Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция патологических митозов и изменение клеточного цикла в первичных фибробластах человека, инфицированных цитомегаловирусом

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барсукова, Анна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культура клеток Инфицирование вирусом Световая микроскопия Антитела и сыворотки Иммунофлуоресцентный анализ Препараты распластанных хромосом Электронная микроскопия Компьютерная реконструкция Радиоавтография

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клеточная модель для изучения ЦМВ Экспрессия белков ЦМВ в клетках ФЛЭЧ

Появление патологических митозов в культуре, инфицированной ЦМВ Макроструктура хромосом в патологических митозах Кинетохоры в ЦМВ-инфицированных клетках ФЛЭЧ Иммуноцитохимический анализ центромерных районов хромосом в ЦМВ-инфицированных клетках ФЛЭЧ

Митотический аппарат в ЦМВ-инфицированных клетках: центросома и веретено деления

Влияние ЦМВ на продолжительность некоторых стадий клеточного цикла ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия белков ЦМВ в клетках ФЛЭЧ

Общая характеристика патологических митозов при ЦМВ-инфекции Макроструктура хромосом в патологических митозах Центромерно-кинетохорный комплекс в патологических митозах Митотический аппарат при ЦМВ-инфекции

Возможные причины остановки митотического деления в условиях ЦМВ-инфекции

Влияние ЦМВ на продолжительность отдельных стадий к легочного цикла

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция патологических митозов и изменение клеточного цикла в первичных фибробластах человека, инфицированных цитомегаловирусом"

Митотическое деление представляет собой универсальный способ репродукции всех эукариотических клеток. Оно обеспечивает редупликацию генетического материала и его равномерное распределение между дочерними клетками. Для этих процессов необходима слаженная работа ряда специфических клеточных структур, что в свою очередь требует наличия сложных регуляторных механизмов.

Нарушения митотического деления могут иметь далеко идущие последствия для отдельных клеток, тканей и организма в целом. Поэтому изучение механизмов развития патологии митоза всегда представляло интерес для исследователей. Если в нормальных условиях в тканях и клеточных культурах патологические митозы появляются относительно редко, то воздействие таких факторов, как облучение и некоторые химические агенты приводит к резкому увеличению их числа. Подобным образом влияет на пролиферирующие клеточные культуры целый ряд вирусов, в том числе цитомегаловирус человека.

Цитомегаловирус (ЦМВ) - представитель группы герпесвирусов, широко распространенный среди населения: доля его носителей в развитых странах достигает 60-80%. На фоне снижения иммунитета ЦМВ вызывает ряд серьезных заболеваний (Баринский и др., 1986, Чешик и др., 1990). Особенно тяжелые поражения возникают при внутриутробном инфицировании; это является одной из частых причин гибели плода (Самохин, 1987).

Цитопатическое действие ЦМВ активно изучается в лабораторных условиях. Еще в 60-е годы были получены данные о влиянии вируса на деление клеток. В ряде работ описывалось существенное возрастание митотического индекса, а также появление аномальных митотических фигур в клеточных линиях, инфицированных ЦМВ (Nachtigal, Nachtigal, 1978, Luleci et al, 1980, AbuBakar et al., 1988). Несколькими авторами высказывалось предположение, что ЦМВ может вызывать остановку митоза в инфицированных клетках (Kamiya et al., 1985, Albrecht et al, 1989).

В целом вопрос о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию не был подробно изучен. В последние 10-15 лет основное внимание исследователей было обращено на молекулярно-биологические аспекты развития вирусной инфекции. В этой области были накоплены обширные сведения. Кроме того, большой интерес в последнее время вызывает влияние вирусов человека, в том числе ЦМВ, на жизненный цикл клетки-хозяина. Получено множество данных об изменении клеточного цикла под действием вируса, однако они остаются довольно противоречивыми.

Ранее, в 70-80-е годы, считалось общепринятым, что ЦМВ стимулирует репликацию ДНК в зараженных клетках (Albrecht et al, 1976, Boldogh et al, 1978, DeMarchi, 1983). Однако работы последних лет опровергают это мнение. По современным представлениям вирус может блокировать клеточный цикл в нескольких точках, включая переход из Gi-периода в фазу синтеза ДНК (Jault et al, 1995, Dittmer, Mocarski, 1996, Bresnahan, 1996). При этом предполагается, что инфицированные клетки перестают делиться. В то же время многие авторы утверждают, что часть клеток в инфицированной культуре накапливается на стадии клеточного цикла, обозначаемой ими как G2/M (Lu and Shenk, 1996, Salvant et al, 1998). Таким образом, не исключается возможность вступления зараженных клеток в митоз, однако используемый в большинстве экспериментов для измерения количества ДНК метод проточной цитометрии не позволяет отличить митотические клетки от находящихся в Ог-периоде.

Можно заключить, что аномалии митотического деления, индуцируемые ЦМВ, в настоящее время остаются практически неизученными. В частности, вопрос об ультраструктурных особенностях митотических клеток в ЦМВ-инфицированной^льтуре оставался вне поля зрения исследователей. Получены лишь некоторые данные об изменениях в строении центросомы, вызываемых вирусом (ВуБ^еуэкауа е1 а1., 1997). Полностью отсутствуют сведения об ультраструктурной организации хромосом в динамике развития инфекции. Решение этих вопросов необходимо для выяснения механизмов цитопатического действия ЦМВ на делящиеся клетки.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей работы было детальное изучение феномена патологии митотического деления, индуцируемой цитомегаловирусом в культивируемых клетках человека.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Проследить изменение пролиферативной активности первичной культуры ФЛЭЧ под влиянием ЦМВ.

2. Изучить особенности общей структуры митотических хромосом в клетках из инфицированной культуры на разных стадиях развития инфекции.

3. Исследовать ультраструктуру кинетохоров митотических хромосом на разных стадиях развития инфекции.

4. Провести ммуноцитохимический анализ белковых компонентов центромерно-кинетохорного комплекса в патологических митозах на разных сроках после инфицирования ЦМВ.

5. Сопоставить данные о структуре митотических хромосом с организацией веретена деления в патологических митозах.

6. Выяснить, способны ли клетки, инфицированные в Б-периоде, вступить в митотическое деление.

7. Выявить влияние условий заражения, включая инфекционную множественность, на длительность стадий клеточного цикла в инфицированной культуре.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Митотическое деление.

Жизненный цикл всех эукариотических клеток включает, по крайней мере на некоторых этапах, митотическое деление. Одни клетки теряют способность делиться на определенной стадии дифференцировки, другие сохраняют ее в течение всей жизни.

Митоз - универсальный и наиболее распространенный способ репродукции животных и растительных клеток. Его особенность заключается в сочетании двух процессов - редупликации генетического материала и его равномерного распределения между дочерними клетками.

История исследований митоза насчитывает уже более ста лет. Накоплен большой объем сведений о его морфологии, физиологии, цитохимии и патологии. Митотическое деление изучалось на множестве типов клеток животных и растений.

Одной из специфических особенностей митоза является его цикличность, что послужило основанием для возникновения понятия митотического (или клеточного) цикла. Временные параметры этого процесса впервые были изучены в 50-е годы Говард и Пелком. Они предложили разбить митотический цикл на четыре периода, или фазы: собственно деление клетки (митоз), пресинтетический период Ог, период синтеза ДНК (8) и премитотический период Ог (Епифанова, 1997). Эти работы открыли путь к экспериментальному изучению событий, происходящих на разных этапах клеточного цикла. Позднее было установлено, что по окончании митоза клетка может выйти в состояние «вне цикла», из которого при необходимости она вновь может вступить в клеточный цикл. Это состояние было обозначено Квастлером и Лайтой как период, или фаза Go (Епифанова, 1997).

Современные методы молекулярной биологии и биохимии позволили приблизиться к пониманию тонких механизмов клеточного деления, пролить свет на способы регуляции этого процесса, выявить и изучить множество задействованных в нем белков. Однако в этой области до сих пор остается немало белых пятен.

Митотический аппарат в клетках млекопитающих.

В клетках млекопитающих ультраструктурные и цитофизиологические особенности митоза достаточно хорошо изучены. Характерным признаком его наступления является конденсация хроматина, начинающаяся в ядре в профазе митоза и продолжающаяся после разрушения ядерной оболочки. Хромосомы млекопитающих, как у всех эукариот, имеют особый домен, обеспечивающий возможность движения во время клеточного деления - кинетохор. Он представляет собой комплекс ДНК и белков, формирующийся в митозе в районе первичной перетяжки (центромеры) хромосомы. На ультраструктурном уровне кинетохор выявляется как трехслойная структура, состоящая из наружной и внутренней пластинок, разделенных промежуточной зоной (Earnshaw, 1994). Наружная пластинка имеет толщину 30-40 нм и средний диаметр 0.5 мкм (Rieder, 1982). Эта область является местом контакта микротрубочек веретена деления с хромосомой (Schulman, Bloom, 1991). Более подробное изучение этой зоны показало, что наружная пластинка образована двумя слоями, имеющими фибриллярную структуру (Pluta et al., 1995). Средняя зона кинетохора, как показали исследования методом томографического анализа в высоковольтном электронном микроскопе, пронизана многочисленными фибриллами, соединяющими наружный и внутренний слои (McEwen et al., 1993). Внутренняя пластинка кинетохора непосредственно прилегает к центромерному хроматину и не всегда четко различима. Она становится более заметна после формирования контакта между кинетохором и микротрубочками (Rieder, 1982). В тех случаях, когда хромосома не связана с микротрубочками, например в ранней прометафазе или после воздействия цитостатиков, наблюдается дополнительный четвертый слой над наружной пластинкой кинетохора - фибриллярная корона (Earnshaw, 1994). По современным представлениям, кинетохор у всех позвоночных состоит из множества функциональных субъединиц и способен связывать от 10 до 45 микротрубочек у разных видов (Brinkley et al., 1992, Rieder, Salmon, 1998).

Некоторые авторы наблюдали появление кинетохорной структуры в клетках человека уже на стадии профазы. В этот период кинетохор выглядит как нечеткое шаровидное образование без выраженной структуры на поверхности конденсирующейся хромосомы (Bernât et al., 1991).

Динамика изменений ультраструктуры кинетохора в митозе была подробно изучена И. С. Кудрявцевым на фибробластах мыши (Кудрявцев, 1997). Он показал, что кинетохор как многослойная структура впервые появляется на поверхности митотических хромосом в ранней прометафазе, сразу после нарушения целостности ядерной оболочки. На этой стадии особенностью строения кинетохора является выраженная двуслойность его наружной пластинки. Внутренняя пластинка не выявляется. На поверхности кинетохора хорошо заметно фибриллярное гало, микротрубочки в этой зоне отсутствуют. Как правило, на этой стадии кинетохоры имеют подковообразную форму.

В поздней прометафазе большинство кинетохоров уже связаны с микротрубочками, и фибриллярное гало у них отсутствует. Наружная пластинка становится более плотной, двуслойность в ней уже не видна. В метафазе кинетохоры имеют характерную трехслойную организацию. На некоторых срезах можно различить, что наружная пластинка состоит из субъединиц, к каждой из которых подходит одна микротрубочка. Кинетохоры на этой стадии плоские, вытянутые. В анафазе морфология кинетохоров значительно не изменяется, однако выявить внутреннюю пластинку уже не удается. В телофазе, после прекращения движения хромосом, кинетохорная структура наблюдается крайне редко. В оставшихся кинетохорах различима наружная пластинка, к которой подходят микротрубочки.

Центромерно-кинетохорный комплекс включает целый ряд белков, многие из которых охарактеризованы за последние годы (рис.1). Так, к наиболее изученному классу CENP (centromere proteins) в настоящее время относят 6 белков, весьма различных по структуре и функциям. Показано, что белок CENP-A (молекулярная масса 17 кДа) является специфическим центромерным вариантом гистона НЗ (Palmer et al., 1987). Предполагается, что он локализован во внутренней пластинке кинетохора (Earnshaw, 1994).

Наиболее подробно изучен белок CENP-B (мол. масса 80 кДа). Установлено, что он имеет специфический сайт связывания с альфа-сателлитной ДНК, которой обогащен центромерный гетерохроматин (Earnshaw, 1987, Masumoto et al., 1989, Pluta et al., 1992) и располагается в области под кинетохором (Cooke et al., 1990). Функцией этого белка, по-видимому, является упаковка гетерохроматина в районе центромеры (Kitagawa et al., 1995).

Белок CENP-C (мол. масса 140 кДа) является компонентом внутренней и пластинки кинетохора (Saitoh et al, 1992). Вероятно, он играет важную роль в формировании функционирующего кинетохора, поскольку в дицентрических хромосомах выявляется только в составе активной центромеры (Earnshaw et al, 1989, Page et al, 1995).

Кроме названных белков, в состав класса CENP включают кинезиноподобный моторный белок CENP-E (Yen et al, 1991) и CENP-F (он же митозин) (Rattner et al, 1993). Эти полипептиды обнаруживаются в составе центромерно-кинетохорного комплекса не на всех стадиях клеточного цикла. Они были выявлены в области фибриллярной короны кинетохора (Pluta et al, 1995). Недавно был идентифицирован еще один белок, отнесенный к тому же семейству - CENP-G (Не et al, 1998). Предположительно, он локализуется в районе внутренней пластинки кинетохора.

К белкам центромерно-кинетохорного комплекса относятся также члены семейства INCENP (inner centromere proteins), участвующие в спаривании сестринских хроматид (Cooke et al, 1987), кинезино-подобный белок МСАК (mitotic centromere-associated kinesin) (Wordeman, Mitchison, 1995), цитоплазматический динеин (Wordeman et al, 1991) и некоторые другие. Эти разнообразные полипептиды регулируют упаковку центромерного района хромосомы, участвуют в формировании кинетохоров и обеспечивают движение хромосом в митозе.

При подготовке к делению в клетке формируется митотический аппарат, основными компонентами которого являются клеточный центр и веретено деления. Эти структуры выполняют активную роль в процессе построения метафазной пластинки и разделения хромосом в анафазе. В интерфазных клетках млекопитающих клеточный центр (центросома) включает пару центриолей, окруженную аморфным перицентриолярным материалом, содержащим ряд белков, и играет роль центра организации микротрубочек (Lange, Gull, 1996). Центросома имеет собственный жизненный цикл, что обеспечивает ее наличие в каждой из дочерних клеток после цитокинеза. Дупликация центриолей начинается в раннем S-периоде интерфазы и завершается в Ог-периоде (Vandre, Borisy, 1989). В профазе каждая пара центриолей становится центром формирования радиально направленных микротрубочек ("звезды"). Пары центриолей расходятся, образуя два полюса деления клетки. Микротрубочки, отходящие от обеих звезд, удлиняются и после разрушения ядерной оболочки начинают взаимодействовать с хромосомами. Веретено деления в митозе образовано двумя полуверетенами, состоящими из астральных (радиально расходящихся) и полярных (направленных "+"-концами к хромосомам и противоположному полюсу) микротрубочек.

Часть полярных микротрубочек образует контакт с кинетохорами хромосом. На первой стадии этого процесса случайным образом возникает латеральный контакт с одной микротрубочкой, после чего хромосома начинает двигаться к полюсу. Предполагается, что "антенный комплекс", улавливающий "+"-конец микротрубочки, формируется белками CENP-E и цитоплазматическим динеином (Rieder, Salmon, 1998), локализованными в области фибриллярной короны кинетохора (Rieder, Alexander, 1990, Wordeman et al., 1991). В дальнейшем к этому кинетохору присоединяются другие микротрубочки, однако полный "набор" формируется только после того, как сестринский кинетохор свяжется с микротрубочками, отходящими от другого полюса. Процесс конгрессии хромосом занимает основную часть времени: микротрубочки ориентируют хромосому относительно оси веретена и перемещают ее в экваториальную плоскость клетки, где силы, тянущие хромосому к обоим полюсам, уравновешиваются. Примечательно, что во время движения хромосомы к полюсу и от полюса кинетохорные микротрубочки растут и укорачиваются без частого отсоединения от кинетохора (Mitchison, Salmon, 1992). В процессе движения участвуют моторные белки, связанные с кинетохорами: CENP-E (Lombillo et al., 1995) и МСАК (Wolczak et al., 1996). При этом даже один кинетохор, не присоединенный к веретену, может являться причиной задержки перехода к анафазе (Rieder et al., 1994). Предполагается, что ингибирующий сигнал продуцируется самим кинетохором, и механизм его действия, возможно, связан с разделением сестринских хроматид (Rieder, Salmon, 1998). После начала анафазы происходит разборка "+"-концов микротрубочек на кинетохорах, благодаря чему хроматиды движутся к полюсам (Yen, Schaar, 1996). В начале телофазы движение хромосом прекращается, но расстояние между двумя сегрегировавшими группами продолжает увеличиваться за счет расхождения полюсов и продольного вытягивания клетки. Сразу после остановки хромосом в конце анафазы - начале телофазы происходит быстрая разборка кинетохоров (Кудрявцев, 1997).

Патология митоза.

Патология митотического деления всегда представляла интерес для исследователей, поскольку она влечет за собой серьезные нарушения, нередко приводящие к гибели клетки. С другой стороны, изучение аномалий митоза необходимо для понимания тех процессов, которые происходят в норме. Уже в 30-е годы были подмечены основные морфологические признаки патологии клеточного деления, такие как изменения в числе и форме хромосом, их неправильное распределение в дочерних клетках, а также аномалии митотического веретена.

Одна из наиболее известных классификаций патологии митоза была создана в 70-е годы И. А. Аловым (Алов, 1972). Он выделил следующие типы:

1. Повреждение хромосом, примерами которого являются: а) нарушение спирализации и деспирализации хромосом; б) раннее разделение хроматид; в) фрагментация и пульверизация хромосом; г) хромосомные и хроматидные мосты; д) отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам; ж) нерасхождение хромосом.

2. Повреждение митотического аппарата: а) задержка митоза в метафазе; б) рассеивание хромосом в метафазе; в) трехгрупповая метафаза; г) многополюсные митозы; д) моноцентрические митозы; е) К-митозы.

3. Нарушение цитотомии: а) преждевременная цитотомия; б) отсутствие цитотомии.

Эта классификация носила в основном морфологический характер. Были высказаны и предположения о возможных механизмах возникновения перечисленных нарушений. Так, повреждение хромосом, по-видимому, вызывается целым комплексом изменений, включающим нарушение синтеза ДНК, нуклеопротеидного обмена, а также синтеза хромосомных белков.

При повреждении митотического аппарата нарушения также имеют многогранный характер, затрагивая и синтез белков, и процесс сборки различных структур. Одним из примеров повреждения митотического аппарата в метафазе является хорошо известный К-митоз (колхициновый митоз). Воздействие на клетку статмокинетических ядов вызывает деполимеризацию микротрубочек, приводя к остановке деления на стадии метафазы. Помимо веретена, затрагивается центросома и изменяется структура хромосом. Первоначально К-митозы делили на два типа: «животный» и «растительный» (Авцын, Шахламов, 1979). Для первого характерно образование плотного комка из сильно набухших хромосом, во втором случае хромосомы незначительно набухают и либо рассеиваются в цитоплазме, либо образуют рыхлую метафазную пластинку. Как оказалось позднее, такой четкой дифференциации между животными и растительными клетками не существует: в клетках млекопитающих встречаются оба типа К-митозов.

В дальнейшем использование новых методов исследования позволило больше узнать о механизмах возникновения аномалий митоза

В нормальных условиях в тканях и в клеточных культурах патологические митозы встречаются нечасто. Увеличение их числа наблюдается при воздействии облучения, некоторых химических агентов, а также при неопластической трансформации (Авцын, Шахламов, 1979, Восток, Самнер, 1981). Механизмы действия этих факторов на деление клеток различны и не всегда известны.

Существуют обширные литературные данные о том, что инфицирование клеточных культур различными вирусами вызывает в них изменение митотической активности. Часто оно сопровождается повышением уровня патологических митозов. Этот эффект был установлен для представителей различных групп вирусов (герпесвирусы, аденовирусы, пикорнавирусы и другие) (Блюмкин, Жданов, 1973). Однако специфические особенности ж влияния на деление клеток изучены слабо. Имеющиеся сведения говорят о том, что различные вирусы вызывают отличные друг от друга качественные изменения. Одним из примеров является широко распространенный в природе и активно изучающийся в последние годы цитомегаловирус.

Цитомегаловирус человека

Цитомегаловирусы (ЦМВ) относятся к (3-подгруппе герпесвирусов. Они распространены среди грызунов, приматов и других животных и высоко видоспецифичны. Среди жителей развитых стран доля носителей ЦМВ достигает 60-80%. ЦМВ человека является причиной многих заболеваний, таких как пневмония, ретиниты, заболевания желудочно-кишечного тракта (Баринский и др., 1986). Особенно серьезные осложнения возникают у больных при сниженном иммунитете - после трансплантации органов, при синдроме иммунодефицита (Чешик и др., 1990). Тяжелые заболевания (слепота, глухота, врожденные уродства) возникают при внутриутробном инфицировании плода (Самохин, 1987).

В течение последних 10-15 лет накоплены значительные сведения о молекулярной биологии цитомегаловируса человека. Вирион ЦМВ состоит из нуклеоида, нуклеокапсида, тегументного слоя и липопротеиновой оболочки. ЦМВ имеет крупный ДНК-геном (около 200 кб) (Plachter et al., 1994). К настоящему времени определена только малая часть из более чем 200 белков, потенциально кодируемых вирусом. Их разделяют на три группы в зависимости от времени появления:

1) сверхранние (IE - immediately early) белки - синтезируются в первые часы развития инфекции. Они выполняют регуляторные функции, координируя экспрессию всех вирусных генов. Среди сверхранних белков мажорными являются р55 (молекулярная масса 55 кДа), р72 (72 кДа) и р86 (86 кДа) (Stenberg et al., 1989, Plachter et al., 1993). Эта группа является объектом наиболее интенсивных исследований в связи с ее регуляторной ролью, во многом определяющей течение инфекции. Помимо того сверхранние белки оказывают влияние на метаболизм клетки-хозяина, активируя транскрипцию ряда клеточных генов, и выполняют авторегуляторные функции. Отличительным свойством белка Ш р72 является его способность ассоциировать с хромосомами митотических клеток (Lafemina et al., 1989).

2) ранние белки - для их экспрессии необходимо наличие сверхранних белков. Функции этой группы слабо изучены; предполагается, что они участвуют в репликации вирусной ДНК, а также в ее регуляции. К ранним белкам относится, в частности, ДНК-полимераза вируса и несколько ДНК-связывающих белков.

3) поздние белки - экспрессируются только при наличии ново-синтезированной вирусной ДНК и ранних белков. Большинство из них относится к структурным белкам, формирующим вирусные частицы.

Экспрессия вирусных генов представляет собой каскад последовательных событий (Plachter et al., 1994). Процесс репликации ДНК и синтеза белковых компонентов вириона сопровождается инициацией сборки вирусных частиц. Она начинается с образования нуклеокапсидов, которое происходит в ядре клетки. Местам сборки нуклеокапсидов соответствуют базофильные включения, наблюдающиеся в инфицированных клетках (Mocarski, 1993). Далее нуклеокапсиды перемещаются через ядерную мембрану в цитоплазму, окружаясь при этом оболочкой. В процессе созревания вирусных частиц задействованы клеточные мембранные компоненты; предполагается, что выход вирионов из клетки осуществляется через ранний эндосомальный компартмент (Plachter, 1994).

Основной мишенью цитомегаловируса при развитии инфекции in vivo являются эпителиальные и эндотелиальные клетки. При этом характерным признаком продуктивного заражения является появление гигантских клеток, что когда-то дало название цитомегаловирусу (Mocarski, 1996). В экспериментах in vitro было установлено, что на ранних стадиях (в первые сутки после попадания вируса в клетку) инфицированные клетки округляются, их диаметр уменьшается. Ядерная мембрана образует множественные впячивания, в цитоплазме вблизи плазматической мембраны появляются пучки актина. Предполагается, что такой физиологический ответ связан с выбросом ионов кальция (Albrecht, 1989). Вторая фаза ответа связана с входом в клетку большого количества ионов натрия. Она соответствует по времени активному синтезу вирусной ДНК и началу продукции вирусных частиц, что часто (но не обязательно) сопровождается развитием цитомегалии (Albrecht, 1989).

Влияние ЦМВ на клеточный цикл.

Жизненный цикл цитомегаловируса длиннее, чем у других представителей герпесвирусов: между его попаданием в клетку и началом синтеза вирусной ДНК проходит около 24 ч. Репликация ДНК достигает высокого уровня к 36 ч после инфицирования, а выход существенного количества новообразованных вирусных частиц начинается только после 72 ч (Mocarski, 1996).

В то же время влияние ЦМВ на метаболизм клетки-хозяина проявляется уже в самые первые часы после заражения (Fortunato et al., 2000). Изучение этого взаимодействия важно для понимания того, каким образом развивается инфекция, и в случае заражения клеточной культуры, и при развитии заболевания в организме. Уже давно было известно, что ЦМВ влияет на клетки подобно факторам роста (Albrecht, 1989). После проникновения вируса в клетку повышается активность ряда ферментов, связанных с плазматической мембраной, что приводит к повышению концентрации вторичных мессенджеров и последующей активации специфических протеинкиназ. Повышенный уровень активаторов приводит к увеличению синтеза ряда клеточных макромолекул: ДНК-полимеразы, топоизомеразы, тимидинкиназы и др. (Huang, Kovalik, 1993). Активированные протеинкиназы фосфорилируют специфические белки, часть из которых влияет на внутриядерные регуляторные факторы. В результате изменяется синтез ряда генов, в том числе связанных с клеточным циклом: антионкогенов р53 и Rb, циклинов. Все это свидетельствует о способности вируса влиять на пролиферативную активность клеток, что в свою очередь может иметь решающее значение для патогенеза in vivo. До недавнего времени полагали, что эти процессы стимулируют репликацию ДНК и подавляют ферменты, негативно регулирующие пролиферацию.

Такое мнение было принято во всех работах 70-80-х годов. В ряде экспериментов клетки, блокированные в фазе Go или Gi, после заражения вирусом входили в S-период (DeMarchi, 1974, St.Jeor et al, 1974, Albrecht et al, 1976). Более подробное изучение этого феномена привело к появлению противоречивых сведений, что в значительной степени было связано с различными условиями постановки опытов. В некоторых работах было показано, что репликация ДНК активируется как при заражении растущей культуры, так и монослойной, рост которой прекратился за счет контактного ингибирования (DeMarchi, Kaplan, 1977). Другие авторы доказывали, что стимулирующее влияние ЦМВ проявляется только при использовании пролиферирующей культуры, а при заражении в монослое оно отсутствует (St.Jeor et al, 1974). С другой стороны, утверждалось, что синтез ДНК в зараженной культуре стимулируется лишь в тех клетках, которые не содержат вирусные белки, и, следовательно, не были инфицированы (DeMarchi, 1983). Использование вируса, облученного ультрафиолетом, или заражение непермиссивных клеточных линий также приводило к усилению синтеза клеточной ДНК (Albrecht et al., 1976, Boldogh et al., 1978, DeMarchi, 1983). Значение такой стимуляции для самого вируса оставалось непонятным, поскольку по общепринятым представлениям синтез клеточной ДНК не нужен для успешной репликации вирусного генома и синтеза вирусных белков. Одна из гипотез состояла в том, что ЦМВ неспецифически стимулирует весь клеточный метаболизм, в том числе и синтез ДНК зараженной клетки, однако в пермиссивных клетках этот эффект может блокироваться вирусными белками (DeMarchi, 1983).

В начале 90-х годов произошел настоящий прорыв в области изучения регуляторных механизмов клеточного цикла (Епифанова, 1997). Накопление данных генетики, молекулярной биологии и биохимии, полученных как в экспериментах с низшими эукариотическими организмами, такими как дрожжи, так и на культивируемых клетках млекопитающих, привело к открытию общности механизмов регуляции размножения всех эукариотических клеток.

Как следствие этих событий в 90-х годах появился целый ряд работ, в которых использовались новые подходы к изучению влияния вирусов на клеточный цикл. В работе Jault с соавторами (Jault et al., 1995), посвященной воздействию ЦМВ на клетки человека, подчеркивалось, что изучение эффекта, оказываемого вирусом на ход клеточного цикла, имеет важное значение. Был проведен анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии в эмбриональных человеческих фибробластах, синхронизированных в Go-периоде и зараженных ЦМВ человека. По результатам этого анализа был сделан вывод, что в инфицированной культуре клетки блокируются в фазе, обозначенной как G2/M, то есть предшествующей делению. При этом подтверждался тезис о том, что ЦМВ стимулирует синтез клеточной ДНК.

В ЦМВ-инфицированных клетках был также исследован уровень содержания белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, в том числе ряда циклинов. Эта группа белков была открыта при изучении белкового синтеза в развивающихся яйцах морских ежей и других организмов (Епифанова, 1997). Позднее было установлено, что успешное прохождение последовательных фаз клеточного цикла обеспечивается циклин-зависимыми протеинкиназами, обозначаемыми в литературе cdk. Особенности этих ферментов и их активность определяется фосфорилированием каталитических субъединиц и формированием комплекса с циклинами. Белки, относящиеся к классу циклинов, экспрессируются в определенные периоды клеточного цикла (рис. 2 ). Принято считать, что существуют две главные контрольные точки (так называемые checkpoints), прохождение которых клетками регулирует ход цикла. Одна из них соответствует переходу из Gi в S-фазу и контролирует инициацию репликации ДНК, а вторая находится на границе Ог-периода и митотической фазы и регулирует вступление клетки в митоз (Hartwell, Weinert, 1989). Во время Gi-фазы экспрессируются циклины, индуцирующие переход из Gi в S: к ним относятся циклины D и Е. Первый из них активен в первой половине Gi-периода, взаимодействуя с различными cdk, в то время как второй ассоциирует с киназой cdk2 и достигает максимального уровня во время перехода в S-период (Sherr, 1993). Второй класс циклинов включает циклины А и В, регулирующие S-фазу и переход из G2 в М. Циклин А, по-видимому, необходим для репликации ДНК, его уровень достигает пика в S-фазе (Pagano et al., 1992). Циклин В синтезируется на протяжении позднего S и всего Ог-периода; ассоциируя с киназой cdc2, он формирует неактивный комплекс, называемый pre-MPF (mitosis-promoting factor). Во время перехода из G2 в М дефосфорилирование киназы приводит к активации MPF и началу митоза (Welch, Wang, 1992). Инактивация MPF, в свою очередь, происходит в анафазе путем деградации циклина В и является необходимой предпосылкой выхода клетки из митоза (Murray et al., 1989).

За работой Jault с соавт. последовал ряд публикаций, посвященных изменениям клеточного цикла в ЦМВ-инфицированных культурах. Все они опирались на данные проточной цитометрии ДНК и подтверждали мнение о блокировании какой-либо стадии цикла. Однако какая именно фаза чувствительна к вирусу, оставалось неясным. В экспериментах, описанных в статье Lu и Shenk (Lu, Shenk, 1996), впервые была использована несинхронизированная пролиферирующая культура фибробластов человека. Измерение количества ДНК не выявило накопления клеток в какой-либо одной стадии цикла. Однако число клеток в культуре не увеличивалось с течением времени. Авторы пришли к выводу, что вирус блокирует прохождение клеточного цикла в нескольких точках, предположительно в точке перехода из Gi в S-фазу, а также в Ог/М-периоде. Дополнительные эксперименты с использованием мечения 3Н-тимидином подтвердили, что количество ДНК-синтезирующих клеток не возрастает после заражения вирусом. Таким образом, впервые были получены данные об отсутствии стимулирующего эффекта ЦМВ на репликацию клеточной ДНК. Было также отмечено, что описанное блокирование цикла проявляется уже через 12 ч после инфицирования. Это говорит о том, что на него не влияют вновь синтезированная вирусная ДНК и поздние белки, которые появляются значительно позже. Гипотеза, высказанная в данной работе, не исключает, что остановка клеточного цикла под действием ЦМВ может произойти на любой из стадий. Это зависит от того, в какой точке находилась клетка в тот момент, когда синтезирующийся в ней гипотетический вирусный или клеточный продукт, ответственный за эту остановку, достигает пороговой концентрации.

В дальнейшем в литературе продолжали появляться противоречивые данные на эту тему. Часть авторов утверждала, что ЦМВ не способствует выходу зараженных клеток из Go или Gi в S-период; напротив, именно переход к фазе синтеза ДНК блокируется при продуктивной инфекции (Dittmer, Mocarski, 1996, Bresnahan, 1996, Wiebusch, Hagemeier, 1999, Hayashi et al., 2000). Противоречие с ранее принятыми представлениями объяснялось тем, что в ряде исследований, показавших индукцию синтеза ДНК вирусом, протокол экспериментов включал инкубацию синхронизированных клеток после заражения в свежей ростовой среде. Эта среда содержала сыворотку, что само по себе индуцировало вступление клеток в S-фазу. Кроме того, использование метода проточной цитометрии не позволяло отличить клеточную ДНК от синтезируемой вирусной (Bresnahan, 1996). В то же время другие исследователи полагали, что ЦМВ стимулирует вхождение клеток в S-период и затем блокирует их в этой фазе клеточного цикла (Murphy et al., 2000, Sinclair et al., 2000). Таким образом, в настоящее время не существует единого мнения относительно того, какие именно моменты клеточного цикла наиболее чувствительны к действию ЦМВ.

В последнее время основное внимание исследователей направлено на изучение механизмов дисрегуляции клеточного цикла в инфицированных клетках. Сейчас считается доказанным, что под влиянием ЦМВ в клетке существенно повышается содержание и активность циклина Е. В статье Bresnahan (Bresnahan, 1996) развивалось предположение о том, что эта активация приводит к накоплению в клетке предшественников макромолекул; формируется состояние, сходное с поздним Gi-периодом и необходимое самому вирусу для успешной репликации. В то же время уровень содержания циклина А существенно снижен, что, по-видимому, свидетельствует о блокировании синтеза ДНК в клетке. Последние данные говорят о том, что уровень содержания циклина Е изменяется под влиянием ранних белков ЦМВ (McElroy et al., 2000).

Роль конкретных вирусных белков в регуляции клеточного цикла активно изучается в настоящее время. Получены данные об участии в этом процессе сверхранних белков р72 и р86 (Wiebusch, Hagemeier, 1999, Johnson et al., 1999, Castillo et al., 2000, Murphy et al., 2000), а также структурного белка ЦМВ UL69 (Lu, Shenk, 1999, Hayashi et al., 2000).

Остается актуальным вопрос, каким образом стадия цикла, на которой находилась клетка в момент заражения, влияет на развитие последующих нарушений. В работе Salvant с соавт. (Salvant et al., 1998) подробно рассмотрено развитие событий после заражения фибробластов человека, находившихся в Go, Gi или S-периоде. Как выяснилось, существенные отличия возникают при развитии инфекции в клетках, зараженных во время синтеза ДНК. В этом случае на самых ранних сроках (до 12 ч) задерживается развитие цитопатического действия и экспрессия вирусных белков, клетки продолжают продвигаться по циклу, проходя G2 и митоз. Однако это не приводит к значительным изменениям долговременного плана по сравнению с развитием инфекции в культурах, зараженных в Go и Gi-периодах. Судя по всему, нахождение клетки в S-фазе является неблагоприятным фактором для ранних стадий вирусной репликации. Эти данные, по мнению авторов, подтверждают гипотезу о том, что для ингибирования синтеза клеточной ДНК уровень экспрессии вирусных белков должен достичь некоего порога. Поэтому клетки, которые были инфицированы позже определенной точки клеточного цикла, некоторое время сохраняют способность синтезировать ДНК и блокируются позже.

Появление патологических митозов при ЦМВ-инфекции.

Несмотря на обилие данных об изменении клеточного цикла в ЦМВ-инфицированных клетках, вопрос об особенностях митотического деления в этих условиях оставался в последние годы вне поля зрения исследователей.

Между тем, первые сведения о влиянии цитомегаловируса на деление клеток были получены еще в 60-х годах. Изучение с помощью световой микроскопии ЦМВ-инфицированной культуры эмбриональных фибробластов человека свидетельствовало о колхициноподобном действии вируса на митотические клетки (Melnick et al., 1965). Среди митозов обнаруживались метафазы с укороченными деформированными хромосомами. Кроме того, наблюдалось отставание одиночных хромосом и многополюсные митозы (Блюмкин, Жданов, 1973).

Позднее в ряде работ было показано существенное увеличение митотического индекса при инфицировании ЦМВ пермиссивной культуры (Albrecht et al., 1976, Boldogh et al., 1978). Многие авторы обращали внимание на появление в различных клеточных культурах, зараженных ЦМВ, большого количества аномальных митозов (Nachtigal, Nachtigal, 1978, Luleci et al., 1978, Kamiya, 1986, AbuBakar et al., 1988). Большинство экспериментов проводилось на эмбриональных фибробластах человека, которые представляют собой удобную экспериментальную модель развития ЦМВ-инфекции in vitro. Наиболее подробно вопрос возникновения патологических митозов при инфицировании ЦМВ был рассмотрен Альбрехтом с соавт. (А1ЬгесЫ: е1 а1, 1989). В этой работе утверждалось, что воздействие вируса приводит к блокированию митотического деления, и предлагались различные гипотезы о механизмах его влияния. Среди возможных причин возникновения хромосомных повреждений назывались нарушение репликации клеточной ДНК и/или синтеза некоторых белков, индукция преждевременной конденсации хромосом под влиянием сигналов активации, исходящих от вируса. Кроме того, впервые было высказано предположение, что эффект, оказываемый ЦМВ, зависит от стадии клеточного цикла, на которой находилась клетка в момент заражения.

Аналогичные изменения в морфологии и жизнедеятельности клеток возникают под влиянием вируса и при абортивной (т. е. непродуктивной) инфекции. Так, в работе Камийя с соавт. (Кагмуа et а1, 1986) было показано, что при заражении ЦМВ человека непермиссивных клеток почки кролика доля патологических митозов в культуре возрастала до 60% к 96 ч после инфицирования. Наиболее частым нарушением являлась фрагментация хромосом, встречались также такие хромосомные аберрации, как пробелы и разрывы. Кроме того, авторы пришли к выводу, что в инфицированной культуре на фоне повышения митотического индекса наблюдалась остановка деления.

Ультраструктурные особенности митотических клеток при ЦМВ-инфекции до сих пор практически не изучались. Лишь недавно было показано, что в патологических митозах нарушается строение клеточного центра (центросомы) (Вуз^еувкауа е1 а1, 1997). Среди характерных изменений назывались дефекты в строении центриолей, изменения в их расположении и количестве. При этом сходные нарушения были выявлены как в пермиссивной к ЦМВ культуре фибробластов человека, так и в непермиссивной культуре Vero (почка зеленой мартышки). Авторы пришли к заключению, что в обеих культурах после заражения вирусом клетки блокируются в митозе.

С этими представлениями вступают в противоречие данные последних исследований, приводящие к заключению, что ЦМВ-инфицированные клетки вообще не доходят до митоза. Напомним, что большинство авторов считают, что вирус блокирует прохождение клеточного цикла в фазе Gi (Lu, Shenk, 1999, Wiebusch, Hagemeier, 1999, Hayashi et al., 2000) или S-периоде (Murphy et al., 2000, Sinclair et al., 2000). Кроме того, результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, не позволяют различить клетки, находящиеся в G2 и митозе. Используемый некоторыми авторами термин "блок в фазе G2/M" обозначает состояние, непонятное с точки зрения клеточной биологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток.

В работе использовали первичную культуру фибробластов легкого эмбрионов человека (ФЛЭЧ), полученную из лаборатории культур тканей Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Клетки выращивали в смеси среды Игла MEM и среды 199 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для постановки экспериментов использовали клетки на 18-22 пассажах культивирования.

Инфицирование вирусом.

Для выполнения работы был использован штамм AD 169 цитомегаловируса (ЦМВ) человека, любезно предоставленный проф. D. Emanuel (Sloan Kettering Cancer Center, Нью-Йорк, США).

Клетки выращивали на покровных стеклах до образования субконфлуэнтного монослоя. Перед инкубацией с вирусом ростовую среду удаляли, промывали клетки средой без сыворотки и вносили среду, содержащую вирус, на 2 ч. Затем клетки промывали и переносили в свежую среду без вируса, содержащую 10% сыворотки, в которой инкубировали клетки в течение 1-4 дней до фиксации. В зависимости от поставленной задачи инфекционная множественность при заражении составляла 0.1-0.5 БОЕ/клетку или 0.01-0.05 БОЕ/клетку.

Световая микроскопия.

Для изучения общей морфологии митотических клеток в инфицированной культуре клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали смесью 96% этанола и уксусной кислоты (3:1) и окрашивали гематоксилином Караччи 12-14 мин.

Антитела и сыворотки.

Для анализа белкового состава центромерно-кинетохорного комплекса использовали следующие аутоимунные сыворотки от больных с синдромом CREST (Earnshaw, Rothfield, 1985, Пуденко и др. 1997):

- афинно-очищенная сыворотка GS, содержащая антитела к центромерным белкам CENP-A, В и С (Earnshaw et al., 1989), была любезно предоставлена проф. W. Earnshaw (The John Hopkins University, Baltimore, USA);

- сыворотка M81, содержащая антитела к белку CENP-A (Семенов, 1990), была получена из Медицинской Академии последипломного образования (Санкт-Петербург).

Также были использованы моноклональные антитела к белкам CENP-B и CENP-C, любезно предоставленные проф. W. Earnshaw.

Для локализации антигенов ЦМВ в инфицированных клетках использовали моноклональные антитела к сверхраннему вирусному белку р72, раннему белку рр65 и позднему белку gB, полученные в лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Для изучения веретена деления в митотических клетках использовали коммерческие моноклональные антитела к альфа-тубулину (Sigma).

Иммунофлуоресцентный анализ.

Клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали абсолютным метанолом 10 мин при -20° С или 3% параформальдегидом (Sigma) на фосфатном буфере PBS (рН 7.2-7.4) 10 мин при комнатной температуре. После фиксации параформальдегидом клетки дополнительно обрабатывали 0.5% раствором Тритон Х-100 на буфере PBS в течение 10 мин.

Инкубацию с первыми антителами проводили в течение 40 мин при 37° С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ или ТРИТЦ (Sigma) в течение 30 мин при 37° С. Для окраски хроматина ядер и митотических хромосом использовали флуорохром DAPI (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл (10 мин). После окраски стекла с клетками заключали в Мовиол (Calbiochem).

Препараты просматривали и фотографировали с помощью микроскопа "Opton-3" (Германия) (объектив 63х, окуляр 10х).

Препараты распластанных хромосом.

Контрольные и инфицированные ЦМВ клетки ФЛЭЧ выращивали во флаконах. Препараты распластанных хромосом получали по стандартной методике (Дарлингтон, Ла Кур, 1980). В некоторых экспериментах в культуральную среду добавляли нокодазол (Serva) в концентрации 0.1 мкг/мл за 2 ч до фиксации клеток. Клетки собирали, обрабатывая парами трипсина, и инкубировали в растворе 75 мМ КС1 10 мин при 37° С. Фиксация проводилась смесью 96% этанола и уксусной кислоты (3:1) при -20° С в три смены общей продолжительностью 50 мин. Суспензию зафиксированных клеток раскапывали на влажные охлажденные предметные стекла и высушивали над газовой горелкой. Полученные препараты окрашивали красителем Гимзы 5-7 мин, просматривали и фотографировали с помощью микроскопа "Opton-3" (объектив ЮОх, окуляр 10х).

Электронная микроскопия.

В работе использовалась стандартная процедура подготовки образцов для электронно-микроскопического исследования (Уикли, 1975). Контрольные и инфицированные клетки, растущие на покровных стеклах, через 2-4 дня после заражения ЦМВ фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере Зеренсена (pH 7.2-7.4) 1.5 ч при комнатной температуре. Затем промывали фосфатным буфером и постфиксировали 1% раствором OsÜ4 в темноте 2 ч при комнатной температуре. Далее материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. Контрастирование образцов 2% раствором уранилацетата натрия осуществляли одновременно с обезвоживанием в 70% этаноле. Затем проводили пропитку образцов в трех смесях ацетона с Эпоном 812 (Serva) (3:1, 1:1, 1:3) и заливку в Эпон 812. Полимеризацию смолы проводили при 37° С 24 ч, затем при 60° С 48 ч.

После окончания полимеризации из шайб с залитым материалом удаляли стекла с помощью жидкого азота. Заливки просматривали в фазовом контрасте, нужную митотическую клетку отмечали при помощи металлического метчика, закрепленного на объективе микроскопа. На выбранную клетку затачивали блок. Серийные ультратонкие срезы толщиной 70-80 нм получали на ультрамикротоме

LKB (Швеция). Готовые срезы помещали на бленды, покрытые подложкой из формвара и контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа Hitachi 11В (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Компьютерная реконструкция.

Фотографии серийных срезов митотических хромосом использовались для реконструкции их трехмерного изображения. Компьютерные модели создавали с помощью программы "Мультивокс - микроскоп", разработанной лабораторией компьютерных методов в медицине (НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского и НИИ ядерной физики).

Радиоавтография.

3Н-тимидин вводили в культуральную среду в концентрации 1 мкКюри/мл (удельная активность 37 кБк/мл) на 1 ч одновременно с заражением вирусом. В контрольную культуру метку вносили в той же концентрации также на 1 ч. После окончания инкубации клетки промывали средой без сыворотки и переносили в свежую среду, содержащую "холодный" тимидин. Фиксацию проводили через разные интервалы времени смесью 96% этанола и уксусной кислоты (3:1) 40 мин при комнатной температуре. Стекла с клетками обрабатывали 5% трихлоруксусной кислотой 15 мин при 4° С для удаления невключившегося предшественника и промывали водой. После высушивания на воздухе стекла с клетками монтировали на предметные стекла клетками вверх. Препараты покрывали фотоэмульсией (НИИ

Химфотопроект), экспонировали в течение 3-4 дней в темноте, проявляли амидоловым проявителем, фиксировали и промывали проточной водой (Епифанова и др., 1977). Препараты докрашивали гематоксилином Караччи 14 мин и изучали в микроскопе "Ор1:оп-3".

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клеточная модель для изучения ЦМВ.

В лабораторных условиях цитомегаловирусная инфекция продуктивно развивается лишь в некоторых клеточных линиях. Наиболее активно репликация вируса и сборка вирусных частиц происходит в фибробластах. Поэтому чаще всего для исследования ЦМВ человека используют культуры эмбриональных человеческих фибробластов. Эти клетки являются пермиссивными к ЦМВ, однако их чувствительность в зависимости от происхождения может различаться.

В данной работе изучение ЦМВ проводилось на фибробластах легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), инфицированных с различной множественностью. Наблюдение за клеточной культурой после заражения с низкой множественностью (0.01-0.05 БОЕ/кл.) показало, что уже на 2-3 день развития инфекции проявляется цитопатическое действие вируса. Клетки становятся менее распластанными, округляются; появляются базофильные внутриядерные включения. На более поздних сроках (3-4 день после заражения), когда в неинфицированной культуре формируется монослой, зараженные клетки образуют островки, часто встречаются многоядерные клетки. При продолжении культивирования инфицированной культуры на 5-6 день после заражения наблюдается большое количество гибнущих клеток, для которых характерны сильно округленная форма и пикнотическое изменение ядра. При электронно-микроскопическом исследовании зараженных клеток начиная со 2-3 дня выявляются внутриядерные включения, состоящие из новосинтезированной вирусной ДНК и формирующихся нуклеокапсидов ЦМВ (рис. 3 А, Б). На более поздних сроках вирусные частицы наблюдаются и в цитоплазме инфицированной клетки, где происходит их созревание (рис. 3 В).

При инфицировании той же клеточной линии с более высокой множественностью (0.1-0.5 БОЕ/кл.) описанные выше процессы развиваются значительно быстрее. Уже к концу 2-го дня после заражения начинается гибель клеток. В целом инфицирование клеточной культуры с более низкой множественностью вируса позволяет более подробно рассмотреть последовательные этапы развития инфекции. В связи с этим в большинстве экспериментов использовалась множественность заражения 0.01-0.05 БОЕ/кл.

Экспрессия белков ЦМВ в клетках ФЛЭЧ.

Для контроля за уровнем инфицированности культуры при постановке экспериментов использовали выявление сверхраннего белка ЦМВ - р72. В интерфазных клетках этот полипептид обнаруживается уже в первые часы после инфицирования в виде внутриядерных включений. Встречалось два типа локализации: в виде компактных зон ("глыбок") или гомогенное окрашивание ядра (рис. 4 А). Окрашивание в виде компактных "глыбок" было более характерно для ранних стадиях развития инфекции (таблица 1); оно чаще наблюдалось при заражении клеток с низкой ИМ. На более поздних сроках и при использовании высокой ИМ преобладало гомогенное окрашивание ядер инфицированных клеток.

Для того чтобы оценить долю инфицированных клеток в культуре, мы подсчитывали количество ядер, содержащих белок Ш р72, фиксируя клетки через разные интервалы времени после заражения ЦМВ с высокой и низкой ИМ. Изменение доли окрашенных клеток отражено в таблице (таблица 1).

Таблица 1

Выявление сверхраннего вирусного белка р72 в клетках ФЛЭЧ на разных сроках после инфицирования (% окрашенных клеток)

Множественность заражения

0.01 - 0.05 БОЕ/кл 0.1 -0.5 БОЕ/кл

Время, час Всего окрашенных клеток,% Гомогенная окраска ядра Окраска в виде компактных глыбок Всего окрашенных клеток,% Гомогенная окраска ядра Окраска в виде компактных глыбок

4 24,5 4,5 20 82 47 35

24 34 18,5 15,5 97 91,5 5,5

48 23 22 1

72 48 44 4

96 97 - -

При анализе препаратов, окрашенных антителами к Ш р72, было отмечено, что в инфицированных митотических клетках этот антиген ассоциировал с хромосомами (рис. 5 А, В).

Нами также проводилось окрашивание клеток, инфицированных с низкой ИМ и зафиксированных через 1-4 дня, моноклональными антителами к раннему белку ЦМВ ррб5 и позднему белку После инкубации клеток с антителами к рр65 с 1-го по 3-й день после инфицирования выявлялась флуоресценция в ядрах -гомогенная или в виде "глыбок" (рис. 6 А, Д). В случае второго варианта расположение зон флуоресценции соответствовало районам, наиболее интенсивно окрашивающимся БАР1, и, по-видимому, содержащим скопления вирусной ДНК На 4-й день появлялась флуоресценция в цитоплазме интерфазных клеток, как правило в виде единичного крупного "пятна" вблизи ядра (рис. 6 В). На всех сроках после заражения в большинстве митотических клеток окраска отсутствовала, однако в некоторых случаях наблюдалась слабая флуоресценция хромосом (рис. 6 Д).

Поздний белок §В при использовании низкой ИМ выявлялся в зараженных клетках начиная со 2-го дня. Он был локализован в цитоплазме интерфазных клеток, при этом наибольшая интенсивность окраски наблюдалась в компактной зоне (одной на клетку), прилегающей к ядру (рис. 7 А) . В митотических клетках на всех сроках после инфицирования §В не выявлялся.

Появление патологических митозов в культуре, инфицированной

ЦМВ.

Для того чтобы охарактеризовать состояние клеток в условиях развития инфекции, был проведен анализ изменений митотического индекса в контрольной культуре ФЛЭЧ и в культуре, инфицированной ЦМВ с низкой ИМ. Клетки фиксировали с 1-го по 4-й день после заражения с интервалом 24 ч и на препаратах подсчитывали количество митозов (рис. 8). В неинфицированной культуре митотический индекс достигал максимального уровня (2.3%) на 2-й день после пересева клеток, после чего снижался до 0.2% на 4-й день. В то же время в культуре, заражённой ЦМВ, величина митотического индекса постоянно возрастала, достигая на 4-й день после инфицирования 13.6%. На тех же время после инфицирования, сутки контрольная культура —■—ЦМВ-инфицированная культура

Рис. 8. Динамика изменений митотического индекса в культуре ФЛЭЧ в 1-4-й день после заражения ЦМВ препаратах проводился подсчет количества клеток на единицу площади (рис. 9). Оказалось, что в то время как в контрольной культуре эта величина возрастала с 1-го по 4-й день культивирования, в инфицированной культуре число клеток на единицу площади существенно не увеличивалось.

Начиная со 2-го дня после инфицирования в культуре ФЛЭЧ наблюдались митотические фигуры, в которых расположение хромосом и их морфология не соответствовали ни одной из нормальных стадий митоза (рис. 10). Ориентируясь на эти критерии, мы выделили следующие основные типы аномальных митозов (рис. 10): 1) расположение хромосом сходно с характерным для метафазы, но степень конденсации хромосом выше, чем в норме, и часто наблюдается несколько отдельно лежащих хромосом (рис. 10 А, Б ). 2) при наличии в центре клетки группы хромосом значительная часть хромосом лежит отдельно (рис. 10 В, Г). Реже встречаются митозы, в которых хромосомы образуют две или три группы. Между этими основными группами располагаются отдельные хромосомы. 3) хромосомы разбросаны по цитоплазме и часто фрагментированы (рис. 10 Д, Е). Описанные типы расположения хромосом схематически отображены на рис. 11 А. Доля патологических митозов среди общего числа митотических клеток возрастала со 2-го по 4-й день после инфицирования с 30 до 86% (таблица 2).

Как показал иммунофлуоресцентный анализ, во всех митозах с аномальной морфологией (патологических митозах) хромосомы гомогенно окрашивались антителами к Ш р72 (рис. 5 В). Среди митозов, идентифицированных как нормальные, также встречались отдельные клетки, содержащие Ш р72 (рис. 5 А).

Для того, чтобы выяснить, способны ли клетки с патологией митоза завершить деление, был произведен подсчет митотических фигур, соответствующих стадиям анафазы или телофазы. Оказалось, что если в контрольной культуре ФЛЭЧ их доля от общего числа митозов составляла в среднем 17%, то на второй день после заражения на 100 митотических клеток приходилось 3 клетки на стадии анафазы или телофазы. На 3-й и 4-й день суммарная доля анафазных и телофазных клеток снижалась до 1%.

Таблица 2

Доля митозов с различной морфологией в инфицированной культуре ФЛЭЧ (% от общего числа митозов)

День после Нормальные Патологические митозы

Инфицирования митозы 1 тип * 2 тип* 3 тип*

2 70 10 15 5

3 .47 10 27 16

4 14 5 22 59 см. рис. 11 А

Описанные выше наблюдения свидетельствовали о том, что в условиях ЦМВ-инфекции в культуре эмбриональных фибробластов возникает патология митотического деления, связанная с остановкой на стадии, предшествующей расхождению хромосом. Изучению этого феномена были посвящены следующие разделы работы.

Макроструктура хромосом в патологических митозах.

Ранее в литературе были описаны хромосомные аберрации, наблюдавшиеся в клетках при ЦМВ-инфекции (ТЧас11%а1, №с1Ид§а1, 1978,

АЬиВакаг, 1988, А1Ьгес1й, 1989). Однако динамика их появления не изучалась и связь с нарушением хода деления выявлена не была.

Для получения данных о морфологии хромосом в патологических митозах анализировали хромосомные препараты, полученные из клеток ФЛЭЧ на разных сроках после инфицирования ЦМВ (таблица 3). На каждую точку исследовали по 100 метафазных пластинок.

Таблица 3

Морфология хромосомных пластинок в ЦМВ - инфицированной культуре ФЛЭЧ: частота встречаемости разных типов,%.

День после Нормальная Аномальная морфология инфицирования морфология 1 тип 2 тип 3 тип

2 72 20 8

3 21 12 55 12

4 5 5 65* 25

1 тип - хромосомы укороченные,степень конденсации повышена

2 тип - наличие хромосомных аберраций, перетяжек, фрагментов, частичного расхождения хроматид

3 тип - пульверизация хроматина на этом сроке преобладают пластинки, состоящие из мелких округлых фрагментов хромосом

В большинстве экспериментов хромосомные препараты получали без предварительной обработки клеточной культуры нокодазолом, которая обычно используется для увеличения количества митозов. Это условие позволяло оценить влияние вируса на хромосомы без дополнительного воздействия цитостатиков.

В неинфицированной культуре метафазные пластинки содержали 46 хромосом и имели стандартную морфологию (рис. 12 А). В отсутствии обработки нокодазолом у большинства хромосом были нечетко видны хроматиды, они выглядели более вытянутыми.

На второй день после заражения ЦМВ большинство метафазных пластинок (72%) были сходны по морфологии хромосом с контрольными клетками (рис. 13 А- В). В то же время в значительной части митозов (около 20%) хромосомы были сильно конденсированы и выглядели укороченными (рис. 13 Г, Д). В инфицированной культуре в отсутствии обработки нокодазолом достигался значительно лучший разброс хромосом, чем в контроле.

На третий день опыта в инфицированной культуре лишь около 20% хромосомных пластинок имели нормальную морфологию. В большинстве клеток наблюдались те или иные изменения морфологии хромосом. При этом преобладающим типом нарушений было появление различных хромосомных аберраций, таких как образование многочисленных перетяжек, хроматидные разрывы, частичное расхождение хроматид, появление отдельно лежащих мелких фрагментов (рис. 14). Как правило, в одной клетке встречалось несколько видов нарушений. Подобная картина наблюдалась и на 2-й день опыта в небольшом количестве митозов (8%). На третий же день доля клеток с такими нарушениями составляла 55%, то есть около половины от общего числа. В том числе в 17% из этих клеток наблюдалась сильная фрагментация части хромосом.

На этом сроке развития инфекции появлялись также клетки, в которых все хромосомы были фрагментированы и наблюдалась так называемая «пульверизация» хроматина (рис. 15). В таких пластинках границы хромосом выявлялись плохо, что не позволяло оценить их число. Доля клеток с такими нарушениями составляла в среднем 12%.

На четвертый день после инфицирования доля пластинок с нормальной морфологией резко снижалась (до 5%). Преобладали пластинки, состоящие из мелких непарных фрагментов хромосом, имеющих округлую форму. Доля клеток, содержащих «пульверизованный» хроматин, возрастала до 25%.

Хромосомные препараты были также получены из клеток ФЛЭЧ, обработанных нокодазолом (0.1 мкг/мл) в течение 2 ч перед фиксацией. При этом в неинфицированной культуре накапливались метафазные клетки, для которых была характерна высокая степень конденсации хромосом и уменьшение их длины (рис. 12 Б, В). Интересно, что в культуре, инфицированной ЦМВ, такая морфология хромосом встречалась начиная со 2-го дня развития инфекции в отсутствии обработки цитостатиками (рис. 13 Г, Д). После инкубации инфицированных клеток с нокодазолом наблюдались те же нарушения макроструктуры хромосом, что и без его воздействия.

Выявленные хромосомные нарушения коррелируют с выделенными нами основными морфологическими типами патологических митозов (рис. 10, 11 А). Можно заключить, что в митозах, отнесенных к первому типу, наиболее вероятным изменением морфологии хромосом является повышение степени конденсации. Второй тип митозов характеризуется более серьезными нарушениями структуры хромосом: появлением аберраций, фрагментацией. Что касается патологических митозов третьего типа, в них повреждения выражены наиболее сильно - вплоть до полной деструктуризации хромосом.

Кинетохоры в ЦМВ-инфицированных клетках ФЛЭЧ.

Кинетохор является одним из компонентов митотического аппарата, обеспечивающим образование контактов микротрубочек веретена деления с

Рисунок 12. Препараты распластанных хромосом из контрольных клеток ФЛЭЧ. А - без обработки цитостатиками; Б, В - обработка 0.1 мкг/мл нокодазола в течение 2 ч перед фиксацией. Окраска по Гимза. Ув. 1860х.

Рисунок 13. Препараты распластанных хромосом из ЦМВ-инфицированной культуры ФЛЭЧ на 2-й день после заражения (без обработки цитостатиками). А-В -хромосомы сходны по морфологии с контрольными; Г, Д - хромосомы сильно конденсированы, укорочены. Окраска по Гимза. Ув. 1860х.

Рисунок 14. Препараты распластанных хромосом из ЦМВ-инфицированной культуры ФЛЭЧ на 3-й день после заражения (без обработки цитостатиками). Стрелками указаны хромосомные аберрации: частичное расхождение хроматид (А), перетяжки (Б, В), мелкие фрагменты (Б, В). Окраска по Гимза. Ув. 1860х.

Рисунок 15. Препараты распластанных хромосом из ЦМВ-инфицированной культуры ФЛЭЧ на 4-й день после заражения (без обработки цитостатиками). Наблюдается сильная фрагментация хромосом. Окраска по Гимза. Ув. 1860х. центромерным районом хромосомы. Правильное строение и функционирование кинетохоров необходимо для нормального расхождения хромосом в митозе. Надо отметить, что данные о состоянии кинетохоров в клетке в условиях ЦМВ-инфекции в литературе полностью отсутствовали. В связи с этим нами было обращено особое внимание на изучение этой структуры. Исследование проводилось как с помощью электронной микроскопии, так и методом иммунофлуоресценции.

Электронно-микроскопический анализ зараженных клеток позволил получить сведения об ультраструктуре кинетохоров в условиях инфекции.

В контрольных митотических клетках ФЛЭЧ в центромерных районах хромосом наблюдались кинетохоры, строение которых соответствовало описанному в литературе для клеток млекопитающих (рис. 16). Кинетохоры имели трехслойную структуру подковообразного (в прометафазе) или прямого (в метафазе) профиля. Наружная пластинка кинетохора была ясно различима, с ней контактировали пучки микротрубочек веретена деления. Диаметр наружной пластинки, измеренный на продольных срезах через центромерный район хромосомы, составлял около 0.25 мкм. Структура кинетохора выявлялась на 4-5 последовательных ультратонких срезах, что составляло около 300-400 нм.

Инфицированные клетки ФЛЭЧ для изучения строения кинетохоров фиксировали через 2, 3, и 4 дня после заражения ЦМВ с низкой ИМ. Митотические клетки прицельно отбирали под микроскопом и получали серийные ультратонкие срезы.

В митотических клетках из инфицированной культуры на 2-3 день после заражения наблюдался ряд изменений в ультраструктуре кинетохоров:

1) изменение морфологии кинетохора: искривление пластинок (рис. 17 Г); разрыхление (на поверхности хромосомы хорошо различима внутренняя пластинка, возрастает ширина среднего слоя кинетохора) (рис. 18 А, 19 А); нечеткость трехслойной организации (внешний и внутренний слой плохо различимы, иногда наружная пластинка выглядит фрагментированной) (рис. 17 Е, 18 Б).

2) изменение размера кинетохора: уменьшение (такие кинетохоры выявлялись всего на 2-3 последовательных срезах, диаметр наружной пластинки составлял в среднем 0.15 мкм) (рис. 18 А-В, 19 Д); укрупнение кинетохоров, связанное скорее с их слиянием, так как в этом случае выявляется один кинетохор на хромосому (рис. 17В).

3) отсутствие трехслойной структуры кинетохора: в центромерном районе на поверхности хромосомы можно видеть аморфное образование (рис.20).

Во всех описанных случаях вблизи кинетохоров наблюдались подходящие к ним микротрубочки веретена. Часто в зоне кинетохора отмечалось сильное вытягивание подлежащего участка хроматина в направлении от тела хромосомы к микротрубочкам (рис. 19 Е). Перечисленные нарушения встречались в разных клетках с различной частотой и в разных сочетаниях.

В целом со 2-го по 4-й день после инфицирования доля стандартных кинетохоров в митозах резко сокращалась. Если на второй день доля аномальных кинетохоров составляла около 20%, то на третий день - уже 64%. На 4-й день в большинстве митозов кинетохоры не выявлялись (рис. 21).

При этом серьезные нарушение в строении кинетохоров, такие как исчезновение трехслойной организации и аморфная морфология, появлялись на 3-й день после инфицирования в клетках с беспорядочным расположением хромосом. В тех митозах, где хромосомы образовывали более или менее четкую метафазную пластинку, большинство кинетохоров имели нормальную морфологию (рис. 17 А, Б). Среди изменений встречалось уменьшение размера и нечеткость трехслойной организации.

На 4-й день после заражения, как указывалось выше, среди митозов преобладают клетки, в которых морфология хромосом и их расположение серьезно нарушены (рис. 22 Б, В). В этих клетках как правило не удается обнаружить кинетохоры. Лишь на единичных хромосомах можно выявить нечеткую структуру, напоминающую наружную пластинку кинетохора, не контактирующую с микротрубочками (рис. 19 Е).

При электронномикроскопическом исследовании митотических клеток на 3-4 день после инфицирования вирусом помимо нарушений кинетохоров, хромосом и центриолей были выявлены другие особенности ультраструктуры. Так, в клетках, в которых была отмечена фрагментация хромосом, наблюдалась также дезорганизация веретена деления. В цитоплазме значительно возрастало содержание промежуточных филаментов и наблюдалось расширение цистерн эндоплазматического ретикулума. Было также отмечено формирование большого количества мембранных структур, в том числе вокруг хромосом. Периферия клетки была заполнена мелкими плотными митохондриями (рис. 22 В).

Различия в морфологии и расположении кинетохоров на хромосомах в контрольных и ЦМВ-инфицированных клетках наглядно демонстрируют реконструированные трехмерные модели хромосом. Нормальная метафазная хромосома имеет два кинетохора сходного размера, симметрично располагающихся на хроматидах в районе первичной перетяжки (рис. 23 А, Б). В то же время, одна из хромосом из клетки, зафиксированной на третий день после

Рисунок 16. Серия ультратонких срезов хромосом из контрольной культуры ФЛЭЧ. Стрелками указаны кинетохоры, выявляющиеся на 4-5 последовательных срезах. Ув. 80000х.

Рисунок 17. Ультраструктура кинетохоров в клетках из ЦМВ-инфицированной культуры ФЛЭЧ на 2-3-й день после заражения. Часть кинетохоров имеет нормальную морфологию (А, Б), встречаются также кинетохоры, увеличенные в размере (В), имеющие искривленные пластинки (Г). Стрелками указаны кинетохоры; Е - двойной стрелкой указана фрагментированная наружная пластинка кинетохора. Ув. 80000х.

Рисунок 18. Серия ультратонких срезов через центромерный район хромосомы из ЦМВ-инфицированной клетки на 3-й день после заражения. Стрелками указаны кинетохоры, выявляющиеся на 2-3 последовательных срезах. Ув. 80000х.

Рисунок 19. А - Г - серия ультратонких срезов через центромерный район хромосомы из ЦМВ-инфицированной клетки на 3-й день после заражения; кинетохор (указан стрелкой) имеет увеличенный средний слой, наружная и внутренняя пластинки четко выявляются лишь на одном срезе. Д, Е - отдельные срезы через центромерные районы хромосом на 4-й день после заражения. Наблюдается выступание центромерного хроматина относительно тела хромосомы (Е), кинетохоры (указаны стрелками) не имеют четкой пластинчатой организации. Ув. 80000х.

Рисунок 20. Серия ультратонких срезов через центромерный район хромосомы на 3-й день после инфицирования ЦМВ. Стрелкой указано аморфное образование, соответствующее кинетохору.

Рисунок 21. Серия ультратонких срезов через центромерный район хромосомы на 4-й день после инфицирования ЦМВ. Кинетохорная структура не выявляется.

Рисунок 22. Расположение хромосом в митозе. А - контрольная клетка ФЛЭЧ, метафаза. Б - ЦМВ-инфицированная клетка, 3-й день после заражения; морфология хромосом изменена, границы между ними нечеткие, кинетохоры не наблюдаются. В -ЦМВ-инфицированная клетка, 4-й день после заражения; хромосомы рассеяны в цитоплазме, фрагментированы; кинетохоры не выявляются, наблюдается большое количество митохондрий. Ув. 20000х (А, Б), 24000х (В).

Рисунок 23. Компьютерная реконструкция хромосомы из неинфицированной митотической клетки ФЛЭЧ (А, Б) и хромосомы из инфицированной клетки на 3-й день после заражения ЦМВ (В, Г). Каждая модель показана в двух ракурсах, позволяющих оценить расположение кинетохоров (К). инфицирования ЦМВ, имеет лишь один кинетохор, размер которого меньше, чем в контроле (рис. 23 В, Г).

Иммуноцитохимический анализ центромерных районов хромосом в ЦМВ-инфицированных клетках ФЛЭЧ

Иммуноцитохимический анализ белкового состава включал изучение клеток ФЛЭЧ на разных сроках после инфицирования ЦМВ с низкой ИМ (1, 2, 3, 4 дня) с применением четырех различных антител и сывороток. Аутоиммунная сыворотка ОЭ содержит антитела к трем белкам центромерно-кинетохорного комплекса: СБИР-А, В и С. Кроме того, использовалась аутоиммунная сыворотка М-81, специфически выявляющая белок СБИР-А, и моноклональные антитела к белкам СЕЫР-В и СЕКР-С.

В контрольных клетках белки центромерно-кинетохорного комплекса, относящиеся к классу СЕМ*, выявлялись как в интерфазе так и в митозе. Все четыре использованных вида антител давали сходную картину окрашивания. В интерфазе зоны флуоресценции были локализованы по всему объему ядра, часть из них располагалась попарно. В митозе флуоресценция в виде таких же мелких дискретных зон выявлялась над хромосомами на всех стадиях деления (рис. 24 А, Б). В метафазе часто наблюдалось расположение отдельных зон флуоресценции в виде полосок, ориентированных перпендикулярно плоскости хромосомной пластинки (рис. 24 Б). Такая картина была наиболее характерна для клеток, обработанных антителами к белку СЕЫР-В.

В культуре ФЛЭЧ, инфицированной ЦМВ, интерфазные ядра окрашивались всеми использованными антителами так же как и в контрольных

Рисунок 24. Выявление центромерных белков класса СЕ№> в митотических клетках ФЛЭЧ. А, А" - контрольная культура, Б - Д - ЦМВ-инфицированная культура на 2-4-й день после заражения. А - Д - окраска антителами, А - Д' - окраска ДАЛИ. Ув. 1860х. клетках. Позитивная окраска наблюдалась и в митотических клетках, причем как в митозах со стандартной морфологией, так и в патологических (рис. 24 В - Д). Интенсивность флуоресценции в контроле и опыте не различалась. Характер окрашивания митотических клеток в инфицированной культуре также в целом совпадал с тем, что наблюдалось в контрольных клетках, однако в метафазе расположение зон флуоресценции над хромосомами как правило было более рыхлым, не выявлялось упорядоченное расположение в виде полосок. Также обращал на себя внимание тот факт, что в патологических митозах, в которых имелась центральная группа хромосом и отдельно лежащие мелкие хромосомные фрагменты на периферии, центромерные белки выявлялись только в центральной группе, а на периферии клетки окраска отсутствовала (рис. 24 Д).

Митотический аппарат в ЦМВ-инфицированных клетках: центросома и веретено деления.

Не менее важным для понимания природы патологических митозов, чем особенности морфологии хромосом, являются сведения о структуре и функционировании митотического аппарата в этих клетках. Нами были исследованы различные компоненты этой сложной системы.

Ряд наблюдений о состоянии центросомного аппарата был сделан при электронно-микроскопическом исследовании патологических митозов на 3-4 день после инфицирования вирусом. Были выявлены несколько типичных нарушений, касающихся строения и расположения центриолей (рис. 25): 1) появление дополнительных центриолей вне полюсов деления (рис. 25 А); 2) нарушение строения центриолей, как например существенное увеличение длины (рис. 25 Б);

3) отсутствие одной или обеих центриолей в полюсе (рис. 25 В). Эти аномалии сходны с теми, которые были описаны в работе Быстревской с соавторами (Ву&геувкауа й а1., 1997).

Морфология патологических митозов, наблюдавшаяся при ЦМВ-инфекции, давала исследователям основание называть их К-митозами по аналогии с эффектом, возникающим после обработки клеток цитостатиками (колцемидом, нокодазолом). Как известно, эти вещества вызывают разборку микротрубочек, приводя к остановке деления в метафазе. Однако недавно появились сообщения о том, что в клетках, инфицированных ЦМВ человека, веретено деления имеет нормальную двухполюсную структуру (Вуз^еувкауа & а1., 1997). Это исключало возможность того, что причиной остановки митоза в данном случае является патология веретена деления.

В настоящей работе были получены новые данные о состоянии митотического веретена в клетках ФЛЭЧ, инфицированных ЦМВ человека. Морфология веретена изучалась с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием антител к альфа-тубулину. При этом исследовались разные стадии развития инфекции - от 1 до 4 дней после заражения с низкой инфекционной множественностью. Было показано, что начиная со 2-го дня после инфицирования появлялись отклонения в строении веретена деления (рис. 26). К таким нарушениям можно отнести: 1) удлинение веретена (рис. 26 Б); 2) отсутствие параллельно ориентированных пучков микротрубочек (рис. 26 Д, Е);

3) появление дополнительных фокусов схождения микротрубочек (рис. 26 В, Г);

4) отсутствие выраженных полюсов (рис. 26 Д, Е). Эти данные суммированы на рис. 11 Б, где схематично отображены основные типы морфологии веретена в митотических клетках из инфицированной культуры.

Рисунок 25. Нарушения в расположении и строении центриолей в митотических клетках из ЦМВ-инфицированной культуры ФЛЭЧ. А - центриоль (Ц) вне полюса, лежащая рядом с хромосомой (Хр); Б - увеличенная одиночная центриоль в полюсе деления; В - полюс (П) без центриолей. Ув. 80000х.

Доля митозов, имеющих характерное двухполюсное веретено, образованное параллельно ориентированными пучками микротрубочек, с 1 по 4 день развития инфекции снижалась в 4 раза (рис. 27). При этом расстояние между полюсами в таком веретене различалось в контрольных и инфицированных клетках: если в нормальной метафазе оно составляло в среднем 10.4+1.8 мкм, то в метафазах из инфицированной культуры - 13.1 ±2.1 мкм, а в митозах с разбросом хромосом - 16.7±2.8 мкм.

Необходимо отметить, что частота встречаемости перечисленных нарушений различалась на разных сроках после инфицирования вирусом (рис. 27). Сопоставив организацию микротрубочек в патологических митозах с характером расположения хромосом в этих клетках, мы обнаружили некоторые закономерности (рис. 11). Так, при наличии метафазной пластинки на всех сроках после инфицирования в клетке выявлялось двухполюсное веретено деления. В митотических клетках, отнесенных нами ко 2-му типу (наличие центральной группы и отдельно лежащих хромосом), чаще всего встречались двухполюсные веретена. Однако их морфология как правило отличалась от нормы: микротрубочки не образовывали четких пучков. Также в этих клетках наблюдалось появление дополнительных зон схождения микротрубочек: как добавочных полюсов, так и небольших фокусов схождения, располагающихся на периферии клетки. В патологических митозах 3-го типа, характеризующихся неупорядоченным расположением хромосом, как правило, наблюдалась сеть микротрубочек, лишенная выраженных полюсов и четкой ориентации пучков. В редких случаях можно было выявить более явную организацию микротрубочек с наличием двух основных зон схождения.

Рисунок 26. Морфология веретена деления в митотических клетках из ЦМВ инфицированной культуры ФЛЭЧ. А - Е - окраска антителами к альфа-тубулину; А' Е' - окраска ДАЛИ. Ув. 1860х.

Рисунок 27. Морфология веретена деления в митозах из инфицированной культуры.

Таким образом, можно заключить, что чем менее упорядоченно располагались хромосомы в патологическом митозе, тем в большей степени организация микротрубочек отличалась от нормальной. Выявлена также зависимость от времени, прошедшего с момента инфицирования: на более поздних сроках (3-4-й день) редко встречались веретена с нормальной морфологией, преобладающие в 1-2-й день. Отсутствие организованного веретена деления, напротив, было характерно именно для 3-4 дней развития инфекции.

Влияние ЦМВ на продолжительность некоторых стадий клеточного цикла.

Изменение клеточного цикла клетки-хозяина является одним из важных аспектов развития продуктивной вирусной инфекции. Этот вопрос также представляет особый интерес в связи с изучением феномена возникновения патологических митозов в инфицированной культуре. В настоящей работе с помощью метода радиоавтографии было изучено влияние ЦМВ на прохождение клеточного цикла на ранних стадиях развития инфекции - в первые два дня после заражения.

Эксперименты проводили с использованием двух различных множественностей заражения: 0.01-0.05 БОЕ/кл. и 0.1-0.5 БОЕ/кл, что позволило проанализировать зависимость влияния вируса на клеточную популяцию от доли инфицированных клеток.

В условиях различной инфекционной множественности была более подробно прослежена динамика митотического индекса в первые два дня после заражения ЦМВ. На препаратах контрольных и инфицированных клеток, зафиксированных через разные интервалы времени, подсчитывали митотический индекс (рис. 28). В неинфицированной культуре количество митозов снижалось в первые часы после смены среды, затем возрастало, достигая исходного уровня к 21 ч после начала эксперимента. Митотический индекс в культуре, инфицированной с низкой ИМ, на протяжении первых суток после инфицирования незначительно отличался от контрольного уровня, тогда как при высокой ИМ наблюдалось его существенное снижение. Начиная с 28 ч после заражения в культурах, инфицированных ЦМВ с высокой и низкой ИМ, величина митотического индекса постоянно возрастала, причем при высокой ИМ этот рост был более интенсивным. К 39 ч после инфицирования уровень митотического индекса был примерно одинаков в обеих инфицированных культурах, превышая контрольный уровень в 2 раза. К концу опыта в культуре, зараженной с высокой ИМ, начиналась гибель клеток и их открепление от поверхности стекла.

Появление патологических митозов наблюдалось при обеих множественностях заражения к концу первого дня развития инфекции (21 ч). Их доля среди общего числа постепенно увеличивалась, достигая при высокой ИМ 80%, а при более низкой - 12% к 40 ч после заражения (рис. 29). В обеих культурах встречались одни и те же морфологические типы патологических митозов. Первыми появлялись митозы с отставанием хромосом и повышенной степенью конденсации.

Следует подчеркнуть, что среди митозов с аномальным расположением хромосом встречались как клетки, содержащие метку, так и немеченые. Доля меченых митозов среди патологических составляла около 50% при обеих ИМ.

В использованной нами культуре ФЛЭЧ через 48 ч после посева на стекла, то есть в момент заражения, импульсную метку 3Н-тимидина включали около

30% клеток. В контрольной (неинфицированной) популяции митотические клетки, содержащие метку над хромосомами, впервые наблюдались через 4 ч после отмывки 3Н-тимидина (рис. 30). Доля меченых митозов постепенно возрастала, достигая наибольшей величины (82%) к 14 ч после начала опыта. Затем наблюдалось плавное падение этого показателя - до 50% к 18ч и до 5% к концу наблюдений (50 ч после импульсного мечения). Второй пик появления меченых митозов на протяжении этого времени не выявлялся.

Среди клеток, инфицированной ЦМВ с высокой и низкой ИМ, первые меченые митозы также появлялись через 4 ч после импульсного мечения. Нарастание их доли среди общего числа митотических клеток происходило в обоих случаях примерно одинаково, и пик появления меченых митозов приходился, как и в контроле, на 14 ч после начала опыта. Однако после 14 ч дальнейшие изменения этого показателя существенно отличались. При использовании низкой ИМ снижение уровня меченых митозов происходило медленнее, чем в контроле. К 23 ч после начала опыта 50% митозов содержали метку над хромосомами, в последующем их доля постепенно приближалась к уровню, отмеченному в контрольной культуре: 4% к 50 ч.

В культуре, инфицированной с высокой ИМ, динамика меченых митозов еще более заметно отличалась от описанной в контроле. Снижение их доли до 50% было отмечено в точке, соответствующей 28 ч после отмывки 3Н-тимидина. В дальнейшем падение уровня меченых митозов происходило примерно с той же скоростью, что и в культуре, зараженной с низкой ИМ, однако в случае использования высокой ИМ нарастание цитопатического действия вируса приводило к гибели клеток. В связи с этим анализ изменений, происходящих в культуре, оказался возможным лишь до 39 ч после заражения.

Рисунок 30. Динамика меченых митозов в культуре ФЛЭЧ после импульсного мечения 3Н-тимидином.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Использование в работе культуры диплоидных эмбриональных фибробластов позволяет, во-первых, создать условия для развития продуктивной цитомегаловирусной инфекции, и, во-вторых, получить клеточную модель, приближенную к условиям in vivo.

При развитии инфекции в организме жизненный цикл ЦМВ отличается большой временной протяженностью. В лабораторных исследованиях для достижения острой инфекции обычно используется высокая множественность заражения, при которой инфицированными оказываются практически 100% клеток в популяции. Однако при использовании более низкой ИМ есть возможность подробнее проследить возникновение и развитие клеточного ответа на действие мощного патогена, которым является цитомегаловирус.

Экспрессия белков ЦМВ в клетках ФЛЭЧ

Сверхранний белок ЦМВ р72 в наших экспериментах, в соответствии с литературными данными, выявляется в клетках ФЛЭЧ начиная с первых часов после инфицирования и на протяжении всего периода наблюдений (до 4 суток). Характер его локализации в интерфазных ядрах сходен с описанным в литературе: LaFemina с соавт. наблюдали два типа окраски антителами в инфицированных фибробластах человека и трансфицированных клетках культуры Vero, экспрессирующих IE р72 (LaFemina et al., 1989). С чем связано наличие двух разных типов распределения данного вирусного белка в ядре, неизвестно. Можно предположить, что характер окрашивания зависит от количества антигена

- с этим согласуется преобладание гомогенной окраски ядра на более поздних сроках развития инфекции, когда Ш р72 накапливается в инфицированных клетках в больших количествах. Также нельзя исключить, что существуют две различные формы белка, или же его распределение в ядре зависит от стадии клеточного цикла.

Большой интерес представляет наблюдение о связывании белка Ш р72 с митотическими хромосомами. Ассоциация вирусного белка с хроматином делящейся клетки - это весьма редкое явление. Она была показана еще лишь для одного вируса - Эпштейна-Барра (белок EBNA) (Rawlins et al, 1985). Неизвестно, в чем состоит значение такого связывания для вируса. Для белка EBNA предполагаемая роль заключается в поддержании плазмидного состояния вирусного генома во время латентной инфекции и в его правильном разделении между дочерними клетками. Однако в случае ЦМВ подобные функции для какого-либо белка пока не установлены.

Интересно, что по некоторым данным ассоциация с митотическими хромосомами характерна еще для одного белка ЦМВ - рр65 (ранний белок, компонент вирусного тегумента) (Dal Monte et al, 1996). Это наблюдение было сделано после обработки антителами к рр65 трансфицированных клеток астроцитомы, экспрессирующих данный белок, и подтверждено на фибробластах, инфицированных ЦМВ. Мы также наблюдали в одном из экспериментов слабое окрашивание хромосом моноклональными антителами к рр65. В интерфазных клетках, по данным тех же авторов, рр65 диффузно распределен в ядре (Dal Monte et al, 1996). Нами выявлен еще один тип локализации рр65 - в виде компактных зон в ядре - характерный для ранних сроков развития инфекции. На более поздних стадиях, когда начинается продукция вируса, рр65 выявляется в цитоплазме, где происходит сборка вирусных частиц.

В отличие от названных выше белков, гликопротеин gB выявляется только в цитоплазме инфицированных клеток. Являясь компонентом липидной мембраны вириона, он синтезируется в больших количествах на поздних сроках развития инфекции. Напомним, что для экспрессии поздних вирусных генов, к которым относится §В, необходима репликация ДНК вируса. В связи с этим представляют интерес предварительные результаты, полученные нами в экспериментах с использованием ганцикловира. Это вещество после добавления в инкубационную среду (концентрация 2.5 мкМ) подавляет синтез вирусной ДНК, являясь ингибитором ДНК-полимеразы вируса. Оказалось, что в таких условиях в инфицированной культуре также появляются патологические митозы. Эти данные позволяют предположить, что индукция патологии митотического деления не зависит от наличия поздних белков ЦМВ, а также от репликации вирусной Д НК.

Общая характеристика патологических митозов при ЦМВ-инфекции

Динамика митотического индекса в инфицированной культуре свидетельствует, что вирус существенно изменяет состояние клеточной популяции и его влияние усиливается по мере развития инфекции.

Представляется очевидным, что ЦМВ вызывает необратимую остановку митотического деления на стадии прометафазы или метафазы. Это подтверждается резким снижением доли анафаз и телофаз среди митозов и отсутствием увеличения количества клеток на стеклах (рис. 9).

При наблюдении за инфицированными клетками ФЛЭЧ in situ можно заключить, что в культуре резко возрастает количество митотических клеток с аномальным расположением хромосом. Для митотических фигур, отнесенных нами к 1-му и 2-му типам (рис. 11 А), чаще всего характерно отставание отдельных хромосом. Это нарушение нельзя назвать специфичным для действия ЦМВ: оно часто наблюдается в других условиях, в том числе может спонтанно возникать в нормальной клеточной культуре. При переходе клетки из прометафазы в метафазу часть хромосом устанавливает контакт с веретеном позже, чем остальные хромосомы. Однако в нормальном митозе в конце концов формируется правильная метафазная пластинка. В условиях ЦМВ-инфекции, в отличии от нормы, обычно наблюдается необратимое отставание значительной части хромосом, поскольку количество нормальных метафазных пластинок по мере развития инфекции постоянно снижается (см. табл. 3). В митотических клетках, отнесенных к 3-му типу (рис. 11 А), выявляется более грубая патология -разброс хромосом в цитоплазме и их фрагментация. Такие клетки невозможно отнести к какой-либо из фаз митоза.

Некоторые из нарушений митотического деления, наблюдавшихся нами при ЦМВ-инфекции, были описаны в работах, посвященных патологии митоза. Можно сказать, что патогенное воздействие ЦМВ напоминает цитопатические эффекты, вызываемые некоторыми другими вирусами и повреждающими агентами (Алов, 1972, Восток, Самнер, 1981, Boppana et al., 1999). Надо отметить, что хотя патогенный эффект ЦМВ был описан уже давно, причины возникновения нарушений были изучены слабо. Наша задача состояла в исследовании клеточных механизмов этого процесса и ультраструктурной основы происходящих изменений.

Как показало изучение делящихся клеток ФЛЭЧ, в условиях развивающейся ЦМВ-инфекции возникает ряд нарушений в их ультраструктуре. Одной из важных характеристик патологического митоза, индуцированного цитомегаловирусом, является повреждение хромосом. Оно наблюдается как на уровне макроструктуры митотических хромосом, так и на уровне их отдельных доменов, а именно центромерно-кинетохорного комплекса. Последний факт представляет собой уникальную особенность цитопатического действия ЦМВ, не известную до сих пор. В инфицированных клетках выявляются также нарушения в строении митотического аппарата: центриолей и веретена деления. Оказалось, что степень выраженности перечисленных патогенных эффектов вируса зависит от времени, прошедшего с момента инфицирования культуры.

Макроструктура хромосом в патологических митозах

В данной работе цитопатическое действие вируса исследовалось на разных стадиях развития инфекции - начиная с 1 до 4 суток после заражения. При этом даже при использовании низкой множественности заражения количество хромосомных аберраций в клетках резко возрастало по мере прогрессии инфекции. Надо отметить, что грубая патология в строении хромосом появлялась на 3-й день после инфицирования, то есть ко времени развития активной продукции вируса.

При сравнении данных, приведенных в табл. 2 и 3, обращает на себя внимание тот факт, что при наблюдениях in situ количество нормальных митозов на 3-4 день после заражения (47% и 14% соответственно, см. табл. 2) существенно выше, чем доля нормальных метафазных пластинок, выявляемых на тех же сроках (21% и 5%, см. табл. 3). Это говорит о том, что часть митотических клеток с хромосомными аномалиями могут идентифицироваться как нормальные.

Возникает вопрос, существует ли какая-либо преемственность между разными типами патологических митозов. Как показал анализ хромосомных препаратов, на раннем сроке развития инфекции (2-й день) можно выделить два основных типа аномальной морфологии метафазных пластинок: 1) пластинка состоит из гиперкомпактизованных хромосом, 2) у части хромосом наблюдаются различные аберрации. По-видимому, эти два типа аномалий возникают независимо друг от друга, причем первый - раньше ( он преобладает на 2-й день после инфицирования), а второй - позже (преобладает на 3-й день).

Гиперкомпактизация хромосом была ранее описана в ЦМВ-инфицированных клетках. В культуре фибробластов человека появление "колхицино-подобных метафаз" с рассеянными в цитоплазме хромосомами было названо самым характерным нарушением митоза при заражении цитомегаловирусом (Блюмкин и Жданов, 1973). Определение "колхицино-подобные" предполагает в качестве механизма нарушения повреждение митотического веретена. При этом в отсутствии контакта с микротрубочками хромосомы рассеиваются в цитоплазме и укорачиваются. Однако по нашим данным на 2-й день после инфицирования ЦМВ клеток ФЛЭЧ отклонения в строении веретена встречаются менее чем в 10% митозов в культуре. Таким образом, изменение морфологии хромосом вызвано другими причинами.

Большинство из зафиксированных нами хромосомных аберраций были ранее отмечены в литературе при описании ЦМВ-инфекции в клетках человека

Каппуа, 1986, АЬиВакаг, 1988, А1ЬгесМ, 1989). Сюда относятся хроматидные и хромосомные пробелы и разрывы, появление ацентрических фрагментов. Однако такое нарушение, как частичное преждевременное расхождение хроматид в некоторых хромосомах, до сих пор не было описано. Мы наблюдали это явление примерно в 30% митотических клеток на 3-й день после инфицирования. Таким образом, его можно считать характерным для действия ЦМВ. К сожалению, препараты, полученные без использования дифференциального окрашивания хромосом, не позволяют различить, какие именно районы хромосом разделяются, а какие остаются сближенными. Можно предположить, что происходит расхождение либо центромерных участков, либо теломер. По данным, полученным нами с помощью электронной микроскопии, в патологических митозах часто наблюдается «выступание» центромерной области хромосомы с расположенным на ней кинетохором относительно продольной оси хроматиды (рис. 19 е). Это может служить подтверждением первого варианта объяснения данной аберрации (расхождения центромер) по крайней мере у части хромосом.

На 3-й день после заражения появляется, а на 4-й день становится преобладающим еще один тип повреждения - «пульверизация» хроматина. По нашему мнению, это результат необратимой остановки митотического деления. На более раннем сроке для большинства патологических митозов характерно сильное вытягивание хромосом в длину и образование многочисленных перетяжек наряду с появлением отдельных мелких хромосомных фрагментов. Именно образование перетяжек может быть первой стадией фрагментации. В отношении гиперкомпактизованных хромосом развитие процесса фрагментации представить сложнее, однако конечной стадией для таких митозов, судя по всему, также является деградация хроматина.

В целом вопрос о том, каким образом осуществляется генотоксическое воздействие ЦМВ, остается открытым. Можно высказать несколько предположений относительно его возможных механизмов на ранних и более поздних стадиях развития инфекции.

Известно, что проникновение вирусных частиц в клетку и начало развития инфекции вызывает существенные физиологические изменения. Недавно было установлено, что при инфицировании ЦМВ гладкомышечных клеток в них быстро (примерно через 30 мин после заражения) возрастает содержание реакционно-способных соединений кислорода (ROI - reactive oxigen intermediates) (Speir et al, 1998). Это приводит к повышению уровня определенных факторов транскрипции, специфически связывающихся с ДНК. Высказывается мнение, что помимо активации транскрипции сверхранних вирусных белков, этот процесс может вызывать повреждение клеточной ДНК. Если аналогичные процессы имеют место при заражении фибробластов, это может приводить к нарушению макроструктуры хромосом в митозе.

Повреждение хроматина в инфицированных клетках может быть вызвано непосредственным воздействием вируса на его компоненты: ДНК и/или белки. Так, возможной причиной повреждения генетического материала клетки может быть встраивание в хромосомы вирусной ДНК. Об этом событии, относящемся к начальному этапу развития инфекции, известно немного. Установлено, что после попадания в клетку вирусный геном транспортируется в определенный ядерный домен, обозначаемый ND10, и эта локализация является необходимым условием для начала экспрессии генов ЦМВ (Ishov et al, 1997).

Кроме того, можно предположить нарушение экспрессии каких-либо белков хромосом в условиях развивающейся инфекции. Ингибирование их синтеза может являться причиной появления грубых нарушений в упаковке фибрилл ДНП и, соответственно, в строении митотических хромосом.

Еще одну возможную причину повреждения хромосом представляет взаимодействие вирусных белков с хроматином клетки-хозяина на более поздних стадиях развития инфекции. Существует ряд данных, свидетельствующих о возможности такого взаимодействия. Наиболее вероятными "кандидатами" здесь можно считать представителей группы сверхранних белков ЦМВ. Эти белки, начинающие синтезироваться в клетке уже в первые часы после заражения, в дальнейшем накапливаются в ядре в больших количествах. Напомним, что по нашим наблюдениям все патологические митозы в инфицированной культуре ФЛЭЧ содержат белок Ш р72, связывающийся с хромосомами. Нельзя также исключить возможность влияния на состояние клеточного хроматина раннего белка ЦМВ рр65, для которого также показано связывание с митотическими хромосомами.

Ранее несколькими авторами в качестве одного из наиболее вероятных причин появления аномальной морфологии хромосом при ЦМВ-инфекции предлагалась их преждевременная конденсация (А1ЬгесМ, 1989). При этом доказательств этой гипотезы представлено не было. По нашему мнению, «пульверизация» хроматина, наблюдаемая в инфицированных клетках на поздних сроках (3-4 дня после заражения), является результатом массовой фрагментации хромосом после необратимой остановки митотического деления. Однако мы не исключаем полностью предположение о преждевременной конденсации, так как в некоторых клетках на 3-4 день после инфицирования морфология хромосом (сильное увеличение длины, уменьшение диаметра и его неравномерность, невозможность выявления парных хроматид) напоминает описание преждевременной конденсации хроматина в Gi-фазе клеточного цикла.

В одной из последних работ группы, возглавляемой D. Н. Spector (Fortunato et al., 2000), впервые было продемонстрировано, что ЦМВ может вызывать специфическое повреждение 1-й хромосомы в человеческих клетках. Этот вывод был сделан на основании экспериментов, включавших заражение клеток в S-фазе и последующий их анализ после вступления в первое митотическое деление (12 ч после инфицирования). Эти данные представляют несомненный интерес, однако вызывают ряд вопросов. Так, кажется маловероятным, что воздействие вируса, даже на самых ранних стадиях после заражения, может ограничиваться одной хромосомой. Вопрос о «чувствительности» отдельных хромосом к действию ЦМВ остается открытым.

В той же работе (Fortunato et al., 2000) авторы показали, что для проявления генотоксического эффекта необходимо взаимодействие вирусных частиц с клеточными рецепторами и/или их вход в клетку, но не требуется экспрессия вирусных генов. Однако ранее для других вирусов (аденовирус, вирус простого герпеса) была установлена необходимость синтеза сверхранних белков как условия появления хромосомных аберраций (Peat and Stanley, 1986, Liao et al., 1999). Этот вопрос также требует прояснения.

Центромерно-кинетохорный комплекс в патологических митозах

По данным электронной микроскопии, нарушения в строении кинетохоров митотических хромосом появляются на 2-й день после инфицирования и существенно усиливаются на 3-й день. На 4-й день в большинстве митозов не удается обнаружить характерную структуру кинетохора. Таким образом, как и в отношении макроструктуры хромосом, по мере развития инфекции нарушения прогрессируют от небольших к резко выраженным.

Нарушение структуры кинетохора может являться одной из причин рассеивания хромосом в митозе. В то же время аномальные кинетохоры с небольшими изменениями структуры встречаются как на хромосомах, лежащих отдельно, на периферии клетки, так и в составе метафазной пластинки. Это свидетельствует о том, что такие изменения, как уменьшение размера, разрыхление, изменение формы и даже фрагментация наружной пластинки не препятствуют образованию контактов с микротрубочками и участию хромосомы в построении метафазной пластинки.

Кинетохоры с серьезными нарушениями организации встречаются только в клетках с нарушенным расположением хромосом, что говорит о том, что эти хромосомы не участвуют в образовании метафазной пластинки. Однако контакт с микротрубочками веретена в большинстве случаев все же образуется.

Чем объясняется отсутствие кинелгохорной структуры на хромосомах на поздних сроках развития инфекции? Эта патология может быть вызвана одной из двух причин: 1) конденсация хромосом в митозе не сопровождается формированием типичного трехслойного кинетохора; 2) сформировавшиеся кинетохоры подвергаются разборке не в телофазе, как в норме, а в прометафазе/метафазе после необратимой остановки деления. Первый вариант возможен, в частности, при нарушении синтеза каких-либо белковых компонентов. Возможность второго варианта подтверждается динамикой встречаемости различных нарушений, которая показывает постепенное их развитие от небольшой до грубой патологии. Это можно представить как процесс постепенной деградации кинетохорной структуры.

По данным иммуноцитохимического анализа хромосомы в патологических митозах содержат основные белки класса CENP (CENP-А, В, С) на всех сроках развития инфекции. Уровень их содержания, по-видимому, не отличается резко от контрольного. Таким образом, можно заключить, что деструктуризация кинетохоров не связана с отсутствием белков этого класса в зараженных клетках. Это направление исследований требует продолжения: необходимо, во-первых, более точно определить локализацию белков CENP на хромосомах, чтобы выявить возможные отклонения от нормы. Во-вторых, необходима характеристика других белков центромерно-кинетохорного комплекса, особенно тех из них, которые непосредственно являются компонентами кинетохора (например, белки-моторы).

Митотический аппарат в патологических митозах

Состояние митотического аппарата в ЦМВ-инфицированных клетках до настоящего времени практически не изучалось. Лишь в нескольких работах были описаны такие результаты влияния вируса, как разрушение сети микротрубочек в продуктивно инфицированных макрофагах (Fish et al., 1996), а также повреждение центросомы в митозе в пермиссивных человеческих фибробластах и непермиссивных клетках культуры Vero (Bystrevskaya et al., 1997). При этом в работе Быстревской с соавт. констатировалась сохранность двухполюсного веретена деления в аномальных митозах, исключая клетки с пульверизованным» хроматином. Авторы делали вывод, что нарушения в ходе митоза начинаются уже после того, как формируется метафазная пластинка и веретено деления. Предполагалось, что наблюдаемый разброс хромосом является результатом асинхронного расхождения хроматид в ранней анафазе и не обязательно связан с повреждением центросомы. Нарушения в центросоме, в свою очередь, проявлялись только в митозе в условиях аномального расположения хромосом; в интерфазных клетках отклонений от нормы не наблюдалось.

Наши наблюдения об изменении строения и расположения центриолей в митозах из инфицированной культуры ФЛЭЧ, полученные с помощью электронной микроскопии, соответствуют картине, описанной в работе Быстревской с соавт. Расширить представления о состоянии митотического аппарата в этих условиях позволил иммуноцитохимический анализ веретена деления в патологических митозах.

Некоторые из выявленных нами нарушений, такие как появление дополнительных фокусов схождения микротрубочек или отсутствие выраженных полюсов, можно связать с нарушением функционирования центросомы как центра организации микротрубочек. В других случаях зависимость между состоянием центросомы и структурой веретена оценить сложно. Когда в составе веретена деления не выявляются параллельные пучки микротрубочек, направленные к хромосомам, логично предположить отсутствие контакта между веретеном и кинетохорами, вызванное нарушением структуры последних. Возможно, количество микротрубочек в клетке увеличивается в ответ на отсутствие связывания с хромосомами. Наблюдающаяся на поздних сроках после инфицирования дезорганизация веретена деления (сеть микротрубочек, не имеющая выраженных фокусов схождения), возможно, является следствием необратимой остановки деления. В таких патологических митозах хромосомы разбросаны в цитоплазме, лишены кинетохоров и часто фрагментированы.

В целом, рассматривая динамику изменений структуры веретена деления в инфицированных клетках, можно обнаружить ту же закономерность, что и в структуре хромосом: со 2-го по 4-й день развития инфекции количество митотических клеток, в которых выявляется патология, возрастает, а нарушения усиливаются.

Возможные причины остановки митотического деления в условиях ЦМВ-инфекции

Всестороннее изучение патологических митозов, возникающих в культуре ФЛЭЧ после инфицирования ЦМВ, свидетельствует о том, что патогенное воздействие вируса приводит к необратимому блокированию клеточного деления на стадии прометафазы/метафазы. Каковы же клеточные механизмы этого явления?

Имеющиеся данные показывают комплексный характер изменений, происходящих в зараженной клетке. В условиях ЦМВ-инфекции оказывается существенно нарушенной структура митотических хромосом в целом и их отдельных районов (центромерно-кинетохорный комлекс) в частности. Повреждение кинетохоров представляет особый интерес, так как оно является отличительной особенностью патологических митозов, индуцированных ЦМВ.

Можно предположить, что из-за неспособности части хромосом участвовать в процессе построения метафазной пластинки ход митоза нарушается на этом этапе. Возможно, причина заключается в нарушении функционирования кинетохора как структуры, обеспечивающей движение хромосомы по микротрубочкам.

С другой стороны, к остановке деления способны привести изменения в строении или функционировании митотического аппарата клетки. Установлено, что в ситуации, когда в метафазной пластинке по какой-то причине хотя бы один кинетохор оказывается не связан с веретеном деления, или количество контактирующих с ним микротрубочек меньше нормы, кинетохор продуцирует ингибирующий сигнал, задерживающий переход клетки в анафазу (Rieder, Salmon, 1998). В митозах из ЦМВ-инфицированной культуры, как говорилось выше, патологические изменения в строении митотического аппарата прогрессируют по мере развития инфекции и могут, особенно на поздних сроках после заражения, составлять непосредственную причину нарушения хода митоза.

Помимо изменений, затрагивающих строение и функционирование различных клеточных структур, важную роль в развитии патологии митотического деления может играть дисбаланс в содержании определенных биохимических факторов в клетке. Известно, что работа всех компонентов, участвующих в процессе митотического деления, координируется сложной системой регуляции. Большую роль в ней играют регуляторы клеточного цикла. Так, например, установлено, что завершение митоза (разборка веретена, деконденсация хроматина, цитокинез) контролируется через инактивацию циклин-зависимых киназ. При этом наличие недеградирующего циклина В ингибирует анафазу, препятствуя выходу клетки из митоза. Согласно литературным данным, уровень циклина В в клетках, инфицированных ЦМВ, существенно повышен (Salvant et al., 1998). Таким образом, накопление циклина В может быть причиной нарушений хода митотического деления. Это лишь один из факторов, возможно ответственных за происходящие изменения. Более подробное изучение этого аспекта развития инфекции может дать новые гипотезы о механизмах влияния вируса на жизненный цикл клетки.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что остановка митоза в условиях ЦМВ-инфекции вызывается целым комплексом причин. На сегодняшний день ни одну из них нельзя считать первичной.

Влияние ЦМВ на продолжительность некоторых стадий клеточного цикла

Различные вирусы выработали механизмы, позволяющие им усилить собственную репликацию путем влияния на клеточные регуляторные функции. В случае ЦМВ, вирус производит в клеточном метаболизме изменения, в норме связанные с индукцией пролиферативного ответа. Однако изменение экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла приводит к его блокированию.

В данной работе исследовались первые этапы развития инфекции - до 48 ч после заражения клеток, то есть до достижения максимального уровня синтеза вирусной ДНК и до начала продукции вирусных частиц. В течение первых суток после инфицирования в клетках происходит подготовка к началу репликации вирусного генома: экспрессируются сверхранние белки- регуляторы, активируется синтез ряда клеточных макромолекул. На вторые сутки начинается синтез ДНК вируса, экспрессируются ранние и поздние белки.

Как показали наши эксперименты, уже в первый день после инфицирования в клеточной культуре наблюдается ряд изменений, касающихся жизненного цикла клеток. Сравнение динамики митотического индекса в культурах, зараженных с разной инфекционной множественностью (рис. 28) показывает, что влияние вируса на уровень пролиферативной активности культуры существенно зависит от множественности заражения. При низкой ИМ отличия от контроля возникают только на второй день после инфицирования, в то время как при высокой ИМ - уже через несколько часов.

Сравнение трех кривых, отражающих динамику митотического индекса в разных условиях, показывает, что при использовании низкой ИМ вируса в течение первых суток инфицированные клетки вступают в митоз в том же количестве, что и контрольные. В то же время в культуре, инфицированной с высокой ИМ, митотический индекс снижается в несколько раз в первые часы после заражения. Можно предположить, что это вызвано задержкой клеток на одной из стадий интерфазы. Однако эта задержка не является необратимой -позднее клетки начинают вступать в митоз, причем подъем митотического индекса происходит достаточно резко. Начиная примерно с 30 ч после заражения и до развития массовой гибели клеток (к концу второго дня при высокой ИМ) он существенно превышает контрольный уровень.

Анализируя изменения количества митозов в культуре, необходимо учитывать появление патологических митозов. Первые митотические клетки с выраженными аномалиями появляются к концу первого дня развития инфекции независимо от использованной ИМ, в дальнейшем их доля среди митозов постоянно нарастает. Надо отметить, что их морфология в обеих инфицированных культурах одинакова. По-видимому, механизмы образования патологии также сходны. Появление патологических митозов совпадает по времени с началом возрастания митотического индекса. Не вызывает сомнений, что повышение количества митозов обусловлено, по крайней мере частично, накоплением в инфицированной культуре клеток, заблокированных в митозе.

Использование импульсного мечения 3Н-тимидином позволило проследить дальнейшую судьбу клеток, находившихся в момент внесения метки в фазе синтеза ДНК. Отметим еще раз, что в работе нами использовалась пролиферирующая клеточная культура, не подвергавшаяся никаким воздействиям для того, чтобы «собрать» большую часть популяции в одной из фаз клеточного цикла. В момент начала опыта импульсную 3Н-тимидиновую метку включало около 30% клеток, то есть клеточная популяция находилась в состоянии роста.

Первые митозы, содержащие метку над хромосомами, появляются во всех вариантах эксперимента через 4 ч после импульсного мечения. Это соответствует данным о продолжительности Ог-периода в фибробластах человека (Фогель и Матульски, 1989). Как показывает сравнение кривых, отражающих уровень меченых митозов в контрольной и инфицированных культурах, до 14 ч после инфицирования (и отмывки 3Н-тимидина), клетки, зараженные в Б-фазе, ведут себя сходным образом: проходят Ог-период и вступают в митоз. При этом максимальный уровень меченых митозов практически совпадает во всех культурах. Эти результаты согласуются с данными БаЬ/агЛ с соавт. (8а1уа1й й а1., 1998), которые установили, что в клетках, зараженных ЦМВ во время 8-периода, в первый день задерживается развитие цитопатического действия и экспрессия вирусных генов. Авторы показывают, что эта задержка компенсируется через 24 ч после заражения и в последствии картина развития инфекции в этих клетках не отличается от наблюдающейся при заражении в других фазах клеточного цикла. В указанной работе было высказано мнение, что репликация ДНК клетки-хозяина является помехой для репликации ДНК вируса.

По нашим данным, по крайней мере часть клеток, находившихся в Б-периоде в момент заражения (возможно, клетки из поздней и частично из средней Б-фазы) вступает в митоз за то же время, что и неинфицированные клетки. В дальнейшем снижение доли меченых митозов происходит по-разному в различных культурах. В контроле она снижается до 50% от общего числа примерно на 5 ч раньше, чем в культуре, зараженной ЦМВ с низкой ИМ, и на 10 ч раньше, чем при высокой ИМ. Это позволяет предположить, что клетки, зараженные в ранней 8-фазе, задерживаются в одной из фаз клеточного цикла: Б, Ог или в митозе.

В ходе эксперимента второй пик появления меченых митозов не выявлялся ни в контрольной, ни в инфицированных культурах. Однако, исходя из общей продолжительности цикла у данного типа клеток (около 24 ч), можно предположить, что меченые митотические клетки, наблюдаемые в контроле через 30-50 ч после отмывки 3Н-тимидина, проходят уже второе деление.

В случае инфицированной культуры также можно допустить, что меченые митотические клетки, наблюдаемые в конце опыта, вступили во второй цикл с момента заражения. Здесь важное значение приобретает тот факт, что среди митозов, содержащих тимидиновую метку, встречаются патологические, появляющиеся, как было сказано выше, к концу первого дня после инфицирования. Другая часть патологических митозов (при высокой ИМ - около 50%, при низкой - больше половины) не содержит метку. Таким образом, часть аномальных митозов образуется из клеток, находившихся в момент инфицирования в Б-периоде, а другие - из клеток, бывших в фазах вь Ог или же в СЗо

По нашему предположению, клетки, находящиеся в 8-периоде в момент инфицирования, могут - нормально или с некоторой задержкой - пройти первое митотическое деление после заражения. Второй цикл деления завершается вступлением в аномальный митоз и необратимой остановкой.

Немеченые патологические митозы, по-видимому, формируются в клетках, прошедших одно деление с момента инфицирования. В целом, совокупность полученных данных приводит к выводу, что развитие патологии митотического деления обусловлено не нахождением клетки в определенной фазе цикла в момент заражения вирусом, а тем интервалом времени, который она провела в условиях развивающейся инфекции.

РОССИЙСКАЯ iV'i' 1

0 if а ~ -»fr

Г Щ ф с » i Л

Б ■ л' . * : * у - ^ i * - ч > в У ¿у ж * -О <?? -г «ir fr . -с >

J 0 at r f / yj • r / ! ty.y w» " / i , ' i * , V.T * * г д 4Я- •'S •

А ч • . -w* * * • • » « • Л ^ S л'" • i ~ ••

• V » 4 • • . ж . i • * • * . ' - * * л.

• • L ' ¿i / "

Б

D » * ^ # * V 4 c* *

• % J 9 • ê . • * ' V it. •.

• » > 1 •

4 с

МЩяЖ

V м ' i ¿«¿яешк.- • -Чч - ■ tILW У

В Т4 J 'v i ш -«гД

- ^ ' я w л г

Л ж ** ч JA

• *. .* t '.»i ■ • к » Д Mí ШЪъЖМЪШШ

V i Ч * у ' ' *-> w -i i ■ m ~> >

И ' 'r ¥.; -Г v.- ' • f-; rk t^ifíS ЛНк/ - ¿I I

• «с у 4 i. • VT*

4 ^ lákJÍL; ■IÉi ,

NJK -f f ' V f >* / ' T*' ■# ; *

J ».», Л ' . t V ,

V 4 a V >c;v/ jfr ' , . ~ • c. л ■ vî. ; , ' Í-.Of ;

• • * V ^ f t i ■ ■ . Ф rjt'i ■ ; j

• Л *>

- \

• .<< т

M * ШЩ Я.

Л: ^ ш

L* • > - ' ' h " ' у ffi^ ^m*.* ■■ i -я--rv • - » • -

Т> „ Г i «MB Д

• i- t

5 е ' . ■ V S

W a ** ч • 1 t * */ ■ w % "

4 % ч" % ЕЭ

El s л Ei Ф в ^ и W* a/Êk m в щ jp и * выводы

1. Цитомегаловирусная инфекция может вызывать необратимую остановку в митозе пермиссивных клеток первичной культуры диплоидных фибробластов человека.

2. Остановка митотического деления сопровождается необратимыми изменениями общей структуры хромосом и митотического аппарата клетки, включая веретено деления и центросому. Степень деструктивных изменений хромосом и веретена деления усиливается по мере развития инфекции.

3. Впервые показано, что ЦМВ-инфекция вызывает нарушения в структурной организации кинетохоров вплоть до их полного исчезновения. Однако основные центромерно-кинетохорные белки класса СЕМ* (СЕ1МР-А, В, С) сохраняются в составе хромосом.

4. Инфицирование ЦМВ клеток, находящихся в Б-периоде клеточного цикла не препятствует их вступлению в митоз.

5. Патология митоза развивается в клетках вне зависимости от того, в какой фазе клеточного цикла они находились в момент заражения.

6. Среди предполагаемых механизмов, приводящих к необратимой остановке митотического деления при ЦМВ-инфекции, можно назвать: а) отсутствие нормальной структуры кинетохоров; б) нарушение формирования веретена деления, связанное с повреждением центросомы и кинетохоров; в) взаимодействие сверхранних и/или ранних вирусных белков с хроматином (хромосомами) клетки-хозяина.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОМ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки // М. «Медицина». 1979. 320 с.

2. Алое И.А. Цитофизиология и патология митоза // М. «Медицина». 1972. 320 с.

3. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А.А. и др. Цитомегаловирусная инфекция человека// В кн.: Герпес: этиология, диагностика, лечение. М. 1986. 150 с.

4. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток//М. «Медицина». 1973.

5. Восток К, Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки // Под ред. АФ.Захарова. М. «Мир». 1981. 598 с.

6. Дарлингтон С.Д., Ла Кур Л.Ф. Хромосомы. Методы работы // Под ред. Н.Н.Воронцова. М. «Атомиздат». 1980. 181 с.

7. Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А. Ф. Авторадиография // М. «Высшая школа». 1977. 246 с.

8. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле // КМК Scientific Press. 1997. 144 с.

9. Кудрявцев И.С. Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле // Автореферат диссертации. М. 1997.

10. Пуденко А.С., Кудрявцев И.С., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. Пространственная ассоциация прекинетохоров и хромоцентров в интерфазных фибробластах мыши // Биологические мембраны. 1997. Т. 14. №4. С. 365-375.

11. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей // М. «Медицина». 1987. 160 с.

12. Семенов М.В. Выявление белко кинетохоров с помощью сывороток больных коллагенозами//Цитология. 1990. Т. 32. №5. С. 489-493.

13. УиклиБ. Электронная микроскопия для начинающих // М. «Наука». 1975. 324 с.

14. Фогель Ф., МатулъскиА. Генетика человека//М. «Мир». 1989. Т. 1. 308 с.

15. Чешик С.Г., Фарбер Н.А., Мартынова В.Н. и др. Проблема цитомегаловирусной инфекции в очаге ВИЧ-инфекции // В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение) / под ред. Баринский И.Ф, Бикбулатова P.M. М. 1990. 98 с.

16. AbuBakar S., Аи W.W., Legator MS. et al. Induction of chromosome aberrations and mitotic arrest by cytomegalovirus in human cells // Environ. Mutagen. 1988. V. 12. P. 409-420.

17. Albrecht Т., Nachtigal M., St.Jeor S.C. et al. Induction of cellular DNA synthesis and increased mitotic activity in Syrian hamster embryo cells abortively infected with human cytomegalovirus // J Gen Virol. 1976. V. 30. P. 167-177.

18. Albrecht Т., Boldogh I., Fons M. Et al Cell-activation responses to cytomegalovirus infection// Subcell. Biochem. 1989. V. 15. P. 157-202.

19. Bernat R. L., Delcmnoy M.R., Rothfield N.F. et al. Disruption of centromere assembly during interphase inhibits kinetochore morphogenesis and function in mitosis // Cell. 1991. V. 66. P. 1229-1238.

20. Boldogh I., Gonczol E, Gartner L. et al. Stimulation of host DNA synthesis and induction of early antigens by ultraviolet light irradiated human cytomegalovirus // Arch Virol. 1978. V. 58. P. 289-299.

21. Boppana S.B., Fowler K.B., Britt W.J. et al. Symptomatic congenital cytomegalovirus infection in infants born to mothers with preexisting immunity to cytomegalovirus // Pediatrics. 1999. V. 104 (Pt 1). P. 55-60.

22. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A. et al. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late G1 // Virology. 1996. V. 224. P. 150-160.

23. Brinkley B.R., Ouspenski I., Zinkowski R.P. Structure and molecular organization of the centromere-kinetochore complex // Trends in cell biol. 1992. V. 2. P. 15-21.

24. Bystrevskaya V.B., Lobova T.V., Smirnov V.N. et al. Centrosome injury in cells infected with human cytomegalovirus // J Struct. Biol. 1997. V. 120. P. 52-60.

25. Castillo J.P., Yurochko A.D., Kowalik T.F. Role of human cytomegalovirus immediate-early proteins in cell growth control // J Virol. 2000. V. 74(17). P. 8028-8037.

26. Cooke C.A., Heck M.M.S., Earnshaw W.C. The inner centromere protein (INCENP) antigens: movement from inner centromere to midbody during mitosis // J Cell Biol. 1987. V. 105. P. 2053-2067.

27. Cooke C.A., Bernat R.L., Earnsaw W.C. CENP-B: a major human centromere protein located beneath the kinetochore // J Cell Biol. 1990. V. 110. P. 1475-1488.

28. Dal Monte P., Bessia C., Landini M.P. et al. Expression of human cytomegalovirus ppUL83 (pp65) in a stable cell line and its association with metaphase chromosomes // J Gen Virol. 1996. V. 77. P. 2591-2596.

29. DeMarchi J.M., Kaplan A.S. Replication of human cytomegalovirus DNA: lack of dependance on cell DNA synthesis // J. Virol. 1976. V. 18. P. 1063-1070.

30. DeMarchi J.M., Kaplan A.S. Physiological state of human embryonic lung cells affects their responce to human cytomegalovirus // J. Virol. 1977. V.23. P. 126-132.

31. DeMarchi J.M. Correlation between stimulation of host cell DNA synthesis by human cytomegalovirus and lack of expression of a subset of early virus genes // Virology. 1983. V. 129. P. 274-286.

32. Dittmer D., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus infection inhibits Gl/S transition // J Virol. 1996. V.71. P. 1629-1634.

33. Earnshaw W.C., Rothfield N. Identification of a family of human centromere proteins using autoimmune sera from scleroderma patients // Chromosoma. 1985. V. 91. P. 313106

34. Earnshaw W.C., Sullivan K.F., Machlin P.S. et al. Molecular cloning of cDNA for CENP-B, the major human centromere autoantigen // J Cell Biol. 1987. V. 104. P. 817829.

35. Earnshaw W.C., Ratrie H.III, Stetten G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads // Chromosoma. 1989. V. 98. P. 1-12.

36. Earnshaw W.C. Structure and molecular biology of the kinetochore // In book: Microtubules. N.Y. Wiley-Liss, Inc. 1994. P. 393-412.

37. Fish K.N., Britt W., Nelson J.A. A novel mechanism for persistence of human cytomegalovirus in macrophages // J. Virol. 1996. V. 70 (3). P. 1855-1862.

38. Fortunato E.Ä., Dell'AquilaM.L., Spector D.H. Specific chromosome 1 breaks induced by human cytomegalovirus // Proc Natl Acad Sei USA. 2000. V. 97(2). P. 853-858.

39. Hartwell L.H., Weinert T.A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events // Science. 1989. V. 246. P. 629-634.

40. Hayashi M.L., Blankenship C., Shenk T. Human cytomegalovirus UL69 protein is required for efficient accumulation of infected cells in the Gl phase of the cell cycle // Proc Natl Acad Sei USA 2000. V. 97(6). P. 2692-2696.

41. He D., Zeng C., Woods K. et al. CENP-G: a new centromeric protein that is associated with the a-1 satellite DNA subfamily // Chromosoma. 1998. V. 107. P. 189-197.

42. Huang E.S., Kovalik T. The pathogenicity of human cytomegalovirus: an overview // In book: Molecular aspects of human cytomegalovirus diseases / Springer-Verlag. 1993. P. 3-45.

43. Ishov A.M., Stenberg R.M., Maul G.G. Human cytomegalovirus immediate early interaction with host nuclear structures: definition of an immediate transcript environment

J Cell Biol. 1997. V. 138. P. 5-16.

44. Jault F.M., Jault J.-M, Ruchti F. et al. Cytomegalovirus infection induces high levels of cyclins, phosphorylated Rb and p53, leading to cell cycle arrest // J Virol. 1995. V. 69. P. 6697-6704.

45. Johnson R.A., Yurochko A.D., Poma E.E. et al. Domain mapping of the human cytomegalovirus IE 1-72 and cellular pi07 protein-protein interaction and the possible functional consequences // J Gen Virol. 1999. V. 80. Pt. 5. P. 1293-1303.

46. Kamiya S., Tanaka J., Ogura T. et al. Rabbit kidney cells abortively infected with human cytomegalovirus are arrested in mitotic phase // Arch. Virol. 1986. V. 89. P. 131144.

47. Kitagawa K., Masumoto H., Ikeda M. et al. Analysis of protein-DNA and proteinprotein interactions of centromere protein B (CENP-B) and properties of the DNA-CENP-B complex in the cell cycle//Mol. Cell Biol. 1995. V. 15. P. 1602-1612.

48. Lafemina R.L., Pizzorno M.C., Moska J.D. et al. Expression of the acidic nuclear immediate-early protein (IE1) of human cytomegalovirus in stable cell lines and its preferential association with metaphase chromosomes // Virology. 1989. V. 172. P. 584600.

49. Lange B.M.H., Gull K. Structure and function of the centriole in animal cells: progress and questions // Trends Cell Biol. 1996. V. 6. P. 348-352.

50. Liao D, Yu A, Weiner AM. Coexpression of the adenovirus 12 E1B 55 kDa oncoprotein and cellular tumor suppressor p53 is sufficient to induce metaphase fragility of the human RNU2 locus // Virology. 1999. V.254(l). P. 11-23.

51. Lombillo V.A., Nislow C, Yen T.J. et al. Antibodies to the kinesin motor domain and CENP-E inhibit microtubule depolymerization-dependent motion of chromosomes in vitro //J Cell Biol. 1995. V. 128. P. 107-115.

52. Lu M, Shenk T. Human cytomegalovirus infection inhibits cell cycle progression at multiple points, including the transition from Gl to S // J Virol. 1996. V. 70. P. 88508857.

53. LuM., Shenk T. Human cytomegalovirus UL69 protein induces cells to accumulate in Gl phase of the cell cycle // J Virol. 1999. V. 73(1). P. 676-683.

54. Luleci G., Sakizli M, Gunalp A. Selective chromosomal damage caused by human cytomegalovirus // Acta Virol. 1980. V. 24. P. 341-345.

55. Masumoto K, Masukata H., Muro Y. et al, A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 1963-1973.

56. McElroy A.K., Dwarakanath R.S., Spector D.H. Disregulation of cyclin E gene expression in human cytomegalovirus-infected cells requires viral early gene expression and is associated with changes in Rb-related protein pi30 // J Virol. 2000. V. 74 (9). P. 4192-4206.

57. McEwen B.F., Arena J.T., Frank J. et al. Structure of the colcemid-treated PtKl kinetochore outer plate as determined by high voltage electrone microscopic tomography // J Cell Biol. 1993. V. 120. P. 301-312.

58. Mitchison T.J., Salmon E.D. Poleward kinetochore fiber movement occurs during both metaphase and anaphase-A in newt lung cell mitosis // J. Cell Biol. 1992. V. 119. P. 569582.

59. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication // In book: The human, herpesviruses. Ed. byRoizmanB., Whitley R.J., Lopez C. N.Y. 1993. P. 173-226.

60. Mocarski E.S. Cytomegaloviruses and their replication // In B.N.Fields et al., Fields Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia. 1996. P. 2447-2492.

61. Murphy E.A., Streblow D.N., Nelson J.A. et al. The human cytomegalovirus IE86 protein can block cell cycle progression after inducing transition into the S phase of permissive cells // J Virol. 2000. V. 74 (15). P. 7108-7118.

62. Murray A. W., Solomon M.J., Kirschner M.W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity // Nature (London). 1989. V. 339. P. 280-286.

63. Nachtigal M., Nachtigal S. Interactions between human herpesvirus and host cell chromosomes //Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol. 1978. V. 37. P. 223-249.

64. Pagano M., Pepperkok P., Verde F. et al. Cyclin A is required at two points in the human cell cycle // EMBO J. 1992. V. 11. P. 961-971.

65. Page S.L., Earnshaw W.C., Choo K.H. et al. Further evidence that CENP-C is a necessary component of active centromeres: studies of a die (X;15) with simultaneous immunofluorescence and FISH //Hum. Mol. Genet. 1995. V. 4. P. 289-294.

66. Palmer D.K., O'Day K, Wener M.H. et al. A 17 kD centromere protein (CENP-A) copurifies with nucleosome core particles and with histones // J Cell Biol. 1987. V. 104. P. 805-815.

67. Peat D.S., Stanley M.A. Chromosome damage induced by herpes simplex virus type 1 in early infection // J Gen Virol. 1986. V. 67 (Pt 10). P. 2273-2277.

68. Plachter B., Britt W.J., Vornhagen R, Stamminger T., Jahn G. Analysis of proteins encoded by IE-regions 1 and 2 of human cytomegalovirus using monoclonal antibodies generated against recombinant antigens // Virology. 1993. V. 193. P. 642-652.

69. Plachter B., Sinzger C., Jahn G. Cell types involved in replication and distribution of human cytomegalovirus // Adv. Virus Res. 1996. V. 46. P. 195-261.

70. Pluta A.F., Saitoh N., Goldberg I. et al. Identification of a subdomain of CENP-B that is necessary and sufficient for localization to the human centromere // J Cell Biol. 1992. V. 116. P.1081-1093.

71. Pluta A.F., Mackay A.M., Ainsztein A.M. et al. The centromere: hub of chromosomal activities // Science. 1995. V. 270. P. 1591-1594.

72. Rattner J.B., Rao A., FritzlerMJ. et al. CENP-F is a .ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization // Cell Motil. Cytoskeleton. 1993. V. 26. P. 214-226.

73. Rawlins D.R., Milman G., Hayward S.D. et al. Sequence-specific DNA-binding of the Epstein-Barr virus nuclear antigen (EBNA-1) to clustered sites in the plasmid maintenance region//Cell. 1985. V. 42. P. 859-868.

74. Rieder C.L. The formation, structure and composition of the mammalian kinetochore and kinetochore fiber // Int. Rev. Cytol. 1982. V. 79. P. 1-58.

75. Rieder C.L., Schultz A., Cole R. et al. Anaphase onset in vertebrate somatic cells is controlled by a chekpoint that monitors sister kinetochore attachment to the spindle // J Cell Biol. 1994. V. 127. P. 1301-1310.

76. Rieder C.L., Alexander S.P. Kinetochores are transported poleward along a single astral microtubule during chromosome attachment to the spindle in newt lung cells // J. Cell Biol. 1990. V. 110. P. 81-95.

77. Rieder C.L., Salmon E.D. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis // Trends Cell Biol. 1998. V. 8. P. 310-318.

78. Saitoh H., Tomkiel J., Cooke C.A. CENP-C, an autoantigen in scleroderma, is a component of the human inner kinetochore plate // Cell. 1992. V. 70. P. 115-125.

79. Salvant B.S., Fortunato E.A., Spector D.H. Cell cycle dysregulation by human cytomegalovirus: influence of the cell cycle phase at the time of infection and effects on cyclin transcription // J Virol. 1998. V. 72. P. 3729-3741.

80. Sherr C.J. Mammalian Gi cyclins // Cell. 1993. V. 73. P. 1059-1065.

81. Shulman I., Bloom K.S. Centromeres: an integrated protein/DNA complex required for chromosome movement// Annu. Rev. Cell Biol. 1991. V. 7. P. 311-336.

82. Sinclair J., Baillie J., Bryant L. et al. Human cytomegalovirus mediates cell cycle progression through G1 into early S phase in terminally differentiated cells // J Gen Virol. 2000. V. 81. Pt. 6. P. 1553-1565.

83. Speir E., Yu Z.X., Ferrcms V.J. et al. Aspirin attenuates cytomegalovirus infectivity and gene expression mediated by cyclooxygenase-2 in coronary artery smooth muscle cells // CircRes. 1998. V. 83(2). P.210-216.

84. Stenberg R.M., Depto A.S., Fortney J., Nelson J.A. Regulated expression of early and late RNAs and proteins from the human cytomegalovirus immediate-early gene region // J. Virol. 1989. V. 63. P. 2699-2708.

85. St.Jeor S.C., Albrecht T., Funk F.D. et al. Stimulation of cellular DNA synthesis by human cytomegalovirus // J Virol. 1974. V. 13. P. 353-362.

86. Vandre D.D., Borisy G.G. The centrosome cycle in animal cells // J.S.Hyams and B.R.Brinkley, eds. San Diego: Academic Press, 1989.

87. Welch P.J., Wang J.Y.J. Coordinated synthesis and degradation of cdc2 in the mammalian cell cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 3093-3097.

88. Wiebusch L., Hagemeier C. Human cytomegalovirus 86-kilodalton IE2 protein blocks cell cycle progression in G1 // J Virol. 1999. V. 73(11). P. 9274-9283.

89. Wolczak C.E., Mitchison T.J., Desai A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly // Cell. 1996. V. 84. P. 37-48.

90. Wordeman L., Steuer E.R., Sheetz MP. et al. Chemical subdomains within the kinetochore domain of isolated CHO mitotic chromosomes // J. Cell Biol. 1991. V. 114. P. 285-294.

91. Wordeman L., Mitchison T.J. Identification and partial characterization of mitotic centromere-associated kinesin, a kinesin-related protein that associates with centromeres during mitosis // J Cell Biol. 1995. V. 128. P. 95-105.

92. Yen T.J., Compton D.A., Wise D. et al CENP-E, a novel human centromere-associated protein required for progression from metaphase to anaphase // EMBO J. 1991. V. 10. P. 1245-1254.

93. Yen T.J., Schaar B.T. Kinetochore function: molecular motors, switches and gates // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. V. 8. P. 381-388.

94. Zhu H., Shen Y., Shenk T. Human cytomegalovirus IE1 and IE2 proteins block apoptosis // J. Virol. 1995. V. 69. P. 7960-7970.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пространственная ассоциация прекинетохоров и хромоцентров в интерфазных фибробластах мыши. Пуденко (Барсукова) А.С., Кудрявцев И.С., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. Биологические мембраны. 1997. Т. 14, №4, стр. 365-375.

2. Changes in the organization of chromosome centromeric regions in CMV-infected cells. Kudryavtsev I., Makarova N., Pudenko A., Pustowoit В., Kushch A. The 22nd International Herpesvirus Workshop, August 2-8, 1997, La Jolla, USA.

3. Effect of HCMV on the structure of mitotic apparatus. Kushch A., Makarova N., Bystrevskaya V., Pudenko A., Pustowoit B. Augustusburg conference of advanced science «Viral infections in pregnancy», September 27-29, 1997, Augustusburg, Saxony, Germany.

4. Влияние цитомегаловирусной инфекции на структуру митотического аппарата в фибробластах человека. Барсукова А.С., Макарова Н.Е., Кущ А.А., Зацепина О.В. V Всероссийский симпозиум "Биология клетки в культуре". Санкт-Петербург, 20-22 октября 1998 г.

5. Необратимые изменения ультраструктуры кинетохоров в митозе, вызываемые цитомегаловирусом человека. Барсукова А.С., Макарова Н.Е., Кущ А. А., Зацепина О.В. Доклады Академии Наук. 1999. Т.369, № 4, стр.564567.

6. Влияние цитомегаловируса на прохождение клеточного цикла и формирование патологических митозов в культуре диплоидных фибробластов человека. Барсукова А.С., Федорова Н.Е., Меджидова А.А., Зацепина О.В., Кущ А. А. Онтогенез. 2001 г. Т.32, №1, стр.29-34.

7. Стабильность пространственной ассоциации прекинетохоров и хромоцентров в интерфазных клетках мыши. Барсукова А.С., Артеменко Е.Г., Калайдзидис А.Л., Зацепина О.В. Цитология. 2001. Т.43, №1, стр. 46-51.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БОЕ - бляшкообразующая единица, ИМ - инфекционная множественность, ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека, ЦМВ -цитомегаловирус, CENP - centromere protein (центромерный белок), IE -immediately early (сверхранний вирусный белок), PB S - phosphate buffer solution.