Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ядерные структуры в ооцитах человека: морфофцнкциональный и иммуноцитохимический аналз

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Ядерные структуры в ооцитах человека: морфофцнкциональный и иммуноцитохимический аналз"

Р Г Б ОД

1 1) ДПР 1323

На правах рукописи УДК576.3 15.3:591.111.8:599.9

Г10ЧУКАЛИНА Галина Николаевна

ЯДЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ В ООЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА: МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ и ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

03.00.25 Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Н.Парфенов Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Е.Р.Гагинская Биологический НИИ СПбГУ, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Я.Ю.Комиссарчик Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной

медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится апреля 1998 года в 13 ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Институт цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологи РАН.

Реферат разослан "23' марта 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Лб. н. Л [¿¿хла^ Л..НПи с аре в а

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последнее время становится все более очевидным, что изучение морфофункциональной организации ядерных структур в оогенезе млекопитающих выходит из разряда «прикладных», обслуживающих только сугубо специфические вопросы развития женских гамет. Накопленные к настоящему моменту сведения, полученные на ооцитах млекопитающих (см. обзор Зыбина, Зыбина, 1992), дают на наш взгляд перспективу для современного анализа морфогенетических трансформаций хромосомного аппарата, нуклеол, многочисленных экстрахромосомных телец, становления компартментализации кариоплазмы, и позволяют считать изучение ядра ооцитов млекопитающих актуальным для решения общецитологических проблем.

Представляется особенно важным исследование ядерных структур, в отмеченных аспектах, на заключительных этапах оогенеза (непосредственно перед созреванием ооцита), когда проходит окончательная «доводка» закладывающейся проморфологии будущего эмбриона, когда, очевидно, происходит накопление ядерных макромолекулярных комплексов, способных обеспечить начальные фазы эмбриогенеза при неактивном геноме зародыша. В современных работах указывается на существенный вклад в поддержании раннего развития млекопитающих процессов, происходящих на поздних стадиях диплотены мейоза (см. напр. Dean et al., 1989; Wassarman, Kinloch, 1992). Несомненно возрастание важности анализа ядерной организации в позднем оогенезе при переходе к материалу человека. Однако именно ядро поздних (преовуляторных) ооцитов человека оказалось слабо изученным в рамках современных подходов. Это тем более парадоксально, поскольку в последнее время, в клинической практике получило широкое распространение культивирование ооцитов из антральных фолликулов человека с последующим оплодотворением in vilro.

Вплоть до наших исследований практически неизученной оставалась ультраструктурная организация ядра ооцита человека в этот период. Не получила

должного освещения синтетическая активность этих ядер, исследованная лишь с помощью световой авторадиографии. Не были выявлены, при ультраструктурном анализе, особенности организации уникальной структуры инактивированных ядер ооцитов человека - кариосферы. Не было проведено сравнения организации кариосферы человека с подобной структурой в ооцитах других животных, где она довольно подробно изучена (Gruzova, Parfenov 1993). Своего решения требовала проблема организации и состава ядрышкоподобного тельца, занимающего центральное положение в кариосфере человека. Нуждались в расшифровке многочисленные ядерные тельца, накопившиеся к концу оогенеза. Последние, вероятно, и обеспечивают ту гетерогенность кариоплазмы ооцита, анализ которой поможет приблизиться к пониманию компартментализации клеточного ядра, его доменной организации. Вопрос о доменной организации ядерного содержимого все более активно выдвигается на передний край современных исследований по клеточной биологии ядер позвоночных (Ascoli, Maul, 1991; Spector, 1993). Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся анализ морфофункциональной организации ядер ооцитов из антральных фолликулов человека на трех последовательных стадиях развития, включая изучение поэтапного формирования комплекса внутриядерных структур - кариосферы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. С помощью элекгронномикроскопических методов описать организацию ядер ооцитов из антральных фолликулов человека на трех последовательных стадиях развития, характеризующихся разной степенью агрегации внутриядерных структур.

2. Изучить ультраструктуру кариосферы из ядер ооцитов человека и проанализировать, на основании литературных данных, ее сходство или различие с кариосферами других позвоночных.

3. Для определения корреляции морфологических преобразований ядер с их синтетической активностью, требовалось, используя электронномикроскопическую авторадиографию, показать уровни транскрипционной активности ядер на диплотенной стадии развития ооцитов.

4. Дать описание строения ядерных телец и с помощью иммуноэлектронной микроскопии идентифицировать те из них, которые содержат компоненты созревания пре-мРНК. В связи с этим, предстояло показать гомологию этих

ядерных телец подобным образованиям в клетках соматического происхождения.

5. Для сравнительного изучения ядерных телец, содержащих факторы созревания пре-мРНК, в разных группах млекопитающих следовало показать их ультраструктурную организацию и состав в ооцитах из преовуляторных фолликулов мыши.

6. Для выявления гомологии между некоторыми ядерными тельцами позднего оогенеза и раннего эмбриогенеза представлялось целесообразным дать иммунофлуоресцентный анализ ядерных телец двухклеточных эмбрионов мыши.

Научная новизна результатов.

Дано первое ультрасгруктурное описание преобразований внутриядерной организации ооцитов из антральных фолликулов человека. Впервые детальное изучение морфодинамики ядерных структур в поздней диплотене человека было сопряжено с электронноавторадиографическим анализом особенностей чередующихся стадий транскрипционной активности ядер.

Впервые на примере человека показаны особенности ультраструктурной организации кариосферы млекопитающих.

Представлены первые иммуноэлектронные данные по составу ряда внутриядерных структур человека.

Впервые проведенные иммуноэлектронные исследования ядер преовуляторных ооцитов человека подтвердили гипотезу о накоплении в позднем оогенезе млекопитающих некоторых макромолекул, обеспечивающих потребности раннего эмбриогенеза.

Впервые в женских гаметах млекопитающих, на примере преовуляторных ооцитов человека, показана роль ядерных структур (ядрышкоподобного тельца и кластеров интерхроматиновых гранул - КИГ) в депонировании компонентов, связанных с процессами созревания РНК.

Впервые выявлено селективное накопление факторов созревания РНК в пределах одной ядерной структуры - КИГ ооцитов человека. Даны первые описан™ фибриллярных зон в составе КИГ.

Представлены первые сведения, позволяющие провести гомологию между кластерами интерхроматиновых гранул ооцитов человека и соматических клеток млекопитающих.

Научно-практическая ценность работы.

Выявление в диплотенных ооцитах человека преобразований ядерных структур, имеющих одинаковую с другими позвоночными направленность, имеет теоретическое значение для построения общей схемы трансформации внутриядерной организации гамет в позднем оогенезе позвоночных разного систематического положения. Полученные данные по депонированию компонентов, связанных с метаболизмом РНК, в определенных ядерных структурах позднедиплотенных ооцитов человека, расширяют представления о функциях части ядерных структур в один из ответственных периодов проэмбрионального развития организмов.

Результаты работы по анализу организации ядра ооцитов из антральных фолликулов человека могут представлять интерес для клиницистов, использующих методы культивирования ооцитов, с последующим оплодотворением in vitro.

Материалы, полученные в работе, могут быть включены в курсы лекций по биологии развития и клеточной биологии для студентов соответствующих кафедр медицинских и биологических высших учебных заведений. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на 9-ом Международном конгрессе по цитологии, Брюссель, Бельгия, 1986 г.; на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" Черноголовка,1987 г.; на 4-ом Французско-чехословацком совещании «Через ооцит к эмбриону» Прага, Чехословакия, 1990 г.; на семинарах лаборатории морфологии клетки, а также на совещаниях кафедры гинекологии Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И.Мечникова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена найЬтраницах и состоит

из введения, обзора литературы, описания материалов и методов

исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы,

содержащего названий. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 3

таблицами.

Автор благодарен сотрудникам лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН за постоянную помощь и поддержку в работе. Автор надеется, что представленные в ней результаты внесут скромный

вклад в развитие направления, связанного с изучением организации ядра ооцита, основанного И.И.Соколовым и плодотворно продолженного М.Н.Грузовой. Автор выражает признательность за помощь в работе К.Г.Мурти и Д.Девис (Детский исследовательский госпиталь, Мемфис, США). Автор благодарен Д.Ф.Костючек за помощь в получении материала (Санкт-Петербургская Государственная Медицинская Академия им. И.И.Мечникова).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для исследования использовались резецированный материал яичников человека, яичники мыши, а также двухклеточные эмбрионы мыши. Фрагменты яичников были получены от пациенток в возрасте от 27 до 50 лет, во время операций по поводу различных гинекологических заболеваний.

Для получения гиперовуляции в яичниках мыши (CBA/C57BI, BALB/C), самок в возрасте от 21 дня до 3-х месяцев, стимулировали ФСГ (Sigma, USA) в концентрации 5-10 IU/мл. Через 48 часов животных забивали, яичники отпрепарировали и выделяли ооциты.

Эмбрионы получали после стимуляции самок ФСГ и ЛГ (Sigma, USA) в той же концентрации, через 42-44 часа после оплодотворения. Вымытые из яйцеводов эмбрионы помещали в фосфатный буфер (рИ=7,2) и использовали для приготовления давленых препаратов.

Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали 1 -3 суток в 5%-ном растворе глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН=7.2), после чего вскрывали полостные фолликулы и отпрепарировали яйценосные бугорки (кумулусы) с ооцитами. Выделенные кумулусы дофиксировали в 2.5%-ном растворе глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН=7.2), часть из них дофиксировали в 1%-ном растворе OsOi на том же буфере. Материал заливали в аралдит или в смесь эпона и аралдита по обычной методике.

Полутонкие и ультратонкие срезы изготовляли на ультратоме Reichert (Австрия).

Для общеморфологических целей использовали серийные полутонкие (0,5-1,0 мкм) срезы материала, заключенного в аралдит или эпон-аралдит.

Диаметр фолликулов замерялся с помощью штангенциркуля. Замеры диаметра ооцитов и их ядер проводились на полутонких срезах с помощью объект-микрометра. Полученные величины диаметра фолликулов, ооцитов и ядер подвергались корреляционному анализу (Лакин, 1990).

Для выявления ДНК эпон-арадцитовые срезы толщиной 0.5 мкм окрашивали аурамином-БОг (Розанов, Кудрявцев, 1967).

Давленые препараты ооцитов и двухклеточных эмбрионов мыши получали по методу Хулсебоса с соавторами (Hulsebos et al., 1984).

Для иммуноцитохимического анализа ядерных структур на

светооптическом уровне использовали моноклональные антитела Y-12 и a-SC35 (см. таблицу 1.). Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание давленых препаратов антителами проводили по методу, подробно описанному By с соавторами (Wu et al., 1991).

Для электронномикроскопического иммуноцитохимического

анализа, ооциты выделяли из антральных фолликулов в фосфатном буфере, содержащем 100 мкг/мл дибутирил циклической AM<t>(Sigma, USA) для блокировки спонтанного возобновления мейоза. После выделения ооциты немедленно фиксировали в смеси 3,7 % параформальдегида и 0,1% глутаральдегида на фосфатном буфере в течении 1 часа. Затем материал подвергался кратковременной (30-40 минут) дегидратации, исключающей абсолютный спирт, после чего материал заливали в смолу LR-White Resin (London Resin Company Ltd.) для иммуноцитохимических исследований. Серийные ультратонкие срезы собирали на никелевые сетки. Сетки со срезами инкубировали в растворе первых антител (см. таблицу I ), разведенных в фосфатном буфере, содержащем 1% желатина, в течении 1,5 часов при 37° С. После промывки в фосфатном буфере сетки инкубировали в растворе вторых антителах, коньюгированных с коллоидным золотом (диаметр частиц коллоидного золота 10 им) (Amersbam, Lisle, USA). В качестве вторых антител использовали козлиные антитела против мышиных

иммуноглобулинов, конъюгированные с коллоидным золотом. Для контроля использовали срезы, обработанные только вторыми антителами.

Для двойного мечения срезов поликлональной кроличьей сывороткой R288 и моноклональными антителами a-SC35 сетки инкубировали в их смеси. После

промывки сетки переносили в смесь вторых антител: козлиных антикроличьих (диаметр частиц коллоидного золота 15 нм) и козлиных антимышиных (диаметр частиц коллоидного золота 5нм).

Ультратонкие срезы для иммуноцитохимических исследований контрастировали насыщенным раствором уранил-ацетата в воде, а для общеморфологических целей - уранил-ацетатом и цитратом свинца.

Препараты просматривали в электронном микроскопе 1ЕМ-7А, 1ЕМ-100С и 1ео1 1200 ЕХ11 Оео', Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

В опытах по выявлению синтеза РНК в ооцитах человека, кусочки яичника с антральными фолликулами, инкубировали в культуральной среде Р-10 или ЯРМ1 (Институт полимиелитов и вирусных энцефалитов, Москва) со стабильно поддерживаемым уровнем рН (контроль проводился по окраске среды) с предшественником 3Н-уридином (иУУУЯ, Прага, Чехословакия, специфическая активность 900 ГБк/ммоль) в конечной концентрации 3.7 Мбк/мл Таблица 1. Антитела, использованные в работе.

АНТИТЕЛА ВЫЯВЛЯЕМЫЙ АНТИГЕН ИСТОЧНИК

Моно кло нальные антитела Y-12 Бт-эпитоп мяРНП Lerneretal., 1981

Моноклональные антитела a SC-3 5 БЯ-белок - фактор сплайсинга, отличный от мяРНП Fu, Maniatis, 1990

Моноклональные антитела а ДНК Двухцепочечная ДНК Chemicon International, USA

Поликлональная Кроличья сыворотка R-288 Белок р80 коилин Andrade etal., 1993

(100 ц Ci/мл). Срок инкубации 30 минут, 1 час и 1,5 часа. Затем из фолликулов выделяли кумулусы и фиксировали 2,5% глутаральдегидом на 0,1М фосфатном буфере (рН=7.2) и дофиксировали в 2% 0s04 на том же буфере. Затем материал заключали в арапдитпо обычной методике. Полутонкие (1мкм) и тонкие срезы обрабатывали ядерной жидкой эмульсией (Химфото, Москва, СССР) в соответствии со стандартной методикой (Larra, Droz, 1970) и экспонировали в течении 1-1,5 месяцев.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ. Морфология ядерных структур ооцитов человека на днплотеннон стадии профазы I мейоза.

Светооптнческие данные. В яичнике человека фолликулы находятся на разных стадиях развития: от примордиальных до многослойных полостных (Курило и др., 1982; Парфенов и др., 1984) Исчерпывающая схема оогенеза млекопитающих, с детальной разбивкой материала по стадиям фолликулогенеза, представлена в работе Л.Ф. Курило (Курило, 1985). Нами изучались зрелые фолликулы, имеющие хорошо развитую полость - антрум. Диаметр таких фолликулов варьирует в широком диапазоне от 7 до 25 мм. По классификации Цезарика (Тевапк е1 а!.,1983) они соответствуют крупным антральным фолликулам. Диаметр ооцитов колеблется в пределах 100 - 120 мкм, а диаметр ядер - от 20 до 30 мкм. Математическая обработка данных (корреляционный анализ) обнаруживает наличие умеренно положительной корреляции между диаметром ооцита и ядра (г =+0.56 + 0.21 при р < 0.02) и полное ее отсутствие между размерами фолликула и ооцита (г = -0.1 + 0.2 при недостоверном отличии от нуля). Отсутствие корреляции в этом случае подтверждает известный факт прекращения роста ооцитов млекопитающих, начиная со стадии формирования антрума в многослойном фолликуле (Дыбан, Баранов, 1977; Зыбина, Грищенко, 1977). Очевидно, такая же ситуация имеет место и в яичниках женщин, так как в использованном нами материале колебания диаметра ооцитов в большинстве случаев были незначительны.

При светооптическом изучении полутонких срезов ооцитов, выделенных из антральных фолликулов, они были разделены натри группы, в соответствии с положением ядра и распределением ядерных структур. В 1-й группе ооциты характеризуются центральным положением ядра и дисперсным (по всему ядру) распределением хромосомного материала. В центре всех ядер ооцитов этой группы располагается округлое плотное образование - ядрышкоподобное тельце (ЯПТ). При световом микроскопировании заключение о том, что в данном случае мы имеем дело не с истинным ядрышком, а с ЯПТ, было сделано по результатам цитохимических окрасок парафиновых срезах фолликулов. Рассматриваемые структуры характеризовались отсутствием пиронинофилии и давали отрицательные результаты после реакции серебрения. В дальнейшем эти данные были подтверждены нами на ультраструктурном уровне. В настоящее время в литературе, ввиду того, что эта структура довольно сильно отличается от

типичного ядрышка, принято называть ее постядрышко или ядрышкоподобное тельце (ЯПТ) (БгоПог! « а!., 1991; Кореспу е1 а1., 1996).

Во 2-й группе ооцнтов, при таком же центральном положении ядра, наблюдается частичная агрегация хромосом вокруг ЯПТ. В 3-ей группе - ядра смещены к периферии ооцита, а хромосомы окружают ЯПТ в виде общей массы, плотно прилегающей к его поверхности. Наиболее заметной структурой в ядрах ооцитов всех трех групп является ЯПТ. В каждом ядре имеется одно ЯПТ, диаметром 5-10 мкм, плотное, темноакрашенное. В ядрах ооцитов 1-й и 2-й группы четко выявляемые хромосомы распределены по всему ядру или имеют тенденцию к сближению вокруг ЯПТ. В нуклеоплазме ооцитов всех трех групп выявляются мелкие, чаще округлые ядерные тельца, диаметром 1-5 мкм, лежащие свободно или связанные с хромосомами. На ультраструкгурном уровне эти образования соответствуют кластерам интерхроматиновых гранул (КИТ). После окраски толуидиновым синим КИГ, в связи с меньшей плотностью, выглядят светлее ЯПТ, благодаря чему хорошо отличаются от него. Их количество в ядре различно и может достигать 10.

Особенностью ядер ооцитов 3-ей группы является полная агрегация ядерных структур на поверхности темноокрашенного ЯПТ. Хромосомы объединяются в общую массу, которая плотно окружает ЯПТ. В результате формируется компактное образование - кариосфера - диаметром до 13 мкм, имеющее округлую или чаще лопастную форму. Кариосфера занимает эксцентричное положение в ядре, зачастую - у самой ядерной оболочки. Кариосфера ярко светится на фоне темной кариоплазмы, после специфической окраски на ДНК аурамином-ЗОг- Эта цитохимическая реакция подтверждает наши морфологические наблюдения, свидетельствующие о концентрации всех хромосом вокруг ЯПТ и образовании кариосферы. В тесной связи с кариосферой находятся КИГ, округлые, довольно крупные образования, диаметром 5-10 мкм. На этой стадии количество их в ядре уменьшается до 3-6.

Образование кариосферы как заключительный этап в преобразовании внутриядерной организации развивающегося ооцита описано, в основном, на светооптическом уровне у разных видов млекопитающих: в ооцитах человека (КиЫтапп, 1970; Эапуа1 е1 а1., 1976; Курило, 1982, 1985; Курило и др., 1983), приматов (Курило, 1982, 1985), некоторых грызунов (Зыбина и др., 1980; Гршценко, 1984), хищных (Кикнадзе, 1966; Кикнадзе и др., 1980). Однако в

других случаях (свинья, крыса, корова, кролик и коза) в ядре ооцита отмечается только конденсация хромосом и компактизация ядрышка (Crozet et al., 1981; 1986; Takeuchi, 1984; Antoine et al., 1986; 1987; 1988; 1989; Kopecny et al., 1994; 1996a,b; Smedt et ai., 1994). При этом авторы не употребляют термин "кариосфера" для обозначения такого состояния хромосомно - ядрышкового аппарата. Однако, по нашему мнению, светооптическая организация ядерных структур в ооцитах этих животных вполне соответствует состоянию кариосферы.

Ультраструктурная организация ядер ооцнтов 1-й группы. При электронном микроскопировании в этой группе ооцитов обнаруживаются многочисленные структуры, распределенные практически по всему объему ядра. В ядре ооцита выявляется еще довольно диспергированный хроматин, который занимает весь объем ядра, включая периферию. Лишь небольшая часть его конденсирована и представлена фибриллярными участками более плотной упаковки (диаметр фибрилл - 6-10 нм). Ядерные гранулы (20-25 нм в диаметре) формируют агрегаты различного размера и формы. Некоторые из них имеют неопределенные очертания, тогда как другие, встречающиеся чаще, обладают правильной округлой формой. Организация таких гранулярных агрегатов точно соответствует структуре кластеров интерхроматиновых гранул (КИГ), которые были описаны в соматических клетках млекопитающих (Monneron, Bernhard, 1969; Fakan.Puvion, 1980). В ооцитах человека КИГ часто выявляются на периферии участков конденсированного хроматина.

Центральное положение в ядре занимает ядрышкоподобное тельце (ЯПТ), которое состоит из плотноупакованного тонко фибриллярного материала. В нем можно выделить зоны с плотной и рыхлой упаковкой фибрилл, толщиной 3-6 нм. В центральной части обособляется плотно упакованный материал. На периферии ЯПТ фибриллы располагаются менее плотно, между ними видны светлые пространства. Скручиваясь, фибриллы образуют тяжи, толщиной до 10 нм. Фибриллы периферической зоны, на границе ЯПТ, переходят в кариоплазму, где включаются в состав разнообразных хроматиновых фрагментов. Подобная ультраструктура ЯПТ описана в диплогенных ооцитах мыши (Chouinard, 1971; Зыбина и др., 1990), крысы (Takeuchi, 1984; Antoine et al., 1986;1987;1988;1989; Kopecny et al., 1996b), свиньи (Crozet et al., 1981; Kopecny et al.,1994; 1996a;), козы (Smedt et al., 1994), коровы (Crozet et al., 1986).

Ультраструктурная организация ядер ооцитов 2-й группы. В ядрах ооцитов данной группы конденсация хроматина прогрессирует. Блоки его плотно упакованного фибриллярного материала разных размеров и очертаний встречаются в различных районах ядра. В некоторых случаях на одном срезе удается проследить довольно протяженные участки конденсированного хроматина, ассоциированные с несколькими КИГ. На данной стадии развития ооцита выявляется начало отчетливой агрегации ядерных структур вокруг ЯПТ. Часть блоков конденсированного хроматина приходит в тесный контакт с материалом ЯПТ.

При окраске срезов ядер ооцитов 2-ой группы антителами к ДНК, хроматин выявляется в виде крупных фибриллярных образований в кариоплазме и в виде периферического слоя на поверхности ЯПТ. КИГ, связанные с хроматином, оказываются в непосредственной близости от ЯПТ. Размеры их несколько увеличиваются, а форма становится, в основном, округлой. Некоторые КИГ лежат свободно в нуклеоплазме, но чаще встречаются на периферии блоков конденсированного хроматина. Размер гранул в КИГ такой же как в ядрах ооцитов 1-й группы - 20 нм. Представляют интерес особенности связи КИГ с хроматином. Имеющиеся в нашем распоряжении серийные срезы, а также результаты их окраски антителами к ДНК позволяют, с известной долей осторожности, заключить, что в зоне контакта КИГ и хроматина может иметь место переход фибрилл, расположенных на периферии хроматина в состав фибриллярного материала КИГ. Можно наблюдать картины, которые указывают на непосредственную связь материала, ассоциированного с хроматином, с фибриллярными зонами КИГ. Следует подчеркнуть, что ни фибриллярные зоны КИГ, ни фибриллярный материал, связывающий их с хроматином, не обнаруживает в своем составе ДНК.

ЯПТ состоит из тонко фибриллярного материала, такой же морфологии, как в ядрах ооцитов 1-й группы. Оно не четко контурировано, хотя имеет округлую . форму. На одном полюсе ЯПТ выявляется ровно очерченное образование, состоящее из материала, плотность упаковки которого значительно выше, чем у остальной части ЯПТ. При большем увеличении видно, что эта плотноупакованная структура как-бы выделяется из ЯПТ, можно даже проследить границу между двумя соединенными фрагментами. Основная часть ЯПТ представлена более рыхло упакованным материалом, в котором можно видеть

мелкие лакуны и вакуоли. На основании вышеизложенных наблюдений по организации ЯПТ, которое имеет на данной стадии еще незавершенную форму, а также учитывая общую картину строения ядра с неполной агрегацией ядерных струкгур, мы рассматриваем 2-ую группу ооцитов, как промежуточную стадию перед окончательным формированием кариосферы в ядре ооцита. Ультраструктурная организация ядер ооцитов З-ей группы. В ооцитах данной группы все ядерные структуры уже собраны вокруг ЯПТ, в результате чего формируется особое образование, которое по аналогии с подобным образованием у других безпозвоночных и позвоночных животных может определяться как кариосфера (вгимуа, РаНепоу, 1993). В кариосфере человека конденсированные массы хроматина плотно прилегают к поверхности ЯПТ. В контакте с хроматином выявляются КИТ, которые на этой стадии значительно больше по размеру, чем на предыдущей. Некоторые из них достигают 5-10 мкм в диаметре и имеют, в основном, округлую форму. ЯПТ, находящееся в центре кариосферы, состоит из однообразно и плотно упакованного тонкофибриллярного материала (фибриллы толщиной около 3 нм). Этот материал идентичен фибриллам центральной части ЯПТ в ядрах ооцитов 1-й и 2-й групп. В кариосферном ЯПТ четко выражены две зоны. На периферии виден слой более плотного материала, толщиной около 0.5 мкм. Вдоль по внутреннему контуру этого слоя различаются одинаково ориентированные фибриллы, за счет которых, очевидно, возникает отчетливая граница между периферическим слоем и центральной частью ЯПТ. Подобная зональность при образовании постядрышка описана в ооцитах козы (Зтеск й а!., 1994).

В контакте с ЯПТ располагается хроматиновый материал кариосферы, состоящий из рыхло лежащих фибрилл, диаметром 6-10 нм. Хроматин плотно окружает ЯПТ, но, однако, не образует сплошной массы вокруг него. Среди фибриллярных скоплений конденсированного хроматина выявляются просветы в виде лакун. По всей вероятности, эти области разграничивают отдельные биваленты. На объединение хромосом, а не на их слияние указывает, по-видимому, и лопастная форма большинства кариосфер в ооцитах человека, Все, за редким исключением, КИТ связаны с хроматином и сходны по организации с КИТ ооцитов первых двух групп.

Итак, нами было установлено, что на заключительных этапах оогенеза в ооцитах из антральных фолликулов человека нарастают процессы конденсации

его основных ядерных образований: хроматина, посгядрышка или ядрышкоподобного тельца (ЯПТ) и кластеров интерхроматиновых гранул (КИГ). Удалось проследить поэтапный характер агрегации, приводящий в конце диплотены к стягиванию хроматина и связанных с ним КИГ, вокруг компактного посгядрышка (ЯПТ), с образованием плотного комплекса -кариосферы. Следует уточнить, что собственно «кариосфера», согласно давно устоявшемуся определению (см. Грузова, 1975; 1977; Gruzova, Parfenov, 1993), представляет собой единое образование, частично или полностью инактивированного хроматина. Однако, в ооцитах человека, по нашим ультраструктурным данным, на стадии кариосферы мы имеем дело с комплексом настолько взаимосвязанных структур, что было бы целесообразно включить в состав кариосферы и ЯПТ - ее, очевидно, организующий центр, а также, связанные с хроматином КИГ.

В ядрах ооцитов из крупных антральных фолликулов человека удалось проследить перераспределение материала ЯПТ, на фоне поэтапного образования кариосферы. В результате этого процесса окончательно устанавливается уникальная структура посгядрышка, которую мы наблюдаем в зрелой кариосфере. Совершенно ясно, что на материале антральных фолликулов человека невозможно было показать все этапы постепенной трансформации ядрышка в ЯПТ кариосферы. Нами были документированы лишь заключительные моменты этого процесса.

В ряде работ, на ооцитах млекопитающих, было показано преобразование ядрышка в ЯПТ, при его инактивации на протяжении ранней диплотены. При этом ядрышко теряет свои элементы (фибриллярный центр, плотный фибриллярный компонент и др.), которые замещаются плотным, фибриллярным материалом ЯПТ (Chouinard, 1971; Crozet et al., 1981; Takeuchi, 1984; Motlik et al., 1984b; Зыбина и др., 1984; 1990; Antoine et al., 1987; Smedt et al., 1994). Трансформация активного нуклеолонемного ядрышка в плотное ЯПТ, в ооцитах млекопитающих, совпадает с началом формирования антрума и окончанием роста ооцита. Хорошо известно, что в данный период развития фолликула происходит падение, а затем и полное прекращение синтеза рРНК в ядре ооцита (Зыбина, 1971; Crozet et al., 1981; Зыбина, Зыбина, 1992). В настоящее время точная цитохимическая природа этой структуры не определена, но ясно одно - она отличается от функционально активного ядрышка. В ранних свегооптических

исследованиях в составе ЯПТ ооцитов млекопитающих были выявлены кислые белки (Зыбина, Схолль, 1972; Takeuchi, 1984; Antoine et al., 1986; 1988). Несколько позже на периферии постядрышка в ооцитах из антральных фолликулов крысы было продемонстрировано наличие РНК (Antoine et al., 1989). Однако в ЯПТ ооцитов человека при использовании различных методов (ЭДГА, серебрение) рДНК не была обнаружена (Парфенов, неопубликованные данные). Такие же результаты дали опыты по гибридизации нуклеиновых кислот in situ (Почукалина, предварительные данные).

Таким образом, очевидно, можно заключить, что в ядре ооцита всех изученных млекопитающих в конце фолликулогенеза образуется единая структура, объединяющая в определенной части ядра конденсированный хроматин и трансформированное ядрышко. Причем морфодинамика преобразований ядерных структур, предшествующих формированию кариосферы, ее общий план строения у разных видов в общих чертах сходны и различия, по всей вероятности, касаются только времени образования и длительности существования кариосферы. Например, длительность этой стадии составляет: у крысы - 1 час (Odor 1955 цит. по Зыбина, Зыбина, 1992), у кролика - 2 часа (Pincus, Enzmann, 1935 цит. по Зыбина, Зыбина, 1992), у свиньи - 20 часов (Motlik et al., 1978). У грызунов кариосфера возникает непосредственно перед овуляцией и существует в ядре короткое время. Этим, очевидно, объясняется тот факт, что у этого, наиболее изученного в плане оогенеза, отряда млекопитающих, кариосфера выявляется довольно редко. В исследованном нами материале, полученном в разные сроки овуляторного цикла женщин, преобладают ооциты с кариосферой. Можно предполагать, что она существует довольно длительный период - не менее двух недель.

Ооциты с кариосферой мы рассматриваем как преовуляторные. Такая точка зрения подтверждается характерными особенностями морфологии фолликулов, из которых эти ооциты были извлечены. В них завершено образование кумулуса, он соединен со стенкой фолликула лишь тонким клеточным тяжем. Клетки яйценосного бугорка расположены рыхло и между ними развиты широкие межклеточные пространства. Блестящая оболочка гомогенна, в ней не видны отростки фолликулярных клеток, а микроворсинки ооцита уменьшаются в размерах и малочисленны. Все это указывает на потерю связей между ооцитом и фолликулярными клетками. В соответствии с

некоторыми данными, такое состояние фолликула и ооцита отражает его готовность к запуску мейоза и овуляции (Channing, 1974; Tesaric, Dvorak, 1982). С другой стороны, в фолликулах, содержащих ооциты 1-й группы, в которых кариосфера еще не образована, отмечается плотный неоформленный кумулус. Последний связан с гранулезой толстым, широким слоем клеток. В блестящей оболочке выявляются многочисленные отростки фолликулярных клеток и микроворсинки, что говорит о наличии тесного контакта клеток кумулуса и ооцита. Таким образом, формирование кариосферы у человека, очевидно, происходит на фоне подготовки ооцита к следующему этапу мейоза, тогда как завершение образования кариосферы отражает состояние ядра ооцита, готового к редукционным делениям и овуляции.

Авторадпографическое исследование синтеза РНК в ооцитах из антральных фолликулов человека. Известно, что в ходе оогенеза млекопитающих, происходит накопление стабильных форм РНК в количестве достаточном для поддержания белковых синтезов, вплоть до стадии бластоцисты (Davidson, 1986). Изучение динамики синтеза РНК ооцитом на разных стадиях развития антрального фолликула человека выявило, что снижение синтетической активности ядер ооцитов совпадает с процессом компактизации хроматина и образованием кариосферы. Оказалось, что каждая группа ооцитов соответствует вполне конкретной стадии развития, определяемой уровнем включения 3Н-уридина: 1-я - активной, 2-я - промежуточной и 3-ья - неактивной стадии. Таким образом, последовательность представленных стадий дает возможность проследить постепенное снижение транскрипционной активности в ядре ооцита в сочетании с изменением его организации.

Светооптическая микроскопия автографов ооцитов 1-й группы выявила включение 3Н-уридина в ядра (инкубация с предшественником - 0,5 - 1 час), причем плотность метки была больше над ЯПТ. Эти данные сравнимы с результатами элекгронномикроскопической авторадиографии. Последние показали большее количество метки над ЯПТ по сравнению с окружающей кариоплазмой. Какой-либо специфичности в локализации метки в ЯПТ выявлено не было. Метка не ассоциировалась ни с одним определенным районом ЯПТ или какой-либо из двух зон, различающихся степенью упаковки фибрилл. В соответствии с данными, полученными на других млекопитающих, накопление метки в ЯПТ отражает, вероятно, транспорт вновь синтезированной РНК из

1(3

нуклеоплазмы в район ЯПТ (Тезапк е! а1 .,1983; МоШк ег а1.,1984; СтогЛ е1 а!., 1986).

Распределение метки в нуклеоплазме характеризуется следующим: она располагается над дисперсным хроматином и отсутствует над крупными блоками конденсированного хроматина. КИГ, также как и конденсированный хроматин, не включают 3Н-уридин: метка располагается вблизи этих структур или на их периферии. В литературе неоднократно указывалось на связь КИГ с работающими генами в ядрах клеток различного происхождения (см. обзор Моеп е1 а1., 1995).

Автографы ооцитов с кариосферой выявили полное прекращение синтеза РНК в ядре как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. Ядерные структуры по морфологическим картинам полностью соответствуют инактивированному состоянию: хромосомы конденсированы, собраны воедино и формируют вокруг ЯПТ кариосферу. Инактивация хромосомно-ядрышкового аппарата ооцитов во время формирования кариосферы является феноменом, типичным для оогенеза всех изученных млекопитающих (Зыбина, Зыбина, 1992).

На фоке полного отсутствия синтеза РНК в ядре ооцита, фолликулярные клетки кумулуса демонстрируют высокую степень синтетической активности. Исследование синтеза РНК в кумулусе показало, что как в случае активно функционирующего ядра ооцита, так и при его инактивации, в фолликулярных клетках продолжается интенсивное включение предшественника в их ядра. При дальнейших увеличениях сроков инкубации (до 1,5 часов) картина включения остается неизменной, наблюдается лишь значительное увеличение числа треков. В отдельных случаях автографы приближаются к контрастным.

Включение 3Н-уридина в ядра ооцитов млекопитающих, выделенных из антральных фолликулов, исследовалось на мыши (Зыбина, 1968; 1971; Кореспу е! а!., 1995), свинье (МоШк е1 а1., 1978, 1984; Сгоге1 й а!., 1981), корове (Сгоге! е1 а1., 1986) и человеке (Тевапк а а1., 1984). Всеми авторами подчеркивается факт наличия метки предшественника в ядре ооцита после продолжительной инкубации (1-2 часа). В ооцитах, извлеченных из Граафова пузырька, было показано медленное, но явное накопление меченой 3Н-уридином РНК в ЯПТ ооцитов свиньи (МоШк е1 а1., 1978, 1984; Сгоге! е1 а!., 1981) и коровы (Cюzйl й а1., 1986). Существенно, что после импульса 3Н-уридина (15-20 минут) метка над ЯПТ не обнаруживалась, тогда, как в кариоплазме выявлялось заметное мечение

(Crozet et al., 1986). Очевидно, что наличие метки в кариоплазме ооцитов, в этом случае, указывает на синтез гетерогенной РНК. Причем часто метка 3Н-уридина ассоциирует с периферическими зонами конденсированного хроматина (Tesarik et al., 1983; Motlik et al., 1984; Crozet et a!., 1986). Как показано в ядрах различных типов клеток, сайты транскрипции преимущественно располагаются именно в этих зонах, которые соответствуют перихроматиновым фибриллам (Fakan, Puvion, 1980; Fakan, 1994). По мнению большинства исследователей, мРНК, синтезированная на заключительном этапе фолликулогенеза, является короткоживущей, и кодирует белки, необходимые для созревания ооцита, в отличие от рРНК и мРНК, которые запасаются для раннего эмбриогенеза и синтезируются в ядре на более ранних стадиях развития ооцита (Davidson, 1986; Bachvarova, 1986; Wassarman, Kinloch,1992). Таким образом, наличие метки в кариоплазме ооцита человека, в ассоциации с хроматином имеет достаточно объяснений. В то же время требует отдельного анализа вопрос о мечении ЯПТ, которое в этот период, несомненно, потеряло все атрибуты истинного ядрышка: рДНК, гранулярный и фибриллярный компоненты; то есть по всем параметрам не может даже предположительно рассматриваться, как структура активная в синтезе РНК.

На примере других млекопитающих хорошо известно, что с развитием в фолликуле антрума, происходит инактивация нуклеолонемного ядрышка, активно функционирующего на предшествующих стадиях. Накопление метки в ЯПТ после продолжительной инкубации с 3Н-уридином может отражать, по мнению ряда авторов, транспорт вновь синтезированной мРНК в эту структуру из мест транскрипции, где находятся активно транскрибирующие хромосомы (Tesarik et al., 1983; Motlik et al., 1984; Crozet et al., 1986). С этой точки зрения, описанная трансформация ядрышковой структуры, по-видимому, отражает изменения и в функции этой органеллы - из места синтеза рибосомной РНК она превращается в места хранения информационной РНК. Компактное фибриллярное ЯПТ, таким образом, может рассматриваться как специфический запасающий компартмент, несущий информацию для трансляции ряда белков (Tesarik et al., 1983). Такая гипотеза частично подтверждается экспериментами на ооцитах и эмбрионах мыши (Кореспу et al., 1995), в которых была прослежена судьба РНК, синтезированной ооцитами из преовуляторных фолликулов. Заметные количества меченой 3Н-уридином РНК выявлялись в пронуклеусах

партеногенетических эмбрионов, которые развивались из таких ооцитов. В дальнейшем, высокая концентрация этой меченой РНК была отмечена в предядрышках (ПЯ) бластомеров. Исходя из этих наблюдений, авторы предполагают, что большая часть медленно метящейся РНК, которая накапливается в ЯПТ, является информационной, синтезированной ооцитом в конце диплотенной стадии, и эта материнская РНК аккумулируется в ПЯ в большей степени, чем где-либо в ядре эмбриона. Такой уникальный способ передачи РНК от ооцита в эмбрион, возможно, объясняет специфическую морфологию компактных постядрышек и предядрышек (ЯПТ и ПЯ) в ооцитах и в эмбрионах млекопитающих (Kopecny et al., 1995).

Нужно отметить, что в последнее время опубликованы данные о том, что не только ЯПТ может быть неким пунктом аккумуляции различных типов мРНК, но и ядрышко может служить промежуточным звеном в ядерном экспорте этих макромолекул. Получает развитие «старая» идея об обязательном участии ядрышка в процессах перехода некоторых видов мРНК из ядра в цитоплазму (Harris, 1978 цит. по Pederson, 1995). Так в ряде работ были продемонстрированы доказательства появления поли(А)+РНК в ядрышках, перед их транслокацией в цитоплазму (Pederson, 1995).

Ультраструктура ядер ооцитов из полостных фолликулов мыши. Изучение морфологии ядерных структур диплотенных ооцитов мыши, выделенных из антральных фолликулов, было проведено с целью выяснить, соответствуют ли они идентичным структурам в ядрах ооцитов человека. Поскольку в ходе исследования ооцитов человека возникла необходимость в проведении экспериментов по непрямой иммунофлуоресценции, а получить биопсийный материал в количестве достаточном для таких опытов не представлялось возможным, в качестве модельного объекта были использованы ооциты мыши. Известно, что под воздействием фолликулостимулирующего гормона, в яичнике мыши образуется до 100 антральных фолликулов. Ооциты, полученные из таких фолликулов, исследовались на электронномикроскопическом уровне и использовались для проведения иммуноцитохимических экспериментов.

В ядре ооцита мыши центральное положение занимает ЯПТ, которое по своей морфологии соответствует ЯПТ из ядер ооцитов человека. Это плотное округлое образование, основу которого составляют фибриллы 3 нм в диаметре. Зональность в структуре ЯПТ не выявляется. Хроматин распределяется в

кариоплазме в виде пучков тонких филаментов, которые агрегируют вокруг ЯПТ. Небольшая часть хроматина сильно конденсирована и непосредственно связана с поверхностью ЯПТ. Ни в одном исследованном ядре, не была найдена типичная лопастная кариосфера, характерная для ядер ооцитов человека. По-видимому, Фельген-положительное кольцо, выявляемое на светооптическом уровне в диплотенных ооцитах мыши (Зыбина, 1968), создают тонкие фибриллярные пучки хроматина, которые окружают ЯПТ со всех сторон. Вместе с хроматином к ЯПТ подтягиваются ядерные тельца, представляющие собой скопления гранул, размер которых соответствует интерхроматиновым и равен 15-20 нм. В ядрах ооцитов мыши насчитывается до 10 таких кластеров.

Таким образом в ядрах диплотенных ооцитов мыши присутствуют конденсированные хромосомы, ЯПТ и КИТ, которые по основным признакам, соответствуют ядерным структурам в ооцитах человека.

Распределение фаеторов созревания РНК в ядрах диплотенных ооцитов и ранних двухклеточных эмбрионов мыши. Двухклеггочные эмбрионы мыши исследовались с целью выявить распределение факторов сплайсинга пре-мРНК в ядрах, где процесс синтеза мРНК еще не запущен. Известно, что на ранних стадиях развития зародыша (у мышей до четырехклеточной стадии) эмбриональный геном не транскрибируется.

При использовании моноклональных антител а-5С35, выявляющих фактор сплайсинга 5С35, отличной от мяРНП природы, в ооцитах мыши было выявлено кластерное распределение метки. Причем количество кластеров соответствовало числу КИТ, выявляемых на ультраструктурном уровне. Некоторые кластеры связаны или лежат на поверхности ЯПТ. ЯПТ, расположенное в центре ядра, фактор сплайсинга ЭС35 не содержит. Подобная картина распределения метки а-8С35 наблюдается в ядрах двухклеточных эмбрионов мыши. Отличие состоит лишь в более мелких размерах кластеров. Предядрышки эмбрионов также, как ЯПТ в ооцитах, не содержат данный фактор сплайсинга.

На препаратах ооцитов, окрашенных с помощью моноклональных антител У-12 к Бт-эпитопу, общему для белков, связанных с мяРНП, свечение имеет несколько иной характер. Наряду с расположением метки У12 в скоплениях на поверхности ЯПТ и в нескольких кластерах в кариоплазме, наблюдается дисперстное, очень слабое свечение в ядре, что соответствует данным по ультраструктурной локализации этих факторов сплайсинга в ядрах ооцитов

человека (см. ниже). В ядрах двухклеточных эмбрионов мыши распределение метки Y12 такое же, как и в ядрах ооцитов. На фоне слабого диффузного свечения в кариоплазме наблюдаются ярко-светящиеся кластеры и скопления метки вокруг нескольких предядрышек.

Распределение факторов созревания РНК в ядрах диплотенных ооцитов из антральных фолликулов человека. К началу 90-х годов было создано новое направление, в рамках которого изучаются внутриядерные домены, вовлеченные в созревание РНК (см.обзор Spector, 1993). Был выявлен ряд ядерных структур в соматических клетках млекопитающих, содержащих компоненты сплайсинга пре-мРНК. Среди них отмечаются: перихроматиновые фибриллы (ПФ), "coiled bodies" скрученные тельца (СТ) и кластеры интерхроматиновых гранул (КИТ). Значение этих структур в метаболизме РНК остается до конца невыясненным.

Начиная данное исследование, мы руководствовались представлениями о том, что прояснению некоторых аспектов этой сложной проблемы мог бы способствовать аяаллз пространственного распределения факторов сплайсинга в ядрах клеток различного происхождения. Существенным представлялось изучение такого распределения в течении цикла "активация - инактивация" процессов транскрипции на широком круге объектов, включая те из них, где этот цикл физиологически детерминирован. Нами было проанализировано распределение факторов сплайсинга (мяРНП и SC35) на фоне поэтапного затухания транскрипционной активности ядер ооцитов из антральных фолликулов человека. Кроме того в результате экспериментов по определению в ядре ооцита человека других структур, содержащих факторы сплайсинга - СТ, была выявлена ядерная локализация маркерного белка СТ - р80 коилина.

Ультраструктурные и авторадиографические исследования показали, что в зависимости от расположения внутриядерных структур и интенсивности включения Н3-уридина, ооциты из антральных фолликулов человека распадаются на три группы, которые составляют последовательный ряд стадий: активная, промежуточная и неактивная. Последняя характеризуется сильной компакгизацией ядерных структур и концентрацией их в одном ограниченном участке ядра.

Активная стадия. При окрашивании серийных срезов ядер ооцитов 1-й группы антителами Y-12 к Sm-эпитопу мяРНП, метка коллоидного золота распределялась по всему ядру равномерно. Плотность мечения, измеренная в ядрах из трех

ооцитов (по 7 срезов на каждое ядро), составила в среднем 7 гранул золота на 1 мкм2. Метка связана с контрастными фибриллами, относящимися, очевидно, к разряду перихроматиновых фибрилл (ПФ). Особенно отчетливо эта связь прослеживается возле фибриллярных масс конденсированного хроматина. КИГ практически не метятся антителами к мяРНП.

Иммунолокализация фактора сплайсинга ЭС35 проводилась на срезах, которые составляли серии со срезами, использованными для мечения антителами У12. При этом кариоплазма метилась менее интенсивно по сравнению с меткой У12, Также как мяРНП, БС35 локализуется на фибриллах, в том числе на тех, которые контактируют с блоками конденсированного хроматина. Однако преобладающая часть метки ос-5С35 сосредоточена в КИГ. При этом мечекию подвергается гранулярная часть КИГ, в то время как их фибриллярные зоны остаются свободными от гранул золота.

Таким образом, общая картина распределения мяРНП и БС35 в кариоплазме точно соответствует локализации факторов сплайсинга в связи с перихроматиновыми фибриллами и КИГ в ядрах соматических клеток млекопитающих (Ракап а а1.,1984; Риуюп е1 а1.,1984; Кореспу й а1.,1991; БресЮг е1 а1.,1991; Ракап, 1994).

Вместе с тем нужно отметить следующий факт: в одном и том же активном ядре ооцита человека плотность мечения а-мяРНП в кариоплазме всегда выше, чем плотность мечения а-БС35; в то же время в КИГ этих же ядер наблюдается полное доминирование а-БС35 метки. Видимо возможны два объяснения этого факта. Первое - такое различие в плотности мечения кариоплазмы У12 и а-ЭС35 можегг отражать реальное соотношение этих двух факторов, требуемое в данный момент времени в местах активного сплайсинга. Второе - это различие вызвано разницей в функциях этих двух факторов сплайсинга и во времени их функционирования в составе сплайсосомы. Ь'С35, вероятно, участвует в сборке сплайсосомы на самых ранних ее этапах, обеспечивая, как готовность РНК к сплайсингу, так и непосредственное узнавание сайтов этого процесса на первичном транскрипте (Ри , Маша^, 1990; Би, 1993;1995; Мап1еу, Таске, 1996). В связи с этим можно предположить, что БС35 заканчивает свое функционирование в составе сплайсосомы раньше мяРНП и начинает накапливаться в КИГ еще до того, как сплайсинг закончился.

Плотное фибриллярное ЯПТ не содержит метки к Sm-эпитопу мяРНП и к SC35, но отчетливо метится антителами к р80 коилину. Такой характер мечения ЯПТ прослеживается и на всех последующих стадиях развития ооцита. Следует отметить нарастание антикоилиновой метки в ЯПТ, с выходом на максимум, на стадии кариосферы.

Промежуточная стадия. При иммунолокализашш мяРНП выявлено их значительное уменьшение в кариоплазме. По сравнению с активной стадией, количество метки падает до 1,4 на мкм2 (ср. с 7 на активной стадии). В то же время происходит накопление мяРНП в КИГ, где они локализуются преимущественно в их фибриллярных зонах. С другой стороны, антитела к SC35, сохраняя в кариоплазме уровень мечения, соответствующий предыдущей стадии, отчетливо локализуются в КИГ. На данной стадии развития ооцита КИГ располагаются как около ЯПТ, так и лежат свободно в кариоплазме. Можно проследить связь КИГ с материалом хромосом около ядерной оболочки и в центральных районах ядра. Метка a-SC35 выявляется сугубо в гранулярной части КИГ. Таким образом, в одной ядерной структуре (КИГ) наблюдается своеобразная сегрегация в локализации факторов сплайсинга. Фибриллярные зоны в КИГ занимают мяРНП, а в гранулярной части находится фактор сплайсинга SC35. Нами получены данные о тесной ассоциации фибрилл из фибриллярных зон КИГ и фибриллярного материала, расположенного на периферии конденсированного хроматина. В некоторых случаях картины, полученные на серийных срезах, могут указывать даже на взаимопереход фибрилл этих двух фибриллярных образований. Следует подчеркнуть, что этот предположительно "общий" фибриллярный материал не метился антителами к ДНК. Принимая во внимание всю совокупность полученных наблюдений, можно думать, что фибриллярные зоны КИГ состоят из фибрилл РНП и, по крайней мере, часть их представляет собой перихроматиновые фибриллы (ПФ), которые в свою очередь, как известно, связаны с мяРНП (Fakan et al., 1984; Puvion et al., 1984; Kiseleva et al., 1994). В некоторых работах описана возможность миграции ПФ из перихроматиновых зон в интерхроматиновую область (Fakan et al,, 1976; Puvion, Moyne, 1978; Fakan, Puvion, 1980; Visa et al., 1993). На основании этих данных, можно предположить, что ПФ могут транслоцироваться в КИГ для завершения их процессинга (Fakan, 1994). Наличие в ядрах ооцитов человека фибриллярных зон КИГ с а-мяРНП мечением может указывать на

существование среди ПФ такой популяции, которая содержит долгоживущую, стабильную форму РНК. Именно такая форма поли(А)*РНК была недавно выявлена в КИГ соматических клеток млекопитающих (Huang et al., i 994). Было показано, что та поли(А)'РНК, которая содержится в КИГ, не исчезает после подавления работы РНК-полимеразы II, тогда как перихроматиновые фибриллы диссоциируют, что подтверждает факт наличия в этих структурах пре-мРНК. Так как известно, что пре-мРНК и мРНК является короткоживущей, то содержащаяся в КИГ поли(А)*РНК, по-видимому, может представлять собой новый класс стабильных ядерных РНК (Huang et al., 1994). С другой стороны, следует иметь в виду, что в фибриллярных зонах КИГ может быть представлен и другой РНП материал, относящийся к некоторым продуктам метаболизма РНК, например ее фрагменты, содержащие интроны. В настоящее время, кроме нескольких общих утверждений, мало что известно о судьбе "вырезанных", в период процессинга пре-мРНК, интронов (Quian et al., 1992; Laurence et al., 1993) и совсем нет данных о связи метаболизма этих интронов с определенными ядерными структурами. Вместе с тем предполагается, что именно КИГ могут вовлекаться в процессы ядерной деградации интронов (Raska, 1995).

Для определения колокализации SC35 фактора сплайсинга и р80 коилина в ЯПТ, были проведены эксперименты по двойному окрашиванию этих антигенов на одних и тех же срезах. Было показано, что в ядрах ооцитов человека р80 коилин и SC35 расположены в разных структурах. Метка а-коилина выявляется исключительно над плотнофибриллярным ЯПТ. Тогда как лежащие рядом КИГ содержат только метку a-SC35. КИГ, которые находятся в других районах ядра, также окрашиваются антителами к SC35. Метка а-коилина ни в одной другой структуре, кроме ЯПТ, выявлена не была.

Неактивная стадия. ЯПТ также как и на предыдущей стадии метится только антителами к р80-коилину. Причем в этом случае плотность мечения заметно выше. Как и на активной стадии в ЯПТ не выявляется SC35. В то же время, на тех же срезах КИГ демонстрируют интенсивное мечение антителами к SC35. Характер включения не изменяется, метка a-SC35 располагается только в гранулярной части КИГ. мяРНП выявляются только в КИГ и отсутствуют в кариоплазме. Причем метка накапливается селективно: антитела к мяРНП занимают только фибриллярные зоны. мяРНП в ЯПТ отсутствуют, как и на предыдущих стадиях. В кариоплазме не отмечено включение ни a-SC35, ни Y12.

По-видимому, в период образования кариосферы, факторы сплайсинга в ядрах ооцитов человека, из кариоплазмы переходят в КИГ и располагаются в двух зонах: мяРНП занимают фибриллярную зону КИГ, а фактор сплайсинга SC35 -гранулярную.

На конечных стадиях оогенеза, на фоне полного прекращения синтеза РНК и формирования кариосферы в ядре ооцита, четко прослеживаются две линии поведения факторов сплайсинга - их поэтапный выход из кариоплазмы и концентрация в КИГ. При этом наблюдается аккумуляция практически всей метки в КИГ и почти полное ее исчезновение в кариоплазме. Таким образом, представленные морфологические и нммуноэлектронные результаты, согласуются с данными по увеличению размеров КИГ, приобретению ими округлой формы в неактивный период, к концу оогенеза. Подобная морфодинамика КИГ наблюдается и в соматических клетках млекопитающих, в условиях искусственного подавления транскрипции. Под воздействием а-аманитина (Spector et al., 1993), а также DRB (Spector et al., 1983) отмечаются изменения в форме "speckles", которые становятся округлыми и дают исключительно яркую окраску. Связи между ними отсутствуют, по сравнению с контролем. Крупные, округлые агрегаты, которые отчетливо метятся антителами к факторам сплайсинга, соответствуют на ультраструктурном уровне КИГ. При инактивации транскрипции, в ядрах преовулягорных ооцитов и ранних двухклеточных эмбрионов мыши, описываемые факторы сплайсинга пре-мРНК, также имеют явное доменное распределение и локализуются в «speckles». Поэтому существуют достаточные основания рассматривать КИГ в ооцитах человека в качестве мест накопления и хранения факторов сплайсинга. Это заключение соответствует гипотезе Факана (Fakan et al., 1984; Fakan, 1994). Если основная функция КИГ - хранение факторов сплайсинга, то накопление этих факторов в КИГ неактивных ядер ооцитов можно рассматривать, как их возвращение в места хранения после прекращения процессов сплайсинга. Подобные выводы были сделаны и по результатам экспериментов на соматических клетках млекопитающих, при ингибировании сплайсинга пре-мРНК некоторыми олнгонуклеотидами и антителами (O'Keefe et al., 1994). Биохимический механизм, который обеспечивает возвращение таких факторов сплайсинга, как SC3S в КИГ, после подавления транскрипции, возможно, представляет собой дефосфорилирование этого белка (Mistelli,Spector, 1996; 1997).

С другой стороны, во время активизации ядра, фосфорилирование SC35 специфическими SR-протеинкиназами может способствовать высвобождению данного фактора сплайсинга из КИГ и переносу его в места активного сплайсинга - к перихроматиновым фибриллам (Codwill et.al., 1996; Misteli, Spector,1997).

КИГ - это единственная структура ядер ооцитов из антральных фолликулов человека, содержащая факторы созревания пре-мРНК - мяРНП и SC35. Это наблюдение входит в противоречие с результатами иммуноэлектронного анализа, проведенного на ядрах ооцитов из антральных фолликулов других млекопитающих (Kopecny et al., 1996а,b). В этих работах SC35 и мяРНП выявлялись в ЯПТ ооцитов свиньи и крысы; здесь же обнаруживался и р80 коилин, маркерный белок СТ. Основываясь на этих данных, авторы (Kopecny et al., 1996а,b) проводят гомологию между ЯПТ ооцитов млекопитающих и сферами ядер ооцитов амфибий и насекомых, играющих, видимо, важную роль в процессах метаболизма РНК этих клеток (Gall, Callan, 1989; Gall et al., 1995). Наши результаты не позволяют распространить эти соображения на ЯПТ ооцитов человека, поскольку здесь эти структуры не содержат ни мяРНП, ни SC35, но отчетливо демонстрируют наличие р80 коилина. Особенно ярко это различие выявляется в экспериментах по двойному мечению. Парадоксальная, до известной степени, ситуация с накоплением большого количества коилина в ЯПТ, может объясняться возможным участием инактивированных ядрышек в генезисе скрученных телец (СТ) или coiled bodies. Данные по связи материала ядрышек с формированием СТ при экспериментальном ингибировании синтеза рРНК (актиномицином Д или DRB) (Raska et al., 1991) или при инактивации ядрышек в условиях падения синтетической активности клетки (у зимующих животных) (Malatesta et al., 1994), были получены на разных типах клеток млекопитающих.

Что же является причиной различия в мечении антителами к р80 коилину и факторам сплайсинга одной и той же структуры в ядрах ооцитов различных видов млекопитающих? Можно предположить, что плотность фибриллярного материала, составляющего ЯПТ в ооцитах человека намного выше, чем в ЯПТ на такой же стадии в ооцитах других млекопитающих, что и является причиной недоступности антител к антигенам мяРНП и SC35. С другой стороны, такое отличие может отражать реальную ситуацию в распределении мяРНП и SC35 в ядрах ооцитов человека. Обнаруженное в нашей работе депонирование р80-

коилина в ЯПТ преовуляторных ооцитов человека вполне соответствует представлениям о существенном вкладе последних стадий оогенеза в накопление материала, обеспечивающего раннее эмбриональное развитие млекопитающих (Davidson, 1986; Wassarman , Kinlosh, 1992).

Кроме того, различия в составе ЯПТ ооцитов млекопитающих и человека могут быть объяснены неоднородностью материала, который используется для анализа ядерных структур ооцитов. При изучении литературных данных, в отдельных случаях, трудно понять на какой стадии развития находятся фолликулы, из которых получены ооциты. В основном, определение стадии сводится к размерам антрального фолликула и практически всегда отсутствуют сведения об овуляторном цикле исследумого животного. У человека формирование ЯПТ совпадает с образованием кариосферы. В ооцитах других млекопитающих, по-видимому, исследование этой структуры проводилось в «докариосферный» период и, возможно, этим объясняются такие различия в данных по составу ЯПТ.

Определенный интерес вызывает организация и состав «неактивного ядрышка» или предядрышка (ПЯ) в ядрах ранних эмбрионов млекопитающих, которое по морфологии соответствует ЯПТ ооцитов. На двух-четырехклеточных зародышах человека описана тонкая структура ПЯ - сферическое, хорошо очерченное тельце, состоящее из плотно упакованных фибрилл 3 нм в диаметре (Tesarik et al., 1987), которые отличаются от типичного фибриллярного компонента истинных ядрышек, диаметр фибрилл которого составляет 4-5 нм (Goessens, 1984; Fakan, 1986). Авторадиографические исследования показали, что модификации ядрышка синхронизированы с началом транскрипции рДНК (Tesarik et al., 1987; Kopecny et al., 1989a). В эмбрионах человека преобразования ПЯ отмечаются со стадии четырех бластомеров. Было показано, что ПЯ не содержит эмбриональной ДНК и проникновение ДНК в эту структуру из окружающего хроматина - первый шаг в раннем становлении ядрышка (Tesarik et al., 1986а). Накопление типичных ядрышковых компонентов в ПЯ отмечаются, начиная с двухклеточного эмбриона у мыши (Fakan, Odartchenko, 1980; Takeuchi, Takeuchi, 1987; 1988), с пяти-восьмиклеточного эмбриона у свиньи (Tomanek et al., 1989), с восьмиклеточной стадии у коровы и человека (Kopecny et al., 1989b; Grillo et al, 1991). По периферии плотной фибриллярной массы ПЯ возникают ФЦ и начинается формирование нуклеолонемы. Исходный компактный материал

еще какое-то время выявляется в центральной части ядрышка на протяжении нескольких клеточных циклов (Fakan, Odartchenko, 1980; Geuskens, Alexandre, 1984; Biggiogera et al., 1994). Эмбриональный нуклеологенез сопровождается возобновлением синтеза рРНК в ядрах двух-восьмиклеточных эмбрионов (Кореспу, 1989; Kopecny et al., 1989b; Tomanec et al, 1989; Grillo et al., 1991; Kopecny, Fakan, 1992). Таким образом, на уровне одной структуры -«компактного ядрышка» - мы видим картину, которая соответствует активации рДНК клетки, повторяющую, но в обратной последовательности, события, происходящий при инактивации синтеза рибосомной РНК в ядрах ооцитов млекопитающих.

Как показали наши иммуноцитохимические исследования, проведенные на двухклеточных эмбрионах мыши, ПЯ не метятся антителами к мяРНП и фактору сплайсинга SC35. Однако распределение метки в кариоплазме полностью соответствует инактивированному состоянию ядра и подобно локализации этих факторов в ядрах ооцитов. На ультраструктурном уровне нами выявлена локализация р80-конлина в ПЯ двухклеточных эмбрионов мыши. При сравнении ультраструктурной организации ПЯ эмбрионов мыши и ЯПТ ооцитов человека поражает удивительное сходство этих структур.

По предположению Тесарика (Tesarik et al., 1987) материал ПЯ - скелетный белок. С другой стороны, в свете современных данных, поскольку в ПЯ были обнаружены факторы сплайсинга мяРНП и SC35 (Biggiogera et al., 1994), возможно, они могут выполнять функцию временного хранилища факторов созревания пре-мРНК (Кореспу et al., 1996) и тем самым соответствовать ЯПТ преовуляторных ооцитов некоторых млекопитающих.

В заключение следует обратиться к развиваемой в нашей лаборатории концепции конвергентное™ схем внутриядерных перестроек на заключительных этапах оогенеза в разных систематических группах позвоночных (Gruzova, Parfenov, 1993). На наш взгляд, полученные нами данные по трансформации внутриядерной организации поздних диплотенных ооцитов человека вполне укладываются в эти представления. Наблюдающаяся на материале человека конденсация и агрегация ядерных структур, стягивание их в одном районе ядра, затухание в этот период ядерной синтетической активности соответствуют подобным морфофункциональным изменениям ядер ооцитов отдельных, изученных в этом аспекте, видов позвоночных. Это относится к рыбам

(Чубарева, 1957), амфибиям (Грузова, Парфенов, 1976; РагГепоу, 1979) и птицам (Гагинская, Грузова, 1969; Гагинская, 1972). И хотя при агрегации ядерных структур в качестве организующего центра используется различный материал (центральное тело, состоящее из аналогов поровых комплексов, у некоторых амфибий; белковые тела у птиц; постядрышко или ядрышкоподобное тельце (ЯПТ) - у млекопитающих и человека), тем не менее, в итоге у всех этих видов, значительно отстоящих друг от друга в систематическом плане, формируется тождественное образование - единый комплекс кариосферы.

Можно думать, что одной из ведущих функций такого единого, цельного образования, как кариосфера ооцитов человека, является удержание всех хромосом в определенной части ядра непосредственно перед созреванием, сопровождающимся, как известно, растворением ядерной оболочки. Ранее уже указывалось на подобную функциональную значимость кариосфер в оогенезе разнообразных групп животных (Грузова, 1975; 1977; Огигоуа, РагГепоу 1993).

2 У

ВЫВОДЫ

1. В ооцитах из антрадьных фолликулов человека на заключительных стадиях диплотены происходят поэтапные преобразования ядерной организации. Они характеризуются постепенной конденсацией основных ядерных элементов: хромосом, постядрышка - ядрышкоподобного тельца (ЯПТ), кластеров интерхроматнновых гранул (КИГ), которая сопровождается их плотной агрегацией в определенном районе ядра и формированием кариосферы. В общих чертах процессы образования кариосферы у человека и других позвоночных одинаковы.

2. На ультраструктурном уровне кариосфера в ооцитах человека - единый комплекс взаимосвязанных структур: ЯПТ, занимающего центральное положение, конденсированного хроматина и КИГ.

3. Конденсация и агрегация ядерных структур, формирование кариосферы в ооцитах человека происходит на фоне падения транскрипционной активности ядер. В состав дефинитивной кариосферы входят полностью инактивированные структуры.

4. ЯПТ ооцитов человека - сугубо фибриллярные образования, содержащие р80 коилин - маркерный белок "coiled bodies" соматических клеток млекопитающих.

5. КИГ преовуляторных ооцитов человека - динамичные комплексы гранул 20-25 нм в диаметре, среди которых обособлены фибриллярные зоны.

6. КИГ содержат мяРНП и SC35 - факторы сплайсинга пре-мРНК. В пределах КИГ факторы сплайсинга накапливаются селективно: мяРНП - в фибриллярных зонах, a SC35 в гранулярной части КИГ. КИГ ооцитов человека гомологичны КИГ соматических клеток млекопитающих.

7. Распределение факторов сплайсинга пре-мРНК в ядре ооцита человека зависит от уровня транскрипционной активности. В активных ядрах они преимущественно сосредоточены в кариоплазме в связи с перихроматиновыми фибриллами; а по мере затухания синтетической активности накапливаются в КИГ. В пнактивированных ядрах (стадия кариосферы) практически все выявляемые факторы сплайсинга сосредоточены в КИГ.

Материалы диссертации отражены в следующих работах:

1. Почукалина Г.Н., Парфенов В.Н. Электропномикроскопическое изучение синтеза РНК ядрами клеток яйценосного бугорка в фолликулах человека // Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума " Структура и функции клеточного ядра " Черноголовка, 1987. С. 247.

2. Parfenov V.N., Pochukalina G.N., Dudina L.M., Kostuchek D.F., Gruzova M.N. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (Electron microscopic and.autoradiographic data) //Gamete Research, 1989. Vol.22. P.219-23 1.

3. Parfenov V.N., Pochukalina G.N. Transcriptional activity of oocyte nuclei and follicular cells in mammalian antral follicles (fine structure autoradiography) // Proc. 4th Franco-czechoslovac meeting " Through the oocyte to the embryo", Prague, Czechoslovakia, 1990. P. 13.

4. Parfenov V., Davis D., Pochukalina G., Kostyuchek D. and Murti K. Dynamic of distribution of splicing components relation to the transcriptional state of human oocytes from antral follicles II J. Cell. Biochem. 1998. V. 68. P. 1-9.

5. Почукалина Г.Н., Девис Д.С., Костючек Д.Ф., Мурти К.Г., Парфенов В.Н. Факторы сплайсинга в ядрах ооцитов из антральных фолликулов человека //Цитология. 1998. Т.40, № 4. С. 237-249.