный остаток

БТ - белковое тело

ЗП - зародышевый пузырек

КИГ - кластеры интерхроматиновых гранул

JICKM - лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

мяРНК - малые ядерные РНК

мяРНП - малые ядерные рибонуклеопротеины

мяшРНК - малые ядрышковые РНК

мАТ - моноклональные антитела

пАТ - поликлональные антитела

пре-мРНК - предшественники матричной РНК

ПС - полая сфера

ПШ - плотный шар

РНП-матрикс - рибонуклеопротеиновый матрикс

ТГЛ - тельце гистонового локуса

ТК - тельце Кахала

ТМГ-кэп - триметилгуанозиновый кэп

Хромосомы-ЛЩ - хромосомы типа ламповых щеток

ЯОР - ядрышковый организатор

DAPI - 4'-6'-diamidino-2-phenylindole

PcG - Polycomb group

PML - Promyelocytic leukemia protein

scaPHK - специфичная для телец Кахала малая РНК

SMN - survival of motor neurons

Введение

Ядро представляет собой высоко компартментализованную клеточную органеллу, которая содержит генетический материал клетки и в которой все биохимические процессы четко скоординированы в пространстве и во времени. Компартментализация ядра клетки направлена, в первую очередь, на увеличение эффективности метаболических процессов путем создания специализированного микроокружения, в котором в высокой концентрации присутствуют только участники процесса (Dundr, Misteli, 2001; 2010; Misteli, 2007; Kumaran et al., 2008). Для описания пространственной компартментализации внутриядерных процессов используют термины, такие как внутриядерный компартмент, внутриядерная структура и внутриядерное тельце. Внутриядерные тельца или органеллы - это гетерогенная группа не окруженных мембранами внутриядерных структур, которые можно отличить друг от друга и от нуклеоплазмы на основании их ультраструктуры и наличия определенных маркерных компонентов (Zimber et al., 2004; Spector, 2006). Термины «домены» и «структуры», в контексте ядерной компартментализации часто употребляются в качестве синонимов, и включают в себя понятие «тельца».

К наиболее актуальным проблемам в области компартментализации клеточного ядра относят определение состава, динамики и функций различных внутриядерных доменов, выяснение механизмов их образования и поддержания их целостности (Misteli, 2007; 2009; Trinkle-Mulcahy, Lamond, 2008; Machyna et al., 2013). На сегодняшний день описано большое количество разных типов внутриядерных телец, молекулярный состав которых подробно охарактеризован, однако об их функциях известно меньше. Активно развивающимся направлением в этой области является изучение гетерогенной группы коилин-содержащих телец. Коилин представляет собой фосфопротеин, способный к олигомеризации, основные функции которого до конца не известны (Carmo-Fonseca et al., 1993; Bellini, 2000; Liu et al., 2009). В настоящее время к основным коилин-содержащим тельцам относят тельца Кахала (ТК), тельца гистонового локуса (ТТЛ) и недавно описанные «жемчужины» (англ. - "pearls") (Gall et al., 1999; Liu et al., 2009; Nizami, Gall, 2012). Существует несколько точек зрения на терминологическое обозначение

б

разных типов телец из группы телец, содержащих коилин. В данной работе мы придерживаемся точки зрения, согласно которой ТК, ТГЛ и «жемчужины» представляют собой не разновидности телец Кахала, а отдельные типы телец, отличающиеся по своим основным функциям и объединенные в одну группу наличием белка коилина (Nizami, Gall, 2012).

Тельца Кахала - это внутриядерные органеллы, принимающие участие в биогенезе сплайсосомных малых ядерных РНК (мяРНК) и малых ядрышковых РНК (мяшРНК), которые необходимы для осуществления сплайсинга предшественников матричной РНК (пре-мРНК) и раннего процессинга рибосомной РНК (рРНК) (Gall et al., 1999). Заключительные этапы созревания сплайсосомных мяРНК и сборка комплексов малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП) происходят именно в ТК (Gall et al., 1999). Несмотря на то, что ТК описаны более ста лет назад, их точный молекулярный состав и функции до конца не известны (Gall, 2000; Cioce, Lamond, 2005; Morris, 2008). Маркерными компонентами, характерными для ТК соматических клеток, являются белок коилин и scaPHK (англ. - "small Cajal body-specific RNA" специфичная для ТК малая РНК), такая как, scaPHK U85 (Andrade et al., 1991, Xie et al., 2007). Здесь и далее в связи с появлением в литературе информации о многих новых классах коротких и малых РНК, по рекомендации В. Гвоздева для новых видов РНК мы используем сокращение, в котором первые буквы соответствуют англоязычному наименованию некодирующей РЕК (Гвоздев, 2003). scaPHK U85 содержит боксы C/D и Н/АСА, определяющие ее участие в 2'-О-метилировании рибозы и псевдоуридинилировании мяРНК, соответственно (Richard et al., 2003; Venteicher et al. 2009). Именно наличие scaPHK определяет основную роль ТК в биогенезе сплайсосомных мяРНК, отличающую их от других коилин-содержащих внутриядерных органелл.

Вторым типом телец из группы коилин-содержащих внутиядерных органелл являются тельца гистонового локуса. ТГЛ участвуют в процессинге 3'-конца пре-мРНК, кодирующей гистоны, и часто ассоциированы с кластерами генов гистонов (Liu et al., 20066; Nizami et al., 2010a). Эти тельца содержат следующие характерные для них компоненты, принимающие участие в процессинге 3'-конца пре-мРНК, кодирующей гистоны: мяРНК U7, два специфичных для мяРНП U7

7

белка (белки LsmlO и Lsmll), а также белки SLBP (англ. - "stem-loop binding protein"), FLASH (англ. - "FLICE-associated huge protein") и симплекин (Abbot et al., 1999; Liu et al., 20066; Nizami et al., 2010a).

В последние годы появились экспериментальные подтверждения модульной организации ТК. Для участия в конкретных процессах ТК содержат наборы компонентов - молекулярные модули, которые могут по-разному комбинироваться. К основным молекулярным модулям ТК относят модуль сплайсосомных мяРНП, модуль мяшРНП, модуль, содержащий компоненты теломеразы (Lemm et al., 2006; Matera, Shpargel, 2006; Xie et al., 2007; Pontes, Pikaard, 2008; Liu et al., 2009). Исследование таких аспектов как модульная организация ядерных телец требует экспериментальных вмешательств в работу генома, например, выключения определенных компонентов одного из функциональных модулей (Lemm et al., 2006). Альтернативным и, возможно, более перспективным подходом может служить исследование существующих в природе вариаций структурно-функциональной организации ядра (Gall, 2000; Liu et al., 2006a; Bogolyubov et al., 2009).

На сегодняшний день работа над выяснением функционального значения формирования коилин-содержащих телец и, в частности, ТК далека от завершения. Уникальную модель для такого рода исследований представляют ооциты животных, которые характеризуются гигантскими размерами ядра и высоким транскрипционным статусом хромосом в форме ламповых щеток (Гагинская, 1989; Gall et al., 1999; Morgan, 2002; Bogolyubov, Parfenov, 2008; Gaginskaya et al., 2009). Известно, что в интерфазных ядрах соматических клеток гены «домашнего хозяйства» всегда активны. Несомненная уникальность модельной системы ооцит-фолликул состоит в том, что даже в тех ооцитах, в которых происходит трансформация хромосом в так называемые ламповые щетки, благодаря тесной кооперации между геномами ооцита и окружающих его фолликулярных клеток, может происходить инактивация некоторых генов «домашнего хозяйства», таких как гены, кодирующие рРНК (Greenfield, 1966; Чинь и др., 1979; Hutchison, 1987).

Кроме того, гигантский размер ядер ооцитов (зародышевых пузырьков) позволяет проводить эксперименты, которые сложно или практически невозможно

осуществить на маленьких ядрах соматических клеток. Большой размер и многочисленность внутриядерных компартментов дают возможность получить изображение с очень высоким уровнем детализации (Gall et al., 2004). Благодаря внедрению новых методик, ядра ооцитов птиц также стали использовать в качестве перспективных объектов для изучения трехмерной архитектуры генома и функциональной компартментализации ядра (Маслова, Красикова, 2011; Maslova, Krasikova, 2012).

Вместе с тем, характеристика внутриядерных компартментов, участвующих в динамике компонентов аппарата транскрипции и процессинга РНК, в ооцитах взрослых самок птиц далека от завершения. ТК, претендующие на роль универсальных ядерных органелл (Gall et al., 2004; Bogolyubov et al., 2009), в ядрах ооцитов половозрелых самок птиц, содержащих транскрипционно активные хромосомы типа ламповых щеток, до сих пор не были охарактеризованы (Krasikova et al., 2004; 2005; Красикова, 2007). Однако, ранее описанные в ядрах растущих ооцитов голубя сизого (Columba livid) сферические внутриядерные структуры - так называемые «полые сферы» (ПС) и «плотные шары» (ПШ) (Хутинаева и др., 1989; Хутинаева, 1990), претендуют на роль эквивалентов ТК у птиц. Подробный анализ ядер ооцитов голубя методами просвечивающей электронной микроскопии позволил охарактеризовать ультратонкую структуру этих внутриядерных телец (Гагинская, 1989). В то же время, молекулярный состав, природа и функции не ассоциированных с хромосомами внутриядерных телец ооцитов голубя - ПС и ГНИ - оставались полностью неизвестными.

В настоящей работе в качестве объекта исследования внутриядерных коилин-содержащих телец были выбраны ооциты птиц; в качестве представителя класса Птицы был выбран голубь сизый (Columba livia var. domestica), в ядрах растущих ооцитов которого ранее были описаны экстрахромосомные внутриядерные тельца, не обнаруженные в зародышевых пузырьках других изученных видов птиц (Гагинская, 1989). Ооциты С. livia были условно разделены на три группы по размеру, коррелирующему со степенью активности ядерного аппарата, согласно классификации Каллебо (Callebaut, 1973). Так термин «маленькие» ооциты в настоящей работе использовался применительно к ооцитам с ранней активацией

9

ядерного аппарата до принятия хромосомами формы ламповых щеток; термин «большие» ооциты был применен к ооцитам, находящимся на стадии хромосом типа ЖЦ. Кроме того, в работе выделяли ооциты, находящиеся на стадии формирования кариосферы, характеризующейся почти полной инактивацией ядерного генома. Промежуточные стадии роста ооцита не рассматривали. Помимо этого, в исследовании использовали растущие ооциты птенцов, в ядрах которых по данным некоторых авторов должно присутствовать ядрышко (Greenfield, 1966; Чинь и др., 1979). Следует подчеркнуть, что характерной особенностью оогенеза птиц, в том числе голубя сизого, является отсутствие функционирующих ядрышек в растущих ооцитах у половозрелых самок (Greenfield, 1966; Гагинская, Грузова, 1969; Гагинская, 1972; Гагинская, Грузова, 1975).

Таким образом, настоящая работа посвящена исследованию молекулярного состава экстрахромосомных РНК-содержащих телец в зародышевых пузырьках голубя сизого на стадии хромосом типа ламповых щеток. Полученные результаты позволили прояснить природу и отдельные функции охарактеризованных ранее с морфологической точки зрения экстрахромосомных телец в ядрах растущих ооцитов С. livia.

Целью настоящей работы было идентифицировать и охарактеризовать

молекулярный состав телец, подобных тельцам Кахала, в ядрах растущих ооцитов

голубя сизого (Columba livia).

В настоящей работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Идентифицировать в ядрах маленьких ооцитов неполовозрелых самок С. livia эквиваленты телец Кахала и телец гистонового локуса соматических клеток.

2. Проверить наличие белка коилина в составе экстрахромосомных телец («плотных шаров» и «полых сфер») в ядрах больших ооцитов на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

3. Проанализировать распределение фактора сплайсинга SR-белка SC35, малых ядерных РНК, Sm-белков, входящих в состав малых ядерных РНП, и белка симплекина в экстрахромосомных ядерных доменах в больших ооцитах на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

4. Проверить наличие белков ядрышка (Noppl40, фибрилларина и N038) в составе экстрахромосомных ядерных телец в больших ооцитах на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок голубя.

5. Определить, к какому типу ядерных телец относятся экстрахромосомные «плотные шары» и «полые сферы», формирующиеся в ядрах больших ооцитов на стадии хромосом-ламповых щёток половозрелых самок С. livia.

1. Обзор литературы 1.1. Внутриядерные домены 1.1.1. Компартментализация внутриядерных процессов в пространстве ядра

Функциональной компартментализации клеточного ядра в последние годы уделяют пристальное внимание. К настоящему моменту накоплен огромный багаж знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе различных процессов, протекающих в ядре, таких как репликация, транскрипция, сплайсинг, сборка рибосом и др. Однако все ещё мало известно о том, как данные процессы скоординированы в трехмерной структуре ядра. Изучение связи архитектуры ядра и его функций проводится давно, однако для полного решения этой проблемы требуются дополнительные исследования (^^еН, 2007; Кигпагап е1 а!., 2008; Тппк1е-Ми1саЬу, Ьашопс!, 2008).

Для клеточного ядра характерны два фундаментальных аспекта: большая степень структурно-функциональной компартментализации органе�