Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ОПЛОДОТВОРЕНИЕ СВИНЕЙ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ОПЛОДОТВОРЕНИЕ СВИНЕЙ IN VITRO"



вссрооояспю «»дим трудов«^ красного энлмкни мучжь

, мсхивдоватклашй институт ииногпюводствл

Ra правнх рукописи

< свдгина галина «шодак8иа

кудьтизмроваяме и оожжотогкнке oúi9rub сжнкя 14 у1щ> "

Специальность: 03.00.13. - физиология человека и »гаотных

-"■АВТОРЕФЕРАТ

- диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

область'

Vi 3i994 г.

.■ Работа рыпоиена в шнтро трансплантации эмбрионов с. -х . жилетных Всероссийского нзучнс-исследователь:: кого института-жи- ~ ЬОГНОВОДСТеа \ ■■'<■'. : '

Кау^ньм рук» родители: академик Л. К. Эрнст; доктор биодоги-чесяих наук, профессор Я И. Сергеев. . "''"V . V. ■■'.':"

Официальны? о;;поненТ№ доктор биологических наук, профессор В. П .Кононов; кандидат биологических наук о. К Советкин.

■■. Ведущее научное учреждение - Научно-промзтюдгт генный Зко-технологический центр по «иаотнсводству,Горки ■';. .. ^' .

Защита состоится «: . ' 1994 года в ■ .'■' час.

на заседании Специализированного совета Л 020.16. ОЯ пр:» Всеро- ■ сийско« научно-исследовательском института животноводства по адресу: 142012,. п^Ду^рпаиад Шдодьского района, Московской оелэсти

С диссертацией модно ознакомиться ь библиотек« института, .Автореферат разослан << ^ » 1ЭЯ4 г. ■ '-.¡¡■-

Ученый секретарь • , '' ■

Специализированного советк - " ■■ • ■ ■. ' '"--■..",

кандидат. биологических наук VT' И. И. инчгик

' 1. РЩЯ ^дрдкт^СРИСТККЛ РАБОТЫ <■■.

. -'.- ^ггу^уьнуугь. темы. Получение бо-кьшго количества потомков, от '.генетически. ценных .¿амок: свинейбольшое значение'ввиду ; / ^льшЙ хоэяйатьеккой:эначимости ,дЕШ11Сгр айда животных.Кроме того зля проведения работ по клеточной и генной ия/акерим, р частности .' для псрес^даи ядоря генов, а такле работ со изучению оогекеза,фол-_ '. ликулогенеза, процессов оплодотворения, и ^раннею знОрион ильного -.■..' ' ретвит^.яеобходкмо увеличение числа способных-к дододотиоренк» ■ ..'; яйцеклеток,( г^ертяев Б. JL ,10S9 ).'.-■ А..;"*"': / '■' 'л-

• ' При т^одидефндерх споеоЗах воспроизводства.из '.всего огромного фонда оода?<рв сз!*не# ^используется .гашь \минимальная,чаоть, оОщ^го запаса,, а тодацля^вдая-доля "остаетсяв яичниках.и служит н^сподь-. ' sуеыш р^»ерво^.( Левин-К. Л. ,1390 ). А-,-'■,;'

■ Эрист Л. К. »Сергеев Н. И. ,1989): . . ■': " --."А

■А . ..ШогооСешгляодм .выделе интенсификации использования репредух-

■ тквиых возшягастей. $е«лгаховяйствснннх животных является

иие проблемы дозр^ван^,оплодотворения ;и• раннего Эмбрионального *:■.■ развития. Что.позволяет использова^'рачительное количество-гене' ратнвиых клето.ге от дверных :уле> иос^е того,когда данньй.особ^.зр-' кончили свой ^онекрый путь.( Эрнст Л К. ,1993 ). *A.V

" Оэдако,. супесотзр^е .методы экстракорпорального оплодотворения оошстов, свиней позволяют лишь' в единичных случаях получать . нормальное^развитие aapp^^rt^Mattioli М. .Bacci M.L.,1S89).3

лучяем случае.после овдр^сгсворения in vitro,яйцеклетки развивают-t* ся^до 2-4 клеточной стадии (Nasal; Т.. et a). ,1983: Yoshida М. ,19й9). : ! ;• Основной причгдеой .низкого уровня " эмбрионального 'рзз ВИТИЯ ЯЙ- ■ А цеклеток свиней является неадекватность: условий созревания': и оп-Адаюзою?«^

.. . Несовершенство методов кутьтивирования и oпJ¡oдoтвcpellия'oolЦ1-•'íoв in vjtro приводит к нар^ению мейоза.и процесса слияния поло-.Авых ■ клеток ирнёадо»1:'.агоге;"к.!: дегенерадда^ '. сюда возникает необходиюсть;глубо1^.<> мучения;условий ' соэрева-,. ния и оплодотворения вне организма, усовершенствование ;'кудьтураль--•'ных .сред и; методов подготовки спермиев' к оплодотворении. • '-;АА': . ; /А Результаты; подобного'; рода4.'исследований 'позволяют/ разработать ————------'— - - - ; -—•—- ■ - vitro и в конечном итоге

_ Г£НА;. 1Дос со/.Анэхйп. ачадгыии

к-,!. 1 v. А. Т1тер а

1 ?iibV № A-3~i.

кых нриеьлсток. ■ ... ■

Д->ль и задачи исследований. 11ель» настоящей работы ягилась . •••:, опгиуиэалкя систем согревания и оглодотворения, ооцитов свиней tiV"'- >..,'•'■ vi tro. Исходя' *i3 чего, гыяи поставлен следушие задачи: • ■ -С ,

- - и^уг;кть эффектность использования различных культурадь- : ных.сред при соьреванич оэцитов свиней и определение'в яреиму-V . !Пествеи;юй «з них оптимальной продолжительности инкубации ;

-изучить действие на ооциты фоникулостимулирующрго илют-э--^ . СНИоИруГОИХ гормогсв; " '."■'■'. " ' Т- . .-. ;

' - определить оптимальный условия оплодотворения • яйцеклеток in vttrci,3K.ii04aíí подготовку С1;ермиев к оплсдотаорению; - ■ ^

. ; - исследовать .действие на ооцчты фолликулярной жидкости с в»- ;.■':'

' '• ней'* ' '■.■' '■■';;■■■' л ' . .у;

т вычсдвтй роль температуры транспортной среды иаошюдотво^'л., ранге ооцигов свиней in vitra . /.'.'-Ч --/Va.'* ; ■ ■

Чаучнгя новизна-исследований состоит в on ре деления- оптимачь- . ■ ных 1ф«тгр:1ев культивирования и оплодотворения. ооцитсв- с^иней:!,"» vitre. Бпе-рсые проведен сравнительный анализ влияния различных - -у кудтуральних сред'на:экстракорпоральное. созревание' ооцитов. Пека- : зана концентр^ционная зависимость позигигрого влияния фо.сликуло-1;;т стимулирующего и лмгеоннзирущего горионоь на согрэваиие ооцитов У in vitro. Шяснано. влияние\тежтературы рагбавлеаия во время цент-.' ркфугкровачия на' подвижность сперматозоидов после заладитации, а, - у ' так»® температуры' транспортирой<и яичников : на результаты оп^дот- '' . ' Борения. Изучено влияние гонадстропинов и фолликулярной жидкости -„у. , на оплодотаорэкие ооцитов m Vi tro. • '

Практическое значение работа Показана возможтость 'пзлноц&я- ."'■ ного созреэаяия и оплодотворения ооцитов' ьви^е^. вне-.организма.! ■' Усовершенствованы: методы культивирования и оилэдотворе f 1ия из о ли-

ровакних ооцитов. которьгемогут' Зыть ■использованы bv лабораториях.^' ' • занимающиеся еплодотворонием яйцеклеток. ,'fï> V / "Vi1

Апробация оаВотн. "Основные! пододения' диссертации докладыва-; лись h¿ í-fl Меадународной конференции (-.Харьков.. 1993 )i ' ' '■■'■',

" ; " Структура диссертаций' и объем работы,, Диссертация''состоит иэ ' - введения, обзора литературы.материада, штодов и результатов иссле-,/: дований,обсуаден»гя, ви-водов и предлолелий.' -Диссертация Сложена на •'. 103 страницах- машинописного'" текста, содержит- 9 таблиц, 1 график' и 5 ; рисунков. Список, литературы-включает 164 истоадш^.в'том чке'ле и •' 148 иностранных. .' fvyy-^y.^ î ■; ; < l ^ ï- í v .< ; :. í^í ■ ^ í "/'■"" -v V ; '

; ' j ■.; ' • z. материал и методы мссдаиовшла

' .Научко-исследсвательская работа.выполнена в центре трансг лантаци эмбрионов сельскохозяйственных жиштн'к Все ро ссийского на-■учяо-исслэдователъсяого института ."животноводства ■;> Материалом исследований служили ооцити из фолликулов д^'-^т-ром 3-е мм. вкгелешгых из яичников убитых на Подольском ияеокомби-"нате половозрелых евшей *квой-массой 90 - 10С кг. ^посредственно vпосле вскрытия Сротной похости животного,яичники отсекали и поме-fpbunt'.B .тйркюс о траяедорткой средой,в качество которой шяольэо-вали О.^Х,раствор хлористого натрия. солерлаицего 100мг/л канамицнн сульфата-или 50 кг/л гентамицин сульфата .

Для экспериментов отбирали яичники в стадии фолликулярного ■ роста или.с'развитыми"желтыми телами.Шталогическне (-кистсзныэ и ?*гсморрэгич0ские") ,'со "свежейовуляцией. и "от cynopocaux свиней от- Драковывали.';',Яичви1р(: доставляли » лабораторию в течение 1,5-2 Часов при 'температуре- неi ниже 32°С. В лаборатории, непосредственно ■■ перед кспоЛб8йванием:их 'дважды промывали в свежей транспортной .. 'среде;/¡стрировавкые.оодиты переносили в чашку. Летри (35 зг.Ю.тп) , со' средой , 197Ц з состояний иэ 1S6,87 .mM NaCl

;2,68. ^WJlííi^v^-WJgTO^Ó/iá'' mU l^lg .x -6 H¡>0, .8,09 мЧМ»гИР0д -X * 12H0,0,83 "uM; *CaC i о1,' Б - мМ - глюкоз u, 0, ЗЗмН Na-пиру вит, 50 мкг/

к« гентам1шда'сульфата,,1. ил/л ,1 Z раствора фенолового красного и j 3,000 г/л BSAj,гдедПроводилГих морфологическую оценку "под стерео'-. :микросколом при "65-100-..- кратном увеличении. Критерием пригодности ооцитов к культивироьани» сч11тал)( наличие расширяющегося лущего-' говенца, округлость формы, однородность и тонкозернистость ооплаз-мы,а'также наличиеоднородногои плотнопрялегаюивго к ооциту ком-, пакгного кумулюса, 1 v.,...■; •

Orceлакционированнне,трижды промытые,два раза в среде РВ -.1 и один раз. в среде для дозревания, ооцитыпереносили в чашу Петри (35 к 10 мм) по 30-40 оодитоа в калщуы, содержащую 2 мл' среди для созревания, покрытойтаким же количеством, предварительно автокла-• вйрованного с ней вазелинового мпс.ча. Чаики помезриш в инкуб-л-ор,: где происходило созревание ооцитов в присутствии 5 X CCV it воаду-;.-

зсё.ЭО Z влажности и температуре 38,5 - 39 °С." ■ ■ "Перенос ооцитов из одной ероды в'-.другую'проводили при

оттянутой'Пастеровской штеткк.В^кя: работы*' по постановке ооцитоп на созреванье эависило от толичеира : подгстаьляваемых к ссэрева- > ; нкю клеток и колебалось от 1: до 1^5 часов. . : • ,'*■-

. Для определения пригодности различных кул>турадьных сред для' . созревания ооцитов свиней in'vitro использовали как комплекс»««, так и.п,>эстш.содердаг^е Б5/!,сг^едь(,а именно: / .,

■ среда! ТСМ 199 на основе сбалансированного солевого рзстро-

■ ра ^лз, содерла-цей J мМ/л" глуташна; 10, нМЛл .4EFES.S6, IS иМ/л

■ NaHCO ., 50 мг/л' Г£нгамицин; сульфата, 15Z фетальноЯ сыв0(ютки телен- :

ка - тем 109 Э; •. - v.-;-/:'.М ' ' ■ J.N •

• ТСК 183Э с добгвдеяйем'й нее З.ОЬ иШл глюкозы. 2,92 Ш/д

- Сй-ла:<тата я i мй-'л }}з-»;'ирувате - ТСМ 1S9 9 мод, I; .,. .;': Л'' ...

-_ ТСМ 199 на осксве сбалаискррваийого, солевого раствора- Хгн-/ _ ' кса,содержащей те.да ^ коило но нты,что и с ре дг*ТСМ199 Э- ТСУ 1ЯЗ X; t .модяфп»вроваш:иЛ раствор ИреСк^а-Гингера (KRB)t( Toyoiia У. . : ;

V- et al. ,1Э?1) ,сод*ртааеп> S4,6>M 11*01,4,78 мЫ KCl.O« mU KHjP04i .

1,19мМ MjSf>4 X 7H20,25,07 MM HaHCOg, 1,71 «И СэС1?,5,£б мМ глюко- • • sa,2l,SB Ш На-лзктата.0,60 мМ Ма-пирувата,50 иг/л гентамицггн ■.; -,0'i. сульфата, 1 мл/л' 1 Х~раствора' фенолового красного и 4,000 г/л ЕГ>А:: у; - среда Vhttt6r.*s '('lieppe Р.С .Pitt;» 3. ^1973 ) ,содержащая . ' тех компонент«';.,что м-раствор КЙБ,но евведенвды в нее в7,72 "••• мМ NaCl, 22, G2 мМ КаНС0з.1;Б5-«М Caf лпктата'; 19,82.мИ Ыа-лактата,

*"* ■ 0,025 мМ На-лчруватаи. 1,000 г/л ES.CtoipewjHhe'"происходило при ' . :5 i СО^Б X О2 И 00'X К« в воздухе.'.'. '•'•' ' ', •

'-.:" Через 40 часов культиеирочьикя определяли ] стади» созревания. • i> Среда, в которой процент ооцитов' достигвих иетафпзи 11 Сил самым:. •:.*."

иызоккм,использовалась во всех посл*думцих зкегеримгнтах;•. ' /• '.'..'" 9 . Дал опС«д?ления норШ.:позреван11Л ' в ¿ависиыост'1- от-:' * продолж: ; v телмюсти культивировался Течение''26;29;31

33;X;33:40;44;48 часов;-. ' '. •

:*. .-' %о5ы улу'пгить';'условии" ^дьтивирования в исходную среду до-.■■ :6a.VMfiui 1;5;10:1Сч20.и»г/)«-4СГ;и^Т.Контролем^служила среда'без' ; О ^ ' гормоно* (тсн; 1В9;'Э1ЙД.:J):■ ■ ■ .л,'. . ■, Пктогенбтиче'ские' чс-следсЕанкя/Прояздьля по ь^'одк^/ГласШ-А." (1590).После ¡^льт^ррванин^сош^ Шстеросской.ги-^ -'Г-..'

; f- : п?тки огстали и группами инк>^и1Х)14ал«''« 0,7 Z растворе, хлористого, 1 ' ютляя приблизительно 5 минут. Затем переносили 10-15 Ьоцитов в', "' Д '• капле ,-раствора'хлор^ого калия на.г.редметное с'текло и нъчргаалк."; ' •

о

■-Л;- . у ■■ ■ .. .. s r--"

. покровнш стеклом, имевшего на крап каплю снеси парафина и ьазеди-.яа (1:1).Фиксировали в растворе уксуса и э-i илового спирта (3:1) в ' течении 12 часоа. Перед окрашиванием 1 % орсешюм предметное стекло помещали на 30 минут в этиловый спирт. Исследование стадии созревания проводили под фазовоконтрастным микроскопом при 400-6С0 , . . кратном увеличении. - ^

.. Классификацию стадии созревания проводили по критериям, пред-доданных Hunter R.H.F. и Polge С. ( I960 ). В отличии от критерия - оценки этих авторов в данной работе прометафаэа I относилась к стадий зародышевого пузырька Г. визикулярная стадия так как в' предварительных . пробах на случайной выборке установль но,что ис-• пользуемые яйцеклетки к началу культивирования находятся на стадии зародышевого пузырька.':: J.

.' Для экспериментов по оплодотворению ооцитрв in vrtiro испох -, - ловалась только свеяв получе иная на пункте по искусственному осе-■ менению, экспериментального хозяйства ** Кленово- Чегодаево " сперма хряков.Сперму доставляли в лабораторию в термосе,без предварите -

льного разбавления'и хранили;при температуре 16 °С в течение 16 -SO часов по методике Cheng V. Т. К. (1985).

.Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по схеме, . предложенной Hamano ¿.'и Toyoda Y. (1986), Лая. этого приблизите ль-но 10 ил сперМобогатой фракции сперш центрифугировали при 500 е <v в течение 10 мшут.1Ьсле удаления супернатанта осадок дважды про-

шали посредством центрифугирования в Б мл РВЗ.содержадего .3 мг/ Г; *. . мл ВЗА.при 600 г в течение 10 минут. Промытые сперматозоиды затем

разбавляли в среде для преинкубации до;2 jtlO8 клеток/мл и инкуби-.' ровадо в п^ мл:в каждой, при 37°(Х Через

4 часа пробирки извлекали) из инкубатора и доводили концентраций- . • .

'^ 'сперматозоидов до Z х 10^ .клеток/мд,добавляя'средудля преинкуба-;

: ivw.;;' V У V^.A^V-V.;*У;. ^■■'-VV-^v^vVC

J; Для кахтацитавди спер^ йрименяли ту-те среду; что и при соэ-

: . ревании ооцитов;но без гормонов с рН* равной 7,8 . toHueHTpa:ian'"BO-"V ,' V ;■ дороднщ, ионов уравновешивали/добашшя по каплям 7;5 X раствор

- Непосредственно перед использованием;'и после преинкубации " Определяли концентрацию« подвижность сперматозоидов в каждом об- V. • разце по общепринятой методике. '... '• i1,УV'^'V;'"

\ Концентрацию спермы определяли в счетной"кзтре Горявва по сбаеп-;.

ркнятой мотодике. v.'V;'- ■' V ■"'-" '.■■'■*'.'■ .■

V ., Для определения; температуру разделения во р.ремя подготовки ■

спермы к калацятащш на подвижность слерматоэовдов послелреинку- . . баци раствор ДальГека, содержащегоЗ. мг/ил БЗА,охло хадалк до температуры хранения спер)/ы -(16 i оставляли в итативо прч коынатной: . , »випературв; ( ь5°С ) ; н помещали в инкубатор с те»теретурой преин-

кубацим ( 37°С ). Пгсле, .часов'm:iiy6awiw определяли подвижность слермиеь.. , •"

, Дяк оплодотворения каздие 4Ö-4S ооццтов,после 44'часов куль-. ' тиаирования .переносили ь. чашку Петри с 2 ш среды, покрытой ^тачим ' количеств см парафинового наела. ..'.-''^ '

Оплодотворение ооциточ проводи лив растворе аналогичному по^... своем}*. eucTfesy среде для соэр^^ания.ие содержащий гормоны бавлениеы Ь нее вместо 15 12 Х'фетадьнсй сыворотки теленка. ' ;

суспензию зперьатозоидов, полученную пгсл*э разбаллекия до 2 х 107сперштозовдов/«л,в количестве 100 ча переносили в культураль-'-ны^ чашепе нахсдяшимися.а них ootWTaittt При эток Оишльнал кон- ■' ц.нтрадия сперматозоидов поставляла' 5 х 1С5;Vwo. . .-»Ч .'■■■■.■ "■'

Сокультивирование проводили в инкубаторе при Зв.б-З9,0°с,о Z : ■ С% в воздухе и £0Х "влажности. Черва 6-8 часов ооцигты двахад прэ- Д

-'.швали посредством осторожного' пипеткроваяил. в среде рослеяуваей 1 инкубации с целыо удаления* клеток курноса; и лизших скоплений спе?чатсэ&идсв.Диз)и®тр р&бочего.кояца НастерОЕСКОй пипетки, при * -этом разнялся, примерно .55 мкм. Посла промывки каждь1«, 10-16 яйцек-' деток поийирли в чашки с" 400 ini среды ЯМОС-2,покрытой таким, же " ..количество« парафинового'масла. Режим инкубации Зыл таким же как -...

, при сскульт:!В1фовании. Через.36 чатов' определяли количество;опло* ' - < «'.дотворенЕШ яйцеклеток. Оплодотворенными считали яйцеклэтки.в кс. - торнх черев 44.часа с момента контакта1 со сиерматовоидаыи ( в ча-.' —'сов-сокулгтивир';вакия и 36 часов'лоследуашцгй иькуб.уии ), пропсно- 'л; : дидо одно митотичсское деление..: ^ : ■ ' " '-1.'■'

. .Среда ЕУ002 состояла ИЭ 119,03 мМ NaC).4(7C mJJ KCl. 1,71 мЫ СоС12,1,10 »4M КН2Р04,1,10 ММ' X 7Н20,25,07 »У Na'!C03. С,31 б

мМ На - лируеата,25,00 мМ На - лагсгага, lO'IU/vw пешщилина G,. SO ' мкг/мл срептокицт: сульфита и 1,000 г/л ВЗА. " ■",.- \ .* V "

Чтоси порьюигь- яроцент' оплодотворенных яЛтклеток в ерзду-:. ; -. .".для.,согревания добавляли >и1юфиаарн№- гонадэтропинм. В ходе иссге- _

>■ '■'■*■''■■ '■ * .'' V , ■'■■."■ '.■""' - 7 ■ '' ■ 'У -".У - ■■

1 у..'-, даваний Сило использовано три варианта спчтов. В'пэрвом случае, к : среде для созревания добавляли 10 мкг/мл «СГ.во втором - 5 «у/мл У лг и в третьем - 10 мяг/мл <ЮГ и 5: мкг/мл ЛГ. Контролем служила среда ТСМ 199 3 мод. 1,беа гормонов. .

: , Дня исследования влияния фолликулярной жидкости на олледот- • ворение ооцитов г. среду для созреванья доОапляли 5 мкг/мл ЯГ, 10 , ыкг/мл ОСГ.и^Ю X.частично оччярнлой фолликулярной дидкости ерк-. лей. Контролем служила'среда не ссдергадзя фолликулярной жидкости.; Данная среда испольвовалась и в.экспериментах но исследованию ' влияния температуры транспортировки яичкичов на результаты опло-■ доуворения ооцитов. У.'.::'-V'С'.'Д/ ¿Ул'У Л''?'-' .V '••

Золлюцглярную жидкость' получали из фолликулов диаметром - 2-5 . ш. Центрифугировали при 1500 ё в течение 15 минут при коыъатней | . У ■■■ температуре с целью удаления клеток кумулюса"и гранудезы.Стерна-

тант фильтровали и хранили в аликвотах при. - '£0 до использова- .

;'■' Для определения влияния температуры транспортировки яичников . ■■.У на оплодотворение ооцитових доставляла! в' лабораторию' а течение 2 . '' -4 часов в. вышёуказашгоЯ. тракспортпой:среде при,температуре 10;.

.[:'■}. щ&Рс."•; ^

4°0 в течение 10 дней. Пэред использованием вое среды зквилибриро-'• ' вали в точение 1 часа. РН'среды при этом находилось в пределах 7,2 ,

."ДуУ-7,4.уу'Г-.;...-,У

• • ^Статистическую обработку 'результатов ¿юследований ' осуцест- '"■■'. узляли с• помощью'критерия Пирсона 1С•Хи-квадрат (Лахин К. А ,1030). -оРабота с этоперишктальнам материалом проходила.в стерильное '

•у-У^^зависит,; От'*' правильности:. лъных^сре д: При - постановке ^■ >

' У1-'УУна^ созревании 1 п; у 1 ооциты' порядка^находятся ■ та ;-с*гадайдияло~ ¿уУ УУ'^'>гтеяы;в'' процессе культйвирования;чзни-должны-'достигнут^ сгадии ме^; ';< ^; Ул гафазы; или ;анафааы второго деления'1 мейсзагУ,^уУ у-у'у -':' У Г;; ' у.'; ^ ;ХСмнако^ неадекватность условий^ инициации - ыёйозал: 1 п- и^ус- 'у';л

- 8 - ,

ловилм внутри организма,б конечном итоге,приводит к частичной,дет. генерации и/или неполноценному в вершению ядерного и цитоплазма -тическэго совревания ооцкта. -.', '■•. V

Ь сеязи с этим в наших экспериментах исследовали,влияние - ■ различных культуральных сред .на созревание ооцитов свиней вне организма. ■'..,■"■".' ' ; —■ ■ ■■ -

Анализ результатов данных экспериментов показал,что через 40 часов культивирования ьаибольтее количество (74 из 103) ооцитов достигает метаФазы второго деления мейоза в среде ТСМ 199'Э'мод. I (табл. 1). '■ ;. ■ : .V

/'*■'■' ■ Таблица 1'. '

Созревание ооцитов после 40 часов культивирования' Г\ ' ' : ' " • в различных питательных средах ■ . /

Исподьз/: ■ и ' стадия созревания п X , " , .Среда-: .ооцитов ЗП метафаэа I : анафаза 1+ метафаэа 11

•"..',„'■ , 'V - ..;,, i, ' : ' телоФаза! ' . ТСМ 199 Э .100 1-1,0 31-22.7 . 6-5,5 "Г 70-64,8

тем 199 мод. I 103 - 27-25,0 .', 7-6.5-. .-""74-63,5'Г тем 199 X 107 6-4Í8 . 52-48.5 ; Л 5-4.7 45-42,0 ;

. KRB . 108 10-9,3 65-СО,2 -6-5,5 ."—27-25;0 :

Vhitten's 1С8 <5-8,3 28-25,9 4 9-8.4j 62-57.4

ххх Достоверно, Ниже, чем в среде ТСЫ199 Э мод. 1 (. Р > 0,001 )

'Модификация среды ТСМ 199 Э.тй'есть''добавление 'к ней 3;05;мН глкак>зы,2.92 мН Са-лактата и 1 мМ Ь'а-пирувата,неявдяется- существенным для реинициэцил мейоаа при созревании ооцитов сриней!п;■.'.. vitro,так как процент со'зреврих:в сред^.-ТСМ .199 Э мод. 1 вш» ( 'на 3,7 X).чем в ТСМ 199 3.но его величина статистически не достовер^ на.. ;■■'-■. ■'' -—':: ■

В противоположность этомувыбор сбалансированного буферного : раствора,- который -.помимо снабжения клеток не обходимыми." ионами, важен таклв .для■поддержания осмотичрстаго,баланса,является;одним из условий полноценного созревания - in vitro. Показ'аио.что норма созревания в "среде'ТСМ 19й ка'солевом растворе-Эрла без'энергетических добавок.(. 7CW Í99 Э.-> составила164j8 X В.средг на^сбалшюиро-' ' ванном солевом растрореХенкса с -добавлением 'в-' нее .2,2 г/л. HaHCOg

(ТСМ 199 У ооциты также достигает метаФазы второго деления шео-

■....' ■ . v - Я - ■ ■

за,однако количество таких ооцитов на 22,8 % меньше ( Р > 0,01), ..чей в среде на бикарбонат ком, буфере, й составляет 42 %,

О возможности использования простых по coüTdEy сред говорит 'относительно /высокая доля созревших ооцитов, наблздаемая в среде VhitteiVs.Oaa составила 57,4 Х.что на 11.1 X ниже,чем при использовании ТСМ 139 Э и лишь'ка 7,4 X,чем в среде ТЫС 299 мод.,!. Примечательным является.то,что.процент достигших метафаэы 11 ооштов был в Vhitten's среде выше на 15,4 Z, чем а ТСМ 109 X,

'В отличии от'среды, Wiitten's норма созрэванкя в KR8 составила лишь Е5 X. При атом наблюдался характерный для условий in vitro блок на метафазе I.

.Таким образом,преимущественной.средой для созревания ооцитов .свиней является, ТСМ 199 Э мод. I,хотя разница шжду нормой созревания в данной среде и в среде ТСМ 109 Э не существенны.

■:"■■:'.. 3.2: Влияние продолжительности культивирования на созревание ооцитов свиней в среде ТСМ 199 Э мэд. I.

Временной фактор является одним из условий полноценного созревания ■ооцитов свиней in vitró. При недостаточной продолжительности культивирования они "не успевают перейти иэ более-ранних стадий ыейоза в поздние,то. есть достигнуть метафазы II. Созревшие да яйцеклетки практически сразу вступают в фазу, старения,параллельно с .чем снижается 'иг оплодотворятодяся способность,

В данномэксперименте исследовали норму созревания ооцитов свиней in vitro- в зависимости от продолжительности культивирования. -VV . .'■ ; ..■-.■■■ ;

, К.36 часам: после постановки на культивирование метафдзы II • достигло лишь'34 I- ооцитов (табл. Я). В последующем,отмечается тенденция к ускорению процесса-созревания. •

'/''■■ Так, при увеличении'продолжительности культивирования с 36 до 38 часов и с 38 до 40 часов количество созревших ооцигоа увеличивается на 16.X и'на 25 X,соответственно. "Через 44 часа культиькро-вания норма соэревания'составила бб^ х.что на 2,9 X выше,чем через' 40 часо». Причем-на гарэдьгоевой стадии не наблодглось ни одного сюцита .ГЬследуютёе:культивирование еще в течение 4 часов ( 43 часов ): не способствует процессу созревания.' -

■/-"; Таким образом, проведенные нами исследования позван-иг еде- -лать ьыг«д.что при:йсоол1'»овании » качестве среды для сезгеймнжГ',.

- 10 - '. ■ ТОМ 199 на растворе Эрла и содержащей 2,92 мМ Са-лшсгатз,1 мМ На-лирувэта,3.05 мМ глгладзм и 15 Z Детальной сыворотки теленка продолжите ль ноеть инкубация долина составлять 40 -44 часа. , ■

... Таблица 2 Созревание ооцитов в среде ТОМ 199'Э мод. 1в зависимости от продолжительности куь ти р ировакия

Время ПОПОЛЬЗОВАНО . Стадия созрозаяия. n - X

культивиро- ооцитов анаф. .1+';

' еания ЗП' ' метаф. 1 _/гелоф. I

28 30 • - ■ 22-73.3 4-13,3 4-13,3

29 30 1-3,4 20-6G.6 3-10,0 . 6-20,0

' 31 . 45 . 1-2,2 28-62. Г, ' 6-33,3 . 10-22.2

33 40 1-2,5 21-52.5 5-12,5 13-32,5,

36 , 63 ■ ■ - . 30-58,6 -5- 9,4; 18-34,0

38 60 27т45,0 3- 5.0 30-50.0 .-.

40 66 . 2-3,6 16-28,С .3- 5,3 ■ 35-62,5

44 • 52 15-28,3 3- 5.8 , 34-65>4 ■ <

. 40 ■ за , 2-5.2 11-20,2 26-66,6 ,

3.3. Влияние гонадотропинов на созревание оцитов СВШК>Й 1Г> vitro

В процессе культивирования определенная часть ооцитов дегенерирует. Причины дегенерации ооцитов в кудьтуральных средах.видимо.СЕяганы с недостаточной, сбалансированностью по своему' со^птагу литательяьм сред, нехваткой в них, в первую очередь, гормональных веществ. Совершенствование культуралышх сред предполагает выяснение роли отдельных компонентов.входящих в их состав,а такя» определение оптимальных концентраций различных добавок.

Результаты последних исследований показали.что хотя мейоз при экстракорпоральном созревании доходит до метафазы II без.каких - либо гормонов в среде согревания, добавление гонадотропинов ускоряет мейбтическое созревание и увеличивает количество ооцитов достигших метафазы II.

В наших экспериментах исследовали влияние различных доз фол-ликулостимулирукйцрго и лот^онизидующего горшков на созревание

. ■ , ■■ ■ - и '

ооцитов свиней in vitro, результаты цитошр je логическпй оценки созревших, в культуре ооцитов представлены в таблицах 3 и А.

Таблиц-» 3

Влияние различных концентраций - 5СГ на созревание ■..'... ооцитов свиней

Концент- . Испольа. * стадия „.созревания п - X

рация, . ооцитов ЗП метаф. I 1+ метаф^ II Р

мкг/мл____телси^. I .__|____

.75 ... - . 23-30,74 5-6,66 47-B2.0G

1 07 2-3.1 16-23,90 4-5.90 ■ 45-07, ГО >0,06

5 58 - 11-19.00, 3-5,20 44-75.60 >0.05

10 ■ 60 1-1,7 5- 3,40 2-3,30 £2-86,60 <0,05

15 .47 3-6.4 5-10,00 2-4,30 37-73,VO >0,05

20 70 10-14,3 14-20,OCi 4-5,70 42-60,00

Данные таблицы 3 показывают, что фолликулост и нули ру идий гормон в концентрации от 1 до 15 мкг/мл ускорял созреваний ооцитов ■ от стадии зародышевого'пузырька до метафазы второго деления мгйо-аа, за счет большей скорости перехода в Солее зрелые стадии.

Так,в контроле на метафгзе.I черев 44 часа культивирования ' находилось 30,74 X ооцитов. Добавление к среде созревания 1; 5 и 10 мкг/мл ФСГ снимало этот уровень на 6,84 I; 11,74 ■ X И 22,34 2, соответственно. Увеличение концентрации ФСГ приводило.к обратному действию. В концентрации 15 мкг/мл количество 'блоков на метафаэе I увеличивалось,по сравнения с 10 мкг/мл,на 2,2 X, а в концентрации 20 мкг/мл - на 11.6 X. -

Наибольшая норма согревания ( 86,6 X ) отмечена при концентрации 10 мкг/мл,что на 24 X, больше, чем 8'контроле С Р < 0.05 ), Повышение концентрации ФСГ до 15'- 20 мкг/мд приводит к снижению нормы созревания, в основном эасч1.-т его ингибирущего влияния на инициацию мейоза. Так,при добавлении к, среде культивирования 15 мкг/мл процент созревших ооцитов был. хотя и больше, чем Ь контроле ,на 16,1 X ( Р >0,05 ),но на стадии зародышевого пузырька осталось 6,4 X ооцитов. При 20 мкг/мл действие 4СГ выражено сильнее и про-ценг ооцитов,невозобнэвивших мейоз,составил 14,3, что почти в 2,5 раза больше;чем при добавлении 15 мкг/мл.

Введение в среду культивирования лютеевизирующего гормона во Есех концентрациях, ускоряло созревание ооцитов 1п VИго,снижая их

.'■■■. - 12 - . ■ .. ', количество на метафазе I. Боли в контроле через 44.часа культивирования процент ооцитов' нераэвившхся далее метафазы I составил 33,8,70 введение 1; 6; 10; 15 и 20 мкг/мл ЛГ приводит к снижению данного уровня на 11,8; 18,2; 17,1: 19,5 и 16.0 X, соответственно, (табл. 4). •

ЛГ", также как и ФСГ, увеличивает количественное соотношение созревших ооцитов. При добавлении к среде культивирования 1; 5;10; .15 и 20 мкг/мл ЛГ через 44 часа инкубации на метафээе II находи -лось 73,4; 80,0; 77,7; '/9,6 И 75.5 Г,что на 11,6;18,2; 15,9; .17,8 и 13,7 соответственно,больше, чем в-контроле ( 61,8 % ).Надо отметить, чго достоверная разница на0.шщалаоь лишь- при концентрации Е; 10 и. 15 мкг/мл. Наибольшая норма, созревания отмечена, при добавлении я 'среду культивирования 5 мкг/мл.

" у." Таблица 4

Влияние различных доз ЛГ на экстракорпоральное созревание*

. ' '■ ооцитов свиней ■'■".■

Йонцент-. Ьспольэ. ' ■_ стация созревания._".

рация. ' ооцитов • SII ■ метаф. I ; анаф. 1+ метаф, 11

мкг/мл ' телоф. I

-. _ ■ Б8 - 21-33,8 3-4,4- 42-61,в ♦

1 04 ' - 14-22,0 3-4,6 . :47:73,6 ■ >0.05

: б 64 ■;-■ . - 10-15,6 2-3,1 52-80,0 <0.05

10 72 1-1.4, 12-16.7. 3-4,2, 56-77,7 <0,05

15 . .49 . - , 7-14,3 3-6,1' 39-79,6 . <6,05

20 53 .. - .10-18,8 3-5,7 40-75,5 >0,06

Таким образом,наш установлено;что при экстракорпоральной созревании ооциты свиней имеют тенденцию к мейотическому созревании дали'при отсутствии гормонов. Введение в среду культивирования.' вСГ и ЛГ способствует ускорению мейотического' созревания - и данный эффект носит дозоз^висишй характер. Оптимальной концентрацией ЧССГ оказалась 10 мкг/мл и ЛГ - 5 ыкг/мл. ''-■■- ■ ■ ■

as. Еспяние тс-млературы'разбавления во время подготовки ' спермы к калацитнции на* подвижность сяер1латозоидов после ка-■ " п&цитации. . . '■- "./ _ ■ " ■ ; ■ ■

. Успех оплодотворения щ vitro во многом вавчсит ст подготоа-

кн сперматозоидов к капациташш. Предъиккубационная работа со спермой предполагает удаление с поверхности сперматозоидов аген- ■ тов семенадьной плазмы,отрицательно влиягаих на их подвижность. Основным приемом при этом является разбаллени** спермы в фи? поло! гическом или буферном растворах с последуклцимцентрифугнрованием и повторной ресуспензией осадка. • '

Известно,что движение сперматозоплов и их оплодотворякдая способность зависит от температуры окружающей среды. Особенно чувствительна к перепаду температур свежеполученная, сперма.

В данном эксперименте исследовали влияние температур разбавления во ,время подготовки'спермы к калацитации на подвижность сперматозоидов после преинкуСаиии. Результаты опыта представлены г " таблице 5..>,'..■ .-'■•■ ■■*."■■

■.": '.■-..■.' -'. Таблица 5

Рлияние температуры разбавления на подвижность ' сперматозоидов после 4'часов инкубации

■ Температура разбавления Подвижность сперматозоидов,Z

. ;,5о - бо ,"■'

'" ; ;70 - во '*■;...- .

-,7 З7°с .. . . 50 - 60 ■'■,.. .

- . Как вадно.из таблицы 5, при разбавлении раствором .Дюльбека с '. температурой 25°С подвижность сперматозоидов через 4 часа инкубз-ч : цки составило .73.*- 80 X. Испо льзовани-г разбавите ля, о хлажде иного до' : ^температуры хранения (16РСНприводило к снижению активности слер-; • иатозомдов на 20 -' 30 X. которая составляла 60 - 60 I. 7 ':Сходный результат' иабдюдали'и после .разбавления. раствором

; Дильбека при 37°С,то есть температуре последующей инкубации. ■ .Таким обраэом,'проведенные'нами исследования позволяют сделать вызоя.что при рабств со спермой,а именно во 'время подготовки ее к капацитации,все операций по удалент с поверхности спермато-^ гоидов,компонентов сем«нальноД плазмы можно проводить при комнат-.'• . ной температуре (температуре в боксе). ".'■*"-''

■ . 14 - -..-..'.•■ :

3. б. Влияние добавления к среде для иогрэвания фолликулости-. мулируюв(его и хютеоиизирующего гормонов на оплодотворение' . ооцитов свиней 1л vitro . . ;

В условиях внефолликулярною культивирования яйцеклеток в синтетических питательных средах удается получать до Ô5.1X ооцитов. достигших метафазы II. '.'.., >.'

В наших исследованиях корма созревания без какой-либо со- -, ■ культуры составило G8,5 Z, Однако,как показывают данные литерату- ■■ pu, а также результаты собственных исследований,при оплодотворении таких~ооцитов дробления не происходит. Причиной нарушения в' ошга- ; дотворении, по-видимому,является то,что синтетические среды сяо-собствуиг созреванию нуклеарных компонентов,но не обеспечивают .',;.' нормального развития цитоплазмы. -

Гонадотропные гормоны играют ведущую роль в инициации меЯозз и, как показали результаты собственных исследований, дозозависимо ускоряют процесс созревания. Однако,в настоясре.время, нет единого мнения относительно влияния гонадотропинов на формирование в оо-1.. цктах предпосылок для успешного оплодотворения, В связи с зтим мы' исследовали влияние обогащения среды для созревания ооцитов гипо- ■ фиэарными гонадотропинами,а именно ФСТ и ЛГ. Результаты экспери- .' мента представлены в таблице б...''./у','v -''Y-/ ■ '■'.<■ -

'-'■-. ■ : ' . Таблица б

* . ■ ■ ' 'h - /-.и * ■ , - - t '

. Влияние включения в среду для созревания ■'■ЯУ';''

, гонадотропинов на оплодотворение ооцитов свиней in vitro -У..

Варианты : опыта Ислользова- : но ооцитов :.у" Количество уу 2-клет. эмбрионов: • • дробления -• у„ у': .

KOHtpOdtt . (ЕСГ . лг ССГ-t ЛГ V' У.. 76 ..'■■'■' 01 . . • 78. .07/ ; . у-;ууи -у/ у • у,. го/ '; yi*;' ¿2,3 у >о. ps Щ • 1Г.9 V . >0,05: ШШ^ШШШ

■ Анализ таблицы 6 показал, что при созревании в среде • без. ka-;f кой-либо сокультуры илй гормонов не' происходот,необходимая'.для.^Г; нормального оплодотворения .внутриклеточная' ди^ренщдов'ка, так. уу ' как ни один, из поставленных на культ.чвированиа-ооцчтов^не^разви-: вззся «с 2-клеточной в стадия. ;..■ v'-v-V v^ij}

■''■■■■ ■"...■" ■.' ■ ' - W- ■ ' .

■ '■- Добавление к среде созревания гипофиэарных гонадотропинов способствовало цитоплаэштичео:с.му созреванию. Причем, в случав внесения ЛГ процент оплодотворения был на 5,6 X больше,чем при использовании одного ФЛ\

Наибольший процент дробления ( 22\9 Z ) получен в третьем варианте,то есть когда созревание ооцитов происходило d присутствии обоих гормонов,что на 10,6 - С Р > 0.05 ) больше.чем в первом варианте и ка S X,чем во втором ( *Р > 0,05 ). .

Таким образом, проведенные нами исследования позволяю: сделать вывод, что обогащение среды для созревания Фоj.лику.лостимуjи-рущкм и лйтеонизиружвдм гормонами в концентрациях 10 мкг/мл и Ь мкг/шг, соответственно, является необходимым условием не только для реинициации мейоза,но и для полноценного оплоло1всрепил оогятоь вне организма. В связи с этим и/ необходимо вкллчать с исслчдуомкх концентрациях а среду для созревания/

3.7. Влияние фолликулярной жидкости на оплодотворение оьцн-. тов свиней in vitra

В процессе созревания ооцитов,наряду с нуклеарнши избиениями происходят специфические внутриклеточные ди^^рекцкровки.при-даедве яйцеклетке способность к нормальному оплодотворении.

Как показывают даоые литература.в условии* in vitro лить у незначительного количества ооцитов,париду с созрезгли^м ядра прт-иезеодит и созревание цитоплазмы. Гонадотроличы.кач показывает данные собственных зкспери1*5нтов, улучшают данный податель. Однако, процент п&лучаемых 2-клетсчных эмбрионов остается низким.

.Известно,что процессы созр^в-'лия регулируиггея важными и далеко ке совсем понятными-'взаимодействиями между гормонами гипоФ.1-га,половыми стероидами и выргбаг ыв ае мьс; ь самих ^сллысулах Факторами. R последним,в первуи очередь.относится фолликулярная »ид- ■ . кость. . . Ï' '-'■■ . ....'.■"■ •

У Большинство экспериментаторов занимаются гсследовашьм инги-бируюцёго влияние: <£олл;;кулярной жидкости зкотракорпо|<алыюе созревание ооц:ггоя свиней, не ; замечая положительного положительного ее влияния на приобретение способности к оплолот но ренин.

■'■ ■.:'" Однако, liai ¡.о к! и др.' (1еСЙ) 'ееоСгсшт, что добавление фолликулярной кидкости• с:среду, созревания увеличивает процент яицекле-■ ТОК С С f.MiipOB3LdMCЯ Му.^КЧМ СрОнуклеусом. ЙНКГрГИСТОМП при этом

: -16 - . о ■1 ■■

были гонадотропины. • , ,

Учитывая это сообщение,ш исследовали влияние фолликулярной жидкости на оплодотворение ооцитов свиней вне организма. Полученные даннае представлены в таблице 7. _*

Таблица 7

Влияние добавления в сроду для созревания 101 фодлику- ' лярной жидкости на оплодотворение ооцитов свиней ....

Варианты : Использо- : 'Количество ■ X ■ '.■: Р

опыта вано ооцитов 2-клет. эмбрионов дробления

Контрольная ■ 143 : ,' '"'■ 28 . 20,3

Опытная 146 *; . 46 31,6 ;.< 0,05

Анализ результатов ( табл! 7) показал.что от общего количества оплодотворенных ооцитов через 44 часа с момента контакта ооцитов со сперматозоидами в контрольной группе двуклеточной стадии дробления достигло 20, ЗХ яйцеклеток. Процент дробившихся эмбрионов возрастал,если в среду для созревания ооцитов добавляли частично , очищенную фолликулярную жидкость.При этой.процентоплодотворения ! составил 31,б,«то на 11,2 X больше,чем в контроле. .. ,

■ Таким образом,проведенные нами исследования позволяют еде-" • дать вывод,что при экстракорпоральном созревании помимо включения в среду для созревания 10 мкг/мл ®СГ и б мкг/мл ЛГ нужно вводить , 10 X частично очищенной фолликулярной жидгости свиней.';!.':'.;', • . '

3.8. Влияние 'температуры транспортировки яичников свиней * на . " ' ' оплодотворяемоть фОЛЛИ(ОГЛЯРНЫХ ООЦИТОВ. :■■■> л;'

Известно,что в изолированном* органе происходят'определенные протеолитические процессы и '.накапливаются токсические вещества,"' . которые,в свою очередь,оказывают отрицательное.влияние на состоя-, ние ооцитсв в фолликулах яичника. Данное обстоятельство может привести к тому, что при последующем культгаировании'возможно зашд-' ление пр0цесса иниц11ац1!и;'мей0за- а появление признаков' аешхрон- А

н0сги. .-,'■. .у

Определенное, влияние на созреваиие^ошггов ,1п уИго могут скавывать тешературные уиловия при доотоёкз яичникоч в лаборато-рио. Однако, одяояначиогошения по данному вопросу, в настоящее время, нет; Ооэтомув данной эксперименте исследова«и влияние темпера' туры транспортировки яичников в лаборатории) на оплодотворение яйцеклеток .'-■' * '

. Ревультаты мсследовалий приведеха в таблице 8. . ' .■ ■ ' ■■ ': . . .■;■.'■■ Таблица С

Влияние температуры транспортировки яичников на оплодотворе-■..'-. ние ооцитов свиней вне организма

Температурам Испольаова- '-<. : .Количество : . ■ ' х ■ ! Р

но ооцитов • 2-клет. эмбриоков дробления

. . а ; •.* 103 ■■'. . - 9 ■■■., , 8,7 >0.001

10 97 . .13 - 13,4 >0,001

•■ 20 . . 112 41 ' 3&.6 ■ - .■

.'за -/V • ■Уу 108 ■ ' ,' "У 32 '. ; 33,0 >0,03

•у - После оплодотворения,созревших вне орган иэма.ооцитов процент опдадотвойяия.то есть количество яйцеклеток,в которых после 44 часов^ иуаьтцвирова:!!« произошло одно митотическое деление, при

температуре 20°С составил 36,б X,ЧТО 1га 3,6 Х'( Р > 0,05) Соль -

■ те.'чём пра ЗЗ°С,1]ри температуре транспортной среды ниже 20°С наб-:дкиалосьреэкое':сниданиепро яйцеклеток.

• Так,при ЗО^С количество 2- клеточных эмбрионов Сило .на 23,2 X

. иенмга.чем при 2С°С,а при.4°С - иа 27,9 X ( Р > 0,001 ). у ■ ■ V / ; Тают образом, устанослеью, что температура траксмортироски - ничников оказьшает суи®ствеяное влияние на степень оллодотгорения

ооцитов |п у>1га 0пттяльной является те^ если вся

■ процедура от получения яичников дэ аспирации ооцмтов длиться не

: Солее 4 часов 4 '.' •.••••' л У.;. Л'-

• Лу V '•■ /У:''уу.В Ы В О Д Ы . .

:.- ; 1. Различные культуральные среды в развой степени пригодны

для 'созреЕаниа ооиитов свиней_ {п'уиго.Бэлее подходявдй является Хсреда ТСа 169 ла сбалансированном солевом растворе Эрла, содержа-

■/^./^¿Г'Ч--.'... . " 1в'-'о-'>У:/.'.-У

^щзл*1мК глутамйна,10 ыЦ НЕРЕЗ,2,92 Са-лага ата, 3,05 мМ глюкозы,-,- *

1 .мы Ма-пирувата, "50 мг/л гентакицин сульфата-иШХ фетальной си- ] • . воротки теленка. В данной среда культивирование делжно продолжать- *; , ся че менее "44 часов. : У. ,'УУ'.>■••■ -^'¿УV--:У;У; У У

Добавление гш10физарных гонадотропшов улучгает. процесс -У" мейоза Оптимальной концентрацией Ф2Г'является 10 ыкг/ил и ЛГ - б : ">(К1/мл. Дитоплазматичес(я>е ^созревание невозможно '¿'среде .бег гор-

Сюшггы.;6плодотворя»?гся лишь в»¿. присутствие. Результаты оп \'. . ' ¿одотчоренш ооцитов при'ЪдйЬвремездоы вкйтенйи ФСГ'н-'

. ъ ' а- Температура: транспортной: среды является существенным услоЧ*.

^•внек при^опдодотворекии. ооцитовШ.у 1 ¿го; и до дша .'составлять ,го°С; < ■:. .;.;. 4.При.подготовке спермы к капащггации вэяаю'учитывать темпе-' ^с'ратуру/раййавителя^Вгй процедуру подготовки 'спермы ■ преиякубацш;у.

^-шма:.; проводить яри колтатно^'* температуре ' (у20г 2Е>°С У

■■'"': ч 5. Добавление ■ к среде для созревания 10 Х - частично очиарнной: V 'фолликулярной Едкости: свиней '.'из. ^фолликулов - диаметром" 2-5 мы спо-;: ■ *,1 со&ствует ^увеличению процента 'оплодотворенных яйцеклеток в'культ'5

•.Vтуре, ;.< -.-у У- .' ^"'У-У1 ■ ■ У-'^.

. '''' У; У-.- л Р Е Д'Л О.К Е Й

- ■ Б научных ^ ;- исследьваниях.;ре№шчдуетсв; для; оптимизации. уело-';. : ■ .< \ вий культивирован»« ооцитов ,;в-замкнутой ¿ШгуШ'о системе вводить ^ ч'В питательную среду для созревгнич;',,гйпо^кэарные.> гонадотропкны и .• 'фолликулярную «идкость свиней и.»йпользоватьуг'емпературннйрежим■''

■ при транспортировке яичников.^ в лабораторшу2а,;ЯС, при подготовке ■ ' . спермы хряка к капацитации температура разбавителя должна сотав- - . • ЛЯРЬ 20-25 С. у; . ', -У'.; '^;-;^ 'У'.^'/^У^ -^У.^""VУ'-"'-

• СПИСОК РАБОТ , У ' У У • У' Сингина Г. К Блияние различных культуральных сред на соарева-; цие ооцитов свиней //1-я Международная наушая конференция "Мило, ваковские чтения",алрель 1993 - г. Харьков • • <-,. ; "

Подоисано к печати 28.04.94 г. ■ л.*' ■." Тиред 90 окэ. ,; ;

Эакаа * 76 >.. . ■ ; V : ■ У частой оперативной полиграфии ВКИИИХ .