Преобразования ядерных структур в оогенезе некоторых позвоночных (к вопросу о морфогенезе капсулы кариосферы)

Парфенов, Владимир Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Преобразования ядерных структур в оогенезе некоторых позвоночных (к вопросу о морфогенезе капсулы кариосферы)
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Преобразования ядерных структур в оогенезе некоторых позвоночных (к вопросу о морфогенезе капсулы кариосферы)"

П 'о

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПАРФЕНОВ Владимир Николаевич

ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР В ООГЕНЕЗЕ НЕКОТОРЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ (К ВОПРОСУ О МОРФОГЕНЕЗЕ КАПСУЛЫ КАРИОСФЕРЫ)

Специальность: 03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в лаборатории морфологии клетки Института цитологии Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

академик РАМН,доктор биологических наук, профессор И.Б.Збарский доктор биологических наук, профессор Е.Р.Гагмнская, доктор медицинских наук, профессор В.А.Отеллин.

Ведущее учреждение: Московский государственный университет.

на Заседании диссертационного совета Д.063.57.22 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Ст.-Петербург,Университетская наб.,7/9, биолого-почвенный факультет, аудитория 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Зажита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Д.К.Обухов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Прогресс, достигнутый за последнее время в изучении основных компонентов ядра /хромосомы, ядрышки, ядерная зболочка, кариоскелет/ и ядерных процессов /транскрипция, сплай-;инг и процессинг РНК, транспорт зрелой РНК/ несомненен 'см.напр.,Ченцов,Поляков, 1974; Busch, 1974-1984 ; Райков, 1978; Збар-;кий,1988; Збарский,Кузьмина, 1991/. Однако вопросы о том, как :труктурированы в ядре эти процессы, как они организованы в ядер--юм пространстве, как компактизуются и как взаимосвязаны надмоле-сулярные ядерные ансамбли, обеспечивающие скоординированное испол-1ение ядерных функций, какова в конечном итоге структурно-функцио-4альная организация ядра в целом - остаются пока еще слабо изучен--1ыми. Сложности решения этих вопросов связаны не только с трудно-;тью самой проблемы, но, вероятно, и с тем, что в большинстве слу-¿аев их решение замыкается в схемах стандартизированных культу-зальных объектов, что вряд ли оправдано с точки зрения биологичес-сого подхода к такого рода комплексным задачам. Между тем сложные щра высокодифференцированных клеток, таких, например, как ооциты амфибий с их гипертрофированными на активной стадии оогенеза хро-юсомно-ядрышковым аппаратом могут дать перспективу для решения зяда вышеозначенных задач. По крайней мере, что касается сплайсинга и созревания РНК это, видимо, начинает с успехом подтверждать-:я (Gall,1991,1992; Wu et al.,1993). При этом следует, однако, ■шеть в виду, что само по себе ядро ооцита амфибий, ставшее за по-:ледние 20 лёт классическим объектом для изучения ряда общебиологических проблем, в том числе и тех, что названы в самом начале зведения (см. напр., обзоры: Macgregor, 1972;1986 ; Franke et îl.,1979; Higashinakagawa,1982; Hadjiolov,1985; Scheer,

3abauvalle, 1985; Callan,1986; Gruzova,1988, Гагинская,1989) оказались наименее изученными при затухании его синтетической актив-юсти, на 5,6 стадии оогенеза по Дьюмонту (Dumont,1972). Больше того, в некоторых сводках функциональная морфология ядра в этот 1ериод необоснованно представлялась статичной и не заслуживающей особого внимания (Дэвидсон,1972). Вместе с тем уже в старых работах указывалось на заметные изменения в морфологии ядер в ходе юзднего оогенеза ряда амфибий (Schultze,1887 ; Carnoy,Lebrun, L898; Lubosch, 1903; Wagner, 1923) причем, на основании этих наблю-1ений угадывались неизвестные формообразовательные функции инакти-}ирующихся хромосом и ядрышек, сконцентрированных в центральных зайонах ядра. Хромосомно-нуклеолярный комплекс этого периода ооге-¡еза амфибий был отождествлен с типичной кариосферой насекомых ;Грузова,1971), что послужило отправной точкой наших исследований. 1ноголетние работы, развернутые впоследствии, выявили сложные мор-югенетические процессы, сопровождающие формирование кариосферы и >бособление ее капсулы, показали участие в этих процессах, обнаруживающих неожиданные потенции, теряющих синтетическую активность [ромосом и ядрышек, большую пластичность ядерной оболочки (ЯО) и ;е дериватов, динамику топологии кариоскелета. Существенен доволь-ю экстравагантный для ядерной организации способ сохранения хро-юсомно-ядрышкового комплекса в ограниченном объеме зародышевого ¡узырька, на большом удалении от ЯО, от периферического слоя кари->скелета - ламины. Расшифровка структурных основ, обеспечивающих

как удержание всего комплекса в центре ядра, так и сохранение егс единства, вероятно, приблизит понимание общих вопросов, связанны* со структурным базисом трехмерной организации ядра и поддержания его морфофункциональной целостности. С другой стороны, выяснение закономерностей трансформации структуры и топологии ядерных компонентов, подготовивших формирование в ядре своеобразного компар-тмента, включающего клубок инактивированных хромосом, сопутствующих РНП и белковых комплексов, и обособленного от остального ядра капсулой, может дать ключ к осознанию механизмов возникновения ка-риоплазменной структурированности, компартментализации вообще. Последняя по мысли ряда авторов (Ascoli,Maul,1991; Saunders • et al.,1991; Spector,1993) обеспечивает своеобразную доменную организацию субъядерного содержимого.

В связи с вышеизложенным основные цели настоящей работы заключались в следующем:используя методы комплексного морфофункцио-нального анализа дать картину преобразования ядерных структур е поздней диплотене ооцитов двух видов амфибий. В качестве иллюстрации возможного конвергентного развития схем поведения внутриядерных структур в поздней диплотене позвоночных разного филогенетического уровня, представлялось целесообразным показать трансформацию ядерной организации в ооцитах антральных фолликулов человека. Кроме того, в сравнении с ядерными структурами позднедиплотенных ооцитов лягушек (5,6-ой стадии оогенеза - период затухания синтетической активности ядер) предстояло охарактеризовать ряд ранее неописанных особенностей общей морфологии, топологии и тонкой организации ядерных структур (хромосом, ядрышек, кариоскелета) в период максимальной активизации хромосомно-ядрышкового аппарата амфибий (3-я стадия оогенеза) . Следовало показать, какие трансформации ядерных структур в ходе их инактивации обусловили (или подготовили) их участие в строительстве уникального внутриядерного комплекса - кариосферы с капсулой, показать пути морфогенеза последней, сходства и различия этих путей у разных видов лягушек. Требовалось выявить состав капсулы кариосферы, обосновать природу ее основного фибриллярного компонента, идентифицировать некоторые ядерные тела, участвующие в образовании материала капсулы, показать их генезис и гомологию подобным образованиям в клетках соматического происхождения. Намечалось провести временной и пространственный анализ распределения материала капсулы в ядре in situ и на выделенных субъядерных компонентах в динамике, на фоне структурных преобразований ядра в ходе поздней диплотены в различные сезоны года и в связи с гормональным стимулированием ооцитов к созреванию in vitro. Предстояло выделить из ядра комплекс кариосферы с капсулой in vitro и показать его целостность и устойчивость к различным воздействиям, в этой связи предполагалось продемонстрировать интегрирующую роль в этом комплексе фибриллярного материала капсулы.

Научная новизна работы. Вопреки прежним представлениям оО "инертности и статичности " морфофункционального состояния ядра в позднем оогенезе амфибий впервые показаны сложные перестройки всех ядерных структур на заключительных этапах оогенеза этих позвоночных. Морфогенетические преобразования в ядрах ооцитов в этот период ведут к формированию многокомпонентного надструктурного комплекса в виде капсулы кариосферы. При построении капсулы впервые об-

наружены необычные формообразовательные потенции основных ядерных структур: хромосом, ядрышек, ядерной оболочки, кариоскелета. Показаны различные пути морфогенеза капсулы кариосферы у двух видов лягушек - травяной и озерной.

Впервые исследован состав основных компонентов субъядерного комплекса капсулы кариосферы при сочетании методов фракционирования ядер ооцитое, биохимических и иммуноэлектронных методик.

Впервые проведенное выделение из ядра кариосферы с капсулой показало, что в условиях экспериментов in vitro и при различных механических воздействиях этот комплекс ведет себя как единое, устойчивое образование. Продемонстрирована интегрирующая роль капсулы в структурной организации центральной части объемного ядра оо-цитов. Впервые показана возможность, с помощью кариоскелетного материала капсулы, фактической инкапсуляции в клеточном ядре конденсированных хромосом, что обеспечивает проявление особой формы ком-партментализации гетерогенного ядерного содержимого.

Впервые проведено детальное ультраструктурное исследование трансформаций ядерной организации при дегенерации ооцитов в фолликулярной атрезии амфибий.

Дано первое электронноавторадиографическое и ультраструктурное описание преобразований функциональной морфологии ядерных структур в позднем оогенезе млекопитающих на примере человека в связи с формированием кариосферы. На основе сведений, представленных в этой работе, литературных данных и данных, полученных сотрудниками лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН подтверждены представления о конвергентности схем внутриядерных перестроек на заключительных этапах оогенеза в разных систематических группах позвоночных.

Отмечено, что при нарастании нуклеосомных фрагментов в хроматине боковых петель ламповых щеток в связи с ними продуцируется новый класс ядерных телец - гранулы"спутники", участвующие в построении капсулы кариосферы.

Показана принципиально новая структурная организация активного хроматина ядрышек - по розеточному типу. В отличии от ранее описанной, подразумевающей линейно-расположенные единицы транскрипции (ЕТ) рибосомных генов, при розеточной организации ЕТ формируют петли дискретных розеток и линкерные участки между ними. При инактивации ядрышек, показано разворачивание розеток и нарастание нуклеосомных фрагментов, что коррелирует с изменением ультраструктуры ядрышек, с экспрессией их типовых компонентов: фибриллярного центра (ФЦ) и плотного фибриллярного компонента (ПФК). Данные о наличии ФЦ и ПФК в многочисленных, экстрахромосомных ядрышках амфибий получены впервые. Используя преимущества ооцитов амфибий как модельного объекта и применяя сумму адекватных методов, включая биохимические и иммуноэлектронные, в работе приведены данные о наличии актина в ядре, позволяющие, вероятно, подвести черту под многолетней дискуссией по этой проблеме. Впервые даны прямые иммуноэлектронные данные как о наличии актиновых пучков в кариоскеле-те, так и об изменении их топологии в связи с разным функциональным статусом ядра.

Показана возможность смещения ламина - белка традиционно периферической части кариоскелета в центральные районы ядра. Представлены первые иммуноэлектронномикроскопические данные, позволяющие предполагать связь карио- и цитоскелета, имеющую место, вероятно, на уровне ядерных пор.

Впервые проведенное иммуноэлектронное исследование по идентификации "coiled bodies" (СВ) в позднем оогенезе амфибий позволило выдвинуть схему происхождения этих СВ от инактивированных ядрышек. Показано, что СВ являются частью кариоскелета ооцитов 6-й стадии оогенеза.

Научно-практическое значение. В представленной работе было продемонстрировано плодотворное использование экспериментальной модели "ооциты лягушек, стимулированные к созреванию in vitro" для изучения трансформации ядерных структур в оогенезе, данная модель может быть рекомендована для углубленного анализа ряда частных проблем ядерной функциональной морфологии, например, генезис и состав автономных внутриядерных пор, механизм конденсации хромосом, участие липидов в организации ядерных структур и др.Данные по структуре ядра ооцитов лягушек при фолликулярной атрезии, указывающие на характерные, легко выявляемые признаки дегенерации, должны учитываться при отборе материала для получения эмбрионов амфибий в лабораторной и биотехнологической практике. Сведения по организации ядра ооцитов человека на заключительных этапах оогенеза представляют интерес для клиницистов, использующих ооциты из полостных фолликулов в системе оплодотворения • in vitro.Результаты работы могут быть включены в курсы лекций по частным разделам эмбриологии, цитологии и гистологии для студентов соответствующих кафедр университетов и медицинских учебных заведений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Проблемы биологии развития" (Москва,1972); 5 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва,1974); 5,6,7,8,9,11 Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям клеточного ядра (Новосибирск, 1975; Алма-Ата,1977; Харьков, 1980; Пущино, 1984; Черноголовка, 1987; Санкт-Петербург, 1993); 9,10,11 Международных, Европейских рабочих совещаниях по яцру (Краков,Польша,1985; Стевенсбик,Голландия, 1987; Суздаль, СССР, 1989) ; 9 Международном цитологическом конгрессе (Брюссель , Бельгия, 1986 ) ; научных собраниях Института цитологии РАН, семинарах лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН, а также коллоквиумах ряда институтов РАН.

Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе.

Работа выполнена в лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН, которую в 1971-1988 гг. возглавлял П.П.Румянцев. Доброжелательное отношение к себе всех сотрудников лаборатории диссертант ощущал с первых дней аспирантуры. Материалы, использованные в докладе получены самостоятельно и в соавторстве с некоторыми сотрудниками этой лаборатории. Большая часть публикаций подготовлена в соавторстве с М.Н.Грузовой, которой автор сердечно благодарен за постоянную поддержку. В работе участвовали А.Г.Цвет-

ков, Г.Н.Почукалина, Е.А.Бугаева, Ю.И.Гукина, которым автор выражает самую искреннюю признательность. Автор также благодарен К.Г.Мурти, Д.Девис {Детский исследовательский госпиталь,Мемфис, США) за помощь в работе.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали ооциты 2,3,6-й стадий оогенеза по Дью-монту (Dumont,1972) двух видов лягушек (Amphibia, Ranidae) - травяной Rana temporaria Linne,1758 и озерной - Rana ridibunda Pallas,1771, которые поставлялись в различные сезоны года из мест обитания (Ленинградская, Псковская и Астраханская области). Дополнительно использовали ооциты в составе яйценосных бугорков (куму-лусов) из антральных фолликулов человека, полученных из фрагментов яичников оперированных пациентов (II Санитарно-гигиенический медицинский институт, кафедра акушерства и гинекологии). Основной объект работы - ооциты Rana temporaria.

Методы световой и электронной микроскопии сочетались с разнообразными цитохимическими подходами, включая флуоресцентные варианты реакции Фельгена (Хачатуров, Смирнова,196 6; Розанов, Кудрявцев, 1968), связывание 3Н-актиномицина Д (Ebstein,1969) и окрашивание AgN03 (Howell,Black,1980). Ядерные структуры ооцитов лягушек изучались также на фоне гормонального стимулирования ооцитов к созреванию in vitro, которое проводилось в зимний период с помощью прогестерона и суспензии гипофизов (Детлаф,1966; Скоблина,1970). Выделение ядер и анализ субъядерных структур in vitro на световом и ультраструктурном уровнях проводились по описанным методикам с небольшими модификациями (Callan,Lloyd,1960; Gall,1966; Miller, Beatty,1969; Макаров,Сафронов,1978; Цветков,1988; Гагинская,Цветков, 1988), при этом большая часть данных была получена с использованием растворов без добавления Мд*+.

Гисто- и электронномикроскопическая авторадиография проводилась с мечеными предшественниками РНК (3Н-уридин), белков ( Н-лей-цин) и липидов (3Н-глицерин) . Кроме того, меченые и немеченые внутриядерные липиды анализировались с помощью тонкослойной хроматографии (Rouser et al.,1968; Светашов,Васьковский,1972).

Белковый состав ядерного содержимого определяли по стандартным методикам с помощью одномерного SDS-гель-электрофореза по Лэммли (Laemmli,1970) и последующего, в некоторых случаях, имму-ноблотинга (Anderson,Thorpe, 1980; Blake et al.,1984). Использование для этих целей ооцитов лягушек имеет ряд неоспоримых преимуществ в сравнении с другими системами: большие размеры ядер ооцитов позволяют выделять их вручную, проводить тщательную отмывку под светомикроскопическим контролем; для полного снятия вопроса об артефактной цитоплазматической контаминации ядерного материала, также вручную возможно удаление ядерной оболочки. Существенно, что получение такого высокочистого ядерного содержимого возможно в краткий (менее 1 мин) период времени, что позволяет минимизировать такие препаративные артефакты, как агрегация белков.

Распределение в ядре ооцитов специфических белков изучалось методами непрямой иммунофлуоресценции и иммуноэлектронной микроскопии. При этом использовали выделенные вручную ядра как натиЕ-

ные, так и остаточные, после экстракции N1(2M NaCl,1% Тритон X-100) или экстракция N2 ( ДНКаза, 1М NaCl,l% Тритон Х-100), кроме того в ряде случаев иммуноэлектронная микроскопия применялась на серийных срезах нативных и экстрагированных ооцитов (экстракция N3). Последняя проводилась по схеме последовательного фракционирования клеток (Fey et al.,1984), включающей 3 основных этапа: 0,5% Тритон Х-100 - 250 мМ (NH4)2S04 - нуклеазы. В части экспериментов на последнем этапе использовалась только ДНКаза I.

Другие методы, а также некоторые детали вышеуказанных методик описаны в статьях, приведенных в списке литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

X.ЯДЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ И ФОРМИРОВАНИЕ КАРИОСФЕРЫ С КАПСУЛОЙ В ООЦИТАХ 6-Й СТАДИИ ООГЕНЕЗА ТРАВЯНОЙ ЛЯГУШКИ.

Во введении уже указывалось на обилие работ по организации ядерных структур активных стадий оогенеза амфибий и их слабую изученность »в период поздней диплотены (5,6-й стадии оогенеза по Дью-монту). Наши работы на ооцитах травяной лягушки в позднем оогенезе показали сложные морфогенетические процессы, сопутствующие формированию капсулы кариосферы данного вида, в которые вовлекаются практически все ядерные структуры. Существенным для понимания этих процессов оказалось изучение внутриядерных преобразований в сезонной динамике. Кроме того, значительная информация была получена в параллельных наблюдениях на фоне гормонального стимулирования ооцитов к созреванию ín vitro.

Формирование кариосферы Rana temporaria начинается в конце лета-начале осени, с концентрации ядрышек в центральной области ядра. Вокруг хромосом с развитыми боковыми петлями появляется барьер, шириной 1-3 мкм, отделяющий их от ядрышек. Ядрышки собираются вокруг хромосом асинхронно, и капсула, отделяющая хромосомы, развивается только с той стороны, к которой подходят ядрышки. Внутри капсулы наблюдаются многочисленные, ДНК-содержащие кольцевые структуры (диаметром около 3 мкм). Некоторые из них связаны с хромосомами, а другие - приходят в контакт с волокнистой зоной. Со стороны ядрышек, снаружи волокнистого компонента расположены, ассоциированные с ним микротельца, диаметром 3-5 мкм. Осенью концентрация хромосом продолжается. Наблюдается редукция боковых петель ламповых щеток. Волокнистый барьер вокруг хромосом принимает почти замкнутый вид и дает отчетливую реакцию на белки и липиды. В отдельных случаях прослежены контакты волокнистого компонента с концевыми участками (теломерной зоной) хромосом. Окончательное формирование капсулы кариосферы происходит в ооцитах 6-й стадии весной. Возникает единая сеть волокнистого материала, охватывающая хромосомы и переходящая в толщу ядрышковой зоны (Рис.1А). Формирование кариосферы и ее капсулы проходит на фоне затухания синтетических процессов в ядре ооцита (см.главу 1.4). К концу апреля ядерная оболочка разрушается, ядрышки сближаются вокруг волокнистой зоны капсулы, сохраняющейся около плотного клубка хромосом.

А Б

рогаг1а.

А - светомикроскопические, Б - ультраструктурные данные. ХР - хромосомы; ПМ - псевдомембраны; ЯД - ядрышки; 1,2,3 - мембранные элементы в составе волокнистого компонента капсулы.

I.1.Ядерные структуры ооцитов, стимулированных к созреванию суспензией гипофиза и прогестероном в общем повторяют картины сезонных преобразований, но в сжатые (до'15 часов) сроки. Остановимся на некоторых, наиболее ярких особенностях этого динамичного процесса, причем в наиболее характерных точках временной (часовой) шкалы. Через 3-4 часа от начала стимулирования происходит интенсивное наращивание волокнистого компонента как в толще капсулы, так и на ее периферии. В хромосомной части, по сравнению с исходным состоянием, наблюдаются значительные изменения: хромосомы утолщаются, укорачиваются. Через 6 часов в ядре появляются четко-видные ядрышки, которые распологаются преимущественно на периферии капсулы. Через 9 часов ядрышки сворачиваются и приобретают сферическую форму. На данной стадии начинается разрушение ядерной оболочки (ЯО). Через 10 часов растворение ЯО прогрессирует. Кариосфе-ра с капсулой смещается к анимальному полюсу. Волокнистая зона образует мощный слой, охватывающий хромосомы. Иногда кариосфера имеет вид кариомеров за счет того, что волокна капсулы могут окружать отдельные биваленты. Через 12-13 часов стимулирования большая часть ЯО уже разрушена. Значительное количество кариоплазмы переходит в ооллазму. Ядрышки сливаются, образуя большие тела неправильной формы. Короткие диакинетические хромосомы окружены волокнистой зоной. Через 15-17 часов от начала стимулирования ядро как таковое исчезает. Среди кариоплазмы располагаются диакинетические хромосомы, по-прежнему окруженные волокнистой зоной. Таким образом, на протяжении 15-17 часов удается наблюдать морфологические изменения ядра, сопровождающие процесс созревания ооцитов. При этом наиболее отчетливо прослеживается образование волокнистого компонента капсулы.

I■2.Электронномикроскопический анализ сформированной карио-сферы в зимних ооцитах 6-й стадии показал, что среди плотного материала конденсированных бивалентов выявляются сферические фибриллярные образования с полостью диаметром от 0,1 до 1,5 мкм, принимающие вид колец на ультратонких срезах. Кольца имеют неодинаковую толщину (0,1 - 0,5 мкм) и состоят из плотноупакованных тяжей толщиной 20-30 нм. Поверхность колец как бы опушена, опушение представляет собой спиралевидные тяжи диаметром 20-30 нм, которые при определенных углах плоскости среза могут принимать вид скоплений гранул или гранулярных клубков. Агрегаты спиралевидных тяжей наблюдаются также и в составе многокомпонентных формирований (подробнее см.1.3). Кроме этих структур в хромосомной части выявляются фибриллы 6-10 нм, иногда образующие пучки, которые могут смещаться и в область нуклеолярной капсулы. Анализ организации волокнистого барьера, отделяющего биваленты от ядрышек, показал, что он состоит из сети анастомозирующих друг с другом тяжей шириной 4 0-50 нм. Высшие тяжи напоминают пунктир, благодаря чередованию светлы и темных участков. Протяженность темных - около 75 нм, светлых - 100 нм. При больших увеличениях и разных углах сечений срезов тяжей видно, что эти структуры представляют собой ряды аналогов поровых комплексов ЯО. Поры в тяжах соединены фибриллярным материалом и тождественны псевдомембранам в ядрах ооцитов комара /Fiil, Moens,1973/. Вместе с тем, следует отметить, по крайней мере, внешнее подобие структуры псевдомембран ядер ооцитов травяной лягушки организации комплекса "ламина-поры" ооцитов Xenopus laevis, где, как известно, поры соединены фибриллярным материалом ламины /Krohne,1978;1982/. Псевдомембраны контактируют с хромосомами, причем отдельные блоки хроматина, видимо, конечных отделов хромосом /теломерные зоны/ оказываются как бы погруженными в область псевдомембран. Ядрышки, входящие в состав капсулы, представляют собой в этот период сложные, неправильной формы структуры. Они подвергаются сегрегации и фрагментации. В результате среди них появляются многочисленные ДНК-содержащие микроядрышки. Ядрышки - фибриллярные образования, их гранулярный компонент редуцирован до крайне небольших участков. Четко прослеживается сегрегация фибриллярного материала ядрышек: на периферии оказывается фибриллярный центр ядрышка /ФЦ/ с характерной нежнофиламентной структурой. Особенно демонстративна такая сегрегация в некоторых ядрышковых фрагментах или микроядрышках, образующие своеобразные двойные структуры, где одна обособленная часть полностью состоит из материала ФЦ. /Подробнее об организации ядрышек данной стадии см. главу IV.2/. Среди ядрышек наблюдаются скопления псевдомембран и фибрилл, подобных таковым центральной зоны кариосферы. Фибриллы обнаруживают связь с расположенными здесь же кольцевыми и многокомпонентными структурами, идентичными таковым, несущим скопления спиралевидных тяжей, из хромосомной части кариосферы с капсулой. В межядрышковой зоне в связи с фибриллами капсулы видны микроядрышки, а в контакте с псевдомембранами наблюдаются мембранные участки в виде овальных пузырьков или трубчатых образований. Мембранные формирования превалируют на периферии нуклеолярной капсулы. Кроме вышеуказанных -здесь же встречаются и типичные пористые пластинки /annelate lamellae/(Рис.1,Б).

1.3. Ультраструктурная организация кариосферы с капсулой

перед созреванием ооцитов травяной лягушки.

Анализ, выполненный на ядрах ооцитов травяной лягушки /6-я стадия/ в период, непосредственно предшествующий созреванию /конец апреля/, выявил ряд особенностей тонкой организации капсулы и сопутствующих структур, дополняющих данные по зимним ооцитам.

1.Среди структур, которые попадали в поле зрения на материале зимних ооцитов и которые представлены в ооцитах перед созреванием, следует отметить связанные с волокнистым материалом капсулы сферические скопления спиралевидных тяжей и многокомпанентные тела /МКТ/ диаметром 0.3-2 мкм. Тонкая организация MKT хорошо сохраняется после экстракции N 3. В них выделяются высококонтрастные участки, которые состоят из электронноплотных тяжей диаметром 2030 нм /Рис.2Б, зона I/, участки фибриллярного материала /фибриллы толщиной около 6 нм - Рис.2, зона II/ и участки нежнофиламентного материала с низкой электронной плотностью /диаметр фибрилл около 4 нм - Рис.2Б, зона III/. Вышеперечисленные части MKT по ультраструктуре соответствуют классическим компонентам ядрышек - плотному фибриллярному компоненту/ПФК/, фибриллярному компоненту и фибриллярному центру /ФЦ/, соответственно. Яркой особенностью MKT является наличие в их составе зоны, составленной из плотноупакованных спиралевидных тяжей /толщиной 20-30 мм - Рис.2Б, зона IV/. Зона IV тесно взаимодействует с остальными частями комплекса; причем на участках их контактов наблюдается взаимопереход составляющих фибрилл. Скопления спиралевидных тяжей, упакованных с гораздо меньшей плотностью, чем материал зоны IV, обнаруживается в тесной связи с контрастной зоной 1/Рис.2Б, зона V/. На отдельных срезах эти округлые образования выглядят как агрегаты гранул; такие же скопления выявляются свободнолежащими в кариоплазме или тесно связанными с ядрышками. В зоне их контактов видны картины интенсивного взаимодействия фибрилл обоих образований. С другой стороны, скопления спиралевидных тяжей обнаруживаются на поверхности ядрышек или в виде компактных округлых сгустков в его толще, в том числе в яд-рышковых вакуолях. Рассматривая данное наблюдение в определенном ряду - скопления спиралевидны тяжей внутри ядрышка, на его поверхности и в контакте с ним, можно со значительной долей уверенности говорить о ядрышковом происхождении этого материала /Рис.2А/. Агрегаты последнего, учитывая вкупе их характерное строение и яд-рышковое происхождение, могут трактоваться как "coiled bodies" /СВ/-структуры, хорошо выраженные в ядрах клеток различного гистогенеза. Результаты иммуноэлектронного анализа, подтверждающие эту точку зрения см. в главе 1.8. Следует еще раз подчеркнуть, что как MKT, так и скопления спиралевидных тяжей приходят в тесное взаимодействие с фибриллами волокнистого материала капсулы кариосферы. Характер и особенности эти контактов отчетливо выявляются при анализе содержимого ядра после экстракции N 1.

2.В апрельских ооцитах, преобладающими в составе волокнистого компонента капсулы, по крайней мере, в околохромосомном районе, являются фибриллы толщиной 7-8 нм, которые могут формировать характерные пучки. Таким образом, волокнистый компонент капсулы возле хромосом в ооцитах перед созреванием состоит из двух хорошо Еыра-

Рис.2. Схема, отражающая взаимодействие спиралевидных теле ("coiled bodies"(СВ) с ядрышками из ооцитов 6-й стадии R.temporari (ультраструктурные и иммуноэлектронномикроскопические данные).

А - обособление СВ в составе ядрышек (ЯД), выход СВ кариоплазму и связь с фибриллярным материалом капсулы (ФК); ПФК плотный фибриллярный компонент ядрышка.

Б - многокомпонентное тело (MKT) с зонами , соответствующим нуклеолярным частям: плотному фибриллярному компоненту (ПФК-зона I) фибриллярному компоненту (ФК-зона II), фибриллярному центру (ФЦ-зон III), СВ-зона IV, V .

В - Части MKT (IV,V зоны, отмечено точками) где наблюдается колокализация коилина - р80 и мя РНП.

женных частей: псевдомембранной и фибриллярной. При этом псевдомембраны оказываются ближе к компактным бивалентам, а фибриллы смещены к ядрышкам. Материал псевдомембран имеет тенденцию проникновения внутрь клубка хромосом. Плотность расположения фибрилл и их пучков довольно высока; можно думать, что именно они создают тот контур около хромосомной части волокнистого компонента, который выглядит замкнутым на полутонких срезах ооцитов данной стадии. Все описанные структуры центральной части кариосферы с капсулой (хромосомы, псеЕДОмембраны и пучки фибрилл) тесно взаимосвязаны друг с другом. Следует подчеркнуть, что наблюдаемый переход волокнистого материала в толщу нуклеолярной капсулы связан с экспансией в межядрышковую зону псевдомембран и фибрилл. Однако, если первые в виде одиночных островков встречаются лишь в областях, расположенных ближе к хромосомам, то фибриллы, чаще собранные в пучки, доминируют в нуклеолярной капсуле на всех уровнях, от центра вплоть до периферии. Здесь фибриллярный материал вступает в тесное

взаимодействие с ядрышками, микроядрышками или их фрагментами. Итак, поэтапное исследование образования волокнистого компонента капсулы кариосферы травяной лягушки (6-я стадия оогенеза) в сезонной динамике ясно показало сложную природу его материала. С одной стороны, в его состав входят внутриядерные поровые комплексы, образующие псевдомембраны, а также разнообразно организованные мембранные образования; эти две части преобладают в волокнистом компоненте капсулы в осенне-зимний период. С другой - существенен вклад и фибрилл, собирающихся в пучки. Фибриллярная часть доминирует весной. Что касается природы волокнистого компонента, то здесь нужно отметить следующее: псевдомембраны сохраняются после экстракции ядер 2М NaCl, кроме того, как показали другие авторы (Филатова и др.,1982),они выявляются и после обработки выделенного комплекса кариосферы с капсулой нуклеазами и 1,5 М NaCl. Фибриллы в свою очередь отчетливо прослеживаются после экстракций NN 1,2,3. Все это указывает на то, что белки этих двух составляющих волокнистого компонента относятся к семейству белков ядерного матрикса или ка-риоскелета. Известно, что такого рода экстракции приводят к потере ядрами по разным сведениям от 70 до 90 % ДНК, РНК и гистонов с сохранением ядерного матрикса (Збарский,Геориев,1959; Berezney,Coffey,1975; Comings,Okada, 1976) .

1.4. Сезонная динамика синтетической активности ядерных структур 6-й стадии оогенеза.

Таблица 1. Сезонная динамика включения 3Н-уридина в ядерные структуры ооцитов 6-й стадии R.temporaria.

\ Ядерные \ структур \юы Сезоны \ Ядрышки о Хромосомы Фон

Х±Д CT Х±Д ст Х+Д

Лето Осень Зима Весна контрастн 1.19 ± 0.09 0.231 ±0.06 0.47 ± 0.11 0.30 0.24 0.32 0.473 + 0.023 0.153 ± 0.018 0.048 ± 0.016 0.136 ± 0.009 0.05 0.04 0.016 0.014 0.026 ± 0.008 0.042 ± 0.006 0.038 ± 0.012 0.040 ± 0.010

Цифры отражают относительную активность = количество зерен / вес бумажной модели

Для каждого сезона проанализировано по 20 ооцитов. Обозначения: X средняя арифметическая, Д - возможная максимальная абсолютная погрешность;ст среднее квадратичное отклонение.

Данные об участии хромосомно-ядрышкового аппарата ооцитов в синтезе РНК представлены в таблице 1. Максимум включения 3Н-уридина приходится на летний период (август), когда только начинается кон-

центрация ядерных структур в центральных районах ядра. Осенью, с образованием кариосферы с капсулой, синтез РНК в ядрышках резко уменьшается, а на хромосомах он падает в 3 раза по сравнению с летом. Зимой синтез РНК падает до минимума (по сравнению с осенью он уменьшается в 5 раз) , а на хромосомах почти полностью прекращается. Весной (конец апреля) синтетические процессы в кариосфере и ее капсуле активизируются. Уровень включения в сферические ядрышки достигает приблизительно 1/4 от уровня включения в ядрышки осенней капсулы. Включение в кариосферу, которая к этому периоду состоит из клубка коротких гладкоконтурных хромосом, немногим меньше включения в хромосомы осенней кариосферы.

Авторадиографические данные показывают, что образование кариосферы с капсулой у травяной лягушки сопряжено с резким уменьшением синтетической активности хромосомно-ядрышкового аппарата. Подобные данные были получены и для кариосферы у других животных: насекомых (Грузова,1967; Beer et al.,1967), птиц (Гагинская,Грузо-ва,1969), млекопитающих (Зыбина,1968). После зимнего спада, синтетическая активность ядерных структур кариосферы с капсулой травяной лягушки весной возрастает. Вызывает интерес включение 3Н-уриди-на в конденсированные хромосомы весенней кариосферы перед созреванием ооцитов. Возможно, на активизацию транскрипции таких хромосом оказывает стимулирующий эффект изменение физиологического статуса самок лягушки.в связи с повышением температуры воды и повышением уровня гонадотропинов в их крови. На гонадотропин-зависимую активацию синтеза информационной РНК в самом конце 6-й стадии оогенеза шпорцевой лягушки указывали Браун и Литтна

(Brown,Littna,1964;1966) . Однако нужно иметь в виду, что в этот период оогенеза мы имеем дело с практически прометафазными хромосомами, с высоким уровнем комлактизации их хроматина, который по этой характеристике приближается, очевидно к митотическому. Транскрипционная активность конденсированного в такой степени хроматина - явление незаурядное. Если первичный уровень комлактизации хроматина - наличие нуклеосом - скорее всего не является фактором, полностью запрещающим транскрипцию (Kornberg,Lorch,1991; Adams,Workman, 1993; Lee et al-,1993), то второй - соленоидный(нук-леомерный), видимо не совместим с прохождением по ДНК РНК-полиме-разы. Можно предполагать, что временная и, возможно, избирательная активация транскрипции компактного хроматина сопровождается частичным. нарушением второго уровня комлактизации - расплетанием, возможно узко локальным, соленоида (нуклеомеров). Феномен "вспышки" синтеза и-РНК в заключительный период оогенеза конденсированными хромосомами Änura безусловно заслуживает дальнейшего изучения современными молекулярно-биологическими методами.

I.5.Наблюдения над выделенной кариосферой с капсулой.

Наблюдения in vitro были предприняты для проверки целостности и устойчивости к различного рода воздействиям комплекса кариосферы с капсулой. Кроме того, предстояло сопоставить морфологию кариосферы с капсулой in vitro без фиксации с картинами, полученными на гистологических препаратах. Были выбраны две точки в сезонной динамике морфогенеза капсулы: октябрь - когда впервые между ядрышками и вокруг сократившихся хромосом появляется заметно выраженный волокнистый компонент, и апрель - когда в ооцитах непосредственно

перед созреванием строительство волокнистого компонента завершается.

На выделенных ядрах октябрьской стадии, как и на гистологических препаратах, видно, что ядерные структуры собраны в центральной зоне и образуют кариосферу диаметром около 200 мкм. После удаления ЯО кариосфера с капсулой сохраняется как единое целое. Ядрышки оказываются прочно скрепленными между собой эластичным материалом так, что капсулу можно механически растянуть. При механических воздействиях невозможно было выделить одиночные ядрышки из состава нуклеолярной капсулы. При попытке разорвать капсулу ядрышки продолжали держаться группами по несколько штук. Сквозь толщу ядрышкового слоя различается светлый пузырек диаметром около 90 мкм, в котором располагаются хромосомы, собственно хромосомная часть кариосферы с капсулой по гистологическим данным. Пузырек занимает не строго центральное положение, а зачастую смещен к одному из полюсов капсулы. Растягивая капсулу, можно добиться выхода этого пузырька почти на ее поверхность и отчетливо его наблюдать. Стенки пузырька при надавливании прогибаются. Тотчас после прекращения растягивания капсула вновь сжимается, и центральный пузырек скрывается в ее толще. Это свидетельствует о связи стенок светлого пузырька с эластичным материалом межядрышковых зон капсулы. Следует подчеркнуть, что при механических воздействиях ядрышки никогда не наблюдались среди хромосом в центральном пузырьке, что свидетельствует о наличии барьера между хромосомами и массой ядрышек. Впечатляющими выглядят результаты наблюдений над выделенной карио-сферой с капсулой апрельских лягушек. Здесь волокнистый компонент капсулы, как было показано на тонких срезах, принимает дефинитивный вид за счет интенсивного нарастания в нем фибриллярного материала. Кариосфера с капсулой были подвержены жестким воздействиям диспергирования - понижение ионной силы раствора в 4 раза. В этих условиях большая часть материала ядрышек оказалась неустойчивой и растворялась: нуклеолы превращались в мелкие, плотные, четкоЕидные структуры и "вываливались" из капсулы. В то же время комплекс кариосферы и волокнистой капсулы продемонстрировал отчетливую целостность и устойчивость. Ввиду большой степени агрегации ядерных структур, участвующих в построении этого комплекса, диспергирование проходит медленно, что позволяет наблюдать ряд этапов проявления наиболее резистентных его составляющих. На всех этапах диспергирования капсулы - от массивной структуры до фибриллярного каркаса - ее волокнистый материал сопровождается гранулами диаметром 0,2-0,6 мкм. Размеры, локализация, устойчивость к диспергированию сближает эти гранулы со "спутниками", которые, как показали эксперименты с выделенньми ядерными структурами на фоне сезонной динамики, тесно ассоциированы с материалом капсулы кариосферы травяной лягушки на всех этапах ее генезиса /см. ниже главу IV. 1/. Таким образом, проведенные наблюдения свидетельствуют о том, что кариосфера с капсулой представляет собой единый, устойчивый комплекс, в образовании которого существенную роль играет эластичный компонент фибриллярной природы. Хромосомы действительно оказываются инкапсулированными внутри ядра в материале из этих фибрилл и ядрышек.

В заключение следует подчеркнуть существенную особенность распределения резистентного к диспергированию фибриллярного мате-

риала ядра на 6-й стадии оогенеза травяной лягушки: он локализуется только в центральном районе в связи и в составе капсулы карио-сферы. В дальнейшем такая топология внутриядерных филаментов различной природы ооцитов 6-ой стадии будет не раз подтверждаться другими методами /см. главу IV.3/.

1.6. Актиновые филаменты в капсуле кариосферы травяной лягушки■

Возвращаясь к изложенным выше данным, следует еще раз подчеркнуть, экперименты на выделенных in vitro кариосферах с капсулой показали, что волокнистый компонент оказывается тем материалом, который обеспечивает целостность комплекса "кариосфера-капсула", его устойчивость к различного рода механическим воздействиям; по ультраструктурным данным он представляет собой скопление фибрилл (диаметром 6-10 нм), среди которых выделяются своим обилием фибриллы толщиной 6-7 нм. Эти сведения давали основания предполагать участие актИновых филаментов в построении капсулы. При анализе ядер, методом негативного контрастирования, в зоне волокнистого компонента капсулы выявлялись пучки фибриллярного материала с толщиной фибрилл около 6-8 нм. Размеры этих фибрилл, их характерное сродство к уранилацетату, при обработке которым они дают четкое негативное окрашивание, способность собираться в пучки однозначно говорят в пользу актиновой природы этих филаментов. В ядрах после глицеринизации, с последующей обработкой тяжелым меромиозином (ТММ), в связи с нуклеолярными агрегатами капсулы выявляются актиновые филаменты, декорированные ТММ. Удается проследить периодичность в расположении последних вдоль по длине микрофиламента. Она составила около 38 нм, что соответствует периодичности стрелок комплекса актин-ТММ, измеренного в основополагающих опытах Хаксли (Huxley, 1963) . Актиновые филаменты проникают вглубь нуклеолярного слоя капсулы, располагаясь между ядрышками, связываясь в ряде случаев с ядрышковыми фрагментами. Данные с использованием метода иммуноэлектронной микроскопии на экстрагированных (экстракция №3) ооцитах 6-ой стадии, дают основательные подтверждения наличия в составе волокнистого компонента капсулы актиновых филаментов (см. также раздел IV.3.1.). На срезах ооцитов 6-й стадии удалось наблюдать тесное взаимодействие актиновых фибрилл с хроматиновыми блоками конденсированных хромосом (иммуноэлектронные сведения). Данные, однако, не позволяют сделать однозначного вывода: входят ли актиновые филаменты непосредственно в состав компактных хромосом или только плотно контактируют с ними. В этой связи, тем не менее любопытно отметить, что факт наличия полимерного актина в хромосомах периодически переоткрывается в работах разных лет, причем ему придаются вполне ожидаемые для контрактильного белка функции - участие в конденсации хромосом, поддержание их линейной целостности, вклад в кариоскелетный остов хромосом (Rungger et al.,1979; Gounon,Karsenti,1981; Галактионов и др.,1985; Фридлянская и др.,1987; Sauman, Berry,1994; Sauman,1995).

При световом микроскопировании в экспериментах с окраской антителами к актину ядер ооцитов :6-й стадии (непрямая

иммунофлуоресценция), в зоне капсулы, среди ядрышек выявляются отчетливо флуоресцирующие 6-8 нм филаменты, образующие в некоторых местах хорошо выраженные, довольно длинные (до 10 мкм) пучки. Последние могут связываться с нуклеолярным материалом капсулы. Четкие результаты дали эксперименты с обработкой сохранившегося после диспергирования ядерного содержимого (см. также главу 1.5), фибриллярного каркаса капсулы, родамин-фаллоидином - красителем чрезвычайно специфично связывающимся с полимерной формой актина (Wulf et al.,1979). В этом случае наблюдаются светящиеся филаменты,как окружающие хромосомную часть, собственно кариосферу, так и те из них, которые входят в состав, волокнистого компонента межнуклеолярных зон.

Как следует из рассмотренных данных, часть фибрилл многокомпонентного волокнистого материала капсулы кариосферы травяной лягушки являются актиновыми по своей природе. Наличие в капсуле пучков актиновых филаментов, по-видимому, играет заметную роль в стабилизации всего сложного хромосомно-нуклеолярного комплекса в ядре. Избирательное появление именно в этом участке ядра хорошо развитых актиновых филаментов, вполне возможно, являетоя следствием активных внутриядерных перестроек в предшествующий период оогенеза, когда происходило перемещение ядрышек от ЯО к центру ядра, сокращение хромосом, т.е. формирование кариосферы с капсулой. Возможная роль в такого рода процессах актина, обладающего контрактильными свойствами, представляется вполне допустимой.

Выяснение специфического для позднего оогенеза лягушек вопроса - роли актиновых филаментов в построении кариосферной капсулы - неизбежно приводит к рассмотрению общей проблемы внутриядерного актина. Учитывая ее острую актуальность и дискуссионность вплоть до сегодняшнего дня, к ее рассмотрению в аспекте динамики кариоскелета ооцитов, придется вернуться в разделе IV.3.1.

1.7. Внутриядерные липиды (распределение и участие в организации капсулы кариосферы).

Ультраструктурный анализ показал активное участие в образовании волокнистого компонента капсулы кариосферы особых элементов: псевдомембранных структур и разнообразных по форме (трубчатых, пузыревидных и т.д.) мембранных образований; причем была выявлена отчетливая динамика их новообразования в процессе гормонального стимулирования ооцитов к созреванию in vitro. Все это ставило вопрос об участии липидов в перестройках ядерных структур ооцитов травяной лягушки и их роли в организации капсулы кариосферы. Особенности ядра ооцитов лягушки делают его удобным объектом для изучения распределения и состава внутриядерных липидов, динамики их поступления в ядро, участия во внутриядерных перестройках. В этой связи следует отметить, что на характеристики фракций внутриядерных липидов оказывают влияние, главным образом, применяемые биохимические методы изоляции ядер соматических клеток, их демембрани-зации, выделения ядерных структур. При использовании этих методик возможны потери липидного материала на разных этапах, его загрязнение липидами ядерной оболочки. Так показано, что чистота отделения хроматина от внутренней ядерной мембраны сказывается на ре-

зультатах определения липидов хромосом (Левитина, 1975) . Ядро ооци-та лягушки 6-й стадии оогенеза дает редкую возможность свести к минимуму эти артефактные воздействия. Его организация на данной стадии, когда хромосомы и ядрышки собраны в компактный комплекс кариосферы с капсулой, на значительном удалении от ядерной оболочки, дает возможность выделения этого комплекса без загрязнения его липидами ядерной оболочки.

Анализ липидного состава кариосфер с капсулой, выделенных ми-крургически из ядер ооцитов, обнаруживает в них нейтральные липи-ды. Основную их часть составляют триглицериды и эфиры холестерина. Подобный состав нейтральных липидов имеют целые ядра и цитоплазма. Вместе с тем в липидном составе трех сравниваемых частей ооцита наблюдаются заметные различия. Так кариосфера с капсулой отличаются присутствием в них диглицеридов, в целых ядрах сравнительно много холестерина и свободных жирных кислот, в цитоплазматических фрагментах присутствуют моноглицериды. Среди полярных липидов кариосфер с капсулой и целых ядер основную массу составляет лецитин (фосфотидилхолин). Кроме того у них есть фракции, не идентифицированные нами, но близкие по подвижности к цереброзидам мозга крысы и кардиолипину. В цитоплазме выявляются фосфотидилэтаноламин и сфингомиелин. При хроматографическом анализе меченых липидов обнаружено, что как в целых ооцитах, так и в выделенных из них ядрах и кариосферах с капсулой, метка включается, в основном, во фракции триглицеридов и лецитина. Остальные фракции метятся с небольшим превышением фона. Через 30 минут после начала гормонального стимулирования, включение 3Н-глицерина в триглицериды очень низкое и составляет 20-30% от включения в суммарные полярные липиды. К 6-ому часу экспозиции с прогестероном метка в триглицеридах возрастает в среднем в 20 раз и в 2-3 раза превосходит включение в суммарные полярные липиды. Для изолированных кариосфер с капсулой и цитоплазмы, преобладание метки во фракции триглицеридов по сравнению с лецитином удается обнаружить уже через 3-4 часа после начала стимулирования. В цитоплазме отношение метки в триглицеридах к метке в лецитине составляет в среднем 30, а в кариосферах с капсулой -3. Результаты авторадиографического анализа, проведенного на срезах ооцитов представлены в таблице 2. При постоянном сроке инкубации ооцитов с изотопом характер распределения метки 3Н-глицерина между тремя зонами ядра не зависит от времени экспозиции с прогестероном и практически не меняется: наибольшее количество треков наблюдается над капсулой кариосферы, меньшее - над кариоплазмой и самое низкое - над хромосомной частью. При сохранении постоянного характера распределения плотности метки между этими зонами ее относительные величины варьируют, достигая при этом своего максимума через 3 часа после начала гормонального стимулирования. Выше отмечалось, что в кариосферах с капсулой в этот период метятся триглицериды и лецитин. Однако ввиду абсолютного преобладания метки в триглицеридах, можно думать, что большая часть метки на автографах должна выявлять распределение именно этих липидов. Локализация меченых липидов соответствует картине распределения волокнистого компонента капсулы кариосферы. Выделяются несколько наиболее часто встречающихся вариантов распределения метки возле ядрышек. Все они совпадают с положением волокнистого компонента в капсуле около этих структур. Непосредственно над хромосомной частью локализова-

но гораздо меньше метки (см. Таблицу '2) . При этом ее можно наблюдать вблизи от хромосом, либо над ними. Такая локализация объясняется скорее всего контактом хромосом с волокнистым компонентом. В то же время нельзя исключить, что такое включение предшественника относится и к липидсодержащим участкам самих хромосом, где наличие липидов показано различными методами (Белая и др., 1971; Николаенко и др., 1981; МапгоИ et а1.,1982).

Таблица 2. Динамика включения 3Н-глицерина в ядерные структуры ооцитов 6-й стадии травяной лягушки, стимулированных к соэреианию прогестероном.

Время действия прогестеро на, ч Время инкубации с изотопом, ч Количество треков площади над различными ра, х + на единицу областями яд-

хромосомная часть кариосферы капсул карио сферы а карио-лимфа фон

1 1 13 5+2.0 25.1±2 8 21 .8±2.0 4 .2+0 з

2 17 3±3.1 31.5+5. 0 19 8±2 . 6 6.7+0 3

3 17 3±2 . 3 33.6±3. 8 25 .1+2.9 5.2+0 4

4 1 13 5±1. 7 22.5±2 2 17 7±1. 9 4 . 8+0 2

5 1 12 5+1.6 25.8±2. 1 20 9±1.7 5.2+0. 4

3 3 16. 4±2.2 33.3±2. 6 21 6±1.5 3.1+0. 3

6 6 6.5+0.7 23.0±3. 1 15 5±1. 6 3,3±0. 3

Примечание. Каждое среднее значение получено для 20 определений.

Итак, основными липидами кариосфер с капсулой травяной лягушки являются триглицериды, эфиры холестерина и лецитин. Явного преобладания нейтральных или полярных липидов не обнаружено. Поскольку основную часть капсулы кариосферы составляют ядрышки, а также волокнистый компонент, то, очевидно, они в значительной мере определяют состав липидов этого образования. Что касается ядрышек, то на их долю, вероятно, приходится лецитин. Было показано, что лецитин (фосфотидилхолин) - основной липид ядрышек (Вогпепз,1968). В то же время не исключено, что часть фракции этих липидов может

входить и в состав мембранных дериватов ядерной оболочки, которые представлены в волокнистом компоненте, поскольку именно лецитин составляет преобладающую долю фосфолипидов ядерной мембраны (Кузьмина и др.,1969; Леменовская и др.,1976; Franke et al.,1976). Триглицериды входят в состав волокнистого компонента капсулы. Б пользу этого свидетельствует хроматографический анализ липидов, включающихся в капсулу кариосферы на фоне гормонального стимулирования, показывающий значительное преобладание триглицеридов над лецитином. Кроме того, распределение метки на автографах выявляет ее преимущественную локализацию над волокнистым компонентом. При этом плотность метки достигает максимума к 3-му. часу стимулирования - времени когда начинается интенсивное наращивание этого компонента в капсуле кариосферы. В связи с тем, что большая часть волокнистого компонента представлена кариоскелетным материалом, можно думать, что обнаружение липидов в его составе отражает явление более общего порядка, а именно: участие липидов в организации ка-риоскелета (ядерного матрикса) клеток. На такую возможность указывалось в ряде работ (Berezney,1975; Соссо et al.,1980; Алесен-ко, 1987) .

I.8.Спиралевидные тела, coiled bodies (СВ) в ооцитах 6-й стадии оогенеза (иммуноморфологическая идентификация).

Как было указано выше (см.главу 1.3), среди структур взаимодействующих с волокнистой капсулой кариосферы (зимние и весенние ооциты) выделяются: а) образования, состоящие из клубков спиралевидных тяжей, связанных в своем генезисе с ядрышками, и б)много-компанентные тела (MKT), имеющие скопления этих же спиралевидных тяжей в своем составе (зоны IV, V MKT см.Рис.2). Характерная ультраструктура этих скоплений, тесная связь с ядрышковыми компонентами, в том числе и в составе MKT, позволили, с известной долей допущения, провести аналогию между ними и "coiled bodies" (СВ) , описанными на различных объектах соматического происхождения (Monneron,Bernhard,1969; Hardin etal.,1969; Diaz de la Espina et al.,1982; Raska et al.,1990,1991; см. также обзор: Lamond and Carmo-Fonseca,1993). Заключение же о тождественности сравниваемых структур было сделано в дополнительных иммуноэлектронных исследованиях с использованием антител к белкам, обнаруженным в составе СВ, и в первую очередь, к маркерному белку СВ - р80-коилину и к суммарному белку малых РНП (мяРНП). Кроме того, для идентификации ядрышкового материала использовались антитела к нуклеолярным белкам - фибрилларину и В-23. В целях выяснения связи анализируемых структур с внутриядерными актиновыми филаментами использовали антитела к актину. Результаты иммуноэлектронной микроскопии MKT, проведенной на серийных срезах ооцитов 6-й стадии оогенеза, сведены в таблицу 3. Обращает на себя внимание высокая интенсивность мечения и колокализация метки, связанной с антителами к р80-коили-ну и мяРНП над зоной IV, составленной из плотноупакованного материала спиралевидных тяжей. Такая же ситуация имеет место и над зоной V. В параллельных наблюдения на этих же ядрах, такая же колокализация антикоилиновой и антимяРНП метки отчетливо выявляется в скоплениях спиралевидных тяжей, обнаруженных в составе ядрышек и лежащих свободно в кариоплазме. Таким образом, данные агрегаты, а также зоны IV и V MKT идентифицируются как СВ. Иммуноблот-анализ с

антителами к р80-коилину, проведенный на ядерном содержимом осци-тов 6-й стадии после снятия ЯО, когда из ядра удаляется большинство растворимых белков, подтвердил как наличие коилина в ядра, так и его "структурированность" - вхождение в состав определенных внутриядерных структур. Иммуноэлектронная микроскопия отчетливо выявила в составе МКТ ядрышковый белок фибрилларин (см.таблицу 3), который локализуется, главным образом, в контрастной зоне X - аналоге ПФК ядрышек. Существенно, что эта же метка, хотя и заметно менее интенсивная, наблюдается и над СВ, встроенном в МКТ (см.таблицу 3) и тесно взаимодействующим с его зоной I. По молекулярным данным фибрилларин является частью ядрышкового комплекса 03 мяРНП, вовлекаемого в процессинг рРНК (Kaas et al.,1990). Интересно, что фибрилларин, входящий в состав как СВ, так и ПФК ядрышек (Raska et al.,1990,1991; Ochs et al.,1985), является, видимо, тем общим компонентом, на основе которого и возможна та тесная взаимосвязь этих двух структур (вплоть до взаимоперехода их материала), описанная в клетках соматического происхождения (Hardin et al.,1969; Zareba-Kowalska, 1989; Malatesta et al., 1994). Очевидно, именно фибрилларин, как резистентный скелетный белок ядрышка (Ochs,Smetana, 1991) , может обеспечивать сохранность в составе МКТ, общей структуры ПФК и его связь с СВ после экстракции. Другой ядрышковый белок - В23, также обнаруживается в составе МКТ, в зонах I,V (см.таблицу 3), а также в СВ, ассоциированных с ядрышками. Отмеченная в главе 1.3. ультраструктура МКТ с наличием зон, тождественных по организации основным ядрышкоеым компонентам, а также показанная здесь композиция МКТ, включающая специфические ядрышковые белки, все это дает основания рассматривать МКТ как нуклеолярные фрагменты или микроядрышки, включившие в свой состав СВ. Если вернуться к Еопросу о генезисе СВ ядер ооцитов 6-й стадии оогенеза R.temporaria, то здесь нужно принять к рассмотрению следующие моменты. Вся совокупность ультраструктурных и иммуноморфологических данных и, особенно, по обнаружению СВ в различных частях ядрышка, а также в связи с его фрагментами, приводят к выводу о нуклеолярном происхождении этих структур. В пользу этого говорит и ряд данных по ассоциации СВ с ядрышками, полученными на соматическом материале, начиная с первых электронномикроскопических работ по СВ

(Monneron, Bernhard, 1969; Hardin et al., 1969). При этом СВ располагаются в тесном контакте как с нуклеолярной поверхностью, давая характерные картины почкования ядрышек (Raska et al.,1990,1991; Brasch et al.,1994), так и с внутренними частями ядрышек. С другой стороны, СВ содержат ряд специфических ядерных компонентов: фибрилларин, аргентофильные белки ядрышкового организатора, ДНК-топо-изомеразу1/Fakan et al,1984; Raska et al,1990;1991/a также U3 и U8 мя PHK/Dundr,Raska,1993; Jimenez-Garcia et al,1994/, участвующие в начальных этапах созревания рРНК. Наряду с этим было показано, что при действии ингибиторов /Актиномицин-Д,DRB/,нацеленных на ядрышко , блокирующих синтез или созревание рРНК и вызывающих сегрегацию и фрагментацию нуклеол, происходит существенное увеличение

Таблица 3. Состав многокомпонентных тел (MKT). Данные иммуноэлектронной микроскопии *

Зоны MKT Коилин м я РНП Фибрилларин В-23 Актин

I + ++ + + + + + + + + ++ +

II - - - + +

III - - - + +

IV +++ + + ++ + + + +++ + + +

V + + + + + + + + ++++ + + +++ +

* Данные базируются на анализе срезов 10 различных MKT.

количества СВ, связанных с ядрышками /Raska et а1,1990/. Такой же эффект дает и естественная инактивация ядрышек, например, при падении метаболических функций клеток в период зимней спячки млекопитающих /Malatesta et а1,1994/. С нашей точки зрения подобная ситуация имеет место и в ооцитах 6-й стадии оогенеза, когда на фоне затухания синтетической активности ядрышек удается наблюдать их сегрегацию, фрагментацию и сопряженный с этим процесс усиления экспрессии СВ, связанных с нуклеолярным материалом. Естественно спросить - каковы могут быть функции "ядрышковых" СВ? На современном этапе'изучения этих образований однозначный ответ на этот вопрос, видимо, невозможен. Вряд ли эти структуры могут самостоятельно обеспечивать синтез рРНК и ее транспорт до ядерной оболочки, как это полагалось раньше /Hardin et al,1969; Brasch, Ochs, 1992/ поскольку в них отсутствуют рДНК, рРНК, РНК-полимераза I /Raska et al,1991; Carmo-Fonseca,1993/. К тому же сам факт большей экспрессии СВ в связи с инактивированными ядрышками тоже должен приводить к подобному выводу. Скорее можно предполагать, что СВ, относящиеся к ядрышку, могут обеспечивать лишь хранение части компонентов, расходуемых в процессах синтеза и созревания рРНК и невостребованных до определенного момента. Нельзя исключить, что продукция СВ на 6-ой, заключительной стадии оогенеза, отражает накопление этих компонентов для последующего эмбриогенеза. Что же касается специфической функциональной роли СВ в позднем оогенезе травяной'лягушки, то на основании ультраструктурных данных /см. главу 1.3/ можно, очевидно, лишь постулировать участие СВ в построении' волокнистого компонента капсулы кариосферы.. Каков механизм участия, какие конкретные компоненты СВ могут передаваться или расходоваться для наработки фибриллярного материала капсулы еще предстоит еыяс-нить. Вместе с тем, сохранность большей части структуры СВ после ряда экстракций и четко выраженное взаимодействие их материала с фибриллами капсулы после этих воздействий указывают скорее всего

на то, что это могут быть белки, относящиеся к разряду кариоске-летных. Не исключено, что одним из них является внутриядерный актин . Наличие актина в СВ и контактирующих с ними фибриллах волокнистого компонента капсулы было продемонстрировано на ооцитах 6-й стадии в иммуноэлектронных экспериментах /см.табл.3 и раздел IV.3.1/.Сфокусировав основное внимание на "нуклеолярных" чертах СВ, нами были сознательно опущены другие немаловажные аспекты этих загадочных и, очевидно, многофункциональных структур. В первую очередь - наличие в них широкого спектра мяРНК, участвующих в созревании информационных РНК. Кроме того, не обсуждались вопросы аналогий между сферами ооцитов амфибий /Gall,Callan,1989; Gall,1992; Wu et al.,1991/ и СВ. Данной теме посвящены недавние специальные работы лаборатории проф.Голла/Wu et al.,1993,1994;Gall et al.,1995/, делающие попытки обосновать гипотезу о том, что сравниваемые структуры являются универсальным ядерным компонентом.

II.КАРИОСФЕРА С КАПСУЛОЙ В ООЦИТАХ 6-Й СТАДИИ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ.

У данного вида лягушек так же, как у R.temporaria, сезонные изменения ядерных структур ооцитов 6-й стадии оогенеза имеют четко выраженный характер. Итогом этих преобразований является формирование в весенних ооцитах, диаметром около 1700 мкм (апрель) карио-сферы. В середине кариосферы наблюдается крупное (15-20 мкм в диаметре) белковое тело - центральное тело кариосферы (ЦТ). Гладко-контурные, лишенные боковых петель биваленты оказываются закрепленными на его поверхности. Заякоревание хромосом осуществляется зачастую их теломерными участками, которые выглядят как характерные вздутия, дающие интенсивную Фельген-положительную реакцию. ЦТ и связанные с ним хромосомы отделены от остальной части ядра слоем перемещенных из периферических районов многочисленных ядрышек (РисЗ.А). Ультраструктурный анализ подтвердил тесное Езаимодейст-

Рис.З. Схема организации дефинитивной кариосферы К.г1с11Ьипс!а.

А - светомикроскопичёские данные (показаны центральное тело и связанные с ним хромосомы).

Е - электронномикроскопические сведения. ПМ- псевдомембраны; ХР-хромосомы; ЯД- ядрышки.

вие хромосом с ЦТ. Само ЦТ представляет собой скопление структур, схожих с порами ядерной оболочки, связанных друг с другом фибрил-ляр-ным материалом, наподобии псевдомембран капсулы кариосферы травяной лягушки (Рис.ЗВ). Итак, оказалось, что капсула кариосферы R.ridibuncía построена по инвертированному типу. Роль компонента, фиксирующего и удерживающего хромосомы на месте, здесь играет ЦТ, а не стенки окружающей хромосомы капсулы, как у R.temporaria. В решении вопроса о генезисе ЦТ кариосферы R.ridibunda весьма плодотворным оказалось рассмотрение преобразований ядерных структур в сезонной динамике и на фоне гормонального стимулирования ооцитов к созреванию in vitro. Начало формирования кариосферы приходится на конец осени: к этому времени хромосомы с редуцированными боковыми петлями собираются в центральном районе ядра и окружаются ядрышками. Между хромосомами и ядрышками хорошо представлены сферические образования со светлой сердцевиной, которые зачастую выглядят в виде колец. В дальнейшем, в осенне-зимний период количество этих структур заметно увеличивается, среди них появляется множество полиморфных образований; кольцевые и полиморфные структуры содержат ДНК. Термин "кольцевые структуры" оказался условным и отражающим лишь световой уровень их анализа. Изучение серийных ультратонких срезов показало, что это сферические фибриллярные тельца, имеющие внутреннюю полость со сложноразветвленными лакунами. С появлением колец сопряжена сегрегация и фрагментация ядрышек, подобно тому, как это наблюдалось в зимних ооцитах R.temporaria. Ядрышки разнообразны по форме - чаще это округлые или вытянутые, гантелевидные структуры. Именно в этот период на поверхности ядрышек появляются кольцевые структуры, сходные с вышеописанными. О ядрышковом происхождении, по крайней мере части кольцевых структур, свидетельствует не только их контакт с ядрышками, но также Ag-NOR реакция. Ар-генгофильные кольцевые структуры (по 6-8 штук) выявляются в ядрышках, расположенных на периферии ядра (средняя диплотена) и в ядрышках, собранных вокруг инвертированной капсулы (6-я стадия ооге-неза), однако в последнем случае их число значительно уменьшается (до 1-2). В то же время, рядом с ядрышками 6-й стадии наблюдаются свободно лежащие, окрашенные серебром кольцевые структуры. Все это, очевидно, может указывать на элиминацию части кольцевых образований, содержащих рДНК, из фрагментирующихся ядрышек ооцитов 6-й стадии оогенеза.

Этапы формирования ЦТ связаны с перестройками в ядрах, характеризующими переход ооцита из зимнего состояния в весеннее и с его подготовкой к созреванию. Появлению материала ЦТ сопутствуют следующие основные изменения ядерных элементов: сокращение хромосом и их боковых петель, завершение ядрышками морфологических преобразований, связанных с их сегрегацией и фрагментацией, и возвращением их к сферической форме. Вероятно, неслучайно именно в этот период появляется материал ЦТ, сначала в виде отдельных фрагментов или зачатков (ЗЦТ). Изучение серийных срезов показало, что на одно ядро приходится несколько ЗЦТ. Материал ЗЦТ плотно окружен кольцевыми или полиморфными структурами, на одном срезе их можно насчитать до двадцати. В исключительных ситуациях, видимо, при избыточной наработке материала ЗЦТ в некоторых местах ядра он принимает вид

широкого, лентовидного фрагмента, так густо окруженного кольцевыми структурами, что их количество с трудом поддается подсчету. В контакте с ЗЦТ наблюдаются и хромосомы.ЗЦТ концентрируются в одном районе ядра, соседствуя друг с другом. Основу их, также как и в ЦТ окончательно сформированной кариосферы, составляют пороподобные структуры, которые соединяются друг с другом фибриллярным материалом в единую систему. Видимое при световом ммкроскопировании размыкание контактирующих с ЗЦТ колец, их раскрывание в сторону ЗЦТ на ультраструктурном уровне выражается в том, что полость кольцевых образований всегда открывается в сторону материала псевдомембран. Контакт колец с ЗЦТ настолько тесен, что в его зоне удается проследить переход их фибрилл в поры зачатка ЦТ. Такие картины позволяют предполагать, что именно кольцевые и полиморфные структуры поставляют материал для образования ЦТ кариосферы. Об этом косвенно свидетельствует также и факт исчезновения колец по мере роста объема ЦТ. Сами кольца, как показал анализ ядерного содержимого после экстракции N1, в основном состоят из белков ядерного матрик-са. Можно думать, что именно эти белки играют существенную роль при формировании ЦТ. Возникает вопрос о механизме слияния зачатков и образовании ЦТ. Наши наблюдения не позволяют ответить на него определенно. Можно предполагать, что увеличение объема близко расположенных ЗЦТ приводит к их постепенному сближению и в конце концов к слиянию в общую массу. При этом, связанные с ЗЦТ хромосомы, сокращаясь, вероятно, тоже оказываются вовлеченными в процесс сближения и, с образованием единого ЦТ, оказываются "заякоренными" в его материале. Подобным образом, видимо, формируется кариосфера у некоторых птиц, имеющая сходную с кариосферой озерной лягушки топографическую организацию (Гагинская,Грузова,1969). Появление ЗЦТ после гормонального стимулирования февральских ооцитов, в которых первоначально они отсутствовали - факт примечательный. Естественно думать, что при действии прогестерона происходит новообразование материала ЦТ, в первую очередь пороподобных структур. Такие же картины наблюдались и при действии прогестерона на ооциты R.temporaria, когда после гормонального стимулирования происходило заметное увеличение псевдомембранного компонента капсулы кариосферы (см.выше,глава 1.1.).

II. I._Устойчивость комплекса "кариосфера с капсулой" и

организация ядра ооцита при фолликулярной атрезии у озерной лягушки .

Накопленные данные по организации ядра и кариосферы позднеди-плотенных ооцитов R.ridibunda, в первую очередь касающиеся факта заякоревания хромосом в ЦТ - своеобразном организующем центре всей композиции ядра, а также наличия в составе ЦТ внутриядерных пор или пороподобных структур, ставили следующий вполне оправданный вопрос. Сколь устойчива, созданная в результате сложного внутриядерного морфогенеза уникальная структура ядра ооцита - кариосфера с инвертированной капсулой? Стабильны ли связи между составляющими ее компонентами, не являются ли они "эфемерными", отражающими случайные флуктуации поведения и взаимного расположения элементов ядра? В отличии от ситуации с травяной лягушкой, когда резистентность ее кариосферы с капсулой оценивалась в экспериментах с выделением in vitro (см.главу 1.5), в случае с озерной лягушкой со-

средоточились на поисках естественной модели такого рода тестирования. В этой связи представлялся обоснованным выбор для этих целей атретических фолликулов, ооциты которых находятся под дестабилизирующим, многофакторным воздействием, развернутым во времени и приводящем в ряде случаев к резорбции половых клеток (Эа1с1ариг, 1988; За1с1ариг,ЫасЛсагпл., 1973; 1988) . Для получения материала отбирались гонады, которые при светомикроскопическом скрининге давали картины дегенерации части их ооцитов 6-й стадии. Эти картины соответствуют тем, которые описаны для дегенирирующих ооцитов амфибий из атретических фолликулов (см. обзор БахсЗариг,1978). На анимальном полюсе этих ооцитов пигментные гранулы сливаются в обширные скопления. Здесь же встречаются редкие клетки, внедрившиеся из фолликулярного эпителия. Обращает на себя внимание периферическая зона ядра. Ядерная оболочка характеризуется большой изрезанностью контура. Многочисленные ее складки проникают далеко вглубь ядра; при этом некоторые инвагинации ядерной оболочки заканчиваются обширными гроздевидными скоплениями "пакетов", заполненных белковым содержимым. Электронная микроскопия показала, что грозди "пакетов" представляют собой скопления неравных по размеру везикул, которые заполнены фибриллярным белковым материалом и окружены мембраной. Ядерная оболочка в целом сохраняет свои атрибуты: мембраны и поровые комплексы. Вместе с тем, во многих зонах выявляются ее изменения: ядерная мембрана теряет четкий контур и замещается филаментозным материалом, поровые комплексы становятся атипичными по структуре, иногда их очертания лишь угадываются, на некоторых участках наблюдается исчезновение пор; видны и разрывы ядерной оболочки, тогда содержимое ядра непосредственно контактирует с цитоплазмой.

Процессы сегрегации и фрагментации, затрагивающие ядрышки е норме, при атретической дегенерации становятся заметно интенсивнее. В теле ядрышка резко обособляются электронноплотные зоны, соответствующие ПФК и крайнепериферические светлые участки с нежно-филаментным материалом - ФЦ. Выход на поверхность ФЦ объясняет появление на краю ядрышек ДНК-содержащих гранул, которые отчетливо наблюдаются при окраске флуорохромами. Вслед за ядрышками, ближе к центру ядра, располагаются хромосомы и ЦТ кариосферы. В одних случаях хромосомы, связанные с ЦТ, хорошо видны как отдельнолежащие биваленты, в других - хромосомы имеют четкую тенденцию к слиянию вокруг ЦТ. На ультраструктурном уровне такая конденсация хромосом выражается в виде хроматиновой сети, окружающей ЦТ.ЦТ дегенирирующих ооцитов по ультраструктуре, в общих чертах, сходно с ЦТ кариосферы в норме. Основу его также составляют автономные поровые комплексы. Однако в отличие от нормы, при атрезии в состав ЦТ входят, кроме того, и разнообразные по форме мембранные образования (пузырьки, цилиндрические структуры, видоизмененные пористые пластинки) .

Итак, процессы фолликулярной атрезии вызывают существенные перестройки в нативной организации практически всех ведущих компонентов ядра ооцитов озерной лягушки. Они относятся: к сильно деструктивным изменениям ядерной оболочки вплоть до ее разрывов, патологическое разрастание внутренней ядерной мембраны и образование везикул, связанных, очевидно, с экспансией в ядро цитоллазматичес-

ких белков; к тенденции хромосом к слиянию; обострению ситуации с сегрегацией и фрагментацией ядрышек; внедрению обильного мембранного компонента в состав ЦТ. Вместе с тем, несмотря на всю серьезность этих изменений для сохранности целостной организации ядра, общий план строения кариосферы с инвертированной капсулой в дегенерирующих ооцитах, оказался неизменным, в сравнении с нормой. Вряд ли подлежит сомнению, что выдерживать, не распадаясь, воздействия, которые могли вызвать вышеотмеченные заметные изменения элементов ядра, могут только такие устойчивые комплексы внутриядерных структур, как кариосферы с капсулой.

НЕКОТОРЫЕ ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ К 1,11 ЧАСТЯМ.

Наблюдения на гистологических и ультратонких срезах ооцитов 6-й стадии оогенеза процессов формирования кариосферы с капсулой у двух видов лягушек, обнаруживают в ядре, помимо хромосом и ядрышек, ряд других ядерных структур, приходящих в контакт с элементами формирующейся капсулы. Среди них отчетливо выявляются две группы телец: фибриллярные сферические образования, выявляемые на гистологических срезах как кольцевые, и агрегаты, состоящие в основном из клубков спиралевидных тяжей - "coiled bodies". Последним, наиболее подробно изученным на материале травяной лягушки, посвящена специальная глава 1.8. Первые же ярко представлены в ядре ооцитов озерной лягушки. У этого же вида более отчетливо выглядит участие этих структур в формировании псевдомембран капсулы,■сгруппированных в ЦТ кариосферы. Очевидно также их' новообразование и постепенная элиминация из ядра. Вопрос о происхождении этих структур все еще ждет своего окончательного решения. Однако, как было отмечено выше, ряд фактов, полученных в комплексном анализе на световом и ультраструктурном уровнях, говорит в пользу ядрышкового происхождения, по крайней мере, части кольцевых структур. Вместе с тем, анализ ситуации в ооцитах осенью (октябрь-ноябрь), когда при редукции боковых петель хромосом-ламповых щеток начинается агрегация ядерных структур, а в центре ядра накапливается множество кольцевых и полиморфных образований, оставлял альтернативную возможность формирование последних на хромосомах. Трудно исключить двойной источник их происхождения в ходе поэтапного становления кариосферы с капсулой: сначала на ламповых щетках нарабатывается первая генерация кольцевых частиц (осень), которая впоследствии дополняется (или замещается) второй генерацией - ядрышкового происхождения. Подобная смена генераций аналогов кольцевых структур -гранул-спутников - хорошо прослежена при формировании капсулы кариосферы на выделенных ядерных структурах травяной лягушки (см.ниже главу IV.1) .

■ Примечателен факт обнаружения в ядрах ооцитов двух видов лягушек автономных поровых комплексов. Впервые они были описаны, причем в связи с формирующейся кариосферой у R.temporaria Ченцовым и Поляковым (Ченцов,Поляков,1974). Характер упаковки пор, отсутствие в связующем их материале мембранных элементов, делает их тождественными с псевдомембранами капсул ооцитов травяной и озерной лягушек. Псевдомембраны участвуют в построении капсулы кариосферы ооцитов животных, эволюционно далеко отстоящих от амфибий: у насекомых (Aedes) поровые комплексы включаются в капсулу, трансформируясь 113 материала модифицированных синаптонемальных комплексов

(поликомплексов) (Fiil, Moens, 1973). Своеобразные аналогии с ЦТ R.ridibunda возникают при анализе накопления автономных поровых комплексов в центральных районах мейотических микронуклеусов жгутиконосцев (Бобылева, 1984; Ковалева,Райков, 1990) . Следует отметить, само по себе появление поровых комплексов внутри ядра описано во внушительном числе работ, большая часть этих данных связана с порами в составе внутриядерных пористых пластинок (annulate lamellae) (см.обзоры: Maul,1977; Kessel,1986,1989). Пока не находит своего объяснения поразительный факт накопления внутриядерных пор преимущественно в половых клетках (ооцитах, сперматоцитах) или клетках злокачественных опухолей. Остаются неясными и функции внутриядерных пор. Умозрительные выводы на этот счет, на основании морфологических картин частой связи внутриядерных пор с нуклеоляр-ными фрагментами, приводят к вряд ли состоятельным заключениям о возможной роли эти пор в созревании или сборке рРНП частиц (Kessel,1983) . Не выяснена также и функциональная роль пор в составе псевдомембран ядер ооцитов лягушек. В этом случае пока можно констатировать их участие в построении капсулы кариосферы. Их способность к новообразованию в составе капсулы, связь с хроматином -будь-то хромосомы в центральной части или ДНК-содержащие производные ядрышек на разных уровнях нуклеолярной капсулы, за исключением ее периферии, все это говорит о неслучайном характере и быстрого морфогенеза и распределения в ядре. Наблюдающиеся картины связи конечных (теломерных) участков хромосом как у R.temporaria, так и у R.ridibunda с псевдомембранами, приводили к предположению, что в их составе должны существовать белки, ответственные за теломер-связывающую способность. Ввиду важности этого вопроса для понимания закономерностей трехмерной организации ядра ооцита и, в первую очередь, ориентации хромосом в обширном зародышевом пузырьке амфибий в один из наиболее . ответственных периодов проэмбрионального развития, нами была предпринята попытка выявления теломер-связыва-ющей активности различных компонентов ядра ооцитов 6-й стадии оо-генеза травяной лягушки. Методами связывания фрагментов теломерной ДНК с экстрактами ЯО и нуклеоплазмы на нитроцеллюлозных фильтрах и ретардацией было показано, что этой активностью обладают кариоске-летные белки ЯО, хотя не исключается наличие теломер-связывающих белков и в центральных районах ядра. В настоящее время проводятся работы по очистке этих белков, для последующего получения к ним антител и локализации их в ядрах ооцитов 6-й стадии оогенеза лягушек.

Сравнение особенностей строения кариосферы с капсулой двух близкородственных видов амфибий - травяной и озерной лягушек, показало, что двухкомпонентный (псевдомембраны и фибриллы) материал хорошо развитой волокнистой части капсулы R.temporaria, у другого вида лягушек - R.ridibunda - фактически редуцирован до псевдомембран, собранных в центральное тело кариосферы. Появление материала волокнистой части капсулы в центре хромосомного клубка, а не вокруг него, как это имеет место у травяной лягушки, вполне логично побудило к выделению особого "инвертированного" типа организации кариосферы с капсулой (Грузова,1979). Однако возникают вопросы: сколь жестко морфогенез капсулы кариосферы того или иного вида животных следует строго определенному типу, совместимы ли эти два различных типа, не перекрываются ли они на отдельных этапах стано-

вления дефинитивной капсулы? В свете данных по заключительным моментам формирования капсулы у травяной лягушки непосредственно перед созреванием ооцитов, когда псевдомембранный материал "наружной" капсулы этого вида смещается в межхромосомную область, явно напоминая признаки "инвертированной" капсулы озерной лягушки, можно, видимо, думать о большей лабильности схем внутриядерных морфогенезов, приводящих в отдельных случаях к перекрыванию различных типов организации кариосфер с капсулой, к размыванию границ между ними.

III. ФОРМИРОВАНИЕ КАРИОСФЕРЫ В ООЦИТАХ ИЗ ПОЛОСТНЫХ ФОЛЛИКУЛОВ ЧЕЛОВЕКА (УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И АВТОРАДИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ) .

Кариосфера, как комплексная ядерная структура, состоящая из хромосом, объединенных в клубок вокруг ядрышка, описана в ряде светомикроскопических работ, у разных видов млекопитающих: в ооци-тах человека (Kuhlmann,1970; Sanial et al.,1976; Курило,1982; Курило и др.,1983), приматов (Курило,1982), грызунов (Pincus,Enzman,1935; Odor,1955; Mandl,1963; Hadek,1965; Зыби-на,1969; Зыбина и др.,1980; Грищенко,1984), хищных (Кикнадзе и др.,1980). Электронномикроскопически этот феномен не подвергался анализу вплоть до наших работ. Нами впервые с привлечением методов ультраструктурного анализа и электронной авторадиографии было исследовано формирование кариосферы у млекопитающих на примере ооцитов человека. Ооцитам млекопитающих присуща остановка в росте на стадии многослойного фолликула; длительный период развития фолликула, превращение его в Граафов пузырек проходит при практически неизменных размеров ооцита (Moore et al.,1974; Дыбан, Баранов, 1977). Такая же ситуация имеет место и в оогенезе человека. Проведенная нами математическая обработка данных с помощью корреляционного анализа показала, что в яичниках женщин наблюдается наличие умеренно положительной корреляции между диаметром ооцита и ядра, и полное ее отсутствие между размерами фолликула и ооцита. При варьировании диаметра полостных фолликулов в широких пределах от 2 до 30 мм, колебания диаметра ооцитов были весьма незначительны. Вместе с тем, по топологии ядерных структур ооциты существенно различаются. Картины тонкой организации их ядер могут составить определенный ряд; от ядер со структурами, распределенными по всему объему ядра, через ядра с разными этапами их агрегации вокруг ядрышек, к ядрам с кариосферой, где ядерные структуры объединяются в комплекс. Авторадиография высокого разрешения, выявила глубокие различия в активности ядер сравниваемых ооцитов. На стадии, предшествующей кариосфере, обнаруживается заметная активность ядра: прослеживается четкая локализация метки 3Н-уридина над ядрышком и дисперигрованным хроматином. В то же время изучение автографов ооцитов с кариосферой указывает на фактически полное прекрашение их ядрами синтеза РНК. Инактивация хромосомно-ядрышкового аппарата, очевидно, общее явление для оогенеза млекопитающих. Первоначально она была продемонстрирована на ооцитах мышей (Зыбина,19 68). Таким образом, образование кариосферы у человека происходит на фоне затухания транскрипционной активности хромосом и ядрышка, и идет по общему для млекопитающих плану. Хромосомы постепенно объединяются в единую массу, которая плотно окружает ядрышко. В результате образуется компактная кариосфера диаметром до 13 мкм, имеющая округлую и чаще лопастную форму. Ядрышко в центре кариосферы состоит из

однообразно и плотноупакованного тонкофибриллярного материала (фибриллы толщиной около 3 нм) . Отсутствие гранул, сугубо фибриллярная природа, при плотной упаковке весьма характерных по виду фибрилл, указывают на полную инактивацию ядрышка. Подобную организацию имеют инактивированные ядрышки из антральных преовуляторных фолликулов мыши (Chouinard,1975; Takeuichi, 1984, 1986 ; Зыбина и др.,1990) крысы (Antoine et al.,1987), свиньи (Crozet et al.,1981) и коровы (Crozet et al.,1986). Спорным остается происхождение материала данных ядрышек. Некоторые авторы рассматривают его как результат компактизации классических компонентов ядрышка: фибриллярного материала (Crozet et al.,1981) или плотного фибриллярного компонента (Takeuichi, 1984;1986). Другие полагают, что описываемые образования являются продуктом своеобразной секреции ядрышек, и по сути, замещают собой истинные ядрышки (Antoine et al., 1988;1989) . Как уже упоминалось, в контакте с ядрышком располагается хромати-новый материал кариосферы, состоящий из рыхлолежащих фибрилл диаметром 6-10 нм. Хроматин плотно окружает ядрышко, но не образует сплошные массы, как это видно на полутонких срезах; в нем заметны светлые просветы в виде лакун. По всей вероятности, эти области разграничивают отдельные хромосомы. На объединение хромосом, а не на их слияние указывает, видимо, и лопастная форма большинства ка-риосфер. На поверхности хроматиновой массы наблюдаться ядрышкопо-добные тела (ЯПТ) (5 - 10 мкм в диаметре), которые представляет собой округлые скопления гранул диаметром 18 - 20 нм, помещенные в тонкой фибриллярный матрикс. Хорошо прослеживается тесная связь ЯПТ с хроматином. Итак, кариосфера человека представляет собой комплекс следующих структур: ядрышко, хромосомы и ЯПТ. По топологии составляющих элементов с центральным положением ядрышка, выступающим организатором агрегации других ядерных структур, она может быть отнесена к инвертированному типу и формально сравнима с кариосферой озерной лягушки и птиц (Гагинская, 1989) .

IV.ДИНАМИКА МОРФОЛОГИИ ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР 3,6-Й СТАДИЙ ООГЕНЕЗА ТРАВЯНОЙ ЛЯГУШКИ.

Нетрудно видеть, что результаты комплексного исследования, изложенные в I части, относятся преимущественно к особенностям организации кариосферы с капсулой. В динамике бьши прослежены, главным образом, заключительные этапы становления дефинитивной капсулы и функционально сопряженные с этим сезонные преобразования ведущих ядерных структур в конце 5-й и 6-й стадий оогенеза лягушек. По мере накопления данных становилось все более очевидным, что особенности этих двух конвергентных процессов ( генезис капсулы и преобразования ядерных структур и их сателлитов) закладываются на предыдущих стадиях оогенеза и сопряжены в первую очередь с характерными чертами морфологии ядерных структур 3-й стадии оогенеза. Последняя - период максимальной активации хромосом-ламповых щеток и ядрышек - как уже отмечалось, является прямой альтернативой периоду агрегации хромосом и многочисленных ядрышек в центральной зоне зародышевого пузырька лягушек. Отсюда бьши понятны возникающие задачи. Предстояло охарактеризовать ряд ранее неописанных особенностей общей морфологии, топологии и тонкой организации ядерных структур на 3-й стадии оогенеза в сравнении с 6-й стадией. Следовало показать, где это представлялось возможным, какие преобразо-

вания ядерных структур обусловили (или подготовили) их участие в морфогенезе уникального ядерного комплекса - капсулы кариосферы.

IV.1■Преобразование хромосом-ламповых щеток и морфогенез капсулы карпосферы (анализ выделенных структур).

Прямые данные по динамике морфологии хромосом и сопутствующих структур, как нам представлялось, могли быть получены при исследовании выделенных вручную ядерных образований, когда они, в отличии от ситуации на срезах', оказываются целиком или своими значительными частями в поле зрения светового или электронного микроскопа. Принимая во внимание ряд оговорок, связанных с потерей части неструктурированной кариоплазмы, можно думать, что в этом случае мы имеем дело с таким препаратом, когда сохраняется большинство связей взаимодействующих структур ядра.

При фазово-контрастном наблюдении ядер, изолированных из оо-цитов 3-й стадии оогенеза, диаметром около 0,6 мм, видно, что ядрышки занимают периферию, а хромосомы смещаются ближе к центру. В растворе с пониженной ионной силой, для диспергирования содержимого ядер, ядрышки преобразуются в ожерельеподобные структуры, при этом без труда обнаруживается 13 отдельно лежащих бивалентов. В этот период биваленты достигают максимальной длины. Так длина самого крупного бивалента I, который легко идентифицируется по наличию характерных теломерных петель, составляет 4 00 мкм. Размеры хромосом-ламповых щеток из ооцитов, переходящих из 3-ей стадии в 4-ую осенних лягушек, практически не меняются. Но в ооцитах осенних лягушек около хромосом появляется множество мелких сферических гранул (диаметром около 1,8 мкм). Около бивалента I располагается до 100 таких гранул. Поскольку эти гранулы всегда сопутствуют ламповым щеткам, мы назвали их "спутниками". Следует отметить, что описываемые нами гранулы-спутники отличаются от обнаруженных Гол-лом с соавторами у других амфибий многочисленных сферических образований - снерпосом (эпигроБотез). Одним из условий идентификации снерпосом является присутствие в среде для выделения и диспергирования ядер ионов Мд" (I ,шМ), в его отсутствие - снерпосомы не выявляются. В протоколах, связанных с данной частью работы (см.раздел "Краткая характеристика объектов и методов исследования") Мд+* был исключен из раствора. Хромосомы в осенних ооцитах лягушек обнаруживают отчетливую тенденцию к агрегации, вследствие чего диспергирование ядер осенних ооцитов происходит медленно, в результате -возможно проследить поэтапное разрыхление хромосомного клубка, обособление отдельных бивалентов и отделение их спутников. Исследование ультраструктуры хромосом-ламповых щеток на диспергированных препаратах подтвердило авторадиографические данные о спаде транскрипционной активности осенью. Если в единицах транскрипции (ЕТ) боковых петель ламповых щеток летом содержится более 20 РНП-фибрилл на 1 мкм, то в ЕТ из ооцитов осенних лягушек - менее 10 на 1мкм. Кроме того, в хромосомах осенних лягушек между РНП-фибрилла-ми ЕТ появляются' протяженные участки неактивного нуклеосомного хроматина. Еще большие изменения- претерпевают ламповые щетки в ооцитах 4-й стадии оогенеза'зимующих лягушек. Диспергировать содержимое ядер таких ооцитов чрезвычайно- трудно. Хромосомы представляют собой клубок компактных"бивалентов с относительно редуцированными петлями; многочисленные спутники'по-прежнему присутствуют ме-

жду хромосомами. Спутники связаны с боковыми петлями. Наряду с одиночными спутниками встречаются и конгломераты. Диаметр спутников зимних ооцитов варьирует от 0,8 до 5,3 мкм. На ультраструктурном уровне обнаружено, что эти спутники тесно связаны с длинными (до нескольких мкм) пучками филаментов разной толщины - от 20 до 70 нм. Последние, анастомозируя друг с другом, образуют сеть. Картины тесной связи спутников с филаментами (толщиной около 10 нм) настолько отчетливы, что создается впечатление вхождения филаментов в состав материала спутников (Рис.4).

На 5-й стадии оогенеза конденсация хромосом прогрессирует. Появляются признаки начала формирования волокнистого компонента капсулы кариосферы. Около хромосом располагаются длинные тяжи волокнистого материала. В составе тяжей видны спутники разного размера; тяжи участвуют в формировании волокнистого компонента капсулы и дальнейшее нарастание массы его волокнистого материала,

Рис.4. Схема отражающая связь гранул-спутников с фибриллярным компонентом капсулы R.temporaria.

А,Б - светомикроскопические В - ультраструктурные данные. А - связь спутников с боковыми петлями хромосом или их фрагментами. Б - тяж волокнистого материала капсулы, в состав которого входят многочисленные гранулы-спутники, В - плотное взаимодействие гранул-спутников с пучками филаментов материала капсулы (ооциты 4-ой стадии).

приобретающего постепенно черты обкладки вокруг хромосом, сопряжено с резким уменьшением числа и размеров спутников. Вместо них между бивалентами обнаруживаются скопления волокнистого материала. Впервые частично оформленную капсулу кариосферы удается обнаружить в ядрах наиболее крупных ооцитов осенью. На таких препаратах видно, что сильно укороченные, в сравнении с 3-4-й стадиями, хромосомы сохраняют хромомерно-петлевую организацию при значительной редукции боковых петель. Капсула представляет собой волокнистую оболочку, в которую вкраплены спутники, при этом последние преобладают на одном из полюсов кариосферы. Капсула кариосферы из ооцитов зимующих лягушек выглядит как плотная массивная волокнистая структура, е толще которой наблюдаются мелкие гранулы, около 0,2 мкм в диаметре. Минимальный диаметр волокон капсулы, видимых в световой микроскоп, составляет 0,1-0,2 мкм. Хромосомы внутри капсулы практически не просматриваются. Завершение морфогенеза приходится на весну. Главная роль в этом процессе, видимо, приходится на ядрышки. В этот период, при наличии в ядрах уже достаточно хорошо раз-

витой волокнистой капсулы, в диспергированных четкообразных ядрышках, расположенных вокруг нее, обнаруживается обособление сферических гранул, подобных спутникам ламповых щеток. В дальнейшем эти ядрышковые спутники исчезают, а сами ядрышки оказываются связанными с материалом, сходным с волокнистым компонентом капсулы. Эти волокна впоследствии еходят в состав волокнистой капсулы кариосфе-ры ооцитов, готоеых к овуляции.

Таким образом, в ооцитах травяной лягушки 3-4-й стадий ооге-неза, на протяжении лета-зимы, в период, предшествующий формированию капсулы кариосферы, прослеживаются трансформации тонкой морфологии ламповых щеток. При незначительных изменениях общих размеров бивалентов, существенно изменяется количество РНП-комплексов на ТЕ боковых петель. В хроматине последних нарастают организованные в нуклеосомы фрагменты. Изменения субмикроскопической анатомии отражают понижение транскрипционной активности боковых петель и сопровождаются массовой продукцией ассоциированных с ними гранул-спутников. На 5-6-й стадиях спутники сливаясь, дают тяжи волокнистого материала - зачатка волокнистого компонента будущей капсулы.

IV.2.Трансформация нуклеолярного хроматина и морфология ядрышек.

Абсолютное большинство работ по функциональной морфологии нук-леол ооцитов амфибий относилось к активным ядрышкам (3-я стадия оогенеза), менее изученными оставались инактивированные ядрышки (5,6-я стадии). Полученные данные давали основание полагать, что в основе субструктуры ядрышек различных уровней функциональной нагрузки лежат особенности организации их хроматина и его распределения в теле нуклеол. Структура транскрипционно активного хроматина ядрышек ооцитов 3-й стадии оогенеза у земноводных изучена подробно. Основное внимание было уделено организации единиц транскрипции (ТЕ) , спейсерных участков, вопросу о наличии нуклеосом в составе осевой фибриллы ДНП. Было показано, что основным элементом транскрибируемого хроматина ядрышек являются тандемно расположенные ТЕ. В то же время существует ряд работ, в которых показано, что на активных стадиях оогенеза структура ядрышек претерпевает значительные изменения: сферические ядрышки приобретают вид замкнутых колец, напоминающих ожерелья, где каждая бусина нанизана на общую нить (Callan,1966; Lane,1967; Ebstein,1969). Кольцевые структуры с бусинами вдоль оси были обнаружены непосредственно в теле сферических- ядрышек (Macgregor,Moon, 1971) . Аналогичные кольцевые структуры были обнаружены Миллером (Miller, 1964) в ооцитах Triturus pyrrogaster. При понижении ионной силы раствора для диспергирования содержимого ядер до 25 мМ ядрышки теряли сферическую форму и превращались в ожерельеподобные кольца. Обработка ДНКазой разрушала целостность таких колец. Перечисленные данные, с одной стороны, указывают на то, что осью ожерельеподобных или четковид-ных структур является рДНК, а с другой - ставят вопрос о том, что транскрипционно активный хроматин ядрышек организован в структуры более высокого порядка, по сравнению с линейно расположенными ТЕ. В связи с этим предстояло описать структуру транскрипционно активного хроматина ядрышек ооцитов 3-ей стадии, показать изменения организации ядрышкового хроматина в ходе оогенеза при различных уровнях функциональной нагрузки ядрышек: высокой (3-я стадия ооге-

неза) и низкой (6-я стация) периода завершения формирования капсулы кариосферы. При этом представлялось существенным выявить, каким образом изменения структуры хроматина в ходе цикла "активация-инактивация" сопряжены с изменениями ультраструктурной морфологии ядрышек на срезах.

В ооцитах 3-ей стадии ядрышки (диаметром 6-10 мкм) занимают периферию ядра. Известно, что вхождение ооцитов амфибий в 3-ю стадию оогенеза (начало вителлогенеза) характеризуется резким подъемом транскрипционной активности, при этом синтез только рРНК на этой стадии составляет около 4 0% тотального синтеза РНК (Davidson et al.,1964; Van Gänsen et al.,1976). Анализ ультратонких срезов подтверждает эти представления. В ядрышках хорошо представлены: гранулярный компонент (диаметр гранул около 25 нм) и (по данным иммуноэлектронной микроскопии) связанный с ним белок В23, ответственный за сборку прорибосомных частиц. Агрегат фибриллярного материала занимает слегка эксцентричное положение (толщина фибрилл около 4-7 нм) . Взаимное положение составляющих активного ядрышка ооцитов травяной лягушки вполне соответствует типичной схеме организации амплифицированных ядрышек ооцитов амфибий, устроенных по типу: кора(гранулы) - сердцевина(фибриллы). Следует отметить, что при самом тщательном анализе, используя в отдельных случаях технику серийных срезов, нам не удалось на данной стадии оогенеза выявить в ядрышках компоненты, напоминающие по организации ФЦ ядрышек. При понижении ионной силы раствора для диспергирования до 25 мМ, ядрышки теряют сферическую форму и превращаются в четковидные кольца разной длины. Эти структуры появляются в связи с растворением кортекса сферических ядрышек. Четковидные структуры представляют собой набор опушенных бусин одинакового размера: 2-2,5 мкм. Использование мягкой процедуры диспергирования хроматина ядрышек в соответствии с методом Миллера позволило изучить структуру транс-крипционно активного ядрышкового хроматина с минимально измененной исходной организацией. Общий план строения визуализированных в электронном микроскопе диспергированных ядрышек не отличается от четковидных структур, видимых в световом микроскопе. Бусины четко-видных колец представляют собой розеткоподобные структуры, где розетка состоит из петель, образованных ET рибосомных генов, замыкающихся в центральную часть, в которой видны скопления электронно-плотного материала. Число петель, образующих розетку может достигать десяти, при этом диаметр розетки колеблется от 2 до 3 мкм. Эти размеры соответствуют диаметру бусин ожерельеподобных ядрышек, видимых при световом микроскопировании. Смежные розетки соединяются друг с другом ET рибосомных генов, с четко различимыми точками инициации и герминации транскрипции и ясно выраженным градиентом длин РНП-фибрилл вдоль осевой нити ДНП. Таким образом, транскрип-ционно активный хроматин ядрышек ооцитов травяной лягушки представляет собой закономерно организованную структуру, основным элементом которой является дискретно расположенная розетка, а не единица транскрипции, как считалось ранее. ТЕ, организованные в виде петель, являются частью этой структуры. Сам факт существования розеток, как одного из уровней организации хроматина уже был описан в ряде работ (Okada, Comings, 1979; Leon,Macaya, 1983; Prusov et al.,1983; Прусов и др.,1985). Однако в этих работах была изучена структура либо компактного хроматина метафазных пластинок после

обработки детергентами и высокомолярными растворами солей, либо предварительно компактизированного хроматина интерфазных ядер при понижении концентрации дивалентных катионов. Транскрипционно активный хроматин ядрышек ооцитов травяной лягушки организован в виде розеток, петли которых представляют собой рЕТ, в отличии от де-конденсированного компактного хроматина, где петли розеток представлены нуклеосомным хроматином. Биологический смысл розеточных структур активного хроматина лягушек остается невыясненным. Однако данные, полученные при изучении транскрипции дрожжевых рибосомных генов, показали, что пространственное сближение точек инициации и терминации транскрипции само по себе способно усилить транскрипционную активность ядрышкового хроматина (Johnson,Warner,1989).

Как было отмечено выше, к началу зимы в ооцитах 6-й стадии оогенеза, практически инактивированные ядрышки собираются в центральных районах ядра, формируя нуклеолярную капсулу вокруг конденсированных и собранных в кариосферу хромосом. Ультраструктура ядрышек этой стадии уже описана (см.главу 1.2). Здесь же ограничимся конспективным изложением данных. Ядрышки резко отличаются по ультраструктуре от активных ядрышек 3-й стадии оогенеза. Они практически лишены гранулярного компонента, однако иногда в их составе удается обнаружить небольшие скопления гранул диаметром около 25 нм. Потеря гранулярного компонента сопряжена с резким уменьшением в ядрышке В23 антигена (иммуноэлектронные данные). Преобладающее число ядрышек сугубо фибриллярной природы. В ядрышках выделяются участки низкой электронной плотности, состоящие из рыхло упакованных фибрилл диаметром около 3 нм. Эти участки контурируются слоем плотно упакованных фибрилл, толщиной 3-6 нм. Эти зоны по своей организации полностью соответствуют фибриллярному центру ядрышка (ФЦ) , окруженным плотным фибриллярным компонентом (ПФК), подробно изученным в ядрышках млекопитающих (см.обзоры:Jordan,1984; Челидзе, Зацепина, 1988; Thiry et al.,1991; Fischer et al.,1991; Scheer et al.,1993). ФЦ зимних ооцитов травяной лягушки занимают эксцентричное положение, часты их выходы на поверхность ядрышка. Наряду с ядрышками, тлеющими ФЦ, попадаются ядрышки, в которых ФЦ отсутствует. Окраска препаратов ядер ооцитов 3Н-актимицином -Д показала, что в большинстве ядрышек гранулы серебра располагаются ближе к периферии, а в отдельных случаях метка выявляется только на поверхности. В то же время, на тех же самых препаратах, можно найти ядрышки, имеющие незначительное число гранул серебра или обнаруживающие их полное отсутствие. Такие ядрышки выглядят как более плотные, темноокрашенные образования. После помещения ядер ооцитов 6-й стадии в среду с пониженной ионной силой, ядрышки распадаются на ожерельеподобные структуры, однако бусины, составляющие "ожерелье" имеют меньший диаметр и располагаются по окружности менее плотно, по сравнению с подобными структурами из ооцитов 3-ей стадии. В электронном микроскопе после диспергирования ядрышек выявляются редкие розетки, а число петель рЕТ, входящих в состав розетки снижается до 4-6. Большая часть хроматина представлена в виде одиночных рЕТ, соединенных друг с другом протяженными участками нуклеосомного хроматина. При тех же условиях диспергирования хроматина в некоторых ядрышках проследить рЕТ не удается: их хроматин представлен тяжами нуклеосомных нитей.

Таким образом, ядрышки нуклеолярной капсулы кариосферы ооци-тов 6-й стадии по своей ультраструктуре и организации хроматина оказались неоднородными. Хроматин, в котором идентифицируются одиночные рТЕ и розетки с пониженным числом петель, несомненно входит в состав ядрышек с хорошо выраженным включением 3Н-актиномицина-Д и обширными зонами ФЦ. Хроматин же, трансформированный в нуклеосом-ные нити, относится к сугубо фибриллярным ядрышкам со слабым или полным отсутствием включения 3Н-актиномицина-Д.

Рассматривая динамику организации ядрышкового хроматина 3,6-й стадий оогенеза травяной лягушки, можно заключить, что при инактивации розеточная структура активного нуклеолярного хроматина постепенно замещается нуклеосомной. При этом в полностью репрессированных ядрышках обнаруживаются только тяжи нуклеосомного хроматина. Последовательная смена структуры хроматина сопровождается отчетливым варьированием выраженности ФЦ. Отсутствие ФЦ в активных ядрышках ооцитов амфибий давно является интригующим моментом в анализе нуклеолярной организации (Miller,1981). В свете данных по розеточной организации активного хроматина можно думать, что обилие розеток, в которые собран практически весь хроматин, отражает такое же обилие мелких, не выявляемых ФЦ; обнаруживаются лишь собранные воедино ПФК, которые представлены в виде единого плотного фибриллярного агрегата, окруженного гранулярным кортексом. Начало инактивации рРНК генов, по-видимому, приводит к появлению ФЦ за счет увеличения доли неактивного хроматина и, как следствие, потере маскирующего эффекта прорибосомного материала и "обнажения" ФЦ, что наблюдается в ядрышках нуклеолярной капсулы кариосферы ооцитов 6-й стадии. Подобная схема Еполне укладывается в предлагаемые модели структурных переходов ФЦ при инактивации ядрышковых организа-г торов, описанных у млекопитающих (Zatsepina et al.,1988; Зацепина и др.,1988,1989). Вместе с тем, в рамках данной схемы остается трудно объяснимым факт появления немногочисленной генерации ядрышек капсулы кариосферы, которые имеют полностью репрессированный хроматин и в то же время на ультратонких срезах в них не выявляются ФЦ. Можно предположить, что в данном случае мы имеем дело с ядрышками, затронутыми глубокими процессами фрагментации с выходом в кариоплазму части их ДНК, лежащей в основе ФЦ. Выше было показано, что на препаратах, обработанных 3Н-актимицином-Д, наблюдаются с одной стороны, ядрышки со слабой меткой, либо с ее полным отсутствием, а с другой - ДНК-содержащие фрагменты ядрышек в окружающей кариоплазме . Возможность сегрегации и фрагментации ядрышек с потерей ДНК в ооцитах 6-й стадии зимующих лягушек была хорошо документирована (см. главу 1.2(.Потеря ядрышками того или иного количества ДНК приводит, вероятно, к значительной перестройке их внутренней организации. Это должно в первую очередь отразится на таких динамичных, ДНК-содержащих элементах ядрышка, как ФЦ, которые могут распадаться на все более многочисленные и мелкие образования, трудно выявляемые при электронном микроскопировании.

IV.3■Кариоскелет и его топология.

Исследования кариоскелета /ядерного матрикса/ были начаты работами Збарского и соавторов /Збарский, Дебов, 1948;1951; Збар-ский, Георгиев, 1959;1962; Георгиев,Ченцов, 1960;1963/, заложившими осноеу понимания кариоскелета как структурного образования, обеспечивающего пространственную организацию ядра. В настоящее время под кариоскелетом понимаются остаточные структуры ядра после экстракции выделенных ядер солями низкой и высокой концентраций, нуклеазами и неионными детергентами. Кариоскелету придается важное значение е поддержании трехмерной структуры ядра, локализации нуклеиновых кислот, регулировании репликации и транскрипции ДНК, налаживании транспортных процессов из ядра. Ему посвящено огромное, все нарастающее число работ, систематизированных в ряде обзоров /см.напр. Comings,1978; Berezney, 1979; Збарский, 1988; Verheijen et al., 1988; Збарский, Кузьмина, 1991/. Начиная с первых работ по ультраструктурной организации скелетных систем клеток /методом анализа экстрактов клеток целиком - Whole-mount microscopy/ ставится вопрос о наличии в кариоскелете филаментных элементов /Сарсо et al., 1982; Fey et al., 1984/. В настоящее время накапливаются данные, дающие основания полагать, что филаменты кариоскелета внутренних частей ядра могут относиться к разряду промежуточных /ПФ/, включая ламин-содержащие и актиновых филаментов. Часть эти данных будет рассмотрена в соответствующих разделах /см. ниже/.

IV.3.1. Ядерные актиновые филаменты.

Проблема ядерного актина уже затрагивалась в связи с выявлением актиновых филаментов в составе волокнистого компонента капсулы кариосферы ооцитов 6-й стадии оогенеза травяной лягушки /см. главу 1.6/. Здесь данную проблему следует рассмотреть несколько подробнее и в первую очередь в аспекте организации кариоскелета.

В серии прежних работ показано наличие актина в ядрах различных клеток /см. обзор, Le Stourgeon, 1978/. Внутриядерному актину придаются различные функции, включая участие в конденсации хромосом /Rounger et а1.,1979/, транскрипции и процессинге РНК /Egly et al.,1984; NaKayasu, Ueda,1985; Sahlas et al,1993/, ядерном транспорте /Reddy, Busch,1983; Ueyama et al.,1987/. Можно видеть, что к актину относятся практически все функции, причисляемые и к кариоскелету вообще. Между тем, окончательных данных, подтверждающих присутствие актина в кариоскелете пока не было. Больше того, не только наличие актина в кариоскелете, но сам ядерный актин и его функциональное значение, несмотря на обилие работ, до сих пор остаются предметами дискуссии /см.напр. Fukuda et al.,1987; Georgatos,1994/. Поскольку, в большей части работ по ядерному актину использовались выделенные биохимическими! методами ядра, основной пункт критики касается возможных цитоплазматических конта-минаций. Использование в качестве объекта ядра ооцитов лягушки со всеми его преимуществами, как модели для анализа состава внутриядерных белков /см. подробнее "Краткая характеристика объектов и методов исследования"/ если не исключают полностью такого рода ар-

тефактные воздействия, то, по крайней мере, сводят их практически до минимума. В такой же степени адекватным выглядит использование для иммуноэлектронного сравнительного анализа распределения внутриядерных актиновых филаментов на разных стадиях оогенеза не выделенных ядер, а ооцитов целиком.

Иммуноблот-анализ проводился на выделенных вручную ядрах из ооцитов 3-й и 6-й стадий оогенеза травяной лягушки. Выделение ядер проводилось под постоянным светомикроскопическим контролем, изолированные ядра тщательно отмывались от цитоплазматических остатков. Для полной гарантии удаления фрагментов цитоплазмы, неразличимых визуально, ЯО ооцитов 6-й стадии мануально удалялись, а содержимое ядер было накоплено для иммуноблоттинга. После переноса на нитроцеллюлозу и инкубации с моноклональными антиактиновыми антителами, окрашивалась единственная полоса, соответствующая белку с молекулярным весом около 4 2 кД. Таким образом, параллельный иммуноблот-анализ показывает, что актин действительно является компонентом ядра ооцитов 3,6-й стадий оогенеза травяной лягушки. Кроме того, его выявление в содержимом ядер ооцитов 6-й стадии после снятия ЯО, в условиях выходя из ядер до 90% растворимых белков /Benavente et al.,1984/ дает основание относить актин к интегральным компонентам внутриядерной структуры ооцитов травяной лягушки.

Иммуноэлектронная микроскопия. После инкубации серийных срезов ооцитов 3-ей стадии, экстрагированных по схеме N3, были получены следующие результаты. Преобладающая часть антиактиновой метки сосредоточена над длинными, извитыми тяжами кариоскелетного материала, протянувшимися из внутриядерных районов к ЯО. Внутри ядра актиновые тяжи ассоциируют с хромосомной зоной, а ближе к периферии - с ядрышками. Без полной реконструкции по серийным срезам, трудно определить, сколько таких тяжей приходится на 1 ядро, однако на одном срезе их удается обнаружить 3-4. Поскольку тяжи очень извиты, крайне трудно проследить на одном срезе один /единственный/ г я ж по всей его полной длине. Анализ серийных срезов показывает, что тяжи продолжаются вплоть до ЯО и никогда не ветвятся. Тяжи имеют диаметр около 0.1 мкм и достигают в длину до 30-4 0 мкм. При большем увеличении было установлено, что каждый тяж состоит из пучков актиновых филаментов. Пучки в разных зонах ядра связаны с фиброгранулярными электронноллотными комплексами, материал которых в большинстве случаев соответствует ядрышковому. Показать подробности контакта /если он существует/ кариоскелетных актиновых тяжей с элементами хромосом-ламповых щеток или ядрышками на ультратонких срезах трудно. Однако, на некоторых удачных срезах удалось наблюдать структуры, идентичные по организации с хромоме-рами ламповых щеток /Mott,Callan,1975; Pyne et al.,1989/, контактирующие в нескольких периферических точках с актиновыми пучками. В то же время, даже используя серийные срезы, прямой контакт с ядрышком обнаруживается редко. Скорее всего, это связано с тем, что в контакт с одним ядрышком приходит ограниченное число актиноЕых тяжей, причем осуществляется этот контакт в лимитированном количестве точек ядрышковой поверхности. На периферии ядра, в контакте с порами ЯО обильно представлены короткие отрезки актиновых тяжей в различной ориентации, что указывает на то, что в этой зоне тяжи принимают весьма извитую форму. На тангенциальных и поперечных срезах ЯО видна ассоциация антиактиновой метки с частью ядерных

пор. 3-я стадия оогенеза характеризуется активным экспортом РНП из ядра. Это подтверждается локализацией в районе ядерных пор больших количеств электронноплотного фиброгранулярного материала в виде сгустков или комплексов, соответствующих по организации гранулярному компоненту ядрышка. Причем на цитоплазматической стороне его скопления плотно прилегают к ЯО и подчас выглядят как своеобразные "друзы", Еыходяшие из ядерных пор.

На 6-й стадии картина мечения ядер экстрагированных /по схеме U3/ ооцитов резко отличается от таковой на 3-й стадии. Это относится в первую очередь к распределению актиновых тяжей, составленных из пучков филаментного материала. Анализ серийных срезов выявил их исключительную локализацию в центральной части ядра, в районе капсулы кариосферы. Периферия ядра полностью свободна от актиновых пучков. Пучки центральных районов ядра 6-й стадии не имеют связи с электронноплотным материалом, который так хорошо выражен на 3-ей стадии. На 6-й стадии актиновые пучки располагаются среди ядрышек нуклеолярной капсулы и прослеживаются довольно глубоко внутри капсулы. Их локализация соответствует расположению не-жнофиламентного актин-содержащего материала волокнистого компонента капсулы, выявляемого при непрямой иммунофлуоресценции с этими же антителами на замороженных срезах. Наблюдаются связи актиновых пучков с ядрышками и микроядрышками. Обнаруживается также и тесное взаимодействие с СВ("coiled bodies", спиралевидными телами, см.также главу 1.8). Причем актин-содержашие меченые филаменты в этом случае прослеживаются внутри эти структур; последние оказываются как бы нанизанными на актиновый тяж, на отдельных срезах наблюдаются по 2-3 тельца на одном протяженном участке тяжа. Характерно, что такие картины в ряде деталей соответствуют картинам взаимосвязи СВ с фибриллами волокнистого компонента капсулы, сохранившимися после экстракции ядер 2М NaCl /см.главу 1.3/.

Итак, проведенный анализ впервые дал прямые иммуноэлектронные доказательства наличия актиновых филаментов в составе кариоскеле-та. До наших исследований не было также данных по изменениям топологии внутриядерного актина в связи с изменениями функционального статуса ядра. Нам удалось продемонстрировать резкие изменения в распределении актиновых филаментов в активных ядрах /3-я стадия оогенеза/ в сравнении с инертными /6-я стадия/ (см.Рис.5). Функциональное значение протяженных от хромосом и ядрышек до пор ЯО актиновых тяжей активных ядер 3-ей стадии мы связываем с их участием в транспорте РНП. Эти тяжи могут обеспечивать своеобразную "колею", по которой осуществляется направленный транспорт в сторону цитоплазмы. Во введении к этому разделу уже указывалось на ряд прежних работ, где обсуждалась возможная роль актина в ядерном экспорте /см.выше/. Недавно заново обозначился интерес к этой проблеме в связи с работами, показавшими, что РНК и белки-челноки распределяются в ядре не диффузно, а вдоль вполне определенных путей /tracks//Iaurence et al. ,1989; Huang,Spector, 1991 ; Heier,Blobel,1992; Xing et al., 1993; Xing,Laurence, 1993/. Было предположено, что основу этих путей могут составлять актиновые филаменты /Meier,Blobel;1992/. Поскольку на 3-ей стадии оогенеза синтез ядрышковой РНК является доминирующим /Davidson et al.,1964; Van Gänsen et al,1976/, можно думать, что большая часть фиброгранулярного материала, обнаруженного в связи с актиновыми тяжами

А Б

Рис.Ь. Схема распределения актин-содержащих элементов кариоскелета на 3-ей (А) и 6-й (Б) стадиях оогенеза R. temporaria. Пучки актиновых филаментов отмечены пунктиром (иммуноэлектронные данные). А- актиновые филаменты; ЯД- ядрышки; ЛЩ- хромосомы ламповые щетки; РНП- комплексы РНП.

представляют собой нуклеолярные по происхождению РНП-комллексы на пути в цитоплазму.

В инертных ядрах 6-й стадии в связи с резким падением до минимума транскрипционных и транспортных процессов отпадает необходимость в протяженных до ЯО актиновых тяжей, обеспечивающих транспорт. На первый план в этот период выступает, вероятно, структурно-опорная функция актиновых пучков кариоскелета. Подтягиваясь в центральные районы ядра вслед за агрегированными здесь ядерными структурами, они стабилизируют положение комплекса кариосферы с капсулой в определенном месте зародышевого пузырька; входя в состав волокнистого компонента капсулы, скрепляют ее составляющие в единую, цельную структуру.

■ Таким образом, рассматривая вышеприведенные сведения вкупе с изложенными данными /см.1.6./ по актину в капсуле кариосферы, полученными другими методами, следует сделать существенный вывод о том, что актиновый компонент волокнистого материала капсулы является частью кариоскелета ооцита травяной лягушки.

IV.3.2. Промежуточные филаменты (ПФ) в ядрах ооцитов травяной лягушки.

Наряду с актином, есть основания полагать, что и белки, составляющие другую часть цитоскелета - ПФ - тоже участвуют в организации кариоскелета. На это указывает: 1 - наблюдающаяся связь между ПФ и периферическим кариоскелетом (Katsuma et al.,1987; Djabali et al.,1991), 2 - высокая степень гомологии по первичной и вторичной структуре между ПФ и ядерными ламинами (Aebi et al.,1986; Franke,1987; Doring,Stick,1990); 3 - выявление in situ в ядре и кариоскелете 10 нм филаментов морфологически (Jackson,Cook,1988; Olins,Olins,1990) и белков, соответствующих белкам ПФ по ряду характеристик (Osborn,Weber, 1987; Alique et al.,1990). Однако, прямые доказательства наличия ПФ в ядре in situ или в составе кариоскелета могли быть получены в иммуноэлектронных экспериментах с использованием антител к белкам цитоскелетных ПФ. На серийных срезах экстрагированных ооцитов 2,3-ей стадий оогенеза (экстракция N3) нами было продемонстрировано распределение в ядре

виментин-содержащих филаментов (см.Рис.6). После инкубации срезов с моноклональными антивиментиновыми антителами, метка наблюдалась в связи с 10 нм фибриллами кариоскелета на разном расстоянии от ЯО. Остаточные ядрышки оставались немечеными. Однако на их периферических участках, где наблюдается тесная связь с фибриллами кариоскелета, выявляется заметное мечение. Использованный метод экстракции целого ооцита, позволил наблюдать взаимоотношение меченных элементов кариоскелета и цитоскелета. Оказалось, что карио- и ци-тоскелетные филаменты контактируют с порами ЯО. С другой стороны, антивиментиновая метка отчетливо локализуется в составе ряда поро-вых комплексов. Такие наблюдения, вероятно, дают основания предполагать что: 1- интеграция карио- и цитоскелета действительно имеет место; 2- она может осуществляется на уровне поровых комплексов ЯО. Известно, что многообразие морфологических (см.напр.Lehto et al.,1978; Carmo-Fonseca et al.,1987) и биохимических (Georgatos,Blobel,1987; Djabali et al.,1991) данных, указывающих на тесное взаимодействие ПФ с материалом пор ЯО, привело к оживлению гипотезы о единой (от цитоплазматической мембраны до внутриядерных зон) сети ПФ, осуществляющей внутриклеточные коммуникации (Goldman et al.,1985). Наблюдения, выполненные на ооцитах 2,3-ей стадий оогенеза травяной лягушки, впервые предоставившие прямые данные об участии виментина или связанного с ним белка в построении кариоскелета животной клетки, поддерживают эту гипотезу.

На 6-й стадии оогенеза ситуация с виментин-содержащими фила-ментами резко меняется. При параллельной инкубации с теми же моноклональными антителами на срезах экстрагированных ооцитов б-й стадии, в отличии от 2-й и 3-ей, выявить в ядре антивиментиновую метку не удалось. При этом бьши просмотрены серийные срезы всех частей ядра от ЯО до центральных районов капсулы кариосферы. Особенно тщательному анализу подвергся район капсулы, поскольку именно здесь на 6-й стадии группируются практически все филаментные элементы кариоскелета. Такой же отрицательный результат дал и имму-ноблотинг с экстрактами целых ядер или их содержимым (ядра без ЯО) . Видимо, это означает, что на 6-й стадии оогенеза композиция кариоскелета меняется: он теряет виментин-содержащие филаменты. Причин этой потери на 6-й стадии оогенеза при наличии отчетливо выраженного компонента в ядрах 2,3-ей стадий еще предстоит объяснить . Вместе с тем, выяснение этого вопроса затрудняется крайне парадоксальным обстоятельством: несмотря на огромное число работ, функции ПФ, одного из существенных структурных компонентов клетки до сих пор остаются невыясненными (см.обзоры Skalli,Goldman,1991; Klundert et al.,1993). В то же время нельзя, вероятно, исключить наличия в составе кариоскелета ооцитов 6-й стадии, кроме Еименти-на, других белков ПФ. Не исключено, что они же могут проявлять активность при внутриядерном строительстве капсулы кариосферы. В этой связи кажутся обнадеживающими данные по обнаружению специфического белка капсулы кариосферы R.temporaria, полученные недавно в лаборатории Дж.Голла А.Г.Цветковым. Этот белок (около 72 кД) был обнаружен при скринировании овариальной кДНК библиотеки травяной лягушки антителами к суммарным белкам ядер ооцитов 6-й стадии. Он содержит сигнальную последовательность, ответственную за ядерную локализацию и a-спиральные участки, соответствующие по длине rod-

домену ПФ. Антитела к этому белку связывались с волокнистой капсулой кариосферы травяной лягушки (Tsvetkov,Gall, в печати).

Ниже будут приведены данные, указывающие на участие в построении волокнистого компонента капсулы кариосферы и другого белка ПФ - ламина.

IV.3.2.1.К вопросу о топологии ламина Ъ Ы1 в ядрах ооцитов 6-й стадии оогенеза.

Ламины, составляющие периферию кариоскелета, относятся к 5-му А , Б

гК/

Рис.6. Схема распределения промежуточных филаментов (ПФ) в ядрах ооцитов R.temporaria.

А - распределение виментин- содержащих ПФ в ядерно-цитоплазматической зоне ооцитов 2-ой стадии оогенеза. Пунктиром отмечены ПФ. В районе пор отмечена постулируемая связь ПФ ядра (Я) и цитоплазмы (Ц); В - виментин.

Б - распределение ламина Ьш в ядре ооцитов 6-ой стадии. Локализация показана точками. К - кариосфера; ЯД - ядрышки.

типу обширной системы белков ПФ (Skalli,Goldman, 1991) . Известно, что в диплотенных ооцитах амфибий наблюдается редкая для позвоночных ситуация - наличие в ядре единственного кариоскелетного белка, подстилающего ЯО - ламина Ьш (68 кД) (Krohne et al., 1984, 1986), который структурно отличен от ламин А, В субтипа соматических клеток (Stick,1988). У шпорцевой лягушки на 6-й стадии оогенеза L т неизменно занимает привычное для этого класса белков положение - под внутренней ядерной мембраной. Анализ же локализации 1Ш в ооцитах 6-й стадии травяной лягушки, предпринятый нами, дал неожиданные результаты, отличающиеся от данных на X.laevis.

В иммуноблот-экспериментах с моноклональными антителами к L ш использовались: содержимое ядер, оболочка которых удалялась вручную (ЯС) , ядерные оболочки, выделенные мануально (ЯО), а также остаточные после экстракции N2 (см.материалы и методы) ЯС и ЯО. Е параллельном анализе показано, что во всех случаях при окраске антителами к ламину Ьш, окрашивается единственная полоса, соответствующая молекулярному весу 68 кД.

Иммуноэлектронная микроскопия показала наличие Ьш антигена е контакте с внутренней ядерной мембраной. Анализ внутриядерной локализации Ьщантигена проводили последовательно вглубь ядра, по зонам от ЯО. Основной материал был получен на серийных срезах ооцитов после экстракции N3, которая, как указывалось, оставляет е ядре комбинацию взаимосвязанных кариоскелетных структур. Обширная зона кариоплазмы, прилегающая к ЯО, была свободна от метки. Анти-

Lui метка появляется только ближе к центральным районам ядра, в зонах, где обнаруживаются скопления фибриллярного материала в виде пучков различной протяженности, клубков или "сгустков" ( диаметр фибрилл - 7-12 нм) , а также фрагменты нуклеолярной капсулы карио-сферы. Здесь метка, как и в случае с актином (см.выше) располагается сугубо над фибриллярным материалом. Однако, если метятся протяженные пучки, то создается впечатление, что в отличие от антиак-тиновой метки, которая в некоторых случаях принимает сплошной вид, мечение антителами к 1Ш имеет менее упорядоченный, вдоль по длине пучка, характер. Нередки картины мечения начальных и конечных участков, либо нескольких вставочных фрагментов. Меченые антителами к Liu пучки^располагаются между ядрышками, достигая глубоких участков нуклеолярного слоя капсулы кариосферы. Удается наблюдать контакты меченых пучков с нуклеолярными фрагментами. Эти же пучки могут ассоциировать с телами, тождественными по организации с "coiled bodies" или их фрагментами, состоящими из спиралевидных тяжей. Таким образом, топология Ьщ-содержащих элементов, в общем, повторяет распределение в ядре ооцита 6-й стадии другого составляющего кари-оскелета - актиновых филаментов (см.1.6; IV.3.1;cm. также Рис.5,6).Структуры с Liu проникают в толщу нуклеолярного слоя, где их положение соответствует локализации волокнистого компонента капсулы. К сожалению, технические трудности не позволили проследить Lin элементы в местах, прилегающих непосредственно к хромосомной части. Можно видеть, что вышеприведенные сведения однозначно указывают на наличие в глубине ядра ооцита 6-й стадии оогенеза травяной лягушки ламина Ьщ. При этом, обнаруженный с помощью имму-ноблотинга примечательный факт сохранения Lm в содержимом ядра после тотального удаления ЯО и потери растворимых белков, уже сам по себе не оставляет сомнения в том, что внутриядерный ламин относится к структурированному компоненту ядра. Обнаружение же анти-Ьшметки в остаточных, после экстракции N3, фрагментов ядра показывает, что такими структурами являются элементы кариоскелета. Кроме того, в контексте специфических вопросов организации капсулы кариосферы лягушки следует подчеркнуть, что наличие метки над фибриллярным материалом в зоне волокнистого компонента с очевидностью доказывает, что, по крайней мере, часть его фибрилл несут Ьщ-анти-ген.

В настоящий момент было бы преждевременным делать окончательные выводы о возможной функции ламина внутри ядра ооцитов 6-й стадии оогенеза травяной лягушки. Также было бы натяжкой, очевидно, видеть основной функциональный смысл появления 1ш структур в центральных районах ядра, в зоне капсулы только в связи с построением ее волокнистого компонента. Хотя на некоторые факты в этой связи, очевидно, следует обратить внимание. Наличие в составе волокнистого компонента псевдомембран - структурного аналога комплекса периферии ядра - "поры-ламина" (Krohne,Benavente,1986), их динамичный характер, способность к новообразованию - могли бы, вероятно, поставить вопрос о возможном участии Ьш элементов в организации псевдомембран. В то же время, тесное взаимодействие фибрилл и псевдомембран волокнистого компонента капсулы с хроматином конденсированных хромосом кариосферы хорошо документировано на разных этапах генезиса капсулы (см. выше). Такое взаимодействие может обеспечивать связь хроматина с ламином, точнее восстановление этой

связи, потерянной гораздо раньше вместе с началом конденсации хромосом, дистанцированием их от ЯО и стягиванием в кариосферу в центральном районе ядра. Интересно, что анализ недавних работ, выполненных на соматическом материале, приводит к заключению о том, что внутриядерные ламины, видимо, связаны с хроматином на разных стадиях клеточного цикла, отдавая предпочтение его конденсированным фракциям. По крайней мере, эта связь наблюдается в интерфазе -внутри ядра клеток Gl-периода (Bridger et al.,1993) и S-фазы (Moir et al.,1994). Ламины тесно ассоциируют также и с митотическими хромосомами (Burke,1990; Glass,Gerace, 1990) . Кроме того, нужно, видимо, иметь в виду и такие весьма общие соображения: внутриядерная локализация 1Ш коррелирует с наличием сложноустроенного комплекса кариосферной капсулы (травяная лягушка) и не наблюдается в ооцитах, ядра которых не "отягощены" этими сложными формированиями (шпорцевая лягушка - Krohne,Benavente,1986). Что касается механизма "доставки" ламина вглубь ядра, в зону капсулы кариосферы, то здесь возможны, по крайней мере, два пути. Поскольку ламины прочно ассоциируют с липидами внутренней ядерной мембраны (Krohne et al.,1987; Nigg,1992) или интегральными мембранными белками ЯО (Meier, Georgatos,1994) в эти зоны ядра ламина может заносится вместе с дериватами ЯО, которые, как было показано (см.1.2) представлены в составе волокнистого компонента капсулы. С другой стороны, появление в таких зонах ламина может быть связано со своеобразной схемой последовательного накопления этого кариофильного белка в ядре: цитоплазматический ламин прежде всего быстро аккумулируется в глубине ядра и только затем, чрезвычайно медленно, через ряд морфологически идентифицируемых стадий транслоцируется в зону под ядерной оболочкой (Goldman et al.,1992). Данные по внутриядерному структурированному ламину ооцитов травяной лягушки в настоящее время получают подтверждение и на соматическом материале (Lutz et al.,1992; Goldman et al.,1992; Bridger et al.,1993; Moir et al.,1994). При этом отмечается, что в глубине ядра ламин формирует характерные скопления фибрилл.

основные вывода.

1. В ядрах ооцитов Rana temporaria и R.ridibunda кариосфера и ее капсула формируются на 5,6-й стадиях оогенеза (по: Dumont,1972)) в результате агрегации многочисленных экстрахромосомных ядрышек и концентрации конденсирующихся хромосом в центральных районах ядра. Детали строения кариосферы различаются у этих двух видов.

Начало образования кариосферы и ее капсулы у травяной лягушки коррелирует с резкой инактивацией хромосомно-ядрышкового аппарата. Дальнейшее поэтапное становление дефинитивной кариосферы происходит на фоне сезонных изменений уровня синтеза РНК в ядре: зимой этот уровень минимален, а весной он повышактся. Отмечено включение предшественника РНК в конденсированные хромосомы весенней кариосферы.

2. Капсула кариосферы, окружающая собранные в клубок хромосомы, в ооцитах травяной лягушки по светооптическим данным

представляет сеть волокон, в которой выявляются белки (в частности актин) и липиды и в которую включены многочисленные ядрышки.

По данным электронной микроскопии волокнистая капсула кариосферы имеет сложную структуру и состоит из псевдомембран (ряды автономных поровых комплексов), мембранных структур (пузырьки, трубчатые тела, дериваты ядерной оболочки в виде пористых пластинок) и фибрилл (6-10 нм толщиной).. Волокнистая капсула - образование, которое интегрирует всю организацию центральной части огромного зародышевого пузырька лягушек: с ней связаны разнообразные ядерные структуры, включая хромосомы и ядрышки. Ядрышки в составе капсулы - сугубо фибриллярные структуры. Они подвержены сегрегации с выходом материала фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента на периферию. Сегрегация сопровождается фрагментацией нуклеол с появлением в межядрышковой зоне их фрагментов и микроядрышек.

3. Накопление волокнистого материала капсулы кариосферы -гормонозависимый процесс; максимального развития капсула достигает весной, перед созреванием ооцитов. Естественный процесс преобразования ядерных структур и формирования кариосферы моделируются в сжатые (до 15 часов) сроки в условия гормонального стимулирования ооцитов.

4. Прочность взаимосвязи структурных элементов капсулы отчетливо проявляется в экспериментах in vitro, с выделением ее из ядра. При различных механических воздействиях данный комплекс ведет себя как прочное объединение ядерных структур, скрепленных в единое целое фибриллярным материалом капсулы. Опыты in vitro ярко свидетельствуют о действительном обособлении в ядре, с помощью волокнистой капсулы, компартмента, включающего клубок компактных хромосом и прилежащую кариоплазму. Фактическая инкапсуляция хромосом и компартментализация нуклеоплазмы сохраняются в жестких экспериментальных условиях диспергирования ядерных структур, что объясняется чрезвычайной прочностью фибриллярного материала капсулы.

5. Капсулу можно рассматривать как часть кариоскелета ооцитов 6-й стадии, поскольку, с одной стороны значительная часть ее фибриллярного материала сохраняется после экстракций в растворах для изоляции кариоскелета, а с другой - в ее составе обнаруживается ряд .компонентов, участвующих в организации кариоскелета клеток, а именно:

а)внутриядерные актиновые филаменты, которые образуют часть фибриллярного материала капсулы;

б)липиды (триглицериды, эфиры холестерина, лецитин), выявляемые в комплексе "кариосфера-ка'псула", где триглицериды входят в состав волокнистого материала капсулы;

в)ламин Liu, который обнаруживается в фибриллярном компоненте капсулы.

6. Среди структур, ассоциированных с фибриллами капсулы, идентифицированы спиралевидные тела - "coiled bodies" (СВ) . которые автономны или находятся в составе специфических многокомпонентных ядерных тел (MKT), несущих материал, имеющий сходство с основными частями типичного ядрышка - фибриллярным центром, плотным фибриллярным компонентом и фибриллярным компонентом. В MKT обнаружены нуклеолярные белки - фибрилларин и В23; автономные СВ содержат фибрилларин. На основании иммуноцитохимических и ультра-

структурных данных предложена схема ядрышкового происхождения СВ ооцитов 6-й стадии. СВ ооцитов травяной лягушки - элемент карио-скелета: их структура, входящие в их состав коилин, фибрилларин сохраняются после экстракций для выделения кариоскелета.

7. Сопоставление организации ядра 3-ей, - активной, и 6-й, -синтетически неактивной, стадий оогенеза показало, что инактивация хромосом и ядрышек вызывает проявление ими необычной функциональной активности - участие в морфогенетических процессах построения капсулы кариосферы, важного элемента компартментализации гетерогенной кариоплазмы и трехмерной архитектоники ядра половой клетки в один из самых ответственных периодов проэмбрионального развития. Проявление этих новых функций в конечном итоге, очевидно, обеспечивается динамичными преобразованиями основных ядерных структур (хромосом, ядрышек, кариоскелета) между 3-ей и 6-й стадиями, глубоко затрагивающими их субмикроскопическую организацию и топологию в ядре:

а) хромосомы ламповые щетки R.temporaria (3,4-я стадии) в период, предшествующий формированию дефинитивной капсулы, демонстрируют изменения своей субмикроскопической анатомии: резко падает количество РНП-комплексов на единицы транскрипции боковых петель, в их хроматине нарастают нуклеосомные фрагменты; в связи с петлями продуцируются многочисленные гранулы - спутники, участвующие в формировании материала волокнистой капсулы;

б) транскрипционно активный хроматин ядрышек ооцитов травяной лягушки (3-я стадия) организован по розеточному типу. Петли в розетках, а также участки, связывающие отдельные розетки, представлены единицами транскрипции рибосомных генов. При инактивации ядрышек и формировании нуклеолярной части капсулы хроматин в розетках приобретает нуклеосомную структуру (6-я стадия). Это сопровождается сегрегацией и фрагментацией нуклеолярного материала и увеличением фибриллярных центров в ядрышках;

в) актиновые филаменты обнаружены в составе кариоскелета ооцитов травяной лягушки. Их топология резко меняется в связи с изменением функционального статуса. На 3-ей активной стадии актиновые филаменты образуют протяженные пучки из центральных зон до пор ЯО. Пучки формируют своеобразную "колею", по которой может обеспечиваться направленный ядерный экспорт. На 6-й, транскрипционно неактивной стадии, актиновые пучки локализуются только в центральном районе ядра, входя в состав волокнистой капсулы, скрепляют ее составляющие в единую структуру. В этот период проявляется структурно-опорная функция актиновых пучков кариоскелета, которые стабилизируют положение комплекса кариосферы с капсулой в определенном месте огромного зародышевого пузырька;

г) промежуточные филаменты (ПФ) входят в состав кариоскелета ооцитов R.temporaria. На 2,3-ей стадиях виментин-содержащие ПФ кариоскелета, вероятно, имеют связь с цитоскелетными ПФ. Интеграция двух компонентов может осуществляться на уровне пор ЯО. На 6-й стадии виментин в составе кариоскелета не обнаружен. В то же время, другой белок ПФ - ламин (Ьш) наряду с периферией кариоскелета, выявлен в центральных зонах ядра, где он входит в состав фибриллярной капсулы.

8. У R.ridibunda кариосфера ооцитов 6-й стадии топологически относится к инвертированному типу. Она состоит из центрального те-

ла (ЦТ), на поверхности которого теломерными участками закрепляются хромосомы. Гомолог наружной волокнистой капсулы R.temporaria -ЦТ, состоит из автономных поровых комплексов. В формировании материала ЦТ весной принимают участие содержащие ДНК и белки кариоске-лета сферические (кольцевые на световом уровне) структуры нуклео-лярного происхождения. Их появление сопряжено с сегрегацией, фрагментацией ядрышек и элиминацией части рДНК. Процесс формирования материала ЦТ стимулируется прогестероном в зимних ооцитах, что указывает на возможность интенсивного новообразования внутриядерных гомологов поровых комплексов, составляющих ЦТ.

9. Комплекс кариосферы с капсулой R.ridibunda - единое устойчивое образование, сохраняющее свою топографическую организацию в условиях дестабилизирующего действия фолликулярной атрезии: деструкции, разрывов ЯО, гипертрофированной экспансии цитоплазматичес-ких белков, внедрения обильного мембранного компонента в состав ДТ.

10. Кариосфера в ооцитах из полостных фолликулов человека гакже принадлежит к инвертированному типу и формально сравнима с кариосферой R.ridibunda, однако роль ЦТ в ооцитах человека выполняет инактивированное ядрышко. Кариосфера у человека - комплекс гесно связанных инактивированных структур: ядрышка, хромосом и яд-эышкоподобных тел.

11. Преобразования ядерных структур в поздней диплотене и агрегация их в кариосферу с капсулой - процессы, развивающиеся <онвергентно в разных систематических группах и ведущие к сложной структурной и функциональной компартментализации ядра в ооците.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Парфенов В.Н. Хромосомно-ядрышковый аппарат в позднем оогенезе Rana ridibunda // Тез.докл.Всесоюзн.конф.мол.уч. "Проблемы Зиологии развития". Москва,1972. С.58.

2. Грузова М.Н.,Парфенов В.Н. Ядерные структуры в позднем оогенезе озерной лягушки // Цитология. 1973.Т.15, N11. С.1345-1351.

3. Gruzova M.N.,Parfenov V.N. The karyosphere in late oogenesis of frogs // Monitore zool.Ital. 1973. Vol.7. P.225-242.

4. Парфенов В.Н. Некоторые наблюдения над кариосферой в позд-1ем оогенезе травяной лягушки // Цитология. 1974. Т.16, N8.

1023-1026.

5. Парфенов В.Н. Особенности позднего оогенеза травяной лягушки // Тез. докл.V Всесоюзн. совещания эмбриологов. Москва, 1974 . :.139-140.

6. Парфенов В.Н. Ядерные структуры в позднем оогенезе лягу-¡ек. Автореферат канд.дисс. Л.,1975. 24 стр.

7. Грузова М.Н., Парфенов В.Н. Ультраструктура ядра в позднем югенезе лягушки // Тез.докл.V Всесоюзн.симп."Структура и функции щеточного ядра". Новосибирск,1975. С.169-170.

8. Парфенов В.Н., Грузова М.Н. Ядерные структуры в позднем югенезе травяной лягушки. I.Светомикроскопические данные // Цито-:огия. 1975. Т.17, N9. С.1018-1025.

9. Парфенов В.Н., Грузова М.Н. Ядерные структуры в позднем огенезе траЕяной лягушки. II .Авторадиографические данные // Цито-:огия. 1975. Т.17, N11. С.1263-1268.

Nucle(ol)ar Workshop (abstracts). Stevensbeek,Netherlands. 1987. P. 120.

28. Почукалина Г.Н., Парфенов B.H. Электронноавторадиографи-ческое изучение синтеза РНК ядрами клеток яйценосного бугорка в фолликулах человека // Тез.докл.IX Всесоюзн.симп. "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка. 1987. С.247.

29. Parfenov V.N., Pochukalina G.N., Dudina L.M., Kostuchek D.F., Gruzova M.N. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (Electron microscopic and autoradiographic data) // Gamete Res. 1989. Vol.22. P.219-231.

30. Tzvetkov A., Parfenov V. Transcriptionally active amphibian oocyte nucleolar chromatin is organized in higher order structures // Proc. 11th Nuclear Workshop. Suzdal,USSR. 1989. P.183.

31. Бугаева E.A., Парфенов B.H. Выявление ламина L III внутри ядра диллотенных ооцитов Rana temporaria // Тез.докл.X Всесоюзн . симп . "Структура и функции клеточного ядра". Гродно. 1990. С.167

32. Бугаева Е.А., Подгорная О.И., Парфенов В.Н. Теломер-спе-дафический белок присутствует в оболочке ядра ооцита лягушки // Ibid. Р.158.

33. Parfenov V.N., Pochucalina G.N. Transcripthional activity of oocyte nuclei and follicular cells in mammalian antral follicles (fine structure autoradiography) // Proc. 4th Franco-czechoslovak meeting "Through the oocyte to the embryo". Prague,Czechoslovakia. 1990. P.13.

34. Tsvetkov A.G., Parfenov V.N. Transcriptionally active amphibian oocyte nucleolar chromatin is organized in higher order structure // In: "Nuclear structure and function" Eds.I.R.Harris and I.B.Zbarsky, Plenum Press, N.Y. 1990. P.203-208.

35. Бугаева E.A., Парфенов B.H., Подгорная О.И. Ядерная обо-ючка дипло.тенных ооцитов лягушки обладает теломер-связывающей активностью // Молек.биол. 1992. Т.26,вып.5. С.983-992.

36. Парфенов В.Н., Девис Д.С., Почукалина Г.Н., Мурти К.Г. 1ммуноморфологическое выявление виментина в кариоскелете ооцитов [■равяной лягушки // Цитология. 1993. Т.35, N10. С.88.

37. Gruzova M.N., Parfenov V.N. Karyosphere in oogenesis and .ntranuclear morphogenesis // Intern.Rev. of Cytology. 1993. Г. 144. P.1-52.

38. Цветков А.Г., Парфенов B.H. Сезонные преобразования хро-docoM ламповых щеток и морфогенез капсулы кариосферы в ооцитах 'равяной лягушки, выявляемые при анализе выделенных структур / / фитология. 1994. Т.36, N1. С.64-71.

39. Почукалина Г.Н., Парфенов В.Н. Организация кариосферы с :апсулой перед созреванием ооцитов травяной лягушки // Цитология. .994. Т.36, N11, С.1027-1034.

40. Грузова М.Н., Цветков А.Г., Почукалина Г.Н., Парфенов 1.Н. Формирование кариосферы в оогенезе некоторых насекомых и ам-¡ибий // Цитология. 1995. Т.37, N8. С.744-768.

41. Parfenov V.N., Davis D.S., Pochukalina G.N., Sample C.E., ■ugaeva E.A., Murty K.G. Nuclear actin filaments and their cpclogical changes in frog oocytes // Exper.Cell Res. 1995. .217. P.385-394.

42. Цветков А.Г., Парфенов В.Н. Организация диспергированного нуклеолярного хроматина и ультраструктура ядрышек в оогенезе травяной лягушки // Цитология. 1995. Т.37, N7, С.567-573.

Подписано к печати 25.10.95 Заказ 387 Тираж 100 Объем 3 п.л. ЦОП СПГУ

19Р034, Санкт-Петербург, наб. Макарова,6.

Информация о работе

Парфенов, Владимир Николаевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1995
ВАК 03.00.11

Автореферат

Похожие работы