Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурный полиморфизм хромосом у крыс в процессе костномозгового кроветворения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурный полиморфизм хромосом у крыс в процессе костномозгового кроветворения"

Г Б од

гГП Т.^'

^ и:.< САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Чабана Лидия Ивановна

СТРУКТУРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ХРОМОСОМ У КРЫС В процессе КОСТНОМОЗГОВОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ

Специальность 03.00,15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург, 1994

Работа выполнена в Институте эволюционной морфологии и экологии животных РАН имени А.Н.Северцева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ЛИГАЧЕВ Анатолий Иванович (Санкт-Петербургский ветеринарный институт); доктор биологических наук, профессор КОНОВАЛОВ Вячеслав Сергеевич (Житомирский сельскохозяйственный институт); доктор биологических наук ХОПЕРСКАЯ Ольга Анатольевна (Институт общей генетики РАН)

Ведущая организация - Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Зашита состоится "-'Д " 1 г 199^г. на васедании разо-

вого диссертационного совета ДР. 120.37.99 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном аграрном университете по адресу: 189620, С.-Петербург-Пушкин, Петербургское шоссе,2, ауд.342

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета

Ученый секретарь совета, доктор биологических наук, профессор, академик ПАНИ

А. К. ГОЛУБЕВ

1. СВЗЯ ЯЛРАЛТЕПГСППТЛ РЛЕСШ

Лга^агагость проблш.ы В настоящее время накоплены многочисленные данные о структурной вариабельности мет авизных хромосом при анализе клеток газетного мозга у ратных видов, п том числе и человека, и объясняли это п основном надвидовой и внутривидовой изменчивостью кариотипа. 1!о в 1963 году японские исследователи Тги;|111о и Ofi.no. обнаружив укорочение плеч у отдельных метафялных хромосом . человека, высказали другое предполи я кие: о наличии хромосомного ьаркера направления дифференцировки кроветворных клеток. Эти выводи Использовали отечественные учение в утешении современной схемы кроветворения. 1Ъ экспериментальных доказательств о роли структурной организации хромосом в дифференцировке отдельных ростков било недостаточно, в этой связи появились сомнения и важный вопрос оставался открытым.

Познание неханианов регуляции дифференцлровга! клеток являетсп узловой проблемой современной биологии, одним из наиболее интересных вопросов генетики и биологии развития. Особенно слолг^ в этом

#

отношении является система кроветворения, где происходит диффэреп-цировка стволовых клеток во многих направлениях и отлччнть дифференцирующиеся клетют друг от друга удается только на относительно поздних этапах, когда выбор специализации уж осугрствлеН. В морфологическом отношении полипотентные. частично детерминированию и унипотентные кроветворные клетки - преджственншш, . от юторых впоследствии образуются тромбоциты, эритроциты н различные лейта-цнти, сущэствупцими .методами не различают.

Важюсть исследований по проблеме дифференцировки родоначальник кроветворных клеток в связи с возможностью их практического использования в рачней диагностик отмечали многие ученые.

В популяции клеток костного мозга крысы, где размножился

о _

кроветворные клетки на ранних этапах своего развития, наыи впервые обнаружен структурный полиморфизм у отдельных хромосом на стадии ыетафааы, проявляющейся в изменении морфологии. Изучению сущности данного явления с учетом вышеназванных актуальных и нерешенных проблем посвяарны настоящие исследования.

Цель райоты. Основной целью данной работы явилось выявление у крыс среди пролиферирушэй популяции клеток костного мозга вариантов структурного полиморфизма кетафааных хромосом и с учетом этого выделение основных типов хромосомных наборов, а также выяснение роди данного явления в процессах дифференцирсщки кроветворных клеток, получение математических характеристик о формировании типов наборов в норме и при экстремальных воздействиях. Цель реализована в результате изучения структурного полиморфизма хромосом в кровег-. воряых клетках у интактных крыс обоего пола, разного возраста и популяций, моделей различных патофизиологических состояний.при эндогенных процессах, а также после воздействия химических й физических факторов с использованием следующих уровней, исследования: субклеточного, клеточного, тканевого, организменного й папуляцион-ного. .

Задача исследования. При выполнении данной работы, поставлены следующее основные вадачи:

1. Изучить структурный полиморфизм хромосом в клеточных популяциях костного мозга и культуры крови интактных белых крыс, выявить основные типы хромосомных наборов".

2. Исследовать структурную организацию метафазиых хромосом

у контрольных животных и ыоделей мегакариоцитопоэза, лейкопозаа и эритропоэза - трех различных уровней регуляции кроветворения, определить частоту образования типов хромосомных наборов в костном мозге и количество кроветворных клеток соответствующей морфологии

й- каждой модели.

3. Взявить взаимосвязь между типами хромосомных наборов и дпффервНцирсвкэй клеток, установить хромосомное определение ыега-каоиощггарпого. Лейкоцитарного и зритроидкого рядов кроветворных . клеток, разработать способ определения на хромосомном уровне функционального состояния костномозгового кроветворения у экспериментальных ¿лйотнйх.

■1. Проследить образование ст;. ¡ггурнэ-фуикционалышх типов 'хромосомных наборов в разные периоды онтогенеза у беспородных крж, сравнить организацию хромосом в метафззных наборах костного йоага линейных й диких крыс.

. .'В. Определить влияние острой кевозмешрнной кровонотери па формирований структурно-функшгональш'к типов хромосомна наборов.

6. Сопостажггь действие раз них доз оборго гачма-облучения на хроцосокные яаборМ:

7, Проанализировать закономерности образований структур-нр-футашон-шн'ых типов хромосомных наборов в организме при разных фйзйологическйх состояниях й возмомше Пути регуляции этого процесса.

Йаучкзи !£ои«з}а. Открыто явление структурных преобразовали! морфологии. ЫетафазнЫх хромосом на уровне клеточной популяции костного мозга крис. Полиморфизм хромосом выражался в изменений ДШш плеч у некоторых из. них, вследствие чего морфологическая структура изменялась от ЯегацентричесКоЯ до акроцентрической. Яро»? того, среди акроцентрйческих хромосом наблюдали спутники трех различных фенотипов,что та!«® обусловило разнообразие йх орг&нйэацйй. В популяции клёпок костного мозга был» выделены три основных типа хромосомных наборов, . различающихся числом йетацентрических и акроцентрйческих хромосом, которые изучены при равномерной и диффереи-

циальных 0- и С- окрасках. Их образование выявлено у лабораторных белых беспородных крыс, у линий Виетар и Август, а также диких серых крцс и, таким образом, у разных по происхождению популяций вида ЯаНцз погуейЮиэ ВегкепЬои1.

11а моделях трех различных уровней регуляций кроветворения обнаружена высокая положительная коррелятивная связь между интенсивностью образования отдельных типов х(юмосомных Наборов,и количество« специализированных клеток, что позволило установить хромосомное определение или маркеры ростков, дифферёнцирувцихся в направлениях лейкоцитарного, мегакариоцитарного и эрятроидного рядов кроветворных клеток, С учетом этих данных разработаны предложения по определению состояния костномозгового кроветворений на.хромосомном уровне, то'есть на.более ранней стадии дифференцировкИ меток по сравнению с иавестнымй методами. -

В разные возрастные периоды от молочного до позднего этапа жизни у крыс в костном мозге обнаружена различная интенсивность образовании трех типой хромосомных наборов, что имеет важное зна-' чение для более глубокого понимания особенностей функционирования систему кроветворения и в целом'организма на разных этапах Онтогенеза

Проанализировано воздействие острой невозкещэнной кровопотери и разных Доз общего гамма-облучения на формирование хромосомных наборов, что дополняет и углубляет известные данные^ об особенностях гемопоэза в этих условиях. - .

В результате впервые выявлены закономерности образования трех структурно-функциональных типов хромосомных наборов в костной мозге на разных этапах онтогенеза и при экстремальных зоздействи-410 является экспериментальным подтверждением эпигенетической гипотезы, объясняющей стабильность дифференцировки клеток измене-

кием структур ДНК и в данном случае на стадии метафаэных хромосом.

Тсаратхмоскгш и прагтгческая значгслхгтт.. Совокупность представленных в диссертации экспериментальных данных и 'обоснованных научных положений имеет'важное теоретическое значение, так как позволяет углубить и расширить- существующие взгляды на функциональную структуру генетического аппарата и роль организации кета-фазных хромосом в механизмах реализации генетической информации. Обнаруженные структурные преобразив; ия метафазных хромосом в популяции клеток костного мозга крысы, связанные с дифференцировгаэй в направлении трех ростков кроветворения, вносят существенные дополнения в области щггогенетйки. онтогенеза й гематологии. Разработанный подход к изучению интимных механизмов генетической регу-дировга диффереицировки клеток может быть использован для даяьней-еИх исследований этого процесса у млекопитающих.

Полученные результаты об особенностях структурной организации йетаФазных хромосом в популяции клеток костного мозга при разпш направлениях диффереицировки и закономерностях образор~шш трех типов хромосомных наборов на конкретных этапах онтогенеза с учетом физиологического состояния крыс поаволяет рекомендовать нх Для изучения в соответствующих курсах студентам вузов, врачам на курсах усовершенствования и аспирантам.

Разработанные в диссертации методы и подходы к анализу структурного полиморфизма метафазных хромосом в популяции (слеток костного шага и полученные конкретные результаты об их преобразованиях при функционировании внедрены в учебный процесс. Они использованы автором при изучении со слушателями Воронежского медицинского института предмета биологии в разделах цитология и генетики, а тага® под руководством автора и профессора С. И. Машина по этому направлению' защищена дипломная работа студенткой Воронежского го-

сударственного университета. Получены акты о внедрении результатов научной работы в учебный процесс .Воронежского госуш1Еерсите«1, Ь включении в лекционный курс биологии в разделе- нСтр:Няурно-Функциональные уровни организации наследственного маггйриадз эутсаргат" для студентов лечебного, педиатрического и ешштарно-гнгиекйчеекп-То факультетов Кемеровского медицинского .института и' с лекционный курс "Ветеринарная генетика" для студентов '&р0Не'жскЬг0-сельйК0Х0"-''' внйетвенного института. '•...'.

Результаты работы имеют важное практическое значение- ; Исследования представляют интерес для понимания влияния•разДйчния факторов среды на. адаптацию организма и расширяв представления о реакции организма.на разнообразные- воздействия, о развйткй приспособительных реакций' через изменение интенсивности образования типов хромосомных наборов в костном ыраге.. Это важно для дальней'-. шего развития теории об управлении заадетой организма от экстремальных воздействий. • ■

Способу определения состояния костномозгового кроветворешш по хромосомным картерам трех кроветворных ростков мокго применять для оценки экстремальных воздействий на организм факторов -физической. Химической н биологической природы. с целью углубления знаний о закономерностях гемопоэза в этих условиях. Получен акт о внедрении разработанного способа в исследованиях лаборатории морфологии и цитогенетики Института радиобиология ИЙ Белоруси.

Данные О формировании трех типов хромосомных наборов после острой невоэмеденной кровопотери,■ воздействия облиго гамма-сблу-чениЯ, а так*» на разных этапах онтогенеза -расширяют преДотавле-1П1Я по этиологии и патогенезу заболеваний, о механизма старения и могут быть учтены в клинической.практике.

Модели о различными соотношениями типов хромосомных наборов и

интенсивностью их образования целесообразно использовать для дальнейшего изучения функционирования хромосомного аппарата на стадии метафазы и процессов гемопоэза в генетических, а также медико-генетических исследованиях.

Апробация работа Основные положения исследований были доложены и обсуждены в Воронежском госуниверситете на заседании Воронежского отделения Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова ( 1985, 1991), науч, м соминаре лаборатории генетики Института- эволюционной морфологии и экологии животных им. Л. 11 Северцева ЛН СССР с представительством от Института обвгэй генетики им. И И. Вавилова АН СССР (1987), научном семинаре лаборатории генетики Института биологии развития им. Н. К. Кольцова АН СССР (1990), на Всесоюзной конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской ЛЭС"(1991). Кроме того, результаты работы были представлены на секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" МНТС ГКНТ (Орджоникидзе,1986), на Втором Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Челябинск, 1986),

*

на V и VI съездах ВОГиС им. Е И. Вавилова (Москва, 1987, Минск, 1992), на Всесоюзном.совещании "Функциональная Морфология клетки".(С.-Петербург, 1991), на Международной экологической ярмаркеСВоронеж, 1092).

. Комплексность *еми Основные материалы И результаты получены автором самостоятельно. Исследования выполняли с 1982 по 1992 г.г. вначале по инициативе автора, а затем после прикрепления в соответствии с письмом ректората Воронежского медицинского института от 19.06. 66г. N 05-23 в Институте-эволюционной морфологии и экологии животных ЛН СССР им. А. Е Северцева в составе темы N 2, 34.2. 4{60), руководителем которой являлся академик И П. Дубинин. ВГМИ предоставлял для работы, животных и рабочее место на базе группы патофизиологии с экспериментальной хирургией Центральной научно-исследователь:

- о -

ской лаборатории.

Часть исследований выполнены на кафедре генетики, селекции и теории эволюции Воронежского университета-. Облучение гкивотншг проводили в Воронежском областном онкологическом диспансере. Культуру крови ставили в лаборатории медико-генетической консультации Воронежской областной больницы. В клинической лаборатории этой больницы оказана помошь при анализе морфологии кроветворных клеток, .

Публикации. Содержание диссертаций изложено в 19 печатных'работах.

Структура диссертации. Работа состоит иа введения, восьми глав, выводов, списка литературы' и изложена на 311 страницах машинописи. Диссертация содержит 64 таблицу и иллюстрирована 30 рисунками. Список литературы включает 444 работ, из шх .283 отечественных и 1Г>1 иностранных авторов.

г. МАТЕРИАЛ, ШОДШ5А И ЛРОГРАШЛ ИОВДЩШШ

Для опытов использовали из вида ДаНцБ гюгуе^сиз Вэгкеп1ю1Л лабораторных белых крыс линий Август, . Вистар й беспородных обоего пола из питомников "Столбовая" и "Ёелый моя" АМН СССР, а таю© диких серых самцов. В осиову исследований полотно изучение структурного полиморфизма хромосом в популяции кроветворных клеток костного мозга у интшстных животных разного возраста, а также , у оксперИменталыШх моделей спленэктомш, асептического.воспаления, гипо1сснческоГо состояния, кровопотерн Н абс^го гамщ-облучвння. ■'-•.'

Операцию СПленэктоши выполняли в соответствии с разработанными ' правилами (Островерхов Г. Е., Лубоцкий Д. а; Бомао Ю. Н., 1972); асептическое воспаление моделировали путем подкожного введения скипидара по Ы, Г, Кахетелидаё (1970) nS.it ДолгиноЙ (1972); гкпоксическое состояние вызывали воздействием низким разрекениеи

- g -

(Лир а В. , СтииеЙ It . 1967); дробное кровопускание в объеме 2,5% от массы животного Воспроизводили в соответствии с рекомендациями В. Д. Барсукова (1969), облучение проводили на гамма-терапевтическом аппарате Агат-С.

Иикропрепарати хромосом готовили по известной методике (Орлов RIL . Чудиновская Г. А. , Крксова Е. IL , 1976) из костного мозга н культуры .крови. Хромосомшю наборы красили равномерной и лигМяпен-циаяьНой окраской. Для анализа отбирали все пластинки с хоросеЯ морфологией и без выбора по степени спирализации. Идентификации хромосом проводили на ммкрофогогрзфиях и под микроскопом с учетом могхкшэтрических ' параметров. Морфологические типы определяли па основе опубликованных рекомендаций других, авторов по полсотни» центромеры и длине плеч. Измерение хромосом проводили с учетом известных приемов, но п нашей модификации (Чабала Л.И. , 1988).

Пси анализе мнтотической активности костного моага считала! число клеток во всех Фазах митоза на 6000. меток • и пересчитывали на 1000 от. (Бобкова 111L . 19S1).

УэрфолоГические типы кроветворных клеток распознавали с. учетом данных гематологического атласа 11 Г. Абрамова (1979, - 1S05), анализ микропрепаратов кроветворных клеток костного >юзга и подсчет лейкоцитов в крови осуществляли стандартно (Тодорой JL ,1963).

ГГри математической обработке данных находили ошибку средней арифметической и средней взвешенной, достоверность разности между средними арифметический! двух выборок, . коэффициент корреляции И корреляционное отношение, использовали множественный регрессионный анализ и аппроксимирующие уравнений (Четыркин Ё.11, Калихмап It Л. , 1982). Статистическую обработку проводили на микрокалысуляторе "Электроника МК-61" и ЭВМ IBM РО/АТ-286 по соответствуй!?™ программам. .

У интактных белых беспородных крыс изучена индивидуальная изменчивость мета&азных хромосом в популяции клеток костного «оага при равномерной и дифференциальных й- и С- окрасках. Осуществлена морфометрическая идентификация хромосом из костного мозга к культуры крови, выделены основные типы хромосомных наборов, разработана условная их классификация, составлены идиограымы и поликарио-градаы. Проанализированы также разновидности фенотипов спутников. Кроме того, исследовано образование хромосомных наборов при разном времени действия колхицина.

Воспроизведены модели трех различных уровней регуляции кроветворения: мзгакариоцитопоэза, лейкопоэза и эритропоэаа; В сравнении с контролем изучены изменения у первой модели, количества-ые-гакариоцитов, второй -.лейкоцитов, третьей - эритроцитов и-в квд-дой из шве анализировали также образование в костнбм мозге выделенных типов хромосомных наборов. При сопоставительном анализе преимущественного образования .' одного из типов специализированных . клеток с тирами хромосомных наборов обнаружена коррелятивная связь шиду ними. Полученные данные использованы для разработки способа диагностики состояния костномозгового кроветворения.':

Изучены особенности пролиферации . структурно-функциональных типов хромосомных наборов у интактных беспородных белых крыс в разные . возрастные периоды. Рассмотрена структурная организация хромосом в метафазных наборах костного мозга у йоловозрелызс крыс линий Август, Вистар и диких.

Воспроизведена модель острой невозмепрнной кровопотери' и прослеяюиа динамика образования структурно-функциональных типов хромосомных наборов на 3, 7, 15, 25 и 60 сутки.;

Исследовано влияние общего гамма-облучения на образование хромосомных наборов после облучения экспозиционными дозами 61,

- И - •

180.6; 309,6 и 438,6 nlüi/кг ь первой декаде лучеьоЛ болезни.

Проанализированы закономерности образования структурно-функци-онадьннх типов хромосомных наборов в костном мозге и возмолные пути их регуляции. Всего на вышеназванные опыты использовано около 500 крыс.

з. яшз!ш|>«!ш жшдзжм яркяоом о юптцщ) Птсвшсрнт narra, шглсп ¡aven После выработки представлений о стандартном кариотипе у Rattus ncrve'glcüs Bei-kenbout (1973) при анализе клеток костного мозга многократно .в литературе отмечали изменения в структуре отдельных меТафазных хромосом и связывали это с эволюцией вида, feci такяе выявлен структурный полиморфизм и вариабельность морфологической структуры отдельных аутосомных. пар на стадии метафазн, но на уровне клеточной популяции костного нозгл. Для изучения обнаруженного явления с учетом размера, формы и структурной изменчивости хромосом мы разработали новую условную классификацию, использовав подходы для классификации хромосом .человека, принятые яа международных совещаниях.

Хромосомы крыс в нашей классификации распределили на семь групп от Л до G в порядке уменьшения линейных параметров, с учетом морфологической структуры и дифференциальной окраоет различных náp. При идентификации половых хромосом учитывали выводи Других авторов и известит! принцип исключения их из гомологичных пар яа ocftoee .ríeта индивидуальной морфологии и особенностей окрас-ют.

Последовательность'расположения хромосом крыс ii нашей классификации по сравнению с ранее принятой совпадает по 1-6 парам и групповая идентификация была следующей. В группах А, В и С содержатся наиболее, крупные хромосомы, но А имеет одну пару субтело- •

центриков (1), В - пять пар акроцеитрикпь и К - хромосому (2-Х-б), а С объединяет три пари метацентричесиих аутосоы (7-9). В следующих двух группах В и Е находятся по три пари средних по размерам хромосом и в первой из них акроцентрические (10-12), а во второй -метацентрические (13-15). .Группы Р и 13 объединяют остальные.самые мелкие хромосомы, но в Г ыишчени акроцентрические и У-хромосома, а в й - метацентрические.

Значительные изменения морфологии вследствие варьирования длины плеч и их соотношений обнаружили у двух наименьших пар хромосом - 18 и 19, морфаструктура которых варьировала от акроцентри-ческой до метацентрической. Поэтому их относили или к группе !•' или 3. С учетом этого выделыш три типа хромосомных наборов в клетках костного шага и по количеству пар метацентршшв в группе б их обозначили как типы I, П и II

Таким образом, в метафааных наборах хромосом ив Iслеток костного мозга первые пять групп (А, В, С,' [3 и Е) образованы из хромосом с относительно стабильной формой, а две последние" (Р и в) включали хромосомы с лабильной формой вследствие различной феноти-пической структурной организации 18 и 19 пар хромосом в разных кроветворных клетках. При этом в типе | наблюдали 26 акроцентри-ческих и Н матацентрических, в типе И - 24 акроцентрических и 16 метацентрических, в типе Ш - 22 акроцентрических и 18 метацентрических и , кроме того, в каддоы из них. по одной паре крупных еуб-тедоиентрических аутосом.

При морфэметричееком анализе 40 метафзэных пластинок, из ко--' торых типа I было 9, типа Л - 17 и типа Ш - 14 шт. . выявлены у от-до'.таньс: пар хромосом близкие линейные; параметры в р. .них типах, например, у последней метацентрической нары, что свидетельствует об идентичной степени спмралиэации хромосомных наборов и стадии

- К! -

метшбазного формирования. У других те метацентрических пар значения линейных параметров в трех типах иногда также полностью совпадали или отличались незначительно. Но при этом наблюдали и различия. Наименьшие хромосомы формировгшюь в типе I чаще у телоцен-трнческой пары и среди акроцентрнческих хромосом, в типах Л и Ш ак-роцентрические и метацентрические хромосомы были примерно одинаковые. Линейные размеры полиморфных хромосом наблюдали более крупные в типе Ш, где они метацентрические, и наименьшие в типе I, где они акроцентрические. Из этого следует, что у субтелоцентркчесютх и большинства акроцентрнческих пар хромосом в разных типах процесс .спирализации проходит неодинаково и интенсивнее о типе I, за счет чего и Фондируются наиболее мелкле хромосомы. В неадекватности линейных параметров и морфологии отдельных пар хромосом, видимо, вы-рахжгся их индивидуальные функционально-генетические свойства в разных типах клетск.

По средним Данным морфометрии построены идиограммы Г рис. 11. При расположении хромосом в порядке уменьшения их длины и с выделением групп больших, средних, малых акроцентриков и метацентриков имеются исключения: в группе в метацентрйяи были несколько крупнее ранее расположенной соседней пары акроцентриков во всех трех типах, е. в тиле I - несколько больйе и предпоследней пары из группы Г. Кпоме того, в типе I метацентрические 7 и 8 пары из группы С име.п линейные параметры немного крупнее б пары акроцентриков из группы В, но в типах П и Щ расположение их соответствует в основном принципу уменьшения линейных параметров.

Схематичное наглядное отображение всех измеренных хромосом на поликариограМмах в системе двух, координат, для одной из которых использованы длина хромосом в мкм и для другой центромэрный индекс в %, показало наименьшие границы изменчивости линейных пара-

I мкм

тал. I

тип П

II

16 - У - 19 20

тип Ш

Хромосоманй • состав I .

и груши А..

2 - X - 6

•. В.

16 - у - 03. 19_го

—V-

7-9

.'Ю-Л.

. о.

13-15 16, 17-У , 18-20 В Г: С

Рйо.1. Идкограшн хрошгомяах; наборов трдас типов из клеток костного мозга крыс

метров хромосом из типа I л наибольшее в типе II, тип Ш ааиикзат промедуточное положение.

1&кклеточнаа структурная иэмзичивость фенотнпнческой организации хромосом а популяции клеток костного мозга вцра.-2ется и в нерегулярном образовании спутников разных фенотипоз у иекоторь« акроцентрических хромосом, у хромосом другой формы их не обцару-тпиш. Вариабельность морфологии акроцэитрцчеекич хромосом достигалась за .счет спутников следутздк фенотипов; "yciqm" - 8 ШЭДЗ двух нитей, сближенных у центромеры; "ияассичешше1' - две уто|{-ченнка- нити с парообразными тельцами на конце и "шлооОрашцй)1', похойцэ на утолщенную нить иди гая прямоугольной, а иногда трап?-цкевядно*} формы. Частота нх образования раздп'й-лась. Среди грзх типов хромосомных наборов чащз хромосомы боа спугншотв наблюдали в'типе I или наели спутники в основном • "иипообраапого" фзнотша. В типах П н Ш частоту встречав мости спутников наблюдали цеоколыго вь:не с более разнообразными фенотипами- н комбинациями меяду парами.

Сравнение хромосомных. наборов ira клеток костного мозга с культурой крови показала, что нх структурная opramîaaiçta но идентична. Если из культуры кроаи, где,как известно,обладает: способностью к делению лимфоциты, нами вияилен лишь один тип П структурной организации хромосом, то в костном мозге, где делятся клетки на трёх ростков кроветворения, выделены три типа хромосомных наборов. При атом линейные параметры у.уюиосан на меток, доляшнся а "культуре на питательной среде, были меньше ipcuocoM из костного шага. Фенотипы сйутников в хромосомных наборах из культуры кровц • находили аналогичные, но частота их встречаемости и отдельных группах отличалась от типа ц из костаэго мозга

Отмеченные различия на стадии метафааы по струкгурной оргаик-аш;ни хромосом, их длине, частоте формирования спутников у вдро-

центрических хромосом в наборах из культуры крови й костного мозга можно объяснить лишь различным условиями пролиферации. В условиях культуры'крови не реконструированы сложные Взаимоотношения между, клетками, имепдие место йри их развитии в организме, ограниченный обмен веществ и набор компонентов воздействия на генетический ап-.парат обуславливает образование одного типа хромосомных наборов. В клетках же Костного мовга при том же генном наборе процессы развития проходят, при более эначительньм разнообразии обменных реакций и воздействий биохимических регуляторов на хромосомный аппарат, что и определяет образование на стадии метафазы трех типов хромосомных наборов.

Изучение трех типов хромосомных наборов Проводили также и при дифференциальных окрасках, б - окраска с применением протеолити-ческого фермента трипсина позволила более четко идентифицировать пары аутосом и выделить половые хромосомы. Сегментная проработка структуры хромосомы во многой зависела от дозы трипсина, зремэни действия колхицина и сроков хранения препаратов. В лучших случаях акроцектрические пары хромосом имели характерную окраску из темных и светлых полос, у метацентрических хромосом темные сегменты часто обособлялись в виде точек, хуже всего проявлялась о - окраска у мелких метацентрикой. В опытах мы не получали всегда идентичной в-сегментации прловых хромосом и аутосомных пар в трех типах хромосомных наборов и в пределах типа, что обусловлено, возможно, различной стадией их развития, степенью спирализации и особенностями надмолекулярной организации молекул в структуре.

При' С -. окраскё, которую получали при обработке препара-тоь в.' гидрате окиси бария и затем 2 х £ЗС растворе, такие не происходила всегда одинаковая проработка одних и тех яе хромосом, что, вероятно, взаимосвязано с различными функциональным»

■ - 17 -•

состояниями и ДОН - белковым взаимодействием.

Таким образом, в - и С - окраски хромосом не позволили полу. чмть а нетмх исследованиях информации о сухости явления структурного полиморфизма хрокюссн в популяции ¡теток костного мозга крысы и для его изучения использовали Другие методические подходы.

Явление образования трех типов хроыосошыз: наборов в костном шзге крыс не зависело от времени действия на йгаотных колхицина, по при -15 мин било на препаратах хромосомных Наборов на стадии иа-тафазы в несколько раа меньше, чем при воздействии нхшиципа 2 ч. С учетом этих результатов и выводов другин авторов по этому ЕОиро-су т использовали экспозиции колхнцпна 2 ч для изучения образования трех типов хромосомных наборов в разных моделях патофизиологических состояний.

4. СГРШУЙ2К<РЛШ!ЮШЬ!1&Я ОРГДШЯЩЯ ХШ4ВСК1

у исдщжи трггд рйзйшия зяищш! явдиаго!>1£2Н1| •

Образование структурно-функциональных ' хромосомных наборов изучал» у самцов белых беспородных крьи при мегакариовдтопоэае. -после сплйнзктомин. лейкопоэзе - в состоянии асептического воспаления И эритропоэае - в условиях воздействия высотной, гипоксией. Для воспроизведения этих моделей попользовали 120 животных и проанализировано п первой на них £>24, во второй 1081 и в третьей 752 ыетафааных наборов с диплоидным числом И хорошей морфологией, а кроме того, 498 тыс. глеток на мкготиЧеску» активность во всех трех серии? оныгии.

4.1. Образиьанко грех г^ьаа изйрров у крыс

2ЦЙ1 шгакг1рйоцатизкк>ае - шсле сашдастшош Формирований трех типов хромосомных найороь в популяции ¡сла-ток костного мозга )фые различалось при разных фиаиологичасрх

состояниях. Так. у контрольных крыс к .модели мэгакариоцитопоэва Сило больше всего хромосомных наборов типа П - 41.ОХ, несколько меньше типа Ш - 30.8% и меньше всего типа I - 28,2% в среднем (Р > 0,999), митотическая активность составила 14,1 £ 1.49.от. ид 1000' клеток костного шага После спленэктомии на 3 сут обнаружено больше всего хромосомных наборов типа I - 58,2%, мэньеэ всего с типом Ш - 16,9Х, наборов со структурной организацией по типу П -Е5.9Х в среднем (Р > 0,999). Митотическая активность у этих гашот-ных увеличилась да 42,8 £ 1,19 шт. на 1000 клеток костного мозга. Ш 5 сут преимущественное образование хромосомных наборов типа I усилилось. В сравнении с контролем у животных после спленэктоьши увеличилась на 3 и 5 сут частота встречаемости хромосомных наборов . типа I в 2.1 и 2,6 раза и значительно уменьшилось, количество мета-фазньи наборов типа П и I Митотическая активность у больных ли-вотных в эти сроки преЬышала контрольную группу в 3,0 и 1,3 раза. У прооперированных животных увеличилось и количество мегак&рйоци-тов. Если у контрольных крыс их было в костном мозге 3,6 + 0,33 шт. на 1000 клеток, то посла удаления селезенки на 3 и 5 сут число их возросло в 2,4 и 2,9 раза.

Следовательно, после спленэктомии на 3 и 5 сут находили функциональный сдвиг на увеличение. митотической активности костного мозга, количества мегакариоцитов и частоты встречаемости хромосомных наборов с организацией по типу I: Коэффициент корреляции иеяду количеством мегакариоцитов и частотой встречаемости хромосомных наборов типа I составил 0,789, то есть является положительным и достаточно высоким, »го свидетельствует о высокой сопряженности анализируемых признаков и взаимосвязи этого типа хромосомного полиморфизма с дифференцировкой клеток мегакариоцитарного ряда.

4. 2. №гг&1ктъ а полкжлтрггамэ трах ткгктп йрошстепши гтйотоп при яейгтгсзэго - л состоянии псептичестого восгсалшЕкя В поомиферирутей популяции клеток костного шага у контрольных крыс было хромосомных наборов со струстурной организацией по типу П - 43,37.. наборов типа I и Ш обраооштялось соответственно . "2.3 и 34.47. в среднем (Р > 0,99) при костномозговой митотической активности 13.7 + 1,02 агг. на 1000 клеток. В состоянии асептического воспаления у животных на 3 сут среди формирующихся метафаз возросло по сравнение с контролем наборов со структурной организацией по типу П до 64,07. в среднем, частота встречаемости хромосомных наборов типов I и Ш уменьшилась до 19,3 и 16,7% (Р > 0,999), мйтотическая активность увеличилась до 29,8 + 2,89 шт. на 1000 клеток. !!а б су/ воспаления у животных также образовалось больвэ всего хромосомных наборов типа П - 61,типа I обнаружили 21,6Х и меньше всего быго типа Ш - 16,6% в среднем (Р > 0,999), митоти-ческая активность при этом снизилась до 24,2 + 1,66 шт. на 1000 . клеток.

Содержание клеток лейкоцитарногб ряда в отпечатках костного иоэгз у животных в состоянии асептического воспаления и в нормаль-пых условиях содержания существенно не различалось, но в периферической крови количество лейкоцитов после введения скипидара значительно увеличилось. Если у интактных животных количество лейкоцитов в крови было 7.6 + 0,39 10 /л, то в состоянии болезни их число возросло на 3 сут до 9,8 + 0<37 ,10 /л. на 0 сут - до 15,3 + 0,67 . 10 /л, то есть в 1,3 н 2,0 раза

Следовательно, у крыс в состоянии асептического воспаления на 3 и б сут по сравнению с икгаэтной группой животных наблюдали активизацию кроветворения, увеличение частоты встречаемости хромосомных наборов по типу П и лейкоцитоз крови. Но так как на б сут •

по сравнению с 3 обозначилась небольшая тенденция к снижению обра-вования хромосомных наборов типа П. то для измерения сопряженности между частотой встречаемости типа П и количеством лейкоцитов в крови с учетом криволинейного типа связи считали корреляционное отношение, которое составило 0,670. Этот достаточно высокий коэффициент свидетельствует о тесной функциональной связи анализируемых показателей. Учитывая, что этот тип хромосомных наборов выделен и из культуры периферической крови, где делятся клетки из лейкоцитарного ряда, можно сделать вывод, что тип П определяет диффэ-ренцировку названного ряда клеток.

4. 3, Разантю тюах типов яоошсомньа кзборяв при эрктропоззе - воздействии шсопгй ггяшгаза

В контрольной группе крыс к этой модели больше всего формировалось. хромосомных наборов типа П - 45, ЪХ, типа'Ш - 32.82 и тша I

- 21,72 (Р > 0,999), митотическая активность составила 11,0 + 1,10 егг. на 1000 клеток. На 4 сут после воздействия высотной гипоксией Г животных встречали среди пролиферируицей популяции клеток наиболее часто хромосомные наборы со структурной организацией по типу Ш

- '45,9%, несколько меньше .типа П - 38,37. и реже-всего типа I -15,82 в среднем (Р > 0,999), митотическая активность клеток у животных была 20.3 + 2,32 ит. • на 1000 клеток костного мозга На 6 сут в гкпоксическом состоянии у животных произошли более значительные изменения в соотношении типов хромосомных наборов и типа Ш увеличилось до 72,32,' а I и П типов наблюдали 11,7 и 16,02 ( Р > 0,999) при костномозговой.митотической активности 18,6 +1,73 ит. на 1000 клеток. ■ .

У подопытных крыс в гипоксическом состоянии по сравнения с контролем увеличилось количество эритроидных клеток. ■ Если у затактных крыс в отпечатках клеток костного мозга насчитывали клеток

зритроидного ряда 26,2 + 1,17%, та в гнпакстести состоянии их число возросла на 4 сут до 33,0 ± 1.50Х и 6 сут до 54,2 ± 0,87%.

Таким образом, у животных после воздействия гипоксией по сравнению с контролем наблюдали повышение частоты встречаемости хромосомных наборов с организацией по типу Ш на 4 сут в 1,4 и 6 сут в 2,2 раза при увеличении клеток зритроидного ряда соответственно в 1,3 и 2,1 раза. Коэффициент корреляции между частотой встречаемости хромосомных наборов типа Ш и количеством дифференцированных клеток зритроидного ряда был 0,867, го есть очень высокий и указывал на тесную сопряженность этих признаков. Следовательно, структурно-функциональная организация хромосом в ыетафазе по типу Щ определяет дифференцировку клеток в направлении зритроидного ряда 4.4 Способ шгоедагелия на хромсссмгюа уролзй Лутппгшшанпго состошрга южпииозгоксга крппетпоргнгя В настоящее время представление о костномозговом кроветворении составляют на основе изучения морфологического состава разных типов клеток, крови и костного мозга. Но при этом не различают в морфологическом отношении меточные элементы в родоначальных первых трех классах из четырех, способных к делению: полипотентных, частично детерминированных полипотентных, уишютеитних клеток-предшественников и морфологически распознаваемых пролиферирую-щих клеток, что вызывает трудности в точной диагностике. Методические рекомендации по цитогенетическим методам диагностики хромосомных болезней Минздрава СССР (1(370) предусматривают при обычной рутинной окраске анализ не Ненее 11 метафаз.

ife.Mii разработан способ диагностики костномозгового кроветворения для экспериментальных животных на основа обнару«£кного явления, который заключается в следутишрМ: На стандартно приготовлекьщ микропрепаратах хромосом из клеток костного мозга проводят отбор

ШТаДчаних и'лш:тшшк о«з ьиоора по степени спирализиции, но с полним числом, минимальным шиюлгнием и четко различимой морфологией хромосом. В каадой такой пластинке аналиаиру*» количество субтедо-центрических, акроцеитрическня и ыетацептрических хромосом, а затем определяй! типы хромосомных наборов и их соотношение при статистически достоверных количествах. Кроме того, на этих препаратах выявляют митотическую активность костного мозга. Полученные данные при акстремальных воздействиях сравнивают с контролем и составляют представление, о патологии и адаптивных изменениях.

Так 1сак у крыс при разных функциональных состояниях происходят различные изменении и преимущественном образовании одного из типов хромосомных наоо; оь и варьирование митотической активности, то для обобщенного учета атих иоказатодей наш разработан критерий образования хромосомных напоров, представляющий собой произведение митотической активности ь шт. на 1000 клеток и частоты встречаемости соответствующего тина, ьиралешюго в долях от единицы. Это позволяет .четче оценить состояние гьмопоэза (рис. 2).

ПредлагайшД способ определения состояния костномозгового кроветворении в отличие от ¡шьветных ы«тодои -выявляет изменения в гемопоээе на более ранней стадии развития клеток по сравнению е морфологически распознаваемыми.

й- АНАЛИЗ шздздзнич ишма)

ИЗ КОМИОГО ¡ЛОГА ШГШГГШД Ш>Ш РА31ШХ ПОПУЛЯЦИИ

Для и&учеиил хромосомных наборов ь костном мозге крыо различного генетического происхождения проанализировали 60 белых беспородных кра: разного возраста и пола, • И крие ши«ш Август и 10 линии Ьистар обоих полов, 3 диких серых самца. У зтнх животных в пзиудоции юиъхж кос иного мюга обнаруживали хримосомяие наборы

S

\\\\V

см

о

OJ

О)

к о

со

£ о

о

о co-

in

а M

о

я 10 к

о) g &

О о

со

<J1 s

^Кратарий образования типов хромосомных наборов, шг/ ш Ю00 ¡теток

□

о ¿1

трех типов.

lia беспородных крысах изучили механизм формирования хромосомных наборов в разные периоды онтогенеза, проанализировав более 2000 ыетафааных пластинок с диплоидным набором и хорошим разбросом хромосом. 350 тыс. клеток костного мозга на митотическую активность.

Образование хромосомных наборов в разных возрастных группах различается по соотношению частот трех типов и митотической активности. Самая высокая ее активность 47-66 шт. на 1000 клеток была у крыс молочного периода массой 30 г, к половозрелому возрасту число клеток в митозе снижалось в'3-3.5 раза'и затем поддерживалось на этом ypouie до поздних этапов онтогенеза. В соотношении типов хромосомных наборов были близкие значения от молочного возраста крыс до наступления этапа старения: в среднем около 402 наборов относили к типу П, среди двух других типов чаще наблюдали преобладание типа Ш. а иногда наборов тира 1 и Щ было примерно одинаковое. У стареющих животных массой 300-470 г формировалось больше всего хромосомных наборов, определяющих мегакарио-цитарний ряд при снижении числа двух других типов.

Выявленную зависимость образования трех структурно-функциональных типов от. возраста животных описали аппроксимирующими • функциями вида:

Y - аа ехр ( а4Х + ааХа t аэХа), где Y - критерий обрачования типов хромосомных наборов;

X -масса кивогных; а0, а,, а-а и а3 - коэффициенты уравнения. Уравнения предетшитк/г собой экспоненту с'лсказателэм степени в виде полинома, нулевой член которого располагается как сомножитель черед зко полентой.

Закономерность интенсивности образования хромосомных наборов

типов I, Пи Ш '' крыс самцов в онтогенезе аппроксимировали следующими уравнениями:

- 39,99-ехр (- 0,03461X +■ 0,1496 10Э Ха - 0,1734 ю"* X3), Уп = 37,10-ехр (- 0,02029X + 0,7727 10* Ха- 0,9577 10"7ХЭ), Гщ - 28,76 ехр (- 0.02035Х + 0,7182 10"* Ха - 0,9084 107 X®) и для каждого типа хромосомных наборов построили теоретические линии регрессии (рис. 3).

Для измерения криволинейной связи между интенсивностью образования хромосомных наборов и массой животных на разных возрастных этапах определили корреляционное отношение, которое было для типа I - 0,093, типа П.- 0,895 и типа Ш - 0,900. Эти коэффициенты такде свидетельствуют о тесной взаимосвязи анализируемых признаков.

Представляется, что различная интенсивность образования трех стрргтурно-фргкционалъит типов хромосомных наборов в разные возрастные периоды связана с общими онтогенетическими механизмами развития. При изучении механизмов старения обнаружено их подобие у крыс, человега и других млекопитающих (Дйльман ЕМ., 1986)1 С увеличением возраста известии тромбоците«:«, нарушение микроциркуляции и сосуднсто-тромбоцитарного гемостаза (Лабораторные ..., 1980), снижение гуморального и клеточного иммунитета, замедленное очищение крови от чужеродных субстанций и микроорганизмов (Петров Р. К ,1987), сдвиги в энергетическом гомеостазе (Дйльман Е 11,1986). Данные нарушения обусловлены особенностями функционирования клеток мегаглриощ"тарцого, лейкоцитарного и зритроидного ростков крови и другими факторами, а таюке, видимо, выявленными наш возрастными изменениями в интенсивности образования трех типов хромосомных наборов - маркеров вышеназванных ростков.

- 2Г. -

Масса животных, г

Рис. з . Динамика обра зова пил сгруктурно-футпсциопалгных ■ типов хромосомных наборов у крыс разного возраста.

1-- эмпирические точки; 2 - средние взвепегоше эмпирические значения; 3 - теоретические линии регрессий

- 27 -

■ а СГР/ЙС&ШГЗ етшгушьсяше.'гашьгаа шш . sc'trjcaiatia плсс?сп у пли гаяет алтея нроадюгви!

Поспею илнеленне кровопотери проводили у самцов крыс с массой в соеднем 201.3 г, всего на опит использовали 94 животных. Образование хгомоссмных наборов в популяции клеток костного мозга изучали на 3, 7, 15. 25 и 60 сут после операции и проанализировано 2524 мета1вз с диплоидным числом хромосом и 420 тыс. клеток на гштотическув активность.

У контрольных крыс наблюдали хромосомных наборов типа П -44,IX, типа [П.- 33,62 и типа I - 22,37. в среднем (Р > 0,999) при мятотической активности 12,1 t 0,97 клгток й митозе на 1000 просмотренных.

Среди больных гйшотньй максимальная пролийерацля была на 3 сут после кропопотери и превосходила шнтроль в 2.1 раза (28 шт. на 1000 клеток). На 7 сут• мистическая активность несколько снизилась. ко оставалась довольно высокой - в 1,3 раза выше контроля. На 1Б сут число клеток в митозе уменьшилось по сравнении с предыдущем сроком в 1.7 раза и почти не отличалось от контроля. Ib 25 к 60 сут. у животных наблюдали период спокойной митотическьй активности костного мозга я показатели (11,5 и 9,5 шт. на 1000 клеток) были более низкие, чем в контроле.

Следовательно, нормализация шготической активности после кровопотери в объеме 2,5% у большинства крыс наступала к 15 сут.

В соотношении типов хромосомных наборов после кровопотери во все сроки наблюдения преобладали хромосомные набору типа 1 aera-кариоцитарного ряда, из которых, как известно, образуются тромбоциты. Тромбоцитопоэа в этом состоянии отмечали многие исследователи. У подопытных кивотннх по сравнению с контролем в соотношении типов было наборов типа 1 больше на 3 й 7 сут в 2,1 и 2,0 ра-

еа, на 15 сут - в 2,6 раза, иа 25 н 60 сут - в 2,4 раза. Но особенно иного их образовывалось на 3 н 7 сут вследствие повышенной цнтотическай активности. .

Частота образования 'хромосомных наборов тина-Ш эритроидного ряда на 3 и 7 сут (29,1 и 31,42) мало отличалась от контрольных гатотных. Ко учитывая, что у адо'пшх в- это время после кравоко-тери митотическая активность превосходила контрольную в 2,1 и 1,8 раза, то днф4ереициров1«а, клиток в направлении эритроидного ряда превышала контроль приыьрно в этих пределах. В носледухздлй пе- . риод с наступлением нормализации митотической активности частота встречаемости хромосомных наборов типа Ш снизилась на 15 и 25 сут в 1,8 раза и 60-су'т ь 2,1 рааа, а следовательно н их количество.

У гошо'лшх после кровопотери частота встречаемости хромосомных наборов типа П лейкоцитарного- ряда на 3 и 7 сут по сравнению с контролем уменьшилась в 1.9 и 1,8 рааа. Однако, учитывая повышенную митотическуи актишюсть и этот период (увеличение в 2,1 и 1,8 рааа) общее количество цдетск, дифференцирующееся и направлении лейкоцитарного ряда. Сило у больных животных близким к уровни интактных. В доследующем с уменьшением митотической активности у -животных хромосомных наборов типа II обрааовшадось на 15, 25 и 60 сут меньше, чем у контрольных «иьотиых, так как частота их образований иа сравнению с контролем уменьшилась в 1.7; 1,6 и 1,4 рааа соответственно. ' '

Основной адаптационный период у крыс проходил при повышенной митотической активности костного мозга и заканчивался к 15 сут. В эта время у животных происходило интенсивное образование хромосомных иабороь типов 1 и Ш в основном за счет повышенной митотической активности. В последуиций период при снижении пролиферации клеток костного мозга наблюдали повышенное образование хромосом-

. 29 -

нух наборов эа счет снижений количества типов П и Ш. Таким образом, для восстановления нарушенного комплекса внутренней устойчивости в результате кровопотери на разню Этапах включались различные авторегуляционные механизмы.

Формирование типов хромосомных наборов после кровоиотери аппроксимировали следующими уравнениями:

^ - 2,630-ехр (3,492Х°'ЯЗ- 2.323Х0'8 + 0,4152Х°'73), - 5,098-ехр (1,б05Хо,йз- 1,5&Ж0,5'* 0,31МХ0'74),

. Уш - 4,032-ехр (0,877Х0'5 - 0.350Х f 0,0286Х1,5 ).

а 1

Коэффициенты детерминации рёгресскй: й* « 0.81; . Г? « 0,53 и

з П

йщ- 0.79 и стандартные отклонения: С| -.1.45; Сц - 1,12 и

Сда - 1.22 для этих математических моделей показывает, что получен-.ные уравнения а/екватны рассматриваемой ' Вависимости. По уравнениям для. каидого типа хромосомных таборов построили теоретические линии регресст! Грие. 4). .

'Из гоафика видно, что пролиферация'наборов типа Г во все срогсгг наблюдения превышала контроль й следующих пределах: 4, в, 3,0; 2,7; 2,3 и 1,9 раза соответственно на'З, 7, 15, 2а и 60 суг после кровопотери. Интенсивность образования хромосомных Наборов типа Ш превосходила контроль линь на 3 и 7 сут-в 1,6 раза, затем их количество по сравнении с контролем уменьшилось в 1,6; 1,9 и 2,6 раза соответственно к 15, 25 и 60 сут После кровопотери.. Критерий образования хромосомных наборов тина П у больных -животных по сравнению с контролем лишь.несколько.увеличился на 3 сут (в .1,2 раза), на 7 сут был на. уровне контроля, а затеи этот показатель уменьшился в 1,4; 1,6 и 1,8 раза соответственно нз 15.2С и 60 сут.

Таким образом, при моделировании кровопотери у крыо наблюдали прежде всего усиленный мегакариоцитопоэв и повышенный эритро-позз с 3 по "7 с г? и резкое СкИяенйе этих процессов в период с 7

îî-OJîl. .С y t v. a

Piic. 4 . Дшиивш образования структурно-фушщионалышх типов хромоеошш laûopoB у icpuc Поел« кровопотера, I - впЕирдзаскша точки} 2 - средние взвешенные -эшшри-Чаcíala значения! 3 -теоретические лиши рох-расски.

- 3i -

по 15 сут.

Сравнительная (соличественная оценка интенсивности пролиферации трёх типов хромосомных наборов, определяющих мегакариоцитар-ный, лейкоцитарный и эритроидныИ ряди кроветворных клеток позволила на более ранней стадии определить направления гемопоэза по сравнению с морфологически распознаваемыми (метками. а следовательно, глубяв раскрыть механизмы самозашиты и авторегуляции организма.

7. шзлаюшяз остршс ди оезго шга-оаяучшпш йа (a^mygikbsyitiaíioiíajbh's imi-wrnxsam'ййшров

Радио чуветыггельность крыс »изучали у самцов массой 115-150 г после доз Ьблучения-51„В: 160,6; 309,6 и 438,6 мКл/кг (200, 700, 1200 и 1700 р) па 3-4, б и 9 сут и использовали ría модель 66 животные. Иавбольпую Гибель животных наблюдали после облучения дозой 438.6 mIUi/кг - 53%, несколько меньше при дозе 309,6 мКл/кг -Z7X, при дозе 180,6 мКл/кг погибло 7%. при дозе 51,6 мЯя/кг в первой декаде смертность отсутствовала.

Анализ образования трех типов хромосомных наборов проводили лишь после облучения дозами 51,6 мКл/кг на 3 И 6 сут, 180,6 й 309,6 иКл/icr на 3 сут, п остальных вариантах опытов хромосомных наборов с полнил числом не обнаружили. Всего в этой серии опытов проанализировано 574 хромосомных наборов с диплоидным Числом и "52 тыс. icíeroK на И1Гот!Гчеекую активность.

. У шгарольньи гснвотиых хромосомных каборсз типа !. Пий находили переднем с частотой 23,7; 41,3 и 30,0% ссотвотствснпо (Р > 069Э) и наблюдали митотическув активность 17,1 ¿0,33 от. на 1000 клэток.

Ítoofíi4ecKaH активность после облучения усштваласЬ у крьв лишь при наименьшей дозе облучения и на 3 cyt, в остальных вари-

антах опыта она угнеталась и в большей степени при более высоких довах обл; тения.

J3 соотношениях типов хромосомных наборов у животных после облучения дозами 51,6; 180,6 и 309.6 мКл/кг на 3 сут по сравнению с контролем увеличилась частота встречаемости хромосомных наборов типа I в первой группе в 1.8 раза и двух других - в.1,4 раза. Частота встречаемости хромосомных наборов типа П и Ш уменьшилась при дозе 51.В • мКл/кг в 1.4 и 1,7 раза, при дозах 180,6 и 309,6 мКл/кг снизилось количество наборов типа Ш в 1.3 и 1,4 раза соответственно и незначительно типа П. IIa б сут при наименьшей дозе облучения хромосомные наборы с диплоидным числом и четкой морфологией наблюдали в единичном числе и чаще типа I.

Таким образом, под влиянием различных доз общего гамма-облучения активизировалось формирование хромосомных наборов, определявших мегакариоцитарный росток, но при более низких дозах облучения это происходило на фоне повышенной митотической активности, а при высоких - на фоне снижения гемопоэаа. При этом наибольшему угнетению у облученных животных подвергалось образование хромосомных наборов, являющихся маркерами эритроидного ростка.

Кроме того, в этой серии опытов изучили характеристику числового комплекса хромосомных наборов с выделением следующих семи Групп с числом хромосом: 7-15, 16-25, 26-35. 36-41, 42, 43-56 и тетраплоиды, проанализировав 3216 пластинок. У всех облученных дивотных наблюдали прежде всего уменьшение в костном мозге количества хромосомных наборов с числом более 42, снижение числа клеток с диплоидным набором хромосом и увеличение доли анеуплоидных наборов, причем эти процессы проходили с большей интенсивностью при более высоких дозах облучения.

Анализ процесса гемопоэза у крыс после облучения проводили

по критерию образования и показателю активности Формирования типов хромосомных наборов. Последний представляет собой произведение числа клеток в митозе с диплоидным набором хромосом и частоты встречаемости типов в долях от единицы. При этом число клеток в митозе с диплоидным набором хромосом определяли путем умножения доли их всречаемости на значение митотической активности.

Интенсивность пролиферации типов хромосомных наборов на 3 сут после облучения разными дозами аначительно отличалась (см. таблицу). Из' таблицы видно, что после облучения дозой 51,6 мКл/кг по сравнению с газнтролем критерий образования хромосомных наборов I и П типов увеличился в 3.4 и 1,3 раза, а типа Ш был на уровне контроля, при этом показатели активности формирования возросли в 5.2; 1,9 и 1,6 раза соответственно. После облучения дозо^ 180,6 мКл/кг произошло уменьшение обоих этих показателей в 1,3; 2,1 и 2,4 раза в сравнении с группой интактных животных. При воздействии дозой 309.6 нКд/кг критерий для I, П и Ш типов резко снизился - в 7.7-, 11,4 и 15,1 раза, но еще более сильно уменьшились показатели активности формирования - в 11.9; 17,0 и 24,7 раза. Таким образом, критерий образования типов хромосомных наборов и показатели их'активности формирования аналогично характеризуют процессы направлений гемопозза. но критерий образования типов хромосомных наборов определяется при аначительно меньших затрата* . времени.

Следовательно, развитие лучеьой больани в первой декаде после облучения обусловлено угнетением в наибольшей степени эритро-■ иддаго, несколько меньше лейкоцитарного и меньше всего мегакапио-цитарного ростка и зависит от дозы облучения.

Таблица

Характеристика пролиферация типов•хромосомных наборов у крыс на 3 сутки после облучения разнши дозами

Группа* ! Митоти-1 Ч&стота встречааш-подоплг- i ческая сти типов хромосомных ! актив- ! них наборов, 2

животных ¡hoctbi !

! шт. /1000--------------------

! клеток I I ! П ! Ш

Критерий образования • I Клеток в ! Активность форми-- типов хромосомных на- ¡митозе с I рования типов хро-боров, ягг./1000 клеток! наборам I мое омни:-: наборов, ! хромосом 1 шт. /1000 клеток

-----------------------!2п, шт. / -------------------

I ! П ! Ш ! ЮООклет. 1 I ! П ! Ш

w

Интактные 17.1 28,7 41,3 30,0 (контроль) +0,33 . После облучения дозами, мКл/кг:

51',б" 30,9 54,0 28.7 17,3 +4,22

180,6 9,1 40,9 36,4 22,7 +0.5?

309,6 1,6 40,3 33,6 21,1 +0,28

4,91 7,06 5,13 3,3 0,95 1,36 0,99

16,-69 8,87 5,35 3,7? 3,31 2,07 0,64 0,62 0,34

9,0 4.90 2,58 1,56 1.8 .0,74 0,65 0,41 0,2 0,08 0,08 0,04

- 35 -

0. ЗЛКОШЯРИССТИ ОБРАЗОВАНИЯ В КССТНОН ИОЗГЕ

стршур1{о-фэтпа1ианаль!зи хрошшзшх клборов-

1!лркерсз трех ростков !пюеетшре1п1я

■ Процессы' ' образования, трех типов хромосомных наборов в костном .мозге ' проходят в определенной внутренней среде клетки и устойчивые закономерно повторяющиеся преобразования морфологии двух пар хромосом 'связаны прежде всего с внутриклеточным уровнем регуляции и работой определенных, генов. С учетом концепции дифференциальной'активности генов и представлений об уровнях структурной организации'хромосом, образование полиморфных хромосом в трех. типах наборов,. видимо, • взаимосвязано с избирательной экспрессией. Ренов в соответствии с направлением дифференцировки, . модификациями •' упаковки .нуклеогистоновой. нити и также с разной последующей степенью- спираяизации одних и тех же участков плеч. , Удлинение ■ или ■ .укорочение плёч. у Полиморфных хромосом не может осуществляться' за ' счет Перестроек, так как аберрации, в своем большинстве, способствуют патологии и явлются-довольно редким явлением, а. в наших исследованиях, обнаружена хорошая воспроизводимость образования трех типов наборов у крыс при разных физио-. логических состояниях. • / "'• ' '■

. Изменения в интенсивности образования трех типов хромосомных наборов,'.очевидно, связаны с более йысокими уровнями регуляции. : Вадклеточный..уровень-' регуляции, вдияюэдй на, состояние плазматических мембран, а также направление дифференцировки клеток отмечали .многие авторы. .Принтом - важная роль отводится гормонам и работе желез внутренней секреции (Гуревич 0. а. ,1985 и др.).

В этой связи' представляется, что с железами внутренней секреции, связано формирование типов хромосомных наборов/ их повышенное образование на ранних этапах онтогенеза, снижение ин-

тенсивности пролиферации к периоду зрелости, . а также изменения при различных экстремальных воздействиях.

Высшие интегральные функции и переработка информации из всех органов и систем организма, а также внешнего мира осуществляется, как известно, в центральной нервной системе. Следовательно, на этом уровне регуляции Имеется большая потенциальная ..возможность через соответствующие гуморальные звенья оказать влияние и на образование трех типов хромосомных наборов,

Названные уровни регуляции, обеспечивая» определенную интенсивность образования структурно-функциональных наборов трех типов при различных Воздействиях на организм. Средй изученных.экстремальных факторов наиболее сильных! раздражителей. для митотической активности в сравнении с контролем были сплейэктомия, асептическое воспаление и облучение дозой 51., б мКл/кг, от воздействия которых на 3 сут отмечали рост пролиферации кДеток костного мозга соответственно в 3.1; 2.2 и 2,3 раза. В последующее сроки наблюдений показатели митозов снижались. При более высоких дозах облучения митотическая активность угнеталась и была ида контрольной.

Соотношение типов хромосомных наборов различалось в экспериментальных группах, причем в большинстве Из Них доминировал тип 1 -маркер мегакариоцитарного ряда Это отмечали у крыс после сплея-эктомии на 3 И 5 сут, в моделях кроВопотери на 3-60 сут и в Первой декаде после облучения, но на фоне различной митотической активности. У животных после облучения разными дозами возникают одинаковые изменения в направлении гемопоэза, но при больших дозах пролиферация угнеталась. Следовательно, на интенсивность образования структурно функциональных хромосомных наборов влияет природа и сила воздействующего фактора.

Преимущественное образование хромосомных наборов типа П -

маркера лейкоцитарного ряда наблюдается в норме у интактных животных. В состоянии асептического воспаления их число увеличиваете*} на 3 и б сут .на фоне повышенной МитотйЧеской активности, но к 10 сут происходит увеличение частоты встречаемости типа 1 и снижение доли двух других типов, Таким Образом, усиленной образование хромосомных наборов типа П Но сравнению с интактныыц гапзот-'ними наблюдается лишь в раннем периоде асептическогб воспаления. Зги факты свидетельствуют о подвияностй процессов образован!« типов хромосомных наборов.

Доминирование хромосомных наборов Tmta Ci - маркера аритройд-пого ряда Происходит при. воздействии гипоксией, Что отмэчали на 3 и б .сут на .фоне, повышенной пролиферации клеток костного мозга.

. СШаруяенные нами закономерности спецлфичеаадх изменений в .костном гздзге соотношений трех структ}фна-фрк1пюнальных типов xpoMocowîiiX наборов на Фоне различной митотнческой активности в разные этапы онтогенеза и при:, воз действии зкстреиад>нШ£ Факторов неадекватной природы и силы дают возможность прогнозировать ин-' TéiiciiBÎiocTb образования наборов в данных состоЛШ'.пх. Выявленные зависимости можно применить для получения моделей е првимукест-в'епнда образованием одного на типов Зфоисеошшх наборов и использовать в мэдшю-бдалогическйх исследованиях,

. ■ asmm Н885д*1 и падошхз

1. У крыс разных популяций: беспородных Салш, линий Август, Едстар и диких серых из вида Rattus nom-51 сиз borkenhout в попу-•дащга меток костного iîogra, где идет ббразованнз трах ростков кроветворения, впервые обнаружен стрзтоуряый полиморфизм хродасоц вследствие изменения длины плач у дзух кшп.йньгли йар аутосоы и выделены три основные : типа хромосомных наборов, различайдихся

числом акроцентрических и метацентрических хромосом. Из 42 хромосом набора имелось в типе I - 26 акроцентрических й. 14 метацентрических, в типе П - 24 акроцентрических и 16 метацентрических и типе Ш - 22 акроцентрических и 18 метацентрических и. кроме того, в каждом из лих - одна пара крупных субтелоцентрических. аутосон. Иа культуры же периферической крови выделен один тип хромосомных наборов с морфологической организацией по типу Д . "

2. У акроцентрических хромосом в наборах выявлены фенотипы спутников: "усики" - в виде двух нитей, сближенных у Центромеры; "классические" - две утонченные нити с шарообразными тельцами яа конце и "пшпообрааные". похожие на утолщенную нить или шип прямоугольной. а иногда трапециевидной формы. Среди типов чаще йе имели спутников хромосомы типа I или у отдельных пар возникали в основном фенотипа "шипообразные". в типах П и Ш присутствовали спутники в более разнообразных комбинациях, .это дополняло полиморфизм хромосом в популяции клеток костного мозга и создавало определенное разнообразие их метафазных морфоструктур.

3. Идентификация трех типов хромосомных наборов в соответствии с разработанной намй классификацией проведена при равномерной и дифференциальных 0 - и С - окрасках. При их анализе не обнаружено критериев для объяснения феномена структурного полиморфизма двух пар хромосом, которые в типе I имеют акроцентри-ческую морфологию, в тйпе Ш - метацентрическую, а в типе П - одна пара МетацектриЧеская, а другая акроЦеЯтрическая. При одинаковой экспозиций колхицина более мелкие размеры имели хромосомы ь типе I, что подтвёрлдено морфометрйческими данными й прослеживается на фотографиях кариотйпироваичых наборов.

4. Три типа хромосомных наборов образуются в костном мозге крыс негависида от продолжительности действия' колхицина, но при

меньшем его воздействии накапливается меньшее число метаЛаз и с более длинными плечами хромосом. Для учета интенсивности образования, трех ■ 'типов зфомосоннш набооов целесообразно выдергивать зкспозШйп (садхацн.ча S часа..

5. íía "моделях • тоех различных уровней регуляции кроветао-рмдаа: ■ Ъгагакаэдюцитбпоэзй .-■ после спленэктомии. лейкопоээа -й' состоянии .асептического воспалений и эритропозза при воз-дэ'Пс^ви'и гипоксией обнаружно в сравнении с контролем усиление ¿ШтЬтической шттйости .и иеодинакойые соотношения трех типов хгзоуосойж набог-оВ'в костном цозге. В первой . модели иаблкда-Jut ш 3 si. S сут одикциональныя.сдвиг на увеличение количества MeráKáPiiomiTo.B и частоты .встречаемости хройоеокныя наборов с оргжшзацп'зй по- тялу 1¡ зЙ второй модели выявили па 3 ¡1 б Лз&соЦитоз ■ кровй и повкйенш. .в костном гшге встреча-emcTír' .хроврео:.?ных набооов с организаций по .типу Й ti в третьей шдэли обнаружили в костном ■ йозгё на 4 и 6 су? усиление процессов ftaíDtóéínyj ¡меток эойтр'ойдного ряда и образования хромосомных. наборов с организацией iio типу Ш при высоких ко-а$фйцйоптах -корреляция -мегиу ' айшшвйруейыми. йризнакаии. В этой связи установлено, что тип I ~ 'маркер шгагсарноЦцтарно-го. raí/П - -.¿ейкоадггаргюго и тай EÍ - зр;пфЬнд1ЮГ0 ряда кроветворна клеток. . . . ' •

6. Ш основе учета стру1ггхр1:о-1уу11[ш,иональ!1ьс{ типов хроыосон-нык наборов, - маркеров дгей^ранцирошад мегакарггацхгарного. лейкоцитарного и зритроиднпго рядов !фови, а тазкй и юггоТиЧесюэй активности разработан'способ определения состояния костножагового кроветворений.'- поэеоляший составить представление о геноноззо на уровне. яиффереицнроЕки родоначальник клеток, ТО есть я,а болео ранней стадии, развития по сравнении со специализированные клетками.

7. Разработаны показатели образования для трех типов, хромосомных наборов, учитывающие в одних случаях митотическую активность и частоту встречаемости хромосомных наборов, а в других -еше и долю клеток с диплоидным набором хромосом, позволявшие точнее сопоставить направление формирования разных ростков гемопозза при различных функциональных состояниях организма.

8. У крыс разных возрастных периодов выявлена •различная интенсивность образования трех структурно-функциональных типов хромосомных наборов. Самые высокие показатели интенсивности образования хромосомных наборов типов I. П и Ш наблюдаются в молочном периоде, к половозрелому возрасту их количество снижается, а в позднем этапе онтогенеза вновь перестраивается гемопоэз на преимущественную пролиферацию хромосомных наборов типа I. маркера мегакариоцитарного ряда, при уменьшении двух других типов, но в большей степени типа Ш. маркера эритроидного ряда.

9. После острой кровопотери у крыс по сравнению с контролем отмечали повышенное образование хромосомных Наборов, определяющих иегакариоцитарный ряд, в течение всего срока наблюдения - 3, 7, 15, 25 и 60 сут, хромосомных наборов, определяюшйх эритроидный ряд - на 3 и 7 сут и хромосомных наборов, определяющих лейкоцитарный ряд - на 3 сут.

10. У животных в первой декаде общего гамма-облучения дозами 51,6; 180,6; 309,6 и 438,6 мКл/кг в сравнении с контролем изменяются процессы формирования числового комплекса наборов, митотическай активность и частота встречаемости трех структурно-функциональных типов хромосомных наборов, но в разной степени в зависимости от доз. После дозы 51,6 мКл/кг на 3. 6 и 9 сут увеличивается количество клеток с несбалансированным

числом хромосом и снижается доля хромосомных наборов с полным диплоидным числом, при более высоких дозах эти процессы нарушений возрастали и после дозы 438,6 мКл/кг на 3 сут формировались только единичные анеуплоиды. Ыитотическая активность клеток костного мозга увеличивалась у животных после дозы 61,6 МКл/кг на 3 сут и угнеталась в остальных вариантах опыта, причем в большей степени при более высоких дозах воздействия. Среди трех типов хромосомных наборов наибольшему угнетению подвергался маркер эритроидного ростка и наименьшэ-му - каркер Уёгакариоцетарного рос пса кроветворения;

11. Закономерности образования трех структурно-функциональных типов хромосомных наборов в костном мозге крыс в разные периоду онтогенеза и при разню патофизиологических состояниях обусловлены потребностями организма в определенных клеточных элементах ¡срови и различным уровнями регуляции от субклеточного до рефлекторного. -

12.' Полученные результаты по интенсивности образования трех струтурно-функциональных' типов хромоссмньй наборов в популяции меток костного мозга иа моделях: ¡.¡эгакариоцитопозва, лейкопозаа,. эритропоэза, кровопотери и облучения дополняют и и углубляют известные данные об особенностях кроветворейш в этих условиях и ыогут быть зтетраполированы в клинической практтсе при решении проблемы защиты организма от заболеваний.

1 В связи с тем. что КаШз погуе^юиз ВзгкепНоиЬ является оригинальным природным объектом по онтогенетическому устройству кроветворных клеток и в соответствии о проведенными исследованиями вознтсапг следующие предлояания.

• а) Для дальнейшего изменил структурной и функциональной характеристики хромосомного аппарата йа стадий метафззы п его роли

В дифференцировке клеток как один из методических подходов ыояно использовать крыс молочного периода, в популяции костного «ззга которых образуется наибольшее количество хромосомных Наборов, а Также получать лабораторные модели с преимущественным формированием одного из типов хромосомных Наборов.

б) Для углубления знаний в области онтогенеза и Механизмов старения целесообразно анализировать возрастные изменения у крыс с учетом образования трех структурно-функциональных типов хромосомных наборов от самых ранних До поздних периодов явдзнИ,-

в). Для расширения знанйй об этиологии болезней, связанных с кроветворением, и выяснения закономерностей гёмопоэза в этих условиях на уровне рбдонаЧаЛьных нролиферирукгалх .клеток следует воспроизводить патологические состояния на крысе и затем осуществлять соответствующую экстраполяцию. .

СПЖЗОЙ ШШШШШХ РШП ПО ШШАШ грЖСКР-ГАДШ!

1. Чабада Л. Й. , 5ункциоиально-структурные преобразования хромосом 6 различных пролиферируицих кроветворных клетках костного мозга белой крысы //Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1986. - N 3. - С. 78-80.

2. Чабала Л. И. Влияние скипидара как. мутагенного фактора на хромосомные наборы костного мозга белых крыс: Тезисы докладов на заседании СекЦйй генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера", МНТО ГКНГ. 2-4 июля 1986 г. - Орджоникидзе,'1986. - С. 138.

3. Чабала Л. Я Природа полиморфизма хромосом клеток костного моага белой Крысы //Тезисы дЬ|<яадов Второго Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. Министерство здравоохранения РСФСР. Всероссийское научное общество гематологов И трансфузиологов. ЧёЛЯбйнск. 1985. - б. 239-240.

4. Чабала Л. И. Особенности полиморфизма хромосом в клетках костного шага беспородных крыс //Тезисы докладов У сгезда ВОГиС им. Н И. Вавилова. - 1987, - Т. 1. - С. 293.

5. Чзбала Л. It Способ измерения абсолютных линейных параметров, хромосом //Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1988. - HI. - С. 86-87.

6. Чабала JI И.. Маштак С. Й. . Полякова HL А. Образование различных структурно-функциональных типов хромосомных наборов у белых крыс после острой кровопотерн. . Воронеж, 1988. - 37 с. Дэп. во ВИНИТИ 22. 02. 88 г. Ñ 1381-Б88.

7. Неожиданные свойства хромосом: I Заметки о советской науке и технике! //Наука и жизнь. - 1988. - N 11. - С. 40.

8. Чабала Л. 11 . К!ашкин С. И. Особенности морфологии метафаа-ных хромосом в кроветворных клетках белой крысы //Генетика. .1990. - Т. 26. - С.. 18Б8-1864.

9. Чабала Л.И. Закономерность образования трех типов хромосомных наборов в костном моаге крыс в различные периоды онтогенеза //ДАН СССР. - 1991¡ - Т. 318. II1. - С. 217-220.

, 10. Чабала JL It Тканевой полиморфизм хромосом в ¡слетках костного мозга белой крысы (Rattus norvegicus Berkenhout) //Генетика популяций животных; ЕГУ, 1991. - С. 75-84.

11. Чабала JL It Об особенностях образования различных типов хрошеомных наборов в кроветворных клетках костного мозга белой крысы//Генетика популяций яивотных: ЕГУ, 1991. - С. 84-91.

12. Генетика популяций животных: Сб. науч. тр. Воронеж, с-х института, Вороне«, отделение Всесоюзного обпрства генетиков н селекционеров т. ЕЯ Вавилова /Ред.кол.: Тапильский И. А., Шпкин С. Ii , Чабала ЛИ. и др. - Воронеж ВГУ, 1991.- В9 с.

13. /Чзбала Л. И., Маякин С. Ii Разновидности морфоструктур

акроцентрическнх хромосом в кроветворных клетках интактной белой крысы. Реферат статьи //Цитология и генетика 1991. - N 3. - Т. 25. - С. 77.

14. Чабала Л И.. Машкин С. И. Разновидности Морфоструктур акроцентрическнх хромосом в кроветворных клетках интактной белой крысы. - Киев, 1990.- 10 с. Деп. во ВШШТИ 11.05.91, N 2468 В-91.

15. Способ определения функционального состояния кроветворения у экспериментальных отвотных: А. с. 1697747 СССР. Ш А 61В 10/00, Л. И. Чабала (СССР). -2 с.

16. Способ диагностики состояния костномозгового кроветворения у экспериментальных тавотных. Чабана Л. II: Информационный листок Воронежского ЩГТИ. N 488-91. 1991. - 4 с.

17. Чабала Л И. . Цаапшн С. И. Белая крыса - биологическая модель для изучения функционального состояния костномозгового 1фоветворения после облучения //Тезисы докладов конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской АЭС". -Шнек. 1991. - С. 143-144.

18. Чабала Л И. Особенности кариотипа клеток газетного мозга белых крыс. Теэисы докладов Беесокэной Конференции "функциональная морфология )слетки". Ленинград //Цитология. -1991. -Н 9.-С. 108.

19. Чабала Л И.. Шшкин С. И. О закономерностях образования стру1стурно-функциональных типов хромосомных наборов в костном мозге у интактных и экспериментальных- крыс. //Известия Российской ЛЯ . - 1992. - N1.-0. 130-134.

Форм.бум. 60x84/16. Офспкая печать.

Тираж 100 Заказ 55рф Ьнронсжская типография "'ГранспорГ'