Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование внутриядерных телец и кариосферы у двух видов жуков-чернотелок

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование внутриядерных телец и кариосферы у двух видов жуков-чернотелок"

РГБ ОД

1 9 ЯНВ

На правах рукописи УДК 576.315.3:595.767.29

АЛЕКСАНДРОВА Ольга Арчпловна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИЯДЕРНЫХ ТЕЛЕЦ И КАРИОСФЕРЫ У ДВУХ ВИДОВ ЖУКОВ-ЧЕРНОТЕЛОК

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

1997

Работа выполнена в лаборатории морфологии клетки Института цитологии Российской Академии Наук.

М. Н. Грузовг ,

Научные руководители - доктор биологических наук кандидат биологических наук А. Г. Цветков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. И. Воробьев, кандидат биологических наук С.А. Филимонова.

Ведущее учреждение - Всероссийский Институт Защиты Растений.

Защита состоится 1998 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Пегербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии

РАН.

Автореферат разослан

1997 года

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л.Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Внутриядерные тельца, отличные от ядрышек, были описаны в ооцитах самых разных животных, в том числе и в ооцитах насекомах с разным типом овариол (Грузова, 1962, 1979а, Bier et al., 1967), рыб (Райкова, 1974), амфибий (Gal!, 1954), птиц (Гагинская, 1972), рептилий (Арронет, 1975) и млекопитающих (Choinard, 1973, 1975; Зыбина, 1975), а также в соматических клетках (Brasch, Ochs, 1992). Весьма вероятно, что внутриядерные тельца - достаточно разнородная группа crpyicryp, различающихся как по внутренней организации, так и по функциям.

В 80-е годы внутриядерные тельца (ВЯТ) снова привлекли внимание исследователей (Fakan, 1984; Gall, Callan, 1989). Показано, что по крайней мере часть внутриядерных телец содержит малые ядерные РНП (мяРНП) и другие факторы, необходимые для созревания вновь синтезированных РНК (Lamond, Carmo-Fonseca, 1993; Gall et al., 1995). Процессы созревания РНК являются предметом пристального внимания в последние годы. И хотя значительные успехи были достигнуты в понимании основных механизмов процессинга РНК, сравнительно мало известно о структурной организации созревания РНК в ядре (Spector, 1993; Fu, Maniatis, 1991). Тем не менее, к настоящему времени можно считать общепринятой точку зрения, что в ядре осуществляется компартментализация процессов созревания РНК, обеспечиваемая особым морфологически выраженным аппаратом рециклирования и накопления компонентов, необходимых для созревания РНК (Spector, 1993). В ходе исследований в этой области в качестве объектов использовались как ядра соматических клеток в культуре (Huang et al., 1994) и в составе тканей животных (Fakan, 1984), так и ядра ооцитов (Wu et al., 1991).

Высокая транскрипционная активность, наблюдаемая в ходе оогенеза, находит свое отражение в динамичной системе разнообразных внутриядерных структур ооцита. Сравнительное изучение последней служит как для исследования собственно оогенеза, так и для решения общецитологических проблем.

Именно в результате исследования внутриядерных структур в ооцитах амфибий в лаборатории Голла (Gall et al., 1995), была предложена гипотеза об универсальности особых внутриядерных органелл - "coiled bodies" или скрученных телец (СТ) и снерпосом, участвующих, по предположению автора, в предварительной сборке, накоплении и рециклировании компонентов, необходимых для созревания РНК, в различных типах клеток.

СТ исследовались в условиях экспериментального (Lamond, Carmo-Fonseca, 1993) и естественного (Malatesta et al., 1994) понижения транскрипционной активности в соматических клетках. В этом случае преобразования структур, содержащих факторы созревания РНК, идут по-разному, в зависимости от особенностей исследуемого объекта. Наряду с примерами значительного уменьшения количеств СТ в ядрах клеток в культуре при действии ингибиторов транксрипции (Mattera, Ward, 1993), наблюдается увеличение количества СТ в соматических клетках тканей животных впадающих в спячку (Malatesta et al., 1994).

Удобной моделью для изучения внутриядерных телец могут служить ядра ооцитов насекомых, у которых овариолы построены по мероистическому типу. В данном случае осуществляется распределение функций между ядрами ооцитов и трофоцитов - питающих клеток, относящихся к клеткам зародышевого пути. Известно, что значительная часть рРНК и мРНК при этом типе оогенеза синтезируется в трофоцитах (Telfer, 1975; Davenport, 1976; Paglia et al., 1976; Capeo, Jeffery, 1979). Ооциты с пониженной транскрипционной активностью выполняют роль накопителей сформированных транскриптов. Хромосомы в ядрах ооцитов из телотрофных мероистических овариол, начиная со стадии ранней диплотены, собраны в кариосферу, часто заключенную в капсулу, образованную волокнистым материалом (Грузова и др., 1995). При исследовании ранее других видов жуков-чернотелок было сделано предположение об участии ВЯТ в формировании кариосферы (Грузова, 19726). В ядрах ооцитов некоторых насекомых с телотрофными мероистическими овариолами отсутствуют ядрышки (Грузова, 19796). В таких ооцитах в особенности удобно изучать морфологию внутриядерных телец, поскольку исключена возможность спутать эти тельца с ядрышками.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся анализ структуры и состава внутриядерных телец у двух видов жуков-чернотелок: Tentyria nomas taurica и Tenebrio moliíor (сем. Tenebrionidae) с телотрофными овариолами, а также исследование структуры и этапов формирования кариосферы.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологию ядер ооцитов Т. nomas taurica и Т. moliíor в течение пахитенной и диплотенной стадии мейоза на свегооптическом и электронномикроскопическом уровнях.

2.Выяснить, осуществляется ли синтез РНК в ядрах ооцитов Т. nomas taurica и Т. moliíor в течение пахитены-диплотены.

3. Определить характер распределения рРНК в овариолах жуков-чернотелок.

4. Сравнить ВЯТ из ооцитов Т. moliíor с СТ из ядер соматических клеток и ядер ооцитов амфибий.

Научная новизна результатов.

Впервые детально изучена ультраструктура ядер ооцитов Т. nomas taurica и Т. moliíor на стадии пахитены-диплотены профазы I мейоза. На примере ядер ооцитов Т. moliíor у жуков из семейства чернотелок впервые показано отсутствие капсулы вокруг кариосферы.

Методом авторадиографии впервые показано сохранение способности ядер ооцитов к синтезу РНК в кариосфере вплоть до поздней диплотены.

Впервые достоверно показано отсутствие синтеза рРНК и ядрышек в ядрах ооцитов жуков-чернотелок'.

Исследование распределения факторов созревания РНК, впервые проводившееся при исследовании овариол телотрофного типа, показало присутствие структурной организации этих факторов в ядрах ооцитов из этого типа овариол.

Научно-практическая ценность работы.

Данные, полученные в ходе исследований ядер ооцитов жуков-чернотелок позволяют: 1) на основании ультраструктурного анализа и иммуноцитохимического исследования, провести классификацию ВЯТ в ооцитах

исследуемых жуков-чернотелок и сравнить их с ВЯТ в ядрах ооцитов других групп животных и в ядрах соматических клеток; 2) представить сравнительный анализ ультраструктуры кариосферы и проследить путь ее формирования; 3) оценить транскрипционную активность ядер ооцитов у исследуемых видов вплоть до стадии поздней диплотены; 4) выяснить, осуществляется ли в ядрах ооцитов жуков-чернотелок синтез рРНК; 5) обсудить возможное участие исследуемых ВЯТ в формировании аппарата созревания РНК в ядрах ооцитов.

Результаты исследований позволяют рассматривать ядра ооцитов жуков-чернотелок в качестве удобной модели для последующего изучения структурной организации созревания РНК в ядре.

Материалы диссертации могут быть использованы в курсах общей цитологии в высших учебных заведениях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" Гродно, 1990 г., на Всесоюзном Совещании "Функциональная морфология клетки", 1991 г., на XI Симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" 1993 г., на 14-ом Международном Совещании по клеточному ядру, Льеж, Бельгия, 1995г., на XX-Международном Энтомологическом Конгрессе.Италия, 1996 г., на XII Всероссийском Симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра", 1996 г.

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего названий. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования являлись яйцевые трубки взрослых самок жуков-чернотелок Tentyria nomas laurica L. (Polyphaga, Tenebrionidae), собранных в Судакском районе Крыма и Tenebrio molitor L. (Polyphaga, Tenebrionidae), культивируемых в лаборатории. Яичники изолировали в физиологической среде OR2 (Wallace et al., 1973). В этом растворе ооциты могут находиться в удовлетворительном состоянии в течение по крайней мере 20 часов.

Для световой микроскопии материал фиксировали в смеси этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) в течение 45 мин, заливали в парафин по обычной методике и готовили срезы толщиной 5-7 мкм. Препараты окрашивали гемалауном-эозином, для суммарного выявления нуклеиновых кислот -галлоцианином - хромовыми квасцами. Для выявления РНК препараты окрашивали метиловым зеленым - пиронином по Унна. Для выявления белков применяли окраску бромфеноловым синим. ДНК выявляли реакцией Фельгена.

Для выявления ДНК с помощью иодистого пропидия или DAPI и гибридизации in situ нуклеиновых кислот готовили срезы толщиной 1.5-2.0 мкм с помощью ультрамикротома Reichert-Jung. Срезы помещали на предварительно желатпнизированные предметные стекла. Препараты предварительно обрабатывали либо раствором РНКазы в концентрации 100 мг/мл во влажной камере при 37°С в течение 2 ч, либо проводили щелочной гидролиз РНК в 0.1 N. NaOH при 45°С в течение 1.5 ч. После этого срезы заключали в среду, содержащую 1 мкг/мл иодистого пропидия или 0,2 мкг/мл DAPI. Полученные препараты просматривали и фотографировали с помощью люминесцентного микроскопа Axioskop (Karl Zeiss).

Для исследования морфологии использовали также серийные полутонкие (0,5-1,0 мкм) срезы материала, заключенного в Эпон-Аралдит, которые окрашивали метиленовым синим (1%-ный раствор в 1%-ном растворе буры) при нагревании.

Давленые препараты яичников получали по методу Хулсебоса с соавторами (Hulsebos et al., 1984). Для этого небольшие кусочки овариол или ядра ооцитов помещали на силиконизированное покровное стекло в 5 мкл среды OR2 . Затем предметным стеклом касались материала, помещали на фильтровальную бумагу и давили на предметное стекло, чтобы удалить избыток среды. После этого препараты немедленно замораживали в жидком азоте, отделяли покровное стекло и фиксировали кусочки овариол в 2%-ном растворе параформальдегида в 95%-ном этиловом спирте.

В работе также использовали препараты ядер ооцитов, приготовленные по методу Голла с соавторами (Gall et al., 1981) с некоторыми модификациями. Выделенные гонады помещали в физиологический раствор OR2. Отдельные

ооциты переносили в раствор для выделения ядер (\Уи е1 а1, 1991). Ядра выделяли из ооцитов с помощью пинцетов и очищали от желтка пипетированием с помощью стеклянного капилляра с диаметром отверстия несколько превышающим диаметр ядра. Далее ядра переносили в прикрепленные к предметным стеклам камеры (Макгрегор, Варли, 1986; \Уи ег а1, 1991) с раствором для диспергирования. Препараты центрифугировали в течение 15 минут при 3700-4000 об/мин. в центрифуге Т62.1 и фиксировали в 70%-ном этаноле.

Для иммуноцитохимического анализа ядерных структур на светооптическом уровне использовали антитела, указанные в таблице 1. Непрямое иммунофлуорес-центное окрашивание давленных препаратов яичников антителами проводили по методу, подробно описанному Ву с соавторами (\Уи а1., 1991).

Таблица 1. Использованные в работе антитела и выявляемые антигены

Антитела Выявляемый антиген Авторы

Моноклональные антитела У12 Бт-эпитоп мяРНП Lerner et al., 1981

Моноклональные антитела К121 Триметилгуанозино-вый кэп мяРНК Krainer, 1988

Моноклональные антитела aSC3 5 БЛ-белок - фактор сплайсинга, отличный от мяРНП Fu, Maniatis,1990

Моноклональные антитела 17С12 фибрилларин Pollard, личное сообщение

Кроличья сыворотка R 288 белок коилин р80 карбоксильный конец (14 кДа) Andrade et al., 1993

Для электронно-микроскопических исследований исследований отдельные овариолы фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на 0,1М фосфатном или какодилатном буфере, постфиксировали в 1%-ном растворе ОзС>4 на том же буфере и заключали в Эпон-812 или в смесь Эпона и Аралдита по обычной методике.

Для электронно-микроскопического иммуноцитохимического

анализа овариолы насекомых фиксировали в растворе параформальдегида (4%) и глутарового альдегида (0.5%) в фосфатном буфере в течение 2 часов, после чего промывали в нескольких порциях того же буфера и заключали в

смолу LR White (Polysciences, Warrington). Ультратонкие срезы ядер ооцитов помещали на никелевые сеточки и инкубировали в растворе первых антител (У12, К121, 17С12, a-SC35). В качестве вторых антител использовали козлиные антитела против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с коллоидным золотом (диаметр гранул 10 нм). В качестве контроля использовали срезы, обработанные только вторыми антителами.

Ультратонкие срезы для иммуноцитохимических исследований контрастировали насыщенным раствором уранил-ацетата в воде, а для общеморфологических целей - уранил-ацетатом и цитратом свинца.

Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-7A или JEM-100С при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Для идентификации мяРНК и рРНК в ядрах ооцитов жуков-чернотелок применяли метод гибридизации in situ РНК с РНК, описанный By с соавторами (Wu et al., 1991). Матрицами для синтеза РНК-зондов антисмысловых по отношению к мяРНК, служили фрагменты генов мяРНК U1 и U2, клонированных с помощью вектора Bluescript. В случае мяРНК U1 и U2 это были фрагменты генов Drosophila melanogaster (Mount, Steitz, 1981; Alonso et al., 1984). Для синтеза меченого антисмыслового рРНК зонда использовали ECOR1 фрагмент рибосомной ДНК Xenopus laevis (Bakken et al., 1982), клонированный с помощью вектора Bluescript. Для получения меченых антисмысловых РНК-зондов использовали реакцию транскрипции in vitro. В качестве меченого предшественника добавляли Bio-11 UTP (Enzo Diagnostic, Inc) или 3H-уридинтрифосфат (148 х Ю10 Бк/ммоль, Amersham). Специфическая активность синтезированных РНК составила 108 имп/мкг. В контрольных препаратах РНК перед гибридизацией была экстрагирована путем обработки препаратов 0.1 н. NaOH в течение 1 ч при 45 0 С.

Для выявления в ядрах ооцитов жуков-чернотелок рДНК использовали метод гибридизации in situ нуклеиновых кислот рРНК - ДНК и рДНК-ДНК. рДНК (фрагмент ECOR1 рибосомной ДНК Xenopus laevis) метили методом случайного праймера, согласно рекомендациям производителя (Random Primed DNA Labeling Kit Protocol, United States Biochemical).

Перед гибридизацией препараты обезвоживали в 100%-ном этиловом спирте, затем в ацетоне и высушивали на воздухе. Раствор для гибридизации содержал формамид (40%), раствор 4xSSC (SSC содержит 0.15 М NaCl, 0.015 М лимоннокислого Na), 0,1 М Na3 РО4, 300 мкг/мл ДНК Escherichia coli, 300 мкг/мл т-РНК Е. coli. Концентрация в гибридизационной смеси меченых РНК-зондов равнялась 5-104 -103 имп/мкп. Гибридизация длилась 12-16 ч при 42° С. Для удаления несвязанной меченой РНК препараты промывали в растворе 0. lxSSC при 60°С в течение одного часа.

В опытах по мечению РНК ооцитов жуков-чернотелок 3Н-уридином яичники инкубировали в среде OR 2, содержащей 825 кБк/мл 3Н-уридина, в течение 30 минут , 1 часа, 3 часов, 20 часов, после чего сразу же фиксировали в смеси этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) в течение 45 мин. и заливали в парафин по обычной методике. Для авторадиографии использовали жидкую эмульсию NTB-2 (Eastman Kodak Со). Препараты с эмульсией экспонировали в течение 24 ч - 2 нед.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Общая характеристика строения овариол жукОв-чернотелок Tenebrio molitor и Tentyria nomas taurica.

На стадии имаго сформировавшиеся парные яичники Tenebrio molitor и Tentyria nomas taurica состоят из нескольких овариол, число которых колеблется от 6 до 10 в каждом. Овариолы T.molitor и Т. nomas taurica, имеющие мероистическую организацию, построены по телотрофному типу, т.е. трофоциты и ооциты по мере развития овариол пространственно разделяются и связь между ними осуществляется за счет трофических тяжей. В овариолах имаго T.molitor и Т. nomas taurica можно выделить 9 условных стадий развития ооцитов в зависимости от размеров, изменений в ядре и цитоплазме и от состояния фолликулярного эпителия. В каждой овариоле существует определенное количество позиций (положений), в каждом из которых могут находиться ооциты на нескольких стадиях развития. В овариолах Т. nomas taurica таких позиций 6, а в овариолах T.molitor - 5.

Овариолы двух исследованных видов построены сходно с овариолами ранее исследованных жуков-чернотелок В laps lelhifera и Gnaptor spinimanus (Грузова, Баталова, 1979). Данные, касающиеся строения овариол T.molitor, не противоречат данным полученным С. Ульман (Ullman, 1973 ) при исследовании жуков того же вида.

Морфодииамика ядерных структур в ооцнтах Tentyria nomas taurica и Tenebrio molitor.

Морфология внутриядерных телец из ооцитов Т. nomas taurica и Т. molitor. Данные световой и электронной микроскопии.

Начиная со стадии поздней пахитены (3 стадия развития ооцита), в ядрах ооцитов Т. nomas taurica и Т. molitor обнаруживаются внутриядерные тельца (ВЯТ). Количество их колеблется от 1-2 до 25-30 на ядро . Размер их варьирует от 0,3 до 7 мкм в диаметре.

На парафиновых срезах при окраске гематоксилином все ВЯТ выглядят как гомогенные плотные сферические образования, не различающиеся между собой. ВЯТ Фельген-отрицательны, после предварительной обработки срезов РНКазой окраска иодистым пропидием не выявляет в них свечения. Однако на срезах, окрашеных иодистым пропидием без обработки РНКазой, ВЯТ демонстрируют слабую флуоресценцию, что свидетельствует о присутствии в них РНК. ВЯТ окрашиваются бромфеноловым синим при выявлении общих белков. ВЯТ часто объединяются в конгломераты или формируют структуры, напоминающие бусы. ВЯТ располагаются как в непосредственной близости от хромосом и в толще формирующейся капсулы кариосферы, так и в свободной кариоплазме и в контакте с ядерной оболочкой.

Согласно электронномикроскопическим данным в ядрах ооцитов жуков обоих видов удалось различить несколько морфологических типов ВЯТ. ВЯТ 1-го типа (ВЯТ1) - мелкие сферические образования (0.5 - 2.0 мкм в диаметре). Они состоят из фибрилл и гранул толщиной 20-25 нм. ВЯТ 2-го типа (ВЯТ2) имеют такой же размер (0.5 - 2 мкм в диаметре) и состоят из тонких фибрилл, толщина которых составляет 10 - 14 нм . ВЯТ 3-го типа (ВЯТЗ), также состоящие из фибрилл толщиной 10-14 нм, отличаются повышенной электронной плотностью и сравнительно крупными размерами (до 7 мкм). В кариоплазме ооцита

обнаружены многочисленные гранулы 60-80 нм, расположенные среди фибриллярного материала, заполняющего кариоплазму.

К седьмой стадии развития ооцита в кариоплазме появляются конгломераты, состоящие из фибриллярно-гранулярных структур, аналогичных ВЯТ1 и тонкофибриллярных образований, по своей морфологии напоминающих ВЯТ2. Различные участки этих конгломератов имеют неодинаковую плотность упаковки составляющих их фибрилл и/или гранул. По-видимому, формирование крупных конгломератов из ВЯТ различных типов приурочено к поздней диплотене. Исследование ядер ооцитов лягушки Rana temporaria на 6-ой стадии оогенеза (конец диплотены) показало присутствие многокомпонентных телец (Parfenov et al., 1996), по своей морфологии напоминающих конгломераты ВЯТ из ядер ооцитов Т. nomas taurica и T.molilor. В то же время, при исследовании оогенеза R. temporaria на средней диплотене (Цветков, личное сообщение) формирование конгломератов в ядрах ооцитов, сходных с таковыми у жуков-чернотелок, не наблюдалось.

Формирование кариосферы в ядрах ооцитов Tentyria nomas taurica и Tenebrio molitor.

На стадии ранней диплотены хромосомы в ядрах ооцитов Tentyria nomas taurica и Tenebrio molitor, собираясь в небольшой области ядра, формируют кариосферу, аналогично тому, как это происходит у исследованных ранее других представителей ceM.Tenebrionidae Blaps lethiphera и Gnaptor spinimanus, (Грузова, Баталова, 1979). При гетеротрофном типе развития ооцита образование кариосферы можно считать правилом, в том числе и для насекомых с мероисгическими овариолами (Roth, 1966; Bier et.al, 1967; Fiil, Moens 1973; Fiil, 1976 а,б; 1978; Matuszevski, 1977,1978; Грузова и др., 1995). Однако сроки формирования и/или структура кариосферы могут различаться даже у филогенетически близких видов. Несмотря на сходство овариол двух исследованных видов жуков-чернотелок в отношении размерных характеристик питающих клеток, ооцитов и их ядер, строение кариосферы имеет принципиальные различия.

Кариосфера в ооцитах Т. nomas taurica начинает формироваться на стадии ранней диплотены. Конденсированные биваленты собираются в небольшой

области ядра и располагаются эксцентрично. В это время в непосредственной близости от хромосом присутствуют ВЯТ различных размеров (от 0.5 до 3 мкм). На б-ой стадии оогенеза вокруг кариосферы начинается формирование волокнистой капсулы. Формирование капсулы - сложный многоступенчатый процесс. Анализ серийных парафиновых срезов обнаружил несколько этапов формирования капсулы кариосферы. В ооцитах, достигших шестой стадии развития, происходит формирование первых волокон капсулы. На этом этапе капсула на светооптическом уровне выглядит как отдельные тяжи волокнистого материала, располагающегося в кариоплазме в тесной связи с кариосферой. К этому моменту диаметр капсулы составляет 20 - 25 мкм, а диаметр ядра ооцита составляет около 60 мкм. Многочисленные ВЯТ находятся в клубке хромосом, в толще волокнистого материала капсулы и в кариоплазме. Постепенно отдельные волокна капсулы на светооптическом уровне становятся неразличимыми, формируя гомогенный "аморфный" материал, окружающий кариосферу. На этом этапе мелкие ВЯТ практически исчезают из области хромосом. Одновременно с этим в толще волокнистого материала появляется некоторое количество более крупных образований (около 3 мкм). По мере дальнейшего формирования капсулы кариосферы мелкие ВЯТ появляются и исчезают в прихромосомной области периодически.

Многократное появление-исчезновение ВЯТ связано со структурными изменениями в формирующейся капсуле, при этом следует отметить, что волны исчезновения ВЯТ связаны со ступенчатым характером уплотнения материала капсулы. За первой волной формирования таких телец, одновременно с их исчезновением, непосредственно вокруг кариосферы в капсуле появляется более плотная зона. После второй волны появления мелких ВЯТ в кариосфере при неизменном строении капсулы, их исчезновение сопровождается образованием значительного количества крупных телец, локализованных вне капсулы, в том числе и на периферии ядра. Третья волна появления- исчезновения телец сопряжена с уплотнением наружной зоны капсулы, а четвертая - завершается формированием плотной гомогенной капсулы, в которой присутствуют 2-3 крупных внутриядерных тельца. Материал капсулы кариосферы на этом этапе подобен материалу зон уплотнения капсулы на предыдущих стадиях. Далее,

когда диаметр ядра ооцита достигает 100 - 112 мкм в диаметре, плотная капсула кариосферы приобретает вакуолизированный вид.

На электронномикроскопическом уровне связь между материалом капсулы и ВЯТ различных типов видна еще более отчетливо. К моменту, когда по светооптическим данным капсула кариосферы состоит из отдельных тяжей, на электронограммах можно обнаружить , что они представлены поперечно исчерченными нитями толщиной около 40 нм и сравнимы по морфологии с центральным элементом синаптонемного комплекса. Иногда такие нити лежат в несколько рядов. Формирование капсулы кариосферы за счет дериватов синаптонемного комплекса описано для некоторых комаров (Aedes aegipti, Culex pipiens, Anopheles gambiae) (Fiil, Moens, 1973; Грузова и др., 1995). Тяжи капсулы выходят из области тесного контакта ВЯТ1 и хромосом в центре кариосферы.

Сформировавшаяся аморфная капсула выглядит, как сеть переплетенных между собой тяжей, в которых составляющие их гранулы лежат рыхло и связаны фибриллярным материалом. Тяжи капсулы структурно связаны с ВЯТ1 и ВЯТ2.

Тесный контакт нитей капсулы с ВЯТ разных типов, хорошо заметный при электронномикроскопических исследованиях и анализе серийных парафиновых срезов ядер ооцитов на различных этапах формирования капсулы, указывает на участие ВЯТ в формировании капсулы кариосферы. У исследованных ранее видов жуков-чернотелок описано многократное появление-исчезновение ВЯТ, коррелирующее с волнообразным характером формирования капсулы, что может свидетельствовать о переупаковке материала ВЯТ в волокна капсулы (Грузова, 19626). Тесный контакт материала капсулы и ВЯТ показан у многих насекомых (Грузова, Зайчикова, 1968; Грузова, 1972, 19796; Matuszevski etal., 1977; Грузова и др., 1995).

Можно утверждать, что капсула кариосферы Т. nomas taurica имеет двойственное происхождение, формируясь как за счет поперечно-исчерченных фибрилл толщиной около 40 нм, напоминающих центральный элемент синаптонемного комплекса, так и за счет материала ВЯТ.

В ядрах ооцитов Т. molilor на четвертой стадии оогенеза хромосомы собираются в небольшом участке ядра. Формируется кариосфера. В ходе развития кариосферы ее диаметр практически не меняется и составляет 7-10 мкм, в то

время как диаметр зародышевого пузырька возрастает от 20 мкм в ооцитах на 4 стадии оогенеза до 90 мкм в поздних вителлогенных ооцитах. Важно подчеркнуть, что на всех этапах своего развития кариосфера Фельген-положительна. Исследование срезов овариол, окрашенных иодистым пропидием, после обработки препаратов РНКазой или гидролиза РНК 0.Ш №ОН, подтвердило, что кариосфера на всех этапах своего формирования является единственной структурой ядра, в которой обнаруживается ДНК.

На начальных этапах формирования кариосферы в ней можно различить отдельные биваленты. "Молодая" кариосфера имеет вид ретикулярного хроматинового клубка. На ультраструктурном уровне в нем выявляются глыбки конденсированного хроматина, которые окружены фибриллярно-гранулярным материалом, напоминающим материал ВЯТ1. Постепенно, как правило к пятой стадии развития ооцита, хромосомы теряют свою индивидуальность. Кариосфера на этом этапе "созревания" представлена на электронограммах вакуолизированной массой высокой электронной плотности, в которой отдельные биваленты неразличимы. Фибриллярно-гранулярный материал, окружающий кариосферу, также становится более электронноплотным. В течение 5-6 стадии развития ооцита происходит уплотнение и вакуолизация кариосферы. В ядрах поздних вителлогенных ооцитов на 7 - 8 стадиях оогенеза в кариосфере формируется центральная полость. На ультраструктурном уровне видно, что внутри электронноплотного кариосферного "кольца" присутствуют каналы, которые связывают центральную полость кариосферы с окружающей ее нуклеоплазмой. В отдельных участках такие каналы расширяются, образуя лакуны. В центральной полости кариосферы и в ее лакунах обнаруживаются сгущения рыхлого фибриллярного материала. С кариосферой, как правило, связаны ВЯТ первого, второго типов и сложные ВЯТ, образованные материалом телец первого и второго типов. Если на начальных этапах формирования кариосферы (ретикулярная кариосфера) наблюдаются контакты отдельных ВЯТ с бивалентами, то сформировавшаяся кольцевидная кариосфера представляет собой плотно упакованный материал конденсированных бивалентов и фибриллярно-гранулярный материал по своей морфологии аналогичный

материалу ВЯТ. Кроме того наблюдается контакт кольцевидной кариосферы и ВЯТ 1 и 2.

Различие в структуре кариосферы Т. nomas taurica и T.molitor может быть связано с условиями обитания и длительностью жизненного цикла у рассматриваемых жуков-чернотелок. Т. nomas taurica, так же как и ранее исследованные В. ¡ethiphera, G. spinimanus, переживает стадию "зимовки". T.molitor имеет короткий жизненный цикл: все время развития жука (от откладывания яиц до созревания ооцитов у имаго) занимает приблизительно 3 месяца при комнатной температуре.

Подобные различия в морфогенезе внутриядерных структур также наблюдаются у представителей отряда Díptera с политрофными овариолами. В ядрах ооцитов различных видов комаров Aedes aegipti, Culex pipiens, Anopheles gambiae (Roth, 1966; FUI, Moens 1973; Fiil, 1976 а, 6; 1978), развития которых осуществляется в течение нескольких сезонов, происходит формирование сложной капсулы кариосферы, в то время, как в оогенезе Drosophila melanogasler с коротким жизненным циклом без сезонных изменений капсула отсутствует (Mahovald, liefert, 1970; King, 1970).

Организация кариоплазмы ооцитов Tentyria nomas taurica и Tenebrio molilor в области, прилежащей к ядерной оболочке.

Ядерная оболочка ооцитов Т. nomas taurica и T.molitor, находящихся на стадии пахитены-диплотены профазы 1 мейоза, характеризуется значительным количеством ядерных пор. В обоих случаях на поверхности внутренней мембраны ядерной оболочки располагается слой электронноплотного гомогенного материала толщиной около 15 нм. Ядерная оболочка не образует инвагинаций в направлении цитоплазмы. В контакте с ядерной оболочкой обнаруживаются цилиндрические "каналы" с шириной просвета около 70 нм, которые по всей видимости могут быть образованы за счет впячивания внутренней мембраны ядерной оболочки. Материал, прилежащий к наружной стороне "цилиндров" напоминает слой выстилающий внутреннюю ядерную мембрану. В ядрах ооцитов Т. nomas taurica к моменту формирования "аморфной" капсулы кариосферы в связи с ядерной оболочкой образуются внутриядерные вакуоли. Их количество может достигать Зх-4х на участок

ядерной оболочки длиной 10 мкм. Вакуоли - электрониопрозрачные сферические образования достигающие 1 мкм в диаметре. Интересно отметить контакт вакуолей с тонкофибриллярными ВЯТ2. Материал ВЯТ2 связан с располагающимися в вакуолях тонкими нитями б нм. ВЯТ1, располагающиеся по периферии ядра, не связаны с внутриядерными вакуолями, но их фибриллы часто контактируют с внутренней ядерной мембраной. В районах цитоплазмы и кариоплазмы, прилежащих к ядерной оболочке, располагаются отдельные крупные гранулы 60 - 80 нм.

В ядрах ооцитов Т. тоШог "каналы", образованные за счет впячивания внутренней ядерной мембраны, образуют расширения от 50 до 300 нм. Такие лакуны, образованные каналами, часто погружены в фибриллярно-гранулярный матрикс. В контакте с лакунами находятся ВЯТ1 и 2. В некоторых случаях ВЯТ связаны непосредственно с ядерной оболочкой. На стадии поздней диплотены можно видеть в пределах лакун сформированные внутриядерные вакуоли, напоминающие внутриядерные вакуоли Т.потах 1аипса.

Формирование внутриядерных вакуолей, в котором принимает участие внутренняя ядерная мембрана, приводящее к образованию каналов или лакун, отмечено в ядрах ооцитов ряда позвоночных и беспозвоночных животных. В этих случаях цитоплазматический материал, попадая в перинуклеарное пространство через поры, переходит в ядро при помощи инвагинации ядерной мембраны (Грузова, 1977).

По-видимому, морфологические картины, наблюдаемые на границе ядро-цитоплазма в ооцитах обоих видов жуков-чернотелок: формирование внутриядерных лакун и каналов, контакт ВЯТ с ядерной оболочкой, а также контакт отдельных гранул 60 - 80 нм с внутренней и наружной мембраной ядерной оболочки, свидетельствуют об активном ядерно-цитоплазматическом обмене, осуществляемом в ооцитах жуков-чернотелок в течение диплотены.

Синтез РНК в овариолаи ТепеЬпо тоШог.

Для того, чтобы определить в ядрах каких клеток осуществляется синтез РНК в ходе оогенеза, овариолы Т. тоШог инкубировали в растворе 3Н-уридина в

течение 30 минут, 1 часа, 3 часов и 20 часов. После нанесения эмульсии все препараты подвергались одинаковой экспозиции.

Через 30 минут инкубации меченый предшественник включался в ядра трофоцитов, фолликулярных клеток и ооцитов. В ооцитах первой - третьей стадии развития, в которых хромосомы располагаются по всему объему ядра, зерна серебра в небольшом количестве обнаруживаются во всей кариоплазме. В ядрах ооцитов четвертой - восьмой стадии, в которых присутствует кариосфера, сформированная в той или иной степени, зерна серебра присутствуют только в области кариосферы. Цитоплазма всех исследованных клеток практически не обнаруживает включения. Единичные зерна серебра обнаруживаются в цитоплазме трофоцитов и ооцитов 1 - 2 стадии развития.

В случае инкубации в меченом предшественнике в течение 1-3 часов, 3Н-уридин включается в ядро и цитоплазму фолликулярных клеток и трофоцитов. В ооцитах 1-4 стадии развития при этих сроках инкубации 3Н-уридин включается в ядро и цитоплазму, а в ооцитах 5-7 стадии - преимущественно в область кариосферы. Незначительное количество зерен серебра обнаруживается также в цитоплазме.

После инкубации в среде с 3Н-уридином в течение 20 часов зерна серебра в значительном количестве присутствовали в ядрах и цитоплазме трофоцитов, в ядрах и цитоплазме фолликулярных клеток, а также в ядрах и в цитоплазме ооцитов 1 -3 стадии развития. В ооцитах 4-5 стадии 3Н-уридин включался в кариосферу, зерна серебра обнаруживались также в свободной кариоплазме ядер и в цитоплазме. Ядра ооцитов 6-8 стадии развития не включали 3Н-уридин, за исключением кариосферы. В то же время в цитоплазме выявлялось включение меченого предшественника.

Данные, полученные в результате исследования давленых препаратов ядер ооцитов 5-8 стадий оогенеза, полученых из овариол, после инкубации в среде с 3Н-уридином в течение 30 минут, 1 часа и 3 часов подтвердили избирательное включение меченого предшественника в область кариосферы, а также включение 3Н-уридина в кариосферу и в свободную кариоплазму при инкубации в течение 20 часов.

К настоящему времени накоплено много данных о синтезе РНК у насекомых с мероистическими овариолами. В таких овариолах ооцит получает значительную часть РНК из специализированных клеток - трофоцитов (Capeo, Jeffery, 1979; Paglia et al., 1979 a, 6).

В опытах по инкубации овариол T.molilor в среде с 3Н-уридином впервые обнаружено, наряду с интенсивным включением предшественника в ядра трофоцитов, префолликулярных, фолликулярных клеток, молодых превителлогенных ооцитов (до образования кариосферы) и ранних вителлогенных ооцитов (на начальных этапах формирования кариосферы), мечение кариосферы в ядрах поздних вителлогенных ооцитов (стадия 7-8) после инкубации уже в течение 30 минут. Это означает, что полного прекращения синтеза РНК в ооцитах не происходит вплоть до поздней диплотены.

Транскрипционная активность ядер ооцитов у насекомых с мероистическими поли- и телотрофными овариолами часто связана с синтезом рРНК (Грузова, 1977). В этом случае нередко наблюдается амплификация рДНК и формирование множественных ядрышек в ядрах ооцитов (Gall, Rochaix, 1974; Cave, 1982; Грузова и др., 1995). Одновременно с этим рРНК поступает в цитоплазму ооцита из трофоцитов (Грузова и др., 1995).

Для того, чтобы определить, ядра каких клеток являются источником рРНК, накапливаемых в течение оогенеза в цитоплазме ооцитов Т. molitor и Т. nomas íaurica, проводилась гибридизация in situ меченых тритием РНК антисмысловых по отношению к рРНК с РНК и ДНК, а также гибридизация in situ рДНК, меченой тритием, с ДНК на парафиновых срезах овариол. При гибридизации in situ РНК-РНК включение зерен серебра в ядра ооцитов не наблюдалось ни на одной из стадий оогенеза. На 1-4ой стадиях оогенеза в цитоплазме ооцитов обнаруживалось лишь небольшое количество зерен серебра, а на 5 - 8 стадиях в цитоплазме ооцитов обнаруживалось значительное количество меченой РНК. Кроме того метка обнаруживалась в гетерохроматиновых участках ядер трофоцитов, фолликулярных клеток и их цитоплазме. При гибридизации рРНК-ДНК в ядрах ооцитов также отсутствовала р ДНК. Зерна серебра отсутствовали как в свободной кариоплазме, так и в

кариосфере и в ВЯТ. Сходные результаты наблюдались в случае гибридизация in situ рДНК-ДНК.

Результатам гибридизации in situ нуклеиновых кислот, свидетельствующим об отсутствии синтеза рРНК в ядрах ооцитов Т. molilor, соответствуют данные по окраске препаратов давленых ядер и ультратонких срезов ооцитов моноклональными антителами 17С12 к фибрилларину - белку плотного фибриллярного компонента ядрышка (Ochs et al., 1985), который образует комплексы с рядом малых ядрышковых РНК, а именно с U3 и U8, вовлеченными в процессинг пре-рРНК (Peculis, Steitz, 1989; Туе, Steitz, 1993). Кариоплазма и различные типы внутриядерных телец никогда не окрашивались этими антителами.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ядрышек в ооцитах обоих видов жуков-чернотелок и о синтезе рРНК в ядрах трофоцитов и фолликулярных клеток.

Особенностями оогенеза жуков-чернотелок можно считать, во-первых, полное отсутствие синтеза рРНК в ооцитах, что позволяет использовать данный объект в качестве модельного, в котором никакие внутриядерные структуры не связаны с синтезом и процессингом рРНК, а во-вторых, сохранение способности ядер ооцитов к синтезу РНК вплоть до поздней диплотены. Распределение мяРНП и фактора сплайсинга SC-3S в ооцитах T.molitor.

Исследование распределения мяРНП и фактора сплайсинга SC-35 в ядрах ооцитов T.molitor с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания проводилось на препаратах ядер ооцитов, приготовленных по методу Голла (Gall et al., 1981), а также на давленых препаратах ядер, изолированных из ооцитов. В связи со сложностями получения такого материала на ранних стадиях развития (диаметр ооцитов на третьей стадии развития приблизительно равен 20мкм), основные результаты получены при исследовании ооцитов 4-8 стадий оогенеза. Тем не менее удалось получить несколько препаратов ооцитов, находящихся на 3 стадии развития, окрашеных с помощью моноклональных антител Y12 к Sm эпитопу, общему для белков, связаных с мяРНК, участвующими в сплайсинге пре-мРНК. В этом случае окрашиваются пахитенные хромосомы, распределенные по всему объему ядра, а также ВЯТ, располагающиеся в свободной кариоплазме.

В ооцитах, находящихся на четвертой стадии оогенеза, "молодая" ретикулярная кариосфера также дает свечение при окраске антителами Y12. Яркую иммунофлуоресценциго обнаруживают все заметные в кариоплазме ВЯТ (как ВЯТ, располагающиеся в непосредственной близости от хромосом, так и ВЯТ, расположенные во всем объеме ядра). Сходный результат получен при окраске ядер ооцитов той же стадии развития моноклональными антителами К 121 к триметилгуанозиновому кэпу, характерному для большинства мяРНК. При использовании моноклональных антител aSC35, выявляющих фактор сплайсинга SC 35, отличной от мяРНП природы, наряду с ретикулярной кариосферой, окрашивается только часть ВЯТ, а именно ВЯТ, расположенные в тесном контакте с кариосферой. ВЯТ, рсположенные в свободной кариоплазме, фактора сплайсинга SC35 не содержат.

Ко времени достижения ооцитами 5 -6 стадий развития, характеризуемой, как правило, присутствием более плотной кариосферы, характер окраски антителами Y12 и К121 остается прежним. В этом случае окрашивается как кариосфера, так и все заметные в ядре ВЯТ. При окраске антителами a SC35 кроме кариосферы и прилежащих к ней ВЯТ яркую флуоресценцию демонстрирует небольшая часть ВЯТ , расположенных в кариоплазме, в то время как значительная часть таких ВЯТ остается неокрашенной. Встречающиеся на 5 -8 стадиях конгломераты ВЯТ целиком окрашиваются моноклональными антителами У12 и К121 и частично - aSC35.

На 7 - 8 стадиях оогенеза, во время которых в ядрах ооцитов, как правило, сформирована плотная кольцевидная кариосфера, обработка препаратов выделенных ядер ооцитов антителами Y12 выявляет иммунофлуоресцентное окрашивание кариосферы и всех ВЯТ в нуклеоплазме. Кроме того, для этой стадии характерным является то, что при непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании антителами Y12 кариоплазма выглядит как сеть волокон и мелких гранул. Использование моноклональных антител К121 и aSC35 выявляет свечение кольцевидной кариосферы. Все ВЯТ ярко окрашиваются антителами К121, а часть-антителами aSC35.

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов давленых ядер и препаратов, приготовленных по методу Голла (Gall et al., 1981) показало, что

большая часть мяРНП локализуется в области кариосферы (окрашивание хромосом) и ВЯТ Однако, гибридизация in situ меченых тритием, а также биотином РНК антисмысловых по отношению к U1 и U2 мяРНК с РНК ядер ооцитов 6-8 стадии на срезах и на препаратах давленных ядер показала интенсивное и почти равномерное мечениб кариоплазмы, включая кариосферу и ВЯТ. Диффузное распределение по крайней мере некоторых видов мяРНП в ядрах ооцитов 6-8 стадии оогенеза косвенно подтверждается "сетчатым" характером окраски ядер моноклональными антителами Y12. Следует отметить, что гибридизация in situ меченых тритием РНК антисмысловых по отношению к U1 и к U2 с РНК на парафиновых срезах овариол другого вида жука-чернотелки Т. nomas lawica показала присутствие этих мяРНК в ядрах ооцитов. Меченая РНК в этом случае распределена равномерно в кариоплазме, в том числе в области кариосферы , ее капсулы и в районах нахождения ВЯТ.

При обработке ультратонких срезов моноклональными антителами Y12 и К121 обнаружено окрашивание материала ВЯТ1 и 2, расположенных в кариоплазме и в составе сложных ВЯТ. При этом материал ВЯТ2 окрашивается более интенсивно. При окраске К121 наблюдается также диффузное распределение частиц золота в кариоплазме. Антитела aSC35 окрашивают ВЯТ1, расположенные в кариоплазме и в составе сложных ВЯТ. Частицы золота при этом располагаются кластерами. ВЯТ 2-го типа антителами a SC35 не окрашиваются. Таким образом, использование моноклональных антител Y12 , К121 и a SC35 показало присутствие мяРНП в ВЯТ 1 и 2, фактора сплайсинга SC35, отличного от мяРНП, в ВЯТ1, а также наличие факторов сплайсинга в соответствующих областях сложных ВЯТ. Кроме описаных выше внутриядерных структур, моноклональные антитела Y12 окрашивают фибриллярные структуры, располагающиеся в цитоплазме ооцита в контакте с ядерной оболочкой.

На препаратах ядер 6 - 8 стадии оогенеза приготовленных по методу Голла (Gall et al., 1981) присутствуют в незначительном количестве (1 -4 на ядро) ВЯТ, состоящие из мелких субъединиц, обнаруживающие свечение при непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании сывороткой R288 против белка коилина. При окраске этими же антителами препаратов выделенных давленых ядер при общей "сетчатой" фоновой окраске кариоплазмы наблюдается присутствие

одного-трех ВЛТ на ядро, окраска которых сывороткой R288 позволяет предполагать присутствие в них коилина или коилиноподобного белка. Обработка ультратонких срезов сывороткой R288 позволила обнаружить незначительное количество окрашеных ВЯТ, соответствующих по морфологии ВЯТ2.

Таким образом, в ядрах ооцитов жуков-чернотелок на пахитенной и диплотенной стадиях профазы I мейоза, обнаружены ВЯТ, содержащие мяРНП. К настоящему времени ВЯТ, содержащие факторы сплайсинга пре-мРНК, процессинга пре-рРНК и созревания 3' гистоновых пре-мРНК, выявлены в ядрах соматических клеток, а также в ядрах ооцитов амфибий и некоторых насекомых. Часть таких ВЯТ, в составе которых обнаружен коилин, или коилиноподобный белок, к настоящему времени представляют собой скрученные тельца - "coiled bodies" (Gall et al., 1995). В то же время в ядрах всех этих клеток присутствует другой класс структур, не имеющий пока общего названия, но характеризующийся отсутствием в них коилина и присутствием главных мяРНП, а также фактора сплайсинга SC35. Это кластеры ИГ в ядрах соматических клеток (Spector, 1991) и снерпосомы в ядрах ооцитов амфибий (Gall, 1991; Wuetal., 1991).

В ядрах ооцитов Т. molitor ВЯТ, содержащие мяРНП и фактор сплайсинга SC 35 (ВЯТ1), по-видимому, гомологичны снерпосомам амфибий и кластерам ИГ соматических клеток.

ВЯТ2, согласно данным световой и ультраструктурной иммуноцитохимии, делятся на два типа. Большая часть ВЯТ2, в которых обнаруживаются мяРНП и отсутствует фактор сплайсинга SC 35, не содержит коилина, и, вероятно, может рассматриваться как второй вид снерпосом. Существование в ядрах ооцитов двух видов снерпосом описано ранее в ооцитах тритона Notophtalmus viridiscens (Wu et al., 1991). В этом случае снерпосомы, не содержащие коилина (А- и В- снерпосомы) , отличались по набору мяРНП, входящих в их состав и по наличию в них фактора сплайсинга SC 35 (Wu et al., 1991). В А-снерпосомах присутствовал только один вид мяРНП - U1 РНП и отсутствовал фактор сплайсинга SC 35, обнаруживаемый в В-снерпосомах. Возможно, что коилин-несодержащие ВЯТ2 являются аналогами А-снерпосом

N.viridiscens. Однако, отсутствие к настоящему времени данных о содержании конкретных мяРНП в ВЯТ Т. molilor, не позволяет делать в этом отношении окончательных выводов.

Небольшое количество коилин-содержащих ВЯТ, обнаруживаемых на препаратах выделенного содержимого ядер ооцитов и на давленых препаратах целых изолированных ядер Т. molilor, по предварительным данным ультраструюурной иммуноцитохимии соответствует коилин-содержащим ВЯТ2. Их можно рассматривать в качестве гомологов СТ. Известно, что CT присутствуют в клеточных линиях в условиях стимуляции роста, в случаях высокого уровня генной экспрессии (Lamond, Carmo-Fonseca, 1993), в ядрах ооцитов, активно транскрибирующих РНК (Gall et а!., 1995), а также в ядрах ооцитов насекомых с аутотрофным типом развития ооцита (Цветков и др., 1996). В ядрах клеток по предположению Голла с соавторами (Gall et al., 1995), CT служат первичным местом сборки мяРНП комплексов, участвующих в процессинге РНК, для их последующей транспортировки к местам синтеза РНК.

В случае уменьшения транскрипционной активности клеток в культуре (терминальная дифференцировка клеток, действие ингибиторов синтеза РНК, тепловой шок) количество CT в ядре уменьшается, мяРНП в значительном количестве обнаруживаются в ИГ и практически исчезают из CT (Lamond, Carmo-Fonseca, 1993). Однако, известны примеры, когда при понижении транскрипционной активности в соматических клетках животных, впадающих в спячку, количество мяРНП в CT не понижается, а общее их количество увеличивается (Malatesta et al., 1994). Вероятно, сходная картина наблюдается в ядрах ооцитов Т. molilor на диплотене к моменту частичной инактивации хромосом ооцита. Возможно, что накопление мяРНП-комплексов в CT ядер ооцитов Т. molilor может быть связано с необходимостью использования этого типа РНК в эмбриогенезе для сплайсинга пре-мРНК. Показано, что, по крайней мере, в некоторых случаях на ранних этапах эмбриогенеза не происходит нового синтеза мяРНК, а используется запас ранее синтезированных молекул (Dean, Schultz, 1990).

Ядра ооцитов Т. molilor на ультратонких срезах не окрашивались моноклональными антителами 17С12 к фибрилларину - белку плотного

фибриллярного компонента ядрышка (Ochs et al., 1985) характерному для СТ соматических клеток и СТ из ядер ооцитов домового сверчка Acheta domesticus, что связано, возможно, с отсутствием синтеза рРНК в ядрах ооцитов жуков-чернотелок.

Окраска препаратов давленных ядер моноклональными антителами aSC35 на разных стадиях развития ооцита выявила изменения в распределении ВЯТ, содержащих этот белок. Прежде всего постепенно происходит "перемещение" таких ВЯТ от области, в которой располагаются хромосомы, к периферии ядра. Кроме того, по мере развития ооцита, происходит значительное увеличение числа БСЗБ-содержащих ВЯТ. Создается впечатление, что, по мере снижения синтеза РНК в ядре ооцита, часть фактора сплайсинга SC35 с хромосом переходит в определенный класс ВЯТ, напоминая "поведение" кластеров интерхроматиновых гранул при понижении транскрипционной активности в соматических клетках.

Скорее всего ВЯТ ооцитов Т. nomas taurica сходны с ВЯТ ооцитов Г. moliior. К сожалению, ввиду недоступности материала, не представилось возможности провести аналогичное иммуноцитохимическое исследование ядер ооцитов Т. nomas taurica. Однако, данные по гибридизации in situ меченых тритием РНК антисмысловых по отношению к U1 и U2 мя РНК с РНК на парафиновых срезах овариол Г. nomas taurica продемонстрировали распределение U1 и U2 мяРНК аналогичное таковому у T.molitor. В обоих случаях в кариоплазме, в составе ВЯТ, в кариосфере, а в случае Т. nomas taurica и в материале капсулы кариосферы, в состав которой входят ВЯТ1 и 2, наблюдалось присутствие зерен серебра в значительных количествх. Таким образом, U1 иШ мяРНП обнаружены в СТ и снерпосомах, а также распределены диффузно в ядрах ооцитов жуков обоих видов.

Подводя итог вышесказаному, можно сказать, что в ядре ооцита T.molitor формируются ВЯТ, значительная часть которых гомологична кластерам ИГ соматических клеток или снерпосомам амфибий. Небольшое число ВЯТ гомологично СТ из ядер соматических клеток, СТ из ядер ооцитов домового сверчка и амфибий. Вышеупомянутые структуры в ооцитах жуков-чернотелок,

таким образом, можно, по моему мнению, называть снерпосомами и скрученными тельцами.

По мере развития ооцита, снерпосомы и СТ объединеняются в конгломераты, участвуют в формировании кариосферы, а также - в ядерно-цитоплазматическом обмене ооцита. Ввиду незначительной транскрипционной активности ядер ооцитов T.molitor , основная функция присутствующих в них снерпосом и СТ, вероятно состоит в накоплении факторов созревания РНК, используемых на ранних этапах эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Формирование кариосферы в ядрах ооцитов Tentyria nomas taurica и Tenebrio molitor осуществляется в течение диплотены. У Т. nomas taurica кариосфера окружена капсулой. У Т. molitor капсула кариосферы отсутствует.

2. В течение пахитены-диплотены в ядрах ооцитов обоих видов жуков-чернотелок морфологически идентифицируются три вида внутриядерных телец (ВЯТ).

3. У Т. molitor ВЯТ принимают участие в формировании кариосферы, а у Т. nomas taurica в формированиии кариосферы и ее капсулы.

4. Особенностью оогенеза жуков-чернотелок является сохранение способности ядер ооцитов к синтезу РНК вплоть до поздней диплотены. Значительная часть синтеза РНК осуществляется в трофоцитах.

5. У обоих видов жуков-чернотелок в ядрах ооцитов не синтезируется рРНК и отсутствуют ядрышки.

6. Часть ВЯТ в ядре ооцита Т. molitor гомологична кластерам интерхроматиновых гранул соматических клеток или снерпосомам амфибий. Кроме того, обнаружены ВЯТ гомологичные скрученным тельцам из ядер соматических клеток и скрученным тельцам из ядер ооцитов амфибий и домового сверчка.

Материалы диссертации отражены в следующих работах:

1. Александрова О. А., Цветков А.Г., ГрузоваМ.Н. Внутриядерные тельца ооцитов некоторых жуков. Структура и функция.// В сб. X Всесоюзный симпозиум "Структура и функция клеточного ядра" Гродно, 1990. С.5.

2. Александрова О. А. Капсула кариосферы как форма упаковки продуктов хромосомной активности в ядрах ооцитов двух видов жуков-чернотелок // Тезисы докладов и сообщений представленных на Всесоюзном Совещании "Функциональная морфология клетки", Цитология. 1991. Т.ЗЗ, № 9. С.40.

3. Александрова О.А. Внутриядерные тельца и формирование капсулы кариосферы в ооцитах жука-чернотелки Tentyria nomas taurica // Цитология. 1992. Т.34, № 6. С. 30-37.

4. Александрова О.А. Выявление мяРНП во внутриядерных тельцах в ооцитах жука-чернотелки Tenebrio molitor. Тезисы докладов и сообщений, представленных на XI Симпозиум "Структура и функция клеточного ядра" // Цитология. 1993. Т.35,№ 10. С.52-53.

5. Alexandrava О., Bogolyubov D,, Tsvetkov A., Gruzova M. 1995. Nuclear bodies and karyosphere formation in oocytes of some insects ( ultrastructural and immunocytochemical analysis) H Proc. 14-th International Workshop on the Cell Nucleus. 27-31 May, Liege, Belgium. P. 68.

6. Александрова O.A., Боголюбов Д.С., Грузова M.H. Кариосфера и внутриядерные тельца в ядрах ооцитов жука-чернотелки Tenebrio molitor // Цитология. 1995. Т. 37, №12. С. 1142-1150.

7. Bogolyubov D.S., Alexandrova О.A., Tsvetkov A G., Antipanova Е.М., Gruzova M.N.. Ultrastructural and immunocytochemical study of karyosphere and nuclear bodies in insects with different types of ovarioles II Proc. XX-th International Congress Entomology. Firenze,Italy, August 25-31.1996. P. 132

8. Tsvetkov A G., Alexandrova O.A., Bogolyubov D.S., Gruzova M.N.. Nuclear bodies containing splicing factors in oocytes of insects with different types of oogenesis // Mol. Biol. Cell. 1996. Suppl. V.7. P.305a.

9. Боголюбов Д.С., Александрова О.А., Цветков А.Г., Грузова M.H. Электронно-микроскопическое, цитохимическое и авторадиографическое

исследование ядер ооцнтов жука-чернотелки Tenebrio molitor II Цитология. 1997. Т.39, № 1. С. 43

10. Боголюбов Д.С., Александрова О. А., Цветков А.Г. Ядро ооцитов жука-чернотелки Tenebrio molitor (электронно-микроскопическое, цитохимическое и авторадиографическое исследование)//Цитология. 1997. Т.39, № 8. С.643-650.

11. Tsvetkov A., Alexandrova О., Bogolyubov D., Gruzova М. Nuclear bodies from the cricket and mealworm oocytes contain splicing factors of pre-mRNA// Eur. J. Entomol. 1997. V. 94. P. 393-407.