Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хромосомный анализ: история, современное состояние. Методы, развитие и периодизация
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Хромосомный анализ: история, современное состояние. Методы, развитие и периодизация"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА
На правах рукописи
Зощук Наталья Викторовна
ХРОМОСОМНЫЙ АНАЛИЗ: ИСТОРИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ. МЕТОДЫ, РАЗВИТИЕ И ПЕРИОДИЗАЦИЯ
03.00.03 - Молекулярная биология 07.00.10 - История науки и техники
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2004
Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской академии наук. Научные руководители:
Доктор биологических наук, профессор А.В. Зеленин. Доктор биологических наук Е.Д. Бадаева. Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Е.А. Ляпунова Доктор биологических наук В.И. Попенко Ведущая организация:
Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова
диссертационного совета 002.235.01 в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Защита диссертации
2004 г. в
ча<
на заседании
2004г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат химических наук
1ИЦЫ11
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Хромосомный анализ - мощный инструмент молекулярной биологии и генетики, направленный на изучение генома. Его история насчитывает свыше ста лет - с тех пор, как В. Флемминг в 1879 году впервые наблюдал продольное растепление хромосом при делении клетки аксолотля. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества самых разнообразных объектов как животного, так и растительного происхождения. Достигнутые успехи определялись в первую очередь совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Первостепенное значение имело развитие техники микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Естественно, что в течение всего этого времени неоднократно предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа и определения его места в биологии и медицине (С.Г.Навашин, 1916. 1921; Левицкий, 1931; White, 1978; Дарлингтон, Л а Кур, 1980; Восток. Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). В то же время, последнее десятилетие ознаменовалось стремительным прорывом в развитии науки, связанным с расшифровкой генома человека и ряда других видов животных, растений и микроорганизмов. Таким образом, созданные ранее классификации хромосомного анализа по ряду объективных причин не могли охватить достижений молекулярной биологии последних лет. С другой стороны, прогресс в определении первичной структуры генома лег в основу создания принципиально новых методов и подходов к изучению хромосом. В связи с перечисленными фактами, назрела насущная необходимость пересмотра истории хромосомного анализа в свете современных представлений и определения его места в биологической науке сегодняшнего дня. Это и послужило целью диссертационной работы.
Цель работы.
Цель работы состояла в рассмотрении истории хромосомного анализа с учетом достигнутого прогресса в исследованиях геномов, выделении отдельных периодов его развития и определении наиболее перспективных направлений. Для этого были решены следующие задачи:
описаны ключевые этапы развития хромосомного анализа за весь период его существования;
- рассмотрены основные методы исследования хромосом, охарактеризованы наиболее широко используемые их модификации, описаны история создания и области применения;
определено место и роль хромосомного анализа в геномную эру; выделены основные этапы развития хромосомного анализа.
Научная новизна и практическая значимость.
В работе сформулировано положение о современном хромосомном анализе, его месте в геномных исследованиях ближайшего будущего и влиянии на его техническое обеспечение современныхгеномныхисследований и новыхтехнологий
| ^«хшгональмат!
1 I I
Рассмотрены ключевые события в истории хромосомного анатиза. Обоснована невозможность выделения четких временных границ в его развитии, поскольку появление новых и усовершенствование существовавших технологий зачастую идет одновременно. Показано, что его успехи в последние годы определялись преимущественно достижениями молекулярной биологии и генетики.
Показано, что успех хромосомного анализа в первую очередь определяется выбором методов и объектов, наиболее соответствующих поставленным целям. В связи с этим, проведена систематизация современных методов хромосомного анализа и составлен справочный материал, облегчающий выбор адекватных подходов для решения конкретных задач.
Развитие и современное состояние хромосомного анализа подробно рассмотрены на примере исследований, проводимых в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Материалы диссертации могут быть использованы при подготовке лекционного материала и практических занятий на кафедрах генетики и молекулярной биологии различных учебных заведений. Они представляют интерес также для экспериментальных лабораторий, поскольку знание истории хромосомного анализа позволит более осмысленно подойти к выбору наиболее адекватных подходов для решения конкретных задач.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены на IV Совещании по кариологии и кариосистематике растений, С-Петербург, Россия (1999) и на Всероссийской конференции «От двойной спирали до генома человека». Москва. Россия (2004).
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, общего очерка истории хромосомного анализа, заключения, выводов и списка литературы. В обзорной части перечислены ключевые события в развитии хромосомного анализа дана сравнительная оценка методов дифференциального окрашивания хромосом, включая обсуждение его молекулярных механизмов. Далее охарактеризованы другие методы исследования хромосом, включая гибридизацию in situ и микродиссекцию. В отдельной главе рассмотрены особенности хромосомного анализа растений на примере работ, проводимых в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и
иллюстрирована рисунками и таблицами. Библиография включает цитированных работ, из них зарубежных источников. По теме диссертации опубликовано 6 статей в отечественных научных журналах.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации.
История хромосомного анализа насчитывается свыше 120 лет. Первым исследованием в этой области явилась работа В. Флемминга (1879). который впервые наблюдал продольное
расщепление хромосом при делении ооцитов аксолотля Двумя годами позже он предложил термин «митоз» для обозначения процесса деления клетки С конца 70-х гг. XIX века поведение хромосом изучалось многими исследователями, но наиболее значимый вклад в эт\ область внесли Э Страсбургер и В Флемминг Первый период развития хромосомного анализа в целом ознаменовался установлением самого факта существования хромосом и их описанием
Новый этап начался в 1903 - 1904 гг, когда В Сзттон и Т Бовери показали, что именно хромосомы могут являться материальными носителями менделевских факторов наследственности В 20-30-е гг XX в прогресс хромосомного анализа определялся в основном изучением растительных объектов сравнительная кариология растений резко опережала сравнительную кариопогию животных Этим она обязана трудам С Г Навашина, Т Сакамуры и ГА Левицкого Именно С Г Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строения Боаьшое значение в кариосистематике растений сыграли также труды ГА Левицкого В 1931 году вышла в свет его работа «Морфология хромосом», в которой он предложил новую методику фиксации и окраски для изучения хромосом культурных (ржи, ячменя, гороха, пшеницы, сахарной свеклы) и некоторых классических в цитологическом отношении растений (Nqjаs, Мыяеап) В круг интересов ученого входили вопросы систематики и эволюции ГА Левицкий - один из основателей радиационной генетики растений Он ввел термин и развил учение о кариотипе
Отдельное место в этот период занимало изучение нетипичных хромосом В 1881 году Бальбиани описал гигантские политенные хромосомы слюнных желез личинок двукрылых (СШгопотш), а Флемминг, исследуя ооциты аксолотля обнаружил хромосомы типа ламповых щеток На протяжении последующих лет в основном совершенствовались лишь методики выделения таких хромосом из ядер
Успехи хромосомного анализа конца XIX - начала XX века определялись в первую очередь совершенствованием оборудования Именно к этому моменту был создан микроскоп позволяющий ДОСТИГНУТЬ разрешения порядка 0 2 мкм Последующие сто лет стали веком его дальнейшего усовершенствования, а также разработки и внедрения новых вариантов микроскопической техники Параллельно этому совершенствовались методики приготовления препаратов В 60 - 80-е гг XIX в были подобраны и внедрены в практику консервирующие жидкости (фиксаторы) и клеточные красители создание которых продолжается до сих пор
Следует отметить, что именно разработка новых способов приготовления препаратов имела ключевое значение для развития хромосомного анализа Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали на тканевых срезах Такие препараты содержали в основном разрушенные митозы хромосомы накладывались одна на другую образуя клубки, плохо поддающиеся анализу Технологии, основанные на использовании суспензий клеток (человек и животные) или приготовлении давленых препаратов (растения) позволили преодолеть эти трудности
В 30-40-х гг. XX века появились первые сведения о возможности идентификации хромосом, основанной на неоднородности их окрашивания, хотя тогда эти методы не нашли практического применения в цитогенетике. В это время был впервые описан так называемый холодовой гетерохроматин (Н-сегменты). под которым подразумевали участки метафазных хромосом в соматических клетках некоторых видов растений и амфибий, которые слабо прокрашиваются основными красителями после охлаждения клеток до температуры 0—3°С в течение 3-5 суток (Darlington, La Cour, 1940; Callan, 1942). Несколько позже было показано, что рентгеновское облучение в комбинации с холодовой обработкой приводит к необычной степени дифференциации - гетерохроматических участков хромосом Trillium. Tradescantia, Vicia, особенно вблизи центромеры (Darlington, La Cour, 1945; Kurabayashi, 1953). Неоднородное окрашивание хромосом растений получали и при обработке корешков солями тяжелых металлов (Элленгорн. 1940).
С конца 50-х - начала 60-х годов XX века фронт исследования хромосом и соответственно развитие хромосомного анализа переместились от растений к человеку и животным. Пора бурного развития цитогенетики человека, а затем и других млекопитающих приходится на 60-е годы. Благодаря ряду усовершенствований методик (использование в качестве материала культуры клеток, применению гипотонического раствора и колхицина [Hsu, 1952], фитагемагглютинина [Moorhead et. al., 1960], приготовление тотальных препаратов, высушенных на воздухе - [Rothfels, Siminovich, 1958]) были выявлены структурные особенности аутосом и половых хромосом человека, определяемые их размерами, положением центромеры, наличием вторичных перетяжек и спутников. Как следствие, в 1956 году появилась работа Дж. Тио и А. Левана. в которой в культуре фибробластов легкого было впервые правильно определено число хромосом (46) человека. С этого момента изучением хромосом человека занимались многочисленные исследовательские группы в разных странах мира Полученные данные были обобщены на конференции по стандартизации хромосом человека, состоявшейся в Дэнвере (США) в 1960 г. В соответствие с рекомендациями этой конференции все хромосомы человека были разделены на 7 групп и обозначены буквами: А(1-3), В(4-5), С(6-12) + X, D(I3-15), E(16-18), F(19-20) и G(21-22) +Y. Номенклатура оказалась почти универсальной и не изменялась (не считая минимальных модификаций) в течение 10 лет.
Новый этап развития хромосомного анализа начался в 1968 году с появлением методов дифференциального окрашивания хромосом. По времени это совпало с другим важным методическим открытием - получением гибридов соматических клеток человека и грызуна, в которых избирательно элиминируются хромосомы человека. Возможность простой и надежной идентификации хромосом позволила использовать такие гибриды для локализации на хромосомах человека различных биохимических маркеров и соответственно кодирующих эти белки генов. Работы по картированию хромосом человека получили стремительное развитие. Уже к 1975 году на индивидуальных хромосомах человека было локализовано более 70 генов. Полученные с помощью этого подхода монохромосомные и радиационные гибриды широко используются для генетического и физического картирования геномов
человека и других организмов. К настоящему моменту на хромосомах человека локализовано около 10 тыс. генов.
Дифференциальное окрашивание хромосом.
1. Q-дифференциальное окрашивание (Q-бэнлинг).
Решающий вклад в развитие этой области науки внесли работы, выполненные в конце шестидесятых годов прошедшего столетия профессором Торбьйрном Касперсоном и его сотрудниками в Нобелевском институте медицинских исследований и генетики (The Nobel Institute for Medical Cell Research and Genetics), входившем в состав знаменитого Каролинского медицинского университета Стокгольма (Karolinska Institutet). В начале 1968г. в журнале «Experimental Cell Research» появилась их статья "Химическая дифференциация по длине метафазных хромосом (Chemical differentiation along metaphase chromosomes)". По праву ее можно считать основополагающей, поскольку она стала мощным стимулом для развития хромосомных исследований и технологий.
Очень скоро оказалось, что Q - метод (от англ. "quinacrine", в русском переводе акрихин), позволивший проводить полную идентификацию хромосом человека, значительно расширил возможности хромосомного анализа, в частности для диагностики некоторых наследственных заболеваний. Он мог быть использован для локализации хромосомных разрывов и границ обменов при аберрациях. Рисунок флуоресценции хромосом был видоспецифичен. воспроизводим, а в дальнейшем выяснилось, что и идентичен в разных тканях организма. Заключением этой блистательной серии исследований стала итоговая статья о полной идентификации всех 24 хромосом человека (Caspersson et al.. 1970). Очень скоро метод Q -бэндинга нашел широкое применение в цитодиагностике генетических заболеваний человека.
Работы Касперсона и его группы легли в основу новой номенклатуры хромосом человека, принятой на знаменитой Парижской конференции в 1971 г.. которой с тех пор руководствуются генетики и цитогенетики всего мира. На ее основании были выбраны и наши "российские хромосомы" в период организации отечественной программы "Геном человека". Позже разработка и внедрение технологий высокоразрешающего бэндинга повлекли за собой необходимость уточнения номенклатуры, что и было отражено в ISCN -International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 1995. В настоящее время флуоресцентный бэндинг превратился в рутинную технику идентификации хромосом человека, животных и растений.
2. С-лифференциальное окрашивание (С-бэндинг).
Разработка и внедрение Q - бэндинга стали мощным стимулом к поиску, созданию и использованию новых методов дифференциальной окраски хромосом. Неоднородность окрашивания хромосом по длине наблюдали и ранее, однако после публикации статей по Q-бэндингу на него стали обращать более пристальное внимание. Так 1970 году при проведении экспериментов по гибридизации in situ меченной тритием сателлитной ДНК на хромосомах мыши был случайно открыт новый метод дифференциальной окраски (Pardue,
Gall, 1970). Авторы заметили, что после денатурации и последующей ренатурации хромосомных препаратов центромерные (гетерохроматические) участки хромосом окрашивались красителем Гимза более интенсивно, чем другие. Позже процедура обработки была модифицирована (Arrighi, Hsu, 1971; 1974) и получила название С- окраски (С- от «centromeric heterochromatin», позже это стали трактовать как "constitutive" heterochromatin).
Метод С - бэндинга быстро стал ценным инструментом в руках цитогенетиков для исследования хромосом животных и человека. Работы по хромосомам растений в то время были единичными, поэтому дальнейшие усилия ученых сконцентрировались на усовершенствовании процедуры С -окрашивания для анализа этих объектов. На середину 70-х - конец 80-х гг. приходится основная масса работ в этом направлении. В этот период были отработаны основные модификации метода, которые применяются до настоящего времени практически без изменений, и детально исследованы несколько объектов, в основном злаки и лилейные. Эти работы доказали видоспецифичность рисунков дифференциального окрашивания и постоянство расположения бэндов на хромосомах. В то же время, общее число изученных видов было ограниченным.
3. С-дифферснииальное окрашивание хромосом (G-бэндинг).
Параллельно с С-дифференциальной окраской появился еще один метод, также основанный на использовании красителя Гимза и названный G-бэндингом (G - от красителя "Giemsa"). В 1971 году Э. Самнер и его коллеги с помощью предобработки препаратов в щелочах, и горячих солевых растворах получили картину чередующихся темно- и светлоокрашенных сегментов на хромосомах человека (Sumner et al., 1971). Было показано, что за исключением Y-хромосомы, G - положительные бэнды совпадают с ярко флуоресцирующими Q - бэндами. Авторы показали, что новый метод способен заменить Q-окрашивание при идентификации индивидуальных хромосом. Помимо этого. G-бэндинг обладал рядом несомненных преимуществ:
- для анализа не нужна флуоресцентная микроскопическая установка: препараты не выцветают, т.е. их можно неограниченно долго хранить:
- бэнды получаются более четкими и детальными.
Практически одновременно был предложен другой вариант метода G-бэндинга. основанный на обработке препаратов хромосом человека трипсином (Seabright, 1971). Рисунки дифференциального окрашивания, полученные с использованием этих двух модификаций, оказались практически идентичными. Вплоть до настоящего времени оба варианта G-бэндинга используются без существенных изменений.
Очень быстро G-бэндинг стал основным методом изучения хромосом человека и животных. Исследование различных видов млекопитающих, в том числе и человека, выявило видоспецифичность. воспроизводимость и индивидуальность рисунков G-окрашивания каждой хромосомы. В то же время возможность получения G - бэндов на хромосомах растений долгое время служила предметом дискуссий. Начиная с 80-х гг. появляется все больше сообщений по G- или по крайней мере G-подобной окраске хромосом растений.
причем наиболее четкие результаты были получены с помощью красителя ацетоорсеина (OR-бэндинг).
Период с конца 60-х гг. до середины 80-х характеризовался появлением новых методов дифференциального окрашивания и совершенствованием существующих. Например, возможности Q-бэндинга значительно расширились с внедрением флуорохромов, специфичных для AT (DAPI, дистамицин A, Hoechst 33258) или ГЦ пар оснований (хромомицин Аз. актиномицин D). Для выявления кинетохоров на митотических хромосомах был разработан метод, получивший название Cd-окрашивания. Среди созданных в это время методов можно перечислить и так называемую «арлекинную окраску», позволяющую выявлять сестринские хроматидные обмены; избирательную окраску азотнокислым серебром ядрышкообразующих районов (Ag - окраска), репликативный бэндинг и ряд других. Все они нашли широкое применение в различных областях знаний, в том числе в пренатальной диагностике, судебной и спортивной медицине, мониторинге окружающей среды.
Другие методы исследования хромосом.
Наряду с дифференциальной окраской, развивались и другие способы исследования хромосом - гибридизация in situ, микродиссекция, причем при изучении хромосом человека и животных они успешно объединились в одну процедуру.
Гибридизация in situ в настоящее время является наиболее распространенным методом хромосомного анализа - за последние 10 лет с его помощью выполнено свыше половины всех работ в области молекулярной цитогенетики. Его используют для решения разнообразных задач: от прямого физического картирования последовательностей ДНК на хромосомах, идентификации хромосом и хромосомных аномалий, до анализа геномного родства и изучения процессов макроэволюции хромосом. Для анализа мелких объектов, а также исследования тонкой структуры хромосом с помощью гибридизации in situ используют не оптический, а электронный микроскоп (в качестве метки берут комплексы коллоидного золота с макромолекулами, специфически связывающимися с репортерными группами в ДНК-зонде).
Первой была разработана радиоактивная гибридизация in situ (1969-1970 гг.). В 1982 г. был предложен новый вариант гибридизации, основанный на мечении проб биотином и выявлении сигналов с помощью ферментативных систем (пероксидазы хрена или щелочной фосфотазы). Несколько позже (в 1985 г.) он был адаптирован для исследования хромосом растений. В то же время, возможности гибридизации in situ значительно расширились с появлением ее флуоресцентного варианта - FISH - благодаря высокому разрешению, безопасности и возможности локализации нескольких проб в одном эксперименте. Созданный изначально для картирования хромосом человека, метод флуоресцентной гибридизации in situ быстро нашел широкое применение в цитогенетике растений и животных.
Появление новых флуорохромов повлекло за собой необходимость совершенствования как самой микроскопической техники, так и разработки программного обеспечения для анализа таких препаратов. С другой стороны, это позволило значительно увеличить число
проб в эксперименте. Одним из наиболее ярких примеров достижений в этой области стал метод хромосомного пэйтинга. Он основан на мечении всех индивидуальных хромосом различными флуорохромами (или их сочетаниями). Картину флуоресценции регистрируют с помощью системы анализа изображения с использованием комбинации соответствующих фильтров. Компьютер считывает спектр и интенсивность флуоресценции каждой хромосомы, и в соответствие с полученными данными, присваивает ей определенный псевдоцвет.
Для проведения FISH на хромосомах необходимы зонды, специфичные для конкретных хромосом или их участков. Основным методом их получения стала микродиссекция. Сочетание технологий микродиссекции и FISH использовались при изучении политенных хромосом двукрылых и хромосом типа «ламповых теток» амфибий, митотических и мейотических хромосом млекопитающих и растений. Микродиссекция внесла существенный вклад в расшифровку генома человека, в частности позволила провести тонкое картирование отдельных хромосомных локусов. Важные место она занимала в осуществлении программы «геном риса» - хромосомно-специфичные библиотеки, которые использовались при секвенировании его генома, были получены с помощью лазерной микродиссекции. Этот метод используется при анализе геномов ячменя, ржи, сахарной свеклы, сои. сосны, табака и других видов растений.
К числу современных подходов хромосомного анализа относится проточная цитометрия -сортировка в потоке, которая позволяет с высокой частотой (до 98-99%) получать фракции индивидуальных хромосом человека и животных. С его помощью были получены многие геномные библиотеки, специфичные для индивидуальных хромосом, ставшие основным источником материала для секвенирования генома человека.
Метод пульс-электрофореза применяют в основном для анализа мелких хромосом, чьи линейные размеры лежат на грани разрешения светового микроскопа (0.1-0.18 мкм). например дрожжей. С. elegans и других. С его помощью были определены размеры наименьшей хромосомы кариотипа домашней курицы Callusgallus domesticus (-3.4 млн.пн.).
Основные методы хромосомного анализа, наиболее широко использующиеся в современной практике, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Основные методы исследования хромосом.
Методы анализа Области применения Недостатки метода
Монохромное окрашивание (конец 19В.-Н.В.) Быстрый, дешевый и эффективный способ для подсчета числа и определения морфологии хромосом. Не все хромосомы можно идентифицировать; субъективная интерпретация, основанная на точности глазомера
Дифференциальное окрашивание хромосом
Q-бэндинг [Caspersson et al, 1968г.,.] Идентификация хромосом человека, животных и некоторых видов растений. Выявление хромосомных Необходима специальная аппаратура, препараты долго не хранятся, применим для ограниченного числа объектов
перестроек. Хорошо совместим с технологией гибридизации in situ.
С-бэндинг [Arrighi, Hsu, 1971] Выявление полиморфизма хромосом человека и животных. Основной метод при исследованиях хромосом растений. Можно использовать не для всех видов животных и растений. Плохо совместим с технологией гибридизации in situ.
G-бэндинг [Sumner etal., 1971] [Seabright, 1971] Простой, эффективный и доступный метод изучения и идентификации хромосом и выявления хромосомных перестроек у человека и животных. Плохо воспроизводим и мало используется для изучения хромосом растений. Ограниченно пригоден для анализа сложных хромосомных перестроек.
N- бэндинг [Matsui, Sasaki, 1973] Окрашивание участков ЯОР и некоторых типов гетерохроматина у растений Непригоден для изучения некоторых видов растений, т.к. выявляет не все типы гетерохроматина.
Гибридизация in situ
Радиоактивная [Gall, Pardue, 1969; John etal., 1969] Прямая локализация на хромосомах последовательностей ДНК Необходимость подсчета зерен серебра в большом числе метафазных пластинок для статистической достоверности результатов, время проявления автографов варьирует от нескольких недель до месяцев, опасность для здоровья и окружающей среды, проблемы хранения и утилизации отходов.
Ферментативная [Langer-Safer et al., 19821 Простой и быстрый способ выявления гибридизациониых сигналов. Работа с высокотоксичными реактивами. Нельзя выявлять одновременно более 2-х зондов.
Флуоресцентная FISH [Pinkel, Straume, Gray, 1986] Возможность локализации на хромосомах нескольких проб, высокое разрешение. Возможность усиления сигнала с помощью амплификации Необходима соответствующая микроскопическая техника (флуоресцентный микроскоп), препараты быстро выцветают
Геномная GISH fLe et al, 1989; Эффективный метод для изучения происхождения и Невозможно различать очень близкие или слишком отдаленные
Anamthawat-Jonsson etal., 1990] эволюции аллополиплоидных видов растений. Используется для локализации точек разрывов при межгеномных транслокациях. геномы.
Спектральное кариотипирование (SKY) [Schröck et al., 1996] Исследования макроэволюционных преобразований хромосом млекопитающих. Идентификация и анализ хромосомных перестроек разной степени сложности. Очень дорогостоящий метод, требующий специального оборудования и программного обеспечения. Не применим для исследования растений.
Микродиссекция [Scalenghe et al., 1981] Получение зондов, специфичных для отдельных хромосом, хромосомных плеч или их участков. Необходимы четкие маркеры для идентификации хромосом.
Система компьютерного. анализа изображения Применим ко всем типам хромосом. Повышает надежность и объективность данных. Нет необходимости работы с фотографией. Высокая стоимость программного обеспечения и оборудования.
Молекулярные механизмы дифференциального окрашивания.
Специального рассмотрения заслуживает обсуждение молекулярной природы различных видов дифференциального окрашивания. Создатели Q - бэндинга ошибочно предположили, что ярко флуоресцирующие полосы, появляющиеся при обработке препаратов акрихин-ипритом, представляют собой участки ДНК. обогащенные ГЦ последовательностями. Несколькими годами позже было показано, что яркая флуоресценция Q - бэндов связала с наличием в этих участках хромосом последовательностей, обогащенных AT - повторами, причем кластерно в виде 3-4 и более АТ-пар подряд (Weisblum, De Haseth, 1972; Comings, 1978). Этот вывод был подтвержден в дальнейших исследованиях с использованием AT- и ГЦ- специфических красителей. Оказалось, что АТ-специфические флуорохромы (Hoechst 33258 и DAP1) дают картину, идентичную той, которая возникает при окраске хромосом акрихином. В то же время флуорохромы, специфичные для ГЦ- богатых районов, дают противоположную картину. Сказанное демонстрирует прямую зависимость Q-бэндинга от нуклеотидного состава ДНК.
Намного сложнее обстоит дело с установлением природы G-бэндинга и близких к нему методов дифференциального окрашивания. Появление G-бэндов в результате обработки препаратов трипсином дает основание предполагать, что в основе дифференцировки хромосом на участки лежат различия в их белковом составе или конфигурации белков. С
другой стороны, совпадение Q-и G-бэндов. возможно, указывает, что эти особенности белков каким-то образом связаны с нуклеотидным составом участков хромосом, в которых они располагаются. Существует точка зрения, что в основе G-бэндинга лежат различия в уровне компактизации отдельных участков хромосом, связанные с их генной активностью.
Периодизация хромосомного анализа.
Ранее упоминалось, что попытки рассмотрения истории хромосомного анализа предпринимались неоднократно. Наиболее интересной нам представляется классификация, предложенная в 1978 г. известным австралийским эволюционистом и цитогенетиком М. Дж. Уайтом (White, 1978). Он выделил шесть этапов развития кариологии:
• альфа-кариология - определение числа и размеров хромосом;
• бэта-кариология - детализация признаков кариотипа: определение относительной длины плеч хромосом, положения центромеры, выявление половых хромосом и пр.;
• гамма-кариология - идентификация специфических районов хромосом с использованием методов дифференциальной окраски;
• дельта-кариология - определение локализации сателлитной ДНК, ядрышкообразующих районов (рДНК). локусов, содержащих гены 55-рибосомной РНК;
• эпсилон- и зета-кариологии - выявление активно работающих участков на хромосомах типа «ламповых щеток» и политенных хромосомах, что позволяет получить детальные карты строения и функционирования хромосом.
В нашей стране классификацию Уайта поддерживал известный российский ученый Н.Н. Воронцов. В то же время следует отметить, что эта классификация достаточно условна, поскольку' ряд направлений хромосомного анализа, выделенных им в качестве самостоятельных, развивался параллельно. Так исторически эпсилон- и зета-кариологии появились раньше дельта-кариологии, возникающей и активно развивающейся на наших глазах. Если быть точными, то Уайт описывает не этапы развития кариологии, а разделы хромосомного анализа. В нее по объективным причинам не вошли новейшие методы. Так. новейшая, молекулярная кариология зарождается лишь сейчас; ее задачи - изучение молекулярной организации и функционирования хромосом. Тем не менее, классификация Уайта позволяет судить, по крайней мере, о некоторых важных этапах развития учения о хромосомах.
Современный хромосомный анализ - понятие достаточно условное. Так в отношении хромосом человека получена обширная информация, начиная с содержания в них ДНК и рисунках окрашивания, и до выявления генных кластеров и индивидуальных генов. В то же время для многих организмов, в том числе для водорослей, мхов, грибов, лишайников большой проблемой является само определение числа хромосом. На самом примитивном уровне остается пока и изучение хромосом многих простейших, грибов, некоторых групп беспозвоночных и многих групп высших растений. Между тем, по классификации Уайта, этот этап можно отнести к альфа - кариологии, которая зародилась еще в конце 19 века.
Области применения хромосомного анализа.
Успех хромосомного анализа во многом обеспечивается выбором методов, наиболее адекватных целям и объектам исследования (таблица 2).
Таблица 2. Основные задачи хромосомного анализа и адекватные методы их решения.
№ Задачи Типы хромосом Методы хромосомного анализа
1. Определение хромосомных митотическис Монохромное окрашивание;
чисел. гибридизация in situ с пробами центромерной ДНК; пульс-электрофорез
2. Идентификация хромосом. митотические Дифференциальное окрашивание; гибридизация in situ; многоцветный флуоресцентный бэндинг.
3. Локализация и ко- Политенные, Гибридизация in situ
локализация на хромосомах митотические С-, G-, Q- и другие типы
клонированных ДНК- хромосомы, окрашивания;
последовательностей хромосомные Fiber-FISH;
или индивидуальных генов. фибриллы' Электронная микроскопия.-
4. Изучение хромосомных Митотические, G-, Q-, С-окрашивание;
перестроек(повторов, мейотические Хромосомный пэйнтинг;
транелокаций, делеций Многоцветный флуоресцентный
и др.). бэщшнг;
Анализ конъюгации хромосом в
мейозе.
5. Установление сходства и Митотическис, Анализ конъюгации хромосом в
различия геномов и мейотические мейозе гибридов;
определение гомеологии GISH, ZOO-FISH;
хромосом. гибридизация in situ с пробами ДНК, имеющими определенную локализацию (рибосомные, некоторые другие гены).
7. Получение фракций митотические, Проточная флуориметрия
индивидуальных хромосом и мейотические, (сортировка).
их участков. политенные. Микродиссекция.
8, Оценка функциональной Митотические. ЯОР (ЫОЯ-)-бэндинг,
активности геномов. «Арлекинная окраска»; репликативный бэндинг.
9. Мониторинг окружающей Митотические, СХО, дифференциальное и
среды. мейотические монохромное окрашивание. Аномалии митоза и мейоза.
10. Медицинская цитодиагностика. Интерфазные ядра, митотические хромосомы. Монохромное окрашивание, все типы бэндинга. FISH, микродиссекция, аномалии митоза.
II. Селекция новых сортов растений и пород животных Митотические G-дифференциальная окраска у животных, С-бэндинг у растений.
!2. Исследование генетически модифицированных организмов. Интерфазные ядра, митотические хромосомы. FISH
13. Структурная геномика. Митотические хромосомы и суспензии. Проточная флуориметрия и микродиссекция.
Исследование хромосом растений.
Геном растений изучается более ста лет (а если учитывать работы Грегора Менделя, то и все 150 лет). К настоящему моменту хромосомные числа определены для - 25% видов растений, но эти значения во многих случаях неполны или неверны, т.к. подсчеты производились лишь у одного индивида или популяции. В целом хромосомы растений изучены намного хуже, чем хромосомы животных.
К концу 90-х годов XX века сформировался комплекс методов, которые с успехом используются для анализа хромосом растений. Эти методы можно условно разделить на несколько групп:
1. Собственно методы дифференциального окрашивания, включающие кроме С- бэндинга, также и G- или точнее G- подобный бэндинг, N-, R-, Т-, рсстрикционный бэндинг.
2. Методы гибридизации in situ, направленные на локализацию на хромосомах генов, в основном кластеров генов рибосомных РНК. или клонированных последовательностей ДНК различной природы.
3. Функциональные методы, позволяющие судить о функции участков хромосом, отдельных генов или их семейств, расположенных в определенных участках хромосом. К функциональным методам относятся репликативный бэндинг, выявление сестринских хроматидных обменов (СХО или окраска "арлекина") и метод определения активности рибосомных генов на хромосомах. Особенности цитогенетических исследований растений подробно рассмотрены на примере работ, проводимых в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. ВА. Энгелыарлта.
Исследования хромосом растений, проводимые в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта. РАН.
Цитогенетические исследования злаков, а впоследствии и других растений с большей или меньшей интенсивностью проводились в Лаборатории в течение 30 лет и активно продолжаются в настоящее время. Первые работы в этом направлении, начатые в конце 60-х гг. под руководством доктора биологических наук А.Б. Иорданского, завершились публикацией серии статей (Иорданский и др., 1971: Зурабишвили и др.. 1974; lordansky et al., 1978). Одновременно с ними вышли работы Б. Гилла и Г. Кимбера (Gill, Kimber, 1974a,b) и Щаповой (Щапова, 1974). Таким образом. 1974 г. можно считать годом рождения современной цитогенетики растений. После этого анализ хромосом растений в лаборатории проводился в нескольких направлениях. Основными из них являются следующие: 1. С-бэндинг крупнохромосомных объектов.
Для исследования крупнохромосомных объектов в Лаборатории была разработана оригинальная модификация метода С - дифференциальной окраски хромосом, с помощью которой были детально изучены и охарактеризованы кариотипы и проведена идентификация. всех индивидуальных хромосом основных видов хлебных злаков (пшеница, рожь, ячмень, тритикале) и ряда других растений -кукурузы, гороха, овса, дикорастущих пшениц и видов родственного рода Aegilops (Савченко и др.. 1986; Муравенко, дисс, 1988: Бадаева. 2000: Саматадзе, 2003; рис.1).
Работы по исследованию дикорастущих и возделываемых тетраплоидных и гексашюидных видов пшеницы в лаборатории были начаты в середине 80-х гг. В результате
этих исследований была разработана
«К*
: «¡¿¿ms
- >
• • TnV
1? й то 'г*
%. Ц »
V» -/•iw ■
7А
,'j « 30
tj" -iftv
1 itjC
»fc 'TD
<4 § f *
т
и».
Г-"'*. •
"Рис. 1. Метафазная пластинка гибрида т.иенйуиш х Т. хромосом злаков (Бадаев и др.. 1983: ЫЬигие с транслокацией по 6В хромосоме, С- л.г то/: ю '-»ааа
г г Муравенко и др., 1986: Бадаева. 2000:
окрашивание.
обобщенная идиограмма хромосом А-, В- и D- геномов и предложены принципы паспортизации и каталогизации сортов и коллекционных образцов пшеницы, которые могут быть использованы в исследованиях других видов и родов растений. Работы продолжаются до настоящего времени.
Изучение гибридов пшениц и видов родственных родов Secale. Hordeum. Agropyron. Aegilops позволило определить генетические взаимосвязи (гомеологию) между индивидуальными хромосомами этих видов и послужил базой для создания единой генетической номенклатуры
Баёаеуа й а1., 1991; Баааеуа ^ а1., 1996).
Из других работ по крупнохромосомным растениям следует упомянуть недавно выполненные исследования хромосом гороха (Саматадзе и др.. 2002; рис.2).
Рис.2
Метафазные пластинки гороха Pisum sativum. окрашенные методом С-бэндинга. а - нормальный кариотип: Ь.с -транслокационныелинии.
2. С-бэндянг мелкохромосомных объектов. Недоконденсация хромосом. С-подобный бэндинг мелкохромосомных объектов.
Особое внимание в работе коллектива лаборатории уделяется изучению так называемых мелкохромосомных растений, что потребовало адаптации существующих методов приготовления препаратов и их окрашивания, а также активного внедрения систем компьютерного анализа хромосом. В результате были впервые описаны кариотипы хлопка, ромашки и льна (рис.3). Размеры хромосом этих объектов (1-5мкм) слишком малы для изучения их на препаратах, приготовленных "обычными" методами и окрашенными с помощью стандартного С-бэндинга.
С-окрашивание дает хорошие результаты лишь на ограниченном числе объектов, и у многих видов с помощью этого метода выявляются лишь центромерные блоки. В связи с этим возникла необходимость создания методов дифференциального окрашивания, которые позволяли бы получить более информативные картины. Их разработка является одним из основных направлений работ лаборатории. В числе наиболее перспективных методов можно назвать ОЯ-. или О-подобный бэндинг. В то же время, появление новых технологий окрашивания диктует необходимость
4.1 С.' ^ j и : - V hi
• 4 V. ' ' ЙЩШ •• л'-g 1» i ....
Рис. 3. Метафазные хромосомы разных сортов Matricaria chamomilla. окрашенные метолом С-бэндинга - сверху: OR-бэндинг -снизу.
их сопоставления со стандартными. Такие исследования были выполнены на хромосомах нескольких видов растений, имеющих как крупные (ячмень, зингерия). так и мелкие (ромашка, лен) хромосомы.
Впервые G-подобное окрашивание у растений было получено в конце 90-х гг. на хромосомах двух видов хлопчатника: диплоидного (Gossypium herbaceum L. var. Africanum (Watt) Mauer) и тетраплоидного (G. barbadense L.) (Muravenko et al., 1998). Окраску проводили в соответствии с модифицированным BrdU-Hoechst-Giemsa - бэндингом. разработанным изначально для исследования хромосом млекопитающих (Zakharov, Egolina, 1976). Для количественного анализа хромосом хлопка в Лаборатории впервые был использована система компьютерного анализа изображения. В результате впервые удалось не только идентифицировать все индивидуальные хромосомы хлопчатника, но и сравнить их с исходными предковыми формами.
На основании подхода, использующего предобработку материала интеркалятором ДНК (9-аминоакридином) и последующее окрашивание ацетоорсеином (OR-бэндинг) была разработана модификация метода, позволившая впервые описать и изучить сверхмелкие хромосомы одноклеточных красных водорослей, относящихся к примитивным низшим растениям. С помощью системы компьютерного хромосомного анализа впервые были четко выявлены, подсчитаны и морфологически охарактеризованы хромосомы Galdieria maxima, G. partita, G. sulfuraría и Cyanidium caldarium.
3. Другие методы хромосомного анализа растений. ..... - , . ,
Л) Ag-NOR- бэндинг (серебрение).
•а:»' ч '"f&Jtätfc" tíb'**' • Рис. 4. Метафазные хромосомы Pisum -í-.*"** - /.^¡у, ■ -
< b 'i . '
sativum. окрашенные серебром ■ -^¿v^
(черные точки - активные районы ;-•: Д
■л ' - * * «г- '
ядрышкового организатора). icr : - .
* » r , ¡ * ""*'*
В Лаборатории Ag-NOR-бэндинг успешно ятт ь v _
используется для анализа ядрышковой активности и используется для анализа ядрышковой активности и
процессов взаимодействия геномов в составе
л Í f & v » ^ vf*;4 ' ч
полиплоидных видов растений - рода Aegilops, Allium, '' ■. t •
Hordeum (Амосова и др., 1989). а также межвидовых \4 "*„ -Ч Л'
* / * - * • V
гибридов и дополненных хромосомных линий. С помощью
Ag-NOR-бэцдинга проведен анализ ядрышковой активности хромосом льна, ромашки, гороха (Саматадзе и др.. 2003). При исследовании гороха [рис. 4] применение Ag-NOR-бэндинга помогло уточнить идентификацию хромосом и сопоставить генетические и цитологические карты хромосом. В частности, сравнение размеров окрашенных участков дало возможность дифференцировать хромосомы, участвующие в двух разных транслокациях. С помощью метода «серебрения» были разделены близкородственные виды льна, ранее относимые к одному виду.
С) Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).
Флуоресцентная гибридизация in situ активно используется в Лаборатории
функциональной морфологии хромосом для решения различных теоретических и
практических задач. С помощью FISH, в комплексе с методом С-окрашивания были
исследованы виды пшеницы, представляющие две эволюционные линии - эммер (AABBDD)
и Timopheevi (A'A'GG). а также диплоидные виды Triticum и Aegihps, считающиеся наиболее
вероятными донорами их геномов (Бадаева. 2000). Для проведения работы были выбраны
клоны ДНК. представляющие высокоповторяющиеся некодирующие последовательности
ДНК (pScl19, pAsl)? и семейства рРНК (рТа71 - )8S-5,8S-26S rDNA; pTa794 - 5S rDNA)
генов. В целом были изучены 12 диплоидных и 14 полиплоидных видов Aegihps. При
анализе диплоидных видов было установлено, что распределение ДНК зондов, особенно
проб рибосомной РНК (рис. 5).
является более консервативной
характеристикой генома, чем рисунки
С-окрашивания. Эти данные были
использованы при анализе
полиплоидных видов Aegihps.
Полученные результаты показали, что
механизмы формирования кариотипов
полиплоидных видов в значительной
степени определяются базовым
(pivotal) геномом. Виды кластера D-
геномов характеризовались высокой Рис 5
цитогенетической стабильностью, а Локализация кластеров 18S-26S рРНК генов на хромосомах
тетрапяоидuотоAegilopsvariabШs методом флуоресцентной модификации хромосом в процессе гибридизации in situ (FISH) видообразования и внутривидовой
дивергенции затрагивали оба родительских генома в равной степени. Значительная хромосомная нестабильность являлась отличительной особенностью видов кластера U-геномов. Модификации хромосом у них затрагивали в основном дифференциальные геномы и происходили за счет транслокаций и интрогрессивной гибридизации. Показано, что наиболее существенные преобразования геномов происходят у тетраплоидных видов, тогда как образование гексаплоидов не приводит к значительным изменениям хромосом.
Метол гибридизации in situ нашел широкое применение в Лаборатории для анализа структурной организации хромосом других таксономических групп растений, в частности на льне и горохе, определения происхождения видов и их геномов и установления гомеологии хромосом. Упомянутые выше исследования злаков показали, что локализация рибосомных генов является не только высоко консервативной характеристикой генома, но и может быть использована для идентифицикации и определения генетического родства (гомеологии) индивидуальных хромосом. В связи с этим, данная характеристика была использована для анализа нескольких видов льна. Исследование его хромосом с помощью монохромного
окрашивания не позволяет точно определить морфологию спутничной хромосомы. Было неясно даже число хромосом у этого вида - 30 или 32. Гибридизация in situ показала прицентромерное расположение кластеров рибосомных генов, т.е. две мелкие хромосомы фактически представляли одну спутничную. На основании этого был сделан вывод, что диплоидное число хромосом этого вида 2п=30.
В) Геномная гибридизация in situ (GISH).
GISH используют при анализе межвидовых гибридов или полиплоидных форм растений. С его помощью можно дифференцировать хромосомы, относящиеся к разным геномам, прямо на препаратах. Метод является уникальным подходом для изучения организации хромосом в интерфазном ядре. Он позволяет точно локализовать точки разрывов при межгеномных транслокациях.
В Лаборатории функциональной морфологии хромосом с помощью GISH были изучены линии Т. araraticum с межгеномными транслокациями. Было показано, что точки разрывов у них локализовались или в центромсрных. или проксимальных районах хромосом. Данное наблюдение свидетельствует о том, что перестройки возникали скорее под воздействием гаметоцидных генов, чем из-за неправильного расхождения унивалентов и слияния телоцентрических хромосом в мейозе гибридов (рис.6).
Рис 6 Геномная гибридизация in situ на хромосомах Triticum araraticum с транслокацией 2А^ [геномную ДНК Tnticum топососсит метили биотином (темная), а геномную ДНК Ае speltoides использовали. как блокирующую] Детекцию сигнала проводили с помощью системы на основе пероксидазы хрена.
4. Системы компьютерно
Системы компьютерного анализа изображения используется для решения многих задач. однако они оказались особо перспективными в исследованиях растений с небольшими, сходными по морфологии хромосомами, таких как рис. сахарный тростник, сахарная свекла, хлопок, ромашка подсолнечник, морковь и др
С помощью системы анализа изображения (VideoKaryoTest 2.0) в Лаборатории была исследована тонкая структура хромосом зингерии и ромашки, выявляемая с помощью разработанного ранее метода G-подобного OR-дифференциального окрашивания. В результате была показана принципиальная возможность использования морфометрического анализа хромосом для изучения геномного полиморфизма мелкохромосомных видов
го анализа изображения.
растений и сформулированы основные методические правила проведения такого анализа. В настоящее время этот метод стал рутинным в лаборатории. Он позволяет проводить в полуавтоматическом режиме анализ препаратов и кариотипирование. что резко облегчает работу и позволяет получить более объективные данные.
5. Микродиссекция.
В работах Лаборатории функциональной морфологии хромосом техника микродиссекции была использована для получения ДНК библиотек пшеницы. В частности, была предпринята попытка получения локус-специфической ДНК из хромосомы 5В пшеницы, содержащей РМ ген. ответственный за гомеологическую конъюгацию хромосом (Родова и др., 1995, рис.6).
Рис.6. Метафазная
пластинка пшеницы до
(а) и после (о) -- : . г уЪ , ■ ^ ф
микролиссекции. Стрелкой обозначена микродиссектированная хромосома5Bldel.
! W
ч"4
Из сказанного видно, что в Лаборатории функциональной морфологии хромосом широко используются все основные методы хромосомного анализа. Именно поэтому Лаборатория занимает одно из ведущих мест в мире в области цитогенетического анализа растений.
Заключение.
Хромосомный анализ в геномную эру.
Конец двадцатого и начато двадцать первого столетия ознаменовались революционизирующими изменениями в биологической науке, связанными с расшифровкой полных нуклеотидных последовательностей ДНК ряда организмов. Опубликованы результаты тотального сиквенса генома человека и значительно более подробного и близкого к завершению сиквенса его пяти самых мелких (14.22. 21, 20 и Y) хромосом, по детальности близкого к таковому для геномов С. elegance и A. thaliana.
Развертывание работ по массовому секвенированию геномов различных организмов стало мощным стимулом для создания принципиально новых технологий. Оно оказало огромное влияние на смежные, а порой и достаточно отдаленные области биологии и медицины. В настоящей работе рассмотрено современное состояние важного раздела биологической и медицинской науки - хромосомного анализа в геномную эру. Особое внимание было уделено следующим проблемам:
1) Роль изучения хромосом и хромосомного анализа в развитии геномики и секвенировании геномов.
2) Влияние, которое оказали и окажут в обозримом, т.е. с достаточной степенью достоверности прогнозируемом будущем, геномные исследования и новые геномные технологии на хромосомный анализ и его технологическое обеспечение.
3) Место, которое будет занимать хромосомный анализ в геномных исследованиях ближайшего будущего.
На основании изучения истории хромосомного анализа, которая насчитывает около 150
лет. нам представляется возможным выделить следующие основные периоды его развития:
1. Конец 70-х гг. Х1Хв.- начало ХХв.- установление факта существования хромосом и их описание. На этот момент развития хромосомного анализа приходится создание и развитие методов микроскопирования. усовершенствования самих микроскопов. Разработаны консервирующие жидкости (фиксаторы) и ядерные красители, совершенствовались методики приготовления препаратов.
2. Начало ХХв. - бурный прогресс хромосомного анализа. Увязано представление о хромосомах с генетикой во многом благодаря работам Т.Х. Моргана и его группы. Прогресс в основном связан с растительными объектами. Успехам кариосистематика растений обязана трудам С.Г. Навашина. Т. Сакамуры и Г.А. Левицкого. Принято считать, что С.Г. Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строения.
3 . 30-40-е гг. ХХв. - первые сведения о возможности изучения хромосом, основанные на неоднородности их окрашивания.
4. Конец 50-х - начало 60-х гг. ХХв. - развитие хромосомного анализа переместилось от растений к человеку и животным. Пора бурного развития цитогенетики человека а затем и других млекопитающих (работа Дж. Тио и А. Левана, 1956: 1960г.- все хромосомы человека разделены на 7 групп). Совершенствование методик приготовления препаратов (работа не на срезах, а на давленых препаратах).
5. 1968г. - создание первого метода дифференциального окрашивания хромосом (Q-бэндинг. группа Т. Касперссона): полная идентификация всех хромосом человека Как следствие, одновременное появление других методов дифференциального окрашивания (С-, G-, N-, R- и др. виды бэндинга).
6. 70-е г.г. - получение гибридов соматических клеток человека и грызунов, в которых избирательно элиминируются хромосомы человека Работы по картированию хромосом человека получили стремительное развитие. К 1975 году на индивидуальных хромосомах человека локализовано более 70 генов (к настоящему времени локализовано около 10тыс. генов).
7. Конец 60-х - 70-е и 80-е гг. ХХв. Создание метода гибридизации in situ: 1969 -радиоактивная; 1982 - нерадиоактивная (на основе биотина): 1990 - геномная гибридизация in situ; 1986 - флуоресцентная гибридизация in situ; 1996 г. - спектральное кариотипирование.
8. 1981 г. - создание метода микродиссекции.
9. Конец ХХв. - начало ХХ!в. - завершен основной этап расшифровки генома человека и ряяда других организмов (арабидопсис. рис. рыба Fugo, Drosophila melanogaster и несколько сотен микроорганизмов). Внедрение современных технологий хромосомного анализа в медицину (генная терапия), использование трансгенных растений в сельском хозяйстве (основная масса используемой в мире сои является трансгенным продуктом). Если ХХв. можно смело назвать веком хромосомного анализа и расшифровки генома
человека, то ХХ!в.. возможно, станет веком осмысления полученных результатов. Не
вызывает сомнения, что в этом хромосомный анализ будет играть существенную роль.
Выводы.
1. Ключевыми этапами развития хромосомного анализа можно считать выявление и описание хромосом, разработку и совершенствование методов приготовления препаратов, консервирующих жидкостей (фиксаторов) и красителей, создание современных методов дифференциального окрашивания, гибридизации in situ, систем компьютерного анализа изображения и т.п. Развитие хромосомного анализа шло параллельно созданию новых технологий и развитию новых областей знаний.
2. Появление новых и развитие существовавших технологий зачастую шло одновременно, поэтому обозначить четкие временные границы отдельных периодов хромосомного анализа достаточно сложно. В то же время, при классификации хромосомного анализа следует исходить из прогресса в области изучении хромосом человека, как наиболее хорошо и всесторонне изученного объекта.
3. Показано, что в начале становления хромосомного анализа первостепенную роль играли совершенствование микроскопирования и технологий работы с препаратами. Позже все более существенное влияние на развитие цитогенетики стали оказывать знания об объекте, т.е. создание новых методов, а также выбор наиболее адекватных поставленным задачам технологий осуществляется целенаправленно, а не подбирается эмпирически.
4. Современный хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа. а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Ого определение кариотипа. составление идиограмм. идентификация хромосом с использованием дифференциального окрашивания, гибридизации in situ, анализа изображения, определение локализации отдельных генов и их семейств и т.п.
5. Для выбора адекватного объекта и методов для решения конкретных задач цитогенетики чрезвычайно важно знание истории хромосомного анализа. В связи с этим проведена систематизация современных методов хромосомного анализа и составлен справочный материал, облегчающий выбор адекватных методов хромосомного анализа применительно к решению поставленных задач.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Зеленин А.В., Зощук Н.В. История современного анализа. Основополагающий вклад работ Касперсона//Онтогенез. 2000. Т. 31. № 2. С. 152-160.
2. Зощук Н.В., Бадаева E.Д., Зеленин А.В История хромосомного анализа // Биологические мембраны. 2001. т. 18.№З.С. 164-172.
3. Зеленин А.В.. Бадаева Е.Д., Зощук Н.В.. Муравенко О.В. Вклад хромосомных технологий в геномику растений / В кн.: Изучение генома и генетическая трансформация растений // Новосибирск: Наука. 2001. С. 13-26.
4. Зощук Н.В.. Бадаева Е.Д.. Зеленин А.В. История современного хромосомного анализа. Дифференциальное окрашивание хромосом растений // Онтогенез. 2003. Т.34. №. 1.С. 5-18.
5. Зеленин А.В., Зощук Н.В. Хромосомный анализ в геномную эру // Вестник РФФИ. 2003. В печати.
Зощук Н.В. История дифференциального окрашивания хромосом растений // Цитология.
IV Совещание по кариологии и кариосистематике растений. 1999. Т. 41. № 12. С. 1064.
да-в 151
Подписано в печать 31.03.2004 Формат 60x88 1/16, Объем 1.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ №62 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва. Ленинские горы. д. 1 Главное здание МГУ. к. 102
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зощук, Наталья Викторовна
Раздел Стр.
I. Введение.
II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации.
III. Дифференциальное окрашивание хромосом.
1. Q-дифференциальное окрашивание (Q - бэндинг).
2. С-бэндинг. Гетерохроматин.
3. G-бэндинг
4. R-и Т-окрашивание.
5. Окрашивание серебром - ЯОР (М(Ж)-бэндинг.
6. Метод N-дифференциального окрашивания хромосом.
7. Cd- и Kt- окрашивание.
8. Высокоразрешающий бэндинг.
9. Нуклеазный бэндинг.
10. Выявление сестринских хроматидных обменов.
11. F- бэндинг
12. Ну-бэндинг.
13. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, 64 специфичными для AT и ГЦ пар оснований.
14. Итоговые замечания по рассмотрению дифференциального 66 окрашивания хромосом.
15. Молекулярные механизмы дифференциального окрашивания 70 и природа бэндов.
IV. Другие методы хромосомного анализа.
1. Методы гибридизации in situ.
2. Микродиссекция хромосом и их отдельных участков.
3. Методы анализа изображений для цитогенетического анализа 92 и физического картирования.
V. Некоторые проблемы, решаемые с помощью хромосомного анализа.
1. Видообразование и хромосомный анализ.
2. Исследование хромосом растений с помощью методов 104 дифференциального окрашивания.
3. Исследования хромосом растений, проводимые в Лаборатории 112 функциональной морфологии хромосом института
Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Хромосомный анализ: история, современное состояние. Методы, развитие и периодизация"
Хромосомный анализ - мощный инструмент генетики и молекулярной биологии, направленный на изучение генома. Его история насчитывает свыше ста лет - с тех пор, как В. Флемминг в 1879 году впервые наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки аксолотля. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества самых разнообразных объектов как животного, так и растительного происхождения. Достигнутые успехи определялись в первую очередь совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Первостепенное значение имело развитие техники микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Естественно, что в течение всего этого времени неоднократно предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа и определения его места в биологии и медицине (С.Г.Навашин, 1916, 1921; Левицкий, 1931; White, 1978; Дарлингтон, ЛаКур, 1980; Восток, Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995).
Хромосомный анализ является органической частью геномного анализа. Впервые термин «геном» был предложен в 1920 году Г. Винклером (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом данного вида. Естественно, что на этом этапе понятия хромосомного и геномного анализа практически совпадали. По мере развития генетики и молекулярной биологии понятие геномного анализа претерпевало значительные изменения. Геномный анализ включает в себя много разделов в зависимости от методов исследования. Так в цитогенетике растений традиционно под геномным анализом подразумевалось исследование филогенетического родства видов и определение геномного состава полиплоидов в пределах родственных систематических групп на основе анализа конъюгации хромосом в мейозе гибридов (Rosenberg, 1909). На современном этапе термин «геномный анализ» используется в более широком смысле, он также подразумевает, в первую очередь, выявление первичной структуры генома, т.е. определение последовательностей всех составляющих его нуклеотидов; включает в себя установление происхождения видов и оценку генетического родства геномов, на основании анализа различных классов уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК, структуры хромосом и сравнительного генетического картирования, структуры генов и спейсерных последовательностей (Friebe, Gill, 1996).
Последние достижения в геномном анализе неразрывно связаны с использованием и развитием методов молекулярной биологии: различные варианты амплификации ДНК (RFLP, PCR и др.) и цитологических подходов (дифференциальное окрашивание хромосом и гибридизация in situ, сравнение структуры геномов с легко изменяющимися (полиморфными) участками). Понятно, что ни один из вышеперечисленных методов не является всеобъемлющим и безошибочным. Эффективность методов определяется степенью, в которой они решают поставленные задачи, в частности характеризуют прямо или опосредованно сходство ДНК между видами. Несмотря на все эти достижения хромосомный анализ остается крайне важной, а в отношении некоторых объектов основной частью геномного анализа.
Традиционно хромосомный анализ начинается с установления числа хромосом и определение их размеров и морфологии (центромерный индекс, наличие и положение вторичных перетяжек). Впоследствии эти подходы были дополнены хромосомным бэндингом и гибридизацией in situ для анализа не только митотических, но и мейотических хромосом. Помимо этого методы геномного анализа включают в себя анализ мейотической коныогации хромосом в гибридах, микроспектрофотометрию окрашенных по Фельгену препаратов, проточную цитометрию, сравнительное картирование ядерного, пластидного и митохондриального геномов, микродиссекцию и микроклонирование, системы компьютерного анализа изображения.
Представляет интерес соотношение понятий хромосомный анализ и кариология. В строгом смысле кариология - это наука о ядре, т.е. понятие более широкое, чем хромосомный анализ. Однако некоторыми авторами (White, 1978; Воронцов, 1980) эти понятия практически отождествляются. Хромосомный анализ - составная часть кариологического анализа - проводится с помощью арсенала различных методов. По мере появления новых методов расширяются возможности и эффективность хромосомного анализа.
Хромосомный анализ начал формироваться давно. На каждом этапе создания новых технологий, используемых в нем, хромосомный анализ определялся по-разному. Поначалу он представлял собой описание морфологии хромосом для целей ботаники, зоологии и медицины. В дальнейшем он расширился за счет появления новых методов анализа и увеличения числа исследуемых объектов.
В настоящее время хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Наиболее интенсивно развиваются исследования в тех областях, где они могут быстро приносить практическую пользу (медицинская цитогеиетика, включая пренатальную диагностику наследственных заболеваний, селекция новых сортов растений и пород животных).
В то же время, последнее десятилетие ознаменовалось стремительным прорывом в развитии науки, связанным с расшифровкой генома человека и ряда других видов животных, растений и микроорганизмов. Таким образом, созданные ранее классификации хромосомного анализа по ряду объективных причин не могли охватить достижений молекулярной биологии последних лет. С другой стороны, прогресс в определении первичной структуры генома лег в основу создания принципиально новых методов и подходов к изучению хромосом. В связи с перечисленными фактами, назрела насущная необходимость пересмотра истории хромосомного анализа в свете современных представлений и определения его места в биологической науке сегодняшнего дня. Это и послужило целыо диссертационной работы.
Цель работы заключается в рассмотрении истории хромосомного анализа с учетом достигнутого прогресса в исследованиях геномов, выделении отдельных периодов его развития и определении наиболее перспективных направлений, конкретно в решении следующих задач: описании ключевых этапов развития хромосомного анализа за весь период его существования; рассмотрении основных методов исследования хромосом, характеристики наиболее широко используемых их модификаций, описании истории создания и области применения;
- определении места и роли хромосомного анализа в геномную эру; выделении основных этапов развития хромосомного анализа.
II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации.
Различными авторами предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа (White, 1978; Дарлингтон, JIa Кур, 1980; Восток , Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). Наиболее полную классификацию этапов его развития предложил известный австралийский цитогенетик и эволюционист М. Дж. Уайт в 1978 году (White, 1978). Он выделил шесть этапов развития кариологии: альфа-кариология - определение числа и размеров хромосом; бэта-кариология - детализация признаков кариотипа: определение относительной длины плеч хромосом, положения центромеры, выявление половых хромосом и пр.; гамма-кариология - идентификация специфических районов хромосом с использованием методов дифференциальной окраски; дельта-кариология - определение локализации сателлитиой ДНК, ядрышкообразующих районов (рДНК), локусов, содержащих гены 55-рибосомной РНК; эпсилон- и зета-кариологии - выявление активно работающих участков на хромосомах типа «ламповых щеток» и политенных хромосомах, что позволяет получить детальные карты строения и функционирования хромосом.
Классификация Уайта получила широкую известность в нашей стране благодаря ее пропаганде в работах Н.Н. Воронцова (Воронцов, 1980; 1986). Необходимо отметить, что эта классификация достаточно условна, поскольку она исторически не выдержана, и ряд направлений хромосомного анализа, выделенных им в качестве самостоятельных, развивался параллельно. Так исторически эпсилон- и зета-кариологии начали активно развиваться раньше дельта-кариологии, возникающей и активно развивающейся на наших глазах. Если быть точными, то Уайт описывает не этапы развития кариологии, а разделы хромосомного анализа. А конкретнее - вышеперечисленные этапы развития кариологии представляют собой детализацию наших знаний о хромосомах и кариотипс в целом. Поэтому классификация Уайта выглядит несколько однобокой. Она основана скорее па методических подходах изучения хромосом, и при этом в нее по историческим причинам не входят новейшие методы. Однако она позволяет судить по крайней мере о некоторых важных этапах развития учения о хромосомах.
Новейшая, молекулярная, кариология зарождается лишь сейчас; ее задачи - изучение молекулярной организации и функционирования хромосом. Современный хромосомный анализ - понятие достаточно условное. Так при исследовании хромосом человека анализ позволяет судить о множестве черт и особенностей хромосом: содержании в них ДНК, рисунке их окрашивания, наличии перестроек вплоть до выявления генных кластеров и индивидуальных генов. В то же время для многих организмов, в том числе для водорослей, мхов, грибов, лишайников большой проблемой является само определение числа хромосом. На самом примитивном уровне остается пока и изучение хромосом многих простейших, грибов, некоторых групп беспозвоночных и многих групп высших растений (Bennett, 1998). Между тем, по классификации Уайта, этот этап можно отнести к альфа - кариологии, которая зародилась еще в конце 19 века.
С 1831 года, т.е. с момента открытия английским ботаником Робертом Броуном клеточного ядра, началось активное изучение как его химического состава, так и функционального значения отдельных структур и компонентов. Уже в 1868 году Мишер выделил ДНК, а несколько позднее Коссель открыл гистоны. Параллельно шло развитие генетики (работы не были связаны с наблюдением хромосом). Несмотря на то, что в 1865 году была опубликована фундаментальная работа Грегора Менделя, в которой он сформулировал законы наследственности, свое официальное начало генетика ведет с 1900 года после переоткрытия законов Менделя тремя исследователями: Гуго Де Фризом, Карлом Корренсом и Эрихом Чермаком.
В конце 70-х гг. XIX века поведение хромосом изучалось многими исследователями, но наиболее значительный вклад в эту область знания внесли Э. Страсбургер и В. Флемминг. В 1880 году Флемминг наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки, а двумя годами позже он предложил термин «митоз». В принципе этот период развития хромосомного анализа ознаменовался установлением самого факта существования хромосом и их описания. В 1903 - 1904 гг. В. Сэттон и Т. Бовери (Sutton, 1903; Boveri, 1904) показали, что именно хромосомы являются материальными носителями мснделевских факторов наследственности. С этого времени начался новый этап изучения хромосом.
В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества других объектов. Достигнутые успехи определялись совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Важнейшее значение имело развитие методов микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов.
Среди важнейших этапов развития микроскопических методов Дарлингтон и JIa Кур (Дарлингтон, Ла Кур, 1980) выделяют создание: И водоиммерсионных объективов (1850г.)
И осветителя для микроскопа (1873г., Э. Аббе - ведущий конструктор фирмы Карл Цейсс) И масляной иммерсии и масляноиммерсионмого объектива (1878г., Э. Аббе) Ш апохроматического объектива (1886г.)
Таким образом к началу 20 века было завершено создание светооптического микроскопа, позволяющего достигнуть разрешения до 0.2 мкм. Последующие сто лет стали веком совершенствования микроскопической техники, в частности были созданы: объективы с широким полем зрения; фазово-контрастная (Mickel, 1941; Burch, Stock, 1942) и электронная микроскопия; создание и развитие флуоресцентной микроскопии; использование электронной микроскопии для исследования политенных хромосом. создание и активное использование компьютерных систем анализа изображения;
Параллельно совершенствовались методики приготовления препаратов. В 60 - 80-е гг. Х1Хв. были подобраны и внедрены в практику консервирующие жидкости (фиксаторы) и клеточные красители, создание которых продолжается до сих пор.
Следует отметить, что именно разработка новых способов приготовлеиия препаратов имела ключевое значение для развития хромосомного анализа. Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали па тканевых срезах. Такие препараты содержали в основном разрушенные митозы, хромосомы накладывались одна на другую, образуя клубки, плохо поддающиеся анализу. Технологии, основанные на использовании суспензий клеток (человек и животные) или приготовлении давленых препаратов (растения) позволили преодолеть эти трудности. Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии. При этом дополнительно стали использовать протеолитические ферменты - трипсин, коллагеиазу или гиалуронидазу - с целью дезинтеграции образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток (Макгрегор, Варли, 1986).
Параллельно с этим изучали нетипичные хромосомы: в 1881 году Бальбиани описал политениые хромосомы слюнных желез личинок двукрылых (Chironomus), а Флемминг, исследуя ооциты аксолотля, обнаружил хромосомы типа ламповых щеток. В течение последующих 50-70 лет в основном совершенствовались лишь методики выделения таких хромосом из ядер.
С именем Т.Х. Моргана и его школы связан совершенно новый этап развития генетики - установлена связь учения о хромосомах с генетикой.
Представления о линейном расположении генов, об их сцеплении и кроссинговсре позволили предсказывать многочисленные явления. Картина внутреннего строения хромосом, предложенная Морганом, стала одним из главных обобщений биологии, превратилась в неопровержимый факт, подтвержденный всем развитием генетики. Именно Морган, опытный экспериментатор, обратил внимание на незаменимые качества такого лабораторного объекта, как дрозофила (короткий жизненный цикл -11-12 дней, легкость и простота разведения). Такой объект требовался Моргану в опытах по получению искусственных мутаций (Morgan, 1907). Появившийся объект принес неожиданный успех не только Моргану и его «дрозофильной группе», но и стал незаменимым для всех генетиков впоследствии. Сейчас изучение политенных хромосом и хромосом типа ламповых щеток представляет собой отдельную область хромосомного анализа. Получены детальные карты строения и функционирования политенных хромосом слюнных желез дрозофилы, в том числе основанные на электронно-микроскопических фотографиях политенных хромосом, выделенных из клеток и растянутых с помощью микроманипулятора (Ананьев, Барский, 1985).
В 20-30-е гг. XX в. прогресс хромосомного анализа определялся в основном изучением растительных объектов, сравнительная кариология растений резко опережала сравнительную кариологию животных. Этим она обязана трудам С.Г.Навашипа (Навашин, 1910, 1911, 1912, 1914), Т. Сакамуры (Sakamura, 1915, 1920) и Г.А. Левицкого (Левицкий, Кузьмина, 1927; Lcwitsky, Тгоп, 1930; Левицкий, 1931а, Левицкий, 1931). Наиболее интересные данные и теоретические выводы в этой области принадлежат С. Г. Навашину и его школе.
В 1912 году на заседании Императорской академии наук России С. Г. Навашин сделал сообщение, которое стало впоследствии знаменитым, «О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans» (семейство Liliaceae). На данном растительном объекте С. Г. Навашин впервые обнаружил наличие мельчайших постоянных придатков, присоединенных «ниточками» к двум хромосомам. Именно эти придатки и были названы Навашиным спутниками («satellites»). С.Г. Навашин показал, что эти тельца являются постоянной составной частью двух из четырех хромосом, т.к. при делении ядра они «расщепляются вместе с остальным телом хромосомы». Именно С. Г. Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строение А в 1916 году в юбилейном сборнике, посвященном К.А. Тимирязеву, вышла в свет работа С.Г. Навашина о внешних признаках внутренней организации хромосом (Навашин, 1916). Объектами исследования были хромосомы лилейных (рода Fritillaria и рода Galtonia). Работа иллюстрирована Рис л <<Расчлененис хромосом» у рисунками, уникальными по тонкости Fritillaria tenella. изображенных на них деталей для цитологической литературы того времени (рис. 1).
Большое значение в кариосистсматике растений сыграли также труды другого классика науки в области цитогенетики Г.А. Левицкого (одного из наиболее выдающихся учеников академика С.Г. Навашина). Продолжая научное направление своего учителя, Г.А. Левицкий обогатил наши знания о строении и изменениях хромосом. Благодаря ему, русская школа в исследованиях морфологии хромосом стала всемирно известной, получив название W классической». Г.Л. Левицкий - автор первого русского руководства по цитогспстике «Материальные основы наследственности» (Левицкий, 1924), по которому учились в 20-30-х годах ХХв. Он наиболее тщательно для своего времени (1910-1913) изучил строение и размножение митохондрий (хондриосом), разработав специальный фиксатор, позволивший установить детали микроскопической организации митохондрий и показать их преемственность путем деления (Прокофьева-Бельговская, 1980).
Г.А. Левицкий.
Основная научная деятельность Г.А. Левицкого была посвящена исследованиям морфологического строения хромосом. В 1931 году вышла в свет его работа «Морфология хромосом», в которой он предложил новую методику фиксации и окраски для выяснения особенностей строения хромосом культурных растений ржи, ячменя, гороха, пшеницы, сахарной свеклы) и некоторых классических в цитологическом отношении растений (Najas, Muscari). Левицким было установлено, что открытое С.Г. Навашиным строение хромосом Galtonia candicans из двух плеч является общей закономерностью строения хромосом, основным принципом их организации. В круг интересов ученого входили вопросы систематики и эволюции (Левицкий, Кузьмина, 1927;
Lcwitsky, Tron, 1930; Левицкий, 1931а). Г.А. Левицкий - один из основателей радиационной генетики растений (Левицкий, Араратян, 1931).
Перед глазами цитолога, жившего до сих пор в атмосфере строгих и прочно установившихся внутриядерных соотношений, развертывается при исследовании рентгенизованпых корешков непривычная и жуткая картина причудливых, поистине калейдоскопических преобразований «материальных носителей наследственности»
14 хромосом, утративших свою обычную устойчивость», - так Левицкий описывает свои первые впечатления от увиденной им картины хромосом, подвергнутых действию рентгеновских лучей. Г.А. Левицкий ввел термин и развил учение о кариотипе (Левицкий, 1931), а термин «идиограмма» предложен его учителем С.Г. Навашиным (Навашин, 1921). Под «идиограммой» Навашин обозначил «совокупность метафазных хромосом в качестве элементов символа вида». В таком понимании термин не получил дальнейшего распространения. Г.А. Левицкий изменил его содержание и под «идиограммой» обозначил графическое изображение совокупности признаков хромосом (их длины, относительных размеров плеч, вторичного расчленения). В таком понимании термин «идиограмма» получил широкое распространение и стал достоянием цитологии (Прокофьева-Бельговская, 1980). В настоящее время под кариотипом подразумевается совокупность признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор: число хромосом, их форма, определяемая прежде всего положением центромер, наличие вторичных перетяжек, спутников, чередование эухроматиновых и гетерохроматиновых районов и т.д. Кариотип образно называют паспортом вида (Инге-Вечтомов, 1989). Таким образом, хромосомы характеризуются длиной, положением
Т А гт:
ST
SM м К центромеры и наличием или отсутствием вторичных перетяжек и спутников. Предложено несколько систем классификаций хромосом, в основе которых лежит группировка по морфологическим (морфометрическим) признакам. Широкое (повсеместное) распространение получила классификация, в основу которой взята величина в 7,0 3.0 1.7 10
Arm ratio (г)
Рис.2. Классификация Левана. г = L/S, где L- длина длинного плеча хромосомы, a S - короткого) соотношения плеч хромосомы (Levan et al., 1964; рис. 2). Данная классификация достаточно произвольна,согласно ей хромосомы делятся на телоцентрические (Т), акроцентрические (А), субтелоцентрические (ST), субметацентричесткие (SM) и метацентрические (М).
Позже были предложены ТАМ (Imai, 1978; рис. 3) и AM (Imai, Crozier, 1980; рис. 3) классификации, основанные на не случайном местоположении центромеры (которое определяется путем соотношения короткого плеча - S -хромосомы к общей длине хромосомы гаплоидного набора) я Е ь Z и о с о
3 U Q и IL
А М
Т А м
AM system ТАМ system
0.1 .6
С/2
Size of short arms (S)
Рис.3. ТАМ и AM "классификация.
ST
0 .1 .6 С/2 С Size of heterochfomatlc short (Sh) or long (Lh) arms Size of euchromatfc short arms (S4)
Imai, 1975, 1976, 1991].
В 90-х гг. 20 века, взяв за отправную точку предположение о том, что ни одна из вышеупомянутых систем не может подойти для описания сложных образцов С-бэндинга эукариотических хромосом, была предложена модифицированная ТАМ классификация (Imai, 1991; рис. 4).
Рис.4. Модифицированная классификация ТАМ.
Короткое плечо хромосомы, длинное и общая (вся) длина хромосомы соответственно были обозначены S, L, С (от англ. Short, Z,ong, Chromosome) и C=S+L. Величины Se, Le, Sh и Lh были предложены для обозначения короткого и длинного плеча эукариотической хромосомы, а также для полностью гетерохроматических коротких и длинных плеч хромосомы. В результате хромосомы подразделили на три категории:
1. Хромосомы с Se и Le.
2. Sh и Le или Se и Lh хромосомы.
3. Sh и Lh хромосомы.
Для упрощения терминологии эухроматические плечи (Se и Le) и гетерохроматические плечи (Sh и Lh) были сокращены до Е и Н соответственно. И перечисленные выше три категории хромосом стали Е хромосомы, ЕН хромосомы и Н хромосомы соответственно (рис. 5).
Многие виды растений имеют сходные хромосомы, которые невозможно различить при монохромном окрашивании (ацето-кармином, ацето-арсеином или окрашиванием по Фельгену) [Зурабишвили и др., 1974], что ограничивает применение кариотипичсского анализа. В этом случае используют анализ мейотических хромосом (мейоз моносомных или транслокационных линий, где хромосомы не образуют бивалентов и легко идентифицируются). Так в свое время были охарактеризованы хромосомы пшеницы, хлопка, табака и т.д. Данный подход до сих пор используется при анализе некоторых видов. Но уже в 30-40-х гг. XX века появились первые сведения о возможности изучения хромосом, основанные на неоднородности их окрашивания. В частности: se | Is* sh
Lh е i6 а ь ,S С
Ае М М А Ам Ам Ам Ам A* Mh Mh
Рис.5. Е, EH, Н хро&осомы.
1) Выявляли так называемый холодовой гетерохроматин (Н-сегменты). Под таковым подразумевали участки хромосомы некоторых видов растений и амфибий, обнаруживаемые с помощью окраски основными красителями как слабоокрашеиные участки на метафазных хромосомах после охлаждения препаратов до температуры 0 - 3°С в течение 3-5 суток (Darlington, La Cour, 1940; Callan, 1942).
2) Обнаружили необычную степень дифференциации гетерохроматических участков хромосом Trillium, Tradescantia, Vicia, особенно вблизи центромеры, наблюдаемую при рентгеновском облучении в комбинации с холодовой обработкой (Darlington, La Cour, 1945; Kurabayashi, 1953).
3) Показано, что при обработке корешков растений солями тяжелых металлов в хромосомах проявляется неоднородное окрашивание (Элленгорн, 1940). ^
В течение последних 30-ти лет, несмотря на появление отдельных публикаций, названные выше методы не получили широкого распространения в исследовательской практике.
С конца 50-х - начала 60-х годов фронт исследования хромосом и соответственно развитие хромосомного анализа переместились от растений к человеку и животным. Открытие, создание и совершенствование технологий хромосомного бэндинга в начале 70-х гг. 20 века снабдило цитогенстиков мощнейшим инструментом для идентификации как индивидуальных хромосом в целом, так и их частей, облегчив тем самым процедуру анализа кариотипа (подробнее см. ниже).
Пора бурного развития цитогенстики человека, а затем и других млекопитающих приходится на 50-60-е гг. XX века. Благодаря ряду усовершенствований методик (использование в качестве материала культуры клеток, применению гипотонического раствора и колхицина [Hsu, 1952], фитагемагтлютинипа [Moorhead ct al., 1960], приготовление тотальных препаратов, высушенных на воздухе - [Rothfels, Siminovich, 1958]) были выявлены структурные особенности аутосом и половых хромосом человека, определяемые их размерами, положением центромеры, наличием вторичных перетяжек и спутников. Как следствие, в 1956 году появилась работа Дж. Тио и Л. Левана (Tijo, Levan, 1956), в которой в культуре фибробластов легкого было впервые правильно определено число хромосом (46) человека. До этого момента исследователи находили у человека как 47 (Winiwarter, 1912), так и 48 хромосом (Painter, 1923). В 40-х гг. кариотип человека считали весьма неблагоприятным объектом для цитологического анализа из-за большого числа хромосом, тесного расположения в метафазах и трудности идентификации даже крупных хромосом. В результате в течение последующих 16 лет к этому вопросу почти не возвращались. Поэтому не удивительно, что открытие хромосомного числа 2п=46 у человека явилось полной неожиданностью для самих авторов: в 265 митозах, за исключением четырех, хромосомное число оказалось 46, а не ожидаемое 48. Дж. Тио и А. Леван дали полный анализ кариотипа, установив в нем 20 хромосом с медианной или субмедиаппой центромерой, 20 хромосом с субтерминальной центромерой и 6 хромосом с терминальной центромерой.
С этого момента изучением хромосом человека занимались многочисленные исследовательские группы в разных странах мира. Полученные данные были обобщены на конференции по стандартизации хромосом человека, состоявшейся в Дэнвере (США) в 1960 г. В соответствие с рекомендациями этой конференции все хромосомы человека были разделены на 7 групп и обозначены буквами: А(1-3), В(4-5), С(6-12) + X, D(13-15), Е(16-18), F(19-20) и G(21-22) +Y. Номенклатура оказалась почти универсальной и не изменялась (не считая минимальных модификаций) в течение 10 лет.
Важным вкладом в развитие цитогенетики человека стало сообщение о наличии 47 хромосом у больных болезнью Дауна (Down syndrome, позднее названный монголизм, Lejeune et al., 1958; опубликовано в янв. 1959) - трисомия по хромосоме G-группы (по 21 хромосоме). А 1960 году были опубликованы еще два сходных по механизму синдрома -трисомия по Е-группе (Edwards et al., 1960) и трисомия по D-группе (Patau et al., 1960).
Описание случаев необычного набора половых хромосом стало ключом к пониманию половой детерминации у человека. Индивиды с набором ХО оказались женщинами, а с ХХУ - мужчинами, т.е. Y хромосома отвечает за детерминацию пола (мужского). Эта ситуация оказалась диаметрально противоположна таковой у плодовой мушки Drosophila, где пол определяется балансом (соотношением) числа X хромосом и аутосом: ХО мухи - самцы, а ХХУ мухи - самки.
Значительным вкладом в цитогенстику млекопитающих стала гипотеза Мэри Лайн о сохранении активности в каждом организме и клетке лишь одной Х-хромосомы, предложенная в 1961 году (Lyon, 1961). Согласно этой гипотезе причиной мозаичного эффекта является инактивация одной из двух X хромосом на ранней эмбриональной стадии. У дрозофилы этот эффект был впервые продемонстрирован лишь в 1979 году (Henikoff, 1979).
Оперируя классификацией Уайта, этот этап развития хромосомного анализа можно условно отнести к бэта - кариологии. С конца 60-х годов можно очертить временные границы еще одного этапа развития хромосомного анализа, который соответствует гамма -кариологии по Уайту. Это появление методов дифференциальной окраски хромосом, позволившей выявлять специфические участки продольной дифференцированности хромосом.
III. Дифференциальное окрашивание хромосом.
1. Q-дифференциальнос окрашивание (Q-бэндинг).
Решающий вклад в развитие этой области науки внесли работы, выполненные в конце шестидесятых годов прошедшего столетия профессором Торбьёрном Касперсоном (рис.6) и его сотрудниками в Нобелевском институте медицинских исследований и генетики (The Nobel Institute for Medical Cell Research and Genetics), входившем в состав знаменитого Каролинского медицинского университета Стокгольма (Karolinska Institutet).
В начале 1968г. в весьма престижном в то время журнале «Experimental Cell Research» появилась статья группы авторов во главе с Касперсоном (Caspersson ct al, 1968) "Химическая дифференциация по длине метафазных хромосом (Chemical differentiation along metaphase chromosomes)". К этому времени имя Касперсона было уже широко известно в науке. В конце 30-х - начале 40-х годов им (параллельно с бельгийским исследователем Жаном Браше) была сформулирована концепция об определяющей роли нуклеиновых кислот в биосинтезе белка. Изучая поглощение ультрафиолетового излучения клетками, Касперсон установил наличие несомненной корреляции между синтезом РНК и белка. Проведенные им измерения содержания нуклеиновых кислот и белка в различных частях клетки позволили выдвинуть гипотезу о том, что рибонуклеиновая кислота несет поток информации для синтеза белка. Это было сделано тогда, когда основная часть ученых мира придерживалась представлений о белках как хранителях и переносчиках генетической информации, т.е. задолго до того, как была сформулирована так называемая центральная догма молекулярной биологии. 1
Рис.6. Торборн Касперсон, 1971 г.
Осуществление этих исследований было бы невозможным без специальной аппаратуры, которая и была сконструирована под его руководством. Работа по совершенствованию этой аппаратуры постоянно продолжалась в группе Касперсопа, в результате чего к середине 60-х годов был создан комплекс специальных сверхточных цитофотометров и цитофлуориметров, позволявших получать количественные физические характеристики клеток и отдельных клеточных структур, включая хромосомы, в первую очередь определять в них содержания нуклеиновых кислот и белка.
С помощью этих приборов, конкретнее сканирующего цитофотометра (Carlson et al., 1963), и приступил Касперсон к решению своей задачи, которая была сформулирована как определение химической неоднородности по длине метафазной хромосомы.
В качестве исходной посылки было взято предположение^что алкилирующие агенты (иприты) могут избирательно взаимодействовать с гуанином в составе ДНК и связываться в повышенном количестве в участках, обогащенных этим основанием. Такие связавшиеся с хромосомой флуоресцентные агенты (флуорохромы) могли быть обнаружены с помощью микрофлуорометрии. Это позволило бы увидеть хромосомные локусы с высоким содержание гуанина.
Для проверки этой гипотезы были взяты два акридиновых соединения: акрихин (antimalarial quinacrine) и его производное акрихин-иприт (quinacrine mustard). Акрихин1 как флуорофор был избран из-за его выгодных спектральных свойств (яркая зеленая флуоресценция, возбуждаемая синим светом) и способностью соединяться с ДНК, подобно
1 Производное акридина - 3-хлор-9-(4-дштиламино-1-метилбутиламино)-7-метоксиакридин было синтезировано в начале 30-х годов в качестве потенциального противомалярийного препарата (Schulemann, 1931; Mauss, Mietzsch, 1933) и получило название атебрина (atebrin). В середине 30-х годов в СССР был налажен выпуск этого препарата под названием акрихина. Это название вскоре был присвоено заводу, и в значительной степени слово "Акрихин" стало знаменем советской химико-фармацевтической промышленности. В англоязычных странах препарат известен под названием куинавкрина (Quinacrine). Подробнее см. Alberts (1966) и Зеленин (1971). В сороковые - пятидесятые годы акрихин широко использовали в мире, включая нашу страну, для лечения и профилактики малярии. другим амипопроизводным акридина. Присоединение к акрихину группы азотистого иприта придало ему дополнительную способность связываться с гуанином (точнее с его азотом в 7-ом положении) с образованием прочного ковалентного комплекса.
В качестве объекта исследования были взяты хромосомные препараты растений и животных (китайский хомячок). Основная часть работы была проведена на хромосомах конских бобов Vicia faba из-за их крупных размеров. Оказалось, что в результате обработки препаратов раствором акрихина (50 мкг/ мл, рН 7.0) метафазпые хромосомы приобретали диффузную зеленую флуоресценцию без каких-либо различий в ее интенсивности в отдельных участках хромосомы. Исключение составил узкий участок в районе центромеры М-хромосомы V.faba.
Подобно акрихину, акрихин-иприт придавал диффузную флуоресценцию хромосоме по всей длине. На этом фоне четко выделялись легко различимые центромерный регион и область спутника, обладавшие ярким свечением. Сходная картина наблюдалась и на хромосомах китайского хомячка.
Хотя интенсивность флуоресценции не была определена количественно, фотографии ясно указывали на наличие участков с высокой способностью связывания с акрихин-ипритом. Это в равной мере относилось как к растительным, так и к животным метафазным хромосомам.
На примере М - хромосомы V. faba с помощью количественной абсорбционной цитометрии было показано, что участки хромосом, приобретающие яркую флуоресценцию после окраски акрихин-ипритом, содержат такое же количество ДНК, как и ее районы, имеющие слабую флуоресценцию. Было высказано мнение, что акрихин связывается с ДНК благодаря встраиванию акридинового ядра в двойную спираль ДНК и ионного взаимодействия боковой диаминоалкановой цепи с ее фосфатными группами. У акрихин-иприта к этому добавлялась способность специфически связываться с атомом азота в положении 7 гуаниана. Последнее обстоятельство и приводило, но мнению авторов, к интенсивной флуоресценции районов хромосом, обогащенных гуанином.
Было изучено влияние этих флуорохромов на частоту хромосомных разрывов. Эксперименты с V.faba показали, что хромосомные разрывы происходят преимущественно в трех хорошо различимых участках рядом с центромерой. Под влиянием акрихина-иприта наблюдалось большое число хромосомных разрывов, т.е. было обнаружено действие, характерное для алкилирующих соединений. В то же время акрихин хромосомных разрывов не индуцировал.
Была прослежена связь между локусами, связывающими акрихин-иприт, и гстерохроматином. Гетерохроматиновые локусы в хромосомах Trillium, выявляющиеся в результате холодовой обработки (холодовой гетерохроматин), соответствовали локусам, связывающим повышенные количества акрихин-иприта.
Было сделано заключение, что акрихин-иприт связывается избирательно, дискретно, флуоресцентно метя как растительные, так и животные хромосомы и что химически активные участки хромосомы могут быть различены (дифференцированы) по длине оси хромосомы, благодаря использованию микрофлуоромстрической техники в сочетании с микроспектрофотометрическим определением количества ДНК. В заключении работы авторы предположили, что исследования по использованию флуоресцентных агентов помогут в дальнейшем разобраться в функциональной структуре метафазных (и интерфазных) хромосом.
Статья 1968 года по праву может быть названа основополагающей. Она послужила мощным стимулом для изучения хромосом различных организмов и развития хромосомных технологий многочисленными исследователями и исследовательскими группами. Работы проводились в нескольких направлениях: 1. Проверка полученных результатов.
2. Использование дифференциального окрашивания для изучения хромосом разнообразных организмов, в первую очередь человека
3. Выяснение природы дифференциального окрашивания.
1. Создание новых методов дифференциального окрашивания.
Разумеется это деление достаточно условно, и авторы многих работ рассматривали и решали эти вопросы одновременно.
Естественно, что в первую очередь были продолжены работы самого Касперсона. В 1969 году выходят статьи (Caspersson et al., 1969а; Caspersson et al., 1969b), в которых идея использования флуорохромов получила свое развитие. Объектом исследования вновь послужили хромосомы конских бобов (Vicia faba) на стадии метафазы. Метафаза имеет серьезные техническое преимущества, т.к. является стадией, на^которой возможно прямое наблюдение за взаиморасположением генных комплексов и генных групп в геноме. Была поставлена задача получить количественную информацию о распределении ДНК по длине хромосомы и, по возможности, данные о распределении разных типов белков в различных участках хромосомы. Особенно интересным было, по мнению авторов, изучение гистонов из-за их почти универсальной встречаемости и возможной роли в генной репрессии.
Так как метафазные хромосомы малы по своим размерам, необходимо было иметь высокоразрешающую оптическую и измерительную технику. Был сконструирован ультрамикроспектрофотометр для фотоэлектрической регистрации. Прибор был специально создан для данной работы, причем была усовершенствована его механическая часть не только для достижения высокой точности, но и с целью быстрого сканирования хромосомы по всей длине с интервалом в 0.2мкм с минимумом экспозиции в коротковолновой области ультрафиолетового света.
Vicia faba (2п=12) содержит несколько типов хромосом - одна пара больших хромосом с медианной перетяжкой и спутником (М-хромосома) и пять пар коротких хромосом (S - хромосомы). После обработки акрихин -ипритом все метафазные хромосомы приобретали зеленую флуоресценцию (рис.7).
Рис.7. Метафазные хромосомы после обработки акрихин-ипритом; фотоЗ. - Хромосомы V.faba, окрашенные акрихин-ипритом. Метафазная пластинка, хЮОО (фотоЗ. - фотоб. - Caspersson etal, 1968); фото4. - М-хромосома V.faba. окрашенная акрихин-ипритом. х2000 и распределение ДИК; фото5. - Хромосомы китайского хомячка, флуоресцентная метафазная пластинка, xl 400; фотоб. - Хромосомы Trillium erectum: а - нормальные; б -флуоресцентные; в - подвергнутые холодовому голоданию, xl 100
При длине волны 530 им была измерена интенсивность свечения сильно флуоресцирующих участков (бэндов, от английского слова band - полоска) и сравнена с флуоресценцией остальных участков хромосом. Параллельно были получены диаграммы распределения ДНК по длине хромосом путем микроспекгрофотометрии в ультрафиолетовой области (265 нм) и при 546 нм для образцов, окрашенных по Фельгену.
Измерения четко показали, что распределение ДНК поразительно однородно по разные стороны от центромеры и в районе вторичной перетяжки. Таким образом было подтверждено заключение, сделанное в первой публикации, о том, что яркая флуоресценция бэндов не является следствием повышенного содержания в них ДНК.
Помимо Vicia были изучены хромосомы Trillium erectum, Scilla sibirica, Lilium candidum, Lilium martagon, Hyacintus spp., Ac tea spp., Pisum sativum, Allium сера и Crepis capillaris. Из класса млекопитающих в качестве объекта исследования были взяты фибробласты китайского хомячка. В их мстафазных хромосомах было выявлено большое число бэндов, выделявшихся яркой флуоресценцией на фоне слабо флуоресцирующих остальных участков хромосом.
Почти сразу же за получением первых картин дифференциально флуоресцентно окрашенных хромосом Каспсрсон с сотрудниками приступили к использованию разработанного метода для изучения хромосом человека (Caspersson ct al., 1970а). Оказалось, что при воздействии акрихин-ипритом в метафазных хромосомах из культуры клеток крови проявляется четкая картина дифференциального окрашивания с отчетливо выраженными бэндами.
Наиболее яркая, постоянная и воспроизводимая флуоресцентная картина была обнаружена в 3, 13-15 и Y хромосомах. Как и на растительном материале, изученном ранее, образцы обладали характерными бэндами, которые могли помочь в идентификации хромосом. Внимание ученых привлекла также возможность использования акрихин-иприта для исследования интерфазных ядер (Caspersson et al., 1970b). Дистальная часть Y хромосомы при окрашивании акрихин-ипритом интенсивно флуоресцировала, и это свойство, по мнению авторов, могло быть успешно применено для идентификации ее в интерфазных ядрах (детерминация пола). После некоторых усовершенствований этот метод получил широкое распространение в работах по определению пола в пренатальной диагностике, а также у взрослых субъектов в судебной и спортивной медицине.
В последующих работах (Caspcrsson ct al., 1970с, 1970е) группа Каспсрсона исследовала почти 5000 хромосом от 14 индивидуумов и распределила их по типам в соответствии с принятой ранее классификацией, основанной на измерении длины хромосомы, цснтромерного индекса и времени репликации. В результате была продемонстрирована возможность идентификации всех хромосом человека и была разработана их новая классификация, включающая в себя распределение флуоресцирующих бэндов в индивидуальных хромосомах.
Хотя большинство хромосом на хороших препаратах, окрашенных акрихин-ипритом, можно было идентифицировать визуально, авторы предложили измерять интенсивность флуоресценции по длине хромосом (фотоэлектрическая регистрация). Метод фотоэлектрической регистрации (Caspersson et al., 1970с, 1970g, 1970е, 1971b) оказался трудоемким, требовал много времени и соответствующего оборудования. Поэтому в последующих работах Касперсон с сотрудниками остановили свой выбор на методе телевизионного контрастирования (Caspersson et al., 1970f, 1971c, 1972c), т.е. на возможности получения более контрастного изображения с фотографии или прямо с флуоресцентного микроскопа.
Очень скоро оказалось, что Q - метод (от англ. "quinacrine"), позволивший проводить полную идентификацию хромосом человека, значительно расширил возможности хромосомного анализа, в частности для диагностики некоторых наследственных заболеваний. Так были изучены хромосомы В группы и обнаружено, что при синдроме "кошачьего крика" дистальная часть короткого плеча 5 хромосомы отсутствует (Caspersson et al., 1970d).
Было сделано заключение, что техника дифференциальной окраски помогает в локализации хромосомных разрывов и границ обменов при различного вида аберрациях (Caspersson et al., 1971b). Для подтверждения этого предположения авторы исследовали 500 метафаз (более 20000 хромосом), полученных при рентгеновском облучении лимфоцитов человека (Caspersson et al., 1972b). Было обнаружено большое число аберраций (транслокации, делеции), в то время как инверсии и дупликации были сравнительно редки. Авторы отметили, что разрешение флуоресцентного метода настолько велико, что возможно достаточно точно локализовать точку разрыва. Наибольшее число разрывов лежало в более бледных (тусклых) областях хромосомы, расположенных между сильно (интенсивно) светящимися бэндами.
Рисунок флуоресценции хромосом был специфичен и воспроизводим, а в дальнейшем выяснилось, что и идентичен в разных тканях организма (Caspersson et al., 1972а). Было проведено сравнение хромосом различных тканей некоторых видов растений, а также человеческих хромосом из разных тканей организма. Не было выявлено различий между хромосомами из кончиков корешков и хромосомами клеток эндосперма Vicia. С целью проведения подобного анализа хромосом человека было изучено около 50 метафазных пластинок из костного мозга, кожи, половых желез и амниона. Сравнение фотографий показало идентичность расположения Q-бэндов и не выявило различий в картине флуоресценции хромосом различных тканей. Заключением этой блистательной серии исследований стала итоговая статья о полной идентификации всех 24 хромосом генома человека (Caspersson et al., 1972е). Очень скоро этот метод (Q-бэндииг) нашел широкое применение в цитодиагностике генетических заболеваний человека.
Работы Касперсоиа и его группы легли в основу знаменитой Парижской номенклатуры хромосом человека, принятой в 1971 (Paris conf., 1971). Этой номенклатурой с тех пор руководствуются генетики и цитогснстики всего мира. Па ее основании были выбраны и наши "российские хромосомы" в период организации отечественной программы "Геном человека".
На рис. 8 (идиограмме) представлен кариотип «полосатых» хромосом человека, обозначенный согласно требованиям
Politivt о ( G Bandi H*(«tiv* R B«nd>
Рис.8. Идиограмма хромосом человека (согласно парижской номенклатуры. Парижской номенклатуре).
Теломеры, центромеры, и некоторое число постоянных четко выраженных бондов используются как маркеры. Участки хромосом между двумя маркерами носят название регионов, и они пронумерованы последовательно 1, 2, 3, и т.д. в обоих (р и q) плечах в направлении от центромеры к теломере. Нумерация полос (бэндов) внутри регионов подчиняется тем же правилам. Разработка и активное использование высокоразрешающего бэндинга привело к необходимости уточнения существующей номенклатуры. Наиболее поздние данные по номенклатуре были обобщены- ISCN - International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 1995.
Различия между старой и новой системами можно проиллюстрировать следующим примером. На рис. 9 представлена идиограмма 14ой хромосомы. Согласно Парижской номенклатуре, бэнд 14q32 означает М5™ хромосому, длинное
BAND 14q32 SU8BAND14q32.3
SUBBAND I4q32.33
Рис.9. 14м хромосома человека (ISCN номенклатура, 1995). плечо, регион 3, бэнд 2. При использовании высоко разрешающего бэндинга удалось подразделить данный бэнд натри, и самый крайний бэнд - обозначен как 14q32.33.
Работы группы Касперсона совпали с другим важным методическим открытием -получением гибридов соматических клеток человека и грызуна, в которых избирательно элиминируются хромосомы человека (Caspersson et al., 1971а). Возможность простой и надежной идентификации хромосом позволила использовать такие гибриды для локализации на хромосомах человека различных биохимических маркеров и соответственно кодирующих эти белки генов. Работы по картированию хромосом человека получили стремительное развитие. Уже к 1975 году на индивидуальных хромосомах человека было локализовано более 70 генов (Ringertz and Savage, 1975). Полученные с помощью этого подхода монохромосомные и радиационные гибриды по настоящее время широко используются для генетического и физического картирования геномов человека и других организмов.
Параллельно проводилось изучение химической природы флуоресцентных бэндов. Здесь исследователи столкнулись со значительными трудностями. Как уже упоминалось, в своей первой работе Касперсон с сотрудниками предположили, что ярко флуоресцирующие бэнды, появляющиеся при обработке препаратов акрихин-ипритом, представляют собой участки ДНК, обогащенные ГЦ последовательностями. Это предположение, однако, не нашло подтверждения. С одной стороны оказалось, что акрихин, лишенный алкилирующей группы азотистого иприта, при повышенных (в 50-100 раз) концентрациях и других условиях обработки, чем использовались в первой работе, тоже дает четко выраженную картину дифференциальной исчерченности. Интенсивность флуоресценции па единицу площади хромосомы была по крайней мере в пять раз ниже в образцах с акрихином, чем с акрихин-ипритом. Поэтому во флуоресцентном микроскопе Q-бэпды при окраске акрихином всегда выглядели менее четко, чем в препаратах с акрихин-ипритом (Caspersson et al., 1969а). Наконец, узкие полосы в S - хромосоме Vicia faba, которые наблюдали в образцах е акрихин-ипритом, не удавалось выявить в препаратах с акрихином. Для М-хромосом эти регионы соответствовали гетерохроматиновым, выявленным с помощью методики холодовой обработки.
С другой стороны, было показано, что яркая флуоресценция Q - бэндов связана с наличием в этих участках хромосом последовательностей, обогащенных AT - повторами (Weisblum and De Haseth, 1972; Comings, 1978). Особый интерес представлял поиск GC- и ЛТ-специфичных флуорохромов для выявления гетерохроматических районов хромосом. Специфичность Q-бэндов к AT- обогащенным участкам ДНК была доказана в опытах с акрихином, акрихин ипритом и профлавином (Weisblum and De Haseth, 1972; Ellison, Barr, 1972). Подобно другим соединениям аминоакридииа, акрихин равномерно связывается с ДНК вне зависимости от ее нуклеотидного состава; но в участках, обогащенных AT парами, его флуоресценция значительно возрастает. В последующие годы, с появлением новых флуорохромов, избирательно связывающихся с AT участками (Hoechst-33256 и DAPI), специфичность Q - бэндов к AT- основаниям экспериментально^ подтверждена, если можно так выразиться, впрямую. Это ни в коей мере не отразилось на применении метода флуоресцентного дифференциального окрашивания для изучения хромосом растений, человека и других объектов. Более того, через некоторое время было обнаружено, что флуорохромы митромициновой группы, специфически связывающиеся с ГЦ парами оснований, дают картину окрашивания, обратную Q - бэндингу. Так на хромосомах трех видов растений (конские бобы Vicia faba, пролеска Scilla siberica и Ornithogalum caudatum) при обработке хромомицином Аз и близким ему митрамицином (GC- специфичность), а также DAPI (AT- специфичность), гетерохроматические участки (С-бэнды), и районы ядрышкого организатора показывали очень яркую флуоресценцию с хромомицином Аз и митромицином, в то время как с DAPI эти сегменты флуоресцировали тускло (Schweizer, 1976). В частности, крупные блоки интеркалярного и тсломерного гетерохроматина хромосом Scilla siberica ярко флуоресцировали после обработки хромомицином Аз и митромицином, но оставались DAPI негативными. На хромосомах Vicia faba и Ornithogalum caudatum яркие хромомициновые бэнды по типу Scilla siberica отсутствовали. А на Ornithogalun caudatum после обработки DAPI были выявлены большие участки ярко окрашенного гетерохроматина. Это позволило автору выдвинуть новые аргументы в пользу того, что "интеркалярный бэндинг" обусловлен различиями в нуклеотидпом составе ДНК по длине хромосомы.
Работы группы Касперсона послужили толчком для изучения хромосомной дифференциации другими исследователями. Так в 1970 году Воза (Vosa, 1970) повторил работу Касперсона на конских бобах Vicia faba, Tulbaghia, Allium сера, Allium carinatum, a также изучил картину флуоресцентного распределения флуорохромов (акрихин, акрихин-иприт и акрифлавин) в культуре фибробластов и лейкоцитов человека. Проводились эксперименты по окрашиванию акрихином хромосом Drosophila melanogaster. При выявлении гетерохроматиновых участков с помощью флуорохромов, Воза отметил, что некоторые типы производных акридина можно успешно применять для получения хромосомных маркеров и изучения химических различий эухроматина и гетерохроматина.
Об актуальности разработки Q - метода говорит тот факт, что подобного рода работы начали одновременно проводиться во многих лабораториях, в том числе и у нас в стране. В частности активная работа по изучению хромосом флуоресцентным методом велась в лабораториях А.А. Прокофьсвой-Бельговской и А.В. Зеленина, начиная с 1971 года (Иорданский и др., 1971; Бадаев и др., 1973).
Сейчас флуоресцентный бэндинг - рутинная техника идентификации хромосом животных и растений (Hansen, 1982 - окрашивание акрихин ипритом, идентифицированы все хромосомы домашней свиньи Sus scrofa domestica).
Подводя итоги сказанному в этой главе, надо отметить, что:
1. Благодаря Q-окраскс стало возможной идентификация всех без исключения хромосом человека.
2. Q - бэндинг открыл возможность для идентификации индивидуальных хромосом животных и растений (по крайней мере некоторых).
3. Был внесен определенный вклад в выявлении химической специфичности по длине хромосом. Однако как упоминалось выше, вопреки первоначальному предположению, Q-окраска позволила выявить не гуанин-содержащие участки хромосом, а участки обогащенные АТ-повторами, причем кластсрно в виде 3-4 и более АТ-пар подряд. Впрочем, казавшийся в начале 70-х годов практически ясный вопрос о природе G- бондов до конца не решен и по настоящее время.
В заключение целесообразно рассказать о реакции А.А. Прокофьевой-Бельговской на появление статьи Касперсона с соавторами в 1968 году. Как вспоминает А.В. Зеленин (Зеленин, Зощук, 2000), ранним летом 1968 года в комнате 343 дома№ 34 по улице Вавилова Института молекулярной биологии под руководством А.А. Прокофьевой-Бельговской собралась группа молодых цитогенстиков (Ю.Ф. Богданов, B.iM. Сипдилис, А.Б. Иорданский и некоторые другие) для обсуждения только что вышедшей статьи Касперсона и соавторов. В качестве специалиста по флуоресцентному анализу и флуорохромам на семинар был приглашен А.В. Зеленин. Собравшиеся довольно быстро разобрали суть статьи, се вывод об открывающихся новых перспективах для изучения структуры хромосом произвел большое впечатление. И несколько странным прозвучало при этом заключительное замечание Александры Алексеевны о том, что разработанный подход может решить проблему полной идентификации хромосом человека. Кое-кто даже недоуменно переглянулся. Как будет ясно из дальнейшего изложения, жизнь подтвердила блестящий прогноз отого выдающегося ученого.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зощук, Наталья Викторовна
Выводы.
1. Ключевыми этапами развития хромосомного анализа можно считать выявление и описание хромосом, разработку и совершенствование методов приготовления препаратов, консервирующих жидкостей (фиксаторов) и красителей, создание современных методов дифференциального окрашивания, гибридизации in situ, систем компьютерного анализа изображения и т.п. Развитие хромосомного анализа шло параллельно созданию новых технологий и развитию новых областей знаний.
2. Появление новых и развитие существовавших технологий зачастую шло одновременно, поэтому обозначить четкие временные границы отдельных этапов хромосомного анализа в целом невозможно. В то же время, при классификации хромосомного анализа следует исходить из прогресса в области изучении хромосом человека, как наиболее хорошо и всесторонне изученного объекта.
3. Показано, что в начале становления хромосомного анализа первостепенную роль играли совершенствование микроскопирования и технологий работы с препаратами. Позже все более существенное влияние на развитие цитогенетики стали оказывать знания об объекте, т.е. создание новых методов, а также выбор наиболее адекватных поставленным задачам технологий осуществляется целенаправленно, а не подбирается эмпирически.
4. Современный хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Это определение кариотипа, составление идиограмм, идентификация хромосом с использованием дифференциального окрашивания, гибридизации in situ, анатиза изображения, определение локализации отдельных генов и их семейств и т.п.
5. Для выбора адекватного объекта и методов для решения конкретных задач цитогенетики чрезвычайно важно знание истории хромосомного анализа. В связи с этим, проведена систематизация современных методов хромосомного анализа и составлен справочный материал, облегчающий выбор адекватных методов хромосомного анализа применительно к решению поставленных задач.
Заключение.
Хромосомный анализ в геномную эру.
Конец двадцатого и начало двадцать первого столетия ознаменовались революционизирующими изменениями в биологической науке, связанными с расшифровкой полных нуклеотидных последовательностей ДНК ряда организмов (см. Зеленин и др., 2001; Зошук идр., 2004). Среди них микроорганизмы, содержащие геномы сверхмелких и мелких размеров: вирусы, бактерии (в том числе возбудитель сибирской язвы - Enserink, 2002), дрожжи (в том числе почкующиеся - Eiser, 2002) и некоторые простейшие, а также организмы с геномами средних размеров - дрозофила, круглый червь (цинорабдитис) и мелкое двудольное растение арабидопсис. Опубликованы результаты секвенирования генома человека (draft sequence) и значительно более подробного и близкого к завершенжосеквенирования пяти самых мелких (14, X, 22, 21, и 20) его хромосом, по детальности, по-видимому, приближающегося к таковому для геномов цинорабдитиса и арабидопсиса.
В качестве иллюстрации интересно привести примерные цифры, характеризующие размеры гаплоидных наборов некоторых организмов: кишечная палочка (Escherichia coli) - 4.5 млн.п.н.; дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) - 45 млн.п.н.; круглый червь нематода (Caenorhabditis elegance) - 97 млн.п.н.; мелкое цветковое растение класса двудольных Резушка Таля (Arabidopsis thaliana) - 125 млн.п.н.; фруктовая мушка (Drosophila mclanogaster) - 180 млн.п.н.; костистая рыба фуго (Fugu rubripes) - 365 млн.п.н.; рис (Oriza sativa) - 430 млн.п.н.; человек (Homo sapiens) - 3.4 млрд.п.н.; рожь (Secale cereale) - 8млрд.п.н., ячмень (Hordeum vulgare) — 5 млрд.н.н., диплоидная пшеница (Triticum monococcum) - 6-7 млрд п.н.; тетраплоидная пшеница (Triticum durum) - 12 -13 млрд.п.н.; гексаплоидная пшеница (Triticum aestivum)- 16 млрд.п.н.; лилейные (Lilium) - около 50-125 млрд.п.н. (Flavell, Smith,1976; Flavell et al., 1977; Flavell et al., 1979; Bennett, 1998; Bevan, Murphy, 1999; Hodkin, 2000).
В августе 2002г. опубликованы сведения об осуществлении черновой работы по секвенированию (draft scqucnce) генома риса (Bevan, 2002), осуществленном двумя исследовательскими группами - в Китае и США, а также мелкой костистой рыбы фуго (Fugu rubripes) [Aparicio et al., 2002]. Объявлено о проектах по полному секвенированию геномов ряда других организмов, включая малярийного плазмодия, малярийного комара и мухи це-це. Неоднократно заявлялось о начале и успешном развитии работ по секвенированию крупных и сверхкрупных геномов злаков (7 - 12 млрд. п.о.).
Развертывание работ по массовому секвенированию геномов различных организмов стало мощным стимулом для создания принципиально новых технологий. Оно оказало огромное влияние на смежные, а порой и достаточно отдаленные области биологии и медицины. Основополагающее значение сыграла при этом международная программа "Геном человека".
В связи со сказанным представляется целесообразным рассмотреть состояние, хромосомного аиализа в геномную эру. Особое внимаиие будет уделено следующим проблемам:
1) Роль хромосомных исследований в развитии генетики, геномики и секвенировании эукариотических геномов.
2) Влияние, которое оказали и окажут в обозримом будущем, геномные исследования и новые геномные технологии на хромосомный анализ и его технологическое обеспечение.
3) Место, которое будет занимать хромосомный анализ в геномных исследованиях ближайшего будущего.
1) Роль изучения хромосом и хромосомного анализа в развитии геномики и секвенирования геномов.
Основополагающая роль науки о хромосомах в развитии генетики и геномики не вызывает сомнений. Коротко она состоит в следующем:
1) Определение роли хромосом как клеточных структур - носителей генетической информации.
2) Понятие о кариотипе как о совокупности признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор.
3) Поиятие генома. Термин "геном" в цитогеиетичсском смысле был предложен в 1920 г. (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом и суммы всех генов в наборе (Ригер, Михаолис, 1967). В наше время под геномом подразумевается совокупность вссх генов, содержащихся в организме, и негениых ДНК-структур (некодирующих повторов), т.е. вся ядерная ДНК, которая входит в состав хромосом. Часто говорят и о цитоплазматическом геноме (или плазмопе), охватывающем ДНК митохондрий и пластид, однако это выходит за пределы рассмотрения дайной работы.
4) Понятия о гаплоидных, диплоидных и полиплоидных организмах.
5) Понятия об анеуплоидии, различных хромосомных абберациях (делениях, транслокациях, инсерциях, дупликациях и т.д.).
Был разработан комплекс методов по детальному изучению структуры и функций хромосом, получивший название хромосомного анализа. Круг методов и подходов хромосомного анализа и его история возникновения были детально рассмотрены выше. Современный хромосомный анализ представляет собой не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте.
По мере развития представлений о структуре и функции хромосом и детального описания кариотипов различных организмов открывались возможности хромосомно-гсистичсского картирования геномов, т.е. локализации конкретных генов на отдельных хромосомах и их участках. В течение длительного времени такие работы осуществлялись путем установления взаимосвязи между утратой того или иного генотипического признака и изменением морфологии хромосом.
Большое количество таких исследований было проведено на дрозофиле. Короткий жизненный цикл и возможность быстрого получения в результате скрещивания особей с измененными генетическими свойствами, с одной стороны, и наличие политенных хромосом, доступных для детального морфологического исследования даже с помощью примитивных методов микроскопического анализа, с другой, сделало эти организмы чрезвычайно удобным объектом для установления таких корреляций (Ананьев, Барский, 1985).
Постепенно подобные исследования стали проводить на других организмах, в частности на человеке. Это стало возможным после детального описания кариотипа человека (Tjio, Lcvan, 1956). Позже благодаря применению целого ряда методик (использование в качестве материала культуры клеток, гипотонического раствора, фитогемагглютинина, приготовление препаратов из интактных клеток) были выявлены и другие структурные особенности аутосом и половых хромосом человека, определяемые их размерами, положением центромеры, наличием вторичных перетяжек и спутников.
Особое значение имела разработка методов приготовления препаратов. Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали на тканевых срезах. Техника получения срезов была такова, что готовые препараты, как правило, содержали разрушенные митозы, хромосомы накладывались одна на другую, образуя клубки, плохо поддающиеся анализу. Эти трудности были преодолены благодаря разработке технологий, основанных на использовании суспензий клеток, из которых можно было получать тонкие «давленные» препараты без приготовления срезов. Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии. При этом дополнительно стали использовать протеалитические ферменты - трипсин, коллагеназу или гиалуронидазу - с целью дезаггрегации образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток.
Резкая интенсификация работ по картированию генома человека произошла в конце 60-х -самом начале 70-х годов прошлого века. Это стало возможным в результате двух почти одномоментных событий - развитию метода дифференциального окрашивания хромосом (Q- и G-бэндинг), позволившего легко и надежно идентифицировать под микроскопом все индивидуальные хромосомы человека и их отдельные части (Caspersson et al., 1968; Sumner et al., 1971; Sumner, 1972), и метода искусственной гибридизации клеток человека и других животных (см. Рингсрц, 1979). С помощью последнего подхода удалось получить активно пролифсрирующие гибридные клетки, образовавшиеся в результате слияния соматических клеток человека и грызунов (хомячок или мышь). Оказалось, что при последовательных делениях таких гибридных клеток в них постепенно утрачиваются хромосомы человека, а кариотип грызуна остается при этом неизменным. Электрофоретическое изучение маркерных белков позволяло при этом выявить утрату в гибридном клоне того или иного белка человека, а анализ дифференциально окрашенных хромосом увязать это событие с конкретной хромосомой человека.
В результате использования этого подхода уже к середине 70-х годов прошлого века на индивидуальных хромосомах человека были клонированы многие десятки тысяч генов. В ряде случаев хромосомы человека утрачивались в гибридных клетках не полностью. При этом в клетках оставались небольшие, но идентифицируемые с помощью дифференциального
•v. окрашивания фрагменты хромосомы, что позволяло осуществлять картирование генов на определенном участке хромосом. Возможности такого исследования резко расширились с разработкой техники так называемых радиационных гибридов. Для слияния брали клетки человека, предварительно подвергнутые воздействию ионизирующего облучения. В результате в гибридных клетках появлялось множество мелких фрагментов хромосом человека.
Параллельно с изучением геномов методами хромосомных технологий, с середины 70-х годов началось прямое изучение последовательностей ДНК путем ссквснирования отдельных клонированных генов и анонимных последовательностей. Получение таких фрагментов ДНК резко расширило возможность прямого физического картирования генома с помощью локализации генов на хромосомах методом гибридизации in situ, сначала в радиоактивном (Gall, Pardue, 1969; John ct al., 1969), а впоследствии флуоресцентном варианте (Pinkcl ct al., 1986; Lichter ct al., 1990; Wiegant et al., 1991). Последний метод, получивший название FISH (fluorescence in situ hybridization), приобрел за прошедшие годы широчайшее распространение и стал одним из важнейших, а во многих случаях основным методом прямого, так называемого физического картирования генов на хромосомах.
Развитие и усовершенствование методов секвснирования протяженных участков ДНК и создание разнообразных технологий клонирования позволило уже в середине 80-х годов XX века поставить задачи тотального секвснирования организмов, сначала прокариотических, а вскоре и эукариотических. Однако большинство геномов этих организмов оказались слишком протяженными, чтобы их клонирование, картирование и ссквенированис было осуществление впрямую, без предварительного разбиения на части. С особой остротой эта проблема возникла в тот момент, когда перед наукой была поставлена задача тотального секвснирования генома человека, состоящего из 3.2 млрд пар нуклеотидов .
Наиболее простым и очевидным способом разбиения генома человека на части может служить его похромосомнос разделение. Однако, это оказалось непростым делом, для которого понадобилось использование всего арсенала методов хромосомного анализа, имевшегося к этому N времени. Самым прямым подходом стало выделение чистых или практически чистых фракций хромосом с помощью проточной цитофлуориметрии. Такое разделение основывается на результатах связывания индивидуальными хромосомами AT и GC-спсцифичных флуоресцентных красителей (Hoechst 33258, DAPI, антибиотиков митромициновой группы и 7-актиномиципа Д), т.е. по-существу на результатах хромосомного бэндинга. С помощью этой технологии удалось выделить фракции индивидуальных аутосом 1-8 и 13-22 человека и обеих половых хромосом (X и Y).
Параллельно технологии проточной флуориметрии широкое распространение получило использование гибридов соматических клеток. Были созданы панели гибридных клеток хомячка (или мыши) и человека, содержащие полный набор хромосом грызуна и индивидуальные хромосомы человека. Комбинируя эти подходы, оказалось возмржным заполнить вышеупомянутый пробел (9-12 хромосомы) и получить индивидуальные фракции всех 24-х хромосом человека.
С помощью двух рассмотренных методов довольно быстро удалось получить геномные библиотеки, содержащие клонотеки всех индивидуальных хромосом человека. Эти клонотеки результат исследования нескольких ведущих лабораторий мира, стали доступны всем ученым, работающим над секвенированисм и картированием генома человека, и легли в основу дальнейших успехов, включая черновой сиквенс генома человека. В последующие годы с помощью метода сортировки в потоке были получены геномные библиотеки из индивидуальных хромосом большого числа домашних и диких животных, что открыло широкие возможности для анализа геномов этих организмов.
Третья технология получения геномного материала из индивидуальных хромосом и их фрагментов для последующего клонирования основывается на методе микродиссекции (Scalenghe et al., 1981), о котором подробно говорилось ранее.
Широкое применение метод микродиссекции нашел при исследовании хромосом человека и животных, особенно для создания молекулярных маркеров ко многим
V; наследственным заболеваниям человека.
Примером успешного использования метода микродиссекции для исследования эволюции хромосом животных является работа Н. Рубцовой (Рубцова, 2001).
Микродиссекция и микроклонировапис как методы изучения генома, являются гибкими и эффективными способами выделения и анализа ДНК, создания геномных бибилиотек и получения ДНК маркеров для любых участков хромосом.
Значительную роль метод микродиссекции сыграл и будет играть в изучении геномов других организмов, для которых плохо применима техника выделения фракций индивидуальных хромосом, в частности и в первую очередь, геномов растений.
Особое место занимают исследования по секвенированию генома риса (Kharb et al., 2001; Butler, 2002). Геном этого чрезвычайно важного в хозяйственном отношении растения составляет 460 млн п.о., и его секвенирование интенсивио проводится в течение нескольких лет. При этом, подобно геному человека, для этих целей используется стратегия похромосомного картирования. Кариотип риса состоит из 10 пар индивидуальных хромосом. Получение хромосом-специфичных библиотек было осуществлено с помощью метода лазерной микродиссекции. Опубликованы детальные карты секвенирования значительной части генома риса.
На фоне этих многолетних весьма трудоемких исследований сенсацией стало сообщение об осуществлении двумя исследовательскими группами чернового секвенирования (draft sequence) генома риса, осуществленного с помощью тотального клонирования (Bevan, 2002). Несомненно, что следующим, очень важным этапом исследований станет создание обобщенной карты генома риса на основании сопоставления результатов, полученных с помощью обоих подходов.
Микродиссекция отдельных участков хромосом с успехом используется для получения локус-специфических клонотек других видов растений, в первую очередь, ячменя. С помощью этого подхода были получены хромосом-специфические клонотеки всех семи хромосом этого растения, что позволило получить ряд важных маркеров, с успехом используемых для картирования генома Н. vulgare (Busch et al., 1995; Busch et al., 1996).
Как упоминалось выше, с помощью микродиссекционного подхода успешно изучают также геномы ржи, сахарной свеклы, сои, сосны, табака и других видов растений (Kilshan, Slade, 1982; Hemould et al., 1997; Jamilena et al., 1995; Matsunaga et al., 1999; Shibata ct al., 1999; Hizume ct al., 2001; Houen ct al., 2001; Islam-Faridi et al., 2002). В частности, осуществлена попытка получения локус-специфической ДНК из хромосомы 5В пшеницы, содержащей PHj ген, ответственный за гомеологическую коньюгацию хромосом (Родова и др., 1995).
Специального рассмотрения заслуживает применение флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для картирования генома. Метод уже внес и продолжает вносить весьма существенный, а порой и решающий вклад в эти исследования.
В первую очередь, речь идет о локализации на хромосомах клонированных генов и анонимных последовательностей ДНК. Для установления точного положения генов флуоресцентная гибридизация in situ была и остается прямым и поэтому наиболее достоверным подходом. Считается, что локализация новых, ранее не описанных генов всегда должна быть осуществлена или подтверждена с помощью FISH. Всс остальные методы, включая панели гибридных клеток и молекулярпо-биологическое исследование генных контигов различной протяженности, по существу, являются предварительными. Важнейшее значение имеет FISH для локализации генов-двойников и псевдогенов, а также для ко-локализации генных контигов, вопрос о взаиморасположении которых и расстоянии между ними не может быть решен с помощью других подходов.
Необходимо упомянуть вариант флуоресцентной гибридизации in situ, лежащий на границе цитогенетического (хромосомного) и молекулярно-биологического подходов. В последнее время за ним закрепился термин f-FISH (fibcr-FISH - гибридизация, проводимая на хроматиновых фибриллах) как наиболее точно отражающий его сущность. Опыты проводят на мазке хроматина, содержащем отдельно лежащие хроматиновые фибриллы. Растянутость хроматина до этого уровня резко повышает разрешающую способность исследования по сравнению с таковым, проводимым на целых конденсированных хромосомах. Метод позволяет точно установить ко-локализацию на хромосомах двух или трех проб ДНК, меченных различными флуорохромами.
2) Влияние геномных технологий на хромосомный анализ.
Такое влияние очевидно. Выше уже говорилось о роли клонирования отдельных участков ДНК для развития одного из важнейших методов хромосомного анализа -флуоресцентной гибридизации in situ. Эта методика просто не могла возникнуть без попадания в руки исследователя изолированных генов и просто участков ДНК (обычно говорят об анонимных последовательностях). Получение таких проб было бы невозможно без появления и использования технологий клонирования и секвенирования.
Роль метода FISH для физического картирования хромосом человека и ряда других видов со "средними" геномами была рассмотрена выше. Однако значение и возможности этого метода оказались значительно более широкими, чем прямые геномные исследования, в частности и в первую очередь в медицинской цитогенетике и биотехнологии. Созданный в основном для картирования хромосом человека, метод флуоресцентной гибридизации in situ нашел широкое применение и в цитогенетике растений, хотя при работе с растительными объектами приходится сталкиваться с некоторыми трудностями. Они заключаются в следующем: жесткая клеточная стенка препятствует получению препаратов, содержащих необходимые для их исследования хорошо разбросанные хромосомы, лишенные цитоплазматичсской подложки; низкий митотичсский индекс, высокая степень конденсации метафазных хромосом (выше, чем у животных), а также сильное морфологическое сходство хромосом.
Первым исследованием с использованием FISH-анализа хромосом растений стала работа Эндрю Лича с соавторами в 1991 году (Leitch et al., 1991). Вскоре техника двухцветной FISH была применена для картирования повторяющихся последовательностей ДНК на хромосомах пшеницы, табака , Aegilops, ячменя, сахарной свеклы, риса и др. видов (Mukai et al., 1993; Kenton ct al., 1993; Yamamoto, Mukay, 1993; Leitch, Heslop-Harrison, 1993; Schmidt et al., 1994; Jiang et al., 1995).
Метод гибридизации in situ используется не только для прямой локализации в хромосомах генов и анонимных последовательностей ДНК, но и в других вариантах, в первую очередь так называемой mFISH (multicolour FISH). Метод основывается на использовании хромосом-специфичсских клонотек из индивидуальных хромосом. Способ получения клонотек близок к таковому, используемому при клонировании генома человека. Полученная ДНК метится флуоресцентным красителем. При гибридизации такой клонотски на хромосомную пластинку в специально подобранных условиях метится только та хромосома, из которой была получена клонотека. При использовании усложненных технологий (многоцветная метка, использование смеси по-разному меченых индивидуальных клонотек, компьютерный анализ изображения) удается различать все 24 индивидуальные хромосомы кариотипа человека.
Наиболее яркие области применения mFISH технологии - идентификация индивидуальных хромосом, например, в гибриде, выявление хромосомных аберраций, в первую очередь транслокаций.
Широкое распространение получают при этом микродиссекционные пробы, получаемые из индивидуальных хромосом и из отдельных хромосомных локусов. Большое значение эта методика имеет для цитодиагностики злокачественных опухолей, в особенности для выяснения природы очень характерных для них «маркерных» хромосом. Опыты проводятся по следующей схеме: с помощью микродиссекции выделяется необходимая хромосома; из нее готовится клонотека, которая гибридизуется с нормальной хромосомной пластинкой человека. В результате удастся установить, за счет каких фрагментов хромосом человека образовался данный аномальный маркер. При всей кажущейся простоте этого подхода его применение требует виртуозного владения техникой микродиссекции и микроклонирования.
Одним из новых методических подходов при изучении макроэволюционпых преобразований хромосом млекопитающих стал новый вариант FISH, получивший название пэйтинга (от англ. paint - красить). Использование пэйнтинг - проб в цитогенстике человека существенно изменило подход к анализу хромосомных перестроек (диагностика наследственных патологий, сравнительная геномика).
В ряде случаев вмешательство молекулярных подходов привело к изменению методов хромосомного анализа, их упрощению и повышению надежности. Это относится, в частности, к методу геномной гибридизации in situ (GISH), который является одной из важнейших модификаций гибридизации in situ (Langcr-Safer, 1982; Le et al., 1989; Schwarzacher et al., 1989; Heslop-Harrison, Schwarzacher, 1996; Mukai, 1996). В качестве пробы используют геномную ДНК одного из родителей при исследовании гибридных видов. В гибридизационную смесь добавляют избыток немеченой фрагментировапной геномной ДНК другого родителя или самого гибрида (для блокирования неспецифической перекрестной гибридизации). В результате геномной гибридизации in situ хромосомы (или участки хромосом), унаследованные от разных видов, окрашиваются по-разному. Метод GISH используют при анализе близкородственных геномов; он позволяет анализировать происхождение гибридов или полиплоидных форм прямо на хромосомных препаратах; является уникальным подходом для локализации точек разрывов при межгеномных транслокациях.
Параллельно расширению возможностей хромосомного анализа, развитие геномных технологий привело к частичному вытеснению молекулярно-биологическими методами "классических" хромосомных подходов в решении некоторых медико-биологических задач. Ярким примером этого является усовершенствование пренатальной диагностики болезни Дауна. Применявшийся с этой целью в течение многих лет метод хромосомного анализа был длительным и трудоемким. Он требовал значительного количества эмбрионального материала, получения культур амниотических или хорионных клеток и высококачественного дифференциального окрашивания. Применения с этой целью FISH с использованием проб, специфичных для хромосомы 21, позволяет проводить такие исследования, имея в своем распоряжении одну клетку эмбриона. Это не только облегчает процесс получения материала, но и позволяет распространять такой анализ на эмбрионы, культивируемые in vitro в процессе получения так называемых "пробирочных" детей.
В других случаях происходит прямое замещение цитогенстических методов молекулярно-биологическими. Так, для определения пола как взрослого организма, так и эмбриона в настоящее время широко используются молекулярная гибридизация с пробами, специфичными для Y-хромосомы.
3) Место хромосомного анализа в современных геномных исследованиях, а) Тотальное или частичное исследование геномов.
Успехи полного секвенирования ряда средних (цинарабдитис, рис, арабидопсис и дрозофила) и одного крупного (человек) генома поставили вопрос о целесообразности использования физического картирования с помощью FISH для выяснения локализации конкретных генов.
Действительно, казалось бы, что если весь геном отсеквенирован, и в нем точно локализованы все гены, то имея такую геномную карту, как будто бы можно сразу же определить хромосомную локализацию нужного гена. Однако, это предположение далеко от д е й ств ите л ы юсти.
Даже если допустить, что эухроматическая часть генома полностью отссквенирована (что в большинстве случаев далеко от действительности), то физическое расположение отсеквенированных контигов и размеры разделяющих их гетерохроматических участков остаются неизвестными. Для восполнения этого пробела необходимо применение прямых приемов физического картирования, т.е. FISH.
Так, у дрозофилы неотсеквенированная гетерохроматиновая часть составляет около одной трети. В данном случае эту сложность удалось в определенной степени преодолеть, "наложив" результаты прямого секвенирования на результаты почти векового изучения хромосом этого организма с помощью самых разнообразных методов, в основном цитогенетических, включая FISH.
В отношении генома человека дело обстоит намного сложнее. Несмотря на широковещательные заявления начала 2001 г об окончании секвенирования генома человека, в действительности процесс определения его полной первичной структуры весьма далек от завершения. Первичная структура только пяти хромосом (14, X, 22,21 и 20) определена с точностью, по-видимому приближающейся к таковой для дрозофилы или арабидопсиса. К примеру, в 20-й хромосоме отсеквепированы и детально охарактеризованы четыре контига. Остается, однако, не совсем ясным взаиморасположение этих контигов, точный размер неотсеквснированной гетерохроматической части, ее отношение к контигам и многое другое.
Эти вопросы, как и фактическое расположение генов, требуют проведения физической локализации генов и других ДНК проб, т.е. использования методики FISH. Исходя из темпов публикации результатов сиквенса самых мелких хромосом человека (за более чем двух годичный период, прошедший с момента опубликования результатов секвенирования генома человека, опубликованы данные по детальному карированию только двух хромосом — 14 и 20), можно полагать, что работа по изучению генома человека, требующая использования FISH-технологий, растянется на многие годы.
Использование хромосомных технологий остается чрезвычайно важным, а в некотором отношении даже решающим для структурных исследований геномов других организмов, в особенности крупных и очень крупных. В первую очередь, речь при этом идет о геномах хозяйственно важных растений. Как упоминалось выше, объявлено о предполагаемом и проводимом секвенировании геномов пшеницы, ржи и т.д.
Говоря о "крупных" и "сверхкрупных" геномах растений, можно с достаточной степенью вероятности утверждать, что для установления их первичной структуры вряд ли окажется применимой стратегия тотального детального секвснирования, по крайней мере в обозримом будущем. Причины этого вытекают из особенностей геномов растений и, в первую очередь, их
•n. огромных размеров, чрезвычайно высокого содержания повторяющихся последовательностей и полиплоидии.
Есть все основания полагать, что в большинстве случаев изучение геномов растений будет проводиться на основании установления генетических взаимосвязей отдельных локусов и хромосом, относящихся к различным геномам. Выше упоминалось, что арабидопсис содержит приблизительно 25000 генов. Предполагалось, что повидимому такое же число генов присуще и другим растениям, по крайней мере цветковым (Bennctzcn et al., 1998; Gale, Devos, 1998; Bennetzen, 1999; Moore, 1995). Однако по результатам чернового секвснирования генома риса (Bevan, 2002) было сделано заключение, что число генов равно приблизительно 45000. Однако результаты детального секвенирования 1 хромосомы риса, осуществленного в рамках международной программы секвенирования генома риса, дают основание полагать, что число генов риса приближается к 100 тыс. Дальнейшие детальные исследования позволят подтвердить или уточнить эту цифру. Однако уже имеющихся сведений достаточно для сравнения геномов различных растений (Gale, Devos, 1998). Поэтому очевидно, что речь должна идти не о общей геномикс растений, а об избирательной геномике важнейших локусов. Естественно, что условием проведения таких исследований является детальное знание хромосом растений. Так установлено, что ген чувствительности к яровизации (vernalization response gene) расположен в локусе VRn-Al хромосомы 5А гексаплоидной пшеницы и локусе Hd-б хромосомы 3 риса (Kato ct al., 1999).
В литературе время от времени появляются сообщения о существовании проектов по тотальному секвепированию крупных геномов растений, в частности, пшениц (Реп, 1998; James, 2000). Однако детали этих проектов, осуществляемых по этим данным различными биотехнологическими фирмами, неизвестны и нет сведений о стратегии, на которой они основаны. Обсуждение реальности этих исследований и их стратегии возможно лишь после появления соответствующих публикаций.
На настоящем уровне знаний можно удовлетвориться лишь сделанным выше ч. утверждением, что в развитии геномики растений чрезвычайно важным звеном будет использование и развитие "похромосомной" технологии с использованием, как основного метода, микродиссекции в усовершенствованном варианте.
Хромосомные технологии в геномике растений можно применять в двух направлениях: (1) как подходы к клонированию и секвепированию геномов и (2) в исследованиях геномов на базе сравнительной геномики. Для успешного проведения работ в этих направлениях при всей условности их разделения необходимо идентифицировать индивидуальные хромосомы, получить полную информацию о кариотипе растения, в том числе и его изменчивости в норме, выделить отдельные хромосомы и их локусы для клонирования и локализовать на хромосомах клонированные гены и анонимные последовательности ДНК.
Исследования индивидуальных хромосом растений успешно развивались в течение последних 30 лет. Они выполнялись с помощью двух основных подходов: дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ.
В конце 90-х гг. была создана усовершенствованная модификация метода флуоресцентной гибридизации in situ на хромосомах растений с невысокой степенью компактизации (профазныс, пахтеимые) или сииаптоисмиых комплексах (Dc Jong et al., 1999). Помимо этого, была разработана техника гибридизации с крупными геномными клонами (космидами, ВАС или YAC) в присутствии фракции высокоповторяющихся последовательностей ДНК для подавления кросс-гибридизации. Сочетание этих подходов позволило локализовать ряд уникальных генов на хромосомах нескольких видов растений (арабидопсис, томаты, кукуруза) (De Jong et al. 1999; Petersen et al., 1999; Fransz et al., 2000; Sadder et al., 2000).
Из широкого арсенала методов дифференциального окрашивания, разработанных для хромосом человека и млекопитающих, в гсномикс растений используются в основном два: С- и N-бэндинг. Однако можно полагать, что в ближайшее время получат широкое распространение и другие методы дифференциальной окраски.
Хромосомные технологии имеют и в обозримом будущем будут иметь огромное значение для сравнительной и эволюционной геномики растений. Эти технологии представляют собой сравнительно недорогие и быстрые методы для оценки внутри- и межвидовой вариабельности, изучения сложных аллополиплоидных геномов, таких как тетраплоидные и гексаплоидныс пшеницы, тритикале и т.д.; анализа эволюционных процессов на хромосомном уровне; исследования образования синтетических геномов и введения (интрогресии) чужеродного генетического материала; выявление генетических взаимоотношений между индивидуальными хромосомами различных видов.
Очевидно, что изучение кариотипа растений с помощью классических цитогенетических методов будет все более обогащаться стремительно развивающимися методами молекулярной биологии и компьютерными технологиями и останется важнейшей подходом для характеристики генома (Jiang, Gill, 1994; Gill, Friebe, 1998). Использование этих технологий особенно важно для изучения таких характеристик генома растений, как стабильность и изменчивость кариотипа не только на уровне отдельных организмов, но и на уровне популяции, сорта и вида. Это особенно существенно для так называемых аллополиплоидных видов (пшеницы, тритикале, овес).
Наконец, трудно себе представить, каким образом можно оценить число и спектры хромосомных перестроек (аберрации, мосты) без использования методов дифференциального окрашивания, а именно этот критерий представляется крайне перспективным для мониторинга окружающей среды по состоянию генома растений.
Специального обсуждения заслуживает состояние работ по использованию FISH-картирования хромосом растений. В отличие от хромосом животных и, прежде всего, человека, локализация генов на хромосомах растений встречает значительные трудности.
До настоящего времени надежные результаты получены только при FISH - локализации тандемно повторяющихся генов и генных кластеров, в первую очередь, генов рибосомных РНК. В этом направлении получены интересные результаты - в том числе установлена частичная гомология генов растений с генами дрозофилы.
В то же время, число сведений о локализации на хромосомах растений с помощью FISH уникальных генов по-прежнему мало. Причина этого неясна. Скорее всего это связано с наличием в геноме высших растений огромного количества (до 99% от общего размера генома) разнообразных повторяющихся последовательностей, создающих "шум", не пробиваемый слабым сигналом от индивидуального гена. Однако не исключено, что в основе этого явления лежат особенности структурной организации хромосом растений (особенности компактизации хроматина и его химического состава). б) Использование флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для подтверждения трансгеноза.
FISH - один из высоко надежных методов исследования трансгеппых организмов, обладающих рядом несомненных достоинств. Прежде всего, с его помощью удается наглядно доказать факт наличия траисгена в организме реципиента, причем с высокой надежностью установить геномный характер встраивания (локализация на хромосоме), если таковое имеет место. Более того, при этом удается выяснить единичность или множественность мест встраивания, постоянство встраивания (локализация трансгена на одной индивидуальной хромосоме во всех клетках трансгенного организма свидетельствует о высоком постоянстве трансгеноза) и наконец постоянство встраивания в ряду поколений трансгспных клеток и организмов. Последнее особенно важно для характеристики трансгспных растений, однако технически это стало возможным лишь в последние годы в связи с усовершенствованием техники FISH для растений.
4. Хромосомные технологии в медицинской цитодиагностике.
В обозримом будущем различные хромосомные технологии будут широко использоваться в медицине, в особенности при анализе злокачественных опухолей.
При этом возможно использование как классических цитогенетических подходов (основанных на различных видах дифференциального окрашивания), так и на применении различных видов FISH, прежде всего m-FISH, в частности с использованием проб, полученных в результате микродиссекции.
Из конкрентиых областей использования этих технологий, в первую очередь следует отметить: выявление классических хромосомных аномалий (синдромы Дауна, хромосомные дупликации, разнообразные перестойки, в том числе Робертсоновская и т.д , амплификации повторяющихся последоваптельностей).
Специального рассмотрения заслуживает использование цитогенетических методик для исследования злокачественных опухолей. Такие изменения как утрата и дупликация хромосом, характерные делеции, хромосомная прогрессия опухолей, в особенности при метастазировании, маркерные хромосомы успешно вывляются с помощью стандартных цитогенетических методик: дифференциальная окраска, стандартная FISH и m-FISH. Для исследования нетипичных хромосомных перестроек особое значение имеет использование хромосом- локус- и бэнд специфических клонотек, получемых с помощью метода микродиссекции.
Можно полагать, что решение этого круга задач вряд ли в обозримом будущем будет замещено молекулярно- генетическими технологиями, хотя эти технологии будут, несомненно, обогащать технологии хромосомные.
Успех хромосомного анализа во многом обеспечивается выбором методов, наиболее адекватных целям и объектам исследования (табл 7).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зощук, Наталья Викторовна, Москва
1. Бадаева Е.Д. Хромосомный анализ при исследовании происхождения В- и G-геномов полиплоидных пшениц//Биол. мембр. 2001. Т. 18. № 3. С. 216-229.
2. Бирштейн В.Я. Цитогенетические и молекулярные аспекты эволюции позвоночных. М.: Наука, 1987.284с.
3. Вавилов Н.И. Научные основы селекции пшеницы // Теоретические основы селекции растений. М.; Л.: Ссльхозгиз, 1935. Т. 2. С. 3-244.
4. Воронцов Н.Н. Развитие эволюционных идей в биологии. М.: Издат.отдел УНЦ ДО МГУ, Прогресс-Традиция, АБФ, 1999. 640сс.
5. Воронцов Н.Н., Радо/сабли С.И. Хромосомные наборы и цитогснетнческая дифференциация двух форм слепушонок надвида Ellobius talpinus Pall. // Цитология. 1967. Т. 3. № 9. С. 848852.
6. Воронцов Н.Н., Ляпунова Е.А. Хромосомные числа и видоодразование у наземных беличьих (Sciuridae, Xerinae, Marmotinae) Голарктики // Бюлл.МОИП, отд. Биол., 1970. Т. 75. № 3. С. 112-126.N
7. Гилл Б.С., Зеленин А.В. Получение амплификата ДНК из микродиссектированной 5BLdel хромосомы//Генетика. 1995. Т. 31. № 7. С. 1016-1020.
8. Графодатский А.С. "Хромосомная живопись" в сравнительной цитогенстике // Биологические мембраны. 2001. Т.18. С. 173-179.
9. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская JI.И. Хромосомы человека. Лтлас. М.: Медицина, 1982.264с.
10. Зеленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой. М.: Наука, 1971. С. 10 -25,190.
11. Зеленин А.В. Памяти Торборна Касперсона// Мол. биол. 1998. 32. № 4. С. 750 751. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Бадаев Н.С. Хромосомный анализ злаков. Теоретические и прикладные аспекты // Генетика. 1987. Т. 23. № 10. С. 1749-1761.
12. Зеленин А.В., Зощук Н.В. История современного анализа. Основополагающий вклад работ Касперсона//Онтогенез. 2000. Т. 31. №2. С. 152-160.
13. Зеленин А.В., Зощук Н.В. Хромосомный анализ в геномную эру// Биологические мембраны. 2004. В печати.
14. ЗелепинА.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений // Молекулярн. биология. 2001а. Т. 35. № 3. С. 339-348.
15. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Зощук Н.В., Муравенко О.В. Вклад хромосомных технологий в геномику растений / В кн.: Изучение генома и генетическая трансформация растений // Новосибирск: Наука. 2001b. С. 13-26.
16. Зощук Н.В., Бадаева Е.Д., Зеленин А.В. История хромосомного анализа // Биологические мембраны. 2001. т. 18. №3. С. 164-172.
17. Левицкий Г.А. Морфология хромосом // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1931а. № 27. Вып.1. С. 20-174.
18. Левицкий Г.А. Морфология хромосом и понятие "кариотипа" в систематике // Там же. 19316. №27. Вып. 1.С. 187-240.
19. Левицкий Г.А. Цитология растений. М.: Наука, 1976. 352с.
20. Левицкий Г.А., Араратян А.Г. Преобразования хромосом под влиянием рентгеновских лучей //Там же. 1931 в. № 27. Вып.1. С. 175-186.
21. Ляпунова Е.А. Описание хромосомного набора и подьверждение видовой самостоятельности Citellus parryi // В сб.: «Млекопитающие, эволюция, кариология, систематика, фаунистика», Новосибирск. 1969. С. 53-54.
22. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Компьютерный и визуальный анализ рисунка G-подобиого бэндинга хромосом ромашки аптечной // Биол. мембраны. 1998. Т. 15. № 6. С. 670-678.
23. Навашин С.Г. О некоторых явлениях при слиянии ядер в зородышсвом мешке после оплодотворения и замечания о типическом делении ядер у Fritillaria tenella // Протоколы засед. Киевск. об-ва естествоиспыт. от 3 апреля. 1910.
24. Навашин С.Г. Об индивидуальных и видовых отличиях хромосом // Протоколы засед. Киевск. об-ва естествоиспыт. от 19 февраля. 1911.
25. Навашин С.Г. О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans // Известия Имп. акад. наук. 1912. Т. 6. № 4.
26. Навашин С.Г. О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans // Изв. Императ. акад. паук. 1912. Т. 6. № 4. С. 373-385.
27. Навашин С.Г. // Сборник статей, посвященный К.А. Тимирязеву. М.: Тип. И.Н. Кушнерева и К0, 1916. С. 185-214.
28. Навашин С.Г. Заметка о числе хромосом в клеточном ядре у Najas major // Протоколы засед. Киевск. об-ва естествоиспыт. от 8 февраля. 1914.
29. Пичугин A.M., Галкина С.А., Потехин А.А., Лунина Е.О., Раутиан М.С., Родионов А.В. Определение минимального размера микрохромосом курицы Gallus gallus domesticus методом пульс-электрофореза // Генетика. 2001. Т. 37. № 5. С. 657-660.
30. Прокофьева-Бельговская А.А. Выдающиеся советские генетики. Сборник биографических очерков. М.: Наука. 1980. С. 24-37.
31. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука, 1986. 431с. Ригер Р., Михаолис А. Генетический и цитологический словарь. М.: Колос, 1967. С. 81. Рингерц II., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М.: Мир. 1979.415сс.
32. Родионов А.В. Эволюция дифференциальной исчерчснности хромосом // Генетика. 1999.Т.35. С.277 290.
33. Родионов А.В., Пунина Е.О., Чупов B.C. Эволюция блочной организации хромосом растений // Биол. мембраны. 2001. Т. 18. № 3. С. 240-248.
34. Родова М.А., Зощук С.А., Барский В.Е., Федорова Л.И., Белявский А.В., Бадаева Е.Д., и др. Получение амплификата ДНК из микродиссектированной 5BLdel хромосомы // Генетика. 1995. Т. 31. №7. С. 1016-1020.
35. РубцоваН.В., Карамышева Т.В., Закиян СМ., Рубцов II.Б. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ организации Х-хромосом полевок подрода Microtus II Биологические мембраны. 2001. Т.18. №3. С. 180-188.
36. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Климахин Г.И., Зеленин А.В. Изучение внутривидового полиморфизма по рисунку С-окрашивания хромосом Matricaria chamomilla L. (= syn. M. recutita L.J // Генетика. 1997. Т. 33. N 1. С. 130- 132.
37. Фляксбергер К.А. Хлебные злаки, пшеница // Культурная флора СССР / Под ред. Е.В.Вульфа. М.; JI.: Гос. изд-во совх. и колх. лит-ры, 1935. Т. 1. 434с.
38. Щапова А.И. Дифференциальная окраска хромосом растений. 1. Secale cereale L. // Цитология. 1974. № 16. С. 370-372.
39. Элленгорн Я.Е. О различии хромосомеров у аллеломорфных спутничных хромосом Allium сера И ДАН СССР. Нов.сер. 1940. 27(4). С. 357-360.
40. Agar W.E. Transverse segmentation and internal differentiation of Chromosomes // Quart. J. Microsc., Sci. 1913. V.58.
41. Al-Allaf S., Godward MBE. Karyotype analysis of four varieties of Helianthus annuus L. // Cytologic 1979. V. 44. P. 319-323.
42. Albert A. The acridines. II cd// A. Arnold. London, 1966. P.l 468.
43. Allshire RC, Javerzat JP, Redhead NJ, Cranston G. Possition cffect variegation at fission yeast centromeres//Cell. 1994. V. 76. P. 157- 169.
44. D'Amato G., Bianchi G., Gapineri R., Marchi P. Feulgen banding in unfixed methaphase chromosomes of some plant species// Caryologia. 1981a. V. 34. P. 83-87.
45. D'Amato G., Gapineri R., Marchi P. Heterochromatin localization in Buglossoides purpurocaerulea (L.) I. M. Johnson (Boraginaceae): a further case of correspondence between Q- and Feulgen+ bands // Caryologia. 1981. V. 34b. P. 395-399.
46. Ambros P.F., Matzke M.A., Matzke A.J.M. Detection of a 17-kb unique sequence (T-DNA) in plant chromosomes by in situ hybridization // Chromosoma. 1986. V. 94. P. 11-18.
47. Aparicio S. Exploding vertebrate genomes //Nature Genetics. 1998. V.18. P.301-303.
48. Arrighi F.E., Hsu T.C. Localization of the heterochromatin in human chromosomes // Cytogenetics. 1971. V.10. P. 81-86.
49. Arrighi F.E., Hsu T.C. Staining constitutive heterochromatin and Gimsa crossbands of mammalian chromosomes // Human chromosome methodology / Ed. J.J. Yunis. N.Y.; L.: Academic Press, 1974. P. 59-71.
50. Babu A. Heterogeneity of heterochromatin of human chromosomes as dcmonstrared by restriction endonuclease treatment. In: Verma RS(ed) Heterochromatin: molecular and structural aspects. Cambrigde University Press, Cambridge, 1988, pp. 250-275.
51. Badaeva E.D., Boguslavsky R.L., Badaev N.S. and Zelenin A.V. Intraspecific chromosomal polymorphism of Triticum araraticum (Poaceae) detected by C-banding technique // Plant Syst. Evol. 1990. V. 169. P. 13-24.
52. Badaeva E.D., Shkutina F.M., Bogdevich I.N., Badaev N.S. Comparative study of Triticum aestivum and T. timophecvi genomes using C-banding technique // Plant Syst. Evol. 1986. V. 154. P.83-194.
53. Badaeva E.D., Sozinova L.F., Badaev N.S., Muravenko O.V., Zelenin A.V. "Chromosomal passport" of Triticum aestivum L. em Thell. cv. Chinese Spring and standardization of chromosomal analysis of cereals//Cereal Res. Commun. 1990. V. 18. №4. P. 273-281.
54. Badaeva E.D., Filatenko A.A., Badaev N.S. Cytogenetic investigation of Triticum timopheevii (Zhuk.) Zhuk. And related species using C-banding // 1994. Theor. Appl. Genet. V. 89. №. 5. P. 622-628.
55. Badaeva E.D., Friebe B. and Gill B.S. Genome differentiation in Aegilops. 1. Distribution of highly repetitive DNA sequences on chromosome of diplois species// Genome. 1996. V. 39. No. 2. P. 293-306.
56. Dadaeva E.D., Friebe В. and Gill B.S. Genome differentiation in Aegilops. 2. Physical mapping of 5S and 18S-26S ribosomal RNA gene families in diploid species// Genome. 1996. V. 39. No. 6. P. 11501158.
57. Bennett M.D., Gustafson J.P. and Smith J.B. Variation in nuclear DNA in the genus Secale// Chromosoma. 1977. V. 61. №. 1. P. 149-176.
58. Bennett M.D. Plant genome values: How much do we know? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2011-2016.
59. Bennetzen J.L. et al. Grass genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998. V. 95. P. 1975-1978. BennetzenJ.L. Plant takes root, branches out//TIG. 1999. V.15. P.85-87.
60. Bevan M. and Murphy G. The small, the large and the wild: the value of comparison in plant genomics// TIG. 1999. V. 15. No. 6. P. 211-214.
61. Bevan M,Bancroft Bent E. et al. Sequence and analysis of chromosome 4 of the plant Arabidopsis thalianall Nature. 1999. V.402. P.769-772.
62. Bhatt В., Burns J., Flannery D., McGee О 'D. Direct visualization of single copy genes on banded metaphase chromosomes by nonisotopic in situ hybridization // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 3951-3961.
63. Bianchi M.S., Bianchi N.O., Pantelias G.E., Wolff S. The mechanism and pattern of banding induccd by restriction cndonucleases in human chromosomes // Chromosoma. 1985. V. 91. P. 131136.
64. Bianchi N.O., Bianchi M.S., Cleaver J.E., Wolff S. The pattern of restriction enzyme-induced banding in the chromosomes of chimpanzee, gorilla, and orangutan and its evolutionary significance//J. Mol. Evol. 1985. V. 22. P. 323-333.
65. Bickmore W.A., Craig J. Chromosome bands: patterns in the genome / Chapman & Hall, New York. 1997.
66. Biemont M.-C., Laurent C. Essai de phylogenie d'especes proches: Cheval, a ne let mulet, par une technique de marguage // C.R. Acad.Sci. Paris. 1974. V. 279. D. 323-326.
67. Biggoigera M., Fakan S., Kaufmann S.H. et al. Simultaneous immunoclectron microscopic visualization of protein B23 and C23 distribution in the Hela cell nucleolus // J. Histochem. 1989. V. 37. P. 1371-1374.
68. Biggiogera M., Kaufmann S.H., Shaper J.H et al. Distribution of nucleolar protein B23 andnucleolin during mouse spermatogenesis//Chromosoma. 1991. V. 100. P. 162-165.
69. Bohorova N., Georgieva-Todorova Y. Hybridization between Helianthus annuus L. (2n=34) and H.
70. Hirsutus raf. (2n=68) // Genet. Breeding. 1987. V. 20. P. 205-210.
71. Boveri T. (1904). Zusammenstellung und Ausblickc, P. 113-124, Gustav Fischer, Jena.
72. Bouchez D., Hofte H. Functional genomics in plants // PIant.PhysioI. 1998. V.l 18. P.725-732.
73. Brat S.V., Verma R.S., Dosik H. A simplified technique for simultaneous staining of nucleolarorganizer regions and kinetochores// Stain. Rcch. 1979. V. 54. P. 107-108.
74. Brenner S., Pepper D., Berns M.W., Tan E., Brinkley B.R. Kinctochore structure, duplication and distribution in mammalian cclls: Analysis by human autoantibodies from scleroderma patients // J.Cell Biol. 1981. V. 91. P. 95-102.
75. Brown S. W. Hcterochromatin // Science. 1966. V. 151. P. 417 425.
76. Brown W., Tyler-Smith C. Centromere activation // Trends Genet. 1995. V. 11. P. 337 339.
77. Buiting K., Greger V., Brownstein B.H., Mohr R.M., Vioculescu I., Winterpacht A., Zapel В.,
78. Horsthemke B. A putetive gene family in 15qll-13 and 16pl 1.2 Possible implication for Prader-Williand Angelman syndromes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5457-5461.
79. Burch C.R., Stock J.P.P. Phase-contrast microscopy // J. Sci. Instrum. 1942. V. 19. P.71.
80. Burris J., Cook-Deegan R., Alberts B. The Human Genome Project after a decade: policy issues //
81. Nature Genetics. 1998. V.20. P. 333-335.
82. Busch W., Martin г., Herrmann R.G., Hohmann U. Repeated DNA sequences isolated by microdissection. 1. Karyotyping of barley (Hordeum vulgare L.) // Genome. 1995. V. 38. №. 6. P. 10821090.
83. Busch W., Herrmann R.G., Hohmann U. Repeated DNA sequences isolated by microdissection. II. Comparative analysis of Hordeum vulgare and Triticum aestivum II Theor. Appl. Genet. 1996. V. 93 (1/2). P. 164-171.
84. Callan II.G. Hcterochromatin in Triton // Proceeding of the Royal Society. 1942. V. 130. P. 324335.
85. Carlson L., Caspersson Т., Foley G. E., Kudynowski J., Lomakka G., Soren L. and Simonsson E. The application of quantitative cytochemical techniques to the study of individual mammalian chromosomes//Exptl. Cell Res. 1963. V. 31. P. 589 594.
86. Caspersson Т., Farber S., Foley G.E. et al. Chemical differentiation along mctaphase chromosomes // Exptl. Cell Res. 1968. V.49. P.219-222.
87. Caspersson Т., Zech L. and Johansson C. Differentiatial binding of alkylating fluorochromes in human chromosomes // Exptl. Cell Res. 1970a. V. 60. P.315 319.
88. Caspersson Т., Zech L., Johansson C. et al. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents// Chromosoma(Berl.). 1970g. V. 30. P.215 227.
89. Caspersson Т., de la Chapelle A., Schroder J. et al. Quinacrine fluorescence of metaphase chromosomes// Exptl. Cell Res. 1972a. V. 72. P. 56 59.
90. Caspersson Т., Haglund U., Lindell B. et al. Radiation-induccd non-random chromosome breakage// Exptl. Cell Res. 1972b. V. 75. P. 541 543.
91. Caspersson Т., Issler P. and Lomakka G. A TV-based technique for optical analysis of chromosome regions// Exptl. Cell Res. 1972c. V. 75. P. 543 546.
92. Cermeno M.C., Orellana J., Santos J.L., Lacadena J.R. Nucleolar activity and competitionamphiplasty) in the genus Aegilops // Heredity (USA). 1984. V. 52. P. 603-611.
93. Cermeno M.C., Friebe В., Zeller F.J., Krolow. K.D. Nucleolar competition in different
94. A/B)(A/B)RR and DDRR tetraploid triticalcs // Heredity (USA). 1987. V. 58. P. 1-12.
95. Chen C.C. The somatic chromosomes of maize // Can. J. Genet. Cytol. 1969. V. 11. P. 752-754.
96. Cheng Z., Yan H., Yu H., TangS., Jiang J., Gu M., Zhu L. Development and aplications of a completeset of rice telotrisomics//Genetics. 2001. V. 157. №. 1. P. 361-368.
97. Chennaveeraiah M.S. Karyomorphologic and Cytotaxonomic Studies in Aegilops //Acta Horti Gotob. 1960. V. 23. P. 85-186.
98. Claussen U., Klein K, Schmidt M. A pipette method for rapid karyotyping in prenatal diagnosis // Prenat. Diagn. 1986. V. 6, P. 401-408.
99. Comings D.E. The structure and function of heterochronatin // Adv. Hum. Genet. 1972. V. 3. P. 237-431.
100. Comings D.E. Mechanisms of chromosome banding and implications for chromosome structure // Ann. Rev. Genet. 1978. V. 12. P. 25 46.
101. Comings D.E., Avelino E., Okada T.A., Wyandt H.E. The mechanism of C- and G-banding of chromosomes // Exptl. Cell Res. 1973. V. 77. P. 469-493.
102. Cuellar Т., Belhassen E., Fernandez-Calvin B. et al. Chromosomal differentiation in Helianthus annuus var. macrocarpus: heterochromatin characterization and rDNA location // Heredity. 1996. V. 76. P. 586-591.
103. Dagher-Kharrat M.B., Grenier G., Bariteau M. et al. Karyotype analysis reveals interspecific differentiation in the genus Cedrus despite genome size and base composition constancy // Theor Appl Genet. 2001. V. 103. P. 846-854.
104. Darlington C.D., La Cour L. Nucleic acid starvation in chromosomes of Trillium // J. Genetics. 1940. V.5. P. 547-562.
105. Darlington C.D., La Cour L.F. Chromosome breakage and the nucleic acid cycle (Trillium, Tradescantia, Vicia)//J. Genetics. 1945. V.46. P. 180-267.
106. Denton Т.Е., Brooke fV.R., Howell W.M. A technique for the simultaneous staining of both nucleolar organizer regions and kinetochores of human chromosomes with silver // Stain Tcch. 1977. V. 52. P. 311-313.
107. Dorer D.R , Henikojf S. Transgcnc repeat arrays interact with distant hetcrochromatin and cause silencing in cis and trans//Gcnetics. 1997. V. 147. P. 1181 -1190.
108. Doudrick R.L., Heslop-Harrison J.S., Nelson C.D. et al. Karyotype of slash pine (Pinus elliottii var. elliottii) using patterns of fluorescence in situ hybridization and fluorochrome banding // J. Hcred. 1995. V. 86. P. 289-296.
109. DrewryA. G-banded chromosomes in Pinus resinosa // J. Hered. 1982. V. 73. P. 305-306. Dunham /., Shimizu N. Roe B.A., Chissoe S. et al. The DNA sequence of human chromosome 22 // Nature. 1999. V.402. P.489-502.
110. Duirillaux B. Nouveau systeme de marquage chromosomiquc les bandes // T. Chromosoma. 1973. V. 41. P. 395-402.
111. Dutrillaux В., Lejeune J. Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humane // CR Acad Sci Paris D. 1971. V. 272. P. 2638-2640.
112. Endo T.R., Gill B.S. Identification of wheat chromosomes by N-banding // Proc.6th Inter. Wheat Genet. Symp., Kyoto, Japan. 1983. P. 355-362.
113. Endo T.R., Gill B.S. Somatic karyotype, heterochromatin distribution, and nature of chromosome differentiation in common wheat, Triticum aestivum L. em Thell. // Chromosoma. 1984. V. 89. P. 361-369.
114. Endo T. R., Gill B. S. The heterochromatin distribution and genome evolution in diploid species of Elymus and Agropyron // Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26. P. 669-678.
115. Endo Т. R. Complete identification of common wheat chromosomes by means of the C-banding technique // Jpn. J. Genet. 1986. V. 61. P. 89-93.
116. Evans H.J., Ross A. Spotted centromeres in human chromosomes // Nature. 1974. V. 249. P. 861862.
117. Ferrucci L., Romano E., de Stefano G.F. The Alul-induccd bands in great apes and man: implication for heterochromatin characterization and satellite DNA distribution // Cytogenet. Cell. Genet. 1987. V. 44. P. 53-57.
118. Fiedler IV., Claussen U., Ludecke H.-J., Sender G., Horsthemke В., Van Kessel A.G., Goertzen IV., Fahsold R. New markers for the neurofibromatosis-2 region generated by microdissection of chromosome 22//Genomics. 1991. V. 10. P. 786-791.
119. Fiskesjo G. Two types of constitutive heterochromatin made visible in Allium by a rapid C-banding method // Hcreditas. 1974. V. 78. P. 153-156.
120. Flavell R.B., Smith D.B. Nucleotide sequence organisation in the wheat genome// Heredity. 1976. V. 37. P. 231-252.
121. Flavell R.B., RimpauJ., and Smith D.B. Repeated sequence DNA relationships in four cereal genomes // Chromosoma. 1977. V. 63. P. 205-222.
122. Flavell R.B., О'Dell M., Smith D. Repeated sequence DNA comparisons between Triticum and Aegilops species// Heredity. 1979. V. 42. No. 2. P. 309-322.
123. Frediani M., Mezzanotte R., Vanni R., Pignone D., Cremonini R. The biochcmical and cytological charactcrization of Vicia faba DNA by means of Mbo I, Alu I and Bam H I restriction endonucleases // Theor. Appl. Genet. 1987. V. 75. P. 46-50.
124. Friebe B. Selective silver staining of nucleolar organizer regions in Vicia faba // Microscopica Acta. 1983. V. 87. № 1. P. 49-52.
125. Friebe В., Gill B. S. Chromosome banding and genome analysis in diploid and cultivated polyploid wheats / In "Methods of genome analysis in plants" // Ed: Prem P. Jauhar, CRC Press, Inc. 1996. P. 39-60.
126. Friebe B. and Gill B.S. Chromosome banding and genome analysis in diploid and cultivated polyploid wheats. In: P.P.Jauhar (Ed): Methods in genome analysis in plants: their merits and piffals. 1996. Boca Ration:CRC Press, pp 39-60.
127. Fukui K., Iijima K. Somatic chromosome map of rice by imaging methods // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 589-596.
128. Funaki K., Matsui S., Sasaki M. Location of nucleolar organizers in animal and plant chromosomes by means of an improved N-banding technique // Chromosoma. 1975. V. 49. № 4. P. 357-370.
129. Fuhii К., Mukai Y. Condensation pattern as a new image parameter for identification of small chromosomes in plant // Jpn. J. Genet. 1988. V. 63. P. 359-366.
130. Fukui K„ Iijima K. Somatic chromosome map of rice by imaging methods // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 589-596.
131. Fukui K., Minescrwa M., Kamisugi Y., Ishikawa M., Ohmido N. Yanagasawa Т., Fujishita M., andSakai F. Microdissection of plant chromosomes by argon-ion laser beam // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 787-791.
132. Fukui K. 1997. Quantitative analysis in physical mapping of genes. In physocal mapping of plant chromosomes. Proc. Aberystwyth Cell Gencttics Group 7th Annual Conference, Aberystwyth, Wales, January 8-10, 1997. IGER. P. 4.
133. FunakiK., Matsui S., Sasaki M. Localozation of nucleolar organizers in animal and plant chromosomes by means of an improved N-banding technique // Chromosoma. 1975. V. 49. №. 4. P. 357-370.
134. Gale M.D., Devos KM. Comparative genetics in the grasses// Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 1971-1974.
135. Gall J.G., Pardue M.L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations // Proc. N. A. S. 1969. V. 63. P.378-383.
136. GeardC.R., Peacock W.J. Sister chromatid exchanges in Vicia faba// Mutation Res. 1969. V. 7. P. 215-223.
137. Gerlach W.L. N-bandcd karyotypes of wheat species// Chromosoma. 1977. V. 62. № 1. P. 49-56. Gill B. S., Kimber G. The Gimsa С banded karyotype of rye // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974a. V. 71. № 4. P. 1247-1249.
138. Gill B.S., Kimber G. Gimsa С banding and the evolution of wheat // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974b. V. 71. № 10. P. 4086-4090.
139. Gill B. S. Evolutionary relationships based on heterochromatin bands in six species of the Triticanae //J. Hered. 1981. V. 72. P.391-394.
140. Gill K.S., Lubbers E.L., Gill B.S., Raupp W.J., Cox T.S. A gcnctic linkage map of Triticum tauschii (DD) and its relationship to the D genome of bread wheat (AABBDD) // Genome. 1991a. V. 34. P. 362-374.
141. Gill B.S., Friebe В., Endo T.R. Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosome bands and structural aberrations in wheat (Triticum aestivum) // Genome. 1991b. V. 34. No. 5. P. 830-839.
142. Gill В., Friebe B. Plant cytogenetics at the down of the 21st century // Current Opinion Plant Biol. 1998. V. l.P. 109-115.
143. Goldman M.A., Holmquist G.P., Gray M.C., Caston L.A., Nag A. Replication timing of mammalian genes and middle repetitive sequences // Science. 1984. V. 224. P. 686-692.
144. Goodpasture C.( Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalianchromosomes using silver staining // Chromosoma (Berl.) 1975. V. 53. P. 37-50.
145. Gottschling D.E., Aparicio O.M, Billington B.L., Zakian V.A. Position effects at S.cerevisiaetelomeres: reversible repression of Pol II transcription // Cell. 1990. V. 63. P. 751- 762.
146. Greilhuber J. Differential staining of plant chromosomes after hydrochloric acid treatments (Hybands) // Ostcrr. Bot. Z. 1973. V. 122, P. 333
147. Greilhuber J. Hy-banding: A quick technique for heterochromatin staining in plant chromosomes // Naturwiss. 1974. V.61.P. 170
148. Greilhuber J. Heterogeneity of heterochromatin in plants: Comparison of Ну- and C-bands in Vicia faba// Plant Syst. Evol. 1975. V. 124. P. 139
149. GreilhuberJ. Why plant chromosomes do not show G-bands // Theor. Appl. Genet. 1977. V. 50. P. 121-124.
150. Greenfield A.J., Brown S.D.M. iMicrodissection and microcloning from the proximal region of mouse chromosome 7: isolation of clones genetically linked to the pudgy locus // Genomics. 1987. V. 1. P. 153-158.
151. Hatch F.T., Bodner A.J., Mazrimas J.A., Moore D.H. Satellite DNA and cytogenetic evolution. DNA quantity, satellite DNA and karyotypic variation in Kangaroo rats (Genus Dipodomys) // Chromosoma. 1976. V. 58. P. 155-168.
152. Hatch F.T., Mazrimas J.A. Satellite DNA and Cytogenetic Evolution: Molecular Aspects and Implications for Man. In: Sparkes R.S., Comings D.E., Fox C.F. (eds) Molecular Human Cytogenetics. Academic Press, Inc. (London). 1977. P. 395-414.
153. Heitz E. Heterochromatin, Chromozentren, Chromomeren // Ber. Dt. bot. Ges. 1929. Bd. 47. S. 247284.
154. Heitz E. Dcr Bau der somatischen Kerne von Drosophila melanogaster // Ztschr. Indukt. Abstammungs- und Vererbungslehre. 1930. Bd. 54. S. 248-249.
155. HeitzE. Die Herkunft dcr Chromozentren// Planta. 1932. Bd. 18. S. 571-630.
156. Heitz E. Uber total und partielle somatische Hetcropyknose bei Drosophila funcbLs // Ztschr.
157. Zellforsch. 1933a. Bd. 19. S. 720-742.
158. Heitz E. Die somatische Heteropyknesc bei Drosophila melanogaster und ihre genetische Bcdeutung // Ztschr. Zellforsch. 1933b. Bd. 20. S. 237-287.
159. Henikoff S. Nuclear organization and gene expression: homologous pairing and long-range interaction // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. V. 9. P. 388-395.
160. Hennig W (1986) Heterochromatin and germ-line-restricted DNA. In: Hcnning W (ed) Germ line-soma differentiation. Results and problems in cell differentiation, vol 13. Springer, Berlin Heidelberg, pp 175 192.
161. Hennig W. Heterochromatin//Chromosoma. Springer-Verlag 1999. P. 1-9.
162. Heslop-Harrison J. S., Schwarzacher T. Genomic Southern and in situ hybridization for plant genome analysis / In "Methods of genome analysis in plants" // Ed: Prem P. Jauhar, CRC Press, Inc. 1996. P. 163-179.
163. Hizume M., Sato S., Tanaka A. A highly reproducible method of nucleolus organizer regions staining in plants // Stain Technol. 1980. V. 55. P.87-94.
164. Hizume M., Shibata F., Maruyama Y., Kondo T. Cloning of DNA sequences localized on proximal fluorescent chromosome bands by microdissection in Pinus densiflora Sieb. & Zusc. // Chromosoma. 2001. V. 110. №. 5. P. 345-351.
165. Hodkin J. A view of Mount Drosophila // Nature. 2000. V.404. P.442-443.
166. Holmquist G.P. Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression // Am. J. Hum. Genet. 1987. V. 40. P. 151-173.
167. Holmquist G.P. DNA sequences in G-bands and R-bands. In: Adolph K.W. (ed) Chromosomes and chromatin. 1988. V. 2. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp 76-121.
168. Holmquist G.P. Review article: chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features // Am J Hum Genet. 1992. V. 51. P. 17-37.
169. HouenA., Field B.L., Saunders V.A. Microdissection and chromosome painting of plant В chromosomes // Methods Cell Sci. 2001. V. 23(1-3). P. 115-124.
170. Howell W.M., Denton Т.Е., Diamond J.R. Differential staining of the satellite regions of human acrocentric chromosomes // Experientia (Basel). 1975. V. 31. P. 260-262.
171. Hsu T.C. Mammalian chromosomes in vitro. The karyotype of man // J. Heredity. 1952. V. 43. P. 167-172.
172. Hsu T.CMy favorite cytological subject: chromosomes // Bioessays. 1992 Nov. V. 14(11). P. 785789.
173. Hsu T.C. How I became a geneticist // Am J Med Genet. 1995 Nov 20. V. 59(3). P. 304-325. Hsu T.C. and Arrighi F.E. Distribution of constitutive heterochromatin in mammalian chromosomes//Chromosoma(Berl-). 1971b. V. 34. P. 243-253.
174. Hsu T.C., Pathak S., Shafer D.A. Introduction of chromosome crossbanding by treating cell with chemical agents before fixation// Exp. Cell Res. 1973. V. 79. P. 484-487.
175. Jellen E.N., Gill B.S., Cox T.S. Genomic in situ hybridization differentiates between A/D and C-genome chromatin and detects intergenomic translocations in polyploid oat species (genus Avena) // Genome. 1994. V.37.P. 613-618.
176. Jeppesen P., Turner B.M. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression // Cell. 1993. V. 74. P. 281-289.
177. Jewell D.C. Chromosome banding in Triticum aestivum cv. Chinese Spring and Aegilops variabilis // Chromosoma. 1979. V. 71.№ l.P. 129-134.
178. Jiang J., Gill B.S. New 18S-26Sribosomal RNA gene loci: chromosomal landmarks for the evolution of polyploid wheats// Chromosoma. 1994a. V. 103. P. 179-185.
179. Jiang J., Gill B.S. Different species-specific chromosome translocation in Triticum timipheevii and T. Turgidum support diphyletic origin of polyploid wheats // Chromosome Res. 1994b. V. 2. P. 5964.
180. Jiang J., Gill B.S. Nonisotopic in situ hybridization and plant genome mapping: the first 10 years// Genome. 1994c. V. 37. № 5. p. 717-725.
181. Jiang J., Gill B.S.,Wang G-L.,Ronald P.C, Ward D.C. Mctaphase and interphase fluorescence in situ hybridization mapping of the rice genome with bacterial artificial chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4487-4491.
182. John H.A., Birnstiel M.L., Jones KW RNA-DNA Hybrids at the Cytological Level // Nature (London). 1969. V.223. P.582-587.
183. De Jong J.H., Fransz P., Zable P. High resolution FISH in plants Techniques and applications // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. P. 258-263.
184. Kaiser R., Weber J., Grzeschik K.-H, Edstrom J.-E., Driesel A., Zenderrling S., Buchwald M., Tsui L.C., Olek К Microdissection and nicrocloning of the long arm of human chromosome 7 // Molecular Biol. Reports. 1987. V. 12. P. 3-6.
185. Kato K, Miura H, Sawada S. Comparative mapping of the wheat VRN-AL region with the rice Hd-6 region // Genome. 1999. V.42. P.204-209.
186. Kihara H. Uber cytologische Studien bei einigen Getrcidearten. I. Species-Bastarde des Weizens und Weizenroggen-Bastarde//Bot. Mag. (Tokyo). 1919. V. 33. P. 17-38.
187. Kihara H. Cytologische und Genetische Studien bei Wichtigen Getrcidearten mit besonderer Rucksicht auf das Vcrhaten der Chromosomcn und die Sterilitat in den Bastardcn // Mem. Coll. Sci. Kyoto: Imp.Univer., 1924. В1.200p.
188. Kihara //. Verwandtschaft fer Aegilops-arten im Lichte der Gcnomanalyse. Ein Uberlich // Der Zuchter. 1940. V. 12. № 3. P. 49-62. • Kihara H. The genus Aegilops classified on the basis of genome analysis // Seiken Ziho. 1947. V. 3. P. 7-25.
189. Kihara H. Consideration on the evolution and distribution of Aegilops species based on the analyser-method//Cytologia. 1954. V. 19. P. 336-357.
190. Kurabayashi M. Effects of post-temperature treatments upon the X-ray induced chromosomal aberrations//Cytologia. 1953. V. 18. P. 253-265.
191. Marks G.E. Feulgen banding of heterochromatin in plant chromosomes // J. Cell Sci. 1983. V. 62. P. 171-174.
192. Ф Martini G., Toniolo D., Vulliamy Т., Luzzatto L., Doro R., Viglietto G., Paonessa G., D'Urso M.D., Persico M.G. Structural analysis of the X-Iinked gene encoding human glucose 6-phosphate dehydrogenase//EMBO J. 1986. V. 5. P. 1849-1855.
193. Matsui S.-I. Nucleolus organizer of Vicia faba chromosomes revealed by the N banding technique // Jpn. J. Genet. 1974. V. 49. № 2. P. 93-96.
194. Matsui S., Sasaki M. Differential staining of nucleolus organizers in mammalian chromosomes // Nature. 1973. V. 245. P. 148-159.
195. Matsui S. Nucleolus organizer of Vicia faba chromosomes revealed by the N-banding technique // Jpn. J. Genet. 1974. V. 49. №. 2. P. 93-96.
196. Miller O.J., Therman E. Chromosome bands // Human chromosomes / 4th ed. Springer-Verlag. New York. Berlin. Heidelberg. 2001. P. 79 94.
197. Monajembashi S., Cremer C., Cremer Т., Wolfrum J., Greulich K.O. Microdissection of human chromosomes by laser microbcam // Exp. Cell Res. 1986. V. 167. P. 262-265.
198. Moore G., Foote Т., Helentjaris Т., Devos K., Kurata N. and Gale M. Was there a single cereal chromosome?//TIG. 1995. V. 11. No. 3. P. 81-82.
199. Morescalchi A. Amphibia / Cytotaxonomy and Vertebrate Evolution // Eds.: Chiarelli and Capanna E. London: Academic Press. 1973. P. 233-348. Morgan Th.II. Exerimental zoology. N.Y. 1907.
200. Mukai Y., Nakahara Y, Yamamoto M. Simultaneous discrimination of the three genomes in hexaploid wheat by muilticolor fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNA pribes // Genome. 1993. V. 36. P. 489-494.
201. Mukai Y., Endo T.R., Gill B.S. Physical mapping of the 5S rRNA multigene family in common wheat // J. Hered. 1990. V. 81. P. 290-295.
202. Mukai Y., Endo T.R., Gill B.S. Physical mapping of the 18S.26S rRNA multigene family in common wheat: Identification of a new locus// Chromosoma. 1991. V. 100. P. 71-78.
203. Mukai Y., Friebe В., Gill B.S. Comparison of C-banding patterns and in situ hybridization sites using highly repetitive and total genomic rye DNA probes of 'Imperial' rye chromosomes added to 'Chinese Spring' wheat//Jpn. J. Genet. 1992. V. 67. P. 71-83.
204. Murphy T.D., Karpen G.H. Centromeres take flight: alpha satellite and the quest for human centromere//Cell. 1998. V. 93. P. 317-320.
205. Muller H.J., Painter T. The differntiation of the sex chromosome of Drosophila into genetically active and inert regions // Ztschridukt. Abstammungs- und Vererbungslehre. 1932. Bd. 62. S. 316365.
206. Murphy T.D., Karpen G.H. Centromeres take flight: alpha satellite and the quest for humancentromere// Cell. 1998. V. 93. P. 317 320.
207. Nagl W. Zellkern und Zellzyklen. Ulmer, Stuttgart. 1976.
208. Natarajan A.T., Sarma N. P. Chromosome banding patterns and the origin of the В genome in wheat//Genet. Res. 1974. V.24. P. 103-108.
209. Ochs R.L., Busch H. Futhcr evidence that phosphoprotein C23 (llOKD/pl 5.1) is the nucleolar silver staining protein // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 250-256.
210. Okamoto M. Identification of the chromosomes of common wheat belonging to the A and В genomes// Can. J. Genet. Cytol. 1962. V. 4. P. 31-37.
211. Painter T.S. Studies in mammalian spermatogenesis. II. Spermatogenesis of man // J. Exp. Zool. 1923. V.37. P. 291.
212. Pardue M. L„ Gall J. G. Chromosomal localization of mouse satellite DNA // Science. 1970. V. 168. P. 1356-1358.
213. Paris Conference: Standardization in human cytogenetics. Birth Defects: Original article series. N.Y.: The National Foundation ,1971. VIII. № 7. 46p.
214. Pedersen C., Rasmussen S.K., Linde-Laursen I. Genome and chromosome identification in cultivated barley and related species of the Triticeae (Poaccae) by in situ hybridization with the GAA-satellite sequence // Genome. 1996. V. 39. P. 93-104.
215. Pedersen C., Langridge P. Identification of the entire chromosome complement of bread wheat by two-colour FISH // Genome. 1997. V. 40. P. 589-593.
216. Pen E. A Bonanza for Plant Genomics // Science. 1998. V.282. P.652-654.
217. Penrad-Mobayed M., Sourrouille P., Bonnanfant-Jaies M.L., N'Da E., Edstrom J.E., Angelier N. Microdissection and cloning of DNA from landmark loop of amphibian Iubpbrush chromosomes // Cromosoma. 1991. V. 101. P. 180-188.
218. Perry P., Wolff S. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids // Nature (Lond.). 1974. V. 251. P. 156-158.
219. Petersen D.G., Lapitan N.L.V., Stack S.M. Localization of single- and low-copy sequences on tomato synaptonemal complex using fluorescence in situ hybridization (FISH) // Genetics. 1999. V.152. P. 427
220. Phillips R.L., Free ling M. Plant genomics aur food supply// Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.). 1998. V. 95. No. 5. P. 1969-1970.
221. Pillo В., Karpinski S., Luclecke H.-J., Horsthemke B. Detailed characterization of a human 8q24.1 microdissection library and generation of "sequence-tagged sites" // Cytogcnet. Cell Genet. 1993. V. 63. P.185-188.
222. Pinkel D., Straume Т., Gray J. W. Cytogenetic analysis using quantitative, highsensitivity, fluorescencein situ hybridization// Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.). 1986. V. 83. P. 2943-2938.
223. Pirrota V., Hadfield C„ Pretorius G.H.J. Microdissection and cloning of the white locus and the 3BI3C2 region of the Drosophila X chromosome // The EMBO Journal. 1983a V. 2. P. 927-934.
224. Pirrota V., Jackie H., Edstrom J.-E. Microcloning of microdissectcd chromosome fragments // Genet.
225. Engineer. Principles Methods. 1983b. V. 5. P. 1-17.
226. Rayburn A.L., Gall B.S. Use of biotin-labeled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes//J. Hered. 1985. V. 76. P. 78-81.
227. Rayburn A.L, Gill B.S. Isolation of a D-genome specific repeated DNA sequence from Aegilops squarrosa.// Plant Mol. Biol. Report. 1986. V. 4. P. 104-109.
228. Rayburn A.L. and Gill B.S. Molecular analysis of the D-genome of the Triticeae II Theor. Appl. Genet. 1987. V. 73. P. 85-388.
229. Richa J., Lo C. W. Inrtoduction of human DNA into mouse eggs by injection of dissected chromosome fragments // Science. 1989. V. 245. P. 175-177.
230. Rodman T.C., Tahiliani S. The Feulgen banded karyotypes of the mouse: Analysis of the mechanisms of banding // Chromosoma. 1973. V. 42. P. 37-45.
231. Rohme D., Fox 11, Herrmann В., Frischauf A.-M., Edstrom J-E., Mains P., Silver L.M., Lehrach //. Molecular clones of the mouse t complex derived from microdisscctcd metaphase chromosomes // Cell. 1984. V. 36. P. 783-788.
232. Rommelaere J., Susskind M„ Errera M. Chromosome and chromatid exchanges in Chinese hamster cells // Chromosoma. 1973. V. 41. P. 243-257.
233. Roos U-P. Are centromeric dots kinetochores? / Nature. 1975. V. 254. P. 463.
234. Rosenberg O. Cytologische und morphologische Studien an Drosera longifolia x rotundifolia //
235. Kungl. Sv. Vetensk. Acad. Handl. 1909. V. 43. P. 1-64.
236. Saccone S., Caccio S., Kasuda J. Identification of the gene-richest bands in human chromosomes // Gene. 1996. V. 174. P. 85-94.
237. Sadder M.T., Ponelies N., Born U., Weber G. Physical localization of single-copy sequences on pachytene chromosomes in maize (Zea mays L.) by chromosome in situ suppression hybridization // Genome. 2000. V. 43. P. 1081-1083.
238. Saitoh Y„ Laemmli U.K. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold // Cell. 1994. V. 76. P. 609-622.
239. Sakamura T. Uber die Einschnurung der Chromosomcn bci Vicia faba (V.M.) // Bot. Mag. 1915. V. 28.
240. Sandery M.J., Forster J.W., Macadam S.R., Blunden R., Jones R.N., Brown S.D.M. Isolation of a sequence common to A- and B-chromosomes of rye (Secale cereale L.) by microcloning // Plant Mol. Biol. Reporter. 1991. V. 9. P. 21-30.
241. Santos J.L., Lacadena J.R., Cermeno M.C., Orella J. Nucleolar organizer activity in wheat-barley chromosome addition lines // Heredity. 1984. V. 52. P. 425-429.
242. Sarma N. P., Natarajan А. T. Identification of hctcrochromatic regions in the chromosomes of rye // Hereditas. 1973. V. 74. P. 233-238.
243. Schondelmaier J., Martin R., Jahoor A., Houben A., Graner A., Koop H.-U., Herrmann R.G., and Jung C. Microdissection and microcloning of the barley (Hordeum vulgare L.) chromosome 1HS // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 629-636.
244. Schrock E., du Manoir S., Veldman Т., Schoell В., Wienberg J., Ferguson-Smith M.A. et al. Multicolor
245. Spectral Karyotyping of Human Chromosomes // Science 26 Jul. 1996; 273 (5274): 494.
246. Schrader O., Ahne R., Fuchs J., Schubert I. Karyotype analysis of Helianthus annuus using Gimsabanding and fluorescence in situ hybridization // Chromosome Res. 1997. V. 5. P. 451-456.
247. Schidemann W. Synthetic anti-malaria preparations // Proc. Roy. Soc. Med. 1931. V. 25. P.897902.
248. Schwarzacher Т., Leitch A.R., Bennett M.D., Heslop-Harrison J,S. In situ localization of parental genomes in a wide hybrid // Ann. Bot.(London). 1989. V. 64. P. 315-324.
249. Schwarzacher II.G. Chromosomes in mitosis and interphase. Heidelberg; N. Y.: Springer-Verlag, 1976. 123p.
250. Schwarzacher H.G., Heslop-Harrison J.S. Practical in situ hybridization. Oxford: BIOS Scientific Publishers. 2000.
251. Schweizer D. Differential staining of plant chromosomes with Gimsa // Chromosoma (Berl.) 1973. V. 40. P. 307-320.
252. Schweizer D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI // Chromosoma (Berl.). 1976. V. 58. P. 307-324.
253. Schweizer D. Fluorescent chromosome banding in plants: applications, mcchanism, and implications for chromosome structure. Proc. 4th John Innes Symp., John Innes Inst., Norwich, U.K. 1979. P. 61-72.к
254. Schubert /., Anastassova-Kristeva M., Rieger R. Specificity of NOR staining in Vicia faba II Exp. Cell Res. 1979. V. 120. P. 433-435.
255. Schubert /., Kunzel G. Position-dependent NOR activity in barley I I Cromosoma. 1990. V. 99. P. 352.
256. ScmidM., Almeida C.G. Chromosome banding in Amphibia XII Restriction endonuclease banding // Chromosoma. 1988. V. 99. P. 283-290.
257. Scubert I. Restriction endonuclease (Re-) banding of plant chromosomes // Caryologia. 1990. V. 43. P. 117.
258. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancet. 1971. V. II. P. 971-972. Senger G., Ludecke ll.-J., Horsthemke В., Claussen U. Microdissection of banded human chromosomes // Human Genet. 1990. V. 84. P. 507-511.
259. Stocker A.J., Fresquez C., Lentzios G. Banding studies on polytene chromosomes of Rhynchosciara hollaenderi II Chromosoma (Berl.). 1978. V. 68. P. 337-356.
260. Stubblefield E., Cherry L.M. Examination of the structure and function of the mammalian centromere / In «Trends in chromosome research» // Ed.: T.Sharma. 1990. Springcr-Verlag. Narosa Publishing House. P. 53-68.
261. Sumner А. Т., Evans H. J., Buckland R. A. New technique for distinguishing between human chromosomes // Nature New Biol. 1971. V. 232. P. 31-32.
262. Sumner A. T. A simple technique for demonstrating centromeric hcterochromatin // Exptl. Cell Res. 1972. V. 75. P. 304-306.
263. Sumner A. T. Chromosome Banding. Unwin Hyman, London. 1990. 434p.
264. Sumner A. T. The distribution of topoisimerase II on mammalian chromosomes // Crom Res. 1996. V.4.P. 5-14.
265. Szabo P., Ward D.C. What's new with hybridization in situ? // Trends in biochemical scicnce. 1982. № 12. P. 425-427.
266. TaziJ., Bird A. Alternative chromatin structure at CpG islands // Cell. 1990. V. 60. P. 909-920. Tjio J.H., Levan A. The chromosome number of man // Separat ur Hereditas. 1956. V. 42. P. 479485.
267. Uchida I.A. and Lin C.C. Quinacrine fluorescent patterns // Human chromosome methodology/ Ed. J.J.Yunis. 1974. P. 47-58.
268. Valdivia M.M., Brinkley B.R. Fractionation and initial characterization of the kinetochore from gene % silencing in Drosophila /Cell. 1985. V. 77. P. 993 1002.
269. Varley JM. Patterns of silver staining of human chromosomes // Chromosoma (Berl.). 1977. V. 61. P. 207-214.
270. Varley J.M., Morgan G.T. Silver staining of lampbrush chromosomes of Triturus cristatus carnifex //Chromosoma (Berl.). 1978. V. 67. P. 233-244.
271. Vosa C. G. Heterochromatin recognition with fluorochromes // Chromosoma (Berl.). 1970. V. 30. P. 366-372.
272. Vosa C.G., Marchi P. Quanacrine Fluorescence and Gimsa staining in plant // Nature New Biology. 1972. V. 237. P. 191-192.
273. Warburion P.E., Cooke H.J. Hamster chromosomes containing amplified human a-satellitc DNA show delayed sister chromatid separation in the absence of de novo kinetochore formation // Chromosoma. 1997. V. 106. P. 149-159.
274. White M. J. D. Modes of speciation./ Ed: С. I. Davem, W. H. Freeman and Company, San Francisco, 1978, P. 47.
275. Wurster-Hill D. H. Chromosomes of eight specics from five families of Carnivora // J. Mammal. 1973, V.54. P. 753-760.
276. Wurster-Hill D. H. and C. W. Gray. Gimsa banding patterns in the chromosomes of 12 species of cats (Felidae) // Cytogenet. Cell Genet. 1973. V. 12. P. 377-397.
277. Yamamoto M„ Mukay Y. Physical mapping of ribosomal RNA genes in Aegilops and Triticum. In: Li S., Z.Y. Xin (Eds): Proc. 8th Int. Wheat Genet. Symp., Bejing, China, 20-25 July 1993. P. 807811.
278. Yamamoto A.H., Komma D.J., Shaffer C.D., Pirrotta V., Endow S.A. The claret locus of encodes products required for eyecolor ana for meiotic chromosome segregation // The EMBO Journal. 1989. V. 8. P. 3543-3552.
279. Yu J. W., Hartz J., Xu Y.S., Gemmill R.M., Korenberg J.R., Patterson D„ Kao F.-T. Isolation, characterization and regional mapping of microcloncs from a human chromosome 21 microdissection library// Amcr. J. Human Genet. 1992. V. 51. P. 263-272.
280. YunisJ.J. Nomenclature for high resolution human chromosomes // Cancer Genet. Cytogcnct. 1980. V. 2. P. 221-229.
281. Zakharov A.F., Egolina N.A. Differential spiralization along mammalian mitotic chromosomes. I. BUdR revealed differentiation in Chinese hamster chromosomes // Chromosoma. 1972. V. 38. P. 341-365.
282. Автор глубоко признателен доктору биологических наук Е.Д. Бадаевой за руководство в проведении настоящей работы, за ценное обсуждение результатов и за консультации автора в области цитогенетики растений.
283. Автор благодарит кандидата биологических наук Т.Г. Саматадзе и кандидата биологических наук А. В, Амосову за предоставленные фотографии.
284. Проведенное исследование было выполнено в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, всем сотрудникам которой, способствовавшим выполнению работы, приношу искреннюю благодарность.
-
Зощук, Наталья Викторовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.03
- Структурный полиморфизм хромосом у крыс в процессе костномозгового кроветворения
- Закономерности хромосомной изменчивости в соматических клетках у детей
- Фенотипический полиморфизм при синдроме дауна как следствие блокады онтогенеза
- Сравнительная кариология бычковых рыб (Gobiidae) фауны России: эволюционный и таксономический аспекты
- Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом
